EP3739321B1 - Qualifizierungsverfahren für kryoelektronenmikroskopie-proben sowie dazugehöriger probenhalter - Google Patents

Qualifizierungsverfahren für kryoelektronenmikroskopie-proben sowie dazugehöriger probenhalter Download PDF

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EP3739321B1
EP3739321B1 EP19175196.5A EP19175196A EP3739321B1 EP 3739321 B1 EP3739321 B1 EP 3739321B1 EP 19175196 A EP19175196 A EP 19175196A EP 3739321 B1 EP3739321 B1 EP 3739321B1
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EP
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grid
cryo
electron microscopy
dls
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Arne MEYER
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Xtal Concepts GmbH
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Definitions

  • the invention relates to the field of dynamic light scattering, or DLS for short, and the field of cryo-electron microscopy, or cryo-EM for short, in particular the qualification of a sample prepared for cryo-electron microscopy on a sample carrier arranged for cryo-electron microscopy, or sample on a cryo-EM grid for short.
  • DLS is an analysis method that is carried out on dissolved or suspended samples, mostly proteins, using scattered light from a laser.
  • DLS is a non-invasive method that can measure both absolute particle sizes and the distribution of sizes in a mixture of different particles.
  • the dynamic light scattering method used to determine the aggregation behavior in a sample is not an imaging method
  • a laser beam is directed into a sample contained in a transparent container, and the fluctuations of the scattered light are quantitatively evaluated, and the particle size and its distribution are calculated from these interference phenomena by mathematical methods.
  • cryo-electron microscopy is also known in the prior art.
  • cryo-EM being a form of transmission electron microscopy in which biological samples are examined at cryogenic temperatures of around or below -150° C., with an examination being carried out in particular close to the native state of the sample can, in particular, the three-dimensional structure elucidation of macromolecules can be carried out by single-particle electron microscopy.
  • cryoelectron microscopy Before a sample is actually examined using cryoelectron microscopy, it is usually first examined (qualified) for its suitability, with the aim of increasing the probability that the sample or type of particle to be examined using cryoelectron microscopy is not present in clumped form.
  • this qualification has mainly been achieved by a preliminary examination using a method that is inexpensive compared to freeze or cryo electron microscopy, transmission electron microscopy, or TEM for short, by recording an image of the sample with lower magnification and here the size distribution based on the appearance of the particles judged on the picture.
  • a disadvantage for example, is that the sample for this qualification method using TEM is complete must have dried, as water would impair the vacuum required for imaging in the microscope. However, since water is often the main component of the buffer solution of the biological macromolecules, drying often leads to oversaturation and thus aggregation of the sample. In this case, the preliminary TEM examination would show a false negative qualification result, i.e. the sample would be unsuitable for cryoelectron microscopy.
  • the qualification process of a sample to be examined for and by means of cryo-electron microscopy is characterized by applying the sample to a sample carrier provided for cryo-electron microscopy (cryo-electron microscopy - sample carrier, also referred to as Cryo-EM grid) and then examining the sample arranged on the sample carrier using dynamic light scattering (DLS), whereby dynamic light scattering is used to determine the particle size distribution within the sample.
  • a sample carrier provided for cryo-electron microscopy
  • DLS dynamic light scattering
  • DLS dynamic light scattering DLS can be measured for the first time on samples that are located directly on a sample carrier provided for cryo-electron microscopy (cryo-electron microscopy--sample carrier, also referred to as a cryo-EM grid).
  • cryo-electron microscopy sample carrier cryo-EM grid
  • the grid material itself does not affect the sample.
  • previous investigations have shown an influence of the grid material on the sample, which the inventors worked out during the investigations (see Fig. 5a, 5b ). Therefore, an examination of the sample on the cryo-electron microscopy sample carrier (cryo-EM grid) is crucial for a reliable assessment of the sample quality. This means that all internal and external influences that affect the aggregation behavior and thus the sample quality are taken into account in one procedure.
  • sample volume used of less than one to a few microliters and the area to be covered of approx. 7 square millimeters lead to a small layer thickness of the sample, which poses an enormous challenge for measurements with dynamic light scattering.
  • sample must be protected from evaporation over the measurement period, otherwise the sample composition will vary and the sample will dry out, which in turn could lead to the same negative effects as drying the TEM sample.
  • a corresponding design can be achieved by various methods, namely, for example, air conditioning of the measuring chamber or by sealing.
  • the invention allows both a qualitative determination of the size of particles on the sample carrier for cryo-electron microscopy and a quantitative assessment of the size distributions. Both properties can be used for sample evaluation.
  • the quantitative size measurement is used here to assess whether, for example, a macromolecular complex is intact or broken down into its sub-components.
  • DLS Two directions of quality are accessible through DLS, namely on the one hand homogeneity of the sample (generally necessary for cryo-EM evaluation, since it is an averaging method) and on the other hand absolute size, ensuring the correct size of the desired macromolecule (eg decomposition of complexes in homogeneous form).
  • the sample By determining the particle size distribution, the sample can in particular be examined for clumping.
  • the sample is also examined on and with the sample carrier used for qualification using cryo-electron microscopy.
  • the laser beam path is guided through the sample without hitting the sample carrier intended for cryoelectron microscopy.
  • cryoelectron sample carrier parameters can be adapted as part of the sample preparation for cryoelectron microscopy by adjusting the cryoelectron sample carrier material and/or other properties of the cryoelectron sample carrier.
  • Various parameters can be varied to avoid clumping on the cryo-electron microscopy sample carrier (cryo-EM grid), including, for example, the grid material (copper, gold, silicon, platinum), the surface coating of the grid, static charging or the so-called • Buffer substance in which the sample is located.
  • the grid material copper, gold, silicon, platinum
  • the qualitative size distribution determination can be used to recognize the clumping effect of the grid surface and to rule it out as far as possible by systematically varying the grid parameters. This would allow a standardization of the adjustment of the grid parameters as part of the sample preparation for cryo-electron microscopy for the first time.
  • the dynamic light scattering arrangement (DLS arrangement) is presented below as an example but not necessarily restrictive: A laser and detector optics are arranged in an optics head, with the scattered light of the laser, caused by the scattering on particles, being bundled onto an optical fiber. The fiber directs the scattered light to an amplifier, implemented in this specific case by a photomultiplier. This converts the incoming photons into electrical signals, which are evaluated by an autocorrelator using mathematical algorithms. The result is a particle size distribution that can be presented in the form of diagrams, cf. Fig. 1 .
  • the sample volume that is penetrated by the laser is located directly on the surface of a sample carrier designed for cryo-electron microscopy, in short a cryo-EM grid or just a grid.
  • cryo-EM grid is arranged vertically, for which the sample holder was developed, which enables easy handling of the grid, cf. Fig. 2a, 2b and 3a, 3b .
  • the dynamic light scattering arrangement is designed for carrying out the qualification method according to the method according to the invention in such a way that the laser beam path is guided through the sample without impinging on the sample carrier provided for cryoelectron microscopy.
  • the laser should be positioned in such a way that the beam path leads through the sample volume without hitting the grid surface, as this can lead to unwanted scattered light through the grid and to heating of the grid and thus the sample.
  • care must be taken that the fluctuating scattered light interference pattern, caused by the particle movement, can be recorded by the detector.
  • the sample holder associated with the dynamic light scattering arrangement is designed for carrying out the qualification method according to the invention and using a dynamic light scattering arrangement in such a way that the sample holder has a recording of the sample carrier provided for cryoelectron microscopy, the sample on the sample carrier provided for cryoelectron microscopy applied during the implementation of the qualification procedure.
  • Fig. 1 a schematic representation of an exemplary embodiment of the DLS measuring apparatus is shown.
  • Fig. 1 shows the basic DLS measurement setup consisting of the most important optical and electronic components.
  • the confocal adjustment of laser 8 and detector 5, which must be guaranteed for the measuring principle, is realized in the optics head 6.
  • This measuring volume 9 is positioned inside the drop sticking to the grid.
  • Fig. 2a and 2b 12 shows a schematic representation of an embodiment of the grid holder 11 with the sample 12 adhered to the grid surface.
  • FIG. 3a and 3b Schematic representations of an exemplary embodiment of the grid holder 11 are shown with a grid inserted.
  • a holder is inserted into a multiwell plate, which can hold a grid in such a way that the laser beam 8 past the grid, in this case parallel to the grid surface, into the sample 12 (for better clarity in Fig. 3a , b not shown) meets.
  • the detector looks at the focal point of the laser 8 (confocal arrangement, see Fig. 1 ).
  • the sample 12 is sealed by the oil 14 in the well and therefore cannot evaporate, so the concentration ratios remain constant. Due to the possibility of positioning within the well, ensured in the concrete realization by motorized X, Y and Z positioning units, the focal point or the measurement volume 9 can be positioned individually within the sample 12 . With a correspondingly precise holder, this is not necessary.
  • a prepared cryo-EM grid (coating, charges are pre-applied) is loaded with a few microliters of the sample 12, usually by manual pipetting. The same work steps are carried out here as in the further cryo-EM examination.
  • the grid is then inserted into the grid holder 11 . And the grid holder in turn transferred to the container filled with paraffin oil. Sealed in this way, the sample 12 can be measured over longer periods of time (possibly several hours).
  • the subsequent measurement is suitable for determining whether and, if so, when contact with the grid surface has an effect on the sample 12.
  • the DLS measurements are usually carried out as a series of individual measurements, which are then summarized as a photon count rate/time diagram or as a radius/time diagram.
  • a control sample is made in compliance with the identical Conditions (paraffin oil seal, temperature, measurement period, etc.) are applied, which, in contrast to sample 12, rests on a polystyrene surface (not shown).
  • Fig. 4a, 4b and 4c show a schematic representation of the processes during grid-induced aggregation of the sample 12 and a surface accumulation of the macromolecules as a result of electrostatic forces of attraction.
  • FIG. 5a and 5b Schematic representations of an exemplary embodiment of the diffusion times as a function of the diffusion constants and distances are shown.
  • the measurements on the control sample are usually used as a comparison (control) before the grid is loaded and after the end of the series of measurements on the grid. If the contact of the sample 12 with the grid surface has an unfavorable effect on the solubility of the sample 12, this becomes visible after a certain time as a change in the particle size or scattered light intensity ( Fig. 5a, 5b , photon count rate as a function of time). Ideally, a sample 12 should show unchanged count rate and radius distribution values, both on the grid and in the control, even over a comparatively long period of time. In this case it can be assumed that the sample 12 does not aggregate through interactions with the grid or the complexes disintegrate when an identical grid is loaded with this sample 12 for the shock freezing.
  • Fig. 4a and b indicate a probable mechanism.
  • the buffer has corrosive properties which will attack the grid material.
  • the metal ions released from the metal lattice of the grid accumulate in the sample volume. After a certain time, the copper ion concentration reaches a critical value. If this value is exceeded, the macromolecule rapidly aggregates. The time it takes to reach this critical ion concentration is both buffer and macromolecule dependent.
  • plasma charging which is a key step in grid preparation.
  • the parameter of the charge density can be varied. It has been shown that a certain charge density value only binds a small number of macromolecules to surfaces, but at the same time still offers sufficient hydrophilicity of the grid surface so that the sample covers the grid sufficiently.
  • DLS measurements in the drop volume of sample 12 on the grid allow conclusions to be drawn about the aggregation behavior of the individual molecules directly on the grid surface. At t 0 no aggregation is detected by DLS. The initiating agent diffuses into the sample volume until the critical ion concentration is exceeded.
  • the DLS measurement volume 9 is used here as a representative sub-volume to draw conclusions about the To draw aggregation behavior of the sample 12 in the entire sample volume. The information can be used as a reliable timer for the subsequent blast freezing process.

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Description

  • Die Erfindung betrifft das Gebiet der dynamischen Lichtstreuung, kurz DLS, und das Gebiet der Kryoelektronenmikroskopie, kurz Cryo-EM, insbesondere die Qualifizierung einer für die Kryoelektronenmikroskopie vorbereiteten Probe auf einem für die Kryoelektronenmikroskopie angeordneten Probenträger, kurz auch Probe auf einem Cryo-EM Grid.
  • Bei der DLS handelt es sich um eine Analysemethode, die an gelösten oder suspendierten Proben, meist Proteine, mittels Streulichtes eines Lasers erfolgt. DLS ist ein non-invasives Verfahren, das sowohl absolute Partikelgrößen, als auch die Verteilung von Größen in einer Mischung verschiedener Partikel messen kann. Im Unterschied zu der Transmissionselektronenmikroskopie, kurz TEM, stellt das Verfahren der dynamischen Lichtstreuung zur Bestimmung des Aggregationsverhaltens in einer Probe kein bildgebendes Verfahren dar. Als Stand der Technik bezüglich der dynamischen Lichtstreuung ist die sog. in situ DLS-Technik bekannt, bei der ein fokussierter Laserstrahl direkt in eine Probe gerichtet wird, die sich in einem durchsichtigen Behältnis befindet, und die Fluktuationen des gestreuten Lichts werden quantitativ ausgewertet, wobei durch mathematische Verfahren aus diesen Interferenzerscheinungen die Partikelgröße und deren Verteilung errechnet werden.
  • Weiter im Stand der Technik ist die Kryoelektronenmikroskopie bekannt, wobei Cryo-EM eine Form der Transmissionselektronenmikroskopie ist, bei der biologische Proben bei kryogenen Temperaturen ungefähr bzw. kleiner als -150 °C untersucht werden, wobei insbesondere eine Untersuchung nahe am nativen Zustand der Probe erfolgen kann, insbesondere kann die dreidimensionale Strukturaufklärung von Makromolekülen durch Einzelpartikel-Elektronenmikroskopie erfolgen.
  • Vor der tatsächlichen Untersuchung einer Probe mittels Kryoelektronenmikroskopie wird diese üblicherweise zunächst auf ihre Eignung hin untersucht (qualifiziert), mit dem Ziel, die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, dass die mittels Kryoelektronenmikroskopie zu untersuchende Probe bzw. Teilchenart nicht verklumpt vorliegt.
  • Seit Jahren wird diese Qualifizierung vorwiegend durch eine Voruntersuchung mit einem im Vergleich zur Gefrier- bzw. Kryoelektronenmikroskopie kostengünstigen Verfahren, der Transmissions-Elektronenmikroskopie, kurz TEM, gelöst, indem ein Bild der Probe mit geringerer Vergrößerung aufgezeichnet und hier die Größenverteilung anhand der Erscheinung der Partikel auf dem Bild beurteilt wird.
  • Diese Herangehensweise weist jedoch einige Nachteile auf, die die Aussagekraft dieser Voruntersuchungsmethode über die Qualität einer Probe beeinträchtigt. Nachteilig ist beispielsweise, dass die Probe für dieses Qualifizierungsverfahren mittels TEM vollständig eingetrocknet sein muss, da Wasser das zur Bildgebung benötigte Vakuum im Mikroskop beeinträchtigen würde. Da Wasser jedoch häufig den Hauptbestandteil der Pufferlösung der biologischen Makromoleküle darstellt, kommt es beim Trocknen nicht selten zur Übersättigung und damit Aggregation der Probe. In dem Fall würde die TEM-Voruntersuchung ein falsch negatives Qualifizierungsresultat vorweisen, also die Probe als nicht geeignet zur Kryoelektronenmikroskopie ausweisen. Da als Kontrastmittel der TEM-Untersuchung zusätzlich Schwermetallsalze wie Uranylazetat Verwendung finden und diese an der Oberfläche von z.B. biologischen Makromolekülen, bspw. Proteinen gebunden werden können, kann die gleichartige Ladung zu Abstoßungseffekten führen. Daher kann nicht ausgeschlossen werden, dass das Protein de-aggregiert und damit ein falsch positives Qualifizierungsergebnis nach der TEM-Voruntersuchung vorliegt. TEM stellt damit keine verlässliche Voruntersuchungsmethode bzw. Qualifizierungsmethode dar, da die Probe für diese Untersuchung erheblich verändert werden muss. Somit handelt es sich um ein invasives Verfahren, bei dem die Probenbeurteilung nicht unter den gleichen Bedingungen wie die nachfolgende Cryo-EM-Aufnahme stattfindet. Die Qualifizierung mittels Transmissionselektronenmikroskopie gibt also lediglich Hinweise darauf, dass die Probe intakt sein könnte, wenn Komplexe nicht dissoziiert und Makromoleküle nicht aggregiert vorgelegen haben.
  • Weitere Nachteile der Transmissionselektronenmikroskopie sind natürlich der erhebliche technische Aufwand, den eine Bildaufzeichnung mittels TEM darstellt. Hierfür sind nicht nur die Anschaffungs- und Betriebskosten von TEM selbst zu nennen, sondern auch der hohe Qualifikationsgrad des Anwenders, sowie der konstruktionsbedingte vergleichsweise geringe Probendurchsatz.
  • Alternativ wurde daher von den Erfindern in A Meyer ET AL: "A time-efficient identification of the best conditions for cryo-EM, NMR, SAXS and crystallization applying in situ DLS", iNEXT meets Industry, 5. März 2018 (2018-03-05), vorgeschlagen, DLS-Messungen an kleinen Teilmengen in der eigentlichen Probe unmittelbar vor dem Aufbringen der Probe auf den Träger für eine Kryoelektronenmikroskopie durchzuführen. Nachteilig ist jedoch, dass die so qualifizierte Probe beim anschließenden Aufbringen auf den Probenhalter für die Kryoelektronenmikroskopie von diesem Probenhalter beeinträchtigt wird, mithin die vorab Untersuchung der kleinen Teilmenge für die später auf dem Probenträger für die Kryoelektronenmikroskopie aufgebrachten Probe nicht repräsentativ ist.
  • Insgesamt ergibt sich daher die technische Aufgabe, ein Verfahren zur Qualifizierung von für die Kryoelektronenmikroskopie vorgesehenen Proben anzugeben, dass zum einen die Nachteile der Transmissionselektronen-Mikroskopie wie auch alternativ einer gesonderten DLS-Messung überwindet und zudem noch ergänzende Probleme löst bzw. von vornherein ausschließen kann, wobei hierzu insbesondere seitens der Erfinder erkannt wurde, dass der Probenträger für eine Probe zur Kryoelektronenmikroskopie als mögliche problem- bzw. fehlerverursachende Quelle in Frage kommt. Es muss sichergestellt werden, dass bei Einzelpartikel-Elektronenmikroskopie die zu untersuchende Teilchenart nicht verklumpt bzw. Molekülkomplexe nicht dissoziiert vorliegen, was in der praktischen Anwendung ein häufig auftretendes Problem darstellt.
  • Gelöst wird diese Aufgabe mit einem Qualifizierungsverfahren gemäß Hauptanspruch. Weitere vorteilhafte Ausgestaltungsvarianten finden sich in den Unteransprüchen.
  • Das Qualifizierungsverfahren einer für die und mittels Kryoelektronenmikroskopie zu untersuchenden Probe ist gekennzeichnet durch das Aufbringen der Probe auf einen für die Kryoelektronenmikroskopie vorgesehenen Probenträger (Kryoelektronenmikroskopie - Probenträger, auch als Cryo-EM Grid bezeichnet) und anschließendes Untersuchen der auf dem Probenträger angeordneten Probe mittels dynamischer Lichtstreuung (DLS), wobei mittels der dynamischen Lichtstreuung eine Bestimmung der Partikelgrößenverteilung innerhalb der Probe erfolgt.
  • Neu an der Erfindung ist insbesondere, dass die dynamische Lichtstreuung DLS erstmalig an Proben gemessen werden kann, die sich direkt auf einem für die Kryoelektronenmikroskopie vorgesehenen Probenträger (Kryoelektronenmikroskopie - Probenträger, auch als Cryo-EM Grid bezeichnet) befinden.
  • Im Zusammenhang mit dieser Erfindung erkannten die Erfinder, dass auch der eigentliche Kryoelektronenmikroskopie - Probenträger (Cryo-EM Grid) eine verklumpende Wirkung auf die Probe ausüben kann. Idealerweise nimmt das Grid-Material selbst keinen Einfluss auf die Probe. Die bisherigen Untersuchungen haben jedoch einen Einfluss des Grid-Materials auf die Probe gezeigt, was seitens der Erfinder während den Untersuchungen herausgearbeitet wurde (siehe Abb. 5a, 5b). Daher ist eine Untersuchung der Probe auf dem Kryoelektronenmikroskopie - Probenträger (Cryo-EM Grid) entscheidend für eine verlässliche Beurteilung der Probenqualität. Damit werden alle internen und externen Einflüsse, die sich auf das Aggregationsverhalten und somit die Probenqualität auswirken, in einem Verfahren berücksichtigt. Veränderungen der Probe infolge von Wechselwirkungen mit dem Grid-Material resultieren häufig in einer Veränderung der Partikelgrößenverteilung, die dann mittels DLS festgestellt werden kann. Beginnend mit einer uniformen Partikelgröße kann sowohl eine Verkleinerung als auch eine Vergrößerung der Partikel, in Folge des Kontakts mit der Grid-Oberfläche, als unerwünschte Wechselwirkung auftreten.
  • Statt einer Abbildung der Teilchen wird ein Größen/Häufigkeitsdiagramm erhalten. Da für elektronenmikroskopische Anwendungen, im Bereich der makromolekularen Strukturaufklärung, diskrete Teilchengrößen, sowie möglichst uniforme Proben eingesetzt werden müssen, stellt DLS hier ein geeignetes Nachweisverfahren dar. Dies konnte bisher schon an Proben gezeigt werden, die mit einem herkömmlichen DLS-System untersucht wurden.
  • Als Ausführungshinweis sei erwähnt, dass das eingesetzte Probenvolumen von unter einem bis zu wenigen Mikrolitern, sowie die zu bedeckende Fläche von ca. 7 Quadratmillimetern zu einer geringen Schichtdicke der Probe führt, wobei dies an Messungen mit dynamischer Lichtstreuung eine enorme Herausforderung darstellt. Zudem muss die Probe über den Messzeitraum vor Verdampfung geschützt werden, da ansonsten die Probenzusammensetzung variiert, die Probe also austrocknet, was wiederum zu den gleichen negativen Effekten wie das Trocknen der TEM-Probe führen könnte. Eine entsprechende Ausführung kann durch verschiedene Verfahren erreicht werden, nämlich beispielsweise Klimatisierung der Messkammer oder durch eine Versiegelung.
  • Entscheidende Vorteile gegenüber der Voruntersuchung mittels TEM sind insbesondere:
    • keine Veränderung der Probe, da ein nicht invasives in situ Verfahren zur Qualifizierung der Probe angewendet wird - kein Einfluss der Messung auf die Probe wie Erwärmen, inelastische Streuung, chemische Veränderung;
    • erheblich geringerer technischer Aufwand von DLS im Vergleich zu TEM und damit Zeit- und Kostenersparnis;
    • deutlich höherer Probendurchsatz und damit einhergehend die Möglichkeit mehrere Parameter in Kombinationen zu erproben;
    • ferner kann eine analoge Probenbehandlung zum Schockgefrierverfahren genutzt werden; sowie
    • geringere nötige Qualifikation des Anwenders.
  • Es handelt sich um technische als auch um wirtschaftliche Vorteile der Erfindung, da kostengünstiger gearbeitet werden kann und erstmalig auch tatsächlich eine hochgradig verlässliche Qualifizierung der Proben für die Kryoelektronenmikroskopie erfolgen kann.
  • Die Erfindung erlaubt sowohl eine qualitative Größenbestimmung von Partikeln auf dem Probenträger für die Kryoelektronenmikroskopie als auch eine quantitative Beurteilung der Größenverteilungen. Beide Eigenschaften können für die Probenbeurteilung ausgenutzt werden. Die quantitative Größenmessung wird hierbei eingesetzt, um zu beurteilen, ob bspw. ein makromolekularer Komplex intakt oder in seine Untereinhalten zerfallen vorliegt.
  • Durch DLS sind zwei Richtungen der Qualität zugänglich, nämlich zum einen Homogenität der Probe (generell notwendig für die Cryo-EM-Auswertung, da es sich um ein mittelndes Verfahren handelt) und zum zweiten die absolute Größe, Sicherstellung der richtigen Größe des gewünschten Makromoleküls (z.B. Zerfall von Komplexen in homogener Form).
  • Mittels der Bestimmung der Partikelgrößenverteilung kann insbesondere eine Untersuchung der Probe auf Verklumpungen erfolgen.
  • Weiter wird die Probe auf und mit dem zur Qualifizierung verwendeten Probenträger mittels Kryoelektronenmikroskopie untersucht.
  • Weiter wird der Laser-Strahlengang durch die Probe geführt, ohne auf den für die Kryoelektronenmikroskopie vorgesehenen Probenträger zu treffen.
  • Weiter kann in einer weiterführenden Ausführungsvariante eine Anpassung der Kryoelektronen-Probenträger-Parameter als Teil der Probenvorbereitung für Kryoelektronenmikroskopie durch Abstimmung des Kryoelektronen-Probenträger-Materials und/oder weiterer Eigenschaften des Kryoelektronen-Probenträgers erfolgen. Zur Vermeidung von Verklumpung auf dem Kryoelektronenmikroskopie Probenträger (Cryo-EM-Grid) können verschiedene Parameter variiert werden, hierzu zählen z.B. das Grid-Material, (Kupfer, Gold, Silizium, Platin), die Oberflächenbeschichtung des Grids, statische Aufladung oder aber die sog. Puffersubstanz, in welcher sich die Probe befindet. Um diese Parameter allerdings gezielt an eine Probe anpassen zu können, ist die Feststellung erforderlich, welche Auswirkung die Variationen der Parameter auf die Probe haben. Bislang erfolgte dies durch Elektronenmikroskopie selbst, was jedoch ein zeit- und kostenintensives Verfahren zur Feststellung der Probenqualität darstellt. Die Messung mittels DLS direkt auf den Grids bietet hier entscheidende Vorteile, nämlich die Zeit- und Gerätekostenersparnis, die hohe Verlässlichkeit der Aussage sowie die einfache Durchführung.
  • Die qualitative Größenverteilungsbestimmung kann, wie bereits beschrieben, eingesetzt werden, um die verklumpende Wirkung der Grid-Oberfläche zu erkennen und durch systematische Variation der Grid-Parameter möglichst auszuschließen. Dies würde eine Standardisierung der Anpassung der Grid-Parameter als Teil der Probenvorbereitung für Kryoelektronenmikroskopie erstmalig erlauben.
  • Die Dynamische Lichtstreuungs-Anordnung (DLS-Anordnung) ist nachfolgend exemplarisch aber gleichwohl nicht zwingend beschränkend dargelegt:
    Ein Laser und eine Detektoroptik sind in einem Optikkopf angeordnet, wobei das Streulicht des Lasers, hervorgerufen durch die Streuung an Partikeln, auf eine optische Faser gebündelt wird. Die Faser leitet das Streulicht zu einem Verstärker, im konkreten Fall durch einen Photomultiplier realisiert. Dieser wandelt die eingehenden Photonen in elektrische Signale um, die von einem Autokorrelator durch Anwendung mathematischer Algorithmen ausgewertet werden. Das Ergebnis ist eine Partikelgrößenverteilung, die in Form von Diagrammen dargestellt werden können, vgl. Abb. 1.
  • Das Probenvolumen, das vom Laser durchdrungen wird, befindet sich erfindungsgemäß direkt auf der Oberfläche eines für die Kryoelektronenmikroskopie ausgebildeten Probenträgers, kurz Cryo-EM-Grid oder auch nur Grid.
  • Vor Austrocknung wird die Probe durch eine Schicht Paraffinöl geschützt. Das Cryo-EM-Grid ist in diesem Fall vertikal angeordnet, wobei dafür der Probenhalter entwickelt wurde, der eine einfache Handhabung des Grids ermöglicht, vgl. Abb. 2a, 2b und 3a, 3b.
  • Die dynamische Lichtstreuungs-Anordnung ist derart für die Ausführung des Qualifizierungsverfahrens gemäß des erfindungsgemäßen Verfahrens ausgebildet, dass der Laser-Strahlengang durch die Probe geführt ist ohne auf den für die Kryoelektronenmikroskopie vorgesehenen Probenträger zu treffen.
  • Der Laser sollte so positioniert werden, dass der Strahlengang durch das Probenvolumen führt, ohne dabei auf die Grid-Oberfläche zu treffen, da dies zum einen zu unerwünschtem Streulicht durch das Grid, zum anderen zu einer Erwärmung des Grids und somit der Probe führen kann. Zusätzlich muss darauf geachtet werden, dass das fluktuierende Streulicht-Interferenzmuster, hervorgerufen durch die Partikelbewegung, vom Detektor aufgezeichnet werden kann.
  • Der zu der dynamischen Lichtstreuungs-Anordnung zugehörige Probenhalter ist für die Ausführung des erfindungsgemäßen Qualifizierungsverfahrens und unter Verwendung einer Dynamischen Lichtstreuungs-Anordnung derart ausgebildet, dass der Probenhalter eine Aufnahme des für die Kryoelektronenmikroskopie vorgesehenen Probenträgers aufweist, wobei auf dem für die Kryoelektronenmikroskopie vorgesehenen Probenträger die Probe bei der Durchführung des Qualifizierungsverfahrens aufgebracht ist.
  • Es zeigen:
    • Abb. 1
    eine schematische Darstellung eines Ausführungsbeispiels der DLS Messapparatur;
    Abb. 2a, b
    eine schematische Darstellung eines Ausführungsbeispiels des Grid-Halters 11 mit der Probe 12, die sich ihrerseits auf dem Grid befindet;
    Abb. 3a, b
    eine schematische Darstellung eines Ausführungsbeispiels des Grid-Halters 11 mit eingesetztem Grid;
    Abb. 4a, b
    eine schematische Darstellung der Vorgänge bei Grid-induzierter Aggregation der Probe 12 und
    Abb. 5a, b
    eine schematische Darstellung eines Ausführungsbeispiels der Diffusionszeiten in Abhängigkeit der Diffusionskonstanten und Distanzen.
  • An dieser Stelle soll darauf hingewiesen werden, dass das Ausführungsbeispiel bzw. die Ausführungsformen der Erläuterung dienen und nicht zwingend beschränkend zu werten sind.
  • In Abb. 1 ist eine schematische Darstellung eines Ausführungsbeispiels der DLS Messapparatur dargestellt.
  • Abb. 1 zeigt den prinzipiellen DLS-Messaufbau bestehend aus den wichtigsten Optik- und Elektronikkomponenten. Im Optikkopf 6 wird die konfokale Justierung von Laser 8 und Detektor 5, die für das Messprinzip gewährleistet werden muss, realisiert. Dieses Messvolumen 9 wird innerhalb des Tropfens, der auf dem Grid haftet, positioniert.
  • Abb. 2a und 2b zeigen eine schematische Darstellung eines Ausführungsbeispiels des Grid-Halters 11 mit der Probe 12, die an der Grid-Oberfläche haftet.
  • In Abb. 3a und 3b sind schematische Darstellungen eines Ausführungsbeispiels des Grid-Halters 11 mit eingesetztem Grid gezeigt.
  • In oben dargestellter Ausführung (Abb. 2a, 2b und 3a, 3b) wird in eine Multiwell-Platte ein Halter eingesetzt, der ein Grid so aufnehmen kann, dass der Laserstrahl 8 am Grid vorbei, in diesem Fall parallel zur Grid-Oberfläche, in die Probe 12 (zur besseren Übersichtlichkeit in Abb. 3a,b nicht dargestellt) trifft. Der Detektor blickt auf den Fokuspunkt des Lasers 8 (konfokale Anordnung, siehe Abb. 1). Die Probe 12 wird durch das in dem Well befindliche Öl 14 versiegelt und kann daher nicht evaporieren, die Konzentrationsverhältnisse bleiben also konstant. Durch die Positioniermöglichkeit innerhalb des Wells, in der konkreten Realisierung durch motorisierte X, Y- und Z- Positioniereinheiten gewährleistet, kann der Fokuspunkt bzw. das Messvolumen 9 innerhalb der Probe 12 individuell positioniert werden. Bei entsprechend genauem Halter ist dies nicht notwendig.
  • Ein vorbereitetes Cryo-EM-Grid (Beschichtung, Ladung werden vorab aufgebracht) wird mit einigen Mikrolitern der Probe 12 beladen, üblicherweise geschieht dies durch manuelles Pipettieren. Hierbei werden die gleichen Arbeitsschritte wie bei der weiteren Cryo-EM-Untersuchung durchgeführt. Anschließend wird das Grid in den Grid-Halter 11 eingesetzt. Und der Grid-Halter seinerseits in den mit Paraffinöl gefüllten Behälter überführt. Auf diese Weise versiegelt, kann an der Probe 12 über längere Zeiträume (u.U. mehrere Stunden) gemessen werden. Die anschließende Messung ist geeignet, um festzustellen, ob und ggf. wann der Kontakt mit der Grid-Oberfläche eine Auswirkung auf die Probe 12 hat. Dabei werden die DLS-Messungen üblicherweise als eine Serie von Einzelmessungen durchgeführt, die anschließend zusammengefasst als Photonenzählrate/Zeit-Diagramm oder als Radius/Zeit-Diagramm dargestellt werden. Üblicherweise wird eine Kontrollprobe unter Einhaltung der identischen Bedingungen (Paraffinölversiegelung, Temperatur, Messzeitraum etc.) angesetzt, die im Unterschied zur Probe 12 auf einer Polystyroloberfläche aufliegt (nicht dargestellt).
  • Abb. 4a, 4b und 4c zeigen eine schematische Darstellung der Vorgänge bei Grid-induzierter Aggregation der Probe 12 sowie eine Oberflächenanlagerung der Makromoleküle in Folge elektrostatischer Anziehungskräfte.
  • In Abb. 5a und 5b sind schematische Darstellungen eines Ausführungsbeispiels der Diffusionszeiten in Abhängigkeit der Diffusionskonstanten und Distanzen gezeigt.
  • Die Messungen an der Kontrollprobe werden in der Regel vor Beladung des Grids sowie nach beendeter Messreihe auf dem Grid als Vergleich (Kontrolle) herangezogen. Wirkt sich der Kontakt der Probe 12 mit der Grid-Oberfläche ungünstig für die Löslichkeit der Probe 12 aus, so wird dies nach einer gewissen Zeit als Veränderung der Partikelgröße bzw. Streulichtintensität sichtbar (Abb. 5a, 5b, Photonenzählrate in Abhängigkeit der Zeit). Idealerweise sollte eine Probe 12, sowohl auf dem Grid als auch in der Kontrolle, selbst über einen vergleichsweise langen Zeitraum, unveränderte Werte der Zählrate und Radiusverteilung aufweisen. In diesem Fall kann davon ausgegangen werden, dass die Probe 12 nicht durch Wechselwirkungen mit dem Grid aggregiert bzw. die Komplexe zerfallen, wenn ein identisches Grid für die Schockgefrierung mit dieser Probe 12 beladen wird. Mehrere Erklärungsmodelle sind denkbar, weshalb der Kontakt der Probe 12 mit der Grid-Oberfläche, Auswirkungen auf das Aggregationsverhalten der Probe hat. Abb. 4a und b zeigen einen naheligenden Mechanismus auf. Der Puffer weist korrosive Eigenschaften auf, wodurch das Grid-Material angegriffen wird. Die sich aus dem Metallgitter des Grids lösenden Metallionen reichen sich dabei im Probenvolumen an. In einer gewissen Zeit erreicht die Kupferionenkonzentration einen kritischen Wert, wird dieser überschritten erfolgt eine rasche Aggregation des Makromoleküls. Die Zeit, die zum Erreichen dieser kritischen lonenkonzenration erreicht wird, ist sowohl Pufferals auch makromolekülabhängig. Darüber hinaus gibt es noch einen weiteren aggregierenden Effekt und das ist die Plasmaaufladung, die einen zentralen Arbeitsschritt der Grid-Vorbereitung darstellt. Hier kann der Parameter der Ladungsdichte variiert werden. Es hat sich gezeigt, dass ein bestimmter Ladungsdichtewert zum einen nur wenig Makromoleküle an Oberflächen bindet, zugleich aber noch ausreichend Hydrophilie der Grid-Oberfläche bietet, so dass die Probe das Grid ausreichend bedeckt.
  • Durch DLS-Messungen im Tropfenvolumen der Probe 12 auf dem Grid lassen sich Rückschlüsse ziehen auf das Aggregationsverhalten der Einzelmoleküle direkt an der Grid-Oberfläche. Bei t0 wird mittels DLS noch keine Aggregation detektiert. Das auslösende Agens diffundiert in das Probenvolumen, bis die kritische lonenkonzentration überschritten ist. Das DLS-Messvolumen 9 dient hier als repräsentatives Teilvolumen, um Rückschlüsse auf das Aggregationsverhalten der Probe 12 im gesamten Probenvolumen zu ziehen. Die Information kann als verlässlicher Zeitgeber für den späteren Schockgefriervorgang verwendet werden.
    • Bezugszeichenliste
    • 1
    Anzeigegerät
    2
    Autokorrelator
    3
    Photomultiplier
    4
    Lichtleiter
    5
    Detektoroptik
    6
    Optikkopf
    7
    Streulichtpfad
    8
    DLS-Laserstrahl
    9
    Detektorfokus / Messvolumen
    10
    Kryoelektronenmikroskopie-Träger (Grid)
    11
    Grid-Halter [DLS] (für das Cryo-EM-Grid mit Probe)
    12
    Probe
    13
    Behältnis
    14
    Paraffinöl

Claims (3)

  1. Qualifizierungsverfahren einer für eine und mittels Kryoelektronenmikroskopie zu untersuchenden Probe (12), umfassend das Aufbringen der Probe (12) auf einen für die Kryoelektronenmikroskopie vorgesehenen Probenträger (10) gekennzeichnet durch anschließendes Untersuchen der auf dem Probenträger angeordneten Probe (12) mittels dynamischer Lichtstreuung mit einem auf die Probe gerichteten Laserstrahl (8), wobei der Laserstrahl (8) durch die Probe (12) geführt wird, ohne auf den für die Kryoelektronenmikroskopie vorgesehenen Probenträger (10) zu treffen und mittels der dynamischen Lichtstreuung eine Bestimmung der Partikelgrößenverteilung innerhalb der Probe (12) erfolgt.
  2. Qualifizierungsverfahren nach dem vorangehenden Anspruch, wobei mittels der Bestimmung der Partikelgrößenverteilung eine Untersuchung der Probe (12) auf Verklumpungen und/oder Dissoziation von Molekülkomplexen erfolgt.
  3. Qualifizierungsverfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Probe (12) auf und mit dem zur Qualifizierung verwendeten Probenträger mittels Kryoelektronenmikroskopie untersucht wird.
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