ES2225856T3 - Procedimiento automatico altamente sensible y preciso y dispositivo para identificar y cuantificar plaquetas y para determinar un estado de activacion plaquetaria usando muestras de sangre completa. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION PROPORCIONA UN METODO ADECUADO Y ALTAMENTE SENSIBLE PARA LA DISCRIMINACION Y CUANTIFICACION DE PLAQUETAS EN UNA MUESTRA DE SANGRE ENTERA UTILIZANDO INSTRUMENTOS DE HEMATOLOGIA AUTOMATIZADOS. EL METODO Y EL SISTEMA DE LA PRESENTE INVENCION PROPORCIONAN LA MEDIDA ADECUADA DE UNA MASA SECA DE PLAQUETAS Y UNA CONCENTRACION DE LOS COMPONENTES DE LAS PLAQUETAS EN UNAS MUESTRAS DE SANGRE NORMALES Y EN MUESTRAS DE SANGRE ANORMALES, COMO, POR EJEMPLO, LAS DE PACIENTES TROMBOCITOPENICOS. LA DETERMINACION DE LA MASA SECA DE PLAQUETAS Y DE LA CONCENTRACION DE LOS COMPONENTES DE LAS PLAQUETAS PUEDE SERVIR PARA EVALUAR EL ESTADO DE ACTIVACION DE LAS PLAQUETAS, YA QUE LAS PLAQUETAS ACTIVADAS POSEEN UNAS CONCENTRACIONES Y UNOS INDICES DE REFRACCION DE LOS COMPONENTES INFERIORES, SEGUN SE HA MEDIDO, QUE LAS PLAQUETAS NO ACTIVADAS. EL METODO Y EL SISTEMA DE LA PRESENTE INVENCION PERMITEN TAMBIEN AL MEDICO O A LA PERSONA QUE LO SEPA UTILIZAR DETERMINAR LA EDAD DE UNA MUESTRA DE SANGRE TOMANDO COMO BASE EL PARAMETRO MEDIDO DE LA CONCENTRACION DE LOS COMPONENTES DE LAS PLAQUETAS.

Description

Procedimiento automático altamente sensible y preciso y dispositivo para identificar y cuantificar plaquetas y para determinar un estado de activación plaquetaria usando muestras de sangre completa.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a procedimientos mejorados de análisis y cuantificación de plaquetas usando sistemas de hematología automáticos. En particular, la invención se refiere a un procedimiento de alto rendimiento que se puede usar con muestras de sangre tanto anómala como normal, para determinar, entre otros parámetros, la cifra de plaquetas, el volumen plaquetario, la concentración o la densidad del componente plaquetario y la masa seca plaquetaria con un grado más elevado de exactitud y precisión en comparación con otros procedimientos.

Antecedentes de la invención

Aunque en la actualidad se usan sistemas analizadores semi y completamente automáticos para determinar la cifra de plaquetas en sangre, en la técnica se reconoce que los procedimientos automáticos actuales de determinación y cuantificación plaquetarias todavía se ven obstaculizados por problemas de inexactitud, falta de precisión y falta de reproducibilidad. Este es particularmente evidente en el análisis de muestras de sangre anómala, tales como las que se obtienen de individuos o pacientes afectados por una serie de discrasias sanguíneas y trastornos trombóticos, tales como trombocitopenia (una disminución del número de plaquetas en sangre, trombocitosis y similares. Hay varias razones para las dificultades y retos en el control de la exactitud de la cifra de plaquetas y pueden atribuirse a 1) la existencia de un gran intervalo dinámico del número y el tamaño de las plaquetas para los pacientes; 2) el pequeño tamaño de las plaquetas; 3) la presencia de partículas del tamaño de las plaquetas que interfieren en las muestras que se están analizando y (4) el comportamiento de las plaquetas al madurar in vitro.

El análisis y cuantificación de plaquetas pueden ser especialmente difíciles en el caso de los individuos con trombocitopenia que poseen números reducidos o bajos de plaquetas en sus muestras de sangre. Este estado con frecuencia es el resultado de tratamientos y terapias de uso habitual en pacientes de cáncer con tendencias trombóticas reducidas. Además, los individuos afectados por ciertas enfermedades inmunológicas, en particular enfermedades autoinmunitarias, tales como la púrpura trombocitopénica idiopática (PTI) a menudo sufren alteraciones y destrucción plaquetarias que conducen a la disminución de la cantidad de plaquetas. Además, los individuos con anemia aplásica también poseen cifras reducidas de plaquetas en sangre. Por ejemplo, en muestras de individuos con trombocitopenia, la cifra de plaquetas a menudo es inferior a 50.000/T1, en comparación con el número de plaquetas en el intervalo normal, que es del orden de aproximadamente 150.000-400.000/T1 (J. C. Dacie y S.M. Lewis, 1984, Practical Haematology, 6ª edición, Churchill Livingstone, Londres).

De hecho, la cuantificación exacta de las plaquetas se convirtió en todavía más importante con el advenimiento de las terapias de sustitución plaquetaria de disponibilidad mundial para los pacientes trombocitopénicos. Además, el desarrollo y uso de una variedad de estudios más sofisticados de la función plaquetaria, por ejemplo, las determinaciones de la activación y/o adherencia de las plaquetas, requieren un contaje de plaquetas exacto y preciso como parte integral de la prueba de hematología de laboratorio. Asimismo, la garantía de la calidad de los paquetes de plaquetas preparados para transfusiones requiere que los procedimientos de contaje exacto de plaquetas estén disponibles y en marcha (R. K. Wertz y J. A. Koepke, 1977, Am. J. Clin. Path., 68 (1): 195-201).

En la técnica son necesarios procedimientos más exactos, precisos y sensibles para la detección, discriminación, cuantificación y caracterización de los parámetros plaquetarios para muestras de sangre tanto anómala cono normal. Además, los procedimientos de análisis de plaquetas exactos y precisos que se pueden llevar a cabo usando muestras de sangre entera obvian la preparación inicial de plasma rico en plaquetas por centrifugación diferencial o técnicas de sedimentación requerida por algunos procedimientos. Tales procedimientos de análisis de plaquetas en sangre entera pueden ser útiles para diagnosticar anomalías plaquetarias insospechadas así como para monitorizar la cifra y los parámetros de plaquetas de individuos normales y de pacientes en los que se esta iniciando un trastorno y durante el curso del tratamiento o la progresión de la enfermedad. Además, en la técnica son necesarios procedimientos para usar en sistemas automatizados que puedan mejorar la resolución de la señal y la discriminación de las plaquetas, en especial en casos con cifras bajas de plaquetas. La presente invención, según se describe, proporciona a la técnica tales ventajas y mejoras.

En la actualidad, los expertos en la técnica conocen y usan dos procedimientos completamente automatizados de contaje y determinación del tamaño de las plaquetas. Uno es el procedimiento de la impedancia en la apertura. Las plaquetas de sangre entera en suspensión acuosa se detectan a medida que pasan a través de una estrecha apertura localizada entre dos electrodos, al hacerlo aumentan la impedancia eléctrica en la apertura con respecto a la del medio de suspensión en proporción aproximada al volumen plaquetario. Por tanto, los pulsos de las plaquetas proporcionan una cifra de plaquetas y un volumen plaquetario. En el procedimiento de la impedancia en la apertura, las plaquetas se distinguen de los eritrocitos según su tamaño, ya que las plaquetas, como grupo, son más pequeñas que los eritrocitos como grupo. En algunas aplicaciones de este procedimiento, las determinaciones de la cifra y el tamaño de las plaquetas se redefinen mediante análisis matemático de la forma de las distribuciones de tamaño de las plaquetas. Estas distribuciones se ajustan a curvas log-normal y los parámetros de las curvas ajustadas proporcionan la cifra y el tamaño de las plaquetas. Aunque la intención de este tratamiento es excluir las partículas residuales y los eritrocitos pequeños cuya presencia distorsiona la distribución log-normal del volumen plaquetario, tales partículas y células contaminantes no siempre se excluyen.

Un segundo procedimiento automático por completo es el procedimiento de dispersión de luz por láser. En este procedimiento, las plaquetas de sangre entera en suspensión acuosa se detectan a medida que interceptan un haz de láser, tras lo cual hacen que la luz incidente se disperse en ángulos característicos en las rutas en las que se han colocado los detectores ópticos. Los pulsos de la señal de las plaquetas proporcionan información acerca del volumen así como de la cifra, ya que se considera que el volumen plaquetario es proporcional a la intensidad de la dispersión. Los ejemplos de los instrumentos de citometría de flujo automática que se han diseñado y que se emplean para llevar a cabo tales procedimientos de dispersión de luz son los instrumentos del H`System (disponible comercialmente con la marca TECHNICON H Systems, por ejemplo H 1, H 2, H 3 y similares, y comercializado por el beneficiario de la presente y el ORTHO ELT-8 (Ortho Diagnostics).

En el sistema ORTHO ELT-8, las plaquetas se distinguen de los eritrocitos simplemente mediante diferencias en la intensidad de la dispersión en un único ángulo sólido. En e' Systemsl sistema TECHNICON H, el tamaño de las plaquetas también se determina en función de la intensidad de la dispersión en un único ángulo sólido; sin embargo, se distinguen de los eritrocitos según sus características intensidades de dispersión en un par de detectores seleccionados de forma adecuada. Aunque la distribución de la intensidad de la dispersión de las plaquetas es log-normal, el segundo procedimiento de dispersión de luz láser no afina el contaje o el tamaño de las plaquetas mediante el ajuste de los datos obtenidos con las curvas log-normal. Las partículas residuales en este procedimiento están compuestas por señales cuyas intensidades de dispersión disminuyen por debajo de un umbral seleccionado.

Como se ha mencionado anteriormente, el procedimiento de la impedancia en la apertura distingue entre plaquetas y eritrocitos y partículas residuales según el tamaño de la partícula, así como según la distribución log-normal de los tamaños de las plaquetas. En caso de que las plaquetas y otras partículas tengan un tamaño superponible, estas distinciones están borrosas y lo mejor que el procedimiento puede hacer es reconocer este fallo. Es más, el procedimiento de dispersión de la luz distingue las plaquetas de los eritrocitos en función de límites bidimensionales, que pueden cruzarse cuando los eritrocitos son más pequeños o si se fragmentan, por lo que también se empañaría la distinción entre las poblaciones celulares dispares.

Un tercer procedimiento semiautomático para la discriminación plaquetaria implica una combinación de dispersión de luz láser y fluorescencia para distinguir las plaquetas de los eritrocitos y las partículas residuales. Las plaquetas de sangre entera en suspensión acuosa se marcan con anticuerpos específicos de plaquetas, tales como CD42A. Los anticuerpos, a su vez, se unen a fluoróforos tales como isotiocianato de fluoresceína (FITC). Las plaquetas marcadas dispersan la luz incidente y emiten fluorescencia a medida que pasan a través de un citómetro de flujo de fluorescencia, tal como el Becton Dickinson FACScan (Becton Dickinson). Las plaquetas y las partículas de tamaño de las plaquetas se distinguen de los eritrocitos según dos patrones de dispersión dimensional, dispersión frontal y dispersión lateral. Después, estas células "acotadas" se clasifican en función de la intensidad de la fluorescencia; sólo las plaquetas muestran una fluorescencia significativa (W. Groner y col., 1994, Blood, Nº 10 Suplemento 687a; R. Dickerhof y A. von Ruecker, 1995, Clin. Lab. Hematol., 17: 163-172).

Aunque los últimos dos procedimientos descritos anteriormente permiten la discriminación de las plaquetas de otros tipos de células sanguíneas y de los residuos, no proporcionan cifras de plaquetas absolutas. Además, no determinan el tamaño de las plaquetas, ya que no existe un modo sencillo para calibrar los procedimientos y los sistemas que llevan a cabo los procedimientos para este propósito. Además, la técnica de marcaje requiere más trabajo y es relativamente cara.

Además de discriminar y cuantificar las plaquetas en las muestras de sangre, en la técnica se necesitan procedimientos sencillos, baratos, exactos y reproducibles para determinar la activación de las plaquetas (o el estado de activación). El estado de activación de las plaquetas es un parámetro importante de la función plaquetaria, como se describe más adelante.

La activación de las plaquetas es una propiedad funcional fundamental de las plaquetas, ya que las plaquetas activadas desempeñan un papel integral en la hemostasia y los trombos. Cuando se produce lesión vascular, las superficies subendoteliales quedan expuestas en el sitio de la lesión, lo que tiene como resultado la adherencia de las plaquetas activadas a la superficie subendotelial. Esto se sigue por la liberación de gránulos de las plaquetas, la agregación plaquetaria y la formación de trombos. Los trombos están compuestos por fibrina, agregados plaquetarios y eritrocitos.

Las plaquetas activadas se diferencian del resto de las plaquetas en que las primeras expresan glucoproteínas de superficie asociadas con el procedimiento de adherencia. Asimismo, las plaquetas activadas liberan componentes granulares y sufren tales procedimientos como un cambio de forma de disco a esfera y la agregación. La tumefacción también está asociada con el cambio de forma.

La trombosis es parte de la respuesta normal a la lesión vascular. Sin embargo, también se produce un aumento de la actividad trombótica, con efectos negativos, en condiciones tales como enfermedad vascular periférica (D. V. Devine y col., 1993, Arteriosclerosis and Thrombosis, 13: 857-62), isquemia cardíaca (D. McTavish y col., 1990, Drugs, 40:238; G. DiMinno y col., 1985, J. Clin. Invest., 75:238), diabetes mellitus (D. Tschope y col., 1991, Seminars in Thrombosis and Hemostasis, 17: 433-438) y angina (R. C. Becker y col., 1994, Coronary Artery Dis., 5: 339). También se sabe que las plaquetas en bancos de sangre en concentrados se activan durante su almacenamiento y, como resultado, pierden algo de su potencia (H. M. Rinder y E. L. Snyder, 1992, Blood Cells, 18: 445). Además, se sabe que la hemodiálisis y los procedimientos quirúrgicos implicados en la circulación extracorpórea de sangre causan la activación de las plaquetas (por ejemplo, J. C. Reverter y col., 1994, J. Lab. Clin. Med., 124:79; Y. T. Wachtfogel y col., 1993, J. Thoracic and Cardiovascular Surg., 106:1-10; R. E. Scharf y col., 1992, Arteriosclerosis and Thrombosis, 12: 1475-1487). En consecuencia, la capacidad para identificar y monitorizar el estado de activación de las plaquetas ex vivo proporciona una técnica de selección útil y ventajosa aportada por la presente invención.

La activación de las plaquetas se ha estudiado usando citometría de flujo por fluorescencia (por ejemplo, S. J. Shattil y col., 1987, Blood 70:307; C. S. Abrams y col., 1990, Blood, 75:128; L. Corash, 1990, Blood Cells, 16: 97-108). Con la tecnología de fluorescencia, las plaquetas se marcan con anticuerpos conjugados con fluorescencia específicos de glucoproteínas que se expresan, o que sufren cambios conformacionales, sobre la superficie de las plaquetas como resultado de la activación plaquetaria. El número de acontecimientos con fluorescencia positiva contados en un citómetro de flujo representa el número de plaquetas activadas; la intensidad de la fluorescencia por acontecimiento representa el número de sitios marcados por superficie celular. Aun que esta técnica es específica y sensible, también presenta varias desventajas, a saber, es caro; la preparación de la muestra requiere tiempo y el análisis de los datos no es automático. Además, no se ha establecido un procedimiento estándar para establecer los umbrales de positividad a fluorescencia, en parte por la naturaleza arbitraria de la posición del umbral y en parte a causa de las diferencias existentes en el diseño experimental.

La activación plaquetaria también se ha estudiado mediante análisis del gradiente de densidad (B. Van Oost y col., 1983, Blood, 62:433-38). La densidad de las plaquetas disminuye a medida que se activan, sobre todo debido a la tumefacción y, de forma secundaria, a causa de la liberación de gránulos alfa y densos (S. Holme y col., 1981, J. Lab. Clin. Med., 97: 610-22; S. Holme y col., 1988, J. Lab. Clin. Med., 112: 223-231), que son más densos que el citoplasma de las plaquetas. En consecuencia, las muestras con plaquetas activadas presentan porcentajes de plaquetas de baja densidad en las separaciones por gradiente de densidad mayores que los de las muestras no activadas. La técnica de separación por gradiente de densidad requiere tiempo y un experto en la tecnología. Además, se requiere un contador celular para determinar el número de plaquetas en cada una de las fracciones del gradiente de densidad. De acuerdo con esto, la presente invención, que ofrece una nueva, barata y sensible técnica de absorción de la dispersión de luz para la determinación de la activación plaquetaria, proporciona a la técnica un avance y una ventaja. El presente procedimiento para determinar la activación de las plaquetas es automático y, por tanto, es eficaz y ahorra tiempo para uso clínico.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona un procedimiento sensible, exacto y preciso para la cuantificación y el análisis de plaquetas en muestras de sangre entera y es particularmente útil para analizar las muestras de sangre de individuos que presentan trastornos de sangre anómala que afectan de forma adversa al número y/o discriminación de `las plaquetas de la sangre. La invención también aporta un procedimiento, un sistema y un aparato rápidos, sencillos y baratos para la discriminación y el análisis de las plaquetas. Un objeto de la presente invención es proporcionar un procedimiento mejorado de análisis de plaquetas usando sistemas de hematología automáticos para reunir los datos acerca de las plaquetas, incluidos la cifra, el tamaño, el componente de concentración y la masa seca de plaquetas. Otro objeto de la invención es proporcionar un procedimiento de alto rendimiento o de alta amplificación y un aparato para la exactitud del contaje de plaquetas que ofrezca más datos para el análisis de las plaquetas y proporcione resultados con más facilidad y menos caros que los procedimientos que emplean intensidad de fluorescencia, intensidad de dispersión e impedancia en la apertura para distinguir en una muestra de sangre entre las plaquetas y las partículas que no son plaquetas.

Otro objeto más de la invención es proporcionar un procedimiento para contar plaquetas, resolución de la señal y discriminación que sea sensible y exacto para muestras de sangre con cifras de plaquetas de aproximadamente 1.000 a menos de aproximadamente 50.000 plaquetas por microlitro. En particular, la invención proporciona una mejor exactitud de la cifra de plaquetas para muestras trombocitopénicas.

Otro objeto más de la invención es dar resultados de citogramas que proporcionen representaciones detalladas y bien delineadas de la distribución del tipo de partículas en la región del tamaño correspondiente a las plaquetas.

Otro objeto de la invención es proporcionar un medio para modificar y mejorar los analizadores de hematología automáticos actuales mediante la adición de al menos dos canales para llevar a cabo un procedimiento mejorado del contaje y análisis de plaquetas. La modificación o mejora añade a los sistemas actuales un canal de ángulo de baja dispersión/amplificación de alto rendimiento y un canal de ángulo de alta dispersión/amplificación de alto rendimiento más análisis basado en la teoría de Dispersión Mie de señales para alcanzar el rendimiento del procedimiento y el aparato de la invención.

Otro objeto de la invención es permitir la identificación y la cuantificación de eritrocitos microcíticos y fragmentos de eritrocitos.

Otro objeto de la invención es proporcionar una determinación de la extensión de la activación de las plaquetas mediante la medición de la concentración del componente plaquetario (CCP). De acuerdo con la invención, los valores de CCP se correlacionan con el estado de activación plaquetaria.

Otro objeto de la invención es proporcionar una determinación de la masa seca de las plaquetas, que es un predictor de la capacidad de activación de las plaquetas.

Otro objeto de la invención es proporcionar una determinación de la concentración del componente plaquetario, que permite la medición de la edad de la muestra de sangre in vitro.

Otros objetos y ventajas proporcionados por la invención serán evidentes a partir de la detallada descripción que se presenta en la siguiente memoria descriptiva.

Descripción de las figuras

Los dibujos adjuntos de las figuras se presentan para describir más la invención y para contribuir a su entendimiento a través de la aclaración de sus diversos aspectos. Los citogramas dispersión/dispersión como se describen a continuación en la presente se obtuvieron cuando este aparato y procedimiento de la invención se usaron en la determinación y el análisis de las plaquetas usando un sistema de detección electroóptico de un analizador de hematología automático de acuerdo con la invención. En las figuras que se presentan a continuación, E= eritrocitos en 106/T1; PLT= cifra de plaquetas en 103/T1; VPM= volumen plaquetario medio en femtolitros (fl; MP + C es equivalente al CCMP= concentración media del componente plaquetario en g/dl; y MP + M es equivalente la MSPM= masa seca plaquetaria media en picogramos (pg).

La figura 1 representa un mapa del volumen plaquetario (V) frente al índice de refracción (n) (es decir, V/n) en un citograma de dispersión/dispersión. Cada línea mostrada en el citograma representa un tipo de partícula concreto según se determina en el análisis y se identifica en la descripción de la figura 3.

Las figuras 2A, 2B y 2C muestran citogramas de dispersión/dispersión de gotas de aceite de n-pentano, n-hexano y n-heptano, respectivamente. Cada línea mostrada en el citograma representa un tipo de partícula concreto como se determina en el análisis y se identifica en la descripción de la figura 3.

La figura 3 demuestra las localizaciones de varias partículas, es decir, eritrocitos, plaquetas grandes, fantasmas de eritrocitos, plaquetas, fragmentos de eritrocitos y residuos originales en citograma de dispersión/dispersión del mapa de tipos de partículas. Esta descripción también se aplica a los citogramas que se muestran en las figuras 4, 5, 6, 8 y 13.

La figura 4 representa un citograma e histogramas representativos que muestran un resultado de una muestra normal usando el procedimiento de determinación de plaquetas y el sistema de la invención.

La figura 5A representa un citograma representativo resultante del análisis de las plaquetas en muestras de sangre anticoagulada-K_{3}EDTA suspendidas en diluyente de eritrocitos (por ejemplo, TECHNICON RBC Diluent). La figura 5B representa un citograma representativo resultante del análisis de las plaquetas en muestras de sangre anticoagulada-K_{3}EDTA suspendidas en suero salino tamponado con fosfato isotónico (PBS). Debe entenderse que las muestras se analizan a temperatura ambiente, aunque no se hayan almacenado a temperatura ambiente.

La figura 6a representa citograma representativo resultante del análisis de muestras de sangre anticoagulada-ACD suspendidas en diluyente de eritrocitos (por ejemplo, TECHNICON RBC DILUENT). La figura 6B representa un citograma representativo resultante del análisis de muestras de sangre anticoagulada-ACD suspendidas en suero salino tamponado con fosfato (PBS).

La figura 7A es un gráfico representativo que muestra la masa seca plaquetaria media (MSPM) frente al tiempo en muestras de sangre de donantes normales. La MSPM se determinó para muestras normales de 24 horas frente a muestras normales de 1 hora almacenadas a temperatura ambiente. La figura 7B muestra un gráfico representativo que muestra la masa seca plaquetaria media frente al tiempo en muestras de sangre de donantes anómalos. La MSPM se determinó para muestras anómalas de 28 horas frente a muestras anómalas de 4 horas almacenadas a temperatura ambiente.

Las figuras 8A, 8B y 8C representan histogramas del volumen plaquetario (VPM) parra una muestra de sangre anómala generados mediante varios procedimientos automáticos, es decir el sistema PLT-1 de la invención (figura 8A), el sistema TECHNICON H.ô2 (FIGURA 8b) y el sistema Coulter STKS (figura 8C).

Las figuras 9A-9D representan el volumen plaquetario medio (VPM) frente a determinaciones de cifras de plaquetas anómalas (PLT) (cifra de PLT <20.000/T1) obtenidas usando el sistema TECHNICON H.ô2 o el sistema Coulter STKS. La figura 9A muestra los resultados obtenidos del sistema TECHNICON H.ô2 usando muestras de sangre anómala de 4 horas. En la figura 9A, r= 0,59; Syx= 0,88 (por favor, defina r y syx); pendiente= 0,14 e intersección= 4,5. La figura 9B muestra los resultados obtenidos del sistema TECHNICON H.ô2 usando muestras de sangre anómala de 28 horas. En la figura 9B, r= 0,72; Syx= 0,54; pendiente= 0,13 e intersección= 3,29. La figura 9C muestra los resultados obtenidos del sistema Coulter STKS usando muestras de sangre anómala de 4 horas. En la figura 9C, r= 0,13; Syx= 0,95; pendiente= 0,02 e intersección= 8,06. La figura 9D muestra los resultados obtenidos del sistema Coulter STKS usando muestras de sangre anómala de 28 horas. En la figura 9D, r= 0,66; Syx= 1,09; pendiente= 0,18 e intersección= 6,31.

Las figuras 10A y 10B representan el volumen plaquetario medio (VPM) frente a determinaciones de cifras de plaquetas anómalas (PLT) de muestras de sangre trombocitopénica anómala (cifra de PLT <20.000/T1) obtenidas usando el nuevo PLT1 y el procedimiento de la invención. La figura 10A muestra los resultados obtenidos del sistema PLT1 usando muestras de sangre anómala de 4 horas. En la figura 10A, r= 0,32; Syx= 0,89; pendiente= 0,06 e intersección= 10,02. La figura 10B muestra los resultados obtenidos del sistema PLT1 usando muestras de sangre anómala de 28 horas. En la figura 10B, r= 0,32; Syx= 1; pendiente= 0,07 e intersección= 11,79.

Las figuras 11A, 11B y 11C representan el volumen plaquetario medio (VPM) frente a determinaciones de cifras de plaquetas realizadas con muestras de sangre normal obtenidas usando diferentes procedimientos automáticos, a saber, el sistema TECHNICON H.2, el sistema Coulter STKS y el nuevo sistema PLT1 de la invención. La figura 11A muestra los resultados obtenidos del sistema TECHNICON H.ô2 usando muestras de sangre normal de 1 hora; la figura 11B muestra los resultados obtenidos del sistema Coulter STKS usando muestras de sangre normal de 1 hora. La figura 11C muestra los resultados obtenidos del sistema PLT1 de la invención usando muestras de sangre normal de 1 hora.

Las figuras 12A y 12B muestran datos exactos de la masa seca plaquetaria media (MSPM) y la concentración media del componente plaquetario (CMCP) de muestras anómalas usando el procedimiento y sistema PLT1. La figura 12A representa los datos exactos de MSMP de muestras anómalas de 28 horas frente a muestras anómalas de 4 horas almacenadas y analizadas a temperatura ambiente. En la figura 12A, r= 0,75; Syx= 0,13; pendiente= 0,74; intersección= 0,49; el valor medio de 4 horas es 2,04 y el valor medio de 28 horas es 1,99. La figura 12B representa datos exactos de CMCP de muestras anómalas de 28 horas frente a muestras anómalas de 4 horas a temperatura ambiente. En la figura 12B, r= 0,35; Syx= 1,3; pendiente= 0,3; intersección= 12; el valor medio de 4 horas es 221, y el valor medio de 28 horas es 18,7.

Las figuras 13A, 13B y 13C representan histogramas del volumen plaquetario (VPM), que corresponden a los resultados presentados en la tabla 8 para la muestra trombocitopénica anómala nº 70. La figura 13A representa los resultados en histograma obtenidos usando el procedimiento PLT1 de análisis de la presente invención; la figura 13 B representa los resultados en histograma obtenidos usando el sistema de análisis TECHNICON H`2 y la figura 13C representa los resultados en histograma obtenidos usando el procedimiento de análisis Coulter STKS System.

Las figuras 14A a 14D muestran una comparación entre el nuevo procedimiento de dispersión de luz de acuerdo con la invención y un procedimiento de fluorescencia para determinar la activación de las plaquetas. Las figuras 14A-14D demuestran que el nuevo procedimiento de dispersión de luz (figuras 14C y 14D) de la invención y el procedimiento de fluorescencia (figuras 14A y 14B) siguen la activación de las plaquetas en relación con la dosis de trombina de un modo similar en ambas muestras de sangre, las tratadas con citrato y las tratadas con EDTA. Las curvas de respuesta a la dosis para el procedimiento de la invención se presentan en formato estándar, en el que la CMCP aumenta (figura 14C) y en formato "al revés" en el que la CMCP disminuye (figura 14D). Tanto la curva del formato al revés como la del formato estándar exhiben resultados idénticos, aunque la primera orientación permite una comparación visual más directa de los resultados entre los dos procedimientos (es decir, la figura 14B comparada directamente con la figura 14D).

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona un procedimiento sensible y exacto de cuantificación y caracterización de plaquetas para usar en sistemas analizadores automáticos de hematología. La invención además proporciona un aparato para llevar a cabo los procedimientos de cuantificación y caracterización de las plaquetas según se describe.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, las plaquetas con frecuencia se abrevian a "PLT". Otras abreviaturas de uso frecuente en la presente memoria descriptiva son las siguientes: E es eritrocito; MSPM es masa seca plaquetaria media; VPM es volumen plaquetario medio; CMCP es concentración media del componente plaquetario; TCP es trombocitopénico o trombocitopenia y TCPS es la denominación usada para una muestra de sangre anómala obtenida de un paciente con trombocitopenia; VCM es volumen celular medio; CHCM es concentración de hemoglobina celular media y HCT es hematocrito.

Los ejemplos de los tipos actuales de sistemas analizadores automáticos de hematología adecuados para usar con la invención son los sistemas H'2 disponibles comercialmente con la marca TECHNICON H 1, H 2, H 3 y similares, comercializados por el beneficiario de la presente. En tales sistemas, la detección de plaquetas (o partículas) se lleva a cabo electroópticamente mediante la medición de la dispersión de la luz y eléctricamente mediante la medición de la impedancia eléctrica. Para los expertos en la técnica, los principios operativos de los sistemas analizadores automáticos TECHNICON H™ se exponen en la presente memoria descriptiva en relación con el análisis de eritrocitos y de plaquetas para describir con claridad los cambios hechos en dichos sistemas para producir la invención. En estos sistemas, los eritrocitos y las plaquetas se analizan juntos en un único canal de medición óptica, que incluye una fuente de luz láser de Helio-Neón, una célula de flujo y dos detectores ópticos. Como parte de su procedimiento de funcionamiento normal, el sistema automático suspende dos microlitros (2 T1) de sangre entera en 1,25 ml de TECHNICON H SYSTEMS RBC DILUENT, una solución reactivo que redondea isovolumétricamente los eritrocitos de forma que se puedan analizar de forma adecuada usando la Teoría de Dispersión de Mie, según se explica en la presente memoria descriptiva. Los reactivos y diluyentes de redondeo de los eritrocitos adecuados para usar en los procedimientos y sistemas de análisis de plaquetas de la invención se describen en las patentes de EE.UU. números 5.284.771, 5.360.739 y 5.411.891 concedidas a S. S. Fan y col.; en las patentes de EE.UU. números 5.350.695 y 5.438.003 concedidas a G. Colella y col.; y en las patentes de EE.UU. números 4.575.490 y 4.412.004 concedidas a Kim y Ornstein.

A continuación se envuelve una corriente de aproximadamente 10 T1 de esta suspensión en un fluido reactivo de igual índice de refracción, es decir, la cubierta de tensioactivo de E/Basófilos de TECHNICON H SYSTEMS. La cubierta de E/Basófilos es un reactivo "pasivo" que no interacciona con las células sanguíneas directamente, sino que en su lugar rodea y centra la corriente en la célula de flujo. También proporciona una serie de partículas únicas para el análisis. Por ejemplo, la composición del reactivo cubierta de tensioactivo E/Basófilos comprende sal inorgánica, tal como cloruro sódico, 7,7 g/l; fosfato sódico dibásico, 2,4 g/l; fosfato sódico monobásico, 0,3 g/l; el polietoxilato no iónico, tensioactivo no hemolítico Pluronic P-105, 1,0 g/l; un reactivo antioxidante, tal como 3,3 c ácido tiodipropiónico, 0,10 g/l y un reactivo antimicrobiano, tal como Proclin 150, 0,40 g/l, a un pH de aproximadamente 7,0-7,5 y una osmolalidad de aproximadamente 285-305 mOsmol/kg.

Los eritrocitos y las plaquetas en la suspensión dispersan parte de la luz láser incidente a medida que la corriente de células cubierta atraviesa la célula de flujo. Los dos detectores perciben la luz dispersada a intervalos angulares concretos respecto del eje de incidencia. La señales del detector se amplifican de forma que, para muestras normales, las señales medias producidas por los eritrocitos se encuentran en el medio del intervalo de las amplitudes de señal asociadas con los eritrocitos. De acuerdo con la invención, la intensidad de la dispersión de la luz se mide en dos intervalos de ángulo sólido en dos canales ópticos a ganancias de señal incrementadas en el primer y el segundo canales ópticos, para producir dos mediciones de la intensidad de la dispersión suficientes para distinguir entre plaquetas y lo que no son plaquetas en la muestra. El valor de la señal del primer canal óptico deriva de un incremento en la ganancia del detector de ángulo alto y el valor de la señal del segundo canal óptico deriva de un incremento en la ganancia del detector de ángulo bajo, lo que, por tanto, tiene como resultado una novedosa versión de ganancia elevada de las salidas en los ángulos alto y bajo. También de acuerdo con la invención, el sistema exhibe las señales debido al grado de dispersión de aproximadamente 5 a 20 grados, más preferentemente de 7 a 15 grados t más preferentemente de 5 a 15 grados a lo largo del eje X de un citograma de dispersión/dispersión. Además, el sistema expresa señales debido al grado de dispersión de aproximadamente 1 a 7 grados, más preferentemente de 1 a 5 grados y más preferentemente de 2 a 3 grados a lo largo del eje Y del citograma de dispersión/dispersión. Estas señales se usan para determinar los parámetros de los eritrocitos tales como el volumen y la concentración de hemoglobina, como después se describe en la presente memoria descriptiva.

Normalmente, los eritrocitos son discos bicóncavos, cuyas propiedades de dispersión son sensibles a la orientación a medida que atraviesan la célula de flujo del sistema óptico descrito anteriormente. Con el fin de eliminar los efectos de la orientación de las partículas sobre la intensidad de la señal, los eritrocitos se convierten en esferas en el TECHNICON H™ SYSTEM RBC Diluent (por ejemplo, las patentes de EE.UU. números 4.575.490 y 4.412.004 concedidas a Kim y Ornstein). Además, la Teoría de la Dispersión de Mie, que proporciona perfiles de la intensidad de la dispersión angular para partículas esferas (tales como los eritrocitos con forma de esfera), predice que la intensidad de dispersión es sensible al índice de refracción así como al volumen celular. Por tanto, dos partículas de igual volumen pero con índices de refracción diferentes tendrán distintos perfiles de dispersión. Dado que el índice de refracción de los eritrocitos depende linealmente de la concentración de hemoglobina celular (R. Barer y S. Joseph, 1954, Quarterly Journal of Microscopical Science, 95:399-423), que varía de una célula a otra, no es probable que las mediciones de la intensidad de la dispersión en un único intervalo de ángulo sólido determinen exclusivamente el volumen celular, incluso para eritrocitos con forma de esferas. Por tanto, para determinar exclusivamente el volumen de un eritrocito es necesario medir si intensidad de dispersión en al menos dos intervalos distintos de ángulo sólido. La concentración de hemoglobina celular se determina como un subproducto de la medición de los dos ángulos.

Los algoritmos que usan la Teoría de Mie proporcionan los patrones de dispersión angular asociados con partículas de un volumen y un índice de refracción determinados. En el intervalo de los tamaños de eritrocitos y las concentraciones de interés (es decir, aproximadamente 30-180 fl y aproximadamente 19-49 g/dl, respectivamente), se ha determinado que existe una correspondencia uno a uno entre 1) el par de intensidades de dispersión a 2-3 grados y 5-15 grados y 2) el volumen y la concentración de eritrocitos (patente de EE.UU. nº 4.735.504 concedida a Tycko). Para el TECHNICON H™ Systems, el conjunto de correspondencias se tabula en forma de una matriz bidimensional. Los índices de la matriz están compuestos por los valores de la señal de los canales X e Y y las entradas de la matriz son los volúmenes y concentraciones asociadas. La teoría de la dispersión electromagnética para partículas esféricas (es decir, la Teoría de Mie) la ha descrito con detalle, por ejemplo, M. Kerker, 1969, En : The Scattering of Light, Academic Press.

Antes de la aplicación automática de la tabla de Mie, el sistema cuenta como células sanguíneas todas las partículas que superan un umbral de señal previamente determinado. A continuación usa las dos mediciones del ángulo sólido mencionadas anteriormente para designarlas como eritrocitos o como plaquetas. Los dos tipos de partículas ocupan distintas regiones del espacio volumen/índice de refracción, siendo los eritrocitos mucho más grandes y teniendo un índice de refracción significativamente superior. Sin embargo, las ganancias de señal que en la actualidad se usan en estos sistemas proporcionan una mala discriminación entre plaquetas y lo que no son plaquetas, tales como fantasmas de eritrocitos, fragmentos de eritrocitos y residuos celulares. Además, el procedimiento actual de la impedancia en la apertura, que depende de las diferencias en el tamaño para distinguir las plaquetas de otras partículas, no discrimina de forma adecuada las plaquetas de fragmentos de eritrocitos o de residuos, que tienen volúmenes similares al volumen de las plaquetas.

Por el contrario, los instrumentos eletroópticos actuales dependen de mediciones en un único intervalo de ángulo para determinar el volumen plaquetario. En los sistemas H'O actuales, se considera que el volumen plaquetario es proporcional a los 5-15 grados de intensidad de dispersión. De hecho, como se describirá en la presente memoria descriptiva, esta intensidad disminuye con el tiempo que permanece una muestra in vitro debido a la tumefacción de las plaquetas (véase el Ejemplo 1). Como resultado, el volumen plaquetario medio comunicado disminuye a medida que el volumen plaquetario medio aumenta. Asimismo, el procedimiento de ángulo único puede comunicar diferentes volúmenes para las plaquetas que en realidad tienen los mismos volúmenes pero distintas densidades (es decir, índices de refracción). Además, tanto los instrumentos electroópticos como los de la impedancia en la apertura a menudo comunican menores valores de VPM para las muestras trombocitopénicas porque los residuos de baja señal comprenden una fracción significativa de la cifra total de partículas en estas muestras anómalas.

Como parte de los esfuerzos de los presentes inventores para alcanzar análisis plaquetarios más sensibles, exactos y precisos para llevar a cabo en sistemas analizadores automáticos, tales como, por ejemplo, los sistemas analizadores TECHNICON H, se adaptó y se configuró una estación de prueba con TECHNICON H1, según se describe en la presente memoria descriptiva, para reunir los datos acerca de las plaquetas usando el procedimiento y el sistema descrito en la invención, que comprende una mayor amplificación de las señales de los canales ópticos de eritrocitos X e Y (ganancias amplificadas e la señal).

El sistema automático de nueva configuración para realizar los análisis de discriminación plaquetaria de la invención se denomina en la presente memoria descriptiva sistema y procedimiento PLT1de la invención. Para el análisis exacto de las plaquetas se usó la Teoría de la Dispersión de Mie para descubrir los factores adecuados de la amplificación aumentada, como se describe en la presente. En primer lugar, para el análisis Mie se seleccionaron los intervalos de volumen y de índice de refracción. El intervalo de volumen seleccionado fue de aproximadamente 1 a 60 fl (fl= fentolitros= 10^{-15} litros) y preferentemente de 1 a 30 fl. Este intervalo se seleccionó para cubrir los tamaños de las plaquetas para todas las muestras normales y la mayoría de las anómalas (J. M. Paulus, 1975, Blood, 46, (3): 321-336). El intervalo del índice de refracción seleccionado fue de aproximadamente 1,340 a 1,400, preferentemente de 1,350 a 1,400. El límite inferior se basa en la observación de que las plaquetas tiene índices de refracción superiores que sus medios plasmáticos (de otra forma serían invisibles) y el índice de refracción del plasma es típicamente superior a aproximadamente 1,345, determinado por refractometría. El límite superior se basa en la observación de que la mayoría de las plaquetas son menos densas (y, por tanto, tiene menores índices de refracción) que los eritrocitos, cuyos índices de refracción rara vez disminuyen por debajo de 1,390 (concentración de hemoglobina celular de 23 g/dl). Preferentemente, el límite se extendió a aproximadamente 1,400 para representar la pequeña fracción de plaquetas que son tan densas como algunos eritrocitos. En función de estos intervalos de volúmenes e índices de refracción y la Teoría de Mie, las señales estándar del canal X del sistema H™ se incrementaron y amplificaron aproximadamente de 8 a 15 veces, preferentemente aproximadamente 12 veces, y las señales Y se incrementaron o amplificaron aproximadamente de 20 a 35 veces, preferentemente aproximadamente 30 veces, de acuerdo con la invención.

A estas amplificaciones de la ganancia de la señal, las intensidades de la dispersión de la luz a, por ejemplo, 2 ó 3 grados y a, por ejemplo, de 5 a 15 grados, fueron adecuadas para distinguir las plaquetas de las sustancias que interfieren, tales como residuos celulares, fragmentos de eritrocitos y fantasmas de eritrocitos. Asimismo, en el procedimiento, los eritrocitos se distinguieron con claridad, ya que sus señales aparecieron en los canales de saturación X= 99, Y= 99. Por tanto, las mediciones combinadas de la dispersión descritas para la invención proporcionan cifras de plaquetas más exactas de lo que lo hacen los procedimientos automáticos actuales, en particular para las muestras trombocitopénicas, en las que típicamente la fracción de interferencias aumenta. Además, los citogramas de dispersión/dispersión generados de acuerdo con la invención permiten una valoración visual del número, el tamaño medio y el índice de refracción medio de las plaquetas contenidas en la muestra. Los citogramas también proporcionan una valoración visual del número y los tipos de partículas del tamaño de las plaquetas que pueden estar presentes en la muestra.

Además, en otros aspecto de la invención, las mediciones de la dispersión en dos ángulos que son únicas de la invención distinguen plaquetas que han liberado sus gránulos (es decir, plaquetas activadas) de aquéllas que no lo han hecho, ya que las plaquetas en forma activada tienen unos índices de refracción menores que los que presentan las formas inactivas. Los instrumentos automáticos actuales no hacen esta distinción.

Es más, la elevada amplificación permite que el sistema de determinación de plaquetas de la invención lleve a cabo el análisis de la Teoría de Mie sobre las plaquetas, proporcionando de este modo la información acerca del volumen plaquetario y del índice de refracción según teorías en vez de observaciones empíricas. En el sistema de la estación de prueba PLT1, los cinco parámetros medidos de acuerdo con la invención fueron la cifra de eritrocitos (cifra de E, 10^{6}/T1), la cifra de plaquetas (cifra de PLT, 103/T1), el volumen plaquetario medio (VPM, fl), la masa seca plaquetaria media (MSPM, pg) y la concentración media del componente plaquetario (CMCP, g/dl).

Debe entenderse que antes del recién descubierto procedimiento de determinación de plaquetas y sus pruebas en el sistema de prueba automático como se ha descrito en la presente memoria descriptiva, los parámetros analíticos medidos de MSPM y CMPC no estaban disponibles anteriormente en los procedimientos y sistemas automáticos de medición y análisis de plaquetas conocidos y usados en la técnica. Por tanto, el procedimiento y sistema de la invención proporciona un análisis de plaquetas exacto y completo de una muestra, incluidos la cifra de plaquetas, el volumen plaquetario medio, la masa seca plaquetaria media y la concentración media del componente plaquetario. Además, la invención también proporciona la cifra de eritrocitos de la muestra al mismo tiempo que produce el análisis completo de las plaquetas como se describe más adelante en la presente.

El procedimiento de amplificación elevada de la invención se comparó con otros procedimientos en relación con la exactitud, la sensibilidad y la reproducibilidad cualitativa y cuantitativa del contaje y la determinación del tamaño de las plaquetas. Los otros procedimientos comparativos incluyeron la intensidad de la dispersión (por ejemplo, el TECHNICON H 2 System, Bayer Corporation, Tarrytown, NY), la impedancia en la apertura (por ejemplo, el sistema Coulter STKS Model, Coulter Electronics, Dade, Fla), la microscopia de contraste de fases y las estimaciones histológicas en extensiones de sangre.

Sistema de alta amplificación de PLT1

De acuerdo con un aspecto de la invención, el procedimiento y el sistema de discriminación y cuantificación de la invención emplea un procedimiento de alta amplificación recién determinado. Las mediciones desarrolladas exclusivamente para la presente invención se realizaron en un TECHNICON H1 System modificado, que se denominó el modelo PLT1 o paradigma de sistema/procedimiento, debido a su capacidad para llevar a cabo mediciones únicas y parámetros de cuantificación sobre plaquetas y su distinción de los sistemas y dispositivos actuales de la técnica. Para los análisis de eritrocitos, la señal del canal X del sistema PLT1 se amplificó aproximadamente 12 veces de su valor nominal ny la señal del canal Y se amplificó aproximadamente 30 veces.

Por tanto, como se ha descrito anteriormente en la presente y de acuerdo con la invención, se preparó una tabla de la Teoría de la Dispersión de Mie para esferas de aproximadamente 1 a 30 fl e índices de refracción de aproximadamente 1,350 a 1,400. La tabla se del mismo formato que el usado para el análisis de eritrocitos. El mapa de volumen/índice de refracción (V/n) correspondiente a X e Y se normalizaron usando suspensiones en gotas de n-pentano (n=1,3577), n-hexano (n= 1,3776 y n-heptano (n= 1,3884). Cincuenta mililitros de cada hidrocarburo se agitaron en vórtex con 1 ml de reactivo de cubierta E/baso. Durante 10 segundos y una muestra se analizó a través de citometría directa, es decir, la muestra no se diluyó más antes de atravesar la célula de flujo, Un mapa del volumen/índice de refracción, incluyendo las curvas derivadas de la tabla del índice de refracción constante para cada uno de los tres hidrocarburos, se mostró en la pantalla de registro, junto con las curvas reales formadas por las gotas. para cada. Las ganancias de señal se ajustaron y las muestras se volvieron a pasar, según fue necesario, hasta que la curva real para cada hidrocarburo sobrepasó su curva asociada derivada de la tabla. Ejemplos de los patrones que se generaron se muestran en la figura 2. Por tanto, de acuerdo con la invención, las plaquetas se distinguen específicamente de lo que no son plaquetas por la presencia en un mapa de volumen/índice de refracción y se distinguen más en función de la distribución gausiana característica de los índices de refracción plaquetarios. La cifra de eritrocitos determinada por el procedimiento PLT1 se calibró como e los sistemas H con u calibrador TECHNICON, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El factor de calibración del contaje de eritrocitos, que representa la dilución, también se aplicó al contaje de plaquetas (por ejemplo, como en los sistemas H), ya que las plaquetas y los eritrocitos en una muestra están sujetos a factores de dilución idénticos. Sin embargo, de acuerdo con la invención y en contraste con los procedimientos automáticos comparativos, en el sistema y procedimiento PLT1 no se aplicó ningún factor de calibración del contaje de plaquetas independiente. Por tanto, las diferencias en la cifra de plaquetas entre el PLT1 y otras tecnologías no se verían oscurecidas por factores de calibración artificiales con propósitos comparativos.

El sistema PLT1 está diseñado parta procesar una muestra de sangre entera mediante el uso de hidráulica, pneumática, química, tiempo de reacción y tiempo de contaje de un canal de E/PLT. Asimismo, las señales del canal de plaquetas se adquieren del mismo par de detectores ópticos que se usan en el canal E/PLT; sin embargo, las amplificaciones aumentadas de la ganancia de señal adquiridas para la medición y determinación de plaquetas como se ha descrito anteriormente son únicas del sistema PLT1 y no son parte de los sistemas y procedimientos de uso actual en la técnica. Las señales adquiridas para el sistema se analizan cono se describe y se proporcionan ejemplos más adelante en la presente:

Las señales representen partículas que no son plaquetas (es decir E u "otros") si 1) están fuera del mapa V/n (estos representan "otros"); 2) saturan los detectores (X= 99, Y=99) (estos representan E); o 3) están en los canales X< 80, Y= 99 (estos representan "otros". Las señales por encima y a la izquierda del mapa cerca del origen representan residuos celulares. Las señales más grandes, incluidas las de los canales X< 80, Y= 99, representan fantasmas de eritrocitos. Las señales de saturación se deben a E y a plaquetas muy grandes. Las señales por debajo y a la derecha del mapa también se deben a fragmentos de E (véase la figura 3).

Las señales restantes en el mapa se analizan del siguiente modo: Primero, el sistema computa el índice de refracción medio y la desviación estándar (DE) de las señales en los canales X= 18 y por encima, usando la tabla de conversión Mie. El sistema excluye las señales den el mapa V/n por debajo del canal X= 18 de esta parte del análisis a causa de una posible contaminación con residuos. A continuación, cualquier señal de partícula con un valor del índice de refracción de entre aproximadamente +2 y -1,8 de la DE de la media se designa como una plaqueta. El resto de las señales de partículas se designa como "Otros". Esto proporciona cifras para tres tipos de partículas, a saber, PLT (P), E (E) y "Otros" (O). El número de partículas detectadas por el sistema, denominado V_{sig}, es superior al número de partículas analizado. Por tanto, P, E y O representan el número relativo de cada tipo de partícula en lugar de la cifra bruta real de cada tipo. Para obtener las cifras brutas, el sistema lleva a cabo las siguientes conversiones:

N_{r}= (R/R + P + O)) x V_{sig}; N_{p}= (P/R + P + O)) x V_{sig};

N_{o}= (O/R + P + O)) x V_{sig}; donde Nr = cifra bruta de eritrocitos; Np= cifra bruta de plaquetas; No= cifra bruta de "otros" y Vsig= número total de partículas detectado. Las cifras brutas se corrigen a continuación para en busca de "coincidencias", es decir, la presencia simultánea de dos o más partículas en el canal detector, que el detector cuenta como una única partícula. Se supone que "otros" actúan como PLT en relación con la coincidencia y, por tanto, se agrupan con ellas en los cálculos de coincidencia-corrección. La frecuencia de la coincidencia se predice con exactitud mediante estadística de Poisson y es evidente para los expertos en la técnica. Las cifras brutas corregidas de E, PLT y "Otros" se designan E\mathcent,PLT\mathcent y Otros \mathcent. Por último, el factor de calibración de E se aplica a E\mathcent,PLT\mathcent y Otros \mathcent, para dar los siguientes valores: E (10^{6}/T1); PLT (10^{3}/T1) y Otros (10^{3}/T1).

Se predice que los intervalos dinámicos del volumen y el índice de refracción del procedimiento y sistema automático PLT1 mejorado se puede extender de forma eficaz para manera la aparición ocasional de PLT grandes y densas en los canales de saturación X= 99, Y= 99. El PLT1 identifica estas como eritrocitos. Esto puede conseguirse mediante la extensión de la tabla de conversión del sistema H Mie actual hasta V< 8 fl y n< 1,400. La amplificación del canal E/PLT empleada en el sistema PLT1 proporciona una resolución adecuada de las señales de plaquetas más grandes para la aplicación de las tablas extendidas, para proporcionar valores V y n exactos.

El sistema PLT1 de la invención computa el volumen plaquetario medio (VPM, fl) y el índice de refracción medio en función de las tablas Mie. El sistema también deriva la concentración media del componente plaquetario (CMCP, g/dl) y la masa seca plaquetaria media (MSPM, pg) de los medias del índice de refracción y del volumen, como se demuestra a continuación:

CMCP (g/dl)= (índice de refracción medio-1,333)/0,0018/(g/dl), donde 1,333= índice de refracción del agua y 0,0018 (g/dl)= incremento medio del índice de refracción (IR). Como un experto en la técnica apreciará y como se analizará más adelante, en esta ecuación, el valor del incremento del IR se trata como constante para eliminarlo como una variable de una célula a otra.

MSPM (pg)= CMCP (g/dl) x VPM (fl)/100. (obsérvese que g/dl= 100 x pg/fl).

El valor del incremento medio del índice de refracción se basa en el hecho de que los componentes principales de la masa seca plaquetaria son proteínas (57%), lípidos (19%) e hidratos de carbono (8,5%) (Wintrobe's Clinical Hematology, novena edición, 1993, página 515). Los incrementos del índice de refracción de estos componentes son 0,00187/ (g/dl), 0,0017 /(g/dl) y 0,00143/ (g/dl), respectivamente (S. H. Armstrong y col., 1947, J. A. C. S., 69: 1747-1753; R. Barer y S. Joseph, 1954, Quarterly Journal of Microscopical Science, 95: 399-423). Usando las concentraciones relativas de estos componentes para asignar un incremento medio del índice de refracción a las plaquetas se proporciona un valor de 0,0018 (g/dl). De los componentes minoritarios, algunos tienen incrementos mayores del índice de refracción y algunos tiene incrementos menores. No se espera que el incremento medio de estos componentes varíe de forma significativa el valor asignado. Obsérvese que 0,0018 /(g/dl) también es el valor asignado al protoplasma por la bibliografía de la materia (R. Barer y S. Joseph, 1954, Quarterly Journal of Microscopical Science, 95: 399-423). Además de comunicar las cifras de E y PLT, el VPM, la CMCP y la MSPC, el sistema de la invención muestra histogramas de frecuencia del volumen plaquetario, la concentración del componente plaquetario y la masa seca plaquetaria (figura 4).

El sistema y procedimiento PLT1 puede usar los mismos reactivos químicos que el procedimiento del canal E/PLT que se emplea en el sistema TECHNICON H actual; el reactivo para la formación de esferas usado no afecta de forma adversa o actúa sobre las plaquetas. Es más, para las plaquetas que se han recogido en anticoagulante K_{3}EDTA y que se analizan según la invención no es necesaria la formación de esferas adicional. Por ejemplo, la figura 5A representa un citograma de dispersión/dispersión de PLT1 generado por el sistema y procedimiento PLT1 de la invención para plaquetas que se han anticoagulado en K_{3}EDTA y que después se han resuspendido en Solución de Diluyente de E. Como se ha comunicado en la técnica, las plaquetas esféricas el K_{3}EDTA da a las plaquetas forma de esferas, aunque de forma imperfecta (S. Holme y S. Murphy, 1980, J. Lab. Clin. Med., 96: 480-493, G. V. R. Born, 1970, J. Physiol., 209: 487-511). La figura 5B representa un citograma de dispersión/dispersión de PLT1 para una segunda alícuota de la misma muestra suspendida en suero salino isotónico tamponado con fosfato (PBS). Como se puede observar al comparar las figuras 5A y 5B, los dos citogramas resultantes del procedimiento y sistema de la invención tienen el mismo aspecto. Es más, los valores comunicados de los parámetros también son iguales, dentro de los límites de error producido por los instrumentos. Estos resultados demuestran que para que el procedimiento de la invención proporcione cifras exactas de E y resultados de los parámetros plaquetarios no se requiere un reactivo de formación de esferas de eritrocitos.

Además, las figuras 6A y 6B muestran un par correspondiente de citogramas de dispersión/dispersión de PLT1 generados que valoran plaquetas procedentes del mismo donante, a excepción de que como anticoagulante se usó una solución comercialmente disponible de ácido/citrato/dextrosa (ACD). En contraste con la acción del K_{3}EDTA, se sabe que el ACD no da forma esférica a las plaquetas (S. Holme y S. Murphy, 1980, J. Lab. Clin. Med., 96: 480-493, G. V. R. Born, 1970, J. Physiol., 209: 487-511. G. V. R. Born y col., 1978, J. Physiol., 280: 193-212.M. Frojmovic y R. Panjwani, 1976, Biophys. J., 16: 1071-1089). De nuevo, los citogramas tiene el mismo aspecto, aunque las muestras suspendidas en ACD dan lugar a citogramas que aparecen más difusos que los generados para las muestras suspendidas en K_{3}EDTA. Este carácter difuso se debe a la orientación aleatoria de las plaquetas no esféricas en la célula de flujo y no afecta de forma adversa a la sensibilidad y exactitud de los resultados obtenidos usando el sistema y procedimiento de la invención. Estos resultados demuestran que el diluyente de eritrocitos no da forma esférica a las plaquetas; de hecho, la forma esférica de las plaquetas no es necesaria para la exactitud de los resultados de la invención.

Como se describe en la presente memoria descriptiva, la presente invención demuestra por primera vez que las plaquetas esféricas, como los eritrocitos, se comportan "de forma eficaz" como esferas homogéneas en las condiciones de medición seleccionadas, incluso aunque las plaquetas no sean perfectamente esféricas y contengan gránulos de varios tipos, números e índices de refracción. Antes de la presente invención, se pensó que este procedimiento de análisis era eficaz sólo para partículas homogéneas esféricas (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 4.735.504 concedida a D. H. Tycko).

Otro aspecto de la invención es la aplicación de la Teoría de Dispersión de Mie a las mediciones de la dispersión en dos ángulos para el análisis plaquetario, usando los mismos o similares intervalos de ángulo adecuados para el análisis de eritrocitos. Antes de la presente invención, los expertos en la técnica conocían que el par seleccionado de intervalos de ángulo sólido usados para el análisis de eritrocitos era específico de este tipo celular, ya que, incluso para los eritrocitos, no todos los pares de ángulos proporcionaban análisis exactos (véase la patente de EE.UU. nº 4.735.504 concedida a. Tycko). Además, se mostró que el análisis de Tycko era eficaz sólo para los eritrocitos esféricos, que típicamente son aproximadamente 10 veces más grandes que las plaquetas (Es decir, VCM= 85 fl para los eritrocitos frente a VCM= 8,5 fl para las plaquetas); por tanto,. Los eritrocitos proporcionan señales para el análisis mucho mayores. Asimismo, hasta el momento de la invención descrita en la presente memoria descriptiva, los expertos en la técnica sólo conocían que dos intervalos del ángulo bastaban para el análisis de las partículas homogéneas y perfectamente esféricas y se suponía que las partículas imperfectamente esféricas requerían al menos tres intervalos de ángulo para el análisis. La presente invención demuestra por primera vez que los parámetros descritos anteriormente (es decir, par de ángulos sólidos y dos intervalos de ángulo), previamente usados sólo para el análisis de eritrocitos, también son eficaces para las determinaciones y mediciones exactas y sensibles de las partículas imperfectamente esféricas y no homogéneas, tales como las plaquetas, cuyo volumen normal varía de, aproximadamente, 2-20 fl.

Los procedimientos actuales actuales (tales como los de TECHNICON H Systems y los descritos en la patente de EE.UU. nº 4.735.504 concedida a Tycko) están diseñados sólo para el análisis de eritrocitos, como para determinar el volumen de eritrocitos y la concentración de hemoglobina celular. Por el contrario, el procedimiento PLT1 de la invención permite de forma ventajosa al análisis simultáneo de plaquetas y eritrocitos, cono se describe y se proporcionan ejemplos en la presente memoria descriptiva. En general, el procedimiento PLT1 demuestra por primera vez que un sistema automático, por ejemplo el Sistema H, puede configurarse para las determinaciones y análisis simultáneos de plaquetas y eritrocitos en un sistema óptico común., de acuerdo con la nueva metodología de la invención, sin sacrificar la exactitud y la precisión de ninguna de las determinaciones. Los análisis según la Teoría Mie por separado de plaquetas y eritrocitos se pueden llevar a cabo en señales recogidas por un único par de detectores ópticos de acuerdo con la invención, porque las plaquetas en una muestra de sangre entera se analizan con las condiciones de amplificación de señal y con las tablas de la Teoría de Dispersión de Mie que son particularmente adecuadas para el tipo de plaquetas en el sistema y procedimiento PLT1, mientras que los eritrocitos en la muestra de sangre entera se analizan con las condiciones de amplificación de señal y con las tablas de la Teoría de Dispersión de Mie que son adecuadas para eritrocitos.

Sólo el procedimiento y sistema PLT1 de la invención proporcionan mediciones automáticas de la masa seca plaquetaria media (MSPM), célula por célula o como media de la muestra. En principio, la MSPM (pero no la masa seca célula por célula o su distribución) se puede determinar a partir de las determinaciones de la concentración media del componente plaquetario, el VPM y % agua en las plaquetas, del siguiente modo:

MSPM (pg)= masa plaquetaria total media (pg) x (100-% agua)/100, donde la mas plaquetaria total media (pg)= densidad plaquetaria media (g/ml= pg/fl) x VPM (fl).

Sin embargo, estas determinaciones requieren medir la densidad plaquetaria (D. G. Penington y col., 1976, Br. J. Hemtol., 34,: 365-376; L. Corash y col., 1977, Blood, 49(1):71-85; C. B. Thompson y col., 1982, Br. J. Hematol., 50:509-519 y L. Corash y col., 1984, Blood, 64(1):185-193) y el % de agua (F. Gorstein y col, 1967, J. Lab. And Clin. Med., 70: 938-950); estas mediciones son tediosas, requieren tiempo y son inadecuadas para la automatización de alto rendimiento.

La media de los valores de MSPM determinados por el procedimiento y sistema PLT1 se puede comparar con las estimaciones indirectas basadas en los valores medios establecidos para la densidad plaquetaria, el VPM y el % de agua en las plaquetas. Generalmente, en la técnica se está de acuerdo en que para las plaquetas anticoaguladas en ACD y separadas según gradientes de estractano, la densidad plaquetaria media es de aproximadamente 1,065 g/ml (D. G. Penington y col., 1976, Br. J. Hemtol., 34,: 365-376; L. Corash y col., 1977, Blood, 49(1):71-85; C. B. Thompson y col., 1982, Br. J. Hematol., 50:509-519 y L. Corash y col., 1984, Blood, 64(1):185-193) y el VPM es de aproximadamente 6,5 fl (E. A. Trowbridge y col., 1985; Clin. Phys. Physiol. Meas., 6(3):221-238; L. Corash y col., 1977, Blood, 49(1):71-85; C. B. Thompson y col., 1982, Br. J. Hematol., 50:509-519). Sin embargo, el valor de VPM derivado de la técnica se basa en las mediciones de la impedancia en la apertura realizadas con dispositivos calibrados con perlas esféricas de poliestireno.Por tanto, las estimaciones del VPM para las plaquetas en ACD no esféricas son por lo general bajas (N. B. Grover y col., 1969, Biophys. J., 9: 1398; J. Hurley, 1974, Biophys. J., 10: 74.). Siendo el resto de valores iguales, las mediciones de la impedancia en la apertura en plaquetas con K3EDTA (es decir, plaquetas esféricas) son más exactas). Estos tipos de mediciones proporcionan valores de VPM de aproximadamente 8,5 fl para muestras frescas (de aproximadamente 1 hora) (E. A. Trowbridge y col., 1985; Clin. Phys. Physiol. Meas., 6(3):221-238).

Existe desacuerdo entre los expertos en la técnica con relación a si el K3EDTA hincha las plaquetas o no, además de darles forma esférica (véase, por ejemplo, S. Holme y S. Murphy, 1980, J. Lab. Clin. Med., 96: 480-493; E. A. Trowbridge y col., 1985; Clin. Phys. Physiol. Meas., 6(3):221-238;, G. V. R. Born, 1970, J. Physiol., 209: 487-511;, G. V. R. Born, 1978, J. Physiol., 280: 193-212). Se ha comunicado que las mediciones según el gradiente de densidad de las plaquetas con K3EDTA proporcionaron una densidad media de 1,060 g/ml (H.H.K. Watson y C. A. Ludlam, 1986, Br. J. Hematol., 62: 117-124). Una comparación de este valor con el valor de 1,065 g/ml de las plaquetas-ACD sugiere que el K3EDTA hincha las plaquetas en aproximadamente un 8%. Según esto, el valor de VPM para las plaquetas "no hinchadas"= 7,8 fl (que concuerda razonablemente bien con los valores publicados basados en las mediciones trombocríticas (S. Karpatkin y A. Charmatz, 1969, J. Clin. Invest., 48: 1073-1082) y con la microscopia óptica (M. Frojmovic y R. Panjwani, 1976, Biophys. J., 16: 1071-1089)). Usando de 7,8 a 8,5 fl como intervalo del VPM, el intervalo de la masa plaquetaria total media es de 8,31 pg a 9,05 pg. Las estimaciones del contenido % de agua varían de 74,6% a 77% (F. Gorstein y col, 1967, J. Lab. And Clin. Med., 70: 938-950; S. Karpatkin, "Compositions of platelets". En : Hematology, 2ª ed. 1977. McGraw-Hill, NY, páginas 1176-1178). Esto proporciona un intervalo de MSPM de 1,91 pg a 2,30 pg. El valor medio de 2,02 pg obtenido usando el PLT1 están dentro de este intervalo. Por el contrario, el valor más elevado publicado de MSPM, 2,8 pg, (S. Karpatkin, "Compositions of platelets". En: Hematology, 2ª ed. 1977. McGraw-Hill, NY, páginas 1176-1178) está muy lejos de este intervalo. Además, este valor no es probable en términos físicos, ya que equivale a un intervalo de la concentración del componente de 32,9 g/dl a 35,9 g/dl, que se superpone al intervalo de la concentración del componente de eritrocitos, 35 g/dl a 38 g/dl, para CMCM= 32 g/dl a 35 g/dl (J. W. Harris y R. W. Kellermeyer, 1972; En The Red Cell, 2ª ed., Harvard University Press, pág. 282). En consecuencia, las plaquetas de densidad media deberían encontrase dentro de la fracción de baja densidad de las poblaciones eritrocitarias normales. Sin embargo, este no es el caso, como se demuestra en la práctica habitual.

En otro aspecto, las mediciones de la actividad plaquetaria, proporcionadas por el procedimiento y sistema de la invención, son clínicamente útiles. En la actualidad, la citometría de flujo por fluorescencia (G. I. Johnston y col., 197, Blood, 69(5): 1401-1403; J. N. George y col., 1896, J. Clin. Invest., 78: 340-348); la medición de la densidad plaquetaria (D. G. Penington y col., 1976, Br. J. Hemtol., 34,: 365-376; L. Corash y col., 1977, Blood, 49(1):71-85; A. J. Friedhoff y col., 1978, Blood 51 (2): 317-323; C. B. Thompson y col., 1982, Br. J. Hematol., 50:509-519 y L. Corash y col., 1984, Blood, 64(1):185-193) y el % de agua (F. Gorstein y col, 1967, J. Lab. And Clin. Med., 70: 938-950) y la determinación del VPM (C. B. Thompson y col., 1983, Lab. Clin. Med., 101: 205-213) se usan para predecir la actividad de las plaquetas. Como se ha mencionado anteriormente en la presente, el primero de estos procedimientos, la citometría de flujo por fluorescencia, es tedioso, requiere tiempo y es caro. El segundo procedimiento, la medición de la densidad plaquetaria, es indirecto y está afectado por las condiciones de extracción y almacenamiento. Por tanto, en la técnica es deseable un procedimiento sencillo, rápido, barato y consistente para predecir la actividad plaquetaria.

La actividad plaquetaria potencial aumenta junto con el número y la masa de gránulos alfa y densos (L. Corash y col., 1977, Blood, 49(1):71-85; y L. Corash y col., 1984, Blood, 64(1):185-193). Dado que la masa seca de las plaquetas se correlaciona con el contenido en gránulos (Ibid.),m la actividad plaquetaria potencial aumenta con la MSPM. Por tanto, un aspecto del procedimiento PLT1 de la invención proporciona un procedimiento sencillo, exacto y barato para predecir la actividad plaquetaria. Además, la MSPM es un parámetro consistente ya que varía poco en las muestras que se han almacenado durante hasta aproximadamente 24 horas antes del análisis, incluso a temperatura ambiente. Además, laMSPM se comporta de forma predecible en el tiempo, en función de los coeficientes de correlación (r) (véase la tabla 1). La Tabla 1 presenta las determinaciones de la MSPM y CMCP de muestras de sangre de donante normal frente al tiempo y la temperatura (8 horas frente a 1 hora a temperatura ambiente (TA); 2 horas frente a 1 hora a TA; 8 horas a TA frente a 8 horas a 4ºC; y 24 horas a TA frente a 24 horas a 4ºC) producidas mediante el procedimiento y sistema PLT1. En las tablas relevantes presentadas a continuación en la presente, "r" es el coeficiente de correlación; "syx" es el error estándar de la estimación; "X media" es el valor medio para una variable independiente e "Ymedia" es el valor medio para una variable dependiente. Por tanto, se pueden obtener valores de MSPM incluso más exactos para muestras frescas mediante la extrapolación de muestras más viejas y almacenadas, dada la edad y la temperatura de almacenamiento de una muestra in vitro. Por ejemplo, dada una velocidad de disminución del 4% por 24 horas a temperatura ambiente y una MSPM de 2,00 pg a 24 horas, la MSPM de la muestra fresca sería de 2,08 pg. Un hecho notable es que el sistema PLT1 comunica esencialmente los mismos valores de MSPM para las muestras de sangre anticoagulada con K_{3}EDTA y con ACD (tabla 2 y figuras 5ªAy 5B). Esto es sorprendente a la luz del hecho de que las plaquetas en ACD no son esféricas, pero sí lo son en K_{3}EDTA. Por tanto, el procedimiento PLT1 de la invención es versátil y proporciona resultados exactos y fiables de la MSPM para el análisis de las plaquetas suspendidas en ambos tipos de anticoagulantes.

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La CMCP está relacionada de forma lineal con el índice de refracción de las plaquetas, que a su vez está relacionado de forma lineal con la densidad plaquetaria. Los resultados del Ejemplo 4 a continuación, en el que los valores de la CMCP obtenidos de acuerdo con los procedimientos de la invención se compararon con los datos de citometría de flujo por fluorescencia para la respuesta a la dosis de plaquetas normales al agonista de plaquetas trombina, demuestran que los valores de CMCP se correlacionan con el estado de activación PLT (figuras 14A-14D). Es un hecho significativo que el procedimiento de la invención para estudias activación PLT es barato, rápido y de uso muy sencillo. Además, los análisis de los datos se automatizan con facilidad. Es más, la información que se puede obtener mediante el uso del procedimiento de la invención es esencialmente uniforme entre un instrumento y otro, si y cuando se usan diferentes instrumentos para llevar a cabo el procedimiento.

El procedimiento es especialmente adecuado para el análisis de muestras de sangre que se han anticoagulado en citrato sódico o en ácido etilendiamina tetracético (EDTA), preferentemente K3EDTA. Como apreciarán los expertos en la técnica, las soluciones de citrato sódico o K3EDTA se pueden mezclar con una muestra de sangre, o citrato sódico o K3EDTA en forma seca (es decir, en polvo) se puede disolver en la muestra de sangre para usar como anticoagulante. Como guía de ejemplo, se usan aproximadamente de 7 a 14 mg de K3EDTA en polvo por cada tubo de 7cc. El citrato sódico se usa de forma rutinaria en forma de solución a 2,0 a 5 g/dl, preferentemente a 3,2 a 3,8 g/dl por tubo y en una proporción final de 1 parte de citrato sódico por 9 partes de sangre entera. Como también apreciarán los expertos en la técnica, el K3EDTA es, con mucho, el anticoagulante más usado para los análisis automáticos de hematología. A este respecto, de forma ventajosa, la presente invención proporciona una valiosa alternativa a los procedimientos anteriores de medición de plaquetas y plaquetas activadas usando anticuerpos, que no puede emplear soluciones que contengan EDTA debido al efecto perjudicial que tales soluciones ejercen sobre la integridad de los sitios de unión epitópicos entre los anticuerpos y las estructuras moleculares a la que se unen.

Otro aspecto de la invención es proporcionar un procedimiento y sistema automatizado para valorar la relación entre los valores de MSPM y el estado de la enfermedad/o los regímenes de tratamiento de la enfermedad (véase el Ejemplo 2). La invención proporciona un procedimiento conveniente para determinar el efecto de, por ejemplo, los tratamientos de quimio o radioterapia sobre el contenido en gránulos de las plaquetas de un paciente, mediante la medición de la MSPM. En la actualidad se cree que la trombocitopenia asociada con la destrucción periférica de las plaquetas tiene como resultado una plaquetas más grandes de lo normal, mientras que el mismo trastorno causado por un trombopoyesis reducida da como resultado plaquetas pequeñas o de tamaño normal (J. D. Bessman y col., 1982, Am. J. Clin.Pathol., 78: 150-153; R. B. Nelson y D. Kehl, 1981, Cancer, 48: 954-956). Además, el incremento de tamaño de las plaquetas está asociado con el infarto de miocardio (A. Eldor y col., 1982, Br. Med. J., 285: 397-400; H. A. Cameron y col., 1983, Br. Med. J., 287: 449-451; J. F. Martin y col., 1983, Br. Med. J, 287: 486-488). En vista de la correlación entre el VPM y la masa seca plaquetaria (L. Corash y col., 1977, Blood, 49(1):71-85; y L. Corash y col., 1984, Blood, 64(1):185-193), cabría esperar que un valor elevado de MSPM estuviera asociado con trombocitopenia destructiva y un valor de MSPV bajo lo estuviera la trombopoyesis reducida. Además, es probable que la MSPM elevada sea predictiva de potencial trombótico.

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Los siguientes ejemplos son ilustrativos de la invención. Se presentan para facilitar la comprensión de los conceptos de la invención y de ningún modo deben interpretarse como limitantes del alcance de la presente invención.

Ejemplos Ejemplo 1

Este ejemplo describe el rendimiento de la ganancia elevada del canal PLT1 y el procedimiento de análisis de plaquetas de la invención probado en aproximadamente 75 muestras de sangre normal (obtenidas de donantes de Bayer Corporation). Para las comparaciones de referencia entre el procedimiento y el sistema PLT1 de la invención y los sistemas frente a los procedimientos usados en la técnica, las muestras de sangre con plaquetas se analizaron usando el analizador automático TECHNICON H2, el analizador Coulter STKS y el mejorado y más exacto sistema PLT1. Para referencia visual, para cada muestra también se prepararon extensiones de sangre marcada. Las cifras de plaquetas, los valores de VPM y las cifras de E se compararon entre los modos de análisis enumerados anteriormente. También se recogieron datos para dos parámetros nuevos para la metodología automática y se introdujeron en la técnica por el sistema y el procedimiento PLT1 de la presente invención, a saber, la Masa Seca Plaquetaria Media (MSPM) y la Concentración Media del Componente Plaquetario (CMCP).

Todas las muestras se recogieron en recipientes al vacío con K3EDTA. Las muestras se analizaron después de 1 hora de almacenamiento a temperatura ambiente, después de 8 horas a temperatura ambiente y a 4ºC y después de 24 horas a temperatura ambiente y a 4ºC.

Para realizar los análisis de plaquetas con los sistemas TECHNICON H2 y Coulter STKS, los sistemas se normalizaron y calibraron según las instrucciones del fabricante. Todas las muestras se utilizaron y analizaron por duplicado. Además, las muestras se utilizaron y analizaron por duplicado en el sistema de prueba PLT1, que se normalizó y calibró como se ha descrito anteriormente.

Para todas las muestras se prepararon extensiones de sangre. A las extensiones se aplicó la tinción de Wright-Giemsa con Hema-Tek 2000 Slide Stainer disponible comercialmente (Bayer Corporation).

Los resultados de los análisis de sangre normal y los datos comparativos de exactitud la cifra de PLT se presentan en la Tabla 3; los datos comparativos de la exactitud del VPM se presentan en la Tabla 4; los datos comparativos de la exactitud de la cifra de E se presentan en la Tabla 5; y los datos de la exactitud del VPM de la MSPM y la CMCP se presentan en la Tabla 1;

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TABLA 4

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Cifra de plaquetas: La cifra de plaquetas obtenida del procedimiento PLT1 concordó bien con las cifras obtenidas en los procedimientos H2 y STKS Systems, ambos dispositivos de contaje de plaquetas ampliamente aceptados. Debe observarse que en el procedimiento PLT1 no se aplicó ningún factor de calibración de la cifra de plaquetas, mientras que los factores de calibración para los sistemas H'' y STKS fueron 0,85 y 1,02, respectivamente. Esto sugiere que al tecnología actual del Sistema H2 incluye un número significativo de partículas que no son plaquetas en su contaje bruto de plaquetas.

VPS: En la actualidad no hay un procedimiento en la técnica para medir el VPM que se considere de referencia. Por tanto, las comparaciones entre los procedimientos se refieren al comportamiento cualitativo de las plaquetas. La figura 4 recoge u histograma típico del volumen plaquetario de una muestra normal para el procedimiento PLT1. Representa una distribución log-normal de los volúmenes plaquetarios, de acuerdo con los resultados publicados (J. M. Paulus, 1975, Bood, 46 (3): 321-336). Las distribuciones típicas de los volúmenes plaquetarios para los sistemas H2 y STKS también son log-normal. Para las muestras normales, los valores del VPM obtenidos usando el sistema PLT1 de la invención y los comparativos con el sistema Coulter STKS indicaron que el VPM aumenta con el tiempo de almacenamiento, mientras que los valores obtenidos con el sistema TECHNICON H2 indicaron una disminución (véase la tabla 4). Este patrón para H2 frente a PLT1 y STKS concordó con el patrón obtenido usando el sistema TECHNICON H6000 frente al sistema Coulter S+, según han publicado Trowbridge y col. (E. A. Trowbridge y col., 1985; Clin. Phys. Physiol. Meas., 6(3):221-238). Como se ha publicado en el artículo de Trowbridge y col., el Sistema TECHNICON H6000 (así como en el sistema TECHNICON H2), el volumen plaquetario es proporcional a la intensidad de dispersión de ángulo alto (5-10 grados en el H6000™ y de 5-15 grados en el sistema H2). La teoría de dispersión de Mie muestra que la dispersión en estos ángulos es sensible al índice de refracción, como se ha explicado anteriormente en la Descripción Detallada de la Invención. Dado que las plaquetas maduran ex vivo, se hinchan y se hacen menos refractantes a causa de la captación de agua (S. Holme y S. Murphy, 1980, J. Lab. Clin. Med., 96: 480-493). Esta hinchazón reduce su intensidad de dispersión de ángulo alto, lo que, por tanto, causa que los sistemas H6000 y H2 comuniquen una disminución del VPM cuando, de hecho, el VPM ha aumentado. Sin embargo, según las mediciones realizadas con el sistema Coulter S+ y el sistema Coulter STKS y mediante otros dispositivos de la impedancia en la apertura, le volumen plaquetario es proporcional a la impedancia eléctrica. Por tanto, estos últimos sistemas comunicaron de forma correcta el aumento del VPM debido a la hinchazón, dado que la impedancia aumenta a medida que la célula se hincha. Dado que el sistema PLT1 de la invención convierte las señales de dispersión de ángulos alto y bajo en volúmenes e índices de refracción usando la Teoría de la Dispersión de Mie, como se ha descrito anteriormente, el sistema y el procedimiento PLT1 también comunican de forma correcta el aumento del VPM debido a la hinchazón.

Cifras de E: las cifras de E determinadas por el sistema PLT1 de la concordaron bien con las cifras obtenidas en los procedimientos TECHNICON H2 y el sistema Coulter STKS Systems, ambos dispositivos de contaje de E aceptados.

MSPM: La figura 4 muestra un histograma típico y representativo de la masa seca de plaquetas obtenido con el sistema PLT1 e indica que la masa seca de plaquetas presenta una distribución log-normal en una muestra. Esto concuerda con los resultados obtenidos en estudios de microscopia electrónica (G. F. Bahr y E. Zeitler, 1965, Lab. Invest., 14(6): 217-239) y las conclusiones basadas en las mediciones en el gradiente de densidad (L. Corash y B. Shafer, 1982, Blood, 60(1):166-171). Según las mediciones con el sistema PLT1, un valor de MSPM típico para una muestra normal almacenada durante 1 hora a temperatura ambiente es 2,02 pg. Este valor concuerda de forma excelente con la mayoría de los valores publicados, que son 2,5, 2,8, 2.06, 21, y 2,06 pg, respectivamente (G. F. Bahr y E. Zeitler, 1965, Lab. Invest., 14(6): 217-2393; F. Gorstein y col, 1967, J. Lab. And Clin. Med., 70: 938-950; S. Karpatkin, "Compositions of platelets". En : Hematology, 2ª ed. 1977. McGraw-Hill, NY, páginas 1176-1178; T. C. Bithell, 1993; "Platelets and megakaryocytes" En: Wintrobe's Clinical Hematology, 9ª ed. Vol. 1Lea y Febiger, Filadelfia, PA, páginas 511-529; y E.E. Woodside y W. Kocholaty, 1960, Blood, 16:1173-1183). El valor de la MSPM disminuyó sólo ligeramente en 24 horas, es decir un 3,5%, cuan do las muestras se almacenaron a temperatura ambiente y en un 1,5% cuando las muestras se almacenaron a 4ºC (tabla 1).

CMCP: La figura 4 también muestra un histograma típico y representativo de la concentración del componente plaquetario obtenido con el sistema PLT1, que sigue una distribución normal (es decir, muestra una distribución normal gausiana) para muestras frescas. Esto concuerda con los resultados de las mediciones del gradiente de densidad (H.H.K. Watson y C. A. Ludlam, 1986, Br. J. Hematol., 62: 117-124; J.F. Martin y col., 1983, Br. Med. Hematol, 54:337-352). El valor de CMCP medio obtenido con el sistema PLT1 para muestras almacenadas durante 1 hora a temperatura ambiente fue 25,6 g/dl. Para comparar este valor con los valores publicados para % sólidos, es necesario determinar las densidades de los componentes no acuosos. Como se ha descrito, la composición plaquetaria relativa de proteínas/lípidos/hidratos de carbono es 57/19/8,5 y los valores de densidad respectivos para estos componentes son 1,33 g/ml, 0,93 g/ml y 1,50 g/ml, respectivamente (R. Barer y S. Joseph, 1954, "General Cytochemical Methods", Quarterly Journal of Microscopical Science, 95:399-423); por tanto, la densidad media de los componentes sólidos es 1,26 g/ml. Por tanto, el volumen ocupado por 25,6 g de componentes plaquetarios en un dl de plaquetas se calcula del siguiente modo: 25,6 g x (1 ml/1,26 g)= 20,3 ml o 0,203 dl. El volumen restante por dl (es decir, el agua) es: 1,000 dl-0,203 dl= 0,797 dl. A una densidad de 1 g/ml, la masa de este volumen de agua es 79,7 g. Por tanto, el % de sólidos = (25,6/(79,7 + 25,6)) x 100= 24,3%. Si el K3EDTA hincha las plaquetas en un 8%, como se ha descrito anteriormente, el % de sólidos= 25,8%. Este intervalo de 24,3% a 25,8% está próximo al intervalo de valores publicados, a saber, 23% a 25,4% (F. Gorstein y col, 1967, J. Lab. And Clin. Med., 70: 938-950; S. Karpatkin, "Compositions of platelets". En : Hematology, 2ª ed. 1977. McGraw-Hill, NY, páginas
1176-1178).

La CMCP disminuyó de forma significativa en 24 horas; se redujo en un 14% para las muestras almacenadas a 4ºC y en un 22% para las muestras almacenadas a temperatura ambiente (Tabla 1). Los análisis estadísticos de la CMCP medida en varios momentos y temperaturas aparecen en la Tabla 6. Los datos muestran que, a temperatura ambiente, los valores de CMCP para las muestras analizadas a 1, 8 y 24 horas, respectivamente, no se superponen unos con otros, dentro de una DE de 1,5. Por tanto, se puede determinar si una muestra es de 1, 8 ó 24 horas con una confianza del 87% mediante la medición de su CMCP. En consecuencia, los valores de la CMCP se pueden usar para controlar la edad de la muestra in vitro. Una variedad de parámetros hematológicos, como el VCM, la CHCH, el HCT y el VPM, es sensible a la edad de la muestra. Por consiguiente, se pueden extraer falsas conclusiones de trastornos tales como macrocitosis, hipocromía, anemia y potencial trombótico plaquetario si se ignoran los efectos de la edad de la muestras y si de muestras viejas no se obtienen datos exactos ni fiables. Por tanto, cabe esperar que el control de la edad de la muestra por medio de los valores de la CMCP usando el procedimiento y el sistema de contaje y análisis de plaquetas posea un valor clínico significativo.

Ejemplo 2

Este ejemplo describe el rendimiento del procedimiento de análisis de plaquetas y del canal PLT con ganancia incrementada (PLT1) de la invención probado en aproximadamente 70 muestras de sangre anómala (obtenidas del Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC), Nueva York). Todas las muestras tenían un número de plaquetas por debajo de 100.000/T1 y se analizaron como ser describe en el Ejemplo 1. Además, las cifras de plaquetas se determinaron mediante microscopia de contraste de fase, ya que la validez del contaje de plaquetas automático no está bien establecida en la actualidad para todas las muestras trombocitopénicas (K. Mayer y col., 1980, Am. J. Clin. Pathol., 74: 135-150; P. J. Cornbleet y S. Kessinger, 1985, Am. J. Clin. Pathol., 83: 78-80). Bayer Corporation suministró las muestras aproximadamente 4 horas después de su extracción y se analizaron a temperatura ambiente a la llegada. Las muestras se volvieron a analizar tras 28 horas de almacenamiento a temperatura ambiente. Los resultados se presentan más adelante en las Tabla 7 y la figura 12.

Cifras de plaquetas: La cifra de plaquetas obtenida usando el procedimiento y el sistema PLT1 de la invención concordó bien con las cifras obtenidas con la microscopia de contraste de fase para las muestras almacenadas a temperatura ambiente durante 4 horas. Las cifras de plaquetas también concordaron con las cifras obtenidas en los sistemas TECHNICON H2 y Coulter STKS Systems, con notables excepciones, uno de los cuales se describe en el Ejemplo 3 más adelante.

VPM: Para las muestras anómalas, los resultados de los sistemas TECHNICON H Y Coulter STKS concordaron mejor entre sí que con los resultados obtenidos usando PLT1, aunque lo opuesto fue cierto para las muestras normales. La razón de esto se hace evidente cuando se comparan los histogramas representativos del volumen plaquetario. La figura 8 muestra que los histogramas del volumen plaquetario generados mediante el sistema TECHNICON H.2 y el sistema Coulter STKS incluyeron partículas de interferencia en los canales bajos. Estas partículas distorsionaron las distribuciones log-normal del volumen plaquetario y como resultado los sistemas dieron valores de VPM por debajo de lo real. Por el contrario, el procedimiento PLT1 de la invención excluyó la mayoría de estos tipos de partículas de interferencia, como indica su distribución log-normal del volumen plaquetario. Por tanto, elPLT1 comunicó un valor de VPM superior de lo que lo hicieron los otros sistemas. Además, las figuras 9A-9D muestran que, según las mediciones del sistema H.2 y del sistema Coulter STKS, el VPM está directamente relacionado con la cifra de plaquetas (hasta 20.000/T1), mientras que las figuras 10A y 10B muestran que, según las mediciones del sistema PLT1, el VPM y la cifra de plaquetas están inversamente relacionados en las muestras normales y en la mayoría de las muestras trombocitopénicas (J. D. Bessman y col., 1982, Am. J. Clin.Pathol., 78: 150-153; J. Levin y J. D. Bessman y col., 1983, J. Lab. Clin. Med., 101: 295-307; J. D. Bessman y col., 1981, Am. J. Clin.Pathol., 76: 289-293; C. Giles, 1981, Br, J, Hematol., 48: 31-37). Por tanto, la los artículos publicados están de acuerdo con los resultados generados por el sistema PLT1 de la invención. Asimismo, las mediciones por microscopia relacionadas con el tamaño en extensiones de sangre marcada indicaron que las muestras TCP contenían plaquetas relativamente más grandes que las muestras normales. Para las muestras normales, los tres sistemas indicaron que el VPM y las cifras de PLT estaban inversamente relacionadas (figura 11), en concordancia con los hallazgos comunicados por los expertos en la
técnica.

En la actualidad, el VPM es un parámetro largamente olvidado en el análisis de las plaquetas, incluso aunque se puede usar para distinguir entre varios trastornos hematológicos (J. Zeigler y col., 1978, Blood, 51(3): 479-486; M. Kraytman, 1973, Blood, 41(4):587-597; Bessman y col., 1982, Am. J. Clin.Pathol., 78: 150-153; J. Levin y J. D. Bessman y col., 1983, J. Lab. Clin. Med., 101: 295-307; C. Giles, 1981, Br, J, Hematol., 48: 31-37; A. Eldor y col., 1982, Br. Med. J., 285: 397-400; H. A. Cameron y col., 1983, Br. Med. J., 287: 449-451; J. F. Martin y col., 1983, Br. Med. J, 287: 486-488; G. A. Threatte, Clin. Lab. Med., 1993, 13 (4): 937-950). La razón para el desacuerdo en la técnica acerca de los valores del VPM es que, antes de la presente invención los valores de VPM se consideraban poco fiables. (E. A. Trowbridge y col., 1985; Clin. Phys. Physiol. Meas., 6(3):221-238; G. A. Threatte y col., 1984, 13 Am. J. Clin. Path., 81: 769-772) por las siguientes razones posibles:

1)

con frecuencia se obtienen diferencias significativas en los valores del VPM debido a las condiciones de almacenamiento de la muestra de sangre entre los instrumentos usados para el sistema convencional TECHNICON H. Y para el sistema de la impedancia en la apertura (E. A. Trowbridge y col., 1985; Clin. Phys. Physiol. Meas., 6(3):221-238; G. A. Threatte, Clin. Lab. Med., 1993, 13 (4): 937-950; U. Lippi y col., 1987, Am. J. Clin. Pathol., 87: 391-393);

2)

ni el sistema convencional del H.O Systems ni los dispositivos para la impedancia en la apertura comunican un VPM exacto para las muestras trombocitopénicas, como se ha demostrado anteriormente; y

3)

El VPM es sensible a las condiciones de extracción y de almacenamiento (C. B. Thompson y col., 1983, Am. J. Clin. Pathol., 89: 327-332; S. Murphy y F. H. Gardner, 1971, J. Clin. Invest., 50: 370-377; B. S. Full y M. B. Zucker, 1965, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 120: 296-301; J. G., White y W. Krivit, 1967, Blood, 30 (5): 625-635.).

Por el contrario, los resultados del VPM obtenidos usando el sistema PLT1 de acuerdo con la presente invención son válidos por las siguientes razones:

1)

la concordancia cualitativa y cuantitativa entre los resultados obtenidos para las muestras normales almacenadas en varias condiciones por procedimientos independientes, a saber, los sistemas PLT1 y de impedancia en la apertura, coloca las mediciones del VPM con ambos sistemas, PLT1 e impedancia en la apertura, sobre terreno más firme;

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2)

los resultados en PLT1 del VPM de muestras trombocitopénicas concuerdan de forma cualitativa con los resultados comunicados en la bibliografía en una variedad de condiciones; y

3)

El PLT1 controla el efecto del almacenamiento de las muestras sobre el VPM mediante la medición de la CMCP, como se comenta más adelante en la presente.

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10

11

Cifra de E: los resultados según el sistema PLT1 de la concordaron bien con los resultados obtenidos con los modos de análisis de los procedimientos TECHNICON H2.

MSPM: la masa seca plaquetaria siguió una distribución log-normal para las muestras del hospital y esta distribución era reconocible incluso para las muestras que proporcionaron para el análisis tan pocas señales brutas de plaquetas como 150 (figura 8). Para las muestras hospitalarias almacenadas a temperatura ambiente durante 4 horas, un valor de MSPM típico fue 2,04 pg, que fue efectivamente igual al valor obtenido para las muestras normales almacenadas durante 1 hora a temperatura ambiente. Por tanto, mediante el uso del sistema PLT1 de la invención se mostró que la MSPM tenía la misma estabilidad en el tiempo para las muestras tanto hospitalarias como normales.

La figura 7 representa gráficos que exhiben valores de MSPM para muestras normales a varios tiempos y condiciones de temperatura (eje Y) frente a la MSPM para las muestras almacenadas durante 1 hora a temperatura ambiente (eje X). Se muestran grupos únicos de valores de MSPM centrados a 2 pg (los valores medios para las muestras normales). La figura 8 muestra el gráfico correspondiente para el conjunto de muestras anómalas e indica la presencia de dos grupos, uno centrado en 2,0 pg y uno a 2,3 pg. Es probable que los grupos diferentes estén relacionados con las diferencias en la potencial actividad trombótica. El mayor el valor de la MSPM para las muestras hospitalarias, es decir, las muestras anómalas, es indicativo de que las plaquetas en estas muestras anómalas tienen más actividad potencial que las de las muestras normales. Como se ha descrito anteriormente en la presente, el procedimiento de la invención para el análisis de plaquetas y los valores de la MSPM obtenidos con el mismo proporcionan un medio para valorar la relación entre los valores de MSPM elevados y loes estados de la enfermedad y/o los regímenes de tratamiento de la enfermedad.

CMCP: las muestras anómalas almacenadas durante 4 horas a temperatura ambiente tenías un valor de CMCP típico de 22,1 g/dl (tabla 6), que era 0,7 g/dl menor al valor determinado para las muestras normales almacenadas durante 8 horas a temperatura ambiente. Los valores de la CMCP obtenidos usando PLT1 exhibieron la misma dependencia del tiempo para las muestras hospitalarias que para las muestras normales.

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Ejemplo 3

Aunque la mayoría de las muestras anómalas descritas en el Ejemplo 2 produjeron cifras de plaquetas similares al margen del procedimiento de medición empleado, un pequeño número de muestras anómalas produjo resultados que diferían ampliamente en función del procedimiento de análisis. Una de tales muestras procedente de un donante trombocitopénico se describe en este ejemplo. La tabla 8 presenta los datos comparativos de las cifras de plaquetas (las muestras se realizaron por duplicado en los sistemas automáticos) y la figura 13 muestra los histogramas producidos por cada uno de los procedimientos automáticos. Como se muestra, sólo el sistema PLT1 de la invención dio cifras de plaquetas que concordaban con las cifras obtenidas mediante la microscopia de contraste de fases para ambas mediciones duplicadas. Las cifras según el sistema TECHNICON H2 fueron aproximadamente el doble de las cifras de la microscopia de contraste de fases. El sistema Coulter STKS comunicó correctamente la cifra de plaquetas en sólo uno de los duplicados y dio blanco en el otro. Asimismo, los histogramas del volumen generados con los sistemas TECHNICON H2 y Coulter STKS no tenían una distribución log-normal, ya que incluían interferencias producidas por fragmentos de eritrocitos. Por tanto, estos dos sistemas proporcionaron valores de VPM que fueron inferiores al valor real, según la observación microscópica de la extensión de sangre. El histograma del volumen generado por el sistema y el procedimiento PLT1 fue log-normal y el valor de VPM comunicado estaba dentro del intervalo de las muestras trombocitopénicas y también concordaba de forma cualitativa con la observación microscópica. Además, la concentración del componente plaquetario determinada por el sistema PL1 siguió una distribución aproximadamente normal y la de la masa seca de las plaquetas también era log-normal, lo que demuestra que las partículas que se contaron como plaquetas en las muestras anómalas por la presente invención, también poseían las características físicas de las plaquetas.

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Ejemplo 4

Este ejemplo describe experimentos realizados para medir la respuesta a la dosis a la activación in vitro de las plaquetas por la trombina. Para estos experimentos se extrajo una muestra de sangre de un donante humano adulto normal no fumador y que no estaba recibiendo tratamiento con aspirina. Las muestras se recogieron en citrato sódico y en K3EDTA como anticoagulantes. Una comparación de los resultados basada en el uso de los anticoagulantes que comprendía K3EDTA con los que usaban citrato sódico demuestra la utilidad del K3EDTA para los estudios de activación plaquetaria con los nuevos procedimientos de la invención.

La activación plaquetaria inducida por trombina se medió mediante detección por citometría de flujo por fluorescencia de un aumento de la expresión en la superficie celular de una proteína granular-I (GMP-140) usando el anticuerpo monoclonal conjugado con ficoeritrina CD62-PR. La expresión de GMP-140 está asociada con la liberación de gránulos I. Este análisis se hace posible mediante la inclusión del tetrapéptido glicil-L-prolil-L-arginil-L-prolina (GPRP) descrito por Michelson y col., (A. D. Michelson y col., 1991, Blood, 77: 770-779). El GPRP inhibe la agregación plaquetaria y la formación de coágulos de fibrina y, por tanto, permite el análisis célula a célula.

Preparación de la muestra

Se diluyó sangre entera a 1:10 en PBS complementado con 0,35% de seroalbúmina bovina. Las alícuotas de sangre entera diluida (300 T1) se incubaron durante 5 minutos en presencia de GPRP 2,5 mM (concentración final).

A las muestras de prueba se añadió I-trombina a concentraciones finales de 0,002 U/ml a 0,087 U/ml, como se indica en las figuras 14A-D. A las muestras control se añadió PBS. Las muestras se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente y después se diluyeron a 1:1 en 1% de paraformaldehído (en PBS) y se incubaron durante otros 30 minutos a temperatura ambiente. A todas las muestras analizadas con citometría de flujo por fluorescencia se añadieron concentraciones saturantes de anticuerpos monoclonales específicos de plaquetas dirigidos contra el receptor de superficie GP1bIX (CD42a, conjugado con FITC, y CD62-PE), y las muestras se incubaron durante 15 minutos. Esta etapa se omitió para las muestras analizadas mediante el procedimiento practicado de acuerdo con la invención. Se añadió PBS hasta una dilución final de 1:600, antes de analizar las muestras.

Análisis de las muestras

Las muestras se analizaron mediante un citómetro de flujo FacScan usando un software de análisis y adquisición FACStation-CellQuest (Becton Dickinson, San José, CA) equipado con un láser de ion argón que funciona a 488 nm. La fluorescencia de FITC Y ficoeritrina se detectó usando filtros de paso de banda de 525 nm y 575 nm, respectivamente. Las plaquetas se identificaron por su perfil de dispersión frontal (FSC) frente al de dispersión lateral (SSC), así como mediante positividad FITC (fluorescencia verde, FL1). Las plaquetas activadas se identificaron por su positividad a PE (fluorescencia roja, FL2), es decir, FSC frente FL2.

Tras la identificación de las plaquetas acotando la dispersión de la luz y positividad a FITC, la unión del marcador de activación CD62 se determinó mediante el análisis de 5.000 sucesos de plaquetas por Fluorescencia PE. La unión de fondo, medida usando el anticuerpo isotípico IgG, se restó de cada muestra. Los resultados se comunicaron como la intensidad media de fluorescencia (IF, unidades arbitrarias) para todas las muestras. La IF es más favorable a la comparación con la CMCP que el % de positividad, ya que ni la IF ni la CMCP requirió el establecimiento de umbrales arbitrarios. Además, las muestras se analizaron mediante el procedimiento de la invención de la dispersión de la luz/absorción durante las dos horas tras la recogida.

El procedimiento de la invención y la metodología de citometría de flujo por fluorescencia se compararon midiendo la activación plaquetaria frente a la trombina añadida (figuras 14A-14D). Los resultados muestran que el procedimiento de dispersión de luz de la invención sigue la activación plaquetaria relacionada con la dosis de trombina para las muestras de sangre anticoaguladas con citrato sódico (círculos vacíos) y K3EDTA (cuadrados vacíos). Como se puede observar, a medida que las concentraciones de trombina aumentan, la CMCP disminuye.

Ejemplo 5

Este ejemplo describe experimentos realizados para medir la autoactivación plaquetaria in vitro en K3EDTA. Para estos experimentos se extrajo una muestra de sangre de un donante humano adulto normal y se recogió en K3EDTA como anticoagulante. Las muestras se prepararon y analizaron como se describe en el Ejemplo 4, pero sin activación con trombina y añadiendo paraformaldehído a los tiempos indicados. La tabla 4 presenta los resultados del curso del tiempo de la autoactivación plaquetaria en presencia de K3EDTA.

TABLA 9

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La tabla 9 muestra que las plaquetas en las muestras almacenadas en EDTA sufren activación que aumenta con el tiempo. Por tanto, las mediciones de la actividad plaquetaria basadas en fluorescencia y la basadas en la dispersión de la luz deben tener en cuenta el envejecimiento de la muestra in vitro.

Ejemplo 6

Este ejemplo describe experimentos realizados para medir el estado de activación de las plaquetas ex vivo. Para estos experimentos se extrajeron muestras de sangre de un donante humano adulto normal y de tres donantes diabéticos. Las muestras se recogieron en K3EDTA como anticoagulante. Las muestras se prepararon y analizaron como se describe en el Ejemplo 4, a excepción de que no se añadió ni trombina ni paraformaldehído. Las muestras se analizaron 7 horas después de su recogida. Los resultados de estos análisis se muestran en la tabla 10.

TABLA 10

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La tabla 10 indica que las mediciones de CMCP y de IF distinguen entre las muestras de sangre que exhiben activación plaquetaria ex vivo (Diabéticos 1 y 2) y las que no (diabético 3). Se puede observar que la IF es mayor y la CMCP menor de lo esperado, según la observación de las figuras 14ª-14D. Esto sugiere que las tres muestras de los diabéticos están activadas, pero que la tercera muestra está menos activada que las dos primeras. LA CMCP de una muestra de sangre normal también muestra que, incluso para muestras normales, la CMCP medida 7 horas después de su recogida en solución de EDTA es menor que la de las muestras recién extraídas. ND indica No determinado. La razón para la disminución del valor de la CMCP y el incremento de la IF es que las plaquetas almacenadas en EDTA se autoactivan de forma progresiva con el tiempo, como se muestra en el Ejemplo 5 anterior. Sin embargo, la CMCP, así como la IF, distinguen entre las muestras que experimentan activación in vivo y las que no.

Claims (25)

1. Un procedimiento automático para la discriminación precisa de las plaquetas de otras células en base célula a célula en una muestra de sangre completa normal o anómala y para determinar los parámetros plaquetarios cualitativos y cuantitativos, que comprende las etapas de:

a) analizar una alícuota de dicha muestra, esencialmente una célula cada vez cuando atraviesa una fuente de luz centrada para producir un patrón de dispersión frontal de la luz, que representa la intensidad de la luz dispersada por unidad de ángulo de dispersión como función del ángulo de dispersión, y dicha intensidad de dispersión de la luz se mide en dos intervalos de ángulo sólido en dos canales ópticos a valores de señal incrementados en el primer y segundo canales ópticos, para producir dos mediciones de la intensidad de la dispersión suficientes para distinguir en dicha muestra las plaquetas de las que no lo son, en el que dicho valor de señal del primer canal óptico deriva de un incremento en la ganancia de un detector de ángulo alto y dicho valor de la señal del segundo canal óptico deriva de un incremento en la ganancia de un detector de ángulo bajo; y

b) distinguir dichas plaquetas de dichas no plaquetas en dicha muestra y determinar dichos parámetros plaquetarios por la presencia de señales de plaquetas derivadas de la dispersión de la luz en un mapa del volumen frente al índice de refracción.

2. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que dichas plaquetas se distinguen de dichas no plaquetas en base a una distribución normal de los índices de refracción de dichas plaquetas.

3. El procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que se determinan los parámetros de volumen plaquetario, concentración del componente plaquetario y masa seca plaquetaria, y además comprende las etapas de:

c) convertir dichos valores de señal de dispersión de la luz en un primer y un segundo canales ópticos en un valor de volumen plaquetario y un valor de índice de refracción de dichas plaquetas.

d) convertir dicho valor del índice de refracción plaquetaria en un valor de la concentración del componente plaquetario; y

e) computar un valor de masa seca plaquetaria como un producto de dicho valor de la concentración del componente plaquetario y dicho valor del volumen plaquetario de las etapas c) y d).

4. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que se determina el parámetro de la cuenta de plaquetas, que además comprende las etapas de:

f) mostrar histogramas de dichos volúmenes plaquetario, concentraciones del componente plaquetario y masas secas plaquetarias; y

g) determinar dicha cuenta de plaquetas en función del volumen plaquetario y el índice de refracción mediante la colocación de dichas plaquetas en dicho mapa de volumen respecto al índice de refracción.

5. El procedimiento según la reivindicación 3, en el que dicho valor de la concentración del componente plaquetario de dicha etapa de conversión d) se determina mediante la sustracción del índice de refracción del agua del índice de refracción computado de las señales de partículas y dividiendo el resultado de dicha sustracción por un incremento medio del índice de refracción.

6. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dichas plaquetas no son esféricas y/o permanecen aproximadamente isovolumétricas.

7. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que las cuentas de eritrocitos se obtienen mediante el contaje de señales en los canales de ganancia alta X= 99, Y= 99 como eritrocitos y además, en el que el análisis de las plaquetas y el análisis de los eritrocitos se llevan a cabo al mismo tiempo.

8. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que los intervalos del volumen y del índice de refracción se extienden para evitar el error debido a la saturación de dichos primer y segundo canales ópticos por plaquetas grandes y densas mediante la extensión hacia abajo de las tablas usadas en condiciones estándar de ganancia de señal para proporcionar análisis del volumen y el índice de refracción de las plaquetas grandes en condiciones de ganancia normal.

9. El procedimiento según la reivindicación 1 u 8, en el que, en la etapa a), dicho incremento de la ganancia de dicho detector de ángulo alto es de aproximadamente 8 a 15 veces y dicho incremento en dicha ganancia de dicho detector de ángulo bajo es de aproximadamente 20 a 35 veces.

10. El procedimiento según la reivindicación 1 o la reivindicación 3, en el que dichas dos mediciones de la dispersión de la luz sirven para determinar el estado de activación de las plaquetas, y en el que las plaquetas activadas tienen un índice de refracción mensurablemente menor y una concentración del componente (CMCP) inferior a los que presentan las plaquetas no activadas; y además en el que dichas plaquetas se activan in vivo o ex vivo.

11. El procedimiento según la reivindicación 10, en el que dicho estado de activación de las plaquetas es una función de la edad in vitro de una muestra de plaquetas, y además, en el que dicho valor de la concentración del componente plaquetario obtenido en la etapa d) determina la edad in vitro de las muestras de sangre almacenadas desde aproximadamente una hora hasta aproximadamente 24 horas a temperatura ambiente o a 4ºC.

12. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que dicha muestra de sangre se autocoagula con EDTA o citrato sódico.

13. El procedimiento según la reivindicación 3, en el que dicho valor de la masa seca plaquetaria obtenido en la etapa e), dicha cifra de plaquetas y el contenido en gránulos de las plaquetas, o combinaciones de los mismos, determina los efectos de la terapia para un cáncer o del tratamiento del cáncer en un paciente que se somete esa terapia o tratamiento.

14. Un aparato automático para la discriminación precisa de las plaquetas de otras células en base a célula por célula en una en una muestra de sangre completa normal o anómala, y para determinar los parámetros plaquetarios en sangre cualitativos y cuantitativos, que comprende:

a) medios para analizar una alícuota, esencialmente una célula cada vez, al atravesar una fuente de luz enfocada, que comprende medios para producir un patrón de dispersión frontal de la luz, que representa la intensidad de la luz dispersada por unidad de ángulo de dispersión como función del ángulo de dispersión, y medios para medir dicha intensidad de dispersión de la luz en dos intervalos de ángulo sólido en dos canales ópticos a ganancias de señal incrementados en el primer y segundo canales ópticos, para producir dos mediciones de la intensidad de la dispersión suficientes para distinguir en dicha muestra las plaquetas de no plaquetas, en el que dicho valor de señal del primer canal óptico deriva de un incremento en la ganancia de un detector de ángulo alto y dicho valor de la señal del segundo canal óptico deriva de un incremento en la ganancia de un detector de ángulo bajo; y

b) medios para distinguir dichas plaquetas de dichas no plaquetas en dicha muestra y determinar dichos parámetros plaquetarios, mediante su colocación dentro de un mapa de volumen respecto a un mapa del índice de reflexión.

15. El aparato según la reivindicación 14, que además comprende medios para distinguir dichas plaquetas de las no plaquetas en base a una distribución normal de los índices de refracción de dichas plaquetas.

16. El aparato según la reivindicación 14 o la reivindicación 15, en el que se determinan los parámetros de volumen plaquetario, concentración del componente plaquetario y masa seca plaquetaria, y que además comprende las etapas de:

c) medios para convertir dichos valores de la dispersión de la luz en un primer y un segundo canales ópticos en un valor de volumen plaquetario y un valor de índice de refracción de dichas plaquetas.

d) medios ara convertir dicho valor del índice de refracción de plaquetaria en un valor de la concentración del componente plaquetario;, determinándose dicho valor de la concentración del componente plaquetario mediante la sustracción del índice de refracción del agua del índice de refracción computado de las señales de partículas y dividiendo el resultado de dicha sustracción por un incremento medio del índice de refracción; y

e) medios para computar un valor de masa seca plaquetaria como un producto de dicho valor de la concentración del componente plaquetario y dicho valor del volumen plaquetario de las etapas c) y d).

17. El aparato según la reivindicación 16, en el que en el que se determina el parámetro de la cuenta de plaquetas, y que además comprende:

f) medios para exhibir histogramas de dichos volúmenes plaquetario, concentraciones del componente plaquetario y masas secas plaquetarias; y

g) medios para determinar dicha cuenta de plaquetas en base al volumen plaquetario y al índice de refracción mediante la colocación de dichas plaquetas en dicho mapa de volumen respecto al índice de refracción.

18. El aparato según cualquiera de las reivindicaciones 14 ó 17, en el que dichas plaquetas no son esféricas y/o permanecen aproximadamente isovolumétricas.

19. El aparato según la reivindicación 14, que además comprende medios para obtener las cifras de eritrocitos mediante el contaje de señales en los canales de ganancia alta X= 99, Y= 99 como eritrocitos y además, en el que el análisis de las plaquetas y el análisis de los eritrocitos se llevan a cabo al mismo tiempo.

20. El aparato según la reivindicación 14, que además comprende medios para extender dichos intervalos del volumen y del índice de refracción para evitar el error debido a la saturación de dichos primer y segundo canales ópticos por plaquetas grandes y densas mediante la extensión hacia abajo de las tablas usadas en condiciones estándar de ganancia de señal para proporcionar análisis del volumen y el índice de refracción de las plaquetas grandes en condiciones de ganancia normal.

21. El aparato según la reivindicación 14 o la reivindicación 20, en el que, en la etapa a), dicho incremento de la ganancia de dicho detector de ángulo alto es de aproximadamente 8 a 15 veces y dicho incremento en dicha ganancia de dicho detector de ángulo bajo es de aproximadamente 20 a 35 veces.

22. El aparato según la reivindicación 14 o la reivindicación 16, en el que dichas dos mediciones de la dispersión de la luz son útiles para determinar el estado de activación de las plaquetas, y en el que las plaquetas activada tienen un índice de refracción mensurablemente menor y una concentración del componente inferior que los que presentan las plaquetas no activadas; y además en el que dichas plaquetas se activan in vivo o ex vivo.

23. El aparato según la reivindicación 22, en el que en el que dicho estado de activación de las plaquetas es una función de la edad in vitro de una muestra de plaquetas, y, en el que dicho valor de la concentración del componente plaquetario obtenido en la etapa d) determina la edad in vitro de las muestras de sangre almacenadas desde aproximadamente una hora hasta aproximadamente 24 horas a temperatura ambiente o a 4ºC.

24. El aparato según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, en el que dichas plaquetas se recogen en EDTA o citrato sódico.

25. El aparato según la reivindicación 16, en el que en el que dicho valor de la masa seca plaquetaria obtenido por los medios de la etapa e), dicha cuenta de plaquetas y el contenido en gránulos de las plaquetas, o combinaciones de los mismos, determina los efectos de la terapia para un cáncer o del tratamiento del cáncer en un paciente sometidos a dicha terapia o tratamiento.