ES2228454T3 - Mejora de la actividad bacteriana de antigenos de neisseria con oligonucleotidos que contienen motivos cg. - Google Patents

Abstract

Una composición inmunógena que comprende: (a) una cantidad inmunoestimulante de un antígeno de Neisseria; y (b) una cantidad inmunoestimulante de una composición adyuvante que comprende (i) un oligonucleótido que comprende al menos un motivo CG, y (ii) una sal de aluminio o una emulsión que comprende escualeno, trioleato de sorbitán y polisorbato 80 microfluidizado para proporcionar micropartículas de tamaño uniforme.

Description

Mejora de la actividad bacteriana de antígenos de Neisseria con oligonucleótidos que contienen motivos CG.

Campo técnico

La presente invención se refiere generalmente al campo de las respuestas inmunes y específicamente a composiciones inmunógenas que comprenden antígenos de Neisseria y oligonucleótidos que comprenden un motivo CG para la administración terapéutica y profiláctica.

Antecedentes de la técnica

Neisseria son cocos gram-negativos, de 0,6 a 1,0 \mum de diámetro. Dos especies de Neisseria son de principal importancia médica: N. gonorrhoeae, el agente causante de la gonorrea, y N. meningitidis, el agente causante de la meningitis bacteriana. Los humanos son sólo el reservorio conocido de los miembros del género Neisseria. Está bien admitido que para que una vacuna frente a N. meningitidis o N. gonorrhoeae sea eficaz, se deben producir los anticuerpos bactericidas capaces de matar la bacteria en presencia del complemento. Las formulaciones actuales de vacunas contra las cepas de meningococo B, por ejemplo, se centran en polisacáridos y proteínas de la membrana externa, que son proteínas elevadamente variables, con poca o ninguna reactividad cruzada entre cepas. Además, no existe una vacuna actual para cepas gonocócicas. Por lo tanto, es muy deseada una composición inmunógena mejorada para Neisseria gonorrhoeae como para Neisseria meningitidis, que se pueda usar en composiciones de vacunas. Además, también es muy deseada una composición inmunógena que comprenda un adyuvante que es capaz de desencadenar una respuesta antibactericida frente a N. meningitidis y N. gonorrhoeae.

Los adyuvantes son compuestos que son capaces de potenciar una respuesta inmune frente a antígenos. Los adyuvantes pueden potenciar tanto la inmunidad humoral como la celular. Sin embargo, para determinados patógenos es preferible estimular la inmunidad celular y, por supuesto, los linfocitos T. Los adyuvantes usados actualmente no inducen de manera adecuada respuestas de linfocitos T, y/o tienen efectos secundarios nocivos.

En la actualidad, los únicos adyuvantes aprobados para uso humano en los Estados Unidos son las sales de aluminio (alumbre). Estos adyuvantes han sido útiles para algunas vacunas que incluyen la hepatitis B, la difteria, la poliomielitis, la rabia y la gripe, pero no pueden ser útiles para otras, especialmente si se requiere la estimulación de la inmunidad celular para la protección. Por ejemplo, las publicaciones indican que el alumbre no pudo mejorar la eficacia de las vacunas frente a la tos ferina y el tifus y proporcionaron sólo una ligero efecto con las vacunas de adenovirus. Además, se han experimentado problemas tales como, la inducción de granulomas en el lugar de inyección y la variación de lote a lote de las preparaciones de alumbre.

El adyuvante completo de Freund (CFA) es un poderoso agente inmunoestimulante que se ha usado satisfactoriamente con muchos antígenos en una base experimental, y especialmente para investigación animal. El CFA está compuesto por tres componentes: un aceite mineral, un agente emulsionante tal como Arlacel A, y micobacterias muertas tales como Mycobacterium tuberculosis. Las disoluciones acuosas de antígeno se mezclan con estos componentes para crear una emulsión de agua en aceite. No obstante, el CFA provoca graves efectos secundarios, incluyendo dolor, formación de abscesos y fiebre, que impide su uso en vacunas humanas o veterinarias. Los efectos secundarios se deben principalmente a las reacciones del huésped frente al componente micobacteriano del CFA. El adyuvante incompleto de Freund (IFA) es similar al CFA sin el componente micobacteriano. Mientras que aún no se aprobó para su uso en los Estados Unidos, el IFA ha sido útil para tipos de vacunas en otros países. El IFA se ha usado satisfactoriamente en humanos con las vacunas frente a la gripe y la poliomielitis y con varias vacunas animales que incluyen la rabia, el moquillo canino y la glosopeda. Sin embargo, los experimentos han mostrado que tanto el aceite como el emulsionante usados en el IFA pueden producir tumores en ratones, lo que indica que un adyuvante alternativo sería una buena elección para el uso humano.

El dipéptido muramilo (MDP) representa la unidad mínima del complejo de pared celular micobacteriana que genera la actividad adyuvante observada con CFA. Ellouz et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 1974, 59, 1317. Se han generado muchos análogos sintéticos de MDP que exhiben una amplia gama de potencia de adyuvante y efectos secundarios adyuvante. Chedid et al. Prog. Allergy, 1978, 25, 63. Tres análogos de MDP - derivados treonilo de MDP (Byars et al, Vaccine, 1987, 5, 223); derivados n-butilo de MDP (Chedid et al., Infect. Immun., 1982, 35, 417); y derivados lipofílicos del tripéptido muramilo (Gisler et al., Immunomodulations of Microbial Products y Related Synthetic Compounds, Y. Yamamura y S. Kotani, editores, Excerpta Medica, Amsterdam, pág. 167) - han mostrado estimular la inmunidad humoral y celular y presentan bajos niveles de toxicidad. Otro derivado del MDP, el N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-[1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-3(hidroxifosforil-oxi)]etilamida (MTP-PE) es lipofílico. MTP-PE tiene colas fosfolipídicas que permiten la asociación de la porción hidrofóbica de la molécula con un entorno lipídico mientras que la porción del péptido muramilo se asocia con el entorno acuoso. Por tanto, el MTP-PE puede actuar por sí mismo como agente emulsionante para generar emulsiones estables de aceite en
agua.

Levamisol y isoprinosina son otros adyuvantes sintéticos que aumentan la inmunidad del huésped. Levamisol es el isómero levo del tetramisol y potencia la inmunidad celular y humoral a través de un mecanismo dependiente de linfocitos T. Isoprinosina, un complejo que contiene inosina, el precursor purínico de la adenosina y guanosina, promueve la mitogénesis de linfocitos T. Tuftsina, un péptido de 4 aminoácido (Thr-Lys-Pro-Arg) homólogo a una secuencia en la cadena pesada de la inmunoglobulina (Ig), estimula principalmente a los macrófagos.

Las micropartículas preparadas a partir de polímeros biodegradables y biocompatibles, conocidas como poli(lactida-coglicolidas) (PLG), han demostrado ser adyuvantes eficaces para una serie de antígenos. Además, las micropartículas PLG pueden controlar la tasa de liberación de antígenos atrapados y; con ello, ofrecer potencial para vacunas de dosis única. Además, se ha demostrado que la administración de polímeros biodegradables con antígenos atrapados en una variedad de modelos animales induce potentes respuestas inmunes. O'Hagan et al. Advanced Drug Deliv. Rev., 1998, 32, 225-246 y Singh et al., Advanced Drug Deliv. Rev., 1998, 34, 285-304.

Una emulsión que comprende escualeno, trioleato de sorbitán (Span85™) y polisorbato 80 (Tween 80™) microfluidizado para proporcionar microgotículas de tamaño uniforme, es decir MF59, también han mostrado inducir potentes respuestas inmunes. Se ha mostrado que las formulaciones MF59 inducen valores de anticuerpos de 5 a 100 veces mayores que los obtenidos con adyuvantes de sales de aluminio. Se ha demostrado que MF59 potencia la respuesta inmune frente a antígenos de numerosos orígenes, incluyendo, por ejemplo, el virus del herpes simple (VHS), el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), el virus de la gripe, el virus de la hepatitis C (VHC), el citomegalovirus (CMV), el virus de la hepatitis B (VHB), el virus del papiloma humano (VPH) y la malaria. Ott et al. Vaccine Design: The Subunit and Adyuvant Approach, 1995, M. F. Powell y M. J. Newman, editores, Plenum Press, Nueva York, págs. 277-296; Singh et al., Vaccine, 1998, 16, 1822-1827; Ott et al., Vaccine, 1995, 13, 1557-1562; O'Hagan et al., Mol. Medicine Today, 1997, February, 69-75; y Traquina et al., J. Infect. Dis., 1996, 174, 1168-75. El adyuvante MF59 mejora la capacidad inmunógena de las subunidades de antígenos a la vez que mantienen el perfil de seguridad y tolerabilidad del adyuvante de alumbre. Van Nest et al., Vaccines 92, 1992, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 57-62 y Valensi et al., J. Immunol, 1994, 755, 4029-39, cuyas descripciones se incorporan íntegramente en la presente memoria como referencia. MF59 se describe además en la solicitud de patente de los Estados Unidos 08/434.512, presentada el 4 de mayo de 1995, cuya descripción se incorporan íntegramente en la presente memoria como referencia. En estudios animales, se ha descubierto que MF59 no es genotóxico, ni teratogénico, ni causa sensibilización. El mecanismo de acción de MF59 parece ser dependiente de la generación de una fuerte respuesta de linfocitos T CD4+, es decir, una respuesta de linfocitos Th2. Sin embargo, los adyuvantes MF59 provocan pocas, si las hubiera, respuestas Th1, o respuestas de linfocitos T citotóxicos (LTC).

Se ha demostrado que los oligonucleótidos que comprenden motivos CpG mezclados con antígenos inducen fuertes respuestas inmunes de tipo Th1. Roman et al., Nat. Med., 1997, 3, 849-854; Weiner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94, 10833-10837; Davis et al., J. Immunol., 1998, 160, 870-876; Chu et al., J. Exp. Med., 1997, 186, 1623-1631; Lipford et al., Eur. J. Immunol., 1997, 27, 2340-2344; y Moldoveanu et al., Vaccine, 1988, 16, 1216-1224. Los dinucleótidos CpG sin metilar son relativamente comunes en el ADN bacteriano, pero están muy poco representados y metilados en el ADN de vertebrados. Bird, Trends Genet., 1987, 3, 342-347. El ADN bacteriano o los oligonucleótidos sintéticos que contienen motivos CpG sin metilar se conocen también por inducir respuestas inmunes que incluyen, por ejemplo, la proliferación de linfocitos B, la secreción de interleucina 6 e inmunoglobulina, y la resistencia a apoptosis. Krieg et al., Nature, 1995, 374, 546-549; Klinman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93, 2879-2883; Ballas et al, J. Immunol., 1996, 157, 1840-1845; Cowdery et al., J. Immunol., 1996, 156, 4570-4575; Halpern et al., Cell. Immunol, 1996, 167, 72-78; Yamamoto et al., Jpn. J. Cancer Res., 1988, 79, 866-873; Stacey et al., J. Immunol, 1996, 157, 2116-2122; Messina et al., J. Immunol, 1991, 147, 1759-1764; Yi et al, J. Immunol, 1996, 157, 4918-4925; Yi et al., J. Immunol., 1996, 157, 5394-5402; Yi et al, J. Immunol. 1998, 160, 4755-4761; y Yi et al., J. Immunol., 1998, 160, 5898-5906; publicaciones PCT WO96/02555, WO98/16247, WO98/18810, WO98/40100, WO 98/49288, WO98/55495, WO98/37919 y WO98/52581. Los documentos WO 98/18810 y WO98/49288 sugieren que el uso de oligonucleótidos CpG para inducir una respuesta inmune que proteja frente a bacterias, incluida Neisseria. El documento WO 98/55495 describe el uso de oligonucleótidos CpG para inducir una respuesta inmune frente a un antígeno. Sin embargo los oligonucleótidos CpG no han mostrado inducir respuestas bactericidas con anticuerpos.

Se desea mucho una composición inmunógena eficaz que comprenda un adyuvante en combinación con un antígeno de Neisseria que induce anticuerpos bactericidas y que se pueda usar para el tratamiento profiláctico y terapéutico en animales de investigación. Además, todavía se desea también una composición inmunógena eficaz que comprenda un adyuvante en combinación con un antígeno de Neisseria que induce anticuerpos bactericidas y que se pueda usar para el tratamiento profiláctico y terapéutico en humanos. Tal respuesta sería útil en el tratamiento de, por ejemplo, las infecciones meningocócicas o gonocócicas así como para inmunizar individuos sensibles a infecciones meningocócicas o gonocócicas.

Descripción de la invención

La presente invención se refiere a composiciones adyuvantes que comprenden un oligonucleótido que comprende al menos un motivo CG, y adyuvante completo de Freund (CFA). Preferiblemente, el oligonucleótido comprende al menos un enlace fosfotioato. El oligonucleótido preferiblemente comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo constituido por ID SEC Nº:1, ID SEC Nº:2, ID SEC Nº:3, ID SEC Nº:4, ID SEC Nº:5, ID SEC Nº:6, ID SEC Nº:7, ID SEC Nº:8, ID SEC Nº:9, ID SEC Nº:10, ID SEC Nº:11, ID SEC Nº:12, ID SEC Nº:13, ID SEC Nº:14, ID SEC Nº:15, ID SEC Nº:16, ID SEC Nº:17, ID SEC Nº:18, ID SEC Nº:19, ID SEC Nº:20, ID SEC Nº:21, ID SEC Nº:22, ID SEC Nº:23, ID SEC Nº:24, ID SEC Nº:25, ID SEC Nº:26, y ID SEC Nº:27. En algunas realizaciones de la invención, el oligonucleótido comprende un motivo CG flanqueado por dos purinas inmediatamente 5' al motivo CG y dos pirimidinas inmediatamente 3' al motivo CG. En realizaciones preferidas de la invención, el oligonucleótido comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo constituido por ID SEC Nº:1, ID SEC Nº:2, ID SEC Nº:3, ID SEC Nº:7, ID SEC Nº:8, ID SEC Nº:9, ID SEC Nº:12, ID SEC Nº:13, ID SEC Nº:19, ID SEC Nº:20, ID SEC Nº:21, ID SEC Nº:22, ID SEC Nº:23, ID SEC Nº:24 y ID SEC Nº:25.

La presente invención también se refiere a composiciones inmunógenas que comprenden una cantidad inmunoestimulante de antígeno de Neisseria, y una cantidad inmunoestimulante de una composición adyuvante que comprende al menos un oligonucleótido comprendiendo al menos un motivo CG. Preferiblemente, la composición adyuvante comprende al menos un oligonucleótido que comprende al menos un motivo CG junto con un segundo adyuvante. Preferiblemente, el antígeno Neisseria se selecciona del grupo constituido por una proteína, una proteína-polisacárido, una proteína-lipopolisacárido, un polisacárido y un lipopolisacárido. Preferiblemente, el antígeno de Neisseria es de Neisseria meningitidis o Neisseria gonorrhoeae. En realizaciones preferidas de la invención, el antígeno de Neisseria es un péptido de Neisseria meningitidis del grupo B, comprendiendo preferiblemente la ID SEC Nº:31. En algunas realizaciones de la invención, la composición adyuvante comprende un segundo adyuvante tal como, por ejemplo, alumbre, adyuvante incompleto de Freund, o adyuvante completo de Freund. En otras realizaciones de la invención, la composición adyuvante comprende una emulsión de gotículas oleosas como segundo adyuvante, que comprende preferiblemente un aceite metabolizable y un agente emulsionante. Preferiblemente, el aceite y el agente emulsionante están presentes en forma de emulsión de aceite en agua con gotículas de aceite, siendo todas ellas sustancialmente menores de 1 micrómetro de diámetro y existiendo en ausencia de cualquier copolímero en bloque de polioxipropileno-polioxietileno. Preferiblemente, el aceite es un aceite animal o un aceite vegetal, más preferiblemente un hidrocarburo insaturado, más preferiblemente un terpenoide tal como el escualeno. En realizaciones preferidas, la composición comprende de 0,5 al 20% en volumen de aceite en un medio acuoso. Preferiblemente, el emulsionante comprende un detergente no iónico. Preferiblemente, el emulsionante comprende un mono-, di-, o triéster de sorbitán o un mono-, di-, o triéter de polioxietilensorbitán. En algunas realizaciones de la invención, la composición comprende del 0,01 al 0,5% en peso del emulsionante.

Las composiciones de la invención también pueden comprender un agente inmunoestimulante por separado tal como, por ejemplo, un componente de la pared celular bacteriana y el péptido muramilo. En realizaciones preferidas de la invención, la composición comprende cualquier oligonucleótido que comprenda al menos un motivo CG descrito en la presente memoria.

La presente invención también se dirige a composiciones de vacunas que comprenden una cantidad inmunoestimulante de un antígeno de Neisseria, como se ha descrito antes, y una cantidad inmunoestimulante de una composición adyuvante, como se ha descrito antes, que comprende un oligonucleótido que comprende al menos un motivo CG, como se ha descrito antes.

La presente invención también se dirige a procedimientos para estimular una respuesta inmune en un animal huésped que comprende la administración al animal de una composición inmunógena descrita en la presente memoria en una cantidad eficaz para inducir una respuesta inmune. Preferiblemente, el animal huésped es un mamífero.

La presente invención también se dirige a procedimientos para inmunizar un animal huésped frente a la infección por Neisseria que comprende la administración al animal una composición de vacuna, como se ha descrito antes, en una cantidad eficaz para inducir una respuesta protectora. Preferiblemente, el animal huésped es un mamífero, más preferiblemente un humano.

La presente invención también se dirige a procedimientos para inmunizar un animal huésped frente a Neisseria meningitidis que comprende la administración al animal de un composición de vacuna, como se ha descrito antes, en una cantidad eficaz para inducir una respuesta protectora, en la que el antígeno es un péptido de Neisseria meningitidis grupo B, comprendiendo preferiblemente la ID SEC Nº:31. Preferiblemente, el animal huésped es un mamífero, más preferiblemente un humano.

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique otra cosa, procedimientos convencionales de virología, immunología, microbiología, biología molecular y técnicas de ADN recombinante dentro de la experiencia de la técnica. Tales técnicas se explican completamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª Edición, 1989); DNA Cloning: A Practical Approach, Vols. I y II (D. Glover, editor); Methods In Enzymology (S. Colowick y N. Kaplan editores, Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D. M. Weir y C. C. Blackwell editores, Blackwell Scientific Publications); y Fundamental Virology, 2ª Edición, Vols. I y II (B. N. Fields y D. M. Knipe, editores).

La presente invención se dirige, en parte, a composiciones inmunógenas que comprenden un antígeno de Neisseria, un adyuvante, y un oligonucleótido que comprende al menos un motivo CG. Las composiciones inmunógenas de la invención aumentaron la inmunogenicidad del antígeno casi 10 veces, determinado por los valores de anticuerpos. Sorprendentemente, cuando se analizaron los sueros de los animales inmunizados en un ensayo bactericida de MenB, se observó una aumento del doble en la capacidad de muerte de células MenB.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "ácido" se refiere a ADN, ARN o híbridos formados de los mismos.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "oligonucleótido que comprende al menos un motivo CG" se refiere a un polinucleótido que comprende al menos un dinucleótido CG. Los oligonucleótidos que comprenden al menos un motivo CG pueden comprender múltiples motivos CG. Estos oligonucleótidos se conocen también en la técnica como oligonucleótidos "CpG" en la técnica. Como se usa en la presente memoria, la expresión "motivo CG" se refiere a una porción de dinucleótido de un oligonucleótido que comprende un nucleótido de citosina seguido por una de nucleótido guanosina. En lugar de citosina se puede usar también 5-metilcitosina.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "emulsión de gotículas de aceite" se refiere a una emulsión que comprende un aceite metabolizable y un emulsionante.

Como se usa en la presente memoria, el término "aproximadamente" se refiere a \pm aproximadamente el 10% del valor que modifica.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "antígeno de Neisseria" se refiere a cualquier proteína, péptido, proteína-polisacárido, proteína-lipopolisacárido, péptido-polisacárido, péptido-lipopolisacárido, polisacárido o lipoppolisacárido procedente de un bacteria Neisseria. Preferiblemente, el antígeno de Neisseria estimula la formación de anticuerpos específicos y reacciona de forma específica in vivo o in vitro con una anticuerpo homólogo y/o estimula una respuesta celular de linfocitos T. El antígeno de Neisseria puede proceder de cualquier especie de Neisseria, pero procede preferiblemente de N. meningitidis o de N. gonorrhoeae. Alguien experto en la técnica está capacitado fácilmente para identificar y preparar numerosos antígenos de Neisseria.

Como se usa en la presente memoria, el término "vacuna" se refiere a una composición inmunógena que es capaz de inducir una respuesta inmune microbicida. Preferiblemente, las vacunas de la presente invención inducen una respuesta bactericida con anticuerpos.

De acuerdo con la presente invención, se proporcionan composiciones y procedimientos que inmunizan o tratan de forma profiláctica y/o terapéutica a un animal huésped frente a infeccionas por Neisseria. Los procedimientos de la presente invención son útiles para conferir una inmunidad profiláctica y terapéutica a un mamífero, preferiblemente un humano. Los procedimientos de la presente invención se pueden practicar en mamíferos, distintos de humanos, para la investigación biomédica.

En una realización de la presente invención, un oligonucleótido que comprende al menos un motivo CG se combina con el CFA para formar una composición adyuvante, que se puede usar con cualquier antígeno. Los oligonucleótidos que comprenden al menos un motivo CG se pueden preparar usando síntesis convencional de oligonucleótidos bien conocida para el especialista experto. Preferiblemente, los oligonucleótidos de la invención comprenden un esqueleto modificado, tal como un fosforotioato o un ácido nucleico peptídico, para conferir resistencia a nucleasas al oligonucleótido. Los esqueletos adicionales que se pueden usar en la presente invención se conocen bien para aquellos en la técnica. Además, el oligonucleótido preferiblemente comprende entre aproximadamente 6 y aproximadamente 100 nucleótidos, más preferiblemente entre aproximadamente 8 y aproximadamente 50 nucleótidos, lo más preferiblemente entre aproximadamente 10 y aproximadamente 40 nucleótidos. Además, los oligonucleótidos de la invención pueden comprender sustituciones de restos de azúcar y restos de base nitrogenada que son bien conocidos para aquellos expertos en la técnica. Los oligonucleótidos preferidos que comprenden al menos un motivo CG se describen, por ejemplo, en Krieg et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 1998, 95, 12631-12636, Klinman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93, 2879-2883, Weiner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94, 10833-10837, Chu et al, J. Exp. Med., 1997, 186, 1623-1631, Brazolot-Millan et al, Proc. Natl. Acad Sci. USA, 1998, 95, 15553-15558, Ballas et al., J. Immunol., 1996, 157, 1840-1845, Cowdery et al., J. Immunol., 1996, 156, 4570-4575, Halpern et al., Cell. Immunol., 1996, 167, 72-78, Yamamoto et al., Jpn. J. Cancer Res., 1988, 79, 866-873, Stacey et al., J. Immunol., 1996, 157, 2116-2122, Messina et al., J. Immunol., 1991, 147, 1759-1764, Yi et al., J. Immunol., 1996, 157, 4918-4925, Yi et al., J. Immunol., 1996, 157, 5394-5402, Yi et al., J. Immunol., 1998, 160, 4755-4761, Roman et al., Nat. Med., 1997, 3, 849-854, Davis et al., J. Immunol., 1998, 160, 870-876, Lipford et al., Eur. J. Immunol., 1997, 27, 2340-2344, Moldoveanu et al., Vacuna, 1988, 16, 1216-1224, Yi et al., J. Immunol., 1998, 160, 5898-5906, las publicaciones PCT WO96/02555, WO 98/16247, WO98/18810, WO98/40100, WO98/55495, WO98/37919, WO98/52581. Se comprenderá que los oligonucleótidos de la invención comprenden al menos un motivo CG pero pueden contener una pluralidad de motivos CG.

Los oligonucleótidos preferidos comprenden secuencias de nucleótidos tales como, por ejemplo, tccatgacgttcctgacgtt (ID SEC Nº:1), ataatcgacgttcaagcaag (ID SEC Nº:2), ggggtcaacgttgagggggg (ID SEC Nº:3), tctcccagcgtgcgccat (ID SEC Nº:4), gagaacgctcgaccttcgat (ID SEC Nº:5), tccatgtcgttcctgatgct (ID SEC Nº:6), tccatgacgttcctgatgct.(ID SEC Nº:7), gctagacgttagcgt (ID SEC Nº:8), atcgactctcgagcgttctc (ID SEC Nº:9), gaaccttccatgctgttccg (ID SEC Nº:10), gctagatgttagcgt (ID SEC Nº:11), tcaacgtt (ID SEC Nº:12), gcaacgtt (ID SEC Nº:13), tcgacgtc (ID SEC Nº:14), tcagcgct (ID SEC Nº:15), tcaacgct (ID SEC Nº:16), tcatcgat (ID SEC Nº:17), tcttcgaa (ID SEC Nº:18), tgactgtgaacgttcgagatga (ID SEC Nº:19), tgactgtgaacgttagcgatga (ID SEC Nº:20), tgactgtgaacgttagagcgga (SEQ ID NO:21), gtttgcgcaacgttgttgccat (ID SEC Nº:22), atggcaacaacgttgcgcaaac (ID SEC Nº:23), cattggaaaacgttcttcgggg (ID SEC Nº:24), ccccgaagaacgttttccaatg (ID SEC Nº:25), attgacgtcaat (ID SEC Nº:26) y ctttccattgacgtcaatgggt (ID SEC Nº:27). En realizaciones preferidas de la invención, el oligonucleótido comprende a un motivo CO flanqueado por dos purinas en el lado 5' del motivo y dos pirimidinas en el lado 3' del motivo. Se comprenderá, sin embargo, que se puede usar en la presente invención cualquier oligonucleótido que comprenda un motivo CG mientras el oligonucleótido induzca una respuesta inmune aumentada.

La presente invención también se dirige a composiciones inmunógenas que comprenden al menos un oligonucleótido CO, como se ha descrito antes, y un adyuvante en combinación con al menos un antígeno de Neisseria. En algunas realizaciones de la invención, el adyuvante es alumbre, el adyuvante incompleto de Freund, o adyuvante completo de Freund. En otras realizaciones de la invención, el adyuvante comprende una cantidad inmunogénica de una emulsión de gotículas de aceite. Las composiciones adyuvantes se preparan generalmente a partir de los componentes descritos a continuación antes de combinar el adyuvante con el antígeno que se usará en la composición inmunógena.

En algunas realizaciones de la invención, el antígeno procede de Neisseria gonorrhoeae. En otras realizaciones de la invención, el antígeno procede de Neisseria meningitidis. Preferiblemente, el antígeno es un péptido Neisseria meningitidis grupo B. Preferiblemente, las secuencias de nucleótidos y aminoácidos del péptido comprenden (ID SEC Nº:30) y (ID SEC Nº:31), respectivamente. Sin embargo, se puede usar cualquier antígeno de Neisseria la presente invención. Antígenos adicionales de Neisseria se describen a continuación en los ejemplos. Además, los péptidos que pueden servir como antígenos de Neisseria de la invención se describen en los documentos WO99/24578, WO99/36544 y WO99/57280. Se comprenderá que se pueden realizar sustituciones conservativas de uno o múltiples aminoácidos con modificación de la inmunogenia de los antígenos de la invención. Además, también se incluyen las variaciones de las cepas bacterianas en las secuencias de nucleótidos y aminoácidos descritas en la presente memoria. Por ejemplo, algunas cepas pueden comprender Y en lugar de C en la posición de aminoácido 11, A en lugar de D en la posición 48, A en lugar de G en la posición 55; Q en lugar de R en la posición 207, A en lugar de S en la posición 312, T en lugar de A en la posición 338 y G en lugar de S en la posición 341.

Se puede añadir el antígeno a las composiciones adyuvantes tras la preparación. El antígeno y la emulsión se pueden mezclar por agitación. Cuando se usan el CFA y el IFA, se puede mezclar el antígeno en PBS con un volumen igual de CFA o de IFA. La mezcla se puede emulsionar pasando a través de una aguja hipodérmica hasta que se consiga una emulsión espesa.

En realizaciones preferidas de la invención, una cantidad inmunoestimulante de al menos un oligonucleótido que comprende al menos un motivo CG y al menos un antígeno de Neisseria se combina con un adyuvante que comprende una emulsión de gotículas de aceite. La emulsión de gotículas de aceite comprende preferiblemente un aceite metabolizable y un emulsionante, en el que el aceite y el emulsionante están presentes en forma de una emulsión de aceite en agua con gotículas de aceite, siendo todas ellas sustancialmente menores de una micrómetro de diámetro. Tales gotículas muestran una sorprendente superioridad frente a las composiciones adyuvantes que contienen aceite y emulsionantes en las que las gotículas de aceite son significativamente mayores que las proporcionadas por la presente invención.

Los componentes individuales de la presente invención, aunque se describen generalmente a continuación y en algún detalle para realizaciones preferidas, se conocen bien en la técnica, y los términos usados en la presente memoria, tales como aceite metabolizable, emulsionante, agente inmunoestimulante, péptido muramilo y péptido muramilo lipofílico, son suficientemente bien conocidos para describir estos compuestos para alguien experto en la técnica sin descripción.

Un componente de estas composiciones es un aceite metabolizable y atóxico, preferiblemente uno de 6 a 30 átomos de carbono que incluye, pero no se limita a, alcanos, alquenos, alquinos y sus correspondientes ácidos y alcoholes, los éteres y ésteres de los mismos, y las mezclas de los mismos. El aceite puede ser cualquier aceite vegetal, aceite de pescado, aceite de animal o un aceite preparado sintéticamente que se puede metabolizar por el cuerpo del animal huésped al que se administrará la composición inmunógena y que no es tóxico para el sujeto. El animal huésped es típicamente un mamífero, y preferiblemente un humano. De esta invención se excluyen de forma expresa el aceite mineral y similares aceites tóxicos destilados de petróleo.

El componente de aceite de esta invención puede ser también cualquier alcano, alqueno o alquino de cadena larga, o un derivado ácido o alcohol de los mismos bien como el ácido libre, su sal o como un éster tal como un mono-, o di- o triéster, tal como los triglicéridos y ésteres del 1,2-propanodiol o polihidroxialcoholes similares. Los alcoholes se pueden acilar empleando ácidos amino- o poli-funcionales, por ejemplo ácido acético, ácido propanoico, ácido cítrico o similares. También se pueden usar los éteres derivados de alcoholes de cadena larga que son aceites y reúnen el resto de condiciones expuestas en la presente memoria.

El resto individual de alcano, alqueno o alquino y sus derivados ácido o alcohol tendrán por lo general aproximadamente 6 a aproximadamente 30 átomos de carbono. El resto pueden tener una estructura de cadena lineal o ramificada. Puede estar completamente saturado o tener uno o más dobles o triples enlaces. Cuando se emplean aceites basados en mono o poli -ésteres o -éteres, la limitación de aproximadamente 6 a aproximadamente 30 carbonos se aplica a los restos individuales de ácido graso o alcohol graso, y no al recuento total de carbonos.

En la presente memoria se puede usar cualquier aceite metabolizable, concretamente de una fuente animal, de pescado o vegetal. Es esencial que el aceite sea metabolizado por el huésped al que se le administra, si no el componente de aceite puede producir abscesos, granulomas o incluso carcinomas, o (cuando se usan en la práctica veterinaria) puede hacer inaceptable la carne de animales y pájaros vacunados para el consumo humano debido al efecto nocivo que puede tener el aceite sin metabolizar sobre el consumidor.

Como ejemplos de fuentes de aceites vegetales se incluyen las nueces, las semillas y los granos. El aceite de cacahuete, el aceite de soja, el aceite de coco y el aceite de oliva, los más comúnmente disponibles, sirven de ejemplos para los aceites de nueces. Los aceites de semillas incluyen el aceite de cártamo, el aceite de semilla de algodón, el aceite de semillas de girasol, el aceite de semillas de sésamo y similares. En el grupo de los granos, el aceite de maíz es el más fácilmente disponible, pero también se pueden usar el aceite de otros granos de cereal tal como trigo, avena, centeno, arroz, tef, tritical y similares.

La tecnología para obtener aceites vegetales está bien desarrollada y bien conocida. Las composiciones de estos y otros aceites similares se pueden encontrar, por ejemplo, en el Índice Merck Index, y los materiales de origen en alimentos y tecnología de nutrición y alimentación.

Los ésteres de ácidos grasos de 6 a 10 carbonos de glicerol y 1,2-propanodiol, a pesar de no encontrarse de forma natural en los aceites de semillas, se pueden preparar mediante hidrólisis, separación y esterificación de los materiales apropiados comenzado con los frutos secos y los aceites de semillas. Estos productos están disponibles comercialmente bajo el nombre NEOBEE® de PVO International, Inc., Chemical Specialties Division, 416 Division Street, Boongon, NJ y otros.

Los aceites procedentes de cualquier fuente animal se pueden emplear también en las composiciones inmunógenas de esta invención. Los aceites y grasas animales y son habitualmente sólidos a temperaturas fisiológicas debidas al hecho que existen como triglicéridos y tienen un mayor índice de saturación que los aceites de peces o vegetales. Sin embargo, los ácidos grasos son obtenibles a partir de grasas animales mediante la saponificación parcial o completa de triglicéridos, que proporciona los ácidos grasos no esterificados. Las grasas y los aceites de la leche de mamíferos son metabolizables y por tanto se pueden usar en la práctica de esta invención. Los procedimientos para la separación, purificación, saponificación y otros métodos necesarios para obtener aceites puros a partir de fuentes animales se conocen bien en la técnica.

La mayoría de los peces contienen aceites metabolizables que se pueden recuperar fácilmente. Por ejemplo, el aceite de hígado de bacalao, los aceites de hígado de tiburón, y el aceite de ballena tal como esperma de ballena sirven de ejemplo de varios de los aceites de peces que se pueden usar en la presente memoria. Varios aceites de cadena ramificada se sintetizan bioquímicamente en unidades de isopreno de 5 carbonos y se denominan por lo general como terpenoides. El aceite de hígado de tiburón contiene un terpenoide ramificado, unsaturated conocido como escualeno, 2,6,10,15,19,23-hexametil-2,6,10,14,18,22-tetracosahexaeno que se prefiere particularmente en la presente memoria. El escualano, el análogo saturado del escualeno, también es un aceite particularmente preferido. Los aceites de pescado, incluido el escualeno y escualano, están disponibles fácilmente a partir de fuentes comerciales o se pueden obtener mediante procedimientos conocidos en la técnica.

El componente de aceite de estas composiciones inmunógenas estará presente en una cantidad de aproximadamente 0,5% a aproximadamente 20% en volumen pero preferiblemente no más de aproximadamente 15%, especialmente en una cantidad de aproximadamente 1% a aproximadamente 12%. Se prefiere más el uso de aproximadamente 1% a aproximadamente 4% de aceite.

La porción acuosa de estas composiciones inmunógenas es preferiblemente solución salina tamponada o, más preferiblemente, agua pura. Ya que estas composiciones se pretenden para la administración parenteral, es preferible desarrollar soluciones tamponadas finales usadas como composiciones inmunógenas de modo que la tonicidad, es decir, la osmolalidad, sea esencialmente la misma que la de los fluidos fisiológicos normales para prevenir el hinchamiento tras la administración o una rápida absorción de la composición debido a concentraciones iónicas diferentes entre la composición y los fluidos fisiológicos. También es preferible tamponar la solución salina para mantener el pH compatible con las condiciones fisiológicas normales. También, en determinados casos, puede ser necesario mantener el pH a un nivel concreto para asegurar la estabilidad de determinados componentes de la composición tales como los glucopéptidos.

En la presente memoria se puede usar cualquier tampón fisiológicamente aceptable, pero se prefieren los tampones de fosfato. Otros tampones aceptables tales como acetato, tris, bicarbonato, carbonato, o similares se pueden usar como sustitutos para los tampones de fosfato. El pH del componente acuoso estará preferiblemente entre aproximadamente 6,0-8,0.

Sin embargo, cuando las composiciones inmunógenas se preparan inicialmente, se prefiere agua pura como componente acuoso de la emulsión. El aumento de la concentración de sal hace más difícil alcanzar el pequeño tamaño deseado de gotícula. Cuando las composiciones finales inmunógenas se preparan a partir de un adyuvante de gotículas de aceite, el material antigénico se puede añadir en un tampón a una osmolalidad apropiada, para proporcionar la composición inmunógena deseada.

La cantidad del componente acuoso empleado en estas composiciones será aquella cantidad necesaria para llevar el valor de la composición a la unidad. Es decir, se mezclará una cantidad de componente acuoso suficiente para hacer 100%, con el resto de los componentes enumerados anteriormente, para llevar las composiciones hasta el volumen.

Por lo general se usó un número sustancial de emulsionantes y agentes de suspensión en las ciencias farmacéuticas. Un emulsionante no es un aceite metabolizable, como se usa en la presente memoria. Los emulsionantes incluyen materiales procedentes de forma natural tales como gomas de los árboles, proteína vegetal, polímeros basados en azúcares tal como alginatos y celulosa y similares. Determinados oxipolímeros o polímeros con un hidróxido u otro sustituyente hidrófilo sobre el esqueleto de carbono con actividad tensioactiva, por ejemplo, povidona, alcohol polivinílico y compuestos mono- y poli-funcionales basados en glicoléter. Los compuestos derivados de ácidos grasos de cadena larga forman un tercer grupo sustancial de emulsionantes y agentes de suspensión que se podrían usar en esta invención. Cualquiera de los tensioactivos anteriores son útiles siempre que no sean tóxicos.

Los ejemplos específicos de emulsionantes adecuados (también mencionados como tensioactivos o detergentes) que se pueden usar de acuerdo con la presente invención incluyen los siguientes:

1. Jabones hidrosolubles, tal como las sales sódicas, potásicas, amónicas y de alcanol-amonio de ácidos grasos superiores (C_{10}-C_{22}), y, particularmente jabones sódicos y potásicos de coco y sebo.

2. Detergentes sintéticos aniónicos que no son jabones, que se pueden representar por las sales hidrosolubles de productos de reacción del ácido sulfúrico orgánico que tienen en su estructura molecular un radical alquilo que contiene de aproximadamente 8 a 22 átomos de carbono y un radical seleccionado del grupo constituido por radicales éster del ácido sulfónico y el ácido sulfúrico. Los ejemplos de estos son los alquilsulfatos de sodio o potasio, procedentes de aceite de coco o de grasa animal; alquilbencenosulfonatos de sodio o de potasio; sulfonatos sódicos de alquilgliceriléter; sulfonatos y sulfatos sódico de monoglicérido de ácido graso de aceite de coco; sales de sodio o de potasio de ésteres del ácido sulfúrico del producto de reacción de un mol de un alcohol graso superior y aproximadamente 1 a 6 moles de óxido de etileno; sulfonatos sódicos o potásicos del óxido de alquilfenoletileno, con 1 a 10 unidades de óxido de etileno por molécula y en los que los radicales alquilo contienen de 8 a 12 átomos de carbono; el producto de reacción de ácidos grasos esterificados con ácido isetiónico y neutralizado con hidróxido sódico; sales potásicas o sódicas de amidas de ácidos grasos de una metiltaurida; y sales potásicas o sódicas de \alpha-olefinas C_{10}-C_{24} sulfonadas con SO_{3}.

3. Detergentes sintéticos no iónicos preparados mediante la condensación de grupos de óxido de alquileno con un compuesto orgánico hidrofóbico. Los grupos hidrofóbicos incluyen productos de condensación de óxido de propileno con propilenglicol, alquilfenoles, producto de condensación de óxido de propileno y etilendiamina, alcoholes alifáticos con 8 a 22 átomos de carbono, y amidas de ácidos grasos.

4. Detergentes no iónicos, tales como óxidos de amina, óxidos de fosfina y sulfóxidos, con características semipolares. Los ejemplos específicos de óxidos de amina terciaria de cadena larga incluyen óxido de dimetildodecilamina y bis-(2-hidroxietiI)dodecilamina. En la Patente de los Estados Unidos nº 3.304.263 que se concedió el 14 de febrero de 1967 se encuentran ejemplos específicos de óxidos de fosfina e incluyen óxido de dimetildodecilfosfina y óxido de dimetil-(2-hidroxidodecil)fosfina.

5. Sulfóxidos de cadena larga, que incluyen aquellos correspondientes a la fórmula R^{1}-SO-R^{2} en los que R^{1} y R^{2} son radicales alquilo sustituidos o sin sustituir, el primero conteniendo de aproximadamente 10 a aproximadamente 28 átomos de carbono, mientras que R^{2} contiene de 1 a 3 átomos de carbono. Los ejemplos específicos de estos sulfóxidos incluyen el dodecilmetilsulfóxido y 3-hidroxitridecilmetilsulfóxido.

6. Detergentes anfolíticos sintéticos, tales como el 3-dodecilamino-propionato de sodio y el 3-dodecilaminopropanosulfonato de sodio.

7. Detergentes dipolares sintéticos, tales como el propano-1-sulfonato de 3-(N,N-dimetil-N-hexadecilamonio) y el 2-hidroxipropano-1-sulfonato de 3-(N,N-dimetil-N-hexadecilamonio).

Además, se pueden usar todos los siguientes emulsionantes en una composición de la presente invención: (a) jabones (es decir, sales alcalinas) de ácidos grasos, ácidos rosínicos, y aceite de sebo; (b) sulfonatos de alquilareno; (c) sulfatos de alquilo, incluidos los tensioactivos con grupos hidrófobos de cadena lineal y cadena ramificada, así como grupos sulfato primario y secundario; (d) sulfatos y sulfonatos que contienen un conector intermedio entre los grupos hidrófobos e hidrófilos, tales como las metiltauridas aciladas grasas y los monoglicéridos grasos sulfatados; (e) ésteres de ácidos de cadena larga de polietilenglicol, especialmente los ésteres de aceite de sebo; (f) polietilenglicoléteres de alquilfenoles; (g) polietilenglicoléteres de alcoholes de cadena larga y mercaptanos; y (h) dietanolamidas grasas de acilo. Aunque los tensioactivos se pueden clasificar de más de una manera, una variedad de clases de tensioactivos expuestos en este párrafo solapan con las clases de tensioactivos previamente descritas.

Existe una serie de emulsionantes diseñados específicamente y que se usan en situaciones biológicas. Por ejemplo, una serie de detergentes biológicos (tensioactivos) se enumeran tal como por Sigma Chemical Company en las páginas 310 a 316 de su Catálogo de Compuestos Orgánicos y Bioquímicos de 1987. Tales tensioactivos se dividen en cuatro tipos básicos: aniónicos, catiónicos, dipolares y no iónicos. Los ejemplos de detergentes aniónicos incluyen el ácido algínico, el ácido caprílico, el ácido cólico, el ácido 1-decanosulfónico, el ácido deoxicólico, el ácido 1-dodecanosulfónico, la N-lauroilsarcosina y el ácido taurocólico. Los detergentes catiónicos incluyen el bromuro de dodeciltrimetilamonio, el cloruro de benzalconio, el cloruro de bencildimetilhexadecilamonio, el cloruro de cetilpiridinio, el cloruro de metilbencetonio y el dodecilsulfato de 4-picolina. Los ejemplos de detergentes dipolares incluyen el 3-[(3-colamidopropil)-dimetiIamonio]-1-propanosulfonato (abreviado comúnmente como CHAPS), 3-[(colamidopropil)-dirnetilamonio]-2-hidroxi-1-propanosulfonato (abreviado generalmente como CHAPSO) N-dodecil-N,N-dimetil-3-amonio-1-propanosulfonato, y liso-\alpha-fosfatidilcolina. Los ejemplos de detergentes no iónicos incluyen decanoil-N-metilglucamida, monopentiléter de dietilenglicol, \beta-D-glucopiranósido de n-dodecilo, condensados de óxido de etileno de alcoholes grasos (por ejemplo, comercializado bajo el nombre registrado de Lubrol), éteres de ácidos grasos polioxietilenados (en concreto ácidos grasos de C_{12}-C_{20}), éteres de sorbitán de ácidos grasos polioxietilenados (por ejemplo, comercializado bajo el nombre registrado de Tween), y éteres de sorbitán de ácidos grasos (por ejemplo, comercializado bajo el nombre registrado de Span).

Un grupo particularmente útil de tensioactivos son los tensioactivos no iónicos basados en sorbitán. Estos tensioactivos se preparan por deshidratación del sorbitol para dar 1,4-sorbitán, que reacciona después con uno o más equivalentes de un ácido graso. El resto sustituido por un ácido graso puede reaccionar además con óxido de etileno para dar un segundo grupo de tensioactivos.

Los tensioactivos de sorbitán sustituidos con ácidos grasos se preparar haciendo reaccionar 1,4-sorbitán con un ácido graso tal como el ácido laúrico, el ácido palmítico, el ácido esteárico, el ácido oleico, o un ácido graso similar de cadena larga, para dar el mono-éster de 1,4-sorbitán, el sesquiéster de 1,g-sorbitán o el triéster de 1,4-sorbitán. Los nombres comunes para estos tensioactivos incluyen, por ejemplo, el monolaurato de sorbitán, el monopalmitato de sorbitán, el monoestearato de sorbitán, el monooleato de sorbitán, el sesquioleato de sorbitán y el trioleato de sorbitán. Estos tensioactivos están disponibles comercialmente con el nombre SPAN® o ARLACEL®, habitualmente con una letra o un número de designación que distingue entre los diversos mono-, di- y triésteres sustituidos de sorbitán.

Los tensioactivos SPAN® y ARLACEL® son hidrófilos y generalmente son solubles o dispersables en aceite. También son solubles en la mayoría de los disolventes orgánicos. Por lo general son insolubles, pero dispersables en agua. Generalmente estos tensioactivos tendrán un índice de equilibrio hidrófilo-lipófilo (HLB) entre 1,8 a 8,6. Tales tensioactivos se pueden preparar fácilmente por medios conocidos en la técnica o están disponibles comercialmente en, por ejemplo, ICI America's Inc., Wilmington, DE con la marca registrada ATLAS®.

Un grupo relacionado de tensioactivos comprende los monoésteres polioxietileno sorbitán y los triésteres polioxietileno sorbitán. Estos materiales se preparan mediante la adición de óxido de etileno a un monoéster o triéster de 1,4-sorbitán. La adición de polioxietileno convierte el tensioactivo lipófilo mono- o triéster de sorbitán en un tensioactivo hidrófilo generalmente soluble en aceite, dispersable en agua y soluble en distintos grados en líquidos orgánicos.

Estos materiales, disponibles comercialmente con la marca TWEEN®, son útiles para preparar emulsiones y dispersiones de aceite en agua o para la solubilización de aceites y preparación de pomadas anhidras hidrosolubles o lavables. Los tensioactivos TWEEN® se pueden combinar con tensioactivos relacionados monoéster o triéster de sorbitán para promover la estabilidad de la emulsión. Los tensioactivos TWEEN® tienen por lo general un valor HLB que ascienda de 9,6 a 16,7.

Un tercer grupo de tensioactivos no iónicos que se podría usar solo o en combinación con los tensioactivos SPAN®, ARLACEL® y TWEEN® son los ácidos grasos de polioxietileno preparados mediante la reacción de óxido de etileno con un ácido graso de cadena larga. El tensioactivo más comúnmente disponible de este tipo se comercializa con el nombre MYRJ® y es un derivado de polioxietileno del ácido esteárico. Los tensioactivos MYRJ® son hidrófilos y solubles o dispersables en agua como los tensioactivos TWEEN®. Los tensioactivos MYRJ® se pueden mezclar con tensioactivos TWEEN®, o con las mezclas de tensioactivos TWEEN®/SPAN® o ARLACEL® para su uso en la formación de emulsiones. Los tensioactivos MYRJ® se pueden preparar mediante procedimientos conocidos en la técnica o están disponibles comercialmente en ICI America's Inc.

Un cuarto grupo de tensioactivos no iónicos basados en polioxietileno son los éteres de ácidos grasos polioxietilenados derivados de los alcoholes laurílico, acetílico, estearílico y oleílico. Estos materiales se preparan como antes mediante la adición de óxido de etileno a un alcohol graso. El nombre comercial para estos tensioactivos es BRIJ®. Los tensioactivos BRIJ® pueden ser hidrófilos o lipófilos dependiendo del tamaño del resto polioxietileno en el tensioactivo. Aunque la preparación de estos compuestos está disponible en la técnica, también es fácilmente disponible de fuentes comerciales tales como ICI America's Inc.

Otros tensioactivos no iónicos que potencialmente se podrían usar en la práctica de esta invención son por ejemplo: polioxietileno, los ésteres poliólicos de ácidos grasos, éter de polioxietileno, éteres grasos de polioxipropileno, derivados de cera de abejas que contienen polioxietileno, el derivado lanolínico de polioxietileno, el glicérido graso polioxietilenado, los ésteres de glicerol e ácidos grasos u otros derivados éter o alcohol ácido polioxietileno de ácidos grasos de cadena larga de 12 a 22 átomos de carbono.

Como las composiciones inmunógenas de esta invención pretender ser sistemas multifásicos, es preferible elegir un tensioactivo no iónico que forme emulsión, y que tenga un valor HLB en el intervalo de aproximadamente 7 a 16. Este valor se puede obtener mediante el uso de un único tensioactivo no iónico tal como el tensioactivo TWEEN® o se puede conseguir mediante el uso de una mezcla de tensioactivos tales como un tensioactivo basado en un mono, di- o triéster de sorbitán; un éster de sorbitán de ácido graso polioxietilenado; un éster de sorbitán en combinación con un tensioactivo derivado lanolínico del polioxietileno; un tensioactivo de éster de sorbitán en combinación con un tensioactivo de éter graso polioxietilenado con elevado HLB; o un tensioactivo de éter graso de polietileno o de sorbitán de ácido graso polioxietilenado.

Se prefiere más el uso de un único tensioactivo no iónico, más concretamente un tensioactivo TWEEN®, como el tensioactivo no iónico que estabiliza la emulsión en la práctica de esta invención. El tensioactivo denominado TWEEN® 80, conocido igualmente como polisorbato 80 para el monooleato de sorbitán 20 polioxietilenado, es el más preferido de los tensioactivos anteriores.

La reducción suficiente del tamaño de gotícula se puede realizar de forma habitual presentando al tensioactivo en una cantidad del 0,02% al 2,5% en peso (p/p). Se prefiere una cantidad del 0,05% al 1% y se prefiere especialmente del 0,01 al 0,5%.

El modo con el que se consigue el tamaño de la gotícula de la invención no es importante para la práctica de la presente invención. Una manera con la que se pueden obtener gotículas de aceite por debajo del micrómetro se consigue mediante el uso de emulsionantes comerciales, tales como el número de modelo 110Y disponible en Microfluidics, Newton, MA. Los ejemplos de otros emulsionantes comerciales incluyen Gaulin modelo 30CD (Gaulin, Inc., Everett, MA) y Rainnie Minilab tipo 8.30H (Miro Atomizer Food y Dairy, Inc., Hudson, WI). Estos emulsionantes funcionaban mediante el principio de elevadas fuerzas de cizalla desarrolladas al forzar los fluidos a través de pequeñas aberturas a presión elevada. Cuando el modelo 110Y funciona a 34,5 - 206,8 MPa, se proporcionan gotículas de aceite con diámetros de 100 a 750 nm.

El tamaño de las gotículas de aceite se puede modificar: cambiando la relación de detergente a aceite (aumentando la proporción disminuye el tamaño de gotícula, trabajando a presión (aumentando la presión operativa se reduce el tamaño de gotícula), a temperatura (aumentando la temperatura disminuye el tamaño de gotícula), y añadiendo un agente inmunoestimulante anfipático (añadiendo tales agentes disminuye el tamaño de gotícula). El tamaño real de gotícula oscilará con el particular detergente, aceite, y agente inmunoestimulante (si lo hubiera) particulares y con las condiciones particulares operativas seleccionadas. El tamaño de la gotícula se puede verificar mediante el uso de instrumentos de medición, tales como el analizador comercial de partículas sub-micrómetricas (Model N4MD) fabricado por Coulter Corporation, y se pueden variar los parámetros usando las directrices expuestas anteriormente hasta que prácticamente todas las gotículas se menores de 1 micrómetro de diámetro, preferiblemente menores de 0,8 micrómetros de diámetro, y lo más preferiblemente menores de 0,5 micrómetros de diámetro. Por prácticamente todas se entiende al menos aproximadamente el 80% (en número), preferiblemente al menos aproximadamente el 90%, más preferiblemente al menos aproximadamente el 95%, y lo más preferiblemente al menos aproximadamente el 98%. La distribución de tamaño de partícula es típicamente gausiana, de modo que el diámetro promedio es menor que los límites establecidos.

La presente invención se practica preparando una emulsión de aceite en ausencia de otros componentes previamente mostrados en la técnica anterior para ser usados con emulsiones submicrométricas para una inmunogenicidad satisfactoria, denominados polímeros bloque de polioxipropileno-polioxietileno tales como los descritos para su uso con adyuvantes en las Patentes de los Estados Unidos nº 4.772.466 y 4.770.874 y en el documento EP-A2-0315153.

Una composición inmunógena de la invención comprende un aceite metabolizable en agua y un emulsionante distinto de un copolímero de POP-POE. El emulsionante no necesita tener cualquier actividad inmunoestimulante, ya que la composición de aceite por sí mismo puede funcionar como adyuvante cuando las gotículas de aceite están en los límites por debajo del micrómetro. Sin embargo, se puede proporcionar una actividad inmunoestimulante aumentada incluyendo cualquiera de los agentes inmunoestimulantes conocidos en la composición. Estos agentes inmunoestimulantes se pueden separar del emulsionante y del aceite o el agente inmunoestimulante y el emulsionante pueden ser una y la misma molécula. Los ejemplos de la primera situación incluyen aceites metabolizables mezclados con micobacterias muertas, tales como Mycobacterium tuberculosis, y componentes subcelulares de las mismas. Más substancias inmunoestimulantes incluyen los péptidos muramilo que son componentes de las paredes celulares de tales bacterias, e incluyen a los derivados de las mismas. Los ejemplos de la mezcla de emulsionante/agente inmunoestimulante son los péptidos muramilo lipófilos descritos en Sánchez-Pescador et al., J. Immunol., 1988, 141, 1720-1727. Estos materiales comprenden el N-acetilpéptido muramilo básico (un resto hidrófilo) que actúa como grupo inmunoestimulante, pero también incluyen un resto lipófilo que proporcione características tensioactivas al compuesto resultante. Tales compuestos, así como otros tipos de sustancias inmunoestimulantes anfipáticas actúan tanto como agentes inmunoestimulantes como emulsionantes y se prefieren en la práctica de la presente invención. Además, también es posible realizar la presente invención usando una sustancia inmunoestimulante anfipática en combinación con una segunda sustancia inmunoestimulante que no sea anfipática. Un ejemplo sería el uso de un péptido muramilo lipófilo en combinación con un dipéptido muramilo esencialmente sin sustituir (es decir, esencialmente hidrófilo).

Una emulsión de gotículas de aceite preferida es MF59. MF59 se puede preparar de acuerdo con los procedimientos descritos en, por ejemplo, Otter al., Vaccine Design: The Subunit and Adyuvant Approach, 1995, M. F. Powell y M.J. Newman, Editores, Plenum Press, Nueva York, págs. 277-296; Singh et al., Vaccine, 1998, 16, 1822-1827; Ott et al., Vaccine, 1995, 13, 1557-1562; y Valensi et al., J. Immunol, 1994, 153, 4029-39.

Los animales se pueden inyectar con las diversas composiciones adyuvantes/inmunógenas, por vías intraperitoneal, intramuscular o subcutánea.

Las composiciones de una composición inmunógena de la invención emplearán una cantidad eficaz de un antígeno. Es decir, incluirán una cantidad de antígeno que, en combinación con el adyuvante, causará que el sujeto produzca una respuesta específica y suficiente, preferiblemente una respuesta de linfocitos T, para dar protección al sujeto frente a una posterior exposición a Neisseria.

No se puede asignar una designación de dosis única que proporcione una orientación específica para todos y cada uno de los antígenos que se puedan emplear en esta invención. La cantidad eficaz de antígeno será una función de su actividad inherente y pureza y se determina empíricamente por aquellos de la experiencia habitual en la técnica mediante experimentación rutinaria. Se prevé que las composiciones adyuvantes de esta invención se puedan usar junto a composiciones inmunógenas de célula entera o víricas así como con antígenos purificados o subunidades de proteínas o composiciones peptídicas inmunógenas preparadas mediante técnicas de ADN recombinante o síntesis. Aunque las composiciones adyuvantes de la invención son estables, el antígeno y la emulsión se pueden mezclar mediante agitación simple. Otras técnicas, tales como el paso de una mezcla del adyuvante y una disolución o suspensión del antígeno rápidamente a través de una pequeña abertura (tal como una aguja hipodérmica) proporciona fácilmente una composición inmunógena útil.

El adyuvante y las composiciones inmunógenas de acuerdo con la presente invención comprenden aproximadamente 1 nanogramo a aproximadamente 1000 microgramos de ácido nucleico, preferiblemente ADN tal como, por ejemplo, oligonucleótidos CG. En algunas realizaciones preferidas, las composiciones inmunógenas contienen aproximadamente 10 nanogramos a aproximadamente 800 microgramos de ácido nucleico. En algunas realizaciones preferidas, las composiciones inmunógenas contienen aproximadamente 0,1 a aproximadamente 500 microgramos de ácido nucleico de ácido nucleico. En algunas realizaciones preferidas, las composiciones inmunógenas contienen aproximadamente 1 a aproximadamente 350 microgramos de ácido nucleico. En algunas realizaciones preferidas, las composiciones inmunógenas contienen aproximadamente 25 a aproximadamente 250 microgramos de ácido nucleico. En algunas realizaciones preferidas, las composiciones inmunógenas contienen aproximadamente 100 microgramos de ácido nucleico. Alguien experto en la técnica puede formular fácilmente una composición inmunógena que comprende cualquier cantidad deseada de ácido nucleico. Las composiciones inmunógenas de acuerdo con la presente invención se suministran estériles y sin pirógenos. Las composiciones inmunógenas se pueden administrar de forma conveniente en forma de dosis unitaria y se pueden preparar por cualquiera de los procedimientos bien conocidos en la técnica farmacéutica, por ejemplo, como se describe en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., Easton, PA, 1980).

Las composiciones inmunógenas de acuerdo con la presente invención comprenden una cantidad inmunoestimuladora del antígeno de Neisseria. Una cantidad inmunoestimuladora es aquella cantidad que es suficiente para inducir una respuesta inmune humoral o celular mensurable. Por ejemplo, las composiciones inmunógenas de la presente invención comprenden aproximadamente 1 nanogramo a aproximadamente 1000 microgramos de antígeno o aproximadamente 10 nanogramos a aproximadamente 800 microgramos de antígeno. En algunas realizaciones preferidas, las composiciones inmunógenas contienen aproximadamente 0,1 a aproximadamente 500 microgramos de antígeno. En algunas realizaciones preferidas, las composiciones inmunógenas contienen aproximadamente 1 a aproximadamente 350 microgramos de antígeno. En algunas realizaciones preferidas, las composiciones inmunógenas contienen aproximadamente 25 a aproximadamente 250 microgramos de antígeno. En algunas realizaciones preferidas, las composiciones inmunógenas contienen aproximadamente 100 microgramos de antígeno. Alguien experto en la técnica puede formular fácilmente una composición inmunógena que comprende cualquier cantidad deseada de antígeno, que se puede determinar empíricamente por aquellos de la experiencia habitual en la técnica mediante la experimentación rutinaria. Las composiciones inmunógenas se pueden administrar de forma conveniente en forma de dosis unitaria y se pueden preparar por cualquiera de los procedimientos bien conocidos en la técnica farmacéutica, por ejemplo, como se describe en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., Easton, PA, l980) La presente invención también se dirige a una composición de vacuna que comprende un adyuvante, como se ha descrito antes, con un oligonucleótido CG, como se ha descrito antes, en combinación con a antígeno de Neisseria, como se ha descrito antes. Tales composiciones de vacunas, tal como la composición de vacuna mostrada en los ejemplos, provoca una respuesta inmune humoral que es bactericida.

La presente invención también se dirige a procedimientos para estimular una respuesta inmune en un animal huésped que comprende la administración al animal de una composición inmunógena descrita anteriormente en una cantidad eficaz para inducir una respuesta inmune. El animal huésped es preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un humano. Las vías preferidas de administración incluyen, pero no se limitan a, intramuscular, intraperitoneal, intradermal, subcutánea, intravenosa, intraarterial, intraocular y oral así como transdérmica o por inhalación o supositorio. Las vías de administración más preferidas incluyen intramuscular, intraperitoneal, intradérmica e inyección subcutánea. De acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención, la composición inmunógena se administra a un animal huésped usando una dispositivo de inyección sin aguja, que se conocen bien y están disponibles extensamente. Alguien con experiencia habitual en la técnica puede usar, siguiendo las instrucciones de la presente memoria, los dispositivos de inyección sin aguja para administrar las composiciones inmunógenas a las célula de un individuo.

La presente invención también se dirige a procedimientos para inmunizar un animal huésped frente a o para tratar un animal huésped con una infección por Neisseria que comprende la administración al animal de una composición inmunógena o de vacuna descrita en la presente memoria en una cantidad eficaz para inducir una respuesta protectora. El animal huésped es preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un humano. Las vías de administración preferidas se describen en la presente memoria.

Modos para realizar la invención

La invención se ilustra además a modo de los siguientes ejemplos que pretenden elucidar la invención. Los ejemplos anteriores están propuestos para ilustrar la invención y se interpretarán por limitar de ningún modo la invención.

Ejemplo 1 Preparación de composiciones adyuvantes

El MTP-PE fue suministrado por CIBA-GEIGY (Basilea, Suiza). El escualeno y TWEEN® 80 se obtuvieron de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). El CFA y el IFA se obtuvieron de Gibco (Grand Island, NY). El hidróxido de aluminio (Rehsorptar) se obtuvo de Reheis Chemical Co. (Berkeley Heights NJ).

La preparación de emulsión de gotículas de aceites se realizó mediante una serie de procedimientos. En el primer procedimiento, se pasó 6 veces una mezcla constituida por 4% de escualeno, 0,008% de TWEEN® 80, 250 \mug/ml de MTP-PE y el antígeno en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a través de una aguja de 0,61 mm. Esta emulsión compuesta por tamaños de gotícula de aceite en el intervalo de 10 micrómetros y se denomina MTP-PE-LO. El segundo procedimiento comprende pasar la mezcla antes descrita a través de un emulsionante Kirkland cinco veces. Esta emulsión consta de gotículas de aceite principalmente de 1 a 2 micrómetros y se denomina MTP-PE-LO-KE. El emulsionante Kirkland (Kirkland Products, Walnut Creek, CA) es una versión a pequeña escala del homogeneizador comercial de filo (por ejemplo, Gaulin modelo 30CD y Rainnie Minilab tipo 8.30H) que generan aproximadamente 6,9 MPa en la cámara de trabajo. En el tercer procedimiento, se pasaron mezclas que contenían 0,3-18% de escualeno y 0,2-1,0 mg/ml de MTP-PE con o sin TWEEN®80 a través del microfluidizador (modelo nº 110Y de Microfluidics, Newton, MA) a 34,5 - 206,8 MPa. Típicamente, se mezclaron 50 ml de emulsión durante 5 minutos o 100 ml durante 10 minutos en el microfluidizador. Las emulsiones resultantes estaban constituidas por gotículas de aceite de 100 a 750 nm dependiendo del escualeno, el MTP-PE y la concentración de detergente y la presión operativa del microfluidizador y temperatura. Estas composiciones se denominan MTP-PE-LO-
MF.

Ejemplo 2 Preparación de antígenos

El gen que codifica el antígeno 919 de MenB se amplificó a partir del de ADN cromosómico de MenB usando los siguientes cebadores: cebador sentido 5'-cgcggatcccatatgtgccaaagcaagagcatc-3' (ID SEC Nº:28), cebador antisentido 5'-cccgctcgagcgggcggtattcggg-3' (ID SEC Nº:29).

Tras la amplificación, el producto de PCR se eluyó de un gel de agarosa y se digirió 1 \mug de ADN con las enzimas de restricción NdeI y XhoI que cortan en el extremo 5' y en el extremo 3' del fragmento amplificado, respectivamente. Tras la digestión, el fragmento se purificó usando el kit de purificación QIAquick (Qiagen) y se ligó al plásmido pET (Novagen), cortado previamente con Ndel y Xhol. La mezcla de ligación se usó para transformar células E. coli DH5 y las colonias que portaban los plásmidos recombinantes se seleccionar sobre placas que contenían ampicilina. A partir de un clon positivo, se preparó el plásmido, denominado pET-919, usando el kit de preparación de plásmidos de Qiagen y se usó el plásmido para transformar células E. coli BL21-DE3.

La cepa E. coli BL21-DE3 (pGEX-919) se creció a 30ºC en 500 ml de LB suplementado con 100 \mug de ampicilina. Cuando se alcanzó un valor DO_{600} de 0,5, el cultivo se suplementó con IPTG 1 mM y se cultivó durante 3 horas más. Las células se recogieron por centrifugación y se disgregaron en 7,5 ml de tampón imidazol enfriado con hielo (NaCl 300 mM, tampón fosfato 50 mM, imidazol 10 mM, pH 8) mediante sonicación en hielo usando un sonicador Branson B-15. Después de la separación de los residuos celulares por centrifugación, el sobrenadante se mezcló con 1 ml de resina-Ni^{2+} (Pharmacia) y se mantuvo a temperatura ambiente durante 30 minutos. La resina se recogió por centrifugación, se lavó con 10 ml de tampón imidazol enfriado con hielo 10 mM y se cargó sobre una columna pequeña desechable. La columna se lavó después con 10 ml de tampón imidazol 20 mM y finalmente la proteína se eluyó con tampón imidazol 250 mM. La proteína se dializó en PBS y se almacenó a -20ºC.

La secuencia de nucleótidos (ID SEC Nº:30) de 919 de MenB se muestra a continuación:

1

Se comprenderá que "y" es una "c" o una "t".

La secuencia de aminoácidos (ID SEC Nº:31) del péptido 919 de MenB péptido se muestra a continuación:

2

Ejemplo 3 Inmunización

A grupos de 4 ratones CD1 se les administró una de las 5 formulaciones de vacuna (mostrada a continuación en la tabla 1). Las vacunas se formularon mezclando 75 \mul de la preparación de proteína (20 \mug de proteína) con 75 \mul del adyuvante específico. Cuando se usa alumbre, se emplearon 150 \mul de una disolución que contenía 20 \mug de proteína y alumbre a una concentración final de 1 mg/ml. Finalmente, en el caso de la formulación de 919-oligo CpG-CFA, se mezclaron 20 \mug del oligodesoxinucleótido fosforotioato (Oligos, Etcd. EEUU) con la secuencia: 5'-tccatgacgttcctgacgtt-3' (ID SEC Nº:1) con 20 \mug de proteína en un volumen final de 75 \mul de CFA antes de la inmunización. Las vacunas se administraron por vía intraperitoneal en el día 1 y el día 21 y se tomaron muestras de suero 15 días después de cada inyección.

Ejemplo 4 Ensayo ELISA

Se recogieron las células MenB M7 por centrifugación de 7 ml de un cultivo líquido con un valor DO_{620} de 0,4. Las células se lavaron una vez en PBS y luego se resuspendieron en PBS conteniendo 0,025% de formaldehído. Después de 2 horas de incubación a temperatura ambiente y posterior incubación a 4ºC durante la noche, las células se dispensaron en placas Greiner de 96 pocillos (100 \mul/pocillo) y se mantuvieron durante la noche a 4ºC. Los pocillos se lavaron luego tres veces con PBT (Tween 20 al 0,1% en PBS) antes de añadir 200 \mul de tampón de saturación (polivinilpirrolidona 10 al 2,7% en agua). Después de lavar con PBT, se añadieron a cada pocillo 200 \mul de sueros diluidos (tampón de dilución: BSA al 1%, Tween 20 al 0,1%, NaN_{3} al 0,1% en PBS) y se incubaron las placas durante 90 minutos a 37ºC. Tras el lavado, se añadieron a cada pocillo 100 \mul de suero de conejo anti-ratón conjugado con HRP (Dako) diluido 1:2000 en tampón de dilución y se incubaron las placas durante 90 minutos a 37ºC. Los pocillos se lavaron tres veces con tampón PBT, se añadieron a cada pocillo 100 \mul de tampón sustrato para HRP (25 ml de tampón citrato pH 5,0, 10 mg de O-fenildiamina, 10 \mul de H_{2}O_{2}) y las placas se mantuvieron a temperatura ambiente durante 20 minutos. Finalmente, se añadieron a cada pocillo 100 \mul de H_{2}SO_{3} y se obtuvieron los valores DO_{490}. Los valores de ELISA se determinaron arbitrariamente as la dilución de suero que dio una D.O. de 0,4. Los valores de ELISA de la mezcla de sueros de cada pauta de inmunización se muestran a continuación en la tabla 1. Como se muestra, los valores más altos de anticuerpo después de 1 dosis de vacuna fueron 919-IFA y 919-CFA-oligo, dando el último unos valores dos veces más altos que 919-IFA. Además, 919-CFA-oligo dio lugar a una mayor respuesta que la respuesta con 919-CFA solo. Mientras que el valor de anticuerpo se medía, se esperaba igualmente que la respuesta fuera mayor que la del 919-oligo solo. Tras la segunda dosis, 919-CFA-oligo volvió a ser la mejor formulación, dando valores de anticuerpos de casi 1 orden de magnitud mayor que cualquier otra formulación usada.

TABLA 1 Valores de ELISA usando el antígeno 919 con diferentes formulaciones de adyuvante

3

Ejemplo 5 Ensayo bactericida

La cepa MenB 2996 se creció en cultivo líquido (caldo Muller-Hinton) hasta que se alcanzó un valor DO_{620} de 0,5-0,8. Luego se recogieron las células por centrifugación y se resuspendieron en tampón de Gey con BSA al 1% (Gibco) obteniendo una suspensión con un valor DO_{620} de 0,5. Por último, la suspensión se diluyó 1:20,000 en tampón de Gey con BSA al 1% y se almacenó a 25ºC. Para el ensayo bactericida, se añadieron a cada pocillo 50 \mul de tampón de Gey conteniendo BSA al 1% junto con 25 \mul de suero diluido de ratón (tampón de dilución: tampón de Gey con BSA al 1%), 25 \mul de suspensión bacteriana y \mul de complemento de cría de conejo normal o inactivado por calor (56ºC durante 30 minutos). Inmediatamente después de la adición del complemento de cría de conejo, se sembraron 22 \mul de cada muestra sobre placas de agar Muller-Hinton y luego se incubaron las placas de 96 pocillos a 37ºC con rotación. Se sembraron muestras de 22 \mul de cada pocillo como antes después de 1 hora de incubación. La tasa de crecimiento de MenB se duplicó en dos horas aproximadamente.

La actividad bactericida de las mezclas de sueros de cada grupo se dan en la tabla 2. Las placas se mantuvieron a 37ºC hasta que las colonias se hicieron visibles. El número de colonias bacterianas de MenB se contó a tiempo 0 y una hora después. La mejor actividad bactericida se encontró en los sueros de ratones inmunizados con la formulación 919-CFA-oligo, que dio una actividad bactericida de al menos 2 veces mayor que otras formulaciones usadas, incluida 919-CFA. Además, 919-CFA-oligo dio lugar a una mayor respuesta que la respuesta 919-CFA solo. Conforme se medía el valor de anticuerpo, se esperaba igualmente que la respuesta fuera mayor que la del 919-oligo solo.

TABLA 2 Actividad bactericida del antígeno 919 usando diferentes formulaciones de adyuvante

4

Ejemplo 6 Antígenos adicionales

Además de o en lugar del antígeno "919" usado en los ejemplos anteriores, las composiciones de la invención pueden comprender uno o más de los siguientes antígenos de proteína:

\bullet una proteína descrita en el documento WO99/57280, o un fragmento inmunógeno de la misma;

\bullet una proteína descrita en el documento WO99/36544, o un fragmento inmunógeno de la misma;

\bullet una proteína descrita en el documento WO99/24578, o un fragmento inmunógeno de la misma;

\bullet una proteína descrita en el documento WO97/28273, o un fragmento inmunógeno de la misma;

\bullet una proteína descrita en el documento WO96/29412, o un fragmento inmunógeno de la misma;

\bullet una proteína descrita en el documento WO95/03413, o un fragmento inmunógeno de la misma;

\bullet una proteína descrita en el documento WO99/31132, o un fragmento inmunógeno de la misma;

\bullet una proteína descrita en el documento WO99/55873, o un fragmento inmunógeno de la misma; y/o

\bullet una proteína descrita en el documento GB-9928197.4, o un fragmento inmunógeno de la misma.

Si la composición comprende una proteína descrita en el documento WO99/24578, dicha proteína comprende preferiblemente una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las ID SEC 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 406, 408, 410, 412, 414, 416, 418, 420, 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436, 438, 440, 442, 444, 446, 448, 450, 452, 454, 456, 458, 460, 462, 464, 466, 468, 470, 472, 474, 476, 478, 480, 482, 484, 486, 488, 490, 492, 494, 496, 498, 500, 502, 504, 506, 508, 510, 512, 514, 516, 518, 520, 522, 524, 526, 528, 530, 532, 534, 536, 538, 540, 542, 544, 546, 548, 550, 552, 554, 556, 558, 560, 562, 564, 566, 568, 570, 572, 574, 576, 578, 580, 582, 584, 586, 588, 590, 592, 594, 596, 598, 600, 602, 604, 606, 608, 610, 612, 614, 616, 618, 620, 622, 624, 626, 628, 630, 632, 634, 636, 638, 640, 642, 644, 646, 648, 650, 652, 654, 656, 658, 660, 662, 664, 666, 668, 670, 672, 674, 676, 678, 680, 682, 684, 686, 688, 690, 692, 694, 696, 698, 700, 702, 704, 706, 70S, 710, 712, 714, 716, 718, 720, 722, 724, 726, 728, 730, 732, 734, 736, 738, 740, 742, 744, 746, 748, 750, 752, 754, 756, 758, 760, 762, 764, 766, 768, 770, 772, 774, 776, 778, 780, 782, 784, 786, 788, 790, 792, 794, 796, 798, 800, 802, 804, 806, 808, 810, 812, 814, 816, 818, 820, 822, 824, 826, 828, 830, 832, 834, 836, 838, 840, 842, 844, 846, 848, 850, 852, 854, 856, 858, 860, 862, 864, 866, 868, 870, 872, 874, 876, 878, 880, 882, 884, 886, 888, 890 y 892, como se describen en el documento WO99/24578 (o una proteína que comprende un fragmento inmunógeno de una o más de estas ID SEC, o una proteína que comprende una secuencia con una identidad de secuencia (preferiblemente mayor del 50%, por ejemplo 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o más) con una de estas ID SEC).

Si la composición comprende una proteína descrita en el documento WO99/36544, dicha proteína comprende preferiblemente una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las ID SEC 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, y 90, como se describen en el documento WO99/36544 (o una proteína que comprende un fragmento inmunógeno de una o más de estas ID SEC, o una proteína que comprende una secuencia con una identidad de secuencia (preferiblemente mayor del 50%, por ejemplo 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o más) con una de estas ID SEC).

Si la composición comprende una proteína descrita en el documento WO99/57280, dicha proteína comprende preferiblemente una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las ID SEC 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 406, 408, 410, 412, 414, 416, 418, 420, 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436, 438, 440, 442, 444, 446, 448, 450, 452, 454, 456, 458, 460, 462, 464, 466, 468, 470, 472, 474, 476, 478, 480, 482, 484, 486, 488, 490, 492, 494, 496, 498, 500, 502, 504, 506, 508, 510, 512, 514, 516, 518, 520, 522, 524, 526, 528, 530, 532, 534, 536, 538, 540, 542, 544, 546, 548, 550, 552, 554, 556, 558, 560, 562, 564, 566, 568, 570, 572, 574, 576, 578, 580, 582, 584, 586, 588, 590, 592, 594, 596, 598, 600, 602, 604, 606, 608, 610, 612, 614, 616, 618, 620, 622, 624, 626, 628, 630, 632, 634, 636, 638, 640, 642, 644, 646, 648, 650, 652, 654, 656, 658, 660, 662, 664, 666, 668, 670, 672, 674, 676, 678, 680, 682, 684, 686, 688, 690, 692, 694, 696, 698, 700, 702, 704, 706, 708, 710, 712, 714, 716, 718, 720, 722, 724, 726, 728, 730, 732, 734, 736, 738, 740, 742, 744, 746, 748, 750, 752, 754, 756, 758, 760, 762, 764, 766, 768, 770, 772, 774, 776, 778, 780, 782, 784, 786, 788, 790, 792, 794, 796, 798, 800, 802, 804, 806, 808, 810, 812, 814, 816, 818, 820, 822, 824, 826, 828, 830, 832, 834, 836, 838, 840, 842, 844, 846, 848, 850, 852, 854, 856, 858, 860, 862, 864, 866, 868, 870, 872, 874, 876, 878, 880, 882, 884, 886, 888, 890, 892, 894, 896, 898, 900, 902, 904, 906, 908, 910, 912, 914, 916, 918, 920, 922, 924, 926, 928, 930, 932, 934, 936, 938, 940, 942, 944, 946, 948, 950, 952, 954, 956, 958, 960, 962, 964, 966, 968, 970, 972, 974, 976, 978, 980, 982, 984, 986, 988, 990, 992, 994, 996, 998, 1000, 1002, 1004, 1006, 1008, 1010, 1012, 1014, 1016, 1018, 1020, 1022, 1024, 1026, 1028, 1030, 1032, 1034, 1036, 1038, 1040, 1042, 1044, 1046, 1048, 1050, 1052, 1054, 1056, 1058, 1060, 1062, 1064, 1066, 1068, 1070, 1072, 1074, 1076, 1078, 1080, 1082, 1084, 1086, 1088, 1090, 1092, 1094, 1096, 1098, 1100, 1102, 1104, 1106, 1108, 1110, 1112, 1114, 1116, 1118, 1120, 1122, 1124, 1126, 1128, 1130, 1132, 1134, 1136, 1138, 1140, 1142, 1144, 1146, 1148, 1150, 1152, 1154, 1156, 1158, 1160, 1162, 1164, 1166, 1168, 1170, 1172, 1174, 1176, 1178, 1180, 1182, 1184, 1186, 1188, 1190, 1192, 1194, 1196, 1198, 1200, 1202, 1204, 1206, 1208, 1210, 1212, 1214, 1216, 1218, 1220, 1222, 1224, 1226, 1228, 1230, 1232, 1234, 1236, 1238, 1240, 1242, 1244, 1246, 1248, 1250, 1252, 1254, 1256, 1258, 1260, 1262, 1264, 1266, 1268, 1270, 1272, 1274, 1276, 1278, 1280, 1282, 1284, 1286, 1288, 1290, 1292, 1294, 1296, 1298, 1300, 1302, 1304, 1306, 1308, 1310, 1312, 1314, 1316, 1318, 1320, 1322, 1324, 1326, 1328, 1330, 1332, 1334, 1336, 1338, 1340, 1342, 1344, 1346, 1348, 1350, 1352, 1354, 1356, 1358, 1360, 1362, 1364, 1366, 1368, 1370, 1372, 1374, 1376, 1378, 1380, 1382, 1384, 1386, 1388, 1390, 1392, 1394, 1396, 1398, 1400, 1402, 1404, 1406, 1408, 1410, 1412, 1414, 1416, 1418, 1420, 1422, 1424, 1426, 1428, 1430, 1432, 1434, 1436, 1438, 1440, 1442, 1444, 1446, 1448, 1450, 1452, 1454, 1456, 1458, 1460, 1462, 1464, 1466, 1468, 1470, 1472, 1474, 1476, 1478, 1480, 1482, 1484, 1486, 1488, 1490, 1492, 1494, 1496, 1498, 1500, 1502, 1504, 1506, 1508, 1510, 1512, 1514, 1516, 1518, 1520, 1522, 1524, 1526, 1528, 1530, 1532, 1534, 1536, 1538, 1540, 1542, 1544, 1546, 1548, 1550, 1552, 1554, 1556, 1558, 1560, 1562, 1564, 1566, 1568, 1570, 1572, 1574, 1576, 1578, 1580, 1582, 1584, 1586, 1588, 1590, 1592, 1594, 1596, 1598, 1600, 1602, 1604, 1606, 1608, 1610, 1612, 1614, 1616, 1618, 1620, 1622, 1624, 1626, 1628, 1630, 1632, 1634, 1636, 1638, 1640, 1642, 1644, 1646, 1648, 1650, 1652, 1654, 1656, 1658, 1660, 1662, 1664, 1666, 1668, 1670, 1672, 1674, 1676, 1678, 1680, 1682, 1684, 1686, 1688 1690, 1692, 1694, 1696, 1698, 1700, 1702, 1704, 1706, 1708, 1710, 1712, 1714, 1716, 1718, 1720, 1722, 1724, 1726, 1728, 1730, 1732, 1734, 1736, 1738, 1740, 1742, 1744, 1746, 1748, 1750, 1752, 1754, 1756, 1758, 1760, 1762, 1764, 1766, 1768, 1770, 1772, 1774, 1776, 1778, 1780, 1782, 1784, 1786, 1788, 1790, 1792, 1794, 1796, 1798, 1800, 1802, 1804, 1806, 1808, 1810, 1812, 1814, 1816, 1818, 1820, 1822, 1824, 1826, 1828, 1830, 1832, 1834, 1836, 1838, 1840, 1842, 1844, 1846, 1848, 1850, 1852, 1854, 1856, 1858, 1860, 1862, 1864, 1866, 1868, 1870, 1872, 1874, 1876, 1878, 1880, 1882, 1884, 1886, 1888, 1890, 1892, 1894, 1896, 1898, 1900, 1902, 1904, 1906, 1908, 1910, 1912, 1914, 1916, 1918, 1920, 1922, 1924, 1926, 1928, 1930, 1932, 1934, 1936, 1938, 1940, 1942, 1944, 1946, 1948, 1950, 1952, 1954, 1956, 1958, 1960, 1962, 1964, 1966, 1968, 1970, 1972, 1974, 1976, 1978, 1980, 1982, 1984, 1986, 1988, 1990, 1992, 1994, 1996, 1998, 2000, 2002, 2004, 2006, 2008, 2010, 2012, 2014, 2016, 2018, 2020, 2022, 2024, 2026, 2028, 2030, 2032, 2034, 2036, 2038, 2040, 2042, 2044, 2046, 2048, 2050, 2052, 2054, 2056, 2058, 2060, 2062, 2064, 2066, 2068, 2070, 2072, 2074, 2076, 2078, 2080, 2082, 2084, 2086, 2088, 2090, 2092, 2094, 2096, 2098, 2100, 2102, 2104, 2106, 2108, 2110, 2112, 2114, 2116, 2118, 2120, 2122, 2124, 2126, 2128, 2130, 2132, 2134, 2136, 2138, 2140, 2142, 2144, 2146, 2148, 2150, 2152, 2154, 2156, 2158, 2160, 2162, 2164, 2166, 2168, 2170, 2172, 2174, 2176, 2178, 2180, 2182, 2184, 2186, 2188, 2190, 2192, 2194, 2196, 2198, 2200, 2202, 2204, 2206, 2208, 2210, 2212, 2214, 2216, 2218, 2220, 2222, 2224, 2226, 2228, 2230, 2232, 2234, 2236, 2238, 2240, 2242, 2244, 2246, 2248, 2250, 2252, 2254, 2256, 2258, 2260, 2262, 2264, 2266, 2268, 2270, 2272, 2274, 2276, 2278, 2280, 2282, 2284, 2286, 2288, 2290, 2292, 2294, 2296, 2298, 2300, 2302, 2304, 2306, 2308, 2310, 2312, 2314, 2316, 2318, 2320, 2322, 2324, 2326, 2328, 2330, 2332, 2334, 2336, 2338, 2340, 2342, 2344, 2346, 2348, 2350, 2352, 2354, 2356, 2358, 2360, 2362, 2364, 2366, 2368, 2370, 2372, 2374, 2376, 2378, 2380, 2382, 2384, 2386, 2388, 2390, 2392, 2394, 2396, 2398, 2400, 2402, 2404, 2406, 2408, 2410, 2412, 2414, 2416, 2418, 2420, 2422, 2424, 2426, 2428, 2430, 2432, 2434, 2436, 2438, 2440, 2442, 2444, 2446, 2448, 2450, 2452, 2454, 2456, 2458, 2460, 2462, 2464, 2466, 2468, 2470, 2472, 2474, 2476, 2478, 2480, 2482, 2484, 2486, 2488, 2490, 2492, 2494, 2496, 2498, 2500, 2502, 2504, 2506, 2508, 2510, 2512, 2514, 2516, 2518, 2520, 2522, 2524, 2526, 2528, 2530, 2532, 2S34, 2536, 2538, 2540, 2542, 2544, 2546, 2548, 2550, 2552, 2554, 2556, 2558, 2560, 2562, 2564, 2566, 2568, 2570, 2572, 2574, 2576, 2578, 2580, 2582, 2584, 2586, 2588, 2590, 2592, 2594, 2596, 2598, 2600, 2602, 2604, 2606, 2608, 2610, 2612, 2614, 2616, 2618, 2620, 2622, 2624, 2626, 2628, 2630, 2632, 2634, 2636, 2638, 2640, 2642, 2644, 2646, 2648, 2650, 2652, 2654, 2656, 2658, 2660, 2662, 2664, 2666, 2668, 2670, 2672, 2674, 2676, 2678, 2680, 2682, 2684, 2686, 2688, 2690, 2692, 2694, 2696, 2698, 2700, 2702, 2704, 2706, 2708, 2710, 2712, 2714, 2716, 2718, 2720, 2722, 2724, 2726, 2728, 2730, 2732, 2734, 2736, 2738, 2740, 2742, 2744, 2746, 2748, 2750, 2752, 2754, 2756, 2758, 2760, 2762, 2764, 2766, 2768, 2770, 2772, 2774, 2776, 2778, 2780, 2782, 2784, 2786, 2788, 2790, 2792, 2794, 2796, 2798, 2800, 2802, 2804, 2806, 2808, 2810, 2812, 2814, 2816, 2818, 2820, 2822, 2824, 2826, 2828, 2830, 2832, 2834, 2836, 2838, 2840, 2842, 2844, 2846, 2848, 2850, 2852, 2854, 2856, 2858, 2860, 2862, 2864, 2866, 2868, 2870, 2872, 2874, 2876, 2878, 2880, 2882, 2884, 2886, 2888, 2890, 2892, 2894, 2896, 2898, 2900, 2902, 2904, 2906, 2908, 2910, 2912, 2914, 2916, 2918, 2920, 2922, 2924, 2926, 2928, 2930, 2932, 2934, 2936, 2938, 2940, 2942, 2944, 2946, 2948, 2950, 2952, 2954, 2956, 2958, 2960, 2962, 2964, 2966, 2968, 2970, 2972, 2974, 2976, 2978, 2980, 2982, 2984, 2986, 2988, 2990, 2992, 2994, 2996, 2998, 3000, 3002, 3004, 3006, 3008, 3010, 3012, 3014, 3016, 3018 y 3020, como se describen en el documento WO99/57280 (o una proteína que comprende un fragmento inmunógeno de una o más de estas ID SEC, o una proteína que comprende una secuencia con una identidad de secuencia (preferiblemente mayor del 50%, por ejemplo 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o más) con una de estas ID SEC).

Si la composición comprende una proteína descrita en el documento WO99/28273, dicha proteína es preferiblemente la proteína descrita en la figura 4 o la figura 13 del documento WO97/28273 (o una proteína que comprende un fragmento inmunógeno de la misma o una proteína que comprende una secuencia con una identidad de secuencia (preferiblemente mayor del 50%, por ejemplo 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o más) con ella).

Si la composición comprende una proteína descrita en el documento WO96/29412, dicha proteína comprende preferiblemente una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las ID SEC 1 a 8 descritas en el documento WO96/29412 (o una proteína que comprende un fragmento inmunógeno de una o más de estas ID SEC, o una proteína que comprende una secuencia con una identidad de secuencia (preferiblemente mayor del 50%, por ejemplo 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o más) con una de estas ID SEC).

Si la composición comprende una proteína descrita en el documento WO95/03413, dicha proteína comprende preferiblemente una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las ID SEC 1 a 23 descritas en el documento WO95/03413 (o una proteína que comprende un fragmento inmunógeno de una o más de estas ID SEC, o una proteína que comprende una secuencia con una identidad de secuencia (preferiblemente mayor del 50%, por ejemplo 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o más) con una de estas ID SEC).

Si la composición comprende una proteína descrita en el documento WO99/31132, dicha proteína comprende preferiblemente una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por la ID SEC 2 descrita en el documento WO99/31132 (o una proteína que comprende un fragmento inmunógeno de la ID SEC 2, o una proteína que comprende una secuencia con una identidad de secuencia (preferiblemente mayor del 50%, por ejemplo 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o más) con la ID SEC 2).

Si la composición comprende una proteína descrita en el documento WO99/55873, dicha proteína comprende preferiblemente una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por ID SEC 2 o la ID SEC 4 descritas en el documento WO99/55873 (o una proteína que comprende un fragmento inmunógeno de la ID SEC 2 o la ID SEC 4, o una proteína que comprende una secuencia con una identidad de secuencia (preferiblemente mayor del 50% por ejemplo 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o más) con la ID SEC 2 o la ID SEC 4).

Si la composición comprende una proteína descrita en el documento GB-9928197.4, dicha proteína comprende preferiblemente una de las siguientes (i), (ii) o (iii):

(i) secuencia de aminoácidos de N. meningitidis serogrupo B

5

o una proteína que comprende un fragmento inmunógeno de la misma, o una proteína que comprende una secuencia con una identidad de secuencia (preferiblemente mayor del 50% por ejemplo 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o más) con ella. La proteína puede carecer de su péptido señal MKLKQIASALMMLGISPLALA;

(ii) secuencia de aminoácidos de N. gonorrhoeae

6

o una proteína que comprende un fragmento inmunógeno de la misma o una proteína que comprende una secuencia con una identidad de secuencia (preferiblemente mayor del 50%, por ejemplo 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o más) con ella. La proteína puede carecer de su péptido señal MKLKQIASALMMLGISPLAFA;

(iii) secuencia de aminoácidos de N. meningitidis serogrupo A

7

o una proteína que comprende un fragmento inmunógeno de la misma, o una proteína que comprende una secuencia con una identidad de secuencia (preferiblemente mayor del 50%, por ejemplo 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o más) con ella. La proteína puede carecer de su péptido señal MKLKQIASALMVLGISPLALA. Las proteínas preferidas para su uso como antígeno de Neisseria son:

\bullet proteína '919', caracterizada por las ID SEC 3069 a 3074 y 3207 a 3241 del documento WO99/57280 (véase también la figura 23 y el ejemplo 15 del mismo).

\bullet proteína '235', caracterizada por las ID SEC 869 a 874 y 3149 a 3178 del documento WO99/57280 (véase también la figura 20 y el ejemplo 12 del mismo).

\bullet proteína '519', caracterizada por las ID SEC 3045 a 3056 y 3185 a 3206 del documento WO99/57280 (véase también la figura 22 y el ejemplo 14 del mismo).

\bullet proteína '225', caracterizada por las ID SEC 793 a 804 y 3115 a 3148 del documento WO99/57280 (véase también la figura 19 y el ejemplo 11 del mismo).

\bullet proteína 'ORF40', caracterizada por el ejemplo 1 (ID SEC 1 a 6) del documento WO99/36544 (véase también la figura 1 del documento GB-9910168.5; véanse también los documentos WO99/31132 y WO99/58683).

\bullet proteína 'ORF4', caracterizada por el ejemplo 26 (ID SEC 215 a 226) del documento WO99/24578 (véase también la figura 2 del documento GB-9910168.5).

Se comprenderá que esta solicitud describe la invención solamente a modo de ejemplo y se pueden realizar modificaciones.

Claims (18)

1. Una composición inmunógena que comprende:

(a) una cantidad inmunoestimulante de un antígeno de Neisseria; y

(b) una cantidad inmunoestimulante de una composición adyuvante que comprende

(i)

un oligonucleótido que comprende al menos un motivo CG, y

(ii)

una sal de aluminio o una emulsión que comprende escualeno, trioleato de sorbitán y polisorbato 80 microfluidizado para proporcionar micropartículas de tamaño uniforme.

2. La composición de la reivindicación 1, en la que dicho antígeno de Neisseria se selecciona del grupo constituido por una proteína, proteína-polisacárido, proteína-lipopolisacárido, polisacárido y lipopolisacárido.

3. La composición de cualquier reivindicación precedente, en la que dicho antígeno de Neisseria es de Neisseria meningitidis o de Neisseria gonorrhoeae.

4. La composición de la reivindicación 3 en la que dicho antígeno de Neisseria es un péptido de Neisseria meningitidis serogrupo B.

5. La composición de la reivindicación 4 en la que dicho péptido comprende la ID SEC Nº:31.

6. La composición de cualquier reivindicación precedente, que comprende además un agente inmunoestimulante por separado seleccionado del grupo constituido por un componente de la pared celular bacteriana y el péptido muramilo.

7. La composición de cualquier reivindicación precedente, en la que dicho oligonucleótido comprende al menos un enlace fosfotioato.

8. La composición de cualquier reivindicación precedente, en la que dicho oligonucleótido comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo constituido por ID SEC Nº:1, ID SEC Nº:2, ID SEC Nº:3, ID SEC Nº:4, ID SEC Nº:5, ID SEC Nº:6, ID SEC Nº:7, ID SEC Nº:8, ID SEC Nº:9, ID SEC Nº:10, ID SEC Nº:11, ID SEC Nº:12, ID SEC Nº:13, ID SEC Nº:14, ID SEC Nº:15, ID SEC Nº:16, ID SEC Nº:17, ID SEC Nº:18, ID SEC Nº:19, ID SEC Nº:20, ID SEC Nº:21, ID SEC Nº:22, ID SEC Nº:23, ID SEC Nº:24, ID SEC Nº:25, ID SEC Nº:26 y ID SEC Nº:27.

9. La composición de cualquier reivindicación precedente, en la que dicho oligonucleótido comprende un motivo CG flanqueado por dos purinas inmediatamente 5' a dicho motivo y dos pirimidinas inmediatamente 3' a dicho motivo.

10. La composición de la reivindicación 9, en la que dicho oligonucleótido comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo constituido por ID SEC Nº:1, ID SEC Nº:2, ID SEC Nº:3, ID SEC Nº:7, ID SEC Nº:8, ID SEC Nº:9, ID SEC Nº:12, ID SEC Nº:13, ID SEC Nº:19, ID SEC Nº:20, ID SEC Nº:21, ID SEC Nº:22, ID SEC Nº:23, ID SEC Nº:24, y ID SEC Nº:25.

11. Una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 que induce una respuesta inmune bactericida.

12. Una composición como la definida en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para su uso como producto farmacéutico.

13. El uso de

(a) una cantidad inmunoestimulante de un antígeno de Neisseria; y

(b) una cantidad inmunoestimulante de una composición adyuvante que comprende

(i)

un oligonucleótido que comprende al menos un motivo CG, y

(iii)

una sal de aluminio o una emulsión que comprende escualeno, trioleato de sorbitán y polisorbato 80 microfluidizado para proporcionar micropartículas de tamaño uniforme.

en la fabricación de un medicamento para inducir una respuesta inmune en un animal.

14. Uso de acuerdo con la reivindicación 13 en la fabricación de un medicamento para inducir una respuesta inmune protectora frente a la infección por Neisseria en un animal.

15. Uso de acuerdo con la reivindicación 14 en el que dicho medicamento comprende un antígeno de Neisseria meningitidis serogrupo B e induce una respuesta inmune protectora frente a Neisseria meningitidis en dicho animal.

16. Uso de acuerdo con la reivindicación 15 en el que dicho péptido comprende la ID SEC Nº:31.

17. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16 en el que dicho animal es un ser humano.

18. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17 en el que dicho medicamento tiene las características de una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 11.