EA046736B1 - Фармацевтические комбинации - Google Patents

Description

Введение

Настоящее изобретение в целом относится к областям иммунологии и молекулярной биологии. Более конкретно, в данном документе представлены фармацевтические комбинации, содержащие антитела (A) или их антигенсвязывающие части, направленные против LY75, и (B) венетоклакс; способы получения фармацевтических комбинаций и способы лечения заболеваний, таких как виды рака, опосредованные экспрессией или активностью LY75.

Предпосылки изобретения

Виды лейкоза и лимфомы принадлежат к обширной группе опухолей, которые поражают кровь, костный мозг и лимфоидную систему; они известны как опухоли кроветворной и лимфоидной тканей.

Лимфома представляет собой группу опухолей из клеток крови, которые развиваются из лимфоцитов. Признаки и симптомы могут включать увеличенные лимфатические узлы, жар, потение, непреднамеренную потерю массы тела, зуд и постоянное ощущение усталости. Существует ряд подтипов лимфомы: двумя основными группами лимфом являются лимфомы Ходжкина (HL) и неходжкинские лимфомы (NHL). Всемирная организация здравоохранения (WHO) включает две другие группы в качестве типов лимфомы: множественную миелому и иммунопролиферативные заболевания. Приблизительно 90% видов лимфомы являются неходжкинскими лимфомами.

Лейкоз представляет собой группу форм рака, которые обычно появляются в костном мозгу и приводят к большому количеству аномальных белых кровяных телец. Симптомы могут включать проблемы кровотечения и кровоподтеков, ощущение усталости, жар и увеличенный риск инфекций. Такие симптомы проявляются из-за нехватки нормальных клеток крови. Диагностику, как правило, осуществляют посредством анализов крови или биопсии костного мозга. Существует четыре основных типа лейкоза: острый лимфобластный лейкоз (ALL), острый миелоидный лейкоз (AML), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL) и хронический миелоидный лейкоз (CML), а также ряд менее распространенных типов.

Лечение видов лейкоза и лимфомы может включать одно или более из химиотерапии, лучевой терапии, направленной терапии и хирургии (и трансплантацию костного мозга в случае видов лейкоза). Успех лечения лейкоза зависит от типа лейкоза и возраста пациента. Результат лечения лимфомы зависит от подтипа, при этом некоторые являются излечимыми, и в большинстве случаев лечение увеличивает выживаемость.

Ранее для лечения видов лейкоза применяли ряд химиотерапевтических средств, включая преднизон, винкристин, антрациклины, L-аспарагиназу, циклофосфамид, метотрексат, 6-меркаптопурин, флударабин, пентостатин и кладрибин. Химиотерапевтические средства для лечения видов лимфомы включают циклофосфамид, гидроксидаунорубицин (также известный как доксорубицин или адриамицин), онковин (винкристин), преднизон, преднизолон, блеомицин, дакарбазин, этопозид и прокарбазин.

Комбинированная химиотерапия включает лечение пациента двумя или более различными лекарственными средствами одновременно. Лекарственные средства могут различаться их механизмом действия и побочными эффектами. Наибольшее преимущество такого подхода состоит в сокращении до минимума шансов развития устойчивости к какому-либо одному средству. Кроме того, лекарственные средства часто можно применять в меньших дозах, снижая токсичность. Виды комбинированной терапии для лечения болезни Ходжкина включают MOPP (мустарген, винкристин, прокарбазин, преднизолон) и ABVD (доксорубицин, блеомицин, винбластин, дакарбазин). Виды комбинированной терапии для лечения неходжкинской лимфомы включают CHOP (циклофосфамид, доксорубицин, винкристин, преднизолон). С учетом количества лекарственных средств, которые известны вследствие применения для лечения видов лейкоза и лимфомы, количество перестановок и комбинаций возможных видов лечения лекарственными средствами определенно является большим. Кроме того, вышеуказанные виды комбинированной терапии не предусматривают антител.

Остается, однако, потребность в новых видах лечения видов лейкоза и лимфомы, и в частности в эффективных видах комбинированной терапии. Лимфоцитарный антиген 75 действует в качестве эндоцитирующего рецептора, направляющего захваченные антигены из внеклеточного пространства в специализированный антиген-процессирующий компартмент, и, как полагают, вызывает снижение пролиферации B-лимфоцитов. Экспрессия лимфоцитарного антигена 75 наблюдалась при раке поджелудочной железы, яичника, молочной железы, ободочной и прямой кишки, пищевода, кожи, щитовидной железы и легкого (немелкоклеточном), а также при множественной миеломе и многих различных подтипах лимфомы и лейкоза. В WO2009/061996 раскрыты выделенные моноклональные антитела, связывающиеся с DEC-205 (LY75) человека, и соответствующие композиции и молекулы на основе антител. Также раскрыты фармацевтические композиции, содержащие антитела, а также терапевтические и диагностические способы применения антител. В WO2008/104806 раскрыты аффинные реагенты, способные к связыванию с LY75, для применения при лечении или профилактике рака. В WO2015/052537 раскрыты конкретные выделенные антитела, способные к связыванию с LY75, и их применение при лечении различных форм рака.

Венетоклакс является низкомолекулярным лекарственным средством для перорального применения, которое блокирует антиапоптотический белок B-клеточной лимфомы-2 (Bcl-2), что приводит к запрограммированной гибели клеток. Он показан при хроническом лимфоцитарном лейкозе (CLL) у паци

- 1 046736 ентов со специфической хромосомной аномалией (делеция 17p). В 2015 году Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) присвоило венетоклаксу статус принципиально нового терапевтического препарата для пациентов с CLL, у которых был рецидив или они были невосприимчивы к предыдущему лечению и имели генетическую мутацию с делецией 17p.

В настоящее время обнаружено, что комбинации определенных антител к LY75 с венетоклаксом демонстрируют синергетические результаты при лечении лимфом.

Краткое описание изобретения

В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает фармацевтическую комбинацию, содержащую:

(A) антитело к LY75 или его антигенсвязывающую часть, которые конкурируют за связывание с LY75 с антителом, содержащим вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 1, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 2; или антитело к LY75 или его антигенсвязывающую часть, при этом указанное антитело содержит:

a) вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит:

i) первую vhCDR, содержащую SEQ ID NO: 5;

ii) вторую vhCDR, содержащую SEQ ID NO: 6; и iii) третью vhCDR, содержащую SEQ ID NO: 7; и

b) вариабельную область легкой цепи, которая содержит:

i) первую vlCDR, содержащую SEQ ID NO: 8;

ii) вторую vlCDR, содержащую SEQ ID NO: 9; и iii) третью vlCDR, содержащую SEQ ID NO: 10;

где необязательно любые одна или более из вышеуказанных SEQ ID NO независимо предусматривают одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, добавлений или делеций; и (B) венетоклакс или его фармацевтически приемлемую соль;

где фармацевтическая комбинация представлена в форме комбинированного препарата для одновременного, раздельного или последовательного применения.

В одном варианте осуществления антитело к LY75 или его антигенсвязывающая часть содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую 1, 2 или 3 CDR, выбранные из группы, состоящей из CDR, содержащих SEQ ID NO: 5, 6 и 7, и/или вариабельную область легкой цепи, содержащую 1, 2 или 3 CDR, выбранные из группы, состоящей из CDR, содержащих SEQ ID NO: 8, 9 и 10.

В некоторых вариантах осуществления антитела к LY75 связываются с LY75 (SEQ ID NO: 15) и способны к интернализации клеткой, экспрессирующей LY75.

В другом варианте осуществления антитело к LY75 содержит области, определяющие комплементарность (CDR), или вариабельные области (VR) тяжелых и/или легких цепей конкретного антитела, описанного в данном документе (например, упоминаемого в данном документе как LY75_A1). Соответственно, в одном варианте осуществления антитело к LY75 содержит домены CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области тяжелой цепи (VH) антитела LY75_A1, имеющей последовательность, показанную под SEQ ID NO: 1, и/или домены CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области легкой цепи (VL) LY75_A1, имеющей последовательность, показанную под SEQ ID NO: 2.

В другом варианте осуществления антитела к LY75 связываются с LY75 человека и содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 1, и/или ее консервативные модификации последовательности. Антитело может дополнительно содержать вариабельную область легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 2 и/или ее консервативные модификации последовательности.

В дополнительном варианте осуществления антитела к LY75 связываются с LY75 человека и содержат вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, содержащие аминокислотные последовательности, представленные под SEQ ID NO: 1 и/или 2 соответственно, и их консервативные модификации последовательности.

Антитела, содержащие вариабельные области тяжелых и легких цепей, характеризующиеся по меньшей мере 80%, или по меньшей мере 85%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или большей идентичностью последовательности с любой из вышеприведенных последовательностей, также включены в настоящее изобретение. Промежуточные диапазоны вышеуказанных значений, например, вариабельные области тяжелых и легких цепей, характеризующиеся по меньшей мере 80-85%, 85-90%, 90-95% или 95-100% идентичностью последовательности с любой из вышеприведенных последовательностей, также подразумеваются как охватываемые настоящим изобретением.

В одном варианте осуществления антитело к LY75 содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 1 или последовательность, которая на по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична SEQ ID NO: 1. В другом варианте осуществления анти

- 2 046736 тело к LY75 содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 2 или последовательность, которая на по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична SEQ ID NO: 2. В другом варианте осуществления антитело к LY75 содержит каркасную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, на по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% идентичную каркасной области вариабельной области тяжелой цепи под SEQ ID NO: 1, показанной под SEQ ID NO: 16, 17, 18 и 19. В другом варианте осуществления антитело к LY75 содержит каркасную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, на по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% идентичную каркасной области вариабельной области легкой цепи под SEQ ID NO: 2, показанной под SEQ ID NO: 20, 21, 22 и 23.

В дополнительном варианте осуществления антитело к LY75 содержит тяжелую цепь, содержащую SEQ ID NO: 38 или последовательность, которая на по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична SEQ ID NO: 38. В другом варианте осуществления антитело к LY75 содержит легкую цепь, содержащую SEQ ID NO: 39 или последовательность, которая на по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична SEQ ID NO: 39. Тяжелая цепь может содержать последовательности под SEQ ID NO: 5-7 или 1. Легкая цепь может содержать последовательности под SEQ ID NO: 8-10 или 2.

В одном варианте осуществления, антитело к LY75 конкурирует за связывание с LY75 с антителом, содержащим вариабельные области тяжелой и/или легкой цепей, содержащие аминокислотные последовательности, представленные под SEQ ID NO: 1 и 2, соответственно, или аминокислотные последовательности, на по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% идентичные им. В другом варианте осуществления антитело к LY75 конкурирует за связывание с LY75 с антителом, содержащим вариабельные области тяжелых и/или легких цепей, содержащие аминокислотные последовательности, представленные под SEQ ID NO: 1 и 2 (LY75_A1).

Другие антитела по настоящему изобретению связываются с тем же эпитопом или эпитопом на LY75, распознаваемым антителами, описанными в данном документе. В другом конкретном варианте осуществления антитело связывается с эпитопом на LY75, распознаваемым антителом, содержащим вариабельные области тяжелых и/или легких цепей, содержащие аминокислотные последовательности, соответственно представленные под SEQ ID NO: 1 и 2, или аминокислотные последовательности, на по меньшей мере 80% идентичные им. В другом варианте осуществления антитело связывается с эпитопом на LY75, распознаваемым антителом, содержащим вариабельные области тяжелых и/или легких цепей, содержащие аминокислотные последовательности, представленные под SEQ ID NO: 1 и 2 (LY75_A1).

В дополнительном варианте осуществления антитела к LY75 специфично связываются с одним или более, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10, пептидом(-ами), выбранным(-и) из группы, включающей SEQ ID NO: 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 или 37, или их фрагментами, где указанные фрагменты содержат по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9 или по меньшей мере 10 смежных аминокислот. В дополнительном варианте осуществления эпитоп, распознаваемый антителами к LY75, содержит один или более пептидов, два или более или три или более пептидов, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 27, 29, 30, 34, 35, 36 или 37, или их фрагментов, где указанные фрагменты содержат по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9 или по меньшей мере 10 смежных аминокислот. В дополнительном варианте осуществления эпитоп, распознаваемый антителами к LY75, содержит один или более пептидов, например, два или три пептида, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 30, 36 и 37, или их фрагментов, где указанные фрагменты содержат по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9 или по меньшей мере 10 смежных аминокислот.

В дополнительном варианте осуществления антитела к LY75 содержат отличающиеся CDR по сравнению с исходными антителами, описанными в данном документе. Таким образом, в настоящем изобретении представлены варианты антител, содержащие варианты вариабельных областей исходного

- 3 046736 антитела, где исходное антитело содержит первую vhCDR, содержащую SEQ ID NO: 5, вторую vhCDR, содержащую SEQ ID NO: 6, третью vhCDR, содержащую SEQ ID NO: 7, первую vlCDR, содержащую SEQ ID nO: 8, вторую vlCDR, содержащую SEQ iD NO: 9 и третью vlCDR, содержащую SEQ ID NO: 10, и где вариант антитела в совокупности имеет 1, 2, 3, 4, 5 или 6 аминокислотных замен в наборе из первой vhCDR, второй vhCDR, третьей vhCDR, первой vlCDR, второй vlCDR и третьей vlCDR, при этом 1-4, 1-3 или 1-2 замены являются особенно применимыми, и где антитело сохраняет специфичное связывание с LY75.

Все антитела, раскрытые в данном документе, могут быть антителами полной длины, например, любого из следующих изотипов: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, секреторный компонент IgA, IgD и IgE. В качестве альтернативы антитела могут представлять собой фрагменты, такие как антигенсвязывающая часть или одноцепочечное антитело (например, Fab, F(ab')2, Fv, одноцепочечный Fvфрагмент, выделенная область, определяющая комплементарность (CDR), или комбинация двух или более выделенных CDR). Антитела могут быть антителами любого типа, в том числе без ограничения человеческими, гуманизированными и химерными антителами.

В других вариантах осуществления антитела к LY75 представлены в форме иммуноконъюгата (т.е. они дополнительно включают ковалентно присоединенную функциональную часть). В конкретном варианте осуществления функциональная часть представляет собой лекарственное средство, такое как майтанзиноид, доластатин, ауристатин, трихотецин, калихеамицин, CC1065 или их производные. В предпочтительном варианте осуществления функциональная часть, представляющая собой лекарственное средство, представляет собой DM1 или DM4.

В одном варианте осуществления антитело к LY75 содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, кодируемые последовательностями нуклеиновой кислоты, содержащими SEQ ID NO: 3 и 4 соответственно, или последовательностями нуклеиновой кислоты, характеризующимися по меньшей мере 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичностью с вышеупомянутыми последовательностями нуклеиновой кислоты или последовательностями, отличающимися от SEQ ID NO: 3 и 4 по причине вырожденности генетического кода.

В дополнительном аспекте представлен способ лечения рака у пациента, включающий одновременное, последовательное или раздельное введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективных количеств компонентов (A) и (B) фармацевтической комбинации по настоящему изобретению.

В дополнительном аспекте настоящего изобретения представлена фармацевтическая комбинация по настоящему изобретению для применения при лечении рака.

Также представлено применение компонентов (A) и (B), как определено в данном документе, в получении фармацевтической комбинации для одновременного, раздельного или последовательного применения для лечения рака. В одном варианте осуществления рак предпочтительно представляет собой лейкоз или лимфому.

В некоторых вариантах осуществления рак выбран из группы, состоящей из неходжкинской лимфомы, диффузной крупноклеточной B-клеточной лимфомы (DLBCL), B-клеточной лимфомы, фолликулярной лимфомы, мантийноклеточной лимфомы, лимфомы из лимфоидной ткани слизистых оболочек (MALT), B-клеточной лимфомы, богатой Т-клетками/гистиоцитами, лимфомы Беркитта, лимфоплазмоцитарной лимфомы, мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы, лимфомы из клеток маргинальной зоны, T-клеточной лимфомы, периферической T-клеточной лимфомы, анапластической крупноклеточной лимфомы и ангиоиммунобластной T-клеточной лимфомы, острого миелоидного лейкоза и хронического лимфоцитарного лейкоза. Более предпочтительно рак представляет собой DLBCL или неходжкинскую лимфому.

Также в пределах объема настоящего изобретения находятся наборы, содержащие фармацевтическую комбинацию по настоящему изобретению и необязательно инструкции по применению. Набор может дополнительно содержать по меньшей мере один дополнительный реагент или одно или более дополнительных антител.

Другие признаки и преимущества настоящего изобретения будут очевидными из следующего подробного описания и формулы изобретения.

Краткое описание графических материалов

На фиг. 1 представлено выравнивание тяжелой цепи LY75_A1 (SEQ ID NO: 1), VH 3-15 человека зародышевого типа (SEQ ID NO: 11) и JH4 человека зародышевого типа (SEQ ID NO: 12). CDR-области тяжелой цепи LY75_A1 подчеркнуты.

На фиг. 2 представлено выравнивание легкой цепи LY75_A1 (SEQ ID NO: 2), VK O12 человека зародышевого типа (SEQ ID NO: 13) и JK4 человека зародышевого типа (SEQ ID NO: 14). CDR-области легкой цепи LY75_A1 подчеркнуты.

На фиг. 3a представлена цитотоксическая активность моноклональных антител к LY75, конъюгированных с DM1, в отношении HT-29 и показано, что при том, что большинство антител связываются с LY75, только некоторые из них проявляют эффективность.

На фиг. 3b представлена цитотоксическая активность антител к LY75, конъюгированных с DM1 ли

- 4 046736 бо DM4, в отношении HT-29.

На фиг. 3c представлена цитотоксическая активность антител к LY75, конъюгированных с DM1 либо DM4, в отношении клеток RAJI.

На фиг. 3d представлена цитотоксическая активность антител к LY75, конъюгированных с DM1 либо DM4, в отношении клеток Namalwa.

На фиг. 3e представлена цитотоксическая активность антител к LY75, конъюгированных с DM1 либо DM4, в отношении клеток Karpas 299.

На фиг. 3f представлена цитотоксическая активность антител к LY75, конъюгированных с DM1 либо DM4, в отношении клеток BxPC3.

На фиг. 3g представлена цитотоксическая активность антител к LY75, конъюгированных с DM1 либо DM4, в отношении клеток HupT4.

На фиг. 3h представлена цитотоксическая активность антител к LY75, конъюгированных с DM1 либо DM4, в отношении клеток HPAFFII.

На фиг. 3i представлена цитотоксическая активность антител к LY75, конъюгированных с DM1 либо DM4, в отношении клеток EHEB.

На фиг. 3j представлена цитотоксическая активность антител к LY75, конъюгированных с DM1 либо DM4, в отношении клеток Mec-1.

На фиг. 3k представлена цитотоксическая активность антител к LY75, конъюгированных с DM1 либо DM4, в отношении клеток AML-193.

На фиг. 3l представлена цитотоксическая активность антител к LY75, конъюгированных с DM1 либо DM4, в отношении клеток HCC 70.

На фиг. 3m представлена цитотоксическая активность антител к LY75, конъюгированных с DM1 либо DM4, в отношении клеток HCC 1806.

На фиг. 3n представлена цитотоксическая активность антител к LY75, конъюгированных с DM1 либо DM4, в отношении клеток MDA-MB-468.

На фиг. 3o представлена цитотоксическая активность антител к LY75, конъюгированных с DM1 либо DM4, в отношении клеток RT4.

На фиг. 3p представлена цитотоксическая активность антител к LY75, конъюгированных с DM1 либо DM4, в отношении клеток 5637.

На фиг. 3q представлена цитотоксическая активность антител к LY75, конъюгированных с DM1 либо DM4, в отношении клеток SW780.

На фиг. 3r представлена цитотоксическая активность антител к LY75, конъюгированных с DM1 либо DM4, в отношении клеток SCC-9.

На фиг. 3 s представлена цитотоксическая активность антител к LY75, конъюгированных с DM1 либо DM4, в отношении клеток OE 19.

На фиг. 3t представлена цитотоксическая активность антител к LY75, конъюгированных с DM1 либо DM4, в отношении клеток OVCAR-3.

На фиг. 3u представлена цитотоксическая активность антител к LY75, конъюгированных с DM1 либо DM4, в отношении клеток SK-OV-3.

На фиг. 3v представлена цитотоксическая активность антител к LY75, конъюгированных с DM1 либо DM4, в отношении клеток MOLP-8.

На фиг. 3w представлена цитотоксическая активность антител к LY75, конъюгированных с DM1 либо DM4, в отношении клеток RPMI8226.

На фиг. 4a представлена эффективность антител к LY75, конъюгированных с DM1 либо DM4, в отношении клеток Raji лимфомы Беркитта в ксенотрансплантатной модели на мышах с SCID.

На фиг. 4b представлена эффективность антител к LY75, конъюгированных с DM1 либо DM4, в отношении клеток Namalwa лимфомы Беркитта в ксенотрансплантатной модели на мышах с SCID.

На фиг. 4с представлена эффективность антител к LY75, конъюгированных с DM1 либо DM4, в отношении клеток HPAFII аденокарциномы поджелудочной железы в ксенотрансплантатной модели на бестимусных голых мышах.

На фиг. 4d представлена эффективность антител к LY75, конъюгированных с DM1 либо DM4, в отношении клеток SW780 карциномы мочевого пузыря человека в ксенотрансплантатной модели на мышах с SCID.

На фиг. 4e представлена эффективность антител к LY75, конъюгированных с DM1 либо DM4, в отношении клеток MDA-MB-468 в ксенотрансплантатной модели на бестимусных голых мышах.

На фиг. 4f представлена эффективность антител к LY75, конъюгированных с DM1 либо DM4, в отношении клеток COLO205 аденокарциномы ободочной и прямой кишки в ксенотрансплантатной модели на бестимусных голых мышах.

На фиг. 5a показано конкурентное связывание mAb к LY75 и mAb к LY75, конъюгированного с MCC-DM1.

На фиг. 5b показано неконкурентное связывание LY75_A1 и mAb к LY75, конъюгированного с MCC-DM1.

- 5 046736

На фигурах 6a-6j показаны графические представления связывания антитела LY75_A1 с пептидами LY75 в пептидной микроматрице.

На фиг. 7 показано выравнивание аминокислотных последовательностей пептидов, с которыми связывается антитело LY75_A1, как в микроматричном анализе пептидов, так и в анализе с осаждением пептидов. Выделенные пептиды, вероятно, образуют эпитоп, распознаваемый антителом LY75_A1.

На фиг. 8 показан график алгебраической оценки: CI. против фракционного эффекта различных доз LY75_DM4 в комбинации с венетоклаксом в отношении клеточной линии U2932 ABC-DLBCL.

На фиг. 9 показан график алгебраической оценки: CI против фракционного эффекта различных доз LY75_DM4 в комбинации с венетоклаксом в отношении клеточной линии HBL-1 ABC-DLBCL.

На фиг. 10 показан график алгебраической оценки: CI против фракционного эффекта различных доз LY75_DM4 в комбинации с венетоклаксом в отношении клеточной линии HBL-1 ABC-DLBCL.

На фиг. 11 показан график алгебраической оценки: CI против фракционного эффекта различных доз LY75_DM4 в комбинации с венетоклаксом в отношении клеточной линии TMD8 ABC-DLBCL.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к фармацевтическим комбинациям, содержащим компоненты (A) и (B), как определено в данном документе, где фармацевтическая комбинация представлена в форме комбинированного препарата для одновременного, раздельного или последовательного применения. Компонент (A) относится к антителу к LY75, как определено в данном документе. Компонент (B) относится к венетоклаксу или его фармацевтически-приемлемой соли.

Один пример белка LY75 приведен под SEQ ID NO: 15 в данном документе. Термины антитела к LY75 и антитела LY75 используются взаимозаменяемо в данном документе.

Антитела LY75, раскрытые в данном документе, могут интернализироваться при контакте с клетками, экспрессирующими рецептор LY75. Как обсуждается в данном документе, рецептор LY75 сверхэкспрессируется и/или дифференциально экспрессируется в определенных раковых клетках, в том числе без ограничения при лейкозе, предпочтительно остром миелоидном лейкозе или хроническом лимфоцитарном лейкозе, лимфоме, предпочтительно DLBCL, B-клеточной лимфоме, фолликулярной лимфоме, мантийноклеточной лимфоме, лимфоме из лимфоидной ткани слизистых оболочек (MALT), B-клеточной лимфоме, богатой T-клетками/гистиоцитами, лимфоме Беркитта, лимфоплазмоцитарной лимфоме, мелкоклеточной лимфоцитарной лимфоме, лимфоме из клеток маргинальной зоны, T-клеточной лимфоме, периферической T-клеточной лимфоме, анапластической крупноклеточной лимфоме и ангиоиммунобластной T-клеточной лимфоме.

В связи с этим, если антитела к LY75, раскрытые в данном документе, конъюгированы с лекарственными средствами (иногда называемые в данном документе конъюгатами антитело-лекарственное средство или ADC), то интернализация этих молекул ADC раковыми клетками приводит к гибели клеток и, таким образом, лечению опухоли.

Антитела к LY75 обладают конкретными структурными особенностями, такими как CDR-области с конкретными аминокислотными последовательностями. В данном документе описан набор CDR, которые могут образовывать аффинный реагент, например, антитело, который характеризуется связыванием с LY75.

Любое из антител к LY75 по настоящему изобретению может являться выделенным антителом.

Таким образом, в настоящем изобретении представлены антитела, предпочтительно выделенные антитела (которые, как вкратце изложено ниже, включают большое разнообразие хорошо известных структур, производных, миметиков и конъюгатов антител), нуклеиновые кислоты, кодирующие комбинации антител, клетки-хозяева, применяемые для получения комбинаций антител, способы получения комбинаций антител и фармацевтические комбинации, содержащие антитела и необязательно фармацевтический носитель, способы лечения, включающие применение фармацевтических комбинаций, и применение фармацевтических комбинаций для лечения форм рака.

Лимфоцитарный антиген 75 действует в качестве эндоцитирующего рецептора, направляющего захваченные антигены из внеклеточного пространства в специализированный антиген-процессирующий компартмент, и, как полагают, вызывает снижение пролиферации B-лимфоцитов.

Согласно SWISS-PROT лимфоцитарный антиген 75 экспрессируется в селезенке, тимусе, толстой кишке и лимфоцитах периферической крови. Он был выявлен в линиях миелоидных клеток и лимфоидных B-клеток. Изоформы, обозначенные в данном документе как OGTA076b и OGTA076c, экспрессируются в злокачественных клетках лимфомы Ходжкина, называемых клетками Ходжкина и РидШтернберга (HRS). LY75 действует в качестве эндоцитирующего рецептора, направляющего захваченные антигены из внеклеточного пространства в специализированный антиген-процессирующий компартмент. Он вызывает снижение пролиферации B-лимфоцитов.

Экспрессия LY75 наблюдалась при раке поджелудочной железы, мочевого пузыря, яичника, молочной железы (в том числе трижды негативном), ободочной и прямой кишки, пищевода, кожи, щитовидной железы и легкого (немелкоклеточном), а также при множественной миеломе и многих различных подтипах лимфомы (в том числе DLBCL) и лейкоза.

Антитело к LY75 в некоторых случаях может перекрестно реагировать с LY75 от вида, отличного

- 6 046736 от человека. Например, для облегчения проведения клинического исследования антитела к LY75 могут перекрестно реагировать с молекулами LY75 мышей или приматов. В альтернативном случае в некоторых вариантах осуществления антитела могут обладать полной специфичностью к LY75 человека и могут не характеризоваться видовой перекрестной реактивностью или другими ее типами в отношении молекул, отличных от человеческих.

Антитела, находящие применение в настоящем изобретении, могут принимать ряд форматов, описанных в данном документе, включающих традиционные антитела, а также производные, фрагменты и миметики антител, описанные ниже. В одном варианте осуществления в настоящем изобретении представлены структуры антител, содержащие набор из 6 CDR, определенных в данном документе (содержащих небольшое количество аминокислотных изменений, описанных ниже).

Антитело, как используется в данном документе, включает большое разнообразие структур, понятных специалистам в данной области, которые в некоторых вариантах осуществления содержат как минимум набор из 6 CDR, определенных в данном документе; включающих без ограничения традиционные антитела (в том числе как моноклональные, так и поликлональные антитела), гуманизированные и/или химерные антитела, фрагменты антител, сконструированные антитела (например, имеющие аминокислотные модификации, вкратце изложенные ниже), полиспецифические антитела (в том числе биспецифические антитела) и другие аналоги, известные из уровня техники.

Структурные единицы традиционных антител обычно включают тетрамер. Каждый тетрамер обычно состоит из двух идентичных пар полипептидных цепей, при этом каждая пара имеет одну легкую (обычно имеющую молекулярную массу приблизительно 25 кДа) и одну тяжелую цепь (обычно имеющую молекулярную массу приблизительно 50-70 кДа). Легкие цепи человека классифицируются как легкие каппа- и лямбда-цепи. Тяжелые цепи классифицируются как мю, дельта, гамма, альфа или эпсилон и соответственно определяют изотип антитела как IgM, IgD, IgG, IgA и IgE. IgG имеет несколько подклассов, включающих без ограничения IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. IgM имеет подклассы, включающие без ограничения IgM1 и IgM2. Таким образом, изотип, как используется в данном документе, означает любой из подклассов иммуноглобулинов, определяемых химическими и антигенными характеристиками их константных областей. Известными изотипами иммуноглобулинов человека являются IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgM1, IgM2, IgD и IgE. Следует понимать, что терапевтические антитела также могут включать гибриды из любой комбинации изотипов и/или подклассов.

Во многих вариантах осуществления в настоящем изобретении применяются изотипы IgG, при этом в ряде путей применения особенное применение находит IgG1.

Аминоконцевая часть каждой цепи содержит вариабельную область из приблизительно 100-110 или больше аминокислот, несущих основную ответственность за распознавание антигена. В вариабельной области в каждом из V-доменов тяжелой цепи и легкой цепи три петли собраны вместе с образованием антигенсвязывающего участка. Каждая из петель называется областью, определяющей комплементарность (далее в данном документе упоминаемой как CDR), в которой изменчивость аминокислотной последовательности является наиболее значительной. Вариабельный относится к тому факту, что определенные сегменты вариабельной области существенно различаются по последовательности среди антител. Вариабельность в пределах вариабельной области распределена неравномерно. На самом деле V-области состоят из относительно инвариантных участков, называемых каркасными областями (FR), из 15-30 аминокислот, разделенных более короткими областями чрезвычайной вариабельности, называемыми гипервариабельными областями, каждая из которых имеет длину 9-15 аминокислот или больше.

Каждая VH и VL состоит из трех гипервариабельных областей (областей, определяющих комплементарность, CDR) и четырех FR, расположенных от аминоконца к карбоксильному концу в следующем порядке: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4.

Г ипервариабельная область обычно охватывает аминокислотные остатки из аминокислотных остатков приблизительно 24-34 (LCDR1; L означает легкую цепь), 50-56 (LCDR2) и 89-97 (LCDR3) в вариабельной области легкой цепи и около приблизительно 31-35В (HCDR1; H означает тяжелую цепь), 5065 (HCDR2) и 95-102 (HCDR3) в вариабельной области тяжелой цепи; Kabat et al., SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991), и/или остатки, образующие гипервариабельную петлю (например, остатки 26-32 (LCDR1), 50-52 (LCDR2) и 91-96 (LCDR3) в вариабельной области легкой цепи и 26-32 (HCDR1), 53-55 (HCDR2) и 96-101 (HCDR3) в вариабельной области тяжелой цепи; Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917). Конкретные CDR по настоящему изобретению описаны ниже.

Во всем настоящем описании при ссылке на остаток в вариабельном домене (примерно остатки 1107 вариабельной области легкой цепи и остатки 1-113 вариабельной области тяжелой цепи) обычно применяется система нумерации по Kabat (например, Kabat et al., выше (1991)).

CDR вносят вклад в образование антигенсвязывающего или, более конкретно, эпитопсвязывающего участка антител. Термин эпитоп или антигенная детерминанта относится к участку на антигене, с которым специфично связывается иммуноглобулин или антитело. Эпитопы могут быть образованы как смежными аминокислотами, так и несмежными аминокислотами, расположенными рядом благодаря сворачиванию белка в третичную структуру. Эпитопы, образованные смежными аминокислотами, обыч

- 7 046736 но сохраняются при воздействии денатурирующих растворителей, тогда как эпитопы, образованные благодаря сворачиванию в третичную структуру, обычно утрачиваются при обработке денатурирующими растворителями. Эпитоп обычно содержит по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 аминокислот в уникальной пространственной конформации. Описанные в данном документе способы определения того, с какими эпитопами связывается указанное антитело (т.е. картирования эпитопов), хорошо известны из уровня техники и включают, например, анализы по методам иммуноблоттинга и иммунопреципитации, где перекрывающиеся или смежные пептиды LY75 исследуют в отношении реактивности с указанным антителом к LY75. Способы определения пространственной конформации эпитопов включают методики, известные из уровня техники, и методики, описанные в данном документе, например, рентгеновскую кристаллографию и 2-мерную спектроскопию ядерного магнитного резонанса (см., например, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)). Термин картирование эпитопов относится к способу идентификации молекулярных детерминант распознавания антигена антителом.

Карбоксиконцевая часть каждой цепи определяет константные области, несущие основную ответственность за эффекторную функцию. Kabat и соавт. собрали данные о множестве первичных последовательностей вариабельных областей тяжелых цепей и легких цепей. На основании степени консервативности последовательностей они отнесли отдельные первичные последовательности к CDR и каркасным участкам и составили их перечень (см. SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th edition, NIH publication, No. 91-3242, E.A. Kabat et al.).

В подклассе иммуноглобулинов IgG в тяжелой цепи находится несколько доменов иммуноглобулинов. Под доменом иммуноглобулина (Ig) в данном документе подразумевается область иммуноглобулина, имеющая четко выраженную третичную структуру. В настоящем изобретении интерес представляют домены тяжелых цепей, включающие константные домены (CH) и шарнирные домены тяжелых цепей. Применительно к антителам IgG каждый из изотипов IgG имеет три CH-области. Соответственно, CH''-домены применительно к IgG являются следующими: CH1 относится к положениям 118-220 согласно EU-индексу по Kabat. CH2 относится к положениям 237-340 согласно EU-индексу по Kabat, a CH3 относится к положениям 341-447 согласно EU-индексу по Kabat.

Другим типом домена тяжелой цепи Ig является шарнирная область. Под шарнирным участком, или шарнирной областью, или шарнирной областью антитела, или шарнирной областью иммуноглобулина в данном документе подразумевается гибкий полипептид, содержащий аминокислоты между первым и вторым константными доменами антитела. В структурном плане СН1-домен IgG заканчивается положением 220 согласно EU, а СН2-домен IgG начинается с положения остатка 237 согласно EU. Таким образом, для антитела IgG шарнирный участок в данном документе определяется как включающий положения с 221 (D221 в IgG1) по 236 (G236 в IgG1), где нумерация соответствует EU-индексу по Kabat. В некоторых вариантах осуществления, например, применительно к Fc-области, включен нижний шарнирный участок, при этом нижний шарнирный участок обычно относится к положениям 226 или 230.

Особенный интерес в настоящем изобретении представляют Fc-области. Под Fc, или Fcобластью, или Fc-доменом, как используется в данном документе, подразумевается полипептид, содержащий константную область антитела, за исключением первого домена константной области иммуноглобулина и в некоторых случаях части шарнирного участка. Таким образом, Fc относится к последним двум доменам константной области иммуноглобулинов IgA, IgD и IgG, последним трем доменам константной области иммуноглобулинов IgE и IgM и гибкому шарнирному участку, расположенному в направлении N-конца от этих доменов. В случае IgA и IgM Fc может содержать J-цепь. В случае IgG Fcдомен содержит домены иммуноглобулинов Cy2 и Cy3 (Cy2 и Cy3) и нижнюю шарнирную область между Cy1 (Cy1) и Cy2 (Cy2). Хотя границы Fc-области могут варьировать, Fc-область тяжелой цепи IgG человека обычно определяется как включающая остатки от C226 или P230 до ее карбоксильного конца, где нумерация соответствует EU-индексу по Kabat. В некоторых вариантах осуществления, как более полно описано ниже, аминокислотные модификации производят в Fc-области, например, с изменением связывания с одним или более FcYR-рецепторами или с FcRn-рецептором.

В некоторых вариантах осуществления антитела являются антителами полной длины. Под антителом полной длины в данном документе подразумевается структура, являющаяся естественной биологической формой антитела, содержащая вариабельные и константные области, содержащие одну или более модификаций, вкратце изложенных в данном документе.

В альтернативном случае антитела могут представлять собой ряд структур, включающих без ограничения фрагменты антител, моноклональные антитела, биспецифические антитела, миниантитела, доменные антитела, синтетические антитела (иногда называемые в данном документе миметиками антител), химерные антитела, гуманизированные антитела, продукты слияния антител (иногда называемые в данном документе конъюгатами антител) и соответственно фрагменты каждого из них. Структуры, в основе которых лежит применение набора CDR, включены в определение антитела.

В одном варианте осуществления антитело представляет собой фрагмент антитела. Конкретные фрагменты антител включают без ограничения (i) Fab-фрагмент, состоящий из VL-, VH-, CL- и CH1

- 8 046736 доменов, (ii) Fd-фрагмент, состоящий из VH- и CHI-доменов, (iii) Fv-фрагмент, состоящий из VL- и VHдоменов отдельного антитела; (iv) dAb-фрагмент (Ward et al., 1989, Nature 341:544-546, включенный посредством ссылки во всей своей полноте), состоящий из отдельной вариабельной области, (v) выделенные CDR-области, (vi) P(ab')2-фрагменты, бивалентные фрагменты, содержащие два связанных Fabфрагмента, (vii) одноцепочечные молекулы Fv (scFv), где VH-домен и VL-домен связаны пептидным линкером, обеспечивающим объединение двух доменов с образованием антигенсвязывающего участка (Bird et al., 1988, Science 242:423-426, Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5879-5883, включенный посредством ссылки во всей своей полноте), (viii) биспецифические одноцепочечные Fv (WO 03/11161, включенная посредством ссылки во всей своей полноте) и (ix) диатела или триатела, поливалентные или полиспецифические фрагменты, конструируемые путем слияния генов (Tomlinson et. al., 2000, Methods Enzymol. 326:461-479; WO94/13804; Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448, все из которых включены посредством ссылки во всей своей полноте).

В некоторых вариантах осуществления антитело может представлять собой комбинацию от различных видов, например, химерное антитело и/или гуманизированное антитело. Иными словами, в настоящем изобретении наборы CDR можно применять с каркасными и константными областями, отличными от конкретно описанных в данном документе по последовательности.

В целом, как химерные антитела, так и гуманизированные антитела относятся к антителам, в которых объединены области от более чем одного вида. Например, химерные антитела традиционно содержат вариабельную(ые) область(и) мыши (или, в некоторых случаях, крысы) и константную(ые) область(и) человека. Гуманизированные антитела обычно относятся к антителам, отличным от человеческих, у которых каркасные области вариабельных доменов были заменены последовательностями, обнаруживаемыми в антителах человека. Как правило, в гуманизированном антителе все антитело, за исключением CDR, кодируется полинуклеотидом человеческого происхождения или за исключением своих CDR идентично такому антителу. CDR, некоторые или все из которых кодируются нуклеиновыми кислотами, происходящими от организма, отличного от человека, трансплантируют в каркасный участок со структурой бета-листа в вариабельной области антитела человека с получением антитела, специфичность которого определяется трансплантированными CDR. Получение таких антител описано, например, в WO 92/11018, Jones, 1986, Nature 321:522-525, Verhoeyen et al., 1988, Science 239:1534-1536, все из которых включены посредством ссылки во всей своей полноте. Обратная мутация по типу замены выбранных остатков акцепторных каркасных участков на соответствующие донорные остатки часто необходима для восстановления аффинности, утрачиваемой конструкцией после первоначальной трансплантации (US 5530101; US 5585089; US 5693761; US 5693762; US 6180370; US 5859205; US 5821337; US 6054297; US 6407213, все из которых включены посредством ссылки во всей своей полноте). Гуманизированное антитело в оптимальном случае также содержит по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина, обычно иммуноглобулина человека, и, соответственно, обычно содержит Fc-область человека. Гуманизированные антитела также можно получать с применением мышей с иммунной системой, подвергнутой генной инженерии. Roque et al., 2004, Biotechnol. Prog. 20:639-654, включенный посредством ссылки во всей своей полноте. Из уровня техники хорошо известен ряд методик и способов гуманизации и реконструирования антител, отличных от человеческих (см. Tsurushita & Vasquez, 2004, Humanization of Monoclonal Antibodies, Molecular Biology of B Cells, 533-545, Elsevier Science (USA), и литературные источники, упоминаемые там, все из которых включены посредством ссылки во всей своей полноте). Способы гуманизации включают без ограничения способы, описанные в Jones et al., 1986, Nature 321:522525; Riechmann et al., 1988; Nature 332:323-329; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534-1536; Queen et al., 1989, Proc Natl Acad Sci, USA 86:10029-33; He et al., 1998, J. Immunol. 160: 1029-1035; Carter et al., 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:4285-9, Presta et al., 1997, Cancer Res. 57(20):4593-9; Gorman et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4181-4185; O'Connor et al., 1998, Protein Eng 11:321-8, все из которых включены посредством ссылки во всей своей полноте. Гуманизация или другие способы снижения иммуногенности вариабельных областей антител, отличных от человеческих, может включать способы изменения поверхности, описанные, например, в Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:969-973, включенном посредством ссылки во всей своей полноте. В одном варианте осуществления исходное антитело было подвергнуто созреванию аффинности, известному из уровня техники. Для гуманизации и созревания аффинности можно использовать структурные способы, например, описанные в USSN 11/004590. Для гуманизации и/или созревания аффинности вариабельных областей антител можно использовать способы на основе отбора, в том числе без ограничения способы, описанные в Wu et al., 1999, J. Mol. Biol. 294:151-162; Baca et al., 1997, J. Biol. Chem. 272(16): 10678-10684; Rosok et al., 1996, J. Biol. Chem. 271(37): 22611-22618; Rader et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 8910-8915; Krauss et al., 2003, Protein Engineering 16(10):753-759, все из которых включены посредством ссылки во всей своей полноте. Другие способы гуманизации могут включать трансплантацию лишь частей CDR, в том числе без ограничения способы, описанные в USSN 09/810510; Tan et al., 2002, J. Immunol. 169:1119-1125; De Pascalis et al., 2002, J. Immunol. 169:3076-3084, все из которых включены посредством ссылки во всей своей полноте.

Антитела, раскрытые в данном документе, могут быть выделенными или рекомбинантными. Вы

- 9 046736 деленный, используемый для описания различных полипептидов, раскрытых в данном документе, означает полипептид, который был идентифицирован и отделен от и/или извлечен из клетки или культуры клеток, в которой он экспрессировался. Таким образом, выделенное антитело предназначено для обозначения антитела, практически свободного от других антител с другой специфичностью к антигенам (например, выделенное антитело, которое специфично связывается с LY75, практически свободно от антител, специфично связывающихся с антигенами, отличными от LY75). Таким образом, выделенное антитело представлено в форме, обычно не обнаруживаемой в природе (например, не встречающейся в природе). Выделенное антитело, определенное в данном документе, может в одном варианте осуществления содержать по меньшей мере одну аминокислоту, не встречающуюся во встречающемся в природе антителе. Эта аминокислота может быть введена посредством добавления или замены. Будет понятно, что вводимая аминокислота может быть встречающейся в природе или не встречающейся в природе аминокислотой. В некоторых вариантах осуществления антитела по настоящему изобретению представляют собой рекомбинантные белки, выделенные белки или практически чистые белки. Выделенный белок не сопровождается по меньшей мере некоторой частью материала, с которым он обычно связан в своем естественном состоянии, например, составляя по меньшей мере приблизительно 5% или по меньшей мере приблизительно 50% по весу от общего белка в указанном образце. Понятно, что выделенный белок может составлять от 5 до 99,9% по весу от содержания общего белка в зависимости от обстоятельств. Например, белок может быть получен в значительно более высокой концентрации путем применения индуцируемого промотора или промотора, обеспечивающего высокую экспрессию, благодаря чему белок получают при повышенных уровнях концентрации. В случае рекомбинантных белков определение включает получение антитела в большом разнообразии организмов и/или клеток-хозяев, известных в данной области техники, в которых оно не образуется в естественных условиях. Обычно выделенный полипептид получают с помощью по меньшей мере одного этапа очистки. Выделенное антитело относится к антителу, практически свободному от других антител с другой специфичностью к антигенам. Например, выделенное антитело, которое специфически связывается с LY75, практически не содержит антител, специфически связывающих антигены, отличные от LY75. Разумеется, выделенное антитело к LY75 может быть связано с венетоклаксом.

Выделенные моноклональные антитела с разной специфичностью можно объединить в четко определенную композицию. Таким образом, например, антитело по настоящему изобретению можно необязательно и по отдельности включать или не включать в состав, как дополнительно обсуждается ниже.

Антитела к LY75 по настоящему изобретению специфично связываются с LY75 (например, SEQ ID NO: 15). Специфичное связывание, или специфично связывается с, или специфичный к в отношении конкретного антигена или эпитопа означает связывание, измеримо отличающееся от неспецифического взаимодействия. Специфичное связывание можно измерить, например, путем определения связывания молекулы в сравнении со связыванием контрольной молекулы, которая обычно представляет собой молекулу сходной структуры, не обладающей активностью связывания. Например, специфичное связывание можно определить по конкуренции с контрольной молекулой, сходной с целевой.

Специфичное связывание с конкретным антигеном или эпитопом может проявляться, например, антителом, имеющим KD для антигена или эпитопа, составляющую по меньшей мере приблизительно 10^-4 М, по меньшей мере приблизительно 10^-5 М, по меньшей мере приблизительно 10^-6 М, по меньшей мере приблизительно 10^-7 М, по меньшей мере приблизительно 10^-8 М, по меньшей мере приблизительно 10^-9 М, в альтернативном случае по меньшей мере приблизительно 10^-10 М, по меньшей мере приблизительно 10^-11 М, по меньшей мере приблизительно 10^-12 М или больше, где KD относится к константе скорости диссоциации при конкретном взаимодействии антитела и антигена. Антитело, которое специфично связывается с антигеном, обычно будет иметь K_D, в 20, 50, 100, 500, 1000, 5000, 10000 или больше раз большую для контрольной молекулы по сравнению с антигеном или эпитопом. Однако, в настоящем изобретении при введении ADC на основе антител к LY75 по настоящему изобретению важно, чтобы KD была достаточной для обеспечения интернализации и, следовательно, гибели клеток без значительных побочных эффектов.

Специфичное связывание с конкретным антигеном или эпитопом также может проявляться, например, антителом, имеющим K_A или K_a для антигена или эпитопа, по меньшей мере в 20, 50, 100, 500, 1000, 5000, 10000 или больше раз большую для эпитопа по сравнению с контролем, где K_A или K_a относится к константе скорости ассоциации при конкретном взаимодействии антитела и антигена.

Стандартные анализы для оценки способности антител связываться с LY75 могут проводиться на уровне белков или клеток и известны из уровня техники, в том числе, например, ELISA, виды вестернблоттинга, RIA, анализы с BIAcore® и анализ с использованием проточной цитометрии. Подходящие анализы подробно описаны в разделе Примеры. Кинетику связывания (например, аффинность связывания) антител также можно оценить с помощью стандартных анализов, известных из уровня техники, как, например, с помощью анализа на системе Biacore®. Для оценки связывания с клетками Raji или Daudi B-клеточной опухоли клетки Raji (номер депонирования в ATCC CCL-86) или Daudi (номер депонирования в ATCC CCL-213) можно получить из общедоступных источников, таких как Американская

- 10 046736 коллекция типовых культур, и применять в стандартных анализах, таких как анализы по методу проточной цитометрии.

Антитела к LY75, которые связываются с LY75 (SEQ ID NO: 15), может интернализоваться при контакте с клетками, экспрессирующими LY75 на поверхности клетки. Эти антитела упоминаются в данном документе как антитела, связывающиеся с LY75 либо, для простоты описания, антитела к LY75. Оба термина используются взаимозаменяемо в данном документе.

Антитела к LY75 интернализируются при контакте с клетками, в частности, опухолевыми клетками, на поверхности которых экспрессируется LY75. Иными словами, антитела к LY75, определенные в данном документе, которые также содержат конъюгированные лекарственные средства, интернализируются опухолевыми клетками, что приводит к высвобождению лекарственного средства и последующей гибели клеток, обеспечивая лечение форм рака, характеризующихся экспрессией LY75. Интернализацию в данном случае можно измерить несколькими способами. В одном варианте осуществления антитела к LY75 приводят в контакт с клетками, такими как линия клеток, вкратце описанная в данном документе, с помощью стандартных анализов, как, например, с использованием MAbZap. Для специалиста в данной области будет очевидно, что анализ с использованием MabZap иллюстрирует ожидаемый эффект, который можно наблюдать для конъюгата антитело-лекарственное средство (ADC). В последнем случае ADC будет интернализироваться, привнося таким образом лекарственное средство в клетку. Токсичное лекарственное средство будет иметь способность к уничтожению клетки, т.е. к уничтожению раковой клеткимишени. Данные анализов MabZap легко принимаются специалистами в данной области как иллюстративные для анализов ADC (Kohls, M and Lappi, D., [2000] Biotechniques, vol. 28, no. 1, 162-165).

В этих вариантах осуществления анализов in vitro антитела к LY75 добавляют вместе с антителом к антителам к LY75, содержащим токсин; например, антитело к LY75 может быть мышиным или гуманизированным, а антитело к антителам к LY75, может быть антителом к мышиным антителам или антителом к гуманизированным антителам и содержать токсин, такой как сапорин. После образования комплекса [антитело к LY75]-[конъюгат антитело к антителу к LY75-лекарственное средство] комплекс интернализируется, и лекарственное средство (например, сапорин) высвобождается, приводя к гибели клеток. Лекарственное средство высвобождается только после интернализации, и поэтому клетки в отсутствие интернализации остаются жизнеспособными. Как вкратце изложено ниже, без ограничения какойлибо теорией, в терапевтических путях применения антитело к антителу к LY75 содержит токсин, и после интернализации связь между антителом и токсином расщепляется с высвобождением токсина и уничтожением клетки.

В одном варианте осуществления антитело к LY75 содержит области, определяющие комплементарность (CDR), или вариабельные области (VR) тяжелых и легких цепей конкретного антитела, описанного в данном документе (например, упоминаемого в данном документе как LY75_A1). Соответственно, в одном варианте осуществления антитело содержит домены CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области тяжелой цепи (VH) антитела LY75_A1, имеющей последовательность, показанную под SEQ ID NO: 1, и домены CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области легкой цепи (VL) антитела LY75_A1, имеющей последовательность, показанную под SEQ ID NO: 2.

В другом варианте осуществления антитело к LY75 содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую первую vhCDR, содержащую SEQ ID NO: 5; вторую vhCDR, содержащую SEQ ID NO: 6; и третью vhCDR, содержащую SEQ ID NO: 7; и вариабельную область легкой цепи, содержащую первую vlCDR, содержащую SEQ ID NO: 8; вторую vlCDR, содержащую SEQ ID NO: 9; и третью vlCDR, содержащую SEQ ID NO: 10.

В другом варианте осуществления антитела к LY75 связываются с LY75 человека и содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, содержащую SEQ ID NO: 1, и ее консервативные модификации последовательности. Антитело может дополнительно содержать вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, содержащую SEQ ID NO: 2, и ее консервативные модификации последовательности.

В дополнительном варианте осуществления антитела к LY75 связываются с LY75 человека и содержат вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, содержащие аминокислотные последовательности, представленные под SEQ ID NO: 1 и/или 2 соответственно, и их консервативные модификации последовательности.

В дополнительном варианте осуществления антитела к LY75 связываются с LY75 человека и содержат вариабельную область тяжелой цепи и легкой цепи, содержащие аминокислотные последовательности, представленные под SEQ ID NO: 38 и/или 39, соответственно, и модификации их консервативных последовательностей.

Как используется в данном документе, термин консервативная модификация последовательности относится, например, к замене аминокислоты аминокислотой, имеющей аналогичные характеристики. Для специалиста в данной области обычно общеизвестно, какие из этих замен могут считаться консервативными. Другие модификации, которые могут считаться консервативными модификациями последовательности, включают, например, гликозилирование.

Необязательно, одна или более из SEQ ID NO: 5-10 независимо предусматривают одну, две, три, че

- 11 046736 тыре или пять консервативных аминокислотных замен; необязательно одна или более из SEQ ID NO: 510 независимо предусматривают одну или две консервативные аминокислотные замены.

Предпочтительно, термин консервативные модификации последовательности подразумевается как включающий аминокислотные модификации, которые не влияют на характеристики связывания антитела, содержащего аминокислотную последовательность, или не изменяют их в значительной степени. Такие консервативные модификации включают аминокислотные замены, добавления или делеции. Модификации могут быть введены в антитело по настоящему изобретению посредством стандартных методик, известных из уровня техники, таких как сайт-направленный мутагенез и ПЦР-опосредованный мутагенез. Консервативные аминокислотные замены являются такими, при которых аминокислотный остаток заменяют аминокислотным остатком, имеющим сходную боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков, имеющих сходные боковые цепи, были определены в уровне техники. Такие семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислыми боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, один или более аминокислотных остатков в CDR-областях антитела по настоящему изобретению могут быть заменены другими аминокислотными остатками из того же семейства боковых цепей, и измененное антитело можно исследовать в отношении сохранения функции с применением функциональных анализов, описанных в данном документе.

Выделенные антитела, содержащие вариабельные области тяжелых и легких цепей, характеризующиеся по меньшей мере 80%, или по меньшей мере 85%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 91%, или по меньшей мере 92%, или по меньшей мере 93%, или по меньшей мере 94%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 96%, или по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или большей идентичностью последовательности с любой из вышеприведенных последовательностей, также включены в настоящее изобретение. Промежуточные диапазоны вышеуказанных значений, например, вариабельные области тяжелых и легких цепей, характеризующиеся по меньшей мере 80-85%, 85-90%, 90-95% или 95-100% идентичностью последовательности с любой из вышеприведенных последовательностей, также подразумеваются как охватываемые настоящим изобретением. В одном варианте осуществления антитело к LY75 содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 1 или последовательность, которая на по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична SEQ ID NO: 1. В другом варианте осуществления антитело к LY75 содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 2 или последовательность, которая на по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична SEQ ID NO: 2. В другом варианте осуществления антитело к LY75 содержит каркасную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична каркасу вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 1, содержащей SEQ ID NO: 16, 17 и 18. В другом варианте осуществления антитело к LY75 содержит каркасную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична каркасу вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO: 2, содержащей SEQ ID NO: 19, 20 и 21.

В дополнительном варианте осуществления антитело к LY75 содержит тяжелую цепь, содержащую SEQ ID NO: 38 или последовательность, которая на по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична SEQ ID NO: 38. В другом варианте осуществления антитело к LY75 содержит легкую цепь, содержащую SEQ ID NO: 39 или последовательность, которая на по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентична SEQ ID NO: 39. Тяжелая цепь может содержать последовательности под SEQ ID NO: 5-7 или 1. Легкая цепь может содержать последовательности под SEQ ID NO: 8-10 или 2.

В одном варианте осуществления антитело к LY75, называемое в данном документе антителом LY75_A1, содержит следующие CDR, а также их варианты, содержащие небольшое количество аминокислотных вариантов

- 12 046736

А1	SEQ Ш NO
CDR1 вариабельной области тяжелой цепи	5
CDR2 вариабельной области тяжелой цепи	6
CDR3 вариабельной области тяжелой цепи	7
CDR1 вариабельной области легкой цепи	8
CDR2 вариабельной области легкой цепи	9
CDR3 вариабельной области легкой цепи	10

В данном документе также раскрыты вариабельные области тяжелых и легких цепей, которые содержат наборы CDR по настоящему изобретению, а также тяжелые и легкие цепи полной длины (например, также содержащие константные области). Специалистам в данной области будет понятно, что наборы CDR антитела к LY75 могут быть включен в мышиные, гуманизированные или человеческие константные области (включая каркасные области). Соответственно, в настоящем описании представлены вариабельные тяжелые и легкие цепи, а также полноразмерные тяжелые и легкие цепи, которые на по меньшей мере 90-99% идентичны SEQ ID, раскрытым в данном документе, при этом все со значениями 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 и 99% являются применимыми в настоящем изобретении.

В некоторых вариантах осуществления антитело к LY75 представляет собой антитело, которое конкурирует за связывание с LY75 человека с антителом, содержащим вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 1, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 2. Антитела, конкурирующие за связывание, можно идентифицировать с применением стандартных методик. Такие методики включают, например, иммунологический анализ, демонстрирующий способность одного антитела к блокированию связывания другого антитела с антигеном-мишенью, т.е. анализ конкурентного связывания. Конкурентное связывание определяют в анализе, в котором исследуемый иммуноглобулин ингибирует специфичное связывание эталонного антитела с общим антигеном, таким как LY75. Известно множество типов анализов конкурентного связывания, например, твердофазный прямой или непрямой радиоиммунологический анализ (RIA), твердофазный прямой или непрямой иммуноферментный анализ (EIA), конкурентный сэндвич-анализ (см. Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242 (1983)); твердофазный прямой EIA с использованием комплекса биотин-авидин (см. Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614 (1986)); твердофазный прямой анализ с мечением, твердофазный прямой сэндвичанализ с мечением (см. Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)); твердофазный прямой RIA с мечением с использованием метки I-125 (см. Morel et al., Mol. Immunol. 25(1):7 (1988)); твердофазный прямой EIA с использованием комплекса биотин-авидин (Cheung et al., Virology 176:546 (1990)) и прямой RIA с мечением (Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77 (1990)). Обычно такой анализ включает применение очищенного антигена, связанного с твердой поверхностью или клетками, несущими любой из них, немеченого исследуемого иммуноглобулина и меченого эталонного иммуноглобулина. Конкурентное ингибирование измеряют путем определения количества метки, связанной с твердой поверхностью или с клетками, в присутствии исследуемого иммуноглобулина. Исследуемый иммуноглобулин обычно присутствует в избытке. Если конкурирующее антитело присутствует в избытке, оно обычно будет ингибировать специфичное связывание эталонного антитела с общим антигеном на по меньшей мере 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75%, 75-80%, 80-85%, 8590%, 90-95%, 95-99% или больше.

У моноклональных антител можно определить характеристики в отношении связывания с LY75 с применением многих известных методов. Как правило, антитела вначале характеризуют с помощью ELISA. Вкратце, микротитрационные планшеты можно покрывать очищенным LY75 в PBS, а затем блокировать нерелевантными белками, такими как бычий сывороточный альбумин (BSA), разбавленный в PBS. Разбавления плазмы от мышей, иммунизированных LY75, добавляют в каждую лунку и инкубируют в течение 1-2 ч при 37°C. Планшеты промывают с помощью PBS/Tween 20 и затем инкубируют с реагентом, представляющим собой поликлональное антитело козы к IgG человека, специфичное к Fc, конъюгированное с щелочной фосфатазой, в течение 1 ч при 37°C. После промывания планшеты проявляют с помощью субстрата ABTS и анализируют при OD 405. Предпочтительно, для процедур слияния будут использовать мышей, у которых проявляются наиболее высокие титры.

Как описано выше, анализ ELISA можно использовать для скрининга антител и, таким образом, гибридом, которые продуцируют антитела, проявляющие положительную реакционная способность с иммуногеном LY75. Гибридомы, которые связываются с LY75 предпочтительно с высокой аффинностью, затем могут быть субклонированы и дополнительно определены их характеристики. Один клон из каждой гибридомы, сохраняющий реактивность исходных клеток (по ELISA), можно затем выбрать для получения клеточного банка и для очистки антител.

Для очистки антител к LY75 отобранные гибридомы можно выращивать в роллерных флаконах, двухлитровых вращающихся колбах или других системах культивирования. Образцы надосадочной жидкости можно фильтровать и концентрировать перед аффинной хроматографией с белком A на сефарозе

- 13 046736 (Pharmacia, Пискатауэй, Нью-Джерси, США) для очистки белка. После замены буфера на PBS концентрацию можно определить по OD280 с использованием коэффициента экстинкции 1,43 или, предпочтительно, с помощью нефелометрического анализа. IgG можно проверить с помощью гель-электрофореза и с помощью антиген-специфического способа.

Чтобы определить, связываются ли выбранные моноклональные антитела к LY75 с уникальными эпитопами, каждое антитело может быть биотинилировано с использованием коммерчески доступных реагентов (Pierce, Рокфорд, Иллинойс, США). Связывание биотинилированных mAb можно выявить с помощью зонда, меченного стрептавидином. Для определения изотипа очищенных антител можно проводить изотипирующий ELISA с применением методик, принятых в данной области техники. Например, лунки титрационных микропланшетов можно покрыть 10 мкг/мл антитела к Ig на ночь при 4°C. После блокирования с помощью 5% BSA в планшетах проводят реакцию с 10 мкг/мл моноклональных антител или очищенных изотипических контролей при температуре окружающей среды в течение двух часов. В лунках затем можно провести реакцию с конъюгированными зондами, специфичными к IgG1 или другим изотипам. Планшеты проявляют и анализируют, как описано выше.

Чтобы протестровать связывание моноклональных антител с живыми клетками, экспрессирующими LY75, можно использовать проточную цитометрию. Вкратце, клеточные линии и/или человеческие РВМС, экспрессирующие мембраносвязанные LY75 (выращенные в стандартных условиях роста), смешивают с различными концентрациями моноклональных антител в PBS, содержащем 0,1% BSA при 4°C в течение 1 ч. После промывания проводят реакцию клеток с антителом к IgG, меченным флуоресцеином, в тех же условиях, что и при окрашивании первичным антителом. Образцы можно анализировать с помощью прибора FACScan с использованием свойств светорассеяния и бокового рассеяния для введения логического ограничения по отдельным клеткам и определения связывания меченых антител. Можно применять альтернативный анализ с применением флуоресцентной микроскопии в дополнение к анализу по методу проточной цитометрии или вместо него. Клетки можно окрашивать в точности так, как описано выше, и изучать с помощью флуоресцентной микроскопии. Данный способ обеспечивает визуализацию отдельных клеток, но может характеризоваться сниженной чувствительностью в зависимости от плотности антигена.

IgG антител к LY75 можно дополнительно исследовать в отношении реакционной способности к антигену LY75 с помощью вестерн-блоттинга. Вкратце, клеточные экстракты из клеток, экспрессирующих LY75, могут быть получены и подвергнуты электрофорезу в полиакриламидном геле с использованием додецилсульфата натрия. После электрофореза отделенные антигены переносят на нитроцеллюлозные мембраны, блокируют 20% мышиной сывороткой крови и зондируют моноклональными антителами, подлежащими исследованию. Связывание IgG можно выявить с помощью антитела к IgG, конъюгированного с щелочной фосфатазой, и проявить с помощью таблеток субстрата BCIP/NBT (Sigma Chem. Co., Сент-Луис, Миссури).

Способы анализа аффинности связывания, перекрестной реактивности и кинетики связывания различных антител к LY75 включают стандартные анализы, известные в данной области техники, например, анализ поверхностного плазмонного резонанса (SPR) Biacore с применением прибора для SPR Biacore 2000 (Biacore AB, Уппсала, Швеция).

В одном варианте осуществления антитело специфично связывается с LY75 человека, содержащим SEQ ID NO: 15). Предпочтительно, антитело к LY75 связывается с LY75 человека с высокой аффинностью.

Предпочтительно, антитело к LY75 связывается с белком LY75 с K_D 5х 10^-8 М или меньше, связывается с белком LY75 с KD 2х10^-8 М или меньше, связывается с белком LY75 с KD 5х10^-9 М или меньше, связывается с белком LY75 с KD 4х10^-9 М или меньше, связывается с белком LY75 с KD 3х10^-9 М или меньше, связывается с белком LY75 с KD 2х10^-9 М или меньше, связывается с белком LY75 с KD 1х10^-9 М или меньше, связывается с белком LY75 с KD 5х 10^-10 М или меньше или связывается с белком LY75 с KD 1 х 10^-10 М или меньше.

В одном варианте осуществления антитела к LY75 конкурируют (например, перекрестно конкурируют) за связывание с LY75 с конкретными антителами к LY75, описанными в данном документе (например, LY75_A1). Такие конкурирующие антитела можно идентифицировать на основании их способности к конкурентному ингибированию связывания одного или более mAb с LY75 в стандартных анализах связывания с LY75. Например, можно применять стандартные анализы ELISA, в которых рекомбинантный белок LY75 человека иммобилизован на планшете, одно из антител является флуоресцентно меченным, и оценивается способность немеченых антител к выведению меченого антитела из конкуренции за связывание. Дополнительно или в альтернативном случае можно применять анализ BIAcore для оценки способности антител к перекрестной конкуренции. Способность исследуемого антитела к ингибированию связывания антитела к LY75 по настоящему изобретению с LY75 человека демонстрирует, что исследуемое антитело может конкурировать с антителом за связывание с LY75 человека.

В одном варианте осуществления конкурирующее антитело представляет собой антитело, которое связывается с тем же эпитопом на LY75 человека, что и конкретные моноклональные антитела к LY75,

- 14 046736 описанные в данном документе (например, LY75_A1). Стандартные методики картирования эпитопов, такие как рентгеновская кристаллография и 2-мерная спектроскопия ядерного магнитного резонанса, можно применять для определения того, связывается ли антитело с тем же эпитопом, что и эталонное антитело (см., например, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)).

В одном варианте осуществления антитело, которое конкурирует за связывание с LY75 и/или связывается с тем же эпитопом на LY75 человека, представляет собой антитело человека.

После выделения одного исходного mAb к LY75, имеющего требуемые свойства, описанные в данном документе, могут быть получены другие mAb с аналогичными свойствами, например, имеющие тот же эпитоп. Например, можно иммунизировать мышей с помощью LY75, как описано в данном документе, получать гибридомы и подвергать полученные mAb скринингу с выявлением способности к конкуренции с исходным mAb за связывание с LY75. Мышей также можно иммунизировать меньшим фрагментом LY75, содержащим эпитоп, с которым связывается исходное mAb. Локализацию эпитопа можно определить путем, например, скрининга с выявлением связывания с рядом перекрывающихся пептидов, охватывающих LY75. В альтернативном случае можно применять способ из Jespers et al., Biotechnology 12:899, 1994, для управления отбором mAb, имеющих тот же эпитоп и, следовательно, аналогичные свойства по сравнению с исходным mAb. С помощью фагового дисплея вначале тяжелую цепь исходного антитела спаривают с совокупностью (предпочтительно человеческих) легких цепей для отбора mAb, связывающихся с LY75, а затем новую легкую цепь спаривают с совокупностью (предпочтительно человеческих) тяжелых цепей для отбора (предпочтительно человеческих) mAb, связывающихся с LY75, имеющих тот же эпитоп, что и исходное mAb. В альтернативном случае варианты исходного mAb можно получить путем мутагенеза кДНК, кодирующей тяжелые и легкие цепи антитела.

Для оценки уровня конкуренции между двумя антителами можно применять, например, радиоиммунологические анализы или анализы с использованием других меток для антител. Например, антиген LY75 можно инкубировать с насыщающим количеством первого антитела к LY75 или его антигенсвязывающего фрагмента, конъюгированных с соединением-меткой (например, Н, I, биотином или рубидием), в присутствии такого же количества второго немеченого антитела к LY75. Затем оценивают количество меченого антитела, связывающегося с антигеном в присутствии немеченого блокирующего антитела, и сравнивают со связыванием в отсутствие немеченого блокирующего антитела. Конкуренцию определяют по процентному изменению сигналов связывания в присутствии немеченого блокирующего антитела по сравнению с отсутствием блокирующего антитела. Таким образом, если имеет место 50% ингибирование связывания меченого антитела в присутствии блокирующего антитела по сравнению со связыванием в отсутствие блокирующего антитела, то имеет место конкуренция между двумя антителами, составляющая 50%. Таким образом, ссылка на конкуренцию между первым и вторым антителами, составляющую 50% или больше, 60% или больше, 70% или больше, как, например, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или больше, означает, что первое антитело ингибирует связывание второго антитела (или наоборот) с антигеном на 50, 60, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или больше (по сравнению со связыванием с антигеном второго антитела в отсутствие первого антитела). Таким образом, ингибирование связывания первого антитела с антигеном вторым антителом, составляющее 50, 60, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или больше, означает, что два антитела связываются с одним и тем же эпитопом.

Настоящим изобретением охватываются варианты антител, иногда также называемые производными антител или аналогами антител. Иными словами, существует ряд модификаций, которые можно производить в отношении антител, раскрытых в данном документе, включающих без ограничения аминокислотные модификации CDR (созревание аффинности), аминокислотные модификации каркасных областей, аминокислотные модификации Fc-области, варианты гликозилирования, ковалентные модификации других типов (например, для присоединения конъюгированных лекарственных средств и т.п.).

Под вариантом в данном документе подразумевается полипептидная последовательность, отличающаяся от таковой у исходного полипептида за счет по меньшей мере одной аминокислотной модификации. В этом случае исходный полипептид представляет собой вариабельную область тяжелой либо легкой цепи полной длины, например, приведенную под SEQ ID NO: 1 или 2 соответственно, или CDRобласти или каркасные области тяжелых и легких цепей, приведенные под SEQ ID NO 5-10 и 16-21 для LY75. Аминокислотные модификации могут включать замены, вставки и делеции, при этом первые во многих случаях являются предпочтительными. Будет понятно, что аминокислотная замена может представлять собой консервативную или неконсервативную замену, при этом консервативные замены являются предпочтительными. Дополнительно, указанная замена может представлять собой замену встречающейся в природе либо не встречающейся в природе аминокислотой.

В целом, варианты могут содержать любое количество модификаций, при условии, что функция антитела будет по-прежнему присутствовать, как описано в данном документе. Иными словами, в случае LY75_A1, например, антитело должно по-прежнему специфично связываться с LY75 человека. Если аминокислотные варианты получают с Fc-областью, например, то варианты антител должны сохранять функции связывания с рецепторами, необходимые для конкретного применения антитела или показания

- 15 046736 к нему.

Варианты в данном случае могут быть созданы в перечисленных последовательностях CDR, каркасной или Fc-областях антитела.

Однако, в целом обычно используют 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислотных замен, поскольку часто целью является изменение функции с минимальным количеством модификаций. В некоторых случаях имеют место от 1 до 5 модификаций (например, отдельных аминокислотных замен, вставок или делеций), при этом 1-2, 1-3 и 1-4 также находят применение во многих вариантах осуществления. Количество модификаций может зависеть от размера модифицируемой области; например, как правило, в CDRобластях требуется меньше модификаций. Специалисту в данной области будет понятно, что даже в CDR-областях местоположение модификации может значительно изменять эффект. В одном варианте осуществления модификации можно производить в любой из CDR1, CDR2 или CDR3 тяжелых и/или легких цепей. В дополнительном варианте осуществления модификации производят в любой из CDR1 или CDR2 тяжелых и/или легких цепей. В еще одном дополнительном варианте осуществления модификации расположены в CDR1 тяжелых и/или легких цепей.

Следует отметить, что ряд аминокислотных модификаций может находиться в функциональных доменах: например, может быть необходимо наличие 1-5 модификаций в Fc-области белков дикого типа или сконструированных белков, а также от 1 до 5 модификаций в Fv-области, например. Вариант полипептидной последовательности предпочтительно будет обладать по меньшей мере примерно 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичностью с исходными последовательностями (например, вариабельными областями, константными областями, и/или последовательностями тяжелой и легкой цепей, и/или CDR LY75_A1). Следует отметить, что, в зависимости от размера последовательности, процентная идентичность будет зависеть от количества аминокислот.

Под аминокислотной заменой или заменой в данном документе подразумевается замещение аминокислоты в конкретном положении исходной полипептидной последовательности другой аминокислотой, которая может быть природной или не встречающейся в природе аминокислотой. Например, замена S100A относится к варианту полипептида, в котором серин в положении 100 замещен аланином. Под аминокислотной вставкой или вставкой, используемой в данном документе, подразумевается добавление аминокислоты в конкретное положение исходной полипептидной последовательности. Под аминокислотной делецией или делецией, используемой в данном документе, подразумевается удаление аминокислоты в конкретном положении исходной полипептидной последовательности.

Под исходным полипептидом, исходным белком, полипептидом-предшественником или белком-предшественником, используемым в данном документе, подразумевается немодифицированный полипептид, который впоследствии модифицируют с получением варианта. В целом, исходным полипептидом в данном документе является LY75_A1. Соответственно, под исходным антителом, используемым в данном документе, подразумевается антитело, которое модифицируют с получением варианта антитела.

Под диким типом, или WT, или нативным в данном документе подразумевается аминокислотная последовательность или нуклеотидная последовательность, обнаруживаемая в природе, в том числе аллельные варианты. Белок, полипептид, антитело, иммуноглобулин, IgG и т.п. WT имеют аминокислотную последовательность или нуклеотидную последовательность, которая не была преднамеренно модифицирована.

Под вариантом Fc-области в данном документе подразумевается последовательность Fc, отличающаяся от последовательности Fc дикого типа за счет по меньшей мере одной аминокислотной модификации. Вариант Fc может относиться к полипептиду Fc как таковому, к композициям, содержащим вариант полипептида Fc, или к аминокислотной последовательности.

В некоторых вариантах осуществления, одна или более аминокислотных модификаций получены в одной или более CDR из LY75_A1. Как правило, в любой отдельной CDR заменяют только 1, или 2, или 3 аминокислоты, и в наборе из 6 CDR обычно производят не более 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 изменений. Однако, следует понимать, что любую комбинацию из отсутствия замен, 1, 2 или 3 замен в любой CDR можно независимо и необязательно сочетать с любой другой заменой. Будет очевидно, что замены можно производить в любой из 6 CDR. В одном варианте осуществления замены производят в CDR1 тяжелых и/или легких цепей.

В некоторых случаях аминокислотные модификации в CDR называют созреванием аффинности. Антитело, подвергнутое созреванию аффинности, имеет одно или более изменений в одной или более CDR, которые приводят к улучшению аффинности антитела к антигену по сравнению с исходным антителом, не имеющим этого(этих) изменения(изменений). В некоторых случаях, хоть и редких, может быть желательным снижение аффинности антитела к его антигену, но это обычно не является предпочтительным.

Созревание аффинности может быть выполнено для увеличения аффинности связывания антитела с антигеном на по меньшей мере приблизительно 10%, приблизительно 20%, приблизительно 30%, приблизительно 40%, приблизительно 50%, приблизительно 60%, приблизительно 70%, приблизительно 80%, приблизительно 90%, приблизительно 100%, приблизительно 110%, приблизительно 120%, прибли

- 16 046736 зительно 130%, приблизительно 140%, приблизительно 150% или больше или в 1, 2, 3, 4-5 раз по сравнению с исходным антителом. Предпочтительные антитела, подвергнутые созреванию аффинности, будут характеризоваться наномолярными или даже пикомолярными значениями аффинности к антигенумишени. Антитела, подвергнутые созреванию аффинности, получают с помощью известных процедур. См., например, Marks et al., 1992, Biotechnology 10:779-783, в котором описано созревание аффинности путем перетасовки доменов вариабельной области тяжелой цепи (VH) и вариабельной области легкой цепи (VL). Случайный мутагенез остатков CDR и/или каркасных участков описан в Barbas, et al. 1994, Proc. Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813; Shier et al., 1995, Gene 169:147-155; Yelton et al., 1995, J. Immunol. 155:1994-2004; Jackson et al., 1995, J. Immunol. 154(7):3310-9; и Hawkins et al., 1992, J. Mol. Biol. 226:889896, например.

В альтернативном случае в одной или более CDR антител по настоящему изобретению можно производить аминокислотные модификации, которые являются молчащими, например, которые незначительно изменяют аффинность антитела к антигену. Их можно производить по ряду причин, включающих оптимизацию экспрессии (которую можно выполнять для нуклеиновых кислот, кодирующих антитела по настоящему изобретению).

Таким образом, в определение CDR и антител, раскрытых в данном документе, включены варианты CDR и антител; т.е. антитела могут включать модификации аминокислот в одной или более CDR LY75_A1. В дополнение, как вкратце изложено ниже, аминокислотные модификации можно также независимо и необязательно производить в любой области за пределами CDR, в том числе в каркасных и константных областях, описанных в данном документе.

В некоторых вариантах осуществления раскрытые в данном документе антитела к LY75 состоят из варианта Fc-домена. Как известно в данной области техники, Fc-область антитела взаимодействует с рядом Fc-рецепторов и лигандов, придавая целый ряд важных функциональных способностей, называемых эффекторными функциями. Эти Fc-рецепторы включают без ограничения (у людей) FcyRI (CD64), в том числе изоформы FcYRIa, FcYRIb и FcyRIc; FcyRII (CD32), в том числе изоформы FcYRIIa (в том числе аллотипы H131 и R131), FcYRIIb (в том числе FcYRIIb-1 и FcYRIIb-2) и FcyRIIc; и FcyRIII (CD16), в том числе изоформы FcYRIIIa (в том числе аллотипы V158 и F158, связанные с антителозависимой клеточной цитотоксичностью (ADCC)) и FcYRIIIb (в том числе аллотипы FcYRIIIb-NAl и FcYRIIIb-NA2), FcRn (неонатальный рецептор), C1q (белок системы комплемента, участвующий в комплементзависимой цитотоксичности (CDC)) и FcRn (неонатальный рецептор, участвующий в регуляции периода полувыведения из сыворотки крови). Подходящие модификации можно производить в одном или более положениях, как в целом изложено, например, в заявке на патент США 11/841654 и литературных источниках, упоминаемых там, US 2004/013210, US 2005/0054832, US 2006/0024298, US 2006/0121032, US 2006/0235208, US 2007/0148170, USSN 12/341769, патенте США № 6737056, патенте США № 7670600, патенте США № 6086875, все из которых явным образом включены посредством ссылки во всей своей полноте, в частности, что касается конкретных аминокислотных замен, усиливающих связывание с Fc-рецепторами.

В дополнение к модификациям, изложенным выше, можно производить другие модификации. Например, молекулы можно стабилизировать путем включения в их состав дисульфидных мостиков, связывающих VH- и VL-домены (Reiter et al., 1996, Nature Biotech. 14:1239-1245, включенный посредством ссылки во всей своей полноте).

В дополнение, модификации цистеиновых остатков являются особенно применимыми в путях применения конъюгатов антитело-лекарственное средство (ADC), дополнительно описанных ниже. В некоторых вариантах осуществления константная область антитела может быть сконструирована содержащей один или более особенно тиол-реактивных цистеиновых остатков в целях обеспечения более специфичного и регулируемого размещения компонента-лекарственного средства. См., например, патент США № 7521541, включенный в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

В дополнение, существует ряд ковалентных модификаций антител, которые можно производить, как вкратце изложено ниже.

Ковалентные модификации антител включены в объем настоящего изобретения и обычно, но не всегда, выполняются посттрансляционно. Например, некоторые типы ковалентных модификаций антитела внедряют в молекулу посредством реакции конкретных аминокислотных остатков антитела с органическим дериватизирующим средством, способным к реакции с определенными боковыми цепями или N- или C-концевыми остатками.

Цистеинильные остатки чаще всего подвергают реакции с α-галогенацетатами (и соответствующими аминами), такими как хлоруксусная кислота или хлорацетамид, с получением карбоксиметильных или карбоксиамидометильных производных. Цистеинильные остатки также можно дериватизировать посредством реакции с бромтрифторацетоном, а-бром-в-(5-имидазолил)пропионовой кислотой, хлорацетилфосфатом, N-алкилмалеимидами, 3-нитро-2-пиридилдисульфидом, метил-2-пиридилдисульфидом, п-хлормеркуробензоатом, 2-хлормеркуро-4-нитрофенолом или хлор-7-нитробензо-2-окса-1,3-диазолом и т.п.

Гистидильные остатки дериватизируют посредством реакции с диэтилпирокарбонатом при pH 5,5

- 17 046736

7,0, поскольку данное средство является относительно специфичным к боковой цепи гистидила. Также применимым является пара-бромфенацилбромид; реакцию предпочтительно проводят в 0,1М какодилате натрия при pH 6,0.

Лизинильные и аминоконцевые остатки подвергают реакции с ангидридами янтарной или других карбоновых кислот. Дериватизация с помощью этих средств обладает эффектом изменения заряда лизинильных остатков на противоположный. Другие подходящие реагенты для дериватизации остатков, содержащих альфа-аминогруппы, включают имидоэфиры, такие как метилпиколинимидат; пиридоксальфосфат; пиридоксаль; хлорборогидрид; тринитробензолсульфоновую кислоту; O-метилизомочевину; 2,4пентандион и глиоксилат в реакции, катализируемой трансаминазой.

Аргинильные остатки модифицируют посредством реакции с одним или более традиционными реагентами, среди которых фенилглиоксаль, 2,3-бутандион, 1,2-циклогександион и нингидрин. Дериватизация аргининовых остатков требует, чтобы реакцию проводили в щелочных условиях, в связи с высокой pKa гуанидиновой функциональной группы. Кроме того, эти реагенты могут реагировать с группами лизина, а также с эпсилон-аминогруппой аргинина.

Можно производить конкретные модификации тирозильных остатков, при этом особенный интерес представляет введение спектральных меток в тирозильные остатки посредством реакции с ароматическими соединениями диазония или тетранитрометаном. Для образования O-ацетилтирозильных молекул и 3-нитропроизводных чаще всего соответственно применяют N-ацетилимидазол и тетранитрометан. Тирозильные остатки йодируют с помощью 125I или 131I с получением меченых белков для применения в радиоиммунологическом анализе, при этом способ с применением хлорамина T, описанный выше, является предпочтительным.

Карбоксильные боковые группы (аспартил или глутамил) избирательно модифицируют посредством реакции с карбодиимидами (R'--N=C=N--R'), где R и R' необязательно представляют собой различные алкильные группы, такие как 1-циклогексил-3-(2-морфолинил-4-этил)карбодиимид или 1-этил-3-(4азоний-4,4-диметилпентил)карбодиимид. Кроме того, аспартильные и глутамильные остатки превращают в аспарагинильные и глутаминильные остатки посредством реакции с ионами аммония.

Дериватизация с помощью бифункциональных средств применима для сшивания антител с нерастворимой в воде матрицей-подложкой или поверхностью для применения в ряде способов в дополнение к способам, описанным ниже. Широко используемые сшивающие средства включают, например, 1,1бис(диазоацетил)-2-фенилэтан, глутаровый альдегид, N-гидроксисукцинимидные сложные эфиры, например, сложные эфиры 4-азидосалициловой кислоты, гомобифункциональные имидоэфиры, в том числе дисукцинимидиловые сложные эфиры, такие как 3,3'-дитиобис(сукцинимидилпропионат), и бифункциональные малеимиды, такие как бис-Ы-малеимидо-1,8-октан. Дериватизирующие средства, такие как метил-3-[(п-азидофенил)дитио]пропиоимидат, обеспечивают получение фотоактивируемых промежуточных соединений, способных образовывать поперечные связи в присутствии света. В альтернативном случае для иммобилизации белков используют реакционноспособные нерастворимые в воде матрицы, такие как активированные бромистым цианогеном углеводы и реакционноспособные субстраты, описанные в патентах США №№ 3969287; 3691016; 4195128; 4247642; 4229537 и 4330440, все из которых включены посредством ссылки во всей своей полноте.

Глутаминильные и аспарагинильные остатки часто дезамидируют с получением соответствующих глутамильных и аспартильных остатков соответственно. В альтернативном случае эти остатки дезамидируют в слабокислых условиях. Любая форма этих остатков находится в пределах объема настоящего изобретения.

Другие модификации включают гидроксилирование пролина и лизина, фосфорилирование гидроксильных групп серильных или треонильных остатков, метилирование α-аминогрупп боковых цепей лизина, аргинина и гистидина (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 [1983], включенный посредством ссылки во всей своей полноте), ацетилирование N-концевой аминогруппы и амидирование любой C-концевой карбоксильной группы.

В дополнение, как будет понятно специалистам в данной области, к антителам (а также к другим композициям по настоящему изобретению) можно добавлять любые метки (в том числе флуоресцентные, ферментные, магнитные, радиоактивные и т.п.).

Другим типом ковалентной модификации являются изменения гликозилирования. В некоторых вариантах осуществления антитела, раскрытые в данном документе, могут быть полностью или частично агликозилированными, например, афукозилированными.

Другой тип ковалентной модификации антитела включает связывание антитела с различными небелковыми полимерами, в том числе без ограничения с различными полиолами, такими как полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль или полиоксиалкилены, согласно изложенному в, например, каталоге PEG 2005-2006 от Nektar Therapeutics (доступном на веб-сайте Nektar), патентах США 4640835; 4496689; 4301144; 4670417; 4791192 или 4179337, все из которых включены посредством ссылки во всей своей полноте. В дополнение, как известно из уровня техники, аминокислотные замены можно производить в различных положениях в антителе для облегчения добавления полимеров, таких как PEG. См., например, публикацию заявки на патент США № 2005/0114037A1, включенную посредством ссылки во всей своей

- 18 046736 полноте.

В дополнительных вариантах осуществления антитела могут содержать метку. Под меченым в данном документе подразумевается, что соединение имеет по меньшей мере один элемент, изотоп или химическое соединение, присоединенные для обеспечения выявления соединения. Как правило, метки подразделяются на три класса: a) изотопные метки, которые могут представлять собой радиоактивные или тяжелые изотопы; b) магнитные, электрические, температурные метки и c) цветные или люминесцентные красители; хотя метки также включают ферменты и частицы, такие как магнитные частицы. Предпочтительные метки включают без ограничения флуоресцентные комплексы лантаноидов (в том числе европия и тербия) и флуоресцентные метки, включающие без ограничения квантовые точки, флуоресцеин, родамин, тетраметилродамин, эозин, эритрозин, кумарин, метилкумарины, пирен, малахитовый зеленый, стильбен, люциферовый желтый, Cascade синий, техасский красный, красители Alexa, циановые красители и другие, описанные в 6-м издании Molecular Probes Handbook под редакцией Richard P. Haugland, явным образом включенном в данный документ посредством ссылки.

Конъюгаты антитело-лекарственное средство.

В некоторых вариантах осуществления антитела к LY75, раскрытые в данном документе, конъюгируют с лекарственными средствами с образованием конъюгатов антитело-лекарственное средство (ADC). Как правило, ADC применяют в путях применения в онкологии, где применение конъюгатов антителолекарственное средство для локальной доставки цитотоксических или цитостатических средств обеспечивает целенаправленную доставку функциональной части, представляющей собой лекарственное средство, в опухоли, что может обеспечить более высокую эффективность, более низкую токсичность и т.п. Обзор данной технологии приведен в Ducry et al., Bioconjugate Chem., 21:5-13 (2010), Carter et al., Cancer J. 14(3): 154 (2008) и Senter, Current Opin. Chem. Biol. 13:235-244 (2009), все из которых включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

Таким образом, в настоящем изобретении представлены фармацевтические комбинации, содержащие, помимо прочего, антитела к LY75, конъюгированные с лекарственными средствами. Как правило, конъюгирование выполняется путем ковалентного присоединения к антителу, как подробно описано ниже, и обычно основано на применении линкера, часто пептидной связи (которая, как описана ниже, может быть предусмотрена чувствительной или нечувствительной к расщеплению протеазами в целевом участке). В дополнение, как описано выше, связывание структурной единицы линкер-лекарственное средство (LU-D) можно выполнить путем присоединения к цистеиновым остаткам в антителе. Как будет понятно специалистам в данной области, количество функциональных частей, представляющих собой лекарственные средства, на антитело может изменяться в зависимости от условий реакции, и соотношение лекарственное средство:антитело может варьироваться от 1:1 до 10:1. Как будет понятно специалистам в данной области, фактическое количество является средним значением.

Таким образом, антитела к LY75 могут быть конъюгированными с лекарственными средствами. Как описано ниже, лекарственное средство ADC может представлять собой любое количество средств, включающих без ограничения представленные цитотоксические средства, такие как химиотерапевтические средства, ингибиторы роста, токсины (например, ферментативно активные токсины бактериального, грибного, растительного или животного происхождения или их фрагменты), или радиоактивные изотопы (иными словами, в радиоконъюгате). В других вариантах осуществления в настоящем изобретении дополнительно представлены способы применения ADC.

Лекарственные средства для применения в настоящем изобретении включают цитотоксические лекарственные средства, в частности, применяемые для терапии рака. Такие лекарственные средства включают, как правило, средства, повреждающие ДНК, антиметаболиты, натуральные продукты и их аналоги. Иллюстративные классы цитотоксических средств включают ингибиторы ферментов, такие как ингибиторы дигидрофолатредуктазы и ингибиторы тимидилатсинтазы, ДНК-интеркаляторы, средства, расщепляющие ДНК, ингибиторы топоизомеразы, лекарственные средства семейства антрациклинов, лекарственные средства из барвинка, митомицины, блеомицины, цитотоксические нуклеозиды, лекарственные средства семейства птеридинов, диинены, подофиллотоксины, доластатины, майтанзиноиды, индукторы дифференцировки и таксолы.

Представители этих классов включают, например, таксол, метотрексат, метоптерин, дихлорметотрексат, 5-фторурацил, 6-меркаптопурин, арабинозид цитозина, мелфалан, лейрозин, лейросидеин, актиномицин, даунорубицин, доксорубицин, митомицин С, митомицин A, карминомицин, аминоптерин, таллизомицин, подофиллотоксин и производные подофиллотоксина, такие как этопозид или фосфат этопозида, винбластин, винкристин, виндезин, таксаны, в том числе таксол, таксотер, ретиноевую кислоту, масляную кислоту, Ж-ацетилспермидин. камптотецин, калихеамицин, эсперамицин, ендиины, дуокармицин A, дуокармицин SA, калихеамицин, камптотецин, гемиастерлины, майтанзиноиды (в том числе DM1), монометилауристатин E (MMAE), монометилауристатин F (MMAF) и майтанзиноиды (DM4) и их аналоги.

Токсины могут применяться в составе конъюгатов антитело-токсин и включают бактериальные токсины, такие как дифтерийный токсин, растительные токсины, такие как рицин, низкомолекулярные токсины, такие как гелданамицин (Mandler et al (2000) J. Nat. Cancer Inst. 92(19): 1573-1581; Mandler et al

- 19 046736 (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028; Mandler et al (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791), майтанзиноиды (EP 1391213; Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623) и калихеамицин (Lode et al (1998) Cancer Res. 58:2928; Hinman et al (1993) Cancer Res. 53:3336-3342), гемиастерлины (WO2004/026293; Zask et al., (2004) J. Med. Chem, 47: 4774-4786). Токсины могут оказывать свои цитотоксические и цитостатические эффекты с помощью механизмов, включающих связывание тубулина, связывание ДНК или ингибирование топоизомеразы.

Также можно применять конъюгаты антитела к LY75 и одного или более низкомолекулярных токсинов, таких как майтанзиноиды, доластатины, ауристатины, трихотецин, калихеамицин, дуокармицины, пирролбензодиазепины и CC1065, и производные этих токсинов, обладающие активностью токсинов.

Антитело к LY75 предпочтительно конъюгировано с DM1 или DM4, наиболее предпочтительно с DM4. Соединения майтанзина, подходящие для применения в качестве майтанзиноидных функциональных частей, представляющих собой лекарственные средства, хорошо известны в данной области техники и могут быть выделены из естественных источников в соответствии с известными способами, быть получены с помощью методик генной инженерии (см. Yu et al (2002) PNAS 99:7968-7973) или представлять собой майтанзинол и аналоги майтанзинола, получаемые синтетически в соответствии с известными способами. Как описано ниже, лекарственные средства можно модифицировать путем включения в их состав функционально активной группы, такой как тиольная группа или аминогруппа, для конъюгирования с антителом.

Иллюстративные майтанзиноидные функциональные части, представляющие собой лекарственные средства, включают компоненты, которые имеют модифицированное ароматическое кольцо, такие как C19-дехлорпроизводные (патент США № 4256746) (получаемые посредством восстановления ансамитоцина P2 алюмогидридом лития); C-20-гидрокси- (или C-20-деметил-) +/-C-19-дехлорпроизводные (патенты США №№ 4361650 и 4307016) (получаемые путем деметилирования с помощью Streptomyces или Actinomyces или дехлорирования с помощью LAH) и C-20-деметокси, C-20-ацилокси (--OCOR), +/дехлорпроизводные (патент США № 4294757) (получаемые путем ацилирования с помощью хлорангидридов), а также компоненты, которые имеют модификации в других положениях.

Иллюстративные майтанзиноидные функциональные части, представляющие собой лекарственные средства, также включают компоненты, которые имеют такие модификации, как C-9-SH (патент США № 4424219) (получаемые посредством реакции майтанзинола с H2S или P2S5); C-14алкоксиметил(деметокси/CH₂OR) (патент США № 4331598); C-14-гидроксиметил или ацилоксиметил (CH2OH или CH₂OAc) (патент США № 4450254) (получаемые из Nocardia); C-15-гидрокси/ацилокси (патент США № 4364866) (получаемые путем превращения майтанзинола под действием Streptomyces); C15-метокси (патенты США №№ 4313946 и 4315929) (выделяемые из Trewia nudlflora); C-18-N-деметил (патенты США №№ 4362663 и 4322348) (получаемые путем деметилирования майтанзинола под действием Streptomyces) и 4,5-дезокси (патент США № 4371533) (получаемые путем восстановления майтанзинола трихлоридом титана/LAH).

Особенную применимость имеют DM1 (раскрытый в патенте США № 5208020, включенном посредством ссылки) и DM4 (раскрытый в патенте США № 7276497, включенном посредством ссылки). См. также ряд дополнительных майтанзиноидных производных и способов в 5416064, WO/01/24763, 7303749, 7601354, USSN 12/631508, WO02/098883, 6441163, 7368565, WO02/16368 и WO04/1033272, все из которых явным образом включены посредством ссылки во всей своей полноте.

ADC, содержащие майтанзиноиды, способы их получения и их терапевтическое применение раскрыты, например, в патентах США №№ 5208020; 5416064; 6441163 и европейском патенте EP 0425235 B1, раскрытия которых явным образом включены в данный документ посредством ссылки. В Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996), описаны ADC, содержащие майтанзиноид, обозначенный как DM1, связанный с моноклональным антителом C242, направленным против рака ободочной и прямой кишки человека. Было обнаружено, что конъюгат является весьма цитотоксическим в отношении культивируемых раковых клеток толстой кишки и демонстрирует противоопухолевую активность в анализе роста опухоли in vivo.

В Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992) описаны ADC, в которых майтанзиноид был конъюгирован с помощью дисульфидного линкера с антителом мыши A7, связывающимся с антигеном в линиях раковых клеток толстой кишки человека, или с другим моноклональным антителом мыши TA.1, которое связывается с онкогеном HER-2/neu. Цитотоксичность конъюгата TA.1-майтанзиноид исследовали in vitro в линии раковых клеток молочной железы человека SK-BR-3, в которой экспрессируется 3х10⁵ поверхностных антигенов HER-2 на клетку. Конъюгированное лекарственное средство достигало степени цитотоксичности, сходной с таковой у свободного майтанзиноидного лекарственного средства, которую можно повысить путем увеличения количества молекул майтанзиноидов на молекулу антитела. Конъюгат A7-майтанзиноид демонстрировал низкую системную цитотоксичность у мышей.

Для композиций, содержащих множество антител, нагрузка лекарственным средством представлена в виде p, среднего количества молекул лекарственного средства на антитело. Нагрузка лекарственным средством может варьироваться в диапазоне от 1 до 20 молекул лекарственного средства (D) на антитело. Среднее количество молекул лекарственного средства на антитело в препарате, полученном посредством

- 20 046736 реакций конъюгирования, можно охарактеризовать с помощью традиционных способов, таких как массспектроскопия, анализ ELISA и HPLC. Также можно определить количественное распределение конъюгатов антитело-лекарственное средство по p.

В некоторых случаях отделение, очистку однородных конъюгатов антитело-лекарственное средство, где p представляет собой определенное значение, от конъюгатов антитело-лекарственное средство с другой нагрузкой лекарственным средством и установление их характеристик можно осуществлять с помощью таких способов, как обращенно-фазовая HPLC или электрофорез. В иллюстративных вариантах осуществления p равно 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 или является их дробью.

Получение соединений-конъюгатов антитело-лекарственное средство можно осуществлять согласно любой методике, известной специалисту в данной области. Вкратце, соединения-конъюгаты антителолекарственное средство могут содержать антитело к LY75 в качестве структурной единицы-антитела, лекарственное средство и необязательно линкер, который соединяет лекарственное средство и связывающее средство.

Множество различных реакций доступно для ковалентного присоединения лекарственных средств и/или линкеров к связывающим средствам. Это можно осуществить посредством реакции с аминокислотными остатками связывающего средства, например, молекулы антитела, включающими аминогруппы лизина, свободные группы карбоновой кислоты глутаминовой и аспарагиновой кислот, сульфгидрильные группы цистеина и различные функциональные части ароматических аминокислот. Широко применяемым неспецифическим способом ковалентного присоединения является карбодиимидная реакция связывания карбоксильной (или амино-) группы соединения с амино- (или карбоксильными) группами антитела. Дополнительно, бифункциональные средства, такие как диальдегиды или имидоэфиры, применялись для связывания аминогруппы соединения с аминогруппами молекулы антитела.

Также для присоединения лекарственных средств к связывающим средствам доступна реакция образования основания Шиффа. Данный способ включает окисление периодатом лекарственного средства, содержащего гликолевые группы или гидроксигруппы, с образованием, таким образом, альдегида, который затем подвергают реакции со связывающим средством. Присоединение происходит посредством образования основания Шиффа с аминогруппами связывающего средства. Изотиоцианаты также можно применять в качестве средств сочетания для ковалентного присоединения лекарственных средств к связывающим средствам. Другие методики известны специалисту в данной области и находятся в пределах объема настоящего изобретения.

В некоторых вариантах осуществления промежуточное соединение, представляющее собой предшественник линкера, подвергают реакции с лекарственным средством в соответствующих условиях. В других вариантах осуществления применяют реакционноспособные группы в лекарственном средстве и/или промежуточном соединении. Продукт реакции между лекарственным средством и промежуточным соединением, или дериватизированное лекарственное средство, затем подвергают реакции с антителом к LY75 по настоящему изобретению в соответствующих условиях.

Будет понятно, что в требуемом соединении также можно производить химические модификации, чтобы сделать реакции этого соединения более пригодными для целей получения конъюгатов по настоящему изобретению. Например, функциональную группу, например, аминогруппу, гидроксильную или сульфгидрильную группу, можно присоединить к лекарственному средству в положении, оказывающем минимальный или допустимый эффект на активность или другие свойства лекарственного средства.

Как правило, конъюгаты соединений антитело-лекарственное средство содержат линкерную единицу между единицей лекарственного средства и единицей антитела. В некоторых вариантах осуществления линкер расщепляется во внутриклеточных или внеклеточных условиях, так что при расщеплении линкера из антитела высвобождается структурная единица-лекарственное средство в соответствующую среду. Например, солидные опухоли, секретирующие определенные протеазы, могут служить в качестве целевых для расщепляемого линкера; в других вариантах осуществления используются именно внутриклеточные протеазы. В еще нескольких других вариантах осуществления линкерная структурная единица не является расщепляемой, и лекарственное средство высвобождается, например, посредством разрушения антител в лизосомах.

В некоторых вариантах осуществления линкер расщепляется с помощью расщепляющего средства, присутствующего во внутриклеточной среде (например, в лизосоме или эндосоме или в кавеоле). Линкер может представлять собой, например, пептидильный линкер, расщепляемый под действием внутриклеточного фермента пептидазы или протеазы, в том числе без ограничения лизосомальной или эндосомальной протеазы. В некоторых вариантах осуществления пептидильный линкер имеет длину по меньшей мере две аминокислоты или имеет длину по меньшей мере три аминокислоты или больше.

Расщепляющие средства могут включать без ограничения катепсины B и D и плазмин, обо всех из которых известно, что они гидролизуют дипептидные производные лекарственных средств, что приводит к высвобождению активного лекарственного средства внутрь клеток-мишеней (см., например, Dubowchik and Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123). Пептидильные линкеры могут расщепляться ферментами, которые присутствуют в клетках, экспрессирующих LY75. Например, можно применять пепти

- 21 046736 дильный линкер, расщепляемый тиол-зависимой протеазой катепсином В, характеризующейся высоким уровнем экспрессии в раковой ткани (например, линкер Phe-Leu или Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO: 46)). Другие примеры таких линкеров описаны, например, в патенте США № 6214345, включенном в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте и во всех отношениях.

В некоторых вариантах осуществления пептидильный линкер, расщепляемый внутриклеточной протеазой, представляет собой линкер Val-Cit или линкер Phe-Lys (см., например, патент США № 6214345, в котором описан синтез доксорубицина с помощью линкера Val-Cit).

В других вариантах осуществления расщепляемый линкер является pH-чувствительным, иными словами, чувствительным к гидролизу при определенных значениях pH. Как правило, pHчувствительный линкер является гидролизуемым при кислотных условиях. Например, можно применять кислотонеустойчивый линкер, гидролизуемый в лизосоме (например, гидразон, семикарбазон, тиосемикарбазон, амид цис-аконитовой кислоты, ортоэфир, ацеталь, кеталь и т.п.). (См., например, патенты США №№ 5122368; 5824805; 5622929; Dubowchik and Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123; Neville et al., 1989, Biol. Chem. 264:14653-14661). Такие линкеры являются относительно стабильными в условиях нейтрального pH, как, например, в крови, но являются нестабильными при pH ниже 5,5 или 5,0, приблизительном pH в лизосоме. В определенных вариантах осуществления гидролизуемый линкер представляет собой тиоэфирный линкер (такой как, например, тиоэфир, присоединенный к терапевтическому средству с помощью ацилгидразоновой связи (см., например, патент США № 5622929)).

В еще нескольких других вариантах осуществления линкер расщепляется в восстанавливающих условиях (например, дисульфидный линкер). Из уровня техники известен ряд дисульфидных линкеров, в том числе, например, те, которые могут образовываться с применением SATA Щ-сукцинимидил-5ацетилтиоацетата), SPDP Щ-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионата), SPDB Щ-сукцинимидил-3(2-пиридилдитио)бутирата) и SMPT Щ-сукцинимидилоксикарбонил-альфа-метил-альфа-(2пиридилдитио)толуола)-, SPDB и SMPT. (См., например, Thorpe et al., 1987, Cancer Res. 47:5924-5931; Wawrzynczak et al., в Immunoconjugates: Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer (C. W. Vogel ed., Oxford U. Press, 1987). См. также патент США № 4880935).

В других вариантах осуществления линкер представляет собой малонатный линкер (Johnson et al., 1995, Anticancer Res. 15:1387-93), малеимидобензоильный линкер (Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10): 1299-1304) или 3'-Ы-амидный аналог (Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10): 1305-12).

В еще нескольких других вариантах осуществления линкерная структурная единица не является расщепляемой, и лекарственное средство высвобождается посредством разрушения антител. (См. публикацию заявки на патент США № 2005/0238649, включенную в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте и во всех отношениях).

Во многих вариантах осуществления линкер является саморасщепляющимся. Используемый в данном документе термин саморасщепляющийся спейсер относится к бифункциональной химической функциональной части, способной к ковалентному соединению двух разнесенных химических функциональных частей в стабильную молекулу из трех частей. Она будет самопроизвольно отделяться от второй химической функциональной части при расщеплении его связи с первым компонентом. См., например, WO 2007/059404A2, WO06/110476A2, WO05/112919A2, WO2010/062171, WO09/017394, WO07/089149, WO07/018431, WO04/043493 и WO02/083180, которые относятся к конъюгатам лекарственное средстворасщепляемый субстрат, где лекарственное средство и расщепляемый субстрат необязательно связаны с помощью саморасщепляющегося линкера, и все из которых явным образом включены посредством ссылки.

Линкер часто является практически нечувствительным к действию внеклеточной среды. Как используется в данном документе, практически нечувствительный к действию внеклеточной среды применительно к линкеру означает, что в образце соединения-конъюгата антитело-лекарственное средство расщепляется не более чем приблизительно 20, 15, 10, 5, 3% или не более чем приблизительно 1% линкеров, если соединение-конъюгат антитело-лекарственное средство присутствует во внеклеточной среде (например, в плазме крови).

То, является ли линкер практически нечувствительным к действию внеклеточной среды, можно определить, например, путем инкубирования соединения-конъюгата антитело-лекарственное средство с плазмой крови в течение предварительно определенного периода времени (например, 2, 4, 8, 16 или 24 часов) и последующей количественной оценки количества свободного лекарственного средства, присутствующего в плазме крови.

В других невзаимоисключающих вариантах осуществления линкер способствует клеточной интернализации. В определенных вариантах осуществления линкер способствует клеточной интернализации, будучи конъюгированным с терапевтическим средством (иными словами, в среде функциональной части линкер-терапевтическое средство соединения-конъюгата антитело-лекарственное средство, описанного в данном документе). В еще нескольких вариантах осуществления линкер способствует клеточной интернализации, будучи конъюгированным как с ауристатиновым соединением, так и с антителами к LY75 по настоящему изобретению.

Ряд иллюстративных линкеров, которые можно применять в композициях и способах по настояще

- 22 046736 му изобретению, описан в WO 2004/010957, публикации заявки на патент США № 2006/0074008, публикации заявки на патент США № 20050238649 и публикации заявки на патент США № 2006/0024317 (каждая из которых включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте и во всех отношениях). Предпочтительно, линкер представляет собой SPDB (№сукцинимидил-3-(2пиридилдитио)бутират).

Нагрузка лекарственным средством представлена в виде p и является средним количеством функциональных частей, представляющих собой лекарственные средства, на антитело в молекуле. Нагрузка лекарственным средством (p) может составлять 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или больше функциональных частей (D) на антитело, хотя часто среднее количество является дробным числом или десятичной дробью. Обычно нагрузка лекарственным средством от 1 до 4 является часто применяемой, и от 1 до 2 также является применяемой. ADC по настоящему изобретению включают группы антител, конъюгированных с рядом компонентов-лекарственных средств в количестве от 1 до 20, например, 1-15, 1-10, 2-9, 3-8, 4-7, 5-6. Среднее количество функциональных частей, представляющих собой лекарственные средства, на антитело в препаратах ADC, полученных в результате реакций конъюгирования, можно охарактеризовать с помощью традиционных способов, таких как масс-спектроскопия и анализ ELISA.

Также можно определить количественное распределение ADC по p. В некоторых случаях отделение, очистка однородных ADC, где p представляет собой определенное значение, от ADC с другой нагрузкой лекарственным средством и установление их характеристик можно осуществлять с помощью таких способов, как электрофорез.

Для некоторых конъюгатов антитело-лекарственное средство p может быть ограничено количеством участков присоединения в антителе. Например, если присоединение происходит по тиольной группе цистеина, как в вышеописанных иллюстративных вариантах осуществления, антитело может иметь только одну или несколько тиольных групп цистеина или может иметь только одну или более достаточно реакционноспособных тиольных групп, посредством которых может быть присоединен линкер. В определенных вариантах осуществления более высокая нагрузка лекарственным средством, например, p > 5, может вызывать агрегацию, нерастворимость, токсичность определенных конъюгатов антителолекарственное средство или утрату клеточной проницаемости для них. В определенных вариантах осуществления нагрузка лекарственным средством для ADC по настоящему изобретению варьируется в диапазоне от 1 до приблизительно 8; от приблизительно 2 до приблизительно 6; от приблизительно 3 до приблизительно 5; от приблизительно 3 до приблизительно 4; от приблизительно 3,1 до приблизительно 3,9; от приблизительно 3,2 до приблизительно 3,8; от приблизительно 3,2 до приблизительно 3,7; от приблизительно 3,2 до приблизительно 3,6; от приблизительно 3,3 до приблизительно 3,8 или от приблизительно 3,3 до приблизительно 3,7. В действительности было показано, что для определенных ADC оптимальный показатель количества функциональных частей, представляющих собой лекарственные средства, на антитело может составлять менее 8 и может составлять от приблизительно 2 до приблизительно 5. См. US 2005/0238649 A1 (включенный в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте).

В некоторых вариантах осуществления менее чем теоретический максимум фрагментов лекарственных средств сопряжен с антителом во время реакции конъюгации. Антитело может содержать, например, лизиновые остатки, не реагирующие с промежуточным соединением лекарственное средстволинкер или линкерным реагентом, как обсуждается ниже. Антитела обычно содержат немного свободных и реакционноспособных тиольных групп цистеина, которые могут быть связаны с компонентомлекарственным средством; в действительности большинство тиольных групп цистеиновых остатков в антителах существуют в качестве дисульфидных мостиков. В определенных вариантах осуществления антитело можно восстановить с помощью восстановителя, такого как дитиотреитол (DTT) или трикарбонилэтилфосфин (TCEP), в условиях частичного или полного восстановления с образованием реакционноспособных тиольных групп цистеина. В определенных вариантах осуществления антитело подвергают воздействию денатурирующих условий с выявлением реакционноспособных нуклеофильных групп, таких как в лизине или цистеине.

Нагрузку (соотношение лекарственное средство/антитело) в ADC можно регулировать различными способами, например, путем: (i) ограничения молярного избытка промежуточного соединения лекарственное средство-линкер или линкерного реагента по сравнению с антителом, (ii) ограничения продолжительности или температуры реакции конъюгирования, (iii) применения условий частичного или ограниченного восстановления для модификации тиольных групп цистеина, (iv) конструирования с помощью рекомбинантных методик аминокислотной последовательности антитела таким образом, чтобы модифицировать количество и положение цистеиновых остатков для регулирования количества и/или положения присоединяемых компонентов линкер-лекарственное средство (как, например, в случае тио-Mab или тио-Fab, получаемых согласно раскрытому в данном документе и в WO2006/034488 (включенной в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте)).

Следует понимать, что если более чем одна нуклеофильная группа в ступает в реакцию с промежуточным соединением лекарственное средство-линкер или линкерным реагентом, за которым следует реагент фрагмента лекарственного средства, то полученный продукт представляет собой смесь соединений

- 23 046736

ADC с распределением одного или более фрагментов лекарственных средств, прикрепленных к антителу. В смеси можно рассчитать среднее количество лекарственных средств на антитело с помощью двойного анализа антител ELISA, специфичного для антитела и специфичного для лекарственного средства. Отдельные молекулы ADC можно идентифицировать в смеси с помощью масс-спектроскопии и разделить с помощью HPLC, например, хроматографии гидрофобных взаимодействий.

В некоторых вариантах осуществления однородный ADC с единственным значением нагрузки можно выделить из смеси конъюгатов с помощью электрофореза или хроматографии.

Способы определения цитотоксического эффекта ADC.

Известны способы определения того, вызывает ли лекарственное средство или конъюгат антителолекарственное средство цитостатический и/или цитотоксический эффект в отношении клетки. Как правило, цитотоксическую или цитостатическую активность конъюгата антитело-лекарственное средство можно измерить путем воздействия на клетки млекопитающих, экспрессирующих белок-мишень, конъюгата антитело-лекарственное средство в среде для культуры клеток; культивирования клеток в течение периода от приблизительно 6 часов до приблизительно 5 дней и измерения жизнеспособности клеток. Клеточные анализы in vitro можно применять для измерения жизнеспособности (пролиферации), цитотоксичности и индукции апоптоза (активации каспаз) конъюгатом антитело-лекарственное средство.

Для определения того, вызывает ли конъюгат антитело-лекарственное средство цитостатический эффект, можно применять анализ включения тимидина. Например, раковые клетки, экспрессирующие антиген-мишень при плотности 5000 клеток/лунка в 96-луночных планшетах, можно культивировать в течение периода 72 ч и подвергать воздействию 0,5 мкКи ³И-тимидина в течение последних 8 ч 72часового периода. Включение ³И-тимидина в клетки культуры измеряют в присутствии и в отсутствие конъюгата антитело-лекарственное средство.

Для определения цитотоксичности можно измерять некроз или апоптоз (запрограммированную гибель клеток). Некроз обычно сопровождается повышением проницаемости плазматической мембраны; отеком клетки и разрывом плазматической мембраны. Апоптоз обычно характеризуется пузырением мембраны, конденсацией цитоплазмы и активацией эндогенных эндонуклеаз. Определение любого из этих эффектов в отношении раковых клеток указывает на то, что конъюгат антитело-лекарственное средство является применимым в лечении форм рака.

Жизнеспособность клеток можно измерить путем определения в клетке поглощения красителя, такого как нейтральный красный, трипановый синий или ALAMAR™ синий (см., например, Page et al., 1993, Intl. J. Oncology 3:473-476). В таком анализе клетки инкубируют в среде, содержащей краситель, клетки промывают, и оставшийся краситель, отражающий поглощение клетками красителя, измеряют спектрофотометрически. Связывающийся с белками краситель сульфородамин B (SRB) также можно применять для измерения цитотоксичности (Skehan et al., 1990, J. Natl. Cancer Inst. 82:1107-12).

В альтернативном случае соль тетразолия, такую как MTT, применяют в количественном колориметрическом анализе выживания и пролиферации клеток млекопитающих путем определения живых, но не мертвых, клеток (см., например, Mosmann, 1983, J. Immunol. Methods 65:55-63).

Апоптоз можно оценить количественно путем измерения, например, фрагментации ДНК. Доступны коммерческие фотометрические способы количественного определения фрагментации ДНК in vitro. Примеры таких анализов, в том числе TUNEL (в котором выявляют включение меченых нуклеотидов во фрагментированную ДНК) и анализы на основе ELISA, описаны в Biochemica, 1999, по. 2, pp. 34-37 (Roche Molecular Biochemicals).

Апоптоз также можно определить путем измерения морфологических изменений в клетке. Например, как и в случае некроза, утрату целостности плазматической мембраны можно определить путем измерения поглощения определенных красителей (например, флуоресцентного красителя, такого как, например, акридиновый оранжевый или бромид этидия). Способ измерения количества апоптозных клеток был описан в Duke and Cohen, Current Protocols in Immunology (Coligan et al. eds., 1992, pp. 3.17.1-3.17.16). Также можно метить клетки красителем для ДНК (например, акридиновым оранжевым, бромидом этидия или йодидом пропидия) и наблюдать в клетках конденсацию хроматина и его краевое расположение вдоль внутренней ядерной мембраны. Другие морфологические изменения, которые можно измерить для определения апоптоза, включают, например, конденсацию цитоплазмы, повышенное пузырение мембраны и сжатие клетки.

Наличие апоптозных клеток можно измерить как в закрепленном, так и в плавающем компартментах культур. Например, оба компартмента можно собрать путем удаления надосадочной жидкости, трипсинизации закрепленных клеток, объединения препаратов после этапа промывки путем центрифугирования (например, в течение 10 мин при 2000 об/мин) и выявления апоптоза (например, путем измерения фрагментации ДНК). (См., например, Piazza et al., 1995, Cancer Research 55:3110-16).

Эффект терапевтической композиции антитела к LY75 по настоящему изобретению in vivo можно оценить в подходящей животной модели. Например, можно применять ксеногенные модели рака, где эксплантаты раковых опухолей или пассированные ксенотрансплантатные ткани вводят животным с ослабленным иммунитетом, таким как голые или имеющие SCID мыши (Klein et al., 1997, Nature Medicine 3: 402-408). Эффективность можно измерять с помощью анализов, в которых измеряют ингибирова

- 24 046736 ние образования опухоли, регрессии опухоли или метастазирования и т.п.

Терапевтические композиции, применяемые в практическом осуществлении вышеописанных способов, можно составлять в фармацевтические композиции, содержащие носитель, подходящий для требуемого способа доставки. Подходящие носители включают любой материал, который при объединении с терапевтической композицией сохраняет противоопухолевую функцию терапевтической композиции и на который обычно не реагирует иммунная система пациента. Примеры включают без ограничения любой из множества стандартных фармацевтических носителей, таких как стерильные фосфатно-солевые буферные растворы, бактериостатическая вода и т.п. (см. в общем плане Remington's Pharmaceutical Sciences 16^th Edition, A. Osal., Ed., 1980).

Способы получения антител.

Антитела, раскрытые в данном документе, могут быть получены с помощью любого подходящего способа. Такие способы включают культивирование клетки-хозяина, содержащей выделенную(-ые) нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), кодирующие антитела. Как будет понятно специалистам в данной области, это можно выполнять рядом способов в зависимости от природы антитела. В случае, когда антитела представляют собой традиционные антитела полной длины, например, вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи находятся в таких условиях, что антитело образуется и может быть выделено.

Вариабельные области тяжелых и легких цепей LY75_A1 раскрыты в данном документе (последовательности как белка, так и нуклеиновой кислоты); как будет понятно в данной области, их можно легко увеличить с получением тяжелых и легких цепей полной длины. Иными словами, при наличии фрагментов ДНК, кодирующих VH-и VK-сегменты, вкратце описанные в данном документе, эти фрагменты ДНК можно подвергнуть дополнительным манипуляциям с помощью стандартных методик рекомбинантных ДНК, например, для превращения генов вариабельных областей в гены цепей антител полной длины, в гены Fab-фрагментов или в ген scFv. В ходе этих манипуляций образуют функциональную связь фрагмента ДНК, кодирующего V_K или VH, с другим фрагментом ДНК, кодирующим другой белок, такой как константная область антитела или гибкий линкер. Термин функционально связанный, применяемый в данном контексте, подразумевается как означающий, что два фрагменты ДНК соединены таким образом, что аминокислотные последовательности, кодируемые двумя фрагментами ДНК, остаются внутри рамки считывания.

Выделенную ДНК, кодирующую VH-область, можно превратить в ген тяжелой цепи полной длины путем образования функциональной связи ДНК, кодирующей V_H, с другой молекулой ДНК, кодирующей константные области тяжелой цепи (C_H1, CH2 и CH3). Последовательности генов мышиных константных областей тяжелых цепей известны из уровня техники [см., например, Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, US Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242], и фрагменты ДНК, охватывающие эти области, можно получить путем стандартной ПЦР-амплификации. Константная область тяжелой цепи может представлять собой константную область IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM или IgD, но наиболее предпочтительно представляет собой константную область IgG1 или IgG4. В случае гена тяжелой цепи Fab-фрагмента можно образовать функциональную связь ДНК, кодирующей V_H, с другой молекулой ДНК, кодирующей только константную область C_H1 тяжелой цепи.

Выделенную ДНК, кодирующую VL/VK-область, можно превратить в ген легкой цепи полной длины (а также ген легкой цепи Fab) путем образования функциональной связи ДНК, кодирующей VL, с другой молекулой ДНК, кодирующей константную область легкой цепи CL. Последовательности генов мышиных константных областей легких цепей известны из уровня техники [см., например, Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, US Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242], и фрагменты ДНК, охватывающие эти области, можно получить путем стандартной ПЦР-амплификации. В предпочтительных вариантах осуществления константная область легкой цепи может представлять собой константную область каппа- или лямбда-цепи.

Для получения гена scFv образуют функциональную связь фрагментов ДНК, кодирующих V_H- и V_L/V_K, с другим фрагментом, кодирующим гибкий линкер, например, кодирующим аминокислотную последовательность (Gly₄ -Ser)₃, так что последовательности VH и V_L/V_K могут экспрессироваться в виде непрерывного одноцепочечного белка, при этом V_L/V_K и VH-области соединены гибким линкером [см., например, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:58795883; McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-554].

Представлены нуклеиновые кислоты, кодирующие антитела, раскрытые в данном документе. Такие полинуклеотиды кодируют как вариабельные, так и константные области каждой из тяжелой и легкой цепей, хотя другие комбинации также рассматриваются в соответствии с описанными в данном документе композициями.

Полинуклеотиды могут находиться в форме РНК или ДНК. Полинуклеотиды в форме ДНК, кДНК геномной ДНК, аналогов нуклеиновых кислот и синтетических ДНК также являются применимыми. ДНК может быть двухнитевой или однонитевой, и в случае однонитевой может представлять собой кодирующую (смысловую) нить или некодирующую (антисмысловую) нить. Кодирующая последователь- 25 046736 ность, которая кодирует полипептид, может быть идентична кодирующей последовательности, представленной в данном документе, или может быть другой кодирующей последовательностью, при этом данная последовательность вследствие избыточности или вырожденности генетического кода кодирует те же полипептиды, что и ДНК, представленная в данном документе.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая(-ие) раскрытые в данном документе антитела, включена(-ы) в векторы экспрессии, которые могут быть внехромосомными или предназначены для интеграции в геном клетки-хозяина, в которую она введена. Векторы экспрессии могут содержать любое количество соответствующих регуляторных последовательностей (в том числе без ограничения последовательности для контроля транскрипции и трансляции, промоторы, сайты связывания рибосомы, энхансеры, точки начала репликации и т.п.) или другие компоненты (селектируемые гены и т.п.), все из которых функционально связаны, как хорошо известно из уровня техники. В некоторых случаях применяют две нуклеиновые кислоты, и каждую помещают в отдельный вектор экспрессии (например, тяжелую цепь в первый вектор экспрессии, легкую цепь во второй вектор экспрессии), или, в альтернативном случае, их можно поместить в один и тот же вектор экспрессии. Специалистам в данной области будет понятно, что конструкция вектора(-ов) экспрессии, в том числе выбор регуляторных последовательностей, может зависеть от таких факторов, как выбор клетки-хозяина, требуемый уровень экспрессии белка и т.п.

Нуклеиновые кислоты и/или системы экспрессии обычно можно вводить в подходящую клеткухозяина с получением рекомбинантной клетки-хозяина с помощью любого способа, подходящего для выбранной клетки-хозяина (например, трансформации, трансфекции, электропорации, инфицирования), таким образом, что молекула(-ы) нуклеиновой кислоты функционально связана(-ы) с одним или более элементами контроля экспрессии (например, в векторе, в конструкции, полученной с помощью процессов в клетке, интегрированной в геном клетки-хозяина). Полученную в результате рекомбинантную клетку-хозяина можно выдерживать в условиях, подходящих для экспрессии (например, в присутствии индуктора, в подходящем отличном от человека животном, в подходящей культуральной среде, дополненной надлежащими солями, факторами роста, антибиотиками, пищевыми добавками и т.п.), в результате чего образуются кодируемый(кодируемые) полипептид(полипептиды). В некоторых случаях тяжелые цепи образуются в одной клетке, а легкие цепи в другой.

Линии клеток млекопитающих, доступных в качестве хозяев для экспрессии, известны из уровня техники и включают большое количество иммортализованных линий клеток, доступных из Американской коллекции типовых культур (ATCC), Манассас, Виргиния, США, в том числе без ограничения клетки яичника китайского хомячка (CHO), клетки HEK 293, клетки NSO, клетки HeLa, клетки почки новорожденного хомяка (BHK), клетки почки обезьяны (COS), клетки гепатоцеллюлярной карциномы человека (например, Hep G2) и множество других линий клеток. Клетки, отличные от клеток млекопитающих, в том числе без ограничения клетки бактерий, дрожжей, насекомых и растений, также можно применять для экспрессии рекомбинантных антител. В некоторых вариантах осуществления антитела можно получать в трансгенных животных, таких как коровы или куры.

Общие способы молекулярной биологии, экспрессии, очистки и скрининга антител хорошо известны, см., например, патенты США №№ 4816567, 4816397, 6331415 и 7923221, а также Antibody Engineering под редакцией Kontermann & Dubel, Springer, Heidelberg, 2001 и 2010 Hayhurst & Georgiou, 2001, Curr Opin Chem Biol 5:683-689; Maynard & Georgiou, 2000, Annu Rev Biomed Eng 2:339-76; и Morrison, S. (1985) Science 229:1202.

Компонентом (B) фармацевтической комбинации является венетоклакс или его фармацевтическиприемлемая соль. Венетоклакс является низкомолекулярным лекарственным средством для перорального применения, которое блокирует антиапоптотический белок B-клеточной лимфомы-2 (Bcl-2), что приводит к запрограммированной гибели клеток. Он показан при хроническом лимфоцитарном лейкозе (CLL) у пациентов со специфической хромосомной аномалией (делеция 17p). В 2015 году Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) присвоило венетоклаксу статус принципиально нового терапевтического препарата для пациентов с CLL, у которых был рецидив или они были невосприимчивы к предыдущему лечению и имели генетическую мутацию с делецией 17p.

Структурная формула венетоклакса приведена ниже

CI

Его названием согласно IUPAC является 4-(4-{[2-(4-хлорфенил)-4,4-диметил-1-циклогексен-1

- 26 046736 ил]метил}-1-пиперазинил)-№({3-нитро-4-[(тетрагидро-2Н-пиран-4-илметил)амино]фенил}сульфонил)-2(1Н-пирроло[2,3-Ь]пиридин-5-илокси)бензамид. Венетоклакс продается под торговыми наименованиями Venclexta® в США и Venclyxto® в Европе.

Фармацевтические композиции.

Фармацевтическая комбинация по настоящему изобретению представлена в форме комбинированного препарата для одновременного, раздельного или последовательного применения. Аналогично, в рамках способов по настоящему изобретению компоненты (A) и (B) фармацевтической комбинации можно вводить пациенту одновременно, раздельно или последовательно.

Термин комбинированный препарат включает как фиксированные комбинации, так и нефиксированные комбинации.

Термин фиксированная комбинация означает, что активные ингредиенты (например, компоненты (A) и (B)) представлены в форме единого средства или дозы. Другими словами, активные ингредиенты присутствуют в единой композиции или составе.

Термин нефиксированная комбинация означает, что активные ингредиенты (например, компоненты (A) и (B)), присутствуют в разных средствах или дозах (например, в виде отдельных композиций или составов), например, в виде набора из частей. Независимые компоненты (A) и (B) (в их требуемых композициях или составах) можно затем вводить раздельно или последовательно, в один и тот же момент времени или в различные моменты времени.

В случае, когда введение осуществляют последовательно, задержка введения второго компонента не должна быть такой, при которой теряется благоприятный эффект, получаемый вследствие применения комбинации. Следовательно, в одном варианте осуществления последовательное лечение включает введение каждого компонента комбинации в течение периода 11 дней. В другом варианте осуществления данный период составляет 10 дней. В другом варианте осуществления данный период составляет 9 дней. В другом варианте осуществления данный период составляет 8 дней. В другом варианте осуществления данный период составляет 7 дней. В другом варианте осуществления данный период составляет 6 дней. В другом варианте осуществления данный период составляет 5 дней. В другом варианте осуществления данный период составляет 4 дня. В другом варианте осуществления данный период составляет 3 дня. В другом варианте осуществления данный период составляет 2 дня. В другом варианте осуществления данный период составляет 24 ч. В другом варианте осуществления данный период составляет 12 ч.

Компоненты (A) и (B) можно вводить в любом порядке, например, вначале компонент (A), а затем компонент (B); или вначале компонент (B), а затем компонент (A).

Соотношение общих количеств компонента (A) и компонента (B), подлежащих введению в комбинированном препарате, может варьироваться, например, с целью удовлетворения потребностей субпопуляции пациентов, подлежащих лечению, или потребностей одного пациента, при этом различные потребности пациентов могут быть обусловлены их возрастом, полом, массой тела и т.д.

Компоненты (A) и (B), независимо от того, присутствуют ли они в одной композиции или в отдельных композициях, независимо могут быть составлены с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями. Фармацевтические комбинации по настоящему изобретению также могут содержать по меньшей мере одно другое противоопухолевое средство или противовоспалительное или иммунодепрессивное средство. Примеры терапевтических средств, которые можно применять в комбинированной терапии, более подробно описаны ниже в разделе, посвященном путям применения антител, раскрытых в данном документе.

Как используется в данном документе, фармацевтически приемлемый носитель включает любые возможные растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства, изотонические и замедляющие всасывание средства и т.п., которые являются физиологически совместимыми. Носитель предпочтительно подходит для внутривенного, внутримышечного, подкожного, парентерального, спинального или эпидермального введения (например, путем инъекции или инфузии). В зависимости от пути введения активное соединение, т.е. антитело, иммуноконъюгат или биспецифическая молекула, могут быть покрыты материалом для защиты соединения от действия кислот и других естественных условий, которые могут инактивировать соединение.

Компоненты (A) и/или (B) могут быть в форме одной или более фармацевтически приемлемых солей. Фармацевтически приемлемая соль относится к соли, которая сохраняет необходимую биологическую активность исходного соединения и не вызывает никаких нежелательных токсических эффектов [см., например, Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19]. Примеры таких солей включают соли присоединения кислоты и соли присоединения основания. Соли присоединения кислоты включают соли, полученные из нетоксичных неорганических кислот, таких как хлористоводородная, азотная, фосфорная, серная, бромистоводородная, йодистоводородная, фосфористая и т.п., а также из нетоксичных органических кислот, таких как алифатические моно- и дикарбоновые кислоты, фенилзамещенные алкановые кислоты, гидроксиалкановые кислоты, ароматические кислоты, алифатические и ароматические сульфоновые кислоты и т.п. Соли присоединения основания включают соли, полученные из щелочноземельных металлов, таких как натрий, калий, магний, кальций и т.п., а также из нетоксичных органических аминов, таких как N.N'-дибензилэтнлендиамин. N-метилглюкамин, хлорпрокаин, холин, диэтаноламин, этилен

- 27 046736 диамин, прокаин и т.п.

Фармацевтическая комбинация по настоящему изобретению или ее часть также могут содержать фармацевтически приемлемый антиоксидант. Примеры фармацевтически приемлемых антиоксидантов включают: (1) водорастворимые антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, гидрохлорид цистеина, бисульфат натрия, метабисульфит натрия, сульфит натрия и т.п.; (2) жирорастворимые антиоксиданты, такие как аскорбилпальмитат, бутилированный гидроксианизол (BHA), бутилированный гидрокситолуол (BHT), лецитин, пропилгаллат, альфа-токоферол и т.п.; и (3) средства, хелатирующие металлы, такие как лимонная кислота, этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA), сорбит, винная кислота, фосфорная кислота и т.п.

Примеры подходящих водных и неводных носителей, которые можно использовать в фармацевтических комбинациях по настоящему изобретению, включают воду, этанол, полиолы (такие как глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и т.п.) и их подходящие смеси, растительные масла, такие как оливковое масло, и инъекционные органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Надлежащую текучесть можно поддерживать, например, путем применения материалов покрытия, таких как лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсий и путем применения поверхностноактивных веществ.

Эти комбинации или их части могут также содержать вспомогательные средства, такие как консерванты, смачивающие средства, эмульгаторы и диспергаторы. Недопущение наличия микроорганизмов можно обеспечивать как с помощью процедур стерилизации, описанных выше, так и путем включения различных антибактериальных и противогрибковых средств, например, парабена, хлорбутанола, фенола, сорбиновой кислоты и т.п. Также может быть желательным включение в композиции изотонических средств, таких как сахара, хлорид натрия и т.п. В дополнение, пролонгированного всасывания инъекционной фармацевтической формы можно добиться путем включения средств, замедляющих всасывание, таких как моностеарат алюминия и желатин.

Фармацевтически приемлемые носители включают стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для получения стерильных инъекционных растворов или дисперсий для немедленного приема. Применение таких сред и средств для фармацевтически активных веществ известно из уровня техники. За исключением случаев, когда какие-либо традиционные среда или средство несовместимы с активным соединением, предусматривается их применение в фармацевтических композициях по настоящему изобретению. В состав композиций также могут быть включены дополнительные активные соединения.

Терапевтические композиции, как правило, должны быть стерильными и стабильными в условиях производства и хранения. Композицию можно составлять в виде раствора, микроэмульсии, липосомы или другой упорядоченной структуры, подходящей для высокой концентрации лекарственного средства. Носитель может представлять собой растворитель или дисперсионную среду, содержащую, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и т.п.) и их подходящие смеси. Надлежащую текучесть можно поддерживать, например, путем применения покрытия, такого как лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии и путем применения поверхностно-активных веществ. Во многих случаях будет предпочтительным включение в композицию изотонических средств, например, сахаров, многоатомных спиртов, таких как маннит, сорбит, или хлорида натрия. Пролонгированного всасывания инъекционных композиций можно добиться путем включения в композицию средства, замедляющего всасывание, например, моностеаратных солей и желатина.

Стерильные инъекционные растворы можно получить путем включения активного соединения в необходимом количестве в соответствующем растворителе с одним или комбинацией из ингредиентов, перечисленных выше, при необходимости, с последующей стерилизующей микрофильтрацией. Дисперсии, как правило, получают путем включения активного соединения в стерильный наполнитель, который содержит основную дисперсионную среду и другие необходимые ингредиенты из перечисленных выше. В случае стерильных порошков для получения стерильных инъекционных растворов предпочтительными способами получения являются вакуумная сушка и сублимационная сушка (лиофилизация), с помощью которых получают порошковую форму активного ингредиента, а также любого дополнительного требуемого ингредиента из их раствора, ранее подвергнутого стерилизующей фильтрации.

Количество активного ингредиента, которое можно объединить с материалом носителя с получением единичной лекарственной формы, будет варьироваться в зависимости от субъекта, подвергаемого лечению, и конкретного способа введения. Количество активного ингредиента, которое можно объединить с материалом носителя с получением единичной лекарственной формы, как правило, будет представлять собой такое количество композиции, которое вызывает терапевтический эффект. Из 100% это количество обычно будет варьироваться в диапазоне от приблизительно 0,01% до приблизительно 99% активного ингредиента, предпочтительно от приблизительно 0,1% до приблизительно 70%, наиболее предпочтительно от приблизительно 1% до приблизительно 30% активного ингредиента в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.

Режимы дозирования корректируют для получения оптимального требуемого ответа (например, си

- 28 046736 нергическая комбинация, терапевтический ответ). Например, можно вводить однократную болюсную дозу, можно вводить несколько разделенных доз в течение некоторого времени, или дозу можно пропорционально понизить или повысить, на что указывают потребности терапевтической ситуации. Особенно преимущественным является составление парентеральных композиций в стандартной лекарственной форме для простоты введения и равномерности дозирования. Стандартная лекарственная форма, как используется в данном документе, относится к физически дискретным единицам, подходящим в качестве одноразовых доз для субъектов, подлежащих лечению; каждая единица содержит предварительно определенное количество активного соединения, рассчитанное для получения требуемого терапевтического эффекта, совместно с необходимым фармацевтическим носителем. Технические требования к стандартным лекарственным формам по настоящему изобретению обусловлены (a) уникальными характеристиками активного соединения и конкретным терапевтическим эффектом, которого следует достичь, и (b) присущими ограничениями в области приготовления такого активного соединения в отношении лечения индивидуумов с чувствительностью, и непосредственно зависят от них.

Для введения антитела к LY75 доза находится в диапазоне от приблизительно 0,0001 до 100 мг/кг, например, от 0,001 до 50 мг/кг, от 0,005 до 20 мг/кг, от 0,01 до 10 мг/кг и более типично от 0,01 до 5 мг/кг от массы тела хозяина. Например, дозы могут составлять 0,05 мг/кг массы тела, 0,1 мг/кг массы тела, 0,3 мг/кг массы тела, 0,3 мг/кг массы тела, 0,5 мг/кг массы тела, 1 мг/кг массы тела, 2 мг/кг массы тела, 3 мг/кг массы тела, 4 мг/кг массы тела, 5 мг/кг массы тела, 6 мг/кг массы тела, 7 мг/кг массы тела, 8 мг/кг массы тела, 9 мг/кг массы тела, 10 мг/кг массы тела, 12 мг/кг массы тела, 15 мг/кг массы тела, 20 мг/кг массы тела, 25 мг/кг массы тела, 30 мг/кг массы тела или находиться в диапазоне 0,1-20 мг/кг, 0,5-15 мг/кг, 1-10 мг/кг, 2-8 мг/кг, 3-7 мг/кг, 4-6 мг/кг. Иллюстративный режим лечения включает введение один раз в день, один раз в 2 дня, один раз в неделю, один раз в две недели, один раз в три недели, один раз в четыре недели, один раз в месяц, один раз в 6 недель, один раз в 3 месяца или один раз в 3-6 месяцев. Предпочтительные режимы дозирования антитела к LY75 по настоящему изобретению включают 1 мг/кг массы тела или 3 мг/кг массы тела посредством внутривенного введения, при этом антитело принимают с использованием одной из следующих схем дозирования: (i) каждые четыре недели в количестве шести доз, затем каждые три месяца; (ii) каждые три недели; (iii) 3 мг/кг массы тела однократно, а затем 1 мг/кг массы тела каждые три недели.

В некоторых вариантах осуществления дозу антитела к LY75 (например, LY75_DM4) регулируют для достижения концентрации антитела в плазме крови, составляющей от 10 до 1500 нМ или от 18 до 1200 нМ (например, приблизительно 18,75, 37,5, 75, 150, 300, 600 или 1200 нМ). Предпочтительно антитело к LY75 (например, LY75_DM4) регулируют для достижения концентрации антитела в крови, составляющей от 15 до 50 нМ, от 50 до 100 нМ, 100-500 нМ или 500-1200 нм.

В некоторых вариантах осуществления дозу венетоклакса (или его фармацевтически приемлемой соли) регулируют для достижения концентрации в плазме крови, составляющей от 0,5 до 500 нМ или от 0,64 до 400 нМ (например, приблизительно 0,64, 3,2, 16, 80, 400 или 2000 нМ). Предпочтительно, венетоклакс (или его фармацевтически приемлемую соль) регулируют для достижения концентрации в плазме крови, составляющей от 0,5 до 20 нМ, от 20 до 50 нМ, 50-100 нМ или 100-500 нм. Ее можно вводить перорально. В некоторых вариантах осуществления доза венетоклакса (или его фармацевтически приемлемой соли) составляет приблизительно 100 мг, 200 мг, 300 мг, 400 мг или 500 мг. Венетоклакс или его фармацевтически приемлемую соль можно вводить с одним или более из циклофосфамида, гидроксидаунорубицина, онковина и преднизона или преднизолона (т.е. CHOP-терапия).

Предпочтительно, комбинация компонентов (A) и (B) представляет собой синергическую комбинацию. Специалисту в данной области будет понятно, что синергическая комбинация представляет собой комбинацию, в которой эффект комбинации является большим, чем сумма эффектов ее отдельных компонентов. Синергизм может быть количественно определен с помощью показателя аддитивности ChouTalalay (CI) (см. Evaluation of combination chemotherapy: integration of nonlinear regression, curve shift, isobologram, and combination index analyses, Zhao L, et al. Clin Cancer Res. (2004) Dec 1;10(23):7994-8004; и Computerized quantitation of synergism and antagonism of taxol, topotecan, and cisplatin against human teratocarcinoma cell growth: a rational approach to clinical protocol design, Chou TC, Motzer RJ, Tong Y, Bosl GJ., J. Natl. Cancer Inst. (1994) Oct 19;86(20):1517-24). Этот способ с применением показателя аддитивности (CI) основан на уравнении множественного эффекта лекарственного средства, выведенном на основании принципа медианного эффекта закона действующих масс. Это дает количественное определение для сильного синергизма (CI<0,3), синергизма (CI=0,3-0,9), аддитивного эффекта (CI=0,9-1,1) или антагонизма/отсутствия пользы (CI>1,1), и это предусматривает алгоритм для компьютерного программного обеспечения для автоматического моделирования комбинаций лекарственных средств. Учитываются как эффективность (значение D(m)), так и форма кривой доза-эффект (значение m) каждого лекарственного средства в отдельности и их комбинации. Показатель аддитивности Чоу-Талалая (CI) можно оценить с применением пакета Synergy R (см. Preclinical versus Clinical Drugs Combination Studies, Chou TC. Leuk. Lymphoma. (2008); 49(11):2059-2080, и источники в нем, все из которых конкретно включены в данный документ посредством ссылки). CI комбинации может быть исследован в подходящей линии клеток, например, в линии клеток ABC-DLBLC (такой как TMD8 или HBL1), например, в условиях, используемых

- 29 046736 в примере 26.

Предпочтительно, фармацевтическая комбинация по настоящему изобретению представляет собой синергическую комбинацию, в которой показатель аддитивности Чоу-Талалая (CI) составляет меньше 0,9, 0,8, 0,7, 0,6, 0,5, 0,4, 0,3 или 0,2. Предпочтительно, CI составляет 0,1-0,5, 0,1-0,3 или 0,1-0,2.

В частности, представлен способ лечения рака у пациента, включающий одновременное, последовательное или раздельное введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективных синергических количеств компонентов (A) и (B) фармацевтической комбинации по настоящему изобретению. Также представлена фармацевтическая комбинация по настоящему изобретению для применения при лечении рака, где синергические количества компонентов (A) и (B) вводят пациенту одновременно, раздельно или последовательно для лечения рака. Предпочтительно, количества компонентов (A) и (B) вводят пациенту с целью обеспечить концентрации в плазме крови, раскрытые выше.

Также представлено применение синергических количеств компонентов (A) и (B) фармацевтической комбинации по настоящему изобретению в получении фармацевтической комбинации для одновременного, раздельного или последовательного применения для лечения рака. Также представлена синергическая фармацевтическая комбинация по настоящему изобретению для применения в терапии или для применения в качестве лекарственного препарата.

В некоторых способах два или более моноклональных антител к LY75 с различными типами специфичности связывания вводят одновременно, и в данном случае доза каждого вводимого антитела находится в пределах указанных диапазонов. Антитело обычно вводят несколько раз. Интервалы между приемами отдельных доз могут соответствовать, например, введению один раз в день, два раза в неделю, один раз в неделю, один раз в месяц, каждые три месяца, каждые шесть месяцев или один раз в год. Интервалы также могут быть нерегулярными, на что указывает измерение уровней антитела к антигенумишени в крови пациента. В некоторых способах дозу корректируют для достижения концентрации антитела в плазме крови, составляющей приблизительно 1-1000 мкг/мл, 5-750 мкг/мл, 10-600 мкг/мл, 15500 мкг/мл, 20-400 мкг/мл и в некоторых способах приблизительно 25-300 мкг/мл.

В качестве альтернативы антитела к LY75 можно вводить в виде составов с замедленным высвобождением, и в данном случае требуется менее частое введение. Доза и частота варьируются в зависимости от периода полувыведения антитела из организма пациента. Как правило, наиболее длительный период полувыведения демонстрируют антитела человека, за которыми следуют гуманизированные антитела, химерные антитела и антитела, отличные от человеческих. Доза и частота введения может варьироваться в зависимости от того, является ли лечение профилактическим или терапевтическим. В профилактических путях применения относительно низкую дозу вводят с относительно редкими интервалами в течение длительного периода времени. Некоторые пациенты продолжают получать лечение до конца своей жизни. В терапевтических путях применения иногда требуется введение относительно высоких доз с относительно короткими интервалами до уменьшения или прекращения прогрессирования заболевания и предпочтительно до тех пор, пока пациент не продемонстрирует частичного или полного уменьшения интенсивности проявления симптомов заболевания. После этого в отношении пациента можно применять профилактический режим.

Фактические уровни доз активных ингредиентов в фармацевтических комбинациях по настоящему изобретению можно варьировать для того, чтобы получить количество активного ингредиента, эффективное для достижения требуемого терапевтического ответа для конкретных пациента, композиции и способа введения без токсичности для пациента. Выбранный уровень дозы будет зависеть от ряда фармакокинетических факторов, в том числе активности конкретных используемых композиций по настоящему изобретению или их сложного эфира, соли или амида, пути введения, времени введения, скорости экскреции конкретного используемого соединения, продолжительности лечения, других лекарственных средств, соединений и/или материалов, применяемых в комбинации с конкретными используемыми композициями, возраста, пола, массы тела, состояния, общего состояния здоровья и анамнеза пациента, подвергаемого лечению, и подобных факторов, хорошо известных в области медицины.

Терапевтически эффективная доза антитела к LY75 предпочтительно приводит в результате к уменьшению тяжести симптомов заболевания, увеличению частоты и продолжительности периодов отсутствия симптомов заболевания или предупреждению нарушения или нетрудоспособности из-за поражения заболеванием. Например, для лечения опухолей, опосредованных LY75, терапевтически эффективная доза предпочтительно ингибирует рост клеток или рост опухоли на по меньшей мере приблизительно 20%, по меньшей мере приблизительно 30%, более предпочтительно на по меньшей мере приблизительно 40%, по меньшей мере приблизительно 50%, еще более предпочтительно на по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере, приблизительно 70% и еще более предпочтительно на по меньшей мере приблизительно 80% или по меньшей мере приблизительно 90% по сравнению с субъектами, которых не подвергали лечению. Способность соединения к ингибированию роста опухоли можно оценить в животной модельной системе, предсказывающей эффективность в отношении опухолей человека. В альтернативном случае данное свойство композиции можно оценить путем изучения способности соединения к ингибированию роста клеток, при этом такое ингибирование можно измерить in vitro с помощью анализов, известных практикующему специалисту. Терапевтически эффективное количество те

- 30 046736 рапевтического соединения может обеспечивать уменьшение размера опухоли или иным образом уменьшать интенсивность проявления симптомов у субъекта. Средний специалист в данной области будет способен определить такие количества на основании таких факторов, как габариты субъекта, тяжесть симптомов субъекта и конкретная композиция или выбранный путь введения.

Фармацевтическую комбинацию по настоящему изобретению можно вводить посредством одного или более путей введения с помощью одного или более из ряда способов, известных из уровня техники. Компоненты (A) и (B) можно вводить посредством одного того же пути или посредством различных путей. Как будет понятно специалисту в данной области, путь и/или способ введения будут варьироваться в зависимости от требуемых результатов. Предпочтительные пути введения антител по настоящему изобретению включают внутривенный, внутримышечный, внутрикожный, внутрибрюшинный, подкожный, спинальный или другие парентеральные пути введения, например, посредством инъекции или инфузии. Фраза парентеральное введение, используемая в данном документе, означает способы введения, отличные от энтерального и местного введения, обычно посредством инъекции, и включает без ограничения внутривенную, внутримышечную, внутриартериальную, интратекальную, внутрикапсулярную, внутриглазничную, внутрисердечную, внутрикожную, внутрибрюшинную, транстрахеальную, подкожную, субкутикулярную, внутрисуставную, субкапсулярную, субарахноидальную, интраспинальную, эпидуральную и внутригрудинную инъекцию и инфузию.

В качестве альтернативы антитело к LY75 можно вводить посредством отличного от парентерального пути, такого как местный, эпидермальный путь введения или путь введения через слизистые, например интраназально, перорально, вагинально, ректально, сублингвально или местно.

Предпочтительно, венетоклакс или его фармацевтически приемлемую соль вводят перорально, например в виде таблетки.

Активные соединения можно получать с носителями, которые будут защищать соединение от быстрого высвобождения, как, например, в составе с контролируемым высвобождением, в том числе имплантатах, трансдермальных пластырях и микроинкапсулированных системах доставки. Можно применять биоразлагаемые биосовместимые полимеры, такие как сополимер этилена и винилацетата, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полимолочная кислота. Многие способы получения таких составов запатентованы или общеизвестны специалистам в данной области [см., например, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems (1978) J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., N.Y].

Терапевтические композиции можно вводить с помощью медицинских устройств, известных из уровня техники. Например, в предпочтительном варианте осуществления компонент (A) и/или (B) можно вводить с помощью безыгольного устройства для подкожных инъекций, такого как устройства, раскрытые в патентах США №№ 5399163; 5383851; 5312335; 5064413; 4941880; 4790824 или 4596556. Примеры хорошо известных имплантатов и модулей, применимых в настоящем изобретении, включают: имплантируемую микроинфузионную помпу для дозирования лекарства с контролируемой скоростью, раскрытую в патенте США № 4487603; терапевтическое устройство для введения лекарственных препаратов через кожу, раскрытое в патенте США № 4486194; помпу для инфузии лекарства для доставки лекарства с точной скоростью инфузии, раскрытую в патенте США № 4447233; имплантируемый инфузионный прибор с переменным объемом подачи для непрерывной доставки лекарственного средства, раскрытый в патенте США № 4447224; осмотическую систему доставки лекарственных средств, имеющую многокамерные отделения, раскрытую в патенте США № 4439196; и осмотическую систему доставки лекарственных средств, раскрытую в патенте США № 4475196. Эти патенты включены в данный документ посредством ссылки. Специалистам в данной области известны многие другие такие имплантаты, системы доставки и модули.

В некоторых вариантах осуществления антитело к LY75 может быть составлено для обеспечения надлежащего распределения in vivo. Например, гематоэнцефалический барьер (BBB) не пропускает многие высокогидрофильные соединения. Для обеспечения пересечения BBB терапевтическими соединениями (если требуется) их можно составлять, например, в липосомах. В отношении способов получения липосом см., например, патенты США 4522811; 5374548 и 5399331. Липосомы могут содержать одну или функциональных частей, избирательно транспортируемых в конкретные клетки или органы, что, таким образом, повышает качество целенаправленной доставки лекарственных средств [см., например, V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685]. Иллюстративные нацеливающие функциональные части включают фолат или биотин (см., например, патент США 5416016.); маннозиды [Umezawa et al. (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038]; антитела [P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180]; рецептор поверхностно-активного белка A [Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134]; p120 [Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090]; см. также K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273.

Пути применения и способы.

Используемый в данном документе термин субъект подразумевается как включающий человека и отличных от человека животных. Отличные от человека животные включают всех позвоночных животных, например, млекопитающих и не являющихся млекопитающими, таких как отличные от человека

- 31 046736 приматы, овцы, собаки, кошки, коровы, лошади, куры, земноводные и пресмыкающиеся. Предпочтительные субъекты включают пациентов-людей, имеющих расстройства, опосредованные нарушенной активностью LY75.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления субъектом является субъект-человек, у которого имеется делеция 17p, например человек, у которого наблюдаются признаки хронического лимфоцитарного лейкоза.

Способы являются особенно подходящими для лечения пациентов-людей, имеющих расстройство, связанное с экспрессией аберрантных LY75. С учетом экспрессии LY75 на опухолевых клетках, комбинации и способы по настоящему изобретению можно применять для лечения субъекта с онкогенным нарушением, например, нарушением, характеризующимся наличием опухолевых клеток, экспрессирующих LY75, или при изготовлении лекарственного препарата для лечения такого нарушения, включающего, например, лейкоз, в том числе хронический лимфоцитарный лейкоз и острый миелоидный лейкоз, неходжкинскую лимфому, в том числе DLBCL, B-клеточную лимфому, фолликулярную лимфому, мантийноклеточную лимфому, лимфому из лимфоидной ткани слизистых оболочек (MALT), B-клеточную лимфому, богатую T-клетками/гистиоцитами, лимфому Беркитта, лимфоплазмоцитарную лимфому, мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому, лимфому из клеток маргинальной зоны, T-клеточную лимфому, периферическую T-клеточную лимфому, анапластическую крупноклеточную лимфому и ангиоиммунобластную T-клеточную лимфому. Было продемонстрировано, что LY75 интернализируется при связывании с антителом, как проиллюстрировано в примерах 5 и 7 ниже, что, таким образом, обеспечивает применение антител к LY75 в любом механизме действия с нагрузкой, например, в подходе с ADC, в радиоиммуноконъюгате или в подходе ADEPT.

Антитела к LY75, обычно вводимые в виде ADC, можно применять для ингибирования или блокирования функции LY75, для которого, в свою очередь, может быть установлена связь с предупреждением или уменьшением интенсивности определенных симптомов заболевания, что, таким образом, подразумевает LY75 в качестве медиатора заболевания. Этого можно достичь путем приведения образца и контрольного образца в контакт с антителом к LY75 в условиях, обеспечивающих образование комплекса между антителом и LY75. В образце и контрольном образце выявляют и сравнивают любые комплексы, образующиеся между антителом и LY75.

Подходящие пути введения композиций антител (например, моноклональных антител и иммуноконъюгатов) in vivo и in vitro хорошо известны из уровня техники и могут быть выбраны средними специалистами в данной области. Например, композиции антител можно вводить посредством инъекции (например, внутривенной или подкожной). Подходящие дозы применяемых молекул будут зависеть от возраста и массы тела субъекта, а также концентрации и/или состава композиции антитела.

Как описано выше, антитела к LY75 можно вводить совместно с одним или более другими терапевтическими средствами, например цитотоксическим средством, радиотоксическим средством или иммунодепрессивным средством. Антитело может быть связано со средством (в виде иммунного комплекса) или может вводиться отдельно от средства. В последнем случае (раздельное введение) антитело можно вводить до, после введения средства или одновременно с ним или можно вводить совместно с применением других известных видов терапии, например, противораковой терапии, например, лучевой терапии. Такие терапевтические средства включают, среди прочих, противоопухолевые средства, такие как доксорубицин (адриамицин), цисплатин, сульфат блеомицина, кармустин, хлорамбуцил, а также циклофосфамид и гидроксимочевина, которые сами по себе являются эффективными только на уровнях, которые являются токсичными или субтоксичными для пациента. Цисплатин вводят внутривенно в виде дозы 100 мг/кг один раз в четыре недели, а адриамицин вводят внутривенно в виде дозы 60-75 мг/мл один раз в 21 день. Другие средства, подходящие для совместного введения с антителами по настоящему изобретению, включают другие средства, применяемые для лечения форм рака, например, рака желудка, рака ободочной и прямой кишки, рака предстательной железы, рака молочной железы, рака яичника или рака легкого, такие как Avastin®, 5FU и гемцитабин. Совместное введение антител к LY75 или их антигенсвязывающих фрагментов по настоящему изобретению с химиотерапевтическими средствами обеспечивает два противораковых средства, действующих посредством различных механизмов, которые обеспечивают достижение цитотоксического эффекта в отношении опухолевых клеток человека. Такое совместное введение может решать проблемы, обусловленные развитием устойчивости к лекарственным средствам или изменением антигенности опухолевых клеток, которое может сделать их не реагирующими с антителом.

Фармацевтические комбинации по настоящему изобретению также можно вводить вместе с сывороткой крови и/или системой комплемента. Эти композиции могут быть преимущественными, если система комплемента находится в непосредственной близости к антителам. В качестве альтернативы, антитела и систему комплемента или сыворотку крови можно вводить раздельно.

Также в пределах объема настоящего изобретения находятся наборы, содержащие компоненты (A) и (B) вместе с инструкциями по применению. Набор может дополнительно содержать один или более дополнительных реагентов, таких как иммунодепрессивный реагент, цитотоксическое средство или радиотоксичное средство, или одно или более дополнительных антител (например, антитело, обладающее дополняющей активностью, которое связывается с эпитопом на антигене LY75, отличным от такового

- 32 046736 для первого антитела).

Соответственно, пациентам, получающим лечение с помощью фармацевтических комбинаций по настоящему изобретению, можно дополнительно вводить (до введения антитела, раскрытого в данном документе, одновременно с ним или после него) другое терапевтическое средство, такое как цитотоксическое или радиотоксичное средство, которое усиливает или увеличивает терапевтический эффект антител.

В других вариантах осуществления субъект может получать дополнительное лечение с помощью средства, которое модулирует, например, усиливает или ингибирует, экспрессию или активность Fcy или FcY-рецепторов, посредством, например, лечения субъекта цитокином. Предпочтительные цитокины для введения в ходе лечения полиспецифической молекулой включают гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), интерферон-γ (IFN-γ) и фактор некроза опухоли (TNF).

Все литературные источники, упоминаемые в настоящем описании, в том числе без ограничения все документы, публикации, патенты, заявки на патенты, презентации, тексты, отчеты, рукописи, брошюры, книги, интернет-публикации, журнальные статьи, периодические издания, информационные бюллетени о продуктах и т.п., настоящим включены в настоящее описание посредством ссылки во всей своей полноте. Обсуждение литературных источников в данном документе предназначено лишь для обобщения утверждений, сделанных их авторами, и не делается признание того факта, что любой литературный источник составляет часть предшествующего уровня техники, а заявители сохраняют за собой право оспаривать достоверность и значимость упоминаемых литературных источников.

Хотя вышеупомянутое изобретение было довольно подробно описано посредством иллюстрации и примера в целях ясности понимания, средним специалистам в данной области в свете идей настоящего изобретения будет без труда понятно, что в его отношении можно производить определенные изменения и модификации без отступления от сущности или объема зависимых пунктов формулы изобретения.

Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано с помощью следующих примеров, которые не следует толковать как дополнительно ограничивающие.

Пример 1. Получение человеческих моноклональных антител против антигена LY75.

В соответствии со стандартными процедурами мышей (XenoMouse IgG1) иммунизировали клетками CHO, трансфицированными LY75 полной длины.

Специфичность антител, выработанных против LY75, исследовали с помощью проточной цитометрии с использованием клеток HEK293, трансфицированных LY75, и впоследствии с использованием клеток HT29, экспрессирующих LY75. Для того чтобы исследовать способность антител связываться с белком LY75 на клеточной поверхности, антитела инкубировали с клетками, экспрессирующими LY75. Клетки промывали буфером для FACS (DPBS, 2% FBS), центрифугировали и ресуспендировали в 100 мкл разбавленного первичного антитела к LY75 (также разведенного в буфере для FACS). Комплекс антитело-линия клеток инкубировали на льду в течение 60 мин и затем дважды промывали буфером для FACS, описанным выше. Осадок клетка-антитело ресуспендировали в 100 мкл разведенного вторичного антитела (также разбавленного в буфере для FACS) и инкубировали на льду в течение 60 мин на льду. Осадок промывали, как описано выше, и ресуспендировали в 200 мкл буфера для FACS. Образцы загружали в проточный цитометр BD FACScanto II, и при этом данные анализировали с помощью программного обеспечения BD FACSdiva (результаты не показаны).

Пример 2. Установление структурных характеристик моноклональных антител к LY75.

Последовательности кДНК, кодирующие вариабельные области тяжелых и легких цепей моноклонального антитела LY75_A1, получали с помощью стандартных методик ПЦР и секвенировали с помощью стандартных методик секвенирования ДНК.

Последовательности антитела можно подвергнуть мутагенезу для возвращения к остаткам зародышевого типа в положении одного или более остатков.

Нуклеотидная и аминокислотная последовательности вариабельной области тяжелой цепи LY75_A1 показаны под SEQ ID NO: 3 и 1 соответственно. Нуклеотидная и аминокислотная последовательности вариабельной области легкой цепи LY75_A1 показаны под SEQ ID NO: 4 и 2 соответственно.

Аминокислотная и нуклеотидная последовательности тяжелой цепи LY75_A1 показаны в SEQ ID NO: 38 и 202, соответственно. Аминокислотная и нуклеотидная последовательности легкой цепи LY75_A1 показаны в SEQ ID NO: 39 и 203, соответственно.

Сравнение последовательности тяжелой цепи иммуноглобулина LY75_A1 с известными последовательностями зародышевого типа тяжелой цепи иммуноглобулина человека продемонстрировало, что в тяжелой цепи LY75_A1 используется VH-сегмент из VH 3-15 человека зародышевого типа и JH-сегмент из J_H JH4 человека зародышевого типа. Дальнейший анализ последовательности VH LY75_A1 с помощью системы Kabat для определения CDR-области привел к выявлению областей CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, показанных под SEQ ID NO: 5, 6 и 7 соответственно. Выравнивания последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 VH LY75_A1 с последовательностью VH 3-15 зародышевого типа и JH JH4 зародышевого типа показаны на фиг. 1.

- 33 046736

Сравнение последовательности легкой цепи иммуноглобулина LY75_A1 с известными последовательностями зародышевого типа легкой цепи иммуноглобулина человека продемонстрировало, что в легкой цепи LY75_A1 используется VK-сегмент из V_K O12 человека зародышевого типа и JK-сегмент из J_K JK4 человека зародышевого типа. Дальнейший анализ последовательности V_K LY75_A1 с помощью системы Kabat для определения CDR-области привел к выявлению областей CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, показанных под SEQ ID NO: 8, 9 и 10, соответственно. Выравнивания последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 V_K LY75_A1 с последовательностями V_K O12 зародышевого типа и J_K JK4 зародышевого типа показаны на фиг. 2.

Пример 3. Иммуногистохимическое исследование с помощью моноклонального антитела к LY75.

С помощью человеческих моноклональных антител, специфичных в отношении LY75, осуществляли иммуногистохимическое исследование с использованием клеточных осадков FFPE HT-29 и А549, матриц с образцами FFPE неходжкинской лимфомы и раковой опухоли поджелудочной железы и свежезамороженных опухолевых образцов лимфомы/лейкоза, срезов раковой опухоли яичника, раковой опухоли поджелудочной железы и раковой опухоли молочной железы и матрицы с нормальными тканями.

Материалы и способы.

Материалы.

Ксилолы (X5P-lgal) от Fisher Scientific, Пенсильвания, США.

100% этанол HistoPrep (HC-800-1GAL) от Fisher Scientific, Пенсильвания, США.

10x цитратный буфер для термического демаскирования эпитопов (AP9003125) от Thermo Scientific, Массачусетс, США.

Ингибитор пероксидазы Thermo Scientific* Pierce* (35000) от Thermo Scientific, Массачусетс, США.

Бессывороточный белковый блокирующий раствор (X0909) от Dako, Калифорния, США.

Вторичное антитело: Fab-специфичное антитело козы к IgG человека, конъюгированное с FITC (109-097-003), от Jackson ImmunoResearch, Пенсильвания, США.

IgG человека ChromPure, целая молекула (09-000-003), от Jackson ImmunoResearch, Пенсильвания, США.

Третичное антитело: антитело мыши к FITC (ab10257) от Abcam, Массачусетс, США.

Очищенный IgG человека для изотипического контроля (1-001A) от R&D Systems, Миннесота, США.

Tween-20 (BP337-100) от Fisher Scientific, Пенсильвания, США.

Ацетон (BP2403-4) от Fisher Scientific, Пенсильвания, США.

HRP-конъюгированный полимер Dual Link EnVision+ для антител мыши и кролика (K4063) от Dako, Калифорния, США.

Набор DAB с 2 растворами (882014) от Invitrogen, Нью-Йорк, США.

Гематоксилин Гарриса (23-245-677) от Fisher Scientific, Пенсильвания, США.

Заливочная среда Faramount (S302580) от Dako, Калифорния, США.

Тканевые срезы и матрицы приобретали от US Biomax Inc., Мэриленд, США или Origene, Мэриленд, США.

Получение микропрепаратов FFPE - удаление парафина и регидратация.

Осуществляли удаление парафина из микропрепаратов FFPE в ксилоле (2x3 мин), а затем осуществляли регидратацию с использованием смеси 1:1 ксилола и 100% этанола (1x3 мин), 100% этанола (2x3 мин), 95% этанола (1x3 мин), 70% этанола (1x3 мин), 50% этанола (1x3 мин), а также водопроводной воды (1x3 мин).

Получение микропрепаратов FFPE - демаскирование антигена (микроволновое излучение).

Антиген LY75 демаскировали с использованием нагревания микроволновым излучением с высокой мощностью до кипения, затем с низкой мощностью в течение 10 мин в 50 мл 1x цитратного буфера в сосуде Коплина. Микропрепараты затем оставляли охлаждаться до комнатной температуры в течение дополнительных 15 мин, затем промывали водопроводной водой 3 мин. Каждый тканевой срез/ТМА обводили окружностью с помощью карандаша для создания гидрофобного барьера, и затем микропрепараты 3 раза промывали в PBS в течение 3 мин для каждой промывки.

Получение микропрепаратов FF.

Микропрепараты извлекали из хранилища при -80°C, и обеспечивали их сушку при комнатной температуре в вытяжном шкафу в течение 20-30 мин. Микропрепараты фиксировали в течение 10 мин в ледяном ацетоне при -20°C, затем обеспечивали их сушку в течение 20 мин в вытяжном шкафу при комнатной температуре. Микропрепараты промывали, и осуществляли их регидратацию в PBS с 3 промывками, каждая в течение 3 мин. Срезы обводили по контуру с помощью карандаша для создания гидрофобного барьера.

Получение комплексов антител.

Первичное антитело к LY75 разбавляли в бессывороточном белковом блокирующем растворе (SFPB) с получением раствора с концентрацией, в 20 раз превышающей требуемую конечную концентрацию (20 мкг/мл для конечной концентрации 1 мкг/мл). Вторичное антитело козы к антигенсвязываю

- 34 046736 щему фрагменту (Fab) иммуноглобулина G человека (IgG) получали аналогичным образом в SFPB для создания раствора с равной концентрацией.

Равные объемы первичного и вторичного антитела объединяли в пробирке с этикеткой, осторожно перемешивали и инкубировали в течение 3 мин при комнатной температуре, в результате чего получали концентрацию первичного антитела, в 10 раз превышающую требуемую конечную концентрацию (10 мкг/мл для конечной концентрации 1 мкг/мл). Эту смесь разбавляли 1:5 с помощью SFPB, осторожно перемешивали и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре, в результате чего получали концентрацию первичного антитела, в два раза превышающую требуемую конечную концентрацию (2 мкг/мл для конечной концентрации 1 мкг/мл).

Для получения конечных окрашивающих комплексов 1% (10 мкг/мкл) раствор IgG человека получали в SFPB, и при этом равный объем добавляли к смеси первичного/вторичного антитела. Эту комбинацию осторожно перемешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин с разбавлением смеси первичного/вторичного антитела до половины концентрации первичного антитела, и в результате получали требуемую конечную концентрацию первичного антитела (1 мкг/мл).

Иммуноокрашивание.

Тем временем активность эндогенной тканевой пероксидазы блокировали посредством инкубирования тканей с ингибитором пероксидазы в течение 5-10 мин при комнатной температуре в увлажнительной камере. Затем микропрепараты промывали в PBS 3 раза в течение 3 мин для каждой промывки. Ткани инкубировали в SFPB в течение 30 мин при комнатной температуре в увлажнительной камере. Конечные окрашивающие комплексы наносили на каждый тканевой срез и/или микроматрицу, и при этом микропрепараты инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре в увлажнительной камере. Затем микропрепараты промывали один раз в PBS и один раз в PBST (PBS+0,125% Tween-20) в течение 3 мин для каждой промывки. Третичное антитело мыши к FITC наносили при концентрации 2 мкг/мл на 30 мин при комнатной температуре в увлажнительной камере. Затем срезы промывали один раз в PBS и один раз в PBST в течение 3 мин для каждой промывки. Затем на ткани наносили HRPконъюгированный полимер Dual Link EnVision+ для антител мыши и кролика, и микропрепараты инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре в увлажнительной камере. Затем микропрепараты промывали один раз в PBS, один раз в PBST в течение 3 мин для каждой промывки. Ткани инкубировали в растворе DAB, полученном в соответствии с инструкциями производителя, при комнатной температуре в течение 10 мин. Затем микропрепараты один раз промывали проточной водопроводной водой в течение 2 мин и один раз в PBS в течение 3 мин. Осуществляли контрастное окрашивание микропрепаратов с помощью гематоксилина в течение 30 с при комнатной температуре и промывали проточной водопроводной водой. Микропрепараты сушили при комнатной температуре в течение 30 мин, и затем микропрепараты заключали под покровные стекла с использованием заливочной среды Faramount.

Результаты.

LY75_A1 характеризовалось положительным результатом при использовании образцов FFPE трижды негативной раковой опухоли молочной железы, причем 77% срезов характеризовались положительным окрашиванием, и 55% демонстрировали интенсивное (+++) окрашивание.

Окрашивание в отношении LY75 нормальных тканей FF, как правило, было в диапазоне от отсутствующего до низкого уровня. Эпителий протоков молочной железы, слюнной железы и поджелудочной железы демонстрировал уровень окрашивания от выраженного низкого до умеренного, и при этом наблюдался низкий уровень положительного окрашивания селезенки. Таким образом, антитела, направленные на LY75, можно использовать в качестве терапевтических средств и диагностических средств при некоторых из исследуемых форм рака и, возможно, других типах рака, характеризующихся экспрессией LY75.

Пример 4. Эффективность моноклональных антител к LY75, конъюгированных с DM1, в отношении клеток HT-29.

Материалы.

CellStripper (неферментативное средство для диссоциации клеток) (MT-25-056CI) от Fisher Scientific, Пенсильвания, США.

PBS, pH 7,4 (1X) (SH30028LS) от Fisher Scientific, Пенсильвания, США.

Среда RPMI 1640 (MT-10-041-CM) от Fisher Scientific, Пенсильвания, США.

CellTiter Glo (G7572) от Promega, Висконсин, США.

Способ.

Осуществляли диссоциацию клеток с помощью CellStripper и подсчет их количества. 5e3 клеток/лунка центрифугировали с получением осадка (в случае клеток в суспензии можно использовать большее количество в зависимости от времени удвоения количества клеток, как, например, 10e3 клеток/лунка). Осадок ресуспендировали в культуральной среде с получением концентрации 1e5 клеток/мл.

Добавляли 50 мкл/лунка суспензии клеток в лунки 96-луночного планшета с белыми стенками и прозрачным дном. Антитела разбавляли и титровали в 8 точках (титрования с 3-кратными разбавлениями), соответствующих концентрациям 0-20 нМ (в два раза превышающим исследуемые концентрации). Разбавленные антитела или среду (для необработанных образцов) (50 мкл/лунка) добавляли в соответст

- 35 046736 вующие лунки.

Избыток среды (200 мкл/лунка) добавляли во внешние ряды и колонки планшета для предотвращения испарения. Планшет инкубировали в течение 72 ч при 37°C.

Планшет извлекали из инкубатора и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Тем временем размораживали раствор CellTiter Glo. Планшет встряхивали и промывали 1 раз с использованием 100 мкл/лунка PBS (в случае клеток в суспензии планшет сначала центрифугировали для осаждения клеток). В каждую лунку добавляли 100 мкл/лунка PBS и 100 мкл CellTiter Glo и тщательно перемешивали с получением смеси. Планшет инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 15 мин и наблюдали посредством микроскопии, чтобы убедиться в том, что произошел эффективный лизис клеток. Затем планшет прочитывали на люминометре Glomax.

Результаты.

Результаты представлены на фиг. 3а, на которой показана субпопуляция антител, которые, как известно, связываются с LY75, что может индуцировать уничтожение клеток HT-29. Это позволяет предположить, что при том, что эти антитела могут связываться с LY75, только некоторые из них проявляют эффективность, будучи конъюгированными с DM1. Затем из субпопуляции выбирали антитела для дальнейшего анализа цитотоксической активности.

Пример 5. Эффективность моноклональных антител к LY75, конъюгированных с DM1 и конъюгированных с DM4, в отношении раковых клеток ободочной и прямой кишки.

Материалы.

CellStripper (неферментативное средство для диссоциации клеток) (MT-25-056CI) от Fisher Scientific, Пенсильвания, США.

PBS, pH 7,4 (1X) (SH30028LS) от Fisher Scientific, Пенсильвания, США.

Среда RPMI 1640 (MT-10-041-CM) от Fisher Scientific, Пенсильвания, США.

CellTiter Glo (G7572) от Promega, Висконсин, США.

Способ.

Осуществляли диссоциацию клеток с помощью Cell Stripper и подсчет их количества. 5e3 клеток/лунка центрифугировали с получением осадка (в случае клеток в суспензии можно использовать большее количество в зависимости от времени удвоения количества клеток, как, например, 10e3 клеток/лунка). Осадок ресуспендировали в культуральной среде с получением концентрации 1e5 клеток/мл.

Добавляли 50 мкл/лунка суспензии клеток в лунки 96-луночного планшета с белыми стенками и прозрачным дном. Антитела разбавляли и титровали в 8 точках (титрования с 3-кратными разбавлениями), соответствующих концентрациям 0-20 нМ (в два раза превышающим исследуемые концентрации). Разбавленные антитела или среду (для необработанных образцов) (50 мкл/лунка) добавляли в соответствующие лунки. Избыток среды (200 мкл/лунка) добавляли во внешние ряды и колонки планшета для предотвращения испарения. Планшет инкубировали в течение 72 ч при 37°C.

Планшет извлекали из инкубатора и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Тем временем размораживали раствор CellTiter Glo. Планшет встряхивали и промывали 1 раз с использованием 100 мкл/лунка PBS (в случае клеток в суспензии планшет сначала центрифугировали для осаждения клеток). В каждую лунку добавляли 100 мкл/лунка PBS и 100 мкл CellTiter Glo и тщательно перемешивали с получением смеси. Планшет инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 15 мин и наблюдали посредством микроскопии, чтобы убедиться в том, что произошел эффективный лизис клеток. Затем планшет прочитывали на люминометре Glomax.

Результаты.

На фиг. 3b показана цитотоксическая активность антител к LY75, конъюгированных с DM1 и DM4, в отношении клеток HT-29. Эти результаты демонстрируют увеличение цитотоксической активности, пропорциональное концентрации антител, по сравнению с другими антителами к LY75, конъюгированными с токсином (выбранными из примера 1).

Пример 6. Эффективность моноклональных антител к LY75, конъюгированных с DM1 и конъюгированных с DM4, в отношении линий клеток лимфомы.

Материалы.

CellStripper (неферментативное средство для диссоциации клеток) (MT-25-056CI) от Fisher Scientific, Пенсильвания, США.

PBS, pH 7,4 (1X) (SH30028LS) от Fisher Scientific, Пенсильвания, США.

Среда RPMI 1640 (MT-10-041-CM) от Fisher Scientific, Пенсильвания, США.

CellTiter Glo (G7572) от Promega, Висконсин, США.

Способ.

Осуществляли диссоциацию клеток с помощью CellStripper и подсчет их количества. 5e3 клеток/лунка центрифугировали с получением осадка (в случае клеток в суспензии можно использовать большее количество в зависимости от времени удвоения количества клеток, как, например, 10e3 клеток/лунка). Осадок ресуспендировали в культуральной среде с получением концентрации 1e5 клеток/мл.

Добавляли 50 мкл/лунка суспензии клеток в лунки 96-луночного планшета с белыми стенками и прозрачным дном. Антитела разбавляли и титровали в 8 точках (титрования с 3-кратными разбавления

- 36 046736 ми), соответствующих концентрациям 0-20 нМ (в два раза превышающим исследуемые концентрации). Разбавленные антитела или среду (для необработанных образцов) (50 мкл/лунка) добавляли в соответствующие лунки. Избыток среды (200 мкл/лунка) добавляли во внешние ряды и колонки планшета для предотвращения испарения. Планшет инкубировали в течение 72 ч при 37°C.

Планшет извлекали из инкубатора и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Тем временем размораживали раствор CellTiter Glo. Планшет встряхивали и промывали 1 раз с использованием 100 мкл/лунка PBS (в случае клеток в суспензии планшет сначала центрифугировали для осаждения клеток). В каждую лунку добавляли 100 мкл/лунка PBS и 100 мкл CellTiter Glo и тщательно перемешивали с получением смеси. Планшет инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 15 мин и наблюдали посредством микроскопии, чтобы убедиться в том, что произошел эффективный лизис клеток. Затем планшет прочитывали на люминометре Glomax.

Результаты.

На фиг. 3c показана цитотоксическая активность антител к LY75, конъюгированных с DM1 и DM4, в отношении клеток RAJI. На фиг. 3d показана цитотоксическая активность антител к LY75, конъюгированных с DM1 и DM4, в отношении клеток Namalwa. На фиг. 3e показана цитотоксическая активность антител к LY75, конъюгированных с DM1 и DM4, в отношении клеток Karpas 299. Эти результаты демонстрируют увеличение цитотоксической активности, пропорциональное концентрации антител, по сравнению с другими антителами к LY75, конъюгированными с DM1 и DM4 (выбранными из примера 1).

Пример 7. Эффективность моноклональных антител к LY75, конъюгированных с DM1 и конъюгированных с DM4, в отношении линий раковых клеток поджелудочной железы.

Материалы.

CellStripper (неферментативное средство для диссоциации клеток) (MT-25-056CI) от Fisher Scientific, Пенсильвания, США.

PBS, pH 7,4 (1X) (SH30028LS) от Fisher Scientific, Пенсильвания, США.

Среда RPMI 1640 (MT-10-041-CM) от Fisher Scientific, Пенсильвания, США.

CellTiter Glo (G7572) от Promega, Висконсин, США.

Способ.

Осуществляли диссоциацию клеток с помощью CellStripper и подсчет их количества. 5e3 клеток/лунка центрифугировали с получением осадка (в случае клеток в суспензии можно использовать большее количество в зависимости от времени удвоения количества клеток, как, например, 10e3 клеток/лунка). Осадок ресуспендировали в культуральной среде с получением концентрации 1e5 клеток/мл.

Добавляли 50 мкл/лунка суспензии клеток в лунки 96-луночного планшета с белыми стенками и прозрачным дном. Антитела разбавляли и титровали в 8 точках (титрования с 3-кратными разбавлениями), соответствующих концентрациям 0-20 нМ (в два раза превышающим исследуемые концентрации). Разбавленные антитела или среду (для необработанных образцов) (50 мкл/лунка) добавляли в соответствующие лунки. Избыток среды (200 мкл/лунка) добавляли во внешние ряды и колонки планшета для предотвращения испарения. Планшет инкубировали в течение 72 ч при 37°C.

Планшет извлекали из инкубатора и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Тем временем размораживали раствор CellTiter Glo. Планшет встряхивали и промывали 1 раз с использованием 100 мкл/лунка PBS (в случае клеток в суспензии планшет сначала центрифугировали для осаждения клеток). В каждую лунку добавляли 100 мкл/лунка PBS и 100 мкл CellTiter Glo и тщательно перемешивали с получением смеси. Планшет инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 15 мин и наблюдали посредством микроскопии, чтобы убедиться в том, что произошел эффективный лизис клеток. Затем планшет прочитывали на люминометре Glomax.

Результаты.

На фиг. 3f показана цитотоксическая активность антител к LY75, конъюгированных с DM1 и DM4, в отношении клеток BxPC3. На фиг. 3g показана цитотоксическая активность антител к LY75, конъюгированных с DM1 и DM4, в отношении клеток HupT4. На фиг. 3h показана цитотоксическая активность антител к LY75, конъюгированных с DM1 и DM4, в отношении клеток HPAFFII. Эти результаты демонстрируют увеличение цитотоксической активности, пропорциональное концентрации антител, по сравнению с другими антителами к LY75, конъюгированными с DM1 и DM4 (выбранными из примера 1).

Пример 8. Эффективность моноклональных антител к LY75, конъюгированных с DM1 и конъюгированных с DM4, в отношении линий клеток, являющихся субстратом хронического лимфоцитарного лейкоза.

Материалы.

CellStripper (неферментативное средство для диссоциации клеток) (MT-25-056CI) от Fisher Scientific, Пенсильвания, США.

PBS, pH 7,4 (1X) (SH30028LS) от Fisher Scientific, Пенсильвания, США.

Среда RPMI 1640 (MT-10-041-CM) от Fisher Scientific, Пенсильвания, США.

CellTiter Glo (G7572) от Promega, Висконсин, США.

Способ.

- 37 046736

Осуществляли диссоциацию клеток с помощью CellStripper и подсчет их количества. 5e3 клеток/лунка центрифугировали с получением осадка (в случае клеток в суспензии можно использовать большее количество в зависимости от времени удвоения количества клеток, как, например, 10e3 клеток/лунка). Осадок ресуспендировали в культуральной среде с получением концентрации 1e5 клеток/мл.

Добавляли 50 мкл/лунка суспензии клеток в лунки 96-луночного планшета с белыми стенками и прозрачным дном. Антитела разбавляли и титровали в 8 точках (титрования с 3-кратными разбавлениями), соответствующих концентрациям 0-20 нМ (в два раза превышающим исследуемые концентрации). Разбавленные антитела или среду (для необработанных образцов) (50 мкл/лунка) добавляли в соответствующие лунки. Избыток среды (200 мкл/лунка) добавляли во внешние ряды и колонки планшета для предотвращения испарения. Планшет инкубировали в течение 72 ч при 37°C.

Планшет извлекали из инкубатора и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Тем временем размораживали раствор CellTiter Glo. Планшет встряхивали и промывали 1 раз с использованием 100 мкл/лунка PBS (в случае клеток в суспензии планшет сначала центрифугировали для осаждения клеток). В каждую лунку добавляли 100 мкл/лунка PBS и 100 мкл CellTiter Glo и тщательно перемешивали с получением смеси. Планшет инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 15 мин и наблюдали посредством микроскопии, чтобы убедиться в том, что произошел эффективный лизис клеток. Затем планшет прочитывали на люминометре Glomax.

Результаты.

На фиг. 3i показана цитотоксическая активность антител к LY75, конъюгированных с DM1 и DM4, в отношении клеток EHEB. На фиг. 3j показана цитотоксическая активность антител к LY75, конъюгированных с DM1 и DM4, в отношении клеток Mec-1. Эти результаты демонстрируют увеличение цитотоксической активности, пропорциональное концентрации антител, по сравнению с другими антителами к LY75, конъюгированными с DM1 и DM4 (выбранными из примера 1).

Пример 9. Эффективность моноклональных антител к LY75, конъюгированных с DM1 и конъюгированных с DM4, в отношении линий клеток, являющихся субстратом острого моноцитарного лейкоза.

Материалы.

CellStripper (неферментативное средство для диссоциации клеток) (MT-25-056CI) от Fisher Scientific, Пенсильвания, США.

PBS, pH 7,4 (1X) (SH30028LS) от Fisher Scientific, Пенсильвания, США.

Среда RPMI 1640 (MT-10-041-CM) от Fisher Scientific, Пенсильвания, США.

CellTiter Glo (G7572) от Promega, Висконсин, США.

Способ.

Осуществляли диссоциацию клеток с помощью CellStripper и подсчет их количества. 5e3 клеток/лунка центрифугировали с получением осадка (в случае клеток в суспензии можно использовать большее количество в зависимости от времени удвоения количества клеток, как, например, 10e3 клеток/лунка). Осадок ресуспендировали в культуральной среде с получением концентрации 1e5 клеток/мл.

Добавляли 50 мкл/лунка суспензии клеток в лунки 96-луночного планшета с белыми стенками и прозрачным дном. Антитела разбавляли и титровали в 8 точках (титрования с 3-кратными разбавлениями), соответствующих концентрациям 0-20 нМ (в два раза превышающим исследуемые концентрации). Разбавленные антитела или среду (для необработанных образцов) (50 мкл/лунка) добавляли в соответствующие лунки. Избыток среды (200 мкл/лунка) добавляли во внешние ряды и колонки планшета для предотвращения испарения. Планшет инкубировали в течение 72 ч при 37°C.

Планшет извлекали из инкубатора и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Тем временем размораживали раствор CellTiter Glo. Планшет встряхивали и промывали 1 раз с использованием 100 мкл/лунка PBS (в случае клеток в суспензии планшет сначала центрифугировали для осаждения клеток). В каждую лунку добавляли 100 мкл/лунка PBS и 100 мкл CellTiter Glo и тщательно перемешивали с получением смеси. Планшет инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 15 мин и наблюдали посредством микроскопии, чтобы убедиться в том, что произошел эффективный лизис клеток. Затем планшет прочитывали на люминометре Glomax.

Результаты.

На фиг. 3k показана цитотоксическая активность антител к LY75, конъюгированных с DM1 и DM4, в отношении клеток AML-193. Эти результаты демонстрируют увеличение цитотоксической активности, пропорциональное концентрации антител, по сравнению с другими антителами к LY75, конъюгированными с DM1 и DM4 (выбранными из примера 1).

Пример 10. Эффективность моноклональных антител к LY75, конъюгированных с DM1 и конъюгированных с DM4, в отношении линий раковых клеток молочной железы.

Материалы.

CellStripper (неферментативное средство для диссоциации клеток) (MT-25-056CI) от Fisher Scientific, Пенсильвания, США.

PBS, pH 7,4 (1X) (SH30028LS) от Fisher Scientific, Пенсильвания, США.

Среда RPMI 1640 (MT-10-041-CM) от Fisher Scientific, Пенсильвания, США.

CellTiter Glo (G7572) от Promega, Висконсин, США.

- 38 046736

Способ.

Осуществляли диссоциацию клеток с помощью Cell Stripper и подсчет их количества. 5e3 клеток/лунка центрифугировали с получением осадка (в случае клеток в суспензии можно использовать большее количество в зависимости от времени удвоения количества клеток, как, например, 10e3 клеток/лунка). Осадок ресуспендировали в культуральной среде с получением концентрации 1e5 клеток/мл.

Добавляли 50 мкл/лунка суспензии клеток в лунки 96-луночного планшета с белыми стенками и прозрачным дном. Антитела разбавляли и титровали в 8 точках (титрования с 3-кратными разбавлениями), соответствующих концентрациям 0-20 нМ (в два раза превышающим исследуемые концентрации). Разбавленные антитела или среду (для необработанных образцов) (50 мкл/лунка) добавляли в соответствующие лунки. Избыток среды (200 мкл/лунка) добавляли во внешние ряды и колонки планшета для предотвращения испарения. Планшет инкубировали в течение 72 ч при 37°C.

Планшет извлекали из инкубатора и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Тем временем размораживали раствор CellTiter Glo. Планшет встряхивали и промывали 1 раз с использованием 100 мкл/лунка PBS (в случае клеток в суспензии планшет сначала центрифугировали для осаждения клеток). В каждую лунку добавляли 100 мкл/лунка PBS и 100 мкл CellTiter Glo и тщательно перемешивали с получением смеси. Планшет инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 15 мин и наблюдали посредством микроскопии, чтобы убедиться в том, что произошел эффективный лизис клеток. Затем планшет прочитывали на люминометре Glomax.

Результаты.

На фиг. 3l показана цитотоксическая активность антител к LY75, конъюгированных с DM1 и DM4, в отношении клеток HCC 70 (ER-отрицательных, PR-отрицательных и Her2-отрицательных). На фиг. 3m показана цитотоксическая активность антител к LY75, конъюгированных с DM1 и DM4, в отношении клеток HCC 1806 (ER-отрицательных, PR-отрицательных и Her2-отрицательных). На фиг. 3n показана цитотоксическая активность антител к LY75, конъюгированных с DM1 и DM4, в отношении клеток MDA-MB-468. Эти результаты демонстрируют увеличение цитотоксической активности, пропорциональное концентрации антител.

Пример 11. Эффективность моноклональных антител к LY75, конъюгированных с DM1 и конъюгированных с DM4, в отношении линий раковых клеток мочевого пузыря.

Материалы.

CellStripper (неферментативное средство для диссоциации клеток) (MT-25-056CI) от Fisher Scientific, Пенсильвания, США.

PBS, pH 7,4 (1X) (SH30028LS) от Fisher Scientific, Пенсильвания, США.

Среда RPMI 1640 (MT-10-041-CM) от Fisher Scientific, Пенсильвания, США.

CellTiter Glo (G7572) от Promega, Висконсин, США.

Способ.

Осуществляли диссоциацию клеток с помощью CellStripper и подсчет их количества. 5e3 клеток/лунка центрифугировали с получением осадка (в случае клеток в суспензии можно использовать большее количество в зависимости от времени удвоения количества клеток, как, например, 10e3 клеток/лунка). Осадок ресуспендировали в культуральной среде с получением концентрации 1e5 клеток/мл.

Добавляли 50 мкл/лунка суспензии клеток в лунки 96-луночного планшета с белыми стенками и прозрачным дном. Антитела разбавляли и титровали в 8 точках (титрования с 3-кратными разбавлениями), соответствующих концентрациям 0-20 нМ (в два раза превышающим исследуемые концентрации). Разбавленные антитела или среду (для необработанных образцов) (50 мкл/лунка) добавляли в соответствующие лунки. Избыток среды (200 мкл/лунка) добавляли во внешние ряды и колонки планшета для предотвращения испарения. Планшет инкубировали в течение 72 ч при 37°C.

Планшет извлекали из инкубатора и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Тем временем размораживали раствор CellTiter Glo. Планшет встряхивали и промывали 1 раз с использованием 100 мкл/лунка PBS (в случае клеток в суспензии планшет сначала центрифугировали для осаждения клеток). В каждую лунку добавляли 100 мкл/лунка PBS и 100 мкл CellTiter Glo и тщательно перемешивали с получением смеси. Планшет инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 15 мин и наблюдали посредством микроскопии, чтобы убедиться в том, что произошел эффективный лизис клеток. Затем планшет прочитывали на люминометре Glomax.

Результаты.

На фиг. 3o показана цитотоксическая активность антител к LY75, конъюгированных с DM1 и DM4, в отношении клеток RT4. На фиг. 3p показана цитотоксическая активность антител к LY75, конъюгированных с DM1 и DM4, в отношении клеток 5637. На фиг. 3q показана цитотоксическая активность антител к LY75, конъюгированных с DM1 и DM4, в отношении клеток SW780. Эти результаты демонстрируют увеличение цитотоксической активности, пропорциональное концентрации антител.

Пример 12. Эффективность моноклональных антител к LY75, конъюгированных с DM1 и конъюгированных с DM4, в отношении линий клеток рака головы и шеи.

Материалы.

CellStripper (неферментативное средство для диссоциации клеток) (MT-25-056CI) от Fisher

- 39 046736

Scientific, Пенсильвания, США.

PBS, pH 7,4 (1X) (SH30028LS) от Fisher Scientific, Пенсильвания, США.

Среда RPMI 1640 (MT-10-041-CM) от Fisher Scientific, Пенсильвания, США.

CellTiter Glo (G7572) от Promega, Висконсин, США.

Способ.

Осуществляли диссоциацию клеток с помощью CellStripper и подсчет их количества. 5e3 клеток/лунка центрифугировали с получением осадка (в случае клеток в суспензии можно использовать большее количество в зависимости от времени удвоения количества клеток, как, например, 10e3 клеток/лунка). Осадок ресуспендировали в культуральной среде с получением концентрации 1e5 клеток/мл.

Добавляли 50 мкл/лунка суспензии клеток в лунки 96-луночного планшета с белыми стенками и прозрачным дном. Антитела разбавляли и титровали в 8 точках (титрования с 3-кратными разбавлениями), соответствующих концентрациям 0-20 нМ (в два раза превышающим исследуемые концентрации). Разбавленные антитела или среду (для необработанных образцов) (50 мкл/лунка) добавляли в соответствующие лунки. Избыток среды (200 мкл/лунка) добавляли во внешние ряды и колонки планшета для предотвращения испарения. Планшет инкубировали в течение 72 ч при 37°C.

Планшет извлекали из инкубатора и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Тем временем размораживали раствор CellTiter Glo. Планшет встряхивали и промывали 1 раз с использованием 100 мкл/лунка PBS (в случае клеток в суспензии планшет сначала центрифугировали для осаждения клеток). В каждую лунку добавляли 100 мкл/лунка PBS и 100 мкл CellTiter Glo и тщательно перемешивали с получением смеси. Планшет инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 15 мин и наблюдали посредством микроскопии, чтобы убедиться в том, что произошел эффективный лизис клеток. Затем планшет прочитывали на люминометре Glomax.

Результаты.

На фиг. 3r показана цитотоксическая активность антител к LY75, конъюгированных с DM1 и DM4, в отношении клеток SCC-9. Эти результаты демонстрируют увеличение цитотоксической активности, пропорциональное концентрации антител.

Пример 13. Эффективность моноклональных антител к LY75, конъюгированных с DM1 и конъюгированных с DM4, в отношении линий раковых клеток пищевода.

Материалы.

CellStripper (неферментативное средство для диссоциации клеток) (MT-25-056CI) от Fisher Scientific, Пенсильвания, США.

PBS, pH 7,4 (1X) (SH30028LS) от Fisher Scientific, Пенсильвания, США.

Среда RPMI 1640 (MT-10-041-CM) от Fisher Scientific, Пенсильвания, США.

CellTiter Glo (G7572) от Promega, Висконсин, США.

Способ.

Осуществляли диссоциацию клеток с помощью Cell Stripper и подсчет их количества. 5e3 клеток/лунка центрифугировали с получением осадка (в случае клеток в суспензии можно использовать большее количество в зависимости от времени удвоения количества клеток, как, например, 10e3 клеток/лунка). Осадок ресуспендировали в культуральной среде с получением концентрации 1e5 клеток/мл.

Добавляли 50 мкл/лунка суспензии клеток в лунки 96-луночного планшета с белыми стенками и прозрачным дном. Антитела разбавляли и титровали в 8 точках (титрования с 3-кратными разбавлениями), соответствующих концентрациям 0-20 нМ (в два раза превышающим исследуемые концентрации). Разбавленные антитела или среду (для необработанных образцов) (50 мкл/лунка) добавляли в соответствующие лунки. Избыток среды (200 мкл/лунка) добавляли во внешние ряды и колонки планшета для предотвращения испарения. Планшет инкубировали в течение 72 ч при 37°C.

Планшет извлекали из инкубатора и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Тем временем размораживали раствор CellTiter Glo. Планшет встряхивали и промывали 1 раз с использованием 100 мкл/лунка PBS (в случае клеток в суспензии планшет сначала центрифугировали для осаждения клеток). В каждую лунку добавляли 100 мкл/лунка PBS и 100 мкл CellTiter Glo и тщательно перемешивали с получением смеси. Планшет инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 15 мин и наблюдали посредством микроскопии, чтобы убедиться в том, что произошел эффективный лизис клеток. Затем планшет прочитывали на люминометре Glomax.

Результаты.

На фиг. 3s показана цитотоксическая активность антител к LY75, конъюгированных с DM1 и DM4, в отношении клеток OE 19. Эти результаты демонстрируют увеличение цитотоксической активности, пропорциональное концентрации антител.

Пример 14. Эффективность моноклональных антител к LY75, конъюгированных с DM1 и конъюгированных с DM4, в отношении линий раковых клеток яичника.

Материалы.

CellStripper (неферментативное средство для диссоциации клеток) (MT-25-056CI) от Fisher Scientific, Пенсильвания, США.

PBS, pH 7,4 (1X) (SH30028LS) от Fisher Scientific, Пенсильвания, США.

- 40 046736

Среда RPMI 1640 (MT-10-041-CM) от Fisher Scientific, Пенсильвания, США.

CellTiter Glo (G7572) от Promega, Висконсин, США.

Способ.

Осуществляли диссоциацию клеток с помощью CellStripper и подсчет их количества. 5e3 клеток/лунка центрифугировали с получением осадка (в случае клеток в суспензии можно использовать большее количество в зависимости от времени удвоения количества клеток, как, например, 10e3 клеток/лунка). Осадок ресуспендировали в культуральной среде с получением концентрации 1e5 клеток/мл.

Добавляли 50 мкл/лунка суспензии клеток в лунки 96-луночного планшета с белыми боками и прозрачным дном. Антитела разбавляли и титровали в 8 точках (титрования с 3-кратными разбавлениями), соответствующих концентрациям 0-20 нМ (в два раза превышающим исследуемые концентрации). Разбавленные антитела или среду (для необработанных образцов) (50 мкл/лунка) добавляли в соответствующие лунки. Избыток среды (200 мкл/лунка) добавляли во внешние ряды и колонки планшета для предотвращения испарения. Планшет инкубировали в течение 72 ч при 37°C.

Планшет извлекали из инкубатора и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Тем временем размораживали раствор CellTiter Glo. Планшет встряхивали и промывали 1 раз с использованием 100 мкл/лунка PBS (в случае клеток в суспензии планшет сначала центрифугировали для осаждения клеток). В каждую лунку добавляли 100 мкл/лунка PBS и 100 мкл CellTiter Glo и тщательно перемешивали с получением смеси. Планшет инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 15 мин и наблюдали посредством микроскопии, чтобы убедиться в том, что произошел эффективный лизис клеток. Затем планшет прочитывали на люминометре Glomax.

Результаты.

На фиг. 3t показана цитотоксическая активность антител к LY75, конъюгированных с DM1 и DM4, в отношении клеток OVCAR-3. На фиг. 3u показана цитотоксическая активность антител к LY75, конъюгированных с DM1 и DM4, в отношении клеток SK-OV-3. Эти результаты демонстрируют увеличение цитотоксической активности, пропорциональное концентрации антител.

Пример 15. Эффективность моноклональных антител к LY75, конъюгированных с DM1 и конъюгированных с DM4, в отношении линий клеток множественной миеломы.

Материалы.

CellStripper (неферментативное средство для диссоциации клеток) (MT-25-056CI) от Fisher Scientific, Пенсильвания, США.

PBS, pH 7,4 (1X) (SH30028LS) от Fisher Scientific, Пенсильвания, США.

Среда RPMI 1640 (MT-10-041-CM) от Fisher Scientific, Пенсильвания, США.

CellTiter Glo (G7572) от Promega, Висконсин, США.

Способ.

Осуществляли диссоциацию клеток с помощью CellStripper и подсчет их количества. 5e3 клеток/лунка центрифугировали с получением осадка (в случае клеток в суспензии можно использовать большее количество в зависимости от времени удвоения количества клеток, как, например, 10e3 клеток/лунка). Осадок ресуспендировали в культуральной среде с получением концентрации 1e5 клеток/мл.

Добавляли 50 мкл/лунка суспензии клеток в лунки 96-луночного планшета с белыми боками и прозрачным дном. Антитела разбавляли и титровали в 8 точках (титрования с 3-кратными разбавлениями), соответствующих концентрациям 0-20 нМ (в два раза превышающим исследуемые концентрации). Разбавленные антитела или среду (для необработанных образцов) (50 мкл/лунка) добавляли в соответствующие лунки.

Избыток среды (200 мкл/лунка) добавляли во внешние ряды и колонки планшета для предотвращения испарения. Планшет инкубировали в течение 72 ч при 37°C.

Планшет извлекали из инкубатора и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Тем временем размораживали раствор CellTiter Glo. Планшет встряхивали и промывали 1x с помощью 100 мкл/лунка PBS (для суспендированных клеток планшет сперва центрифугировали для осаждения клеток). Добавляли 100 мкл/лунка PBS и 100 мкл клеточного титра Glo в каждую лунку и растирали до перемешивания. Планшет инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 15 мин и наблюдали посредством микроскопии, чтобы убедиться в том, что произошел эффективный лизис клеток. Затем планшет прочитывали на люминометре Glomax.

Результаты.

На фиг. 3v показана цитотоксическая активность антител к LY75, конъюгированных с DM1 и DM4, в отношении клеток MOLP-8. На фиг. 3w показана цитотоксическая активность антител к LY75, конъюгированных с DM1 и DM4, в отношении клеток RPMI8226. Эти результаты демонстрируют увеличение цитотоксической активности, пропорциональное концентрации антител.

Пример 16. Эффективность моноклональных антител к LY75, конъюгированных с DM1 и конъюгированных с DM4, в ксенотрансплантатных моделях Raji.

Эффективность LY75_DM1 и LY75_DM4 исследовали в ксенотрансплантатной модели с подкожным введением мышам с SCID клеток Raji лимфомы Беркитта.

Иммунодефицитным мышам с SCID подкожно инокулировали опухолевые клетки Raji (лимфомы

- 41 046736

Беркитта человека). Опухолям давали возможность сформироваться, и мышей распределяли в пять групп обработки по 3-6 мышей на группу. Когда среднее значение объема опухоли достигало среднего показателя 129-132 мм³ на группу, каждую группу обрабатывали одним из следующих соединений, вводимых внутривенно при указанных дозах: группа 1 (наполнитель; фосфатно-солевой буферный раствор (PBS)); группа 2 (LY75_DM1; 10 мг/кг), группа 3 (изотипический контроль-DMI; 10 мг/кг), группа 4 (LY75_DM4; 5 мг/кг), группа 5 (изотипический контроль-SPBDDM4; 5 мг/кг). Вторую дозу вводили спустя одну неделю. Отслеживали значения массы тела (BW), мышей часто осматривали для определения состояния здоровья и нежелательных побочных эффектов, и опухоли измеряли два раза в неделю. Мышей подвергали эвтаназии, когда их опухоли достигали конечной точки объема опухоли 2000 мм³ или через 60 дней, в зависимости от того, что происходило первым. Эффективность определяли, исходя из задержки роста опухоли (TGD), увеличения медианного значения времени до достижения конечной точки (TTE) и исходя из анализа с помощью логарифмического рангового критерия различий по кривым выживаемости Каплана-Мейера для мышей, обработанных ADC, по сравнению с мышами, обработанными PBS. У первых пяти контрольных мышей, обработанных наполнителем, у которых была достигнута конечная точка, отбирали образцы опухолей, которые обрабатывали путем фиксации в формалине и заливки парафином.

Результаты.

На фиг. 4a показано, что каждый из LY75_DM1 и LY75_DM4 продемонстрировал значительную противоопухолевую активность и значительно пролонгированное выживание в ксенотрансплантатной модели лимфомы Беркитта из клеток Raji на мышах с SCID по сравнению с контролями; тем не менее, дозы 5 мг/кг LY75_DM4 были значительно более эффективными, чем дозы 10 мг/кг LY75_DM1, в результате чего у 5 из 6 мышей наблюдалась полная, но временная регрессия опухоли. Все обработки были хорошо переносимыми, и не наблюдались клинические признаки токсичности. Эти данные позволяют предположить, что ADC, направленные на LY75, например, LY75_DM1 и LY75_DM4, могут обеспечивать клинически благоприятный эффект при лечении раковых пациентов-людей с неходжкинской лимфомой.

Пример 17. Эффективность моноклональных антител к LY75, конъюгированных с DM1 и конъюгированных с DM4, в ксенотрансплантатных моделях Namalwa.

Эффективность LY75_DM1 и LY75_DM4 исследовали в ксенотрансплантатной модели с подкожным введением мышам с SCID клеток Namalwa лимфомы Беркитта.

Иммунодефицитным мышам с SCID подкожно инокулировали опухолевые клетки Namalwa (лимфомы Беркитта человека). Опухолям давали возможность сформироваться, и мышей распределяли в пять групп обработки по 6 мышей на группу. Когда среднее значение объема опухоли достигало среднего показателя 114 мм³ на группу, каждую группу обрабатывали одним из следующих соединений, вводимых внутривенно при указанных дозах: группа 1 (наполнитель; фосфатно-солевой буферный раствор (PBS)); группа 2 (LY75_DM1; 10 мг/кг), группа 3 (изотипический контроль-DMI; 10 мг/кг), группа 4 (LY75_DM4; 5 мг/кг), группа 5 (изотипический контроль-SPBDDM4; 5 мг/кг). Отслеживали значения массы тела (BW), мышей часто осматривали для определения состояния здоровья и нежелательных побочных эффектов, и опухоли измеряли два раза в неделю. Мышей подвергали эвтаназии, когда их опухоли достигали конечной точки объема опухоли 2000 мм³ или через 60 дней, в зависимости от того, что происходило первым. Эффективность определяли, исходя из задержки роста опухоли (TGD), увеличения медианного значения времени до достижения конечной точки (TTE) и исходя из анализа с помощью логарифмического рангового критерия различий по кривым выживаемости Каплана-Мейера для мышей, обработанных ADC, по сравнению с мышами, обработанными PBS. У первых пяти контрольных мышей, обработанных наполнителем, у которых была достигнута конечная точка, отбирали образцы опухолей, которые обрабатывали путем фиксации в формалине и заливки парафином.

Результаты.

На фиг. 4b показано, что каждый из LY75_DM1 и LY75_DM4 продемонстрировал значительную противоопухолевую активность и пролонгирование выживания в ксенотрансплантатной модели лимфомы Беркитта из клеток Namalwa на мышах с SCID по сравнению с контролями; тем не менее, доза 5 мг/кг LY75_DM4 была значительно более эффективной, чем доза 10 мг/кг LY75_DM1, вызывая кратковременное уменьшение объема опухоли. Все обработки были хорошо переносимыми, и не наблюдались клинические признаки токсичности. Эти данные позволяют предположить, что ADC, направленные на LY75, например, LY75_DM1 и LY75_DM4, могут обеспечивать клинически благоприятный эффект при лечении раковых пациентов-людей с неходжкинской лимфомой.

Пример 18. Эффективность моноклональных антител к LY75, конъюгированных с DM1 и конъюгированных с DM4, в ксенотрансплантатных моделях рака поджелудочной железы.

Эффективность LY75_DM1 и LY75_DM4 исследовали в ксенотрансплантатной модели с подкожным введением бестимусным голым мышам клеток HPAFII аденокарциномы поджелудочной железы.

Иммунодефицитным бестимусным голым мышам подкожно инокулировали опухолевые клетки HPAFII (аденокарциномы поджелудочной железы человека). Опухолям давали возможность сформироваться, и мышей распределяли в пять групп обработки по 6 мышей на группу. Когда среднее значение

- 42 046736 объема опухоли достигало среднего показателя ~114 мм³ на группу, каждую группу обрабатывали одним из следующих соединений, вводимых внутривенно при указанных дозах: группа 1 (наполнитель; фосфатно-солевой буферный раствор (PBS)); группа 2 (LY75_DM1; 10 мг/кг), группа 3 (изотипический контроль-DMI; 10 мг/кг), группа 4 (LY75_DM4; 5 мг/кг), группа 5 (изотипический контроль-SPBDDM4; 5 мг/кг). Отслеживали значения массы тела (BW), мышей часто осматривали для определения состояния здоровья и нежелательных побочных эффектов, и опухоли измеряли три раза в неделю. Мышей подвергали эвтаназии, когда их опухоли достигали конечной точки объема опухоли 2000 мм³ или через 90 дней, в зависимости от того, что происходило первым. Эффективность определяли, исходя из эффекта обработки в отношении объема опухоли и исходя из анализа с помощью логарифмического рангового критерия различий по кривым выживаемости Каплана-Мейера для мышей, обработанных ADC, по сравнению с мышами, обработанными PBS. Отбирали образцы опухолей у контрольных мышей, обработанных наполнителем, и обрабатывали путем фиксации в формалине и заливки парафином.

Результаты.

На фиг. 4c показано, что LY75_DM1 и LY75_DM4 проявляли значительную и сходную по силе противоопухолевую активность, и при этом наблюдалось пролонгирование выживания в ксенотрансплантатной модели HPAFII на голых мышах по сравнению с контролями. Все обработки были хорошо переносимыми, и не наблюдались клинические признаки токсичности. Эти данные позволяют предположить, что ADC, направленные на LY75, например, LY75_DM1 и LY75_DM4, могут обеспечивать клинически благоприятный эффект при лечении пациентов-людей с раком поджелудочной железы.

Пример 19. Эффективность моноклональных антител к LY75, конъюгированных с DM1 и конъюгированных с DM4, в ксенотрансплантатных моделях рака мочевого пузыря.

Эффективность LY75_DM1 и LY75_DM4 исследовали в ксенотрансплантатной модели с подкожным введением мышам с SCID клеток SW780 карциномы мочевого пузыря человека.

Иммунодефицитным бестимусным голым мышам подкожно инокулировали опухолевые клетки HPAFII (аденокарциномы поджелудочной железы человека). Опухолям давали возможность сформироваться, и мышей распределяли в пять групп обработки по 6 мышей на группу. Когда среднее значение объема опухоли достигало среднего показателя ~114 мм³ на группу, каждую группу обрабатывали одним из следующих соединений, вводимых внутривенно при указанных дозах: группа 1 (наполнитель; фосфатно-солевой буферный раствор (PBS)); группа 2 (LY75_DM1; 1 мг/кг), группа 3 (LY75_DM1; 2,5 мг/кг), группа 4 (LY75_DM1; 5 мг/кг), группа 5 (LY75_DM4; 1 мг/кг)), группа 6 (LY75_DM4; 2,5 мг/кг)), группа 7 (LY75_DM4; 5 мг/кг)), группа 8 (изотипический контроль-SPBDDM4; 5 мг/кг). Отслеживали значения массы тела (BW), мышей часто осматривали для определения состояния здоровья и нежелательных побочных эффектов, и опухоли измеряли три раза в неделю. Мышей подвергали эвтаназии, когда их опухоли достигали конечной точки объема опухоли 2000 мм³ или через 90 дней, в зависимости от того, что происходило первым. Эффективность определяли, исходя из эффекта обработки в отношении объема опухоли и исходя из анализа с помощью логарифмического рангового критерия различий по кривым выживаемости Каплана-Мейера для мышей, обработанных ADC, по сравнению с мышами, обработанными PBS. Отбирали образцы опухолей у контрольных мышей, обработанных наполнителем, и обрабатывали путем фиксации в формалине и заливки парафином.

Результаты.

На фиг. 4d показано, что LY75_DM1 и LY75_DM4 проявляли значительную и сходную по силе противоопухолевую активность, и при этом наблюдалось пролонгирование выживания в ксенотрансплантатной модели SW780 на голых мышах по сравнению с контролями. Все обработки были хорошо переносимыми, и не наблюдались клинические признаки токсичности. Эти данные позволяют предположить, что ADC, направленные на LY75, например, LY75_DM1 и LY75_DM4, могут обеспечивать клинически благоприятный эффект при лечении пациентов-людей с раком мочевого пузыря.

Пример 20. Эффективность моноклональных антител к LY75, конъюгированных с DM1 и конъюгированных с DM4, в ксенотрансплантатных моделях рака молочной железы.

Эффективность LY75_DM1 и LY75_DM4 исследовали в ксенотрансплантатной модели с подкожным введением бестимусным голым мышам клеток MDA-MB-468.

Иммунодефицитным бестимусным голым мышам подкожно инокулировали опухолевые клетки MDA-MB-468 (трижды негативной аденокарциномы молочной железы человека). Опухолям давали возможность сформироваться, и мышей распределяли в семь групп обработки по 10 мышей на группу. Когда среднее значение объема опухоли достигало среднего показателя 167 мм³ на группу, каждую группу обрабатывали одним из следующих соединений, вводимых внутривенно при указанных дозах: группа 1 (наполнитель; 20 мМ сукцинат натрия, pH 5,0, 6% трегалоза, 0,04% полисорбат); группа 2 (LY75_DM1; 5 мг/кг), группа 3 (LY75_DM1; 10 мг/кг), группа 4 (LY75_DM4; 5 мг/кг), группа 5 (LY75_DM4; 2,5 мг/кг), группа 6 (LY75_DM4; 1 мг/кг), группа 7 (изотипический контроль-DM4; 5 мг/кг). Отслеживали значения массы тела (BW), мышей часто осматривали для определения состояния здоровья и нежелательных побочных эффектов, и опухоли измеряли два раза в неделю. Мышей подвергали эвтаназии через 82 дня после инокуляции опухоли. Эффективность определяли, исходя из противоопухолевой активности (среднее значение размера опухоли в группе обработки/среднее значение размера опухоли в контрольной

- 43 046736 группе х 100) и увеличения среднего значения времени до достижения конечной точки (TTE) у мышей, обработанных ADC, по сравнению с мышами, обработанными PBS. Отбирали образцы пяти самых больших опухолей от контрольных мышей, обработанных наполнителем, в день 71 после инокуляции и обрабатывали путем фиксации в формалине и заливки парафином.

Результаты.

На фиг. 4e показано, что каждый из LY75_DM1 и LY75_DM4 демонстрировал существенную противоопухолевую активность в ксенотрансплантатной модели MDA-MB-468 на голых мышах по сравнению с контролями. При использовании LY75_DM4 наблюдали зависимую от дозы активность, при этом 2,5 и 5 мг/кг характеризовались намного более сильным эффектом, чем 1 мг/кг. При 5 мг/кг LY75_DM1 и LY75_DM4 характеризовались сходной эффективностью. Длительные регрессии среднего объема опухоли наблюдали в случае LY75_DM1 при 10 и 5 мг/кг и LY75_DM4 при 5 и 2,5 мг/кг. Все обработки были хорошо переносимыми, и не наблюдались клинические признаки токсичности. Эти данные позволяют предположить, что ADC, направленные на LY75, например, LY75_DM1 и LY75_DM4, могут обеспечивать клиническую пользу при лечении пациентов-людей с трижды негативным раком молочной железы.

Пример 21. Эффективность моноклональных антител к LY75, конъюгированных с DM1 и конъюгированных с DM4, в ксенотрансплантатных моделях рака ободочной и прямой кишки.

Эффективность LY75_DM1 и LY75_DM4 исследовали в ксенотрансплантатной модели с подкожным введением бестимусным голым мышам клеток COLO205 аденокарциномы ободочной и прямой кишки.

Иммунодефицитным бестимусным голым мышам подкожно инокулировали опухолевые клетки COLO205 (аденокарциномы ободочной и прямой кишки человека). Опухолям давали возможность сформироваться, и мышей распределяли в пять групп обработки по 6 мышей на группу. Когда среднее значение объема опухоли достигало среднего показателя 117 мм³ на группу, каждую группу обрабатывали одним из следующих соединений, вводимых внутривенно при указанных дозах: группа 1 (наполнитель; фосфатно-солевой буферный раствор (PBS)); группа 2 (LY75_DM1; 10 мг/кг), группа 3 (изотипический контроль-DMI; 10 мг/кг), группа 4 (LY75_DM4; 5 мг/кг), группа 5 (изотипический контроль-ЭМ4; 5 мг/кг). Вторую дозу вводили через двенадцать дней после первой. Отслеживали значения массы тела (BW), мышей часто осматривали для определения состояния здоровья и нежелательных побочных эффектов, и опухоли измеряли два раза в неделю. Мышей подвергали эвтаназии, когда их опухоли достигали конечной точки объема опухоли 1000 мм³ или через 60 дней, в зависимости от того, что происходило первым. Эффективность определяли, исходя из задержки роста опухоли (TGD), увеличения медианного значения времени до достижения конечной точки (TTE) и исходя из анализа с помощью логарифмического рангового критерия различий по кривым выживаемости Каплана-Мейера для мышей, обработанных ADC, по сравнению с мышами, обработанными PBS. У первых пяти контрольных мышей, которых обрабатывали носителем, для достижения конечной точки брали образцы опухолей, которые были обработаны фиксацией формалином и залиты парафином.

Результаты.

На фиг. 4f показано, что LY75_DM1 и LY75_DM4 демонстрировали сходную умеренную противоопухолевую активность и пролонгирование выживания в ксенотрансплантатной модели аденокарциномы ободочной и прямой кишки из клеток COLO205 на голых мышах по сравнению с контролями. Все обработки были хорошо переносимыми, и не наблюдались клинические признаки токсичности. Эти данные позволяют предположить, что ADC, направленные на LY75, например, LY75_DM1 и LY75_DM4, могут обеспечивать клиническую пользу при лечении пациентов-людей с раком ободочной и прямой кишки.

Пример 22. Токсичность моноклональных антител к LY75, конъюгированных с DM1 и конъюгированных с DM4, в отношении макак-крабоедов.

Шесть самцов обезьян распределяли в исследовании по 2 обезьяны/группа. Наполнитель (PBS), LY75_DM4 (расщепляемый) или LY75_DM1 (нерасщепляемый) вводили два раза (в день 1 и день 29) посредством внутривенной инфузии продолжительностью 15 мин при 0 мг/кг/доза (PBS, наполнитель), 5 мг/кг/доза (LY75_DM4, расщепляемый) или 10 мг/кг/доза (LY75_DM1, нерасщепляемый). Отбирали образцы крови для токсикокинетических исследований перед началом введения доз (день 1) и через 1, 2, 3, 7, 14, 21 и 28 дней после каждой дозы. Отбирали образцы крови для клинико-патологических анализов перед началом введения доз (день 1) и через 1, 3, 7, 14, 21 и 28 дней после каждой дозы (момент времени 28 дней после 1-й дозы также использовали в качестве момента времени перед введением дозы для 2-й дозы). Всех исследуемых животных подвергали эвтаназии, и проводили вскрытие после последнего забора крови в день 57. Выделяли плазму крови, отделенную из каждого образца крови, замораживали и транспортировали в Oxford BioTherapeutics, Inc. для анализа в отношении концентрации ADC с помощью ELISA.

Наблюдаемые клинико-патологические проявления, связанные с обработкой, включали слабовыраженную регенеративную анемию и временные уменьшения количества клеток лейкоцитарного профиля крови, наиболее существенные для количества нейтрофилов. Анемию наблюдали как у животных, обработанных 5 мг/кг LY75_DM4, так и у одного из двух животных, обработанных 10 мг/кг LY75_DM1. Тяжелую нейтропению с максимальным снижением количества нейтрофилов через одну неделю после вве

- 44 046736 дения дозы и быстрое восстановление их количества наблюдали у всех животных; при этом максимальное снижение абсолютного количества нейтрофилов было меньшим у животных, обработанных LY75_DM4. He наблюдали эффектов в отношении параметров коагуляции APTT и PT, связанных с исследуемым препаратом. Изменения химического состава сыворотки крови включали временное повышение уровня AST, CK, LDH (у 1 из 2 животных в каждой группе обработки) и глобулина после введения 5 мг/кг LY75_DM4 и 10 мг/кг LY75_DM1. Кроме того, наблюдали временное повышение уровня фермента ALT, специфичного для печени, только у животных, обработанных LY75_DM4. Небольшая продолжительность и/или величина повышений параметров химического состава сыворотки крови позволяли предположить, что они не относились к нежелательным явлениям. При анализе мочи отсутствовали наблюдаемые проявления, связанные с исследуемым препаратом. В ходе обследования при вскрытии после 4-недельного периода восстановления отсутствовали наблюдаемые макропатологические проявления, связанные с обработкой, или изменения абсолютных и относительных значений массы органов. Наблюдаемые гистопатологические проявления только для щитовидной железы (изменение морфологических характеристик коллоидного содержимого в фолликулах) и почки (расширенные канальцы во внешнем слое коркового вещества) классифицировали как характеризующиеся минимальной тяжестью; не связанные с изменениями других исследуемых параметров; а также не относящиеся к нежелательным явлениям и имеющие минимальную токсикологическую значимость. Заключение. Обработка повторными дозами при двух дозах - 5 мг/кг LY75_DM4 или 10 мг/кг LY75_DM1 хорошо переносилась макакамикрабоедами. Все наблюдаемые проявления токсичности, связанной с обработкой, были обратимыми после 4-недельного периода восстановления.

Пример 23. Установление характеристик эпитопа для LY75 A1 с помощью анализа конкурентного связывания с использованием сортировки клеток с активированной флуоресценцией (FACS).

Способ.

Клетки COLO205 (ATCC, № в каталоге CCL-222) отделяли от матрасов для тканевых культур с помощью CellStripper (Cellgro, № в каталоге MT-25-056CI). Клетки промывали и ресуспендировали в буфере для FACS (PBS+2% FBS), нейтрализовали питательной средой и подсчитывали. Клетки высевали при 50000 клеток на лунку в 96-луночный планшет с V-образным дном лунок. Клетки промывали один раз буфером для FAcS (PBS (Fisher, № в каталоге SH30028-03) +2% FBS). Добавляли mAb к LY75 (выбранное из примера 1) или LY75_A1 в лунки при исходной концентрации 250 нМ, и осуществляли 3-кратные серийные разбавления, и вносили в соответствующие лунки в течение 45 мин на льду. Исследуемое содержимое лунок, для которого требовались один или более этапов окрашивания, при необходимости выдерживали в буфере для FACS для обеспечения одновременного завершения заключительного окрашивания для всех исследуемых условий. Содержимое двух лунок с буфером для FACS оставляли неокрашенным в качестве контролей.

После инкубирования с блокирующим антителом клетки два раза промывали буфером для FACS. Клетки ресуспендировали в буфере для FACS, содержащем mAb к LY75, конъюгированное с MCC-DM1 (1 нМ), и инкубировали на льду в течение 45 мин. Клетки промывали, как описано выше, ресуспендировали в буфере FACS плюс 1 мкг/мл мышиных антител к майтанзину и инкубировали на льду в течение 45 мин. Клетки промывали, как описано выше, и ресуспендировали в буфере для FACS, содержащем 2 мкг/мл антитела козы к каппа-цепи Ig мыши, конъюгированного с RPE. Клетки инкубировали на льду в течение 45 мин, затем промывали, как описано выше. Клетки ресуспендировали в буфере FACS при 200 мкл на лунку. Среднее значение интенсивности флуоресценции для каждого образца определяли с помощью проточного цитометра Guava EasyCyte Plus HT (форматы 96-луночного планшета), и необработанные данные анализировали с помощью Guava Cytosoft.

Результаты.

На фиг. 5a показано, что блокирование с использованием mAb к LY75, конъюгированного с MCCDM1, приводило к снижению связывания mAb к LY75. Анализ связывания LY75_A1 с клетками COLO205 продемонстрировал, что LY75_A1 неспособно блокировать связывание mAb к LY75, конъюгированного с MCC-DM1 (см. фиг. 5b). Таким образом, можно определить, что mAb к LY75 и LY75_A1 не являются конкурирующими антителами, и при этом LY75_A1 распознает отличный и уникальный эпитоп LY75 по сравнению с другими антителами к LY75.

Пример 24. Определение характеристик эпитопа LY75_A1 с помощью микроматричного анализа пептидов.

Способ.

Микроматричный анализ пептидов осуществляли в LC Sciences, Хьюстон, Техас, при этом, вкратце, способ включал следующие этапы: синтезировали смежные 8-мерные пептиды белка LY75, перекрывающиеся по одной аминокислоте, охватывающие остатки 216-1666 белка LY75 полной длины, и иммобилизовали на микроматричном чипе. Чип содержал три панели, так что эксперимент проводили в трех повторностях. Микроматрицу исследовали с использованием LY75_A1 для идентификации пептидов, с которыми связывалось антитело. Анализ связывания проводили при следующих условиях: микроматрицу, содержащую смежные пептиды в трех повторностях, промывали 1 мл буфера для связывания при 4°C в течение 20 мин. Затем ее инкубировали с 1 мкг/мл LY75_A1 в буфере для связывания (pH 7,0) при 4°C

- 45 046736 в течение 2 ч. Матрицу еще раз промывали 0,5 мл промывочного буфера при 4°C в течение 30 мин, затем инкубировали с 25 нг/мл конъюгата антитела к IgG человека с Alexa 647 в буфере для связывания (pH 7,0) при 4°C в течение 1 ч. Матрицу еще раз промывали 0,5 мл промывочного буфера при 4°C в течение 30 мин.

Затем матрицу сканировали при 635 нм и PMT 500 и регистрировали интенсивность сигнала. Пептид классифицировали как выявляемый, если он присутствовал по меньшей мере в 2/3 допустимых дублирующих проб. Среднюю интенсивность сигнала для повторностей представляли как конечную интенсивность сигнала.

Результаты.

Как показано на фиг. 6, антитело LY75_A1 характеризовалось специфичным связыванием с рядом пептидов, расположенных на матрице. Максимальный уровень сигнала, наблюдаемый для связывания с LY75_A1, составлял 25000 (шкала 1-65535), при этом средний уровень сигнала для всех пятен на матрице составлял приблизительно 885. Интенсивность сигнала, равную 3000, устанавливали в качестве точки отсечения фона, обусловленного неспецифичным связыванием. Исходя из наблюдаемого уровня интенсивности сигнала связывания с антителом, идентифицировали потенциальные последовательности, образующие эпитоп для LY75_A1. Эти области показаны на фиг. 6a-6j и под SEQ ID NO: 22-31.

Пример 25. LY75_A1 анализ с осаждением пептидов.

Способ.

1.1. Анализ с соосаждением.

Рекомбинантный белок LY75 расщепляли путем триптического протеолиза белка, связанного с гранулами (Promega, США). Полученные в результате расщепления пептиды извлекали с помощью колонки для захвата C18 (Thermo Fisher Scientific). Затем очищенные пептиды инкубировали с 200 мкл гранул с белком A, сшитым с антителом LY75_A1, в течение ночи при 4°C. На следующий день отбирали несвязанные пептиды, и при этом гранулы два раза промывали 1 мл PBS. Пептиды, связанные с антителом, элюировали из гранул путем их нагревания при 90°C в 100 мкл PBS в течение 5 мин. Повторяли этот этап элюирования.

1.2. Масс-спектрометрия.

Образцы анализировали с помощью жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией с использованием системы Waters nanoACQUITY UPLC, оснащенной колонкой nanoACQUITY UPLC BEH 130 С18, 75 мкм x250 мм (186003545) и LTQ Orbitrap Velos (Thermo Fisher Scientific). Пептиды элюировали с использованием градиента с увеличением количества ацетонитрила от 3 до 35% при скорости 300 нл/мин в течение 120 мин. Получали масс-спектры в режиме полного сканирования при разрешающей способности 60000 в диапазоне массы 400-2000 масса/заряд с использованием Orbitrap. В каждом цикле отбирали двадцать пептидов, характеризующихся наибольшей интенсивностью, для сканирований посредством CID MS/MS в линейной ионной ловушке с нанораспылительным источником ионов, установленным на приборе.

1.3. Анализ аминокислотной последовательности пептида.

Необработанные данные, полученные с использованием LTQ Orbitrap Velos, обрабатывали с помощью программного обеспечения Mascot (Matrix Science), в котором используется алгоритм Mowse (Curr Biol. 1993 Jun 1;3(6):327-3) для выведения последовательностей аминокислот, исходя из набора пиков, путем поиска по базе данных последовательностей, состоящей из Ensembl (https://www.ensembl.org/index.html), IPI (www.ebi.ac.uk/IPI/IPIhuman.html) и SwissProt (https://www.uniprot.org) вместе с последовательностями белков-контаминантов. Критерии идентификации пептидов включали расщепление трипсином, до 2 отсутствующих сайтов расщепления и различные биологические и химические модификации (окисленный метионин, модификация цистеина с помощью MMTS или йодацетамида и фосфорилирование серина, треонина и тирозина). Пептиды, которым присваивали ранг 1 при ожидаемом значении 0,05% или меньше, степени совпадения спектров 28 или больше, загружали в базу данных OGAP.

1.4. Распознавание пептидов, ассоциированных с LY75.

В способе идентификации LY75 использовали пептидные последовательности, полученные экспериментальным путем с помощью масс-спектрометрии, как описано выше, встречающихся в природе белков человека для идентификации и упорядочивания кодирующих экзонов в опубликованной геномной последовательности человека. Эти экспериментально определенные последовательности сравнивали с базой данных OGAP®, которая была скомпилирована путем обработки и интеграции масс пептидов, сигнатур пептидов, EST и общедоступных данных геномных последовательностей, как описано в международной патентной заявке WO2009/087462.

Результаты.

Результаты анализа с соосаждением пептидов с использованием антитела LY75_A1 показаны в табл. 1 ниже и на фиг. 7. Пептиды, которые были идентифицированы при обоих элюированиях пептидов 1a и 1b в анализе с соосаждением и в микроматричном анализе, считались наиболее вероятными кандидатами для образования эпитопа.

- 46 046736

Таблица 1

Сравнение экспериментов с микроматричным анализом пептидов и соосаждением пептидов

SEQ ID NO:	Пептид, идентифицированный с помощью микроматричного анализа	Пептид, идентифицированный с помощью анализа с осаждением
	Область 1 (аминокислоты 609-618)	-
	Область 2 (аминокислоты 651-662)	-
40	Область 3 (аминокислоты 761-780)	GWHFYDDR (765-772)
41 42	Область 4 (аминокислоты 883-901)	ISEWPIDDHFTYSR(877-890) FP VTFGEECLYMS АК(896-910)
43	Область 5 (аминокислоты 1029-1040)	ELTYSNFHPLLVSGR (10301044)
44	Область 6 (аминокислоты 1077-1093)	HFVSLCQK (1084-1091)
45	Область 7 (аминокислоты 1107-1118)	QTLQNASETVK (1099-1109)
	Область 8 (аминокислоты 1368-1378)	-
	Область 9 (аминокислоты 1518-1528)	-
	Область 10 (аминокислоты 1535-1554)	-

Таблица 1 показывает, что ряд перекрывающихся пептидных областей LY75 был идентифицирован как в микроматричном анализе пептидов, так и в обоих элюированиях 1a и 1b в анализе с осаждением пептидов. Считалось, что эти области с наибольшей долей вероятности содержат эпитоп, распознаваемый антителом LY75_A1, поскольку они связываются с LY75_A1 при исследовании с помощью обеих используемых методик.

Пример 26. Синергетические комбинации LY75_DM4 и венетоклакса.

Ряд активированных B-клеточных линий диффузной B-клеточной лимфомы (ABC-DLBCL) (т.е. клеточные линии U2932, HBL1, OCI-Ly10, TMD8) подвергали в течение 72 ч воздействию возрастающих доз LY75_DM4 (т.е. 18,75 - 37,5 - 75 - 150 - 300 - 600 - 1200 нМ) либо отдельно, либо в комбинации с возрастающими дозами венетоклакса (0,64 - 3,2 - 16 - 80 - 400 - 2000 - 10000 нМ). За этим следовал анализ с использованием MTT [3 -(4,5 -диметилтиазолил-2)-2,5 -дифенилтетразолбромида].

Показатель аддитивности Chou-Talalay (C.I.) мог быть оценен с использованием пакета Synergy R (Preclinical versus Clinical Drugs Combination Studies. Chou TC. Leuk. Lymphoma. 2008;49(11):2059-2080). Он обеспечивает количественное определение сильного синергизма (<0,3), синергизма (0,3-0,9), аддитивного эффекта (0,9-1,1) или антагонизма/отсутствия благоприятного эффекта (>1,1).

Графики алгебраических оценок CI по отношению к фракционному эффекту различных доз LY75_DM4 в комбинации с венетоклаксом в отношении различных клеточных линий ABC-DLBCL показаны на фиг. 8-11.

Обосновывающие данные приведены в табл. 2-5 ниже. (Фракционный эффект - это эффект дозы лекарственного средства или, в данном случае, комбинации двух разных доз лекарственных средств в отношении жизнеспособности клеток. См. Drug combination studies and their synergy quantification using the Chou-Talalay method, Chou TC Рак Res. 2010 Jan 15; 70(2):440-6. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-091947. Epub 2010 Jan 12; Evaluation of combination chemotherapy: integration of nonlinear regression, curve shift, isobologram, and combination index analyses, Zhao L1, Wientjes MG, Au JL. Clin Cancer Res. 2004 Dec 1; 10(23):7994-8004 и Computerized quantitation of synergism and antagonism of taxol, topotecan, and cisplatinagainst human teratocarcinoma cell growth: a rational approach to clinical protocol design, Chou TC1, Motzer RJ, Tong Y, Bosl GJ. J Natl Cancer Inst. 1994 Oct 19; 86(20):1517-24).

- 47 046736

Таблица 2

Показатель аддитивности Chou-Talalay (CI) различных доз LY75_DM4 в комбинации с венетоклаксом в отношении клеточной линии U2932 ABC-DLBCL

№	Венетоклакс (нМ)	LY75DM4 (нМ)	CI
1	0,64	18,75	0,228628
2	3,2	18,75	48390,23
3	16	18,75	0,832871
4	80	18,75	48571,11
5	400	18,75	1,283932
6	2000	18,75	4,300007
7	0,64	37,5	0,20187
8	3,2	37,5	0,158138
9	16	37,5	0,162302
10	80	37,5	0,359423
И	400	37,5	1,063934
12	2000	37,5	4,016023
13	0,64	75	0,240453
14	3,2	75	0,318658
15	16	75	0,269793
16	80	75	0,449203
17	400	75	1,319344
18	2000	75	4,535702
19	0,64	150	0,668392
20	3,2	150	0,503223
21	16	150	0,368141
22	80	150	0,78697
23	400	150	1,229211
24	2000	150	4,080756
25	0,64	300	0,674222
26	3,2	300	0,614852
27	16	300	0,471318
28	80	300	0,612392
29	400	300	1,0508
30	2000	300	2,887408

31	0,64	600	0,398468
32	3,2	600	0,269578
33	16	600	0,215265
34	80	600	0,262392
35	400	600	0,482253
36	2000	600	1,556613
37	0,64	1200	0,311401
38	3,2	1200	0,201658
39	16	1200	0,131998
40	80	1200	0,143223
41	400	1200	0,264552
42	2000	1200	0,889985

- 48 046736

Таблица 3

Показатель аддитивности Chou-Talalay (CI) различных доз LY75_DM4 в комбинации с венетоклаксом в отношении клеточной линии HBL-1 ABC-DLBCL

№	Венетоклакс (нМ)	LY75 DM4 (нМ)	CI
1	0,64	18,75	0,060475
2	3,2	18,75	0,066231
3	16	18,75	0,072936
4	80	18,75	0,103875
5	400	18,75	0,2431
6	2000	18,75	0,723887
7	10000	18,75	2,513073
8	0,64	37,5	0,2091
9	3,2	37,5	0,126913
10	16	37,5	0,130206
И	80	37,5	0,181304
12	400	37,5	0,257498
13	2000	37,5	0,723106
14	10000	37,5	2,455379
15	0,64	75	0,307332
16	3,2	75	0,251612
17	16	75	0,235462
18	80	75	0,185182
19	400	75	0,304787
20	2000	75	0,717305
21	10000	75	2,213852
22	0,64	150	0,429262
23	3,2	150	0,324116
24	16	150	0,379524
25	80	150	0,276266
26	400	150	0,341981
27	2000	150	0,641475
28	10000	150	1,688396
29	0,64	300	0,530256
30	3,2	300	0,558872
31	16	300	0,48397
32	80	300	0,427943
33	400	300	0,411042
34	2000	300	0,581318
35	0,64	600	0,81368
36	3,2	600	0,7166
37	16	600	0,688208
38	80	600	0,539914
39	400	600	0,447228
40	2000	600	0,576687
41	10000	600	0,927968
42	0,64	1200	1,462271
43	3,2	1200	1,463631
44	16	1200	1,240995
45	80	1200	0,962969
46	400	1200	0,699419
47	2000	1200	0,834858
48	10000	1200	1,20449

- 49 046736

Таблица 4

Показатель аддитивности Chou-Talalay (CI) различных доз LY75_DM4 в комбинации с венетоклаксом в отношении клеточной линии OCI-LY10 ABC-DLBCL

№	Венетоклакс (нМ)	LY75 DM4 (нМ)	CI
1	0,64	18,75	0,358713
2	3,2	18,75	0,390664
3	16	18,75	0,528223
4	80	18,75	0,519535
5	400	18,75	0,48347
6	2000	18,75	0,449909
7	0,64	37,5	0,76338
8	3,2	37,5	0,792829
9	16	37,5	0,863246
10	80	37,5	0,849432
И	400	37,5	0,842251
12	2000	37,5	0,83696
13	0,64	75	1,620332
14	3,2	75	1,497024
15	16	75	1,52695
16	80	75	1,247205
17	400	75	1,03465
18	2000	75	0,679064
19	0,64	150	2,591237
20	3,2	150	2,543499
21	16	150	2,319816
22	80	150	2,028179
23	400	150	1,529779
24	2000	150	1,245879

- 50 046736

Таблица 5

Показатель аддитивности Chou-Talalay (CI) различных доз LY75_DM4 в комбинации с венетоклаксом в отношении клеточной линии TMD8 ABC-DLBCL

№	Венетоклакс (нМ)	LY75 DM4 (нМ)	CI
1	0,64	18,75	3,857478
2	3,2	18,75	0,280543
3	16	18,75	0,384029
4	80	18,75	0,317572
5	400	18,75	0,746108
6	2000	18,75	1,517033
7	10000	18,75	5,015455
8	0,64	37,5	0,563791
9	3,2	37,5	0,501728
10	16	37,5	0,518688
И	80	37,5	0,54784
12	400	37,5	0,769738
13	2000	37,5	1,419712
14	10000	37,5	5,250996
15	0,64	75	1,002662
16	3,2	75	0,925877
17	16	75	0,941806
18	80	75	0,952971
19	400	75	1,073273
20	2000	75	1,592762
21	10000	75	4,559974
22	0,64	150	1,564785
23	3,2	150	1,540005
24	16	150	1,522806
25	80	150	1,396608
26	400	150	1,273743
27	2000	150	1,376175
28	10000	150	0,217978

- 51 046736

Последовательности

SEQ ID NO	Описание	Последовательность
1	А. к. A1VH	EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTYSNAWMSWVRQ APGKELEWVGRIKSKTDGGTTDYAAPVQGRFTISRDDSKN TLYLQMNSLKTEDTAVYYCTIFGVVSFDYWGQGTLVTVSS
2	А. к. A1VL	DVQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISDYLSWYQQRPG KAPNLLIYAASNLKTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISTLQPEDF ATYYCQQSYRSPWTFGQGTKVEIKR
3	Нуклеотиды A1VH	gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtaaagccgggggggtcccttagactct cctgtgcagcctctggcttcacttacagtaacgcctggatgagctgggtccgccaggctccag ggaaggggctggagtgggttggccgtattaaaagcaaaactgatggtgggacaacagacta cgctgcacccgtgcaaggcagattcaccatctcaagagatgattcaaaaaacacgctgtatct gcaaatgaacagcctgaaaaccgaggacacagccgtgtattactgtacgatttttggagtggtt agctttgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctca
4	Нуклеотиды A1VL	gacgtccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgttggagacagagtcaccatca cttgccgggcaagtcagagcattagcgactatttaagttggtatcagcagagaccagggaaa gcccctaacctcctgatctatgctgcatccaatttaaagactggggtcccatcaaggttcagtg gcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcactctgcaacctgaagattttgcaac gtactactgtcaacagagttacaggtccccgtggacgttcggccaagggaccaaggtggaa atcaaacga
5	А. к. A1VHCDR1	NAWMS
6	А. к. A1VHCDR2	RIKSKTDGGTTDYAAPVQG
7	А. к. A1VHCDR3	FGVVSFDY
8	А. к. A1VLCDR1	RASQSISDYLS
9	А. к. A1VLCDR2	AASNLKT
10	А. к. A1VLCDR3	QQSYRSPWT
11	VH3|315/D4|411	EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNAWMSWVRQ APGKGLEWVGRIKSKTDGGTTDYAAPVKGRFTISRDDSKN TLYLQMNSLKTEDTAVYYCTTTTVT
12	JH4	YFD YWGQGTL VT VS S
13	012	DIQMTQ SP S SLS AS VGDRVTITCRASQ SIS S YLNW YQQKPG KAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDF ATYYCQQSYS
14	JK1	WTFGQGTKVEIKR

- 52 046736

15	LY75 (DEC205)	MRTGWATPRRPAGLLMLLFWFFDLAEPSGRAANDPFTIVH GNTGKCIKPVYGWIVADDCDETEDKLWKWVSQHRLFHLH SQKCLGLDITKSVNELRMF SCDS S AMLWWKCEHHSL YGA ARYRLALKDGHGTAISNASDVWKKGGSEESLCDQPYHEIY TRDGNSYGRPCEFPFLIDGTWHHDCILDEDHSGPWCATTL NYEYDRKWGICLKPENGCEDNWEKNEQFGSCYQFNTQTA LSWKEAYVSCQNQGADLLSINSAAELTYLKEKEGIAKIFWI GLNQLYSARGWEWSDHKPLNFLNWDPDRPSAPTIGGSSCA RMDAESGLWQSFSCEAQLPYVCRKPLNNTVELTDVWTYS DTRCD AGWLPNNGFCYLLVNESNSWDI<AHAI<CI<AF S SDL ISIHSLADVEVVVTKLHNEDIKEEVWIGLKNINIPTLFQWSD GTEVTLTYWDENEPNVPYNKTPNCVSYLGELGQWKVQSC EEKLKYVCKRKGEKLNDASSDKMCPPDEGWKRHGETCY I<IYEDEVPFGTNCNLTITSRFEQEYLNDLMI<I<YDI<SLRI<YF WTGLRDVD SCGEYNWATVGGRRRAVTF SNWNFLEP ASPG GCVAMSTGKSVGKWEVKDCRSFKALSICKKMSGPLGPEE ASPKPDDPCPEGWQSFPASLSCYKVFHAERIVRKRNWEEA ERFCQ ALGAHLS SF SHVDEIKEFLHFLTDQF SGQHWLWIGL NKRSPDLQGSWQWSDRTPVSTIIMPNEFQQDYDIRDCAAV I<VFHRPWRRGWHFYDDREFIYLRPFACDTI<LEWVCQIPI<G RTPKTPDWYNPDRAGIHGPPLIIEGSEYWFVADLHLNYEEA VLYCASNHSFLATITSFVGLKAIKNKIANISGDGQKWWIRIS EWPIDDHFTYSRYPWHRFPVTFGEECLYMSAKTWLIDLGK PTDCSTKLPFICEKYNVSSLEKYSPDSAAKVQCSEQWIPFQ NKCFLKIKPVSLTFSQASDTCHSYGGTLPSVLSQIEQDFITSL LPDMEATLWIGLRWTAYEKINKWTDNRELTYSNFHPLLVS GRLRIPENFFEEESRYHCALILNLQKSPFTGTWNFTSCSERH FVSLCQKYSEVKSRQTLQNASETVKYLNNLYKIIPKTLTW HSAKRECLKSNMQLVSITDPYQQAFLSVQALLHNSSLWIG LF SQDDELNFGWSDGKRLHF SRWAETNGQLEDC VVLDTD GFWKTVDCNDNQPGAICYYSGNETEKEVKPVDSVKCPSPV LNTPWIPFQNCCYNFIITKNRHMATTQDEVHTKCQKLNPK SHILSIRDEKENNFVLEQLLYFNYMASWVMLGITYRNKSL MWFDKTPLSYTHWRAGRPTIKNEKFLAGLSTDGFWDIQTF KVIEEAVYFHQHSILACKIEMVDYKEEYNTTLPQFMPYED GIYSVIQKKVTWYEALNMCSQSGGHLASVHNQNGQLFLE DIVKRDGFPLWVGL S SHDGSES SFEWSDGSTFD YIPWKGQ TSPGNCVLLDPKGTWKHEKCNSVKDGAICYKPTKSKKLSR LT YS SRCP AAKENGSRWIQYKGHC YKSDQ ALHSF SEAKKL CSKHDHSATIVSIKDEDENKFVSRLMRENNNITMRVWLGL SQHSVDQSWSWLDGSEVTFVKWENKSKSGVGRCSMLIAS NETWKKVECEHGFGRVVCKVPLGPDYTAIAIIVATLSILVL MGGLIWFLFQRHRLHL AGF S S VRYAQGVNEDEIMLPSFHD
16	A1VHFR1	EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTYS
17	A1VHFR2	WVRQAPGKGLEWVG
18	A1VHFR3	RFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTI
19	A1VHFR4	WGQGTLVTVSS

- 53 046736

20	A1VLFR1	DVQMTQSPSSLSASVGDRVTITC
21	A1VLFR2	WYQQRPGKAPNLLIY
22	A1VLFR3	GVPSRFSGSGSGTDFTLTISTLQPEDFATYYC
23	A1VLFR4	FGQGTKVEIKR
24	LY75, 609-618	WEVKDCRSFK
25	LY75, 651-662	PASLSCYKVFHA
26	LY75, 761-780	PWRRGWHFYDDREFIYLRPF
27	LY75, 883-901	DDHFTYSRYPWHRFPVTFG
28	LY75, 1029- 1040	RELTYSNFHPLL
29	LY75, 1077- 1093	FTSCSERHFVSLCQKYS
30	LY75, 1107- 1118	TVKYLNNLYKII
31	LY75, 1368- 1378	EAVYFHQHSIL
32	LY75, 1518- 1528	KKLSRLTYSSC
33	LY75, 1535- 1554	NGSRWIQYKGHCYKSDQALH
34	LY75, 877-901	ISEWPIDDHFTYSRYPWHRFPVTFG
35	LY75, 1099- 1118	QTLQNASETVKYLNNLYKII
36	LY75, 883-892	DDHFTYSRYP
37	LY75, 1077- 1091	FTSCSERHFVSLCQK
38 39 40 41 42	A1_H (аминокислота) AIL (аминокислота) (765-772) (877-890) (896-910)	MEWSWVFLFFLSVTTGVHSEVQLVESGGGLVKPGGSLRLS CAASGFTYSNAWMSWVRQAPGKELEWVGRIKSKT DGGTTDYAAPVQGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAV YYCTIFGVVSFDYWGQGTLVTVSSASTKFPSVFPLAP SSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTF PAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT KVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KALPAPIEKTISKAKFQPREPQVYTLPPSREEMTKNQV SLTCLVKFFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGK MSVPTQVLGLLLLWLTDARCDVQMTQSPSSLSASVGDRV TITCRASQSISDYLSWYQQRPGKAPNLLIYAASN LKTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISTLQPEDFATYYCQQSYRSP WTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGT ASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDS KDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC GWHFYDDR ISEWPIDDHFTYSR FPVTFGEECLYMSAK
43	(1030-1044)	ELTYSNFHPLLVSGR
44	(1084-1091)	HFVSLCQK
45	(1099-1109)	QTLQNASETVK
46	Линкер	Gly-Phe-Leu-Gly

- 54 046736

Перечень последовательностей в произвольном текстовом формате SEQ ID NO: 38 <223> Тяжелая цепь А1

SEQ ID NO: 39 <223> Легкая цепь А1

SEQ ID NO: 46 <223> Линкер

SEQ ID NO: 47-157 <223> Пептид

SEQ ID NO: 159-201 <223> Пептид

Перечень последовательностей <110> Берлин-Хеми АГ <120> ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМБИНАЦИИ <130> 489.138735/02 <160> 203 <170> PatentIn версия 3.5 <210> 1 <211> 119 <212> БЕЛОК <213> Human <400> 1

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Tyr Ser Asn Ala 20 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala 50 55 60

Pro Val Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95

Tyr Cys Thr Ile Phe Gly Val Val Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 <210> 2

- 55 046736 <211> 108 <212> БЕЛОК <213> Human <400> 2

Asp Val Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asp Tyr 20 25 30

Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Lys Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Thr Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Arg Ser Pro Trp 85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105 <210> 3 <211> 357 <212> ДНК <213> Human <400> 3 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtaaagc cgggggggtc ccttagactc 60 tcctgtgcag cctctggctt cacttacagt aacgcctgga tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggttggccgt attaaaagca aaactgatgg tgggacaaca 180 gactacgctg cacccgtgca aggcagattc accatctcaa gagatgattc aaaaaacacg 240 ctgtatctgc aaatgaacag cctgaaaacc gaggacacag ccgtgtatta ctgtacgatt 300 tttggagtgg ttagctttga ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357 <210> 4 <211> 324 <212> ДНК <213> Human <400> 4 gacgtccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgttggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc gactatttaa gttggtatca gcagagacca 120

- 56 046736 gggaaagccc ctaacctcct gatctatgct gcatccaatt taaagactgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcac tctgcaacct 240 gaagattttg caacgtacta ctgtcaacag agttacaggt ccccgtggac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acga 324 <210>5 <211>5 <212> БЕЛОК <213> Human <400> 5

Asn Ala Trp Met Ser 1 5 <210>6 <211> 19 <212> БЕЛОК <213> Human <400> 6

Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala Pro 1 5 10 15

Val Gln Gly <210>7 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Human <400> 7

Phe Gly Val Val Ser Phe Asp Tyr 1 5 <210> 8 <211> 11 <212> БЕЛОК <213> Human <400> 8

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asp Tyr Leu Ser

5 10 <210> 9 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Human

- 57 046736 <400> 9

Ala Ala Ser Asn Leu Lys Thr 1 5 <210> 10 <211> 9 <212> БЕЛОК <213> Human <400> 10

Gln Gln Ser Tyr Arg Ser Pro Trp Thr 1 5 <210> 11 <211> 104 <212> БЕЛОК <213> Human <400> 11

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala 20 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala 50 55 60

Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95

Tyr Cys Thr Thr Thr Thr Val Thr 100 <210> 12 <211> 15 <212> БЕЛОК <213> Human <400> 12

Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 15

- 58 046736 <210> 13 <211> 93 <212> БЕЛОК <213> Human <400> 13

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser 85 90 <210> 14 <211> 13 <212> БЕЛОК <213> Human <400> 14

Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 1 5 10 <210> 15 <211> 1722 <212> БЕЛОК <213> Human <400> 15

Met Arg Thr Gly Trp Ala Thr Pro Arg Arg Pro Ala Gly Leu Leu Met 1 5 10 15

Leu Leu Phe Trp Phe Phe Asp Leu Ala Glu Pro Ser Gly Arg Ala Ala 20 25 30

Asn Asp Pro Phe Thr Ile Val His Gly Asn Thr Gly Lys Cys Ile Lys 35 40 45

- 59 046736

Pro Val Tyr Gly Trp Ile Val Ala Asp Asp Cys Asp Glu Thr Glu Asp 50 55 60

Lys Leu Trp Lys Trp Val Ser Gln His Arg Leu Phe His Leu His Ser 65 70 75 80

Gln Lys Cys Leu Gly Leu Asp Ile Thr Lys Ser Val Asn Glu Leu Arg 85 90 95

Met Phe Ser Cys Asp Ser Ser Ala Met Leu Trp Trp Lys Cys Glu His

100 105 110

His Ser Leu Tyr Gly Ala Ala Arg Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Asp Gly

115 120 125

His Gly Thr Ala Ile Ser Asn Ala Ser Asp Val Trp Lys Lys Gly Gly

130 135 140

Ser Glu Glu Ser Leu Cys Asp Gln Pro Tyr His Glu Ile Tyr Thr Arg

145 150 155 160

Asp Gly Asn Ser Tyr Gly Arg Pro Cys Glu Phe Pro Phe Leu Ile Asp

165 170 175

Gly Thr Trp His His Asp Cys Ile Leu Asp Glu Asp His Ser Gly Pro

180 185 190

Trp Cys Ala Thr Thr Leu Asn Tyr Glu Tyr Asp Arg Lys Trp Gly Ile

195 200 205

Cys Leu Lys Pro Glu Asn Gly Cys Glu Asp Asn Trp Glu Lys Asn Glu

210 215 220

Gln Phe Gly Ser Cys Tyr Gln Phe Asn Thr Gln Thr Ala Leu Ser Trp

225 230 235 240

Lys Glu Ala Tyr Val Ser Cys Gln Asn Gln Gly Ala Asp Leu Leu Ser

245 250 255

Ile Asn Ser Ala Ala Glu Leu Thr Tyr Leu Lys Glu Lys Glu Gly Ile

260 265 270

Ala Lys Ile Phe Trp Ile Gly Leu Asn Gln Leu Tyr Ser Ala Arg Gly

275 280 285

Trp Glu Trp Ser Asp His Lys Pro Leu Asn Phe Leu Asn Trp Asp Pro

- 60 046736

290 295 300

Asp Arg Pro Ser Ala Pro Thr Ile Gly Gly Ser Ser Cys Ala Arg Met 305 310 315 320

Asp Ala Glu Ser Gly Leu Trp Gln Ser Phe Ser Cys Glu Ala Gln Leu

325 330 335

Pro Tyr Val Cys Arg Lys Pro Leu Asn Asn Thr Val Glu Leu Thr Asp

340 345 350

Val Trp Thr Tyr Ser Asp Thr Arg Cys Asp Ala Gly Trp Leu Pro Asn

355 360 365

Asn Gly Phe Cys Tyr Leu Leu Val Asn Glu Ser Asn Ser Trp Asp Lys

370 375 380

Ala His Ala Lys Cys Lys Ala Phe Ser Ser Asp Leu Ile Ser Ile His 385 390 395 400

Ser Leu Ala Asp Val Glu Val Val Val Thr Lys Leu His Asn Glu Asp 405 410 415

Ile Lys Glu Glu Val Trp Ile Gly Leu Lys Asn Ile Asn Ile Pro Thr

420 425 430

Leu Phe Gln Trp Ser Asp Gly Thr Glu Val Thr Leu Thr Tyr Trp Asp

435 440 445

Glu Asn Glu Pro Asn Val Pro Tyr Asn Lys Thr Pro Asn Cys Val Ser

450 455 460

Tyr Leu Gly Glu Leu Gly Gln Trp Lys Val Gln Ser Cys Glu Glu Lys

465 470 475 480

Leu Lys Tyr Val Cys Lys Arg Lys Gly Glu Lys Leu Asn Asp Ala Ser

485 490 495

Ser Asp Lys Met Cys Pro Pro Asp Glu Gly Trp Lys Arg His Gly Glu

500 505 510

Thr Cys Tyr Lys Ile Tyr Glu Asp Glu Val Pro Phe Gly Thr Asn Cys

515 520 525

Asn Leu Thr Ile Thr Ser Arg Phe Glu Gln Glu Tyr Leu Asn Asp Leu

530 535 540

- 61 046736

Met Lys Lys Tyr Asp Lys Ser Leu Arg Lys Tyr Phe Trp Thr Gly Leu 545 550 555 560

Arg Asp Val Asp Ser Cys Gly Glu Tyr Asn Trp Ala Thr Val Gly Gly

565 570 575

Arg Arg Arg Ala Val Thr Phe Ser Asn Trp Asn Phe Leu Glu Pro Ala

580 585 590

Ser Pro Gly Gly Cys Val Ala Met Ser Thr Gly Lys Ser Val Gly Lys

595 600 605

Trp Glu Val Lys Asp Cys Arg Ser Phe Lys Ala Leu Ser Ile Cys Lys

610 615 620

Lys Met Ser Gly Pro Leu Gly Pro Glu Glu Ala Ser Pro Lys Pro Asp 625 630 635 640

Asp Pro Cys Pro Glu Gly Trp Gln Ser Phe Pro Ala Ser Leu Ser Cys

645 650 655

Tyr Lys Val Phe His Ala Glu Arg Ile Val Arg Lys Arg Asn Trp Glu

660 665 670

Glu Ala Glu Arg Phe Cys Gln Ala Leu Gly Ala His Leu Ser Ser Phe

675 680 685

Ser His Val Asp Glu Ile Lys Glu Phe Leu His Phe Leu Thr Asp Gln 690 695 700

Phe Ser Gly Gln His Trp Leu Trp Ile Gly Leu Asn Lys Arg Ser Pro 705 710 715 720

Asp Leu Gln Gly Ser Trp Gln Trp Ser Asp Arg Thr Pro Val Ser Thr

725 730 735

Ile Ile Met Pro Asn Glu Phe Gln Gln Asp Tyr Asp Ile Arg Asp Cys

740 745 750

Ala Ala Val Lys Val Phe His Arg Pro Trp Arg Arg Gly Trp His Phe

755 760 765

Tyr Asp Asp Arg Glu Phe Ile Tyr Leu Arg Pro Phe Ala Cys Asp Thr

770 775 780

Lys Leu Glu Trp Val Cys Gln Ile Pro Lys Gly Arg Thr Pro Lys Thr

- 62 046736

785 790 795 800

Pro Asp Trp Tyr Asn Pro Asp Arg Ala Gly Ile His Gly Pro Pro Leu

805 810 815

Ile Ile Glu Gly Ser Glu Tyr Trp Phe Val Ala Asp Leu His Leu Asn

820 825 830

Tyr Glu Glu Ala Val Leu Tyr Cys Ala Ser Asn His Ser Phe Leu Ala

835 840 845

Thr Ile Thr Ser Phe Val Gly Leu Lys Ala Ile Lys Asn Lys Ile Ala

850 855 860

Asn Ile Ser Gly Asp Gly Gln Lys Trp Trp Ile Arg Ile Ser Glu Trp 865 870 875 880

Pro Ile Asp Asp His Phe Thr Tyr Ser Arg Tyr Pro Trp His Arg Phe

885 890 895

Pro Val Thr Phe Gly Glu Glu Cys Leu Tyr Met Ser Ala Lys Thr Trp

900 905 910

Leu Ile Asp Leu Gly Lys Pro Thr Asp Cys Ser Thr Lys Leu Pro Phe

915 920 925

Ile Cys Glu Lys Tyr Asn Val Ser Ser Leu Glu Lys Tyr Ser Pro Asp

930 935 940

Ser Ala Ala Lys Val Gln Cys Ser Glu Gln Trp Ile Pro Phe Gln Asn

945 950 955 960

Lys Cys Phe Leu Lys Ile Lys Pro Val Ser Leu Thr Phe Ser Gln Ala

965 970 975

Ser Asp Thr Cys His Ser Tyr Gly Gly Thr Leu Pro Ser Val Leu Ser

980 985 990

Gln Ile Glu Gln Asp Phe Ile Thr Ser Leu Leu Pro Asp Met Glu Ala 995 1000 1005

Thr Leu Trp Ile Gly Leu Arg Trp Thr Ala Tyr Glu Lys Ile Asn 1010 1015 1020

Lys Trp Thr Asp Asn Arg Glu Leu Thr Tyr Ser Asn Phe His Pro 1025 1030 1035

- 63 046736

Leu Leu Val Ser Gly Arg Leu Arg Ile Pro Glu Asn Phe Phe Glu 1040 1045 1050

Glu Glu Ser Arg Tyr His Cys Ala Leu Ile Leu Asn Leu Gln Lys 1055 1060 1065

Ser Pro Phe Thr Gly Thr Trp Asn Phe Thr Ser Cys Ser Glu Arg 1070 1075 1080

His Phe Val Ser Leu Cys Gln Lys Tyr Ser Glu Val Lys Ser Arg 1085 1090 1095

Gln Thr Leu Gln Asn Ala Ser Glu Thr Val Lys Tyr Leu Asn Asn 1100 1105 1110

Leu Tyr Lys Ile Ile Pro Lys Thr Leu Thr Trp His Ser Ala Lys 1115 1120 1125

Arg Glu Cys Leu Lys Ser Asn Met Gln Leu Val Ser Ile Thr Asp 1130 1135 1140

Pro Tyr Gln Gln Ala Phe Leu Ser Val Gln Ala Leu Leu His Asn 1145 1150 1155

Ser Ser Leu Trp Ile Gly Leu Phe Ser Gln Asp Asp Glu Leu Asn 1160 1165 1170

Phe Gly Trp Ser Asp Gly Lys Arg Leu His Phe Ser Arg Trp Ala 1175 1180 1185

Glu Thr Asn Gly Gln Leu Glu Asp Cys Val Val Leu Asp Thr Asp 1190 1195 1200

Gly Phe Trp Lys Thr Val Asp Cys Asn Asp Asn Gln Pro Gly Ala 1205 1210 1215

Ile Cys Tyr Tyr Ser Gly Asn Glu Thr Glu Lys Glu Val Lys Pro 1220 1225 1230

Val Asp Ser Val Lys Cys Pro Ser Pro Val Leu Asn Thr Pro Trp 1235 1240 1245

Ile Pro Phe Gln Asn Cys Cys Tyr Asn Phe Ile Ile Thr Lys Asn 1250 1255 1260

Arg His Met Ala Thr Thr Gln Asp Glu Val His Thr Lys Cys Gln

- 64 046736

1265 1270 1275

Lys Leu Asn Pro Lys Ser His Ile Leu Ser Ile Arg Asp Glu Lys 1280 1285 1290

Glu Asn Asn Phe Val Leu Glu Gln Leu Leu Tyr Phe Asn Tyr Met 1295 1300 1305

Ala Ser Trp Val Met Leu Gly Ile Thr Tyr Arg Asn Lys Ser Leu 1310 1315 1320

Met Trp Phe Asp Lys Thr Pro Leu Ser Tyr Thr His Trp Arg Ala 1325 1330 1335

Gly Arg Pro Thr Ile Lys Asn Glu Lys Phe Leu Ala Gly Leu Ser 1340 1345 1350

Thr Asp Gly Phe Trp Asp Ile Gln Thr Phe Lys Val Ile Glu Glu 1355 1360 1365

Ala Val Tyr Phe His Gln His Ser Ile Leu Ala Cys Lys Ile Glu 1370 1375 1380

Met Val Asp Tyr Lys Glu Glu Tyr Asn Thr Thr Leu Pro Gln Phe 1385 1390 1395

Met Pro Tyr Glu Asp Gly Ile Tyr Ser Val Ile Gln Lys Lys Val 1400 1405 1410

Thr Trp Tyr Glu Ala Leu Asn Met Cys Ser Gln Ser Gly Gly His 1415 1420 1425

Leu Ala Ser Val His Asn Gln Asn Gly Gln Leu Phe Leu Glu Asp 1430 1435 1440

Ile Val Lys Arg Asp Gly Phe Pro Leu Trp Val Gly Leu Ser Ser 1445 1450 1455

His Asp Gly Ser Glu Ser Ser Phe Glu Trp Ser Asp Gly Ser Thr 1460 1465 1470

Phe Asp Tyr Ile Pro Trp Lys Gly Gln Thr Ser Pro Gly Asn Cys 1475 1480 1485

Val Leu Leu Asp Pro Lys Gly Thr Trp Lys His Glu Lys Cys Asn 1490 1495 1500

- 65 046736

Ser Val Lys Asp Gly Ala Ile Cys Tyr Lys Pro Thr Lys Ser Lys 1505 1510 1515

Lys Leu Ser Arg Leu Thr Tyr Ser Ser Arg Cys Pro Ala Ala Lys 1520 1525 1530

Glu Asn Gly Ser Arg Trp Ile Gln Tyr Lys Gly His Cys Tyr Lys 1535 1540 1545

Ser Asp Gln Ala Leu His Ser Phe Ser Glu Ala Lys Lys Leu Cys 1550 1555 1560

Ser Lys His Asp His Ser Ala Thr Ile Val Ser Ile Lys Asp Glu 1565 1570 1575

Asp Glu Asn Lys Phe Val Ser Arg Leu Met Arg Glu Asn Asn Asn 1580 1585 1590

Ile Thr Met Arg Val Trp Leu Gly Leu Ser Gln His Ser Val Asp 1595 1600 1605

Gln Ser Trp Ser Trp Leu Asp Gly Ser Glu Val Thr Phe Val Lys 1610 1615 1620

Trp Glu Asn Lys Ser Lys Ser Gly Val Gly Arg Cys Ser Met Leu 1625 1630 1635

Ile Ala Ser Asn Glu Thr Trp Lys Lys Val Glu Cys Glu His Gly 1640 1645 1650

Phe Gly Arg Val Val Cys Lys Val Pro Leu Gly Pro Asp Tyr Thr 1655 1660 1665

Ala Ile Ala Ile Ile Val Ala Thr Leu Ser Ile Leu Val Leu Met 1670 1675 1680

Gly Gly Leu Ile Trp Phe Leu Phe Gln Arg His Arg Leu His Leu 1685 1690 1695

Ala Gly Phe Ser Ser Val Arg Tyr Ala Gln Gly Val Asn Glu Asp 1700 1705 1710

Glu Ile Met Leu Pro Ser Phe His Asp 1715 1720 <210> 16

- 66 046736 <211> 30 <212> БЕЛОК <213> Human <400> 16

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Tyr Ser 20 25 30 <210> 17 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Human <400> 17

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly 1 5 10 <210> 18 <211> 32 <212> БЕЛОК <213> Human <400> 18

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile 20 25 30 <210> 19 <211> 11 <212> БЕЛОК <213> Human <400> 19

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

5 10 <210> 20 <211> 23 <212> БЕЛОК <213> Human <400> 20

Asp Val Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

- 67 046736

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 21 <211> 15 <212> БЕЛОК <213> Human <400> 21

Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 22 <211> 32 <212> БЕЛОК <213> Human <400> 22

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15

Leu Thr Ile Ser Thr Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 23 <211> 11 <212> БЕЛОК <213> Human <400> 23

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

5 10 <210> 24 <211> 10 <212> БЕЛОК <213> Human <400> 24

Trp Glu Val Lys Asp Cys Arg Ser Phe Lys

5 10 <210> 25 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Human <400> 25

Pro Ala Ser Leu Ser Cys Tyr Lys Val Phe His Ala 1 5 10

- 68 046736 <210> 26 <211> 20 <212> БЕЛОК <213> Human <400> 26

Pro Trp Arg Arg Gly Trp His Phe Tyr Asp Asp Arg Glu Phe Ile Tyr 1 5 10 15

Leu Arg Pro Phe 20 <210> 27 <211> 19 <212> БЕЛОК <213> Human <400> 27

Asp Asp His Phe Thr Tyr Ser Arg Tyr Pro Trp His Arg Phe Pro Val 1 5 10 15

Thr Phe Gly <210> 28 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Human <400> 28

Arg Glu Leu Thr Tyr Ser Asn Phe His Pro Leu Leu 1 5 10 <210> 29 <211> 17 <212> БЕЛОК <213> Human <400> 29

Phe Thr Ser Cys Ser Glu Arg His Phe Val Ser Leu Cys Gln Lys Tyr 1 5 10 15

Ser <210> 30 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Human

- 69 046736 <400> 30

Thr Val Lys Tyr Leu Asn Asn Leu Tyr Lys Ile Ile 1 5 10 <210> 31 <211> 11 <212> БЕЛОК <213> Human <400> 31

Glu Ala Val Tyr Phe His Gln His Ser Ile Leu

5 10 <210> 32 <211> 11 <212> БЕЛОК <213> Human <400> 32

Lys Lys Leu Ser Arg Leu Thr Tyr Ser Ser Cys

5 10 <210> 33 <211> 20 <212> БЕЛОК <213> Human <400> 33

Asn Gly Ser Arg Trp Ile Gln Tyr Lys Gly His Cys Tyr Lys Ser Asp 1 5 10 15

Gln Ala Leu His 20 <210> 34 <211> 25 <212> БЕЛОК <213> Human <400> 34

Ile Ser Glu Trp Pro Ile Asp Asp His Phe Thr Tyr Ser Arg Tyr Pro 1 5 10 15

Trp His Arg Phe Pro Val Thr Phe Gly 20 25 <210> 35 <211> 20 <212> БЕЛОК <213> Human

- 70 046736 <400> 35

Gln Thr Leu Gln Asn Ala Ser Glu Thr Val Lys Tyr Leu Asn Asn Leu 1 5 10 15

Tyr Lys Ile Ile 20 <210> 36 <211> 10 <212> БЕЛОК <213> Human <400> 36

Asp Asp His Phe Thr Tyr Ser Arg Tyr Pro

5 10 <210> 37 <211> 15 <212> БЕЛОК <213> Human <400> 37

Phe Thr Ser Cys Ser Glu Arg His Phe Val Ser Leu Cys Gln Lys 1 5 10 15 <210> 38 <211> 468 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Тяжелая цепь A1 <400> 38

Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly 1 5 10 15

Val His Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys 20 25 30

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Tyr 35 40 45

Ser Asn Ala Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60

Glu Trp Val Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp 65 70 75 80

- 71 046736

Tyr Ala Ala Pro Val Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser 85 90 95

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Phe Gly Val Val Ser Phe Asp Tyr Trp

115 120 125

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

130 135 140

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

145 150 155 160

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

165 170 175

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

180 185 190

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

195 200 205

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

210 215 220

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 225 230 235 240

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu

245 250 255

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

260 265 270

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

275 280 285

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

290 295 300

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

305 310 315 320

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

- 72 046736

325 330 335

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

340 345 350

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

355 360 365

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

370 375 380

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

385 390 395 400

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

405 410 415

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

420 425 430

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

435 440 445

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

450 455 460

Ser Pro Gly Lys 465 <210> 39 <211> 234 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Легкая цепь A1 <400> 39

Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr 1 5 10 15

Asp Ala Arg Cys Asp Val Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30

Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser 35 40 45

Ile Ser Asp Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro

- 73 046736

55 60

Asn Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Lys Thr Gly Val Pro Ser 65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95

Thr Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr

100 105 110

Arg Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

115 120 125

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

130 135 140

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 145 150 155 160

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

165 170 175

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

180 185 190

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

195 200 205

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

210 215 220

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230 <210> 40 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Homo sapiens <400> 40

Gly Trp His Phe Tyr Asp Asp Arg 1 5 <210> 41 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Homo sapiens

- 74 046736 <400> 41

Ile Ser Glu Trp Pro Ile Asp Asp His Phe Thr Tyr Ser Arg 1 5 10 <210> 42 <211> 15 <212> БЕЛОК <213> Homo sapiens <400> 42

Phe Pro Val Thr Phe Gly Glu Glu Cys Leu Tyr Met Ser Ala Lys 1 5 10 15 <210> 43 <211> 15 <212> БЕЛОК <213> Homo sapiens <400> 43

Glu Leu Thr Tyr Ser Asn Phe His Pro Leu Leu Val Ser Gly Arg 1 5 10 15 <210> 44 <211>8 <212> БЕЛОК <213> Homo sapiens <400> 44

His Phe Val Ser Leu Cys Gln Lys 1 5 <210> 45 <211> 11 <212> БЕЛОК <213> Homo sapiens <400> 45

Gln Thr Leu Gln Asn Ala Ser Glu Thr Val Lys

5 10 <210> 46 <211> 4 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Линкер <400> 46

Gly Phe Leu Gly

- 75 046736 <210> 47 <211>8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 47

Trp Glu Val Lys Asp Cys Arg Ser

5 <210> 48 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 48

Glu Val Lys Asp Cys Arg Ser Phe

5 <210> 49 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 49

Val Lys Asp Cys Arg Ser Phe Lys

5 <210> 50 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 50

Lys Asp Cys Arg Ser Phe Lys Ala

5 <210> 51 <211> 8 <212> БЕЛОК

- 76 046736 <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 51

Asp Cys Arg Ser Phe Lys Ala Leu

5 <210> 52 <211>8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 52

Cys Arg Ser Phe Lys Ala Leu Ser

5 <210> 53 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 53

Arg Ser Phe Lys Ala Leu Ser Ile

5 <210> 54 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 54

Pro Ala Ser Leu Ser Cys Tyr Lys

5 <210> 55 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 55

- 77 046736

Ala Ser Leu Ser Cys Tyr Lys Val 1 5 <210> 56 <211>8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 56

Ser Leu Ser Cys Tyr Lys Val Phe

5 <210> 57 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 57

Leu Ser Cys Tyr Lys Val Phe His

5 <210> 58 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 58

Ser Cys Tyr Lys Val Phe His Ala

5 <210> 59 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 59

Cys Tyr Lys Val Phe His Ala Glu

5 <210> 60

- 78 046736 <211>8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 60

Tyr Lys Val Phe His Ala Glu Arg

5 <210> 61 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 61

Lys Val Phe His Ala Glu Arg Ile

5 <210> 62 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 62

Val Phe His Ala Glu Arg Ile Val

5 <210> 63 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 63

Phe His Ala Glu Arg Ile Val Arg

5 <210> 64 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид

- 79 046736 <400> 64

Asp Cys Ala Ala Val Lys Val Phe 1 5 <210> 65 <211>8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 65

Ala Ala Val Lys Val Phe His Arg

5 <210> 66 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 66

Val Lys Val Phe His Arg Pro Trp

5 <210> 67 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 67

Val Phe His Arg Pro Trp Arg Arg

5 <210> 68 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 68

His Arg Pro Trp Arg Arg Gly Trp

5

- 80 046736 <210> 69 <211>8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 69

Pro Trp Arg Arg Gly Trp His Phe

5 <210> 70 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 70

Arg Arg Gly Trp His Phe Tyr Asp

5 <210> 71 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 71

Gly Trp His Phe Tyr Asp Asp Arg

5 <210> 72 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 72

His Phe Tyr Asp Asp Arg Glu Phe

5 <210> 73 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность

- 81 046736 <220>

<223> Пептид <400> 73

Tyr Asp Asp Arg Glu Phe Ile Tyr 1 5 <210> 74 <211>8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 74

Asp Arg Glu Phe Ile Tyr Leu Arg

5 <210> 75 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 75

Glu Phe Ile Tyr Leu Arg Pro Phe

5 <210> 76 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 76

Pro Ile Asp Asp His Phe Thr Tyr

5 <210> 77 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 77

Ile Asp Asp His Phe Thr Tyr Ser

- 82 046736 <210> 78 <211>8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 78

Asp Asp His Phe Thr Tyr Ser Arg

5 <210> 79 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 79

Asp His Phe Thr Tyr Ser Arg Tyr

5 <210> 80 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 80

His Phe Thr Tyr Ser Arg Tyr Pro

5 <210> 81 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 81

Phe Thr Tyr Ser Arg Tyr Pro Trp

5 <210> 82 <211> 8 <212> БЕЛОК

- 83 046736 <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 82

Thr Tyr Ser Arg Tyr Pro Trp His

5 <210> 83 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 83

Tyr Ser Arg Tyr Pro Trp His Arg

5 <210> 84 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 84

Ser Arg Tyr Pro Trp His Arg Phe

5 <210> 85 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 85

Arg Tyr Pro Trp His Arg Phe Pro

5 <210> 86 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 86

- 84 046736

Tyr Pro Trp His Arg Phe Pro Val 1 5 <210> 87 <211>8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 87

Pro Trp His Arg Phe Pro Val Thr

5 <210> 88 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 88

Trp His Arg Phe Pro Val Thr Phe

5 <210> 89 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 89

His Arg Phe Pro Val Thr Phe Gly

5 <210> 90 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 90

Arg Glu Leu Thr Tyr Ser Asn Phe

5 <210> 91

- 85 046736 <211>8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 91

Glu Leu Thr Tyr Ser Asn Phe His

5 <210> 92 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 92

Leu Thr Tyr Ser Asn Phe His Pro

5 <210> 93 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 93

Thr Tyr Ser Asn Phe His Pro Leu

5 <210> 94 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 94

Tyr Ser Asn Phe His Pro Leu Leu

5 <210> 95 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид

- 86 046736 <400> 95

Ser Asn Phe His Pro Leu Leu Val 1 5 <210> 96 <211>8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 96

Asn Phe His Pro Leu Leu Val Ser

5 <210> 97 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 97

Phe His Pro Leu Leu Val Ser Gly

5 <210> 98 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 98

His Pro Leu Leu Val Ser Gly Arg

5 <210> 99 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 99

Pro Leu Leu Val Ser Gly Arg Leu

5

- 87 046736 <210> 100 <211>8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 100

Leu Leu Val Ser Gly Arg Leu Arg

5 <210> 101 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 101

Leu Val Ser Gly Arg Leu Arg Ile

5 <210> 102 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 102

Val Ser Gly Arg Leu Arg Ile Pro

5 <210> 103 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 103

Phe Thr Ser Cys Ser Glu Arg His

5 <210> 104 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность

- 88 046736 <220>

<223> Пептид <400> 104

Thr Ser Cys Ser Glu Arg His Phe 1 5 <210> 105 <211>8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 105

Ser Cys Ser Glu Arg His Phe Val

5 <210> 106 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 106

Cys Ser Glu Arg His Phe Val Ser

5 <210> 107 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 107

Ser Glu Arg His Phe Val Ser Leu

5 <210> 108 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 108

Glu Arg His Phe Val Ser Leu Cys

- 89 046736 <210> 109 <211>8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 109

Arg His Phe Val Ser Leu Cys Gln

5 <210> 110 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400>110

His Phe Val Ser Leu Cys Gln Lys

5 <210> 111 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400>111

Phe Val Ser Leu Cys Gln Lys Tyr

5 <210> 112 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400>112

Val Ser Leu Cys Gln Lys Tyr Ser

5 <210> 113 <211> 8 <212> БЕЛОК

- 90 046736 <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400>113

Ser Leu Cys Gln Lys Tyr Ser Glu

5 <210> 114 <211>8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400>114

Leu Cys Gln Lys Tyr Ser Glu Val

5 <210> 115 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400>115

Cys Gln Lys Tyr Ser Glu Val Lys

5 <210>116 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400>116

Gln Lys Tyr Ser Glu Val Lys Ser

5 <210>117 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400>117

- 91 046736

Thr Val Lys Tyr Leu Asn Asn Leu 1 5 <210>118 <211>8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400>118

Val Lys Tyr Leu Asn Asn Leu Tyr

5 <210>119 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400>119

Lys Tyr Leu Asn Asn Leu Tyr Lys

5 <210> 120 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 120

Tyr Leu Asn Asn Leu Tyr Lys Ile

5 <210> 121 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 121

Leu Asn Asn Leu Tyr Lys Ile Ile

5 <210> 122

- 92 046736 <211>8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 122

Asn Asn Leu Tyr Lys Ile Ile Pro

5 <210> 123 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 123

Asn Leu Tyr Lys Ile Ile Pro Lys

5 <210> 124 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 124

Leu Tyr Lys Ile Ile Pro Lys Thr

5 <210> 125 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 125

Tyr Lys Ile Ile Pro Lys Thr Leu

5 <210> 126 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид

- 93 046736 <400> 126

Lys Ile Ile Pro Lys Thr Leu Thr 1 5 <210> 127 <211>8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 127

Ile Ile Pro Lys Thr Leu Thr Trp

5 <210> 128 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 128

Ile Pro Lys Thr Leu Thr Trp His

5 <210> 129 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 129

Pro Lys Thr Leu Thr Trp His Ser

5 <210> 130 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400>130

Lys Thr Leu Thr Trp His Ser Ala

5

- 94 046736 <210> 131 <211>8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 131

Thr Leu Thr Trp His Ser Ala Lys

5 <210> 132 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400>132

Glu Ala Val Tyr Phe His Gln His

5 <210> 133 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400>133

Ala Val Tyr Phe His Gln His Ser

5 <210> 134 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400>134

Val Tyr Phe His Gln His Ser Ile

5 <210> 135 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность

- 95 046736 <220>

<223> Пептид <400>135

Tyr Phe His Gln His Ser Ile Leu 1 5 <210>136 <211>8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400>136

Phe His Gln His Ser Ile Leu Ala

5 <210>137 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400>137

Lys Lys Leu Ser Arg Leu Thr Tyr

5 <210> 138 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 138

Lys Leu Ser Arg Leu Thr Tyr Ser

5 <210> 139 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 139

Leu Ser Arg Leu Thr Tyr Ser Ser

- 96 046736 <210> 140 <211>8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 140

Ser Arg Leu Thr Tyr Ser Ser Arg

5 <210> 141 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 141

Arg Leu Thr Tyr Ser Ser Arg Cys

5 <210> 142 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 142

Asn Gly Ser Arg Trp Ile Gln Tyr

5 <210> 143 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 143

Gly Ser Arg Trp Ile Gln Tyr Lys

5 <210> 144 <211> 8 <212> БЕЛОК

- 97 046736 <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 144

Ser Arg Trp Ile Gln Tyr Lys Gly

5 <210> 145 <211>8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 145

Arg Trp Ile Gln Tyr Lys Gly His

5 <210> 146 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 146

Trp Ile Gln Tyr Lys Gly His Cys

5 <210> 147 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 147

Ile Gln Tyr Lys Gly His Cys Tyr

5 <210> 148 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 148

- 98 046736

Gln Tyr Lys Gly His Cys Tyr Lys 1 5 <210> 149 <211>8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 149

Tyr Lys Gly His Cys Tyr Lys Ser

5 <210> 150 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400>150

Lys Gly His Cys Tyr Lys Ser Asp

5 <210> 151 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 151

Gly His Cys Tyr Lys Ser Asp Gln

5 <210> 152 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400>152

His Cys Tyr Lys Ser Asp Gln Ala

5 <210> 153

- 99 046736 <211>8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 153

Cys Tyr Lys Ser Asp Gln Ala Leu

5 <210> 154 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 154

Tyr Lys Ser Asp Gln Ala Leu His

5 <210> 155 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 155

Lys Ser Asp Gln Ala Leu His Ser

5 <210> 156 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 156

Ser Asp Gln Ala Leu His Ser Phe

5 <210> 157 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид

- 100 046736 <400> 157

Asp Gln Ala Leu His Ser Phe Ser 1 5 <210> 158 <211> 1722 <212> БЕЛОК <213> Homo sapiens <400> 158

Met Arg Thr Gly Trp Ala Thr Pro Arg Arg Pro Ala Gly Leu Leu Met 1 5 10 15

Leu Leu Phe Trp Phe Phe Asp Leu Ala Glu Pro Ser Gly Arg Ala Ala 20 25 30

Asn Asp Pro Phe Thr Ile Val His Gly Asn Thr Gly Lys Cys Ile Lys 35 40 45

Pro Val Tyr Gly Trp Ile Val Ala Asp Asp Cys Asp Glu Thr Glu Asp 50 55 60

Lys Leu Trp Lys Trp Val Ser Gln His Arg Leu Phe His Leu His Ser 65 70 75 80

Gln Lys Cys Leu Gly Leu Asp Ile Thr Lys Ser Val Asn Glu Leu Arg 85 90 95

Met Phe Ser Cys Asp Ser Ser Ala Met Leu Trp Trp Lys Cys Glu His

100 105 110

His Ser Leu Tyr Gly Ala Ala Arg Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Asp Gly

115 120 125

His Gly Thr Ala Ile Ser Asn Ala Ser Asp Val Trp Lys Lys Gly Gly

130 135 140

Ser Glu Glu Ser Leu Cys Asp Gln Pro Tyr His Glu Ile Tyr Thr Arg

145 150 155 160

Asp Gly Asn Ser Tyr Gly Arg Pro Cys Glu Phe Pro Phe Leu Ile Asp

165 170 175

Gly Thr Trp His His Asp Cys Ile Leu Asp Glu Asp His Ser Gly Pro

180 185 190

- 101 046736

Trp Cys Ala Thr Thr Leu Asn Tyr Glu Tyr Asp Arg Lys Trp Gly Ile

195 200 205

Cys Leu Lys Pro Glu Asn Gly Cys Glu Asp Asn Trp Glu Lys Asn Glu

210 215 220

Gln Phe Gly Ser Cys Tyr Gln Phe Asn Thr Gln Thr Ala Leu Ser Trp

225 230 235 240

Lys Glu Ala Tyr Val Ser Cys Gln Asn Gln Gly Ala Asp Leu Leu Ser

245 250 255

Ile Asn Ser Ala Ala Glu Leu Thr Tyr Leu Lys Glu Lys Glu Gly Ile

260 265 270

Ala Lys Ile Phe Trp Ile Gly Leu Asn Gln Leu Tyr Ser Ala Arg Gly

275 280 285

Trp Glu Trp Ser Asp His Lys Pro Leu Asn Phe Leu Asn Trp Asp Pro

290 295 300

Asp Arg Pro Ser Ala Pro Thr Ile Gly Gly Ser Ser Cys Ala Arg Met 305 310 315 320

Asp Ala Glu Ser Gly Leu Trp Gln Ser Phe Ser Cys Glu Ala Gln Leu

325 330 335

Pro Tyr Val Cys Arg Lys Pro Leu Asn Asn Thr Val Glu Leu Thr Asp

340 345 350

Val Trp Thr Tyr Ser Asp Thr Arg Cys Asp Ala Gly Trp Leu Pro Asn

355 360 365

Asn Gly Phe Cys Tyr Leu Leu Val Asn Glu Ser Asn Ser Trp Asp Lys

370 375 380

Ala His Ala Lys Cys Lys Ala Phe Ser Ser Asp Leu Ile Ser Ile His 385 390 395 400

Ser Leu Ala Asp Val Glu Val Val Val Thr Lys Leu His Asn Glu Asp 405 410 415

Ile Lys Glu Glu Val Trp Ile Gly Leu Lys Asn Ile Asn Ile Pro Thr

420 425 430

Leu Phe Gln Trp Ser Asp Gly Thr Glu Val Thr Leu Thr Tyr Trp Asp

435 440 445

- 102 046736

Glu Asn Glu Pro Asn Val Pro Tyr Asn Lys Thr Pro Asn Cys Val Ser

450 455 460

Tyr Leu Gly Glu Leu Gly Gln Trp Lys Val Gln Ser Cys Glu Glu Lys

465 470 475 480

Leu Lys Tyr Val Cys Lys Arg Lys Gly Glu Lys Leu Asn Asp Ala Ser

485 490 495

Ser Asp Lys Met Cys Pro Pro Asp Glu Gly Trp Lys Arg His Gly Glu

500 505 510

Thr Cys Tyr Lys Ile Tyr Glu Asp Glu Val Pro Phe Gly Thr Asn Cys

515 520 525

Asn Leu Thr Ile Thr Ser Arg Phe Glu Gln Glu Tyr Leu Asn Asp Leu

530 535 540

Met Lys Lys Tyr Asp Lys Ser Leu Arg Lys Tyr Phe Trp Thr Gly Leu 545 550 555 560

Arg Asp Val Asp Ser Cys Gly Glu Tyr Asn Trp Ala Thr Val Gly Gly

565 570 575

Arg Arg Arg Ala Val Thr Phe Ser Asn Trp Asn Phe Leu Glu Pro Ala

580 585 590

Ser Pro Gly Gly Cys Val Ala Met Ser Thr Gly Lys Ser Val Gly Lys

595 600 605

Trp Glu Val Lys Asp Cys Arg Ser Phe Lys Ala Leu Ser Ile Cys Lys

610 615 620

Lys Met Ser Gly Pro Leu Gly Pro Glu Glu Ala Ser Pro Lys Pro Asp 625 630 635 640

Asp Pro Cys Pro Glu Gly Trp Gln Ser Phe Pro Ala Ser Leu Ser Cys

645 650 655

Tyr Lys Val Phe His Ala Glu Arg Ile Val Arg Lys Arg Asn Trp Glu

660 665 670

Glu Ala Glu Arg Phe Cys Gln Ala Leu Gly Ala His Leu Ser Ser Phe

675 680 685

- 103 046736

Ser His Val Asp Glu Ile Lys Glu Phe Leu His Phe Leu Thr Asp Gln 690 695 700

Phe Ser Gly Gln His Trp Leu Trp Ile Gly Leu Asn Lys Arg Ser Pro 705 710 715 720

Asp Leu Gln Gly Ser Trp Gln Trp Ser Asp Arg Thr Pro Val Ser Thr

725 730 735

Ile Ile Met Pro Asn Glu Phe Gln Gln Asp Tyr Asp Ile Arg Asp Cys

740 745 750

Ala Ala Val Lys Val Phe His Arg Pro Trp Arg Arg Gly Trp His Phe

755 760 765

Tyr Asp Asp Arg Glu Phe Ile Tyr Leu Arg Pro Phe Ala Cys Asp Thr

770 775 780

Lys Leu Glu Trp Val Cys Gln Ile Pro Lys Gly Arg Thr Pro Lys Thr 785 790 795 800

Pro Asp Trp Tyr Asn Pro Asp Arg Ala Gly Ile His Gly Pro Pro Leu

805 810 815

Ile Ile Glu Gly Ser Glu Tyr Trp Phe Val Ala Asp Leu His Leu Asn

820 825 830

Tyr Glu Glu Ala Val Leu Tyr Cys Ala Ser Asn His Ser Phe Leu Ala

835 840 845

Thr Ile Thr Ser Phe Val Gly Leu Lys Ala Ile Lys Asn Lys Ile Ala

850 855 860

Asn Ile Ser Gly Asp Gly Gln Lys Trp Trp Ile Arg Ile Ser Glu Trp 865 870 875 880

Pro Ile Asp Asp His Phe Thr Tyr Ser Arg Tyr Pro Trp His Arg Phe

885 890 895

Pro Val Thr Phe Gly Glu Glu Cys Leu Tyr Met Ser Ala Lys Thr Trp

900 905 910

Leu Ile Asp Leu Gly Lys Pro Thr Asp Cys Ser Thr Lys Leu Pro Phe

915 920 925

Ile Cys Glu Lys Tyr Asn Val Ser Ser Leu Glu Lys Tyr Ser Pro Asp

930 935 940

- 104 046736

Ser Ala Ala Lys Val Gln Cys Ser Glu Gln Trp Ile Pro Phe Gln Asn

945 950 955 960

Lys Cys Phe Leu Lys Ile Lys Pro Val Ser Leu Thr Phe Ser Gln Ala

965 970 975

Ser Asp Thr Cys His Ser Tyr Gly Gly Thr Leu Pro Ser Val Leu Ser

980 985 990

Gln Ile Glu Gln Asp Phe Ile Thr Ser Leu Leu Pro Asp Met Glu Ala 995 1000 1005

Thr Leu Trp Ile Gly Leu Arg Trp Thr Ala Tyr Glu Lys Ile Asn 1010 1015 1020

Lys Trp Thr Asp Asn Arg Glu Leu Thr Tyr Ser Asn Phe His Pro 1025 1030 1035

Leu Leu Val Ser Gly Arg Leu Arg Ile Pro Glu Asn Phe Phe Glu 1040 1045 1050

Glu Glu Ser Arg Tyr His Cys Ala Leu Ile Leu Asn Leu Gln Lys 1055 1060 1065

Ser Pro Phe Thr Gly Thr Trp Asn Phe Thr Ser Cys Ser Glu Arg 1070 1075 1080

His Phe Val Ser Leu Cys Gln Lys Tyr Ser Glu Val Lys Ser Arg 1085 1090 1095

Gln Thr Leu Gln Asn Ala Ser Glu Thr Val Lys Tyr Leu Asn Asn 1100 1105 1110

Leu Tyr Lys Ile Ile Pro Lys Thr Leu Thr Trp His Ser Ala Lys 1115 1120 1125

Arg Glu Cys Leu Lys Ser Asn Met Gln Leu Val Ser Ile Thr Asp 1130 1135 1140

Pro Tyr Gln Gln Ala Phe Leu Ser Val Gln Ala Leu Leu His Asn 1145 1150 1155

Ser Ser Leu Trp Ile Gly Leu Phe Ser Gln Asp Asp Glu Leu Asn 1160 1165 1170

- 105 046736

Phe Gly Trp Ser Asp Gly Lys Arg Leu His Phe Ser Arg Trp Ala 1175 1180 1185

Glu Thr Asn Gly Gln Leu Glu Asp Cys Val Val Leu Asp Thr Asp 1190 1195 1200

Gly Phe Trp Lys Thr Val Asp Cys Asn Asp Asn Gln Pro Gly Ala 1205 1210 1215

Ile Cys Tyr Tyr Ser Gly Asn Glu Thr Glu Lys Glu Val Lys Pro 1220 1225 1230

Val Asp Ser Val Lys Cys Pro Ser Pro Val Leu Asn Thr Pro Trp 1235 1240 1245

Ile Pro Phe Gln Asn Cys Cys Tyr Asn Phe Ile Ile Thr Lys Asn 1250 1255 1260

Arg His Met Ala Thr Thr Gln Asp Glu Val His Thr Lys Cys Gln 1265 1270 1275

Lys Leu Asn Pro Lys Ser His Ile Leu Ser Ile Arg Asp Glu Lys 1280 1285 1290

Glu Asn Asn Phe Val Leu Glu Gln Leu Leu Tyr Phe Asn Tyr Met 1295 1300 1305

Ala Ser Trp Val Met Leu Gly Ile Thr Tyr Arg Asn Lys Ser Leu 1310 1315 1320

Met Trp Phe Asp Lys Thr Pro Leu Ser Tyr Thr His Trp Arg Ala 1325 1330 1335

Gly Arg Pro Thr Ile Lys Asn Glu Lys Phe Leu Ala Gly Leu Ser 1340 1345 1350

Thr Asp Gly Phe Trp Asp Ile Gln Thr Phe Lys Val Ile Glu Glu 1355 1360 1365

Ala Val Tyr Phe His Gln His Ser Ile Leu Ala Cys Lys Ile Glu 1370 1375 1380

Met Val Asp Tyr Lys Glu Glu Tyr Asn Thr Thr Leu Pro Gln Phe 1385 1390 1395

Met Pro Tyr Glu Asp Gly Ile Tyr Ser Val Ile Gln Lys Lys Val 1400 1405 1410

- 106 046736

Thr Trp Tyr Glu Ala Leu Asn Met Cys Ser Gln Ser Gly Gly His 1415 1420 1425

Leu Ala Ser Val His Asn Gln Asn Gly Gln Leu Phe Leu Glu Asp 1430 1435 1440

Ile Val Lys Arg Asp Gly Phe Pro Leu Trp Val Gly Leu Ser Ser 1445 1450 1455

His Asp Gly Ser Glu Ser Ser Phe Glu Trp Ser Asp Gly Ser Thr 1460 1465 1470

Phe Asp Tyr Ile Pro Trp Lys Gly Gln Thr Ser Pro Gly Asn Cys 1475 1480 1485

Val Leu Leu Asp Pro Lys Gly Thr Trp Lys His Glu Lys Cys Asn 1490 1495 1500

Ser Val Lys Asp Gly Ala Ile Cys Tyr Lys Pro Thr Lys Ser Lys 1505 1510 1515

Lys Leu Ser Arg Leu Thr Tyr Ser Ser Arg Cys Pro Ala Ala Lys 1520 1525 1530

Glu Asn Gly Ser Arg Trp Ile Gln Tyr Lys Gly His Cys Tyr Lys 1535 1540 1545

Ser Asp Gln Ala Leu His Ser Phe Ser Glu Ala Lys Lys Leu Cys 1550 1555 1560

Ser Lys His Asp His Ser Ala Thr Ile Val Ser Ile Lys Asp Glu 1565 1570 1575

Asp Glu Asn Lys Phe Val Ser Arg Leu Met Arg Glu Asn Asn Asn 1580 1585 1590

Ile Thr Met Arg Val Trp Leu Gly Leu Ser Gln His Ser Val Asp 1595 1600 1605

Gln Ser Trp Ser Trp Leu Asp Gly Ser Glu Val Thr Phe Val Lys 1610 1615 1620

Trp Glu Asn Lys Ser Lys Ser Gly Val Gly Arg Cys Ser Met Leu 1625 1630 1635

- 107 046736

Ile Ala Ser Asn Glu Thr Trp Lys Lys Val Glu Cys Glu His Gly 1640 1645 1650

Phe Gly Arg Val Val Cys Lys Val Pro Leu Gly Pro Asp Tyr Thr 1655 1660 1665

Ala Ile Ala Ile Ile Val Ala Thr Leu Ser Ile Leu Val Leu Met 1670 1675 1680

Gly Gly Leu Ile Trp Phe Leu Phe Gln Arg His Arg Leu His Leu 1685 1690 1695

Ala Gly Phe Ser Ser Val Arg Tyr Ala Gln Gly Val Asn Glu Asp 1700 1705 1710

Glu Ile Met Leu Pro Ser Phe His Asp 1715 1720 <210> 159 <211> 23 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 159

Cys Ile Lys Pro Val Tyr Gly Trp Ile Val Ala Asp Asp Cys Asp Glu 1 5 10 15

Thr Glu Asp Lys Leu Trp Lys 20 <210> 160 <211> 11 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 160

Cys Glu His His Ser Leu Tyr Gly Ala Ala Arg

5 10 <210> 161 <211> 34 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

- 108 046736 <223> Пептид <400> 161

Asp Gly His Gly Thr Ala Ile Ser Asn Ala Ser Asp Val Trp Lys Lys 1 5 10 15

Gly Gly Ser Glu Glu Ser Leu Cys Asp Gln Pro Tyr His Glu Ile Tyr 20 25 30

Thr Arg <210> 162 <211> 19 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 162

Lys Gly Gly Ser Glu Glu Ser Leu Cys Asp Gln Pro Tyr His Glu Ile 1 5 10 15

Tyr Thr Arg <210> 163 <211> 18 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 163

Gly Gly Ser Glu Glu Ser Leu Cys Asp Gln Pro Tyr His Glu Ile Tyr 1 5 10 15

Thr Arg <210> 164 <211> 15 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 164

- 109 046736

Asp Gly His Gly Thr Ala Ile Ser Asn Ala Ser Asp Val Trp Lys 1 5 10 15 <210> 165 <211> 17 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 165

Trp Gly Ile Cys Leu Lys Pro Glu Asn Gly Cys Glu Asp Asn Trp Glu 1 5 10 15

Lys <210> 166 <211> 13 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 166

Ile Phe Trp Ile Gly Leu Asn Gln Leu Tyr Ser Ala Arg 1 5 10 <210> 167 <211> 15 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 167

Leu His Asn Glu Asp Ile Lys Glu Glu Val Trp Ile Gly Leu Lys 1 5 10 15 <210> 168 <211> 15 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 168

Thr Pro Asn Cys Val Ser Tyr Leu Gly Glu Leu Gly Gln Trp Lys 1 5 10 15

- 110 046736 <210> 169 <211> 23 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 169

Tyr Phe Trp Thr Gly Leu Arg Asp Val Asp Ser Cys Gly Glu Tyr Asn 1 5 10 15

Trp Ala Thr Val Gly Gly Arg 20 <210> 170 <211> 11 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 170

Ser Val Gly Lys Trp Glu Val Lys Asp Cys Arg

5 10 <210> 171 <211> 10 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 171

Trp Glu Val Lys Asp Cys Arg Ser Phe Lys

5 10 <210> 172 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 172

Ala Leu Ser Ile Cys Lys Lys

5

- 111 046736 <210> 173 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 173

Pro Ala Ser Leu Ser Cys Tyr Lys Val Phe His Ala 1 5 10 <210> 174 <211>8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 174

Arg Asn Trp Glu Glu Ala Glu Arg

5 <210> 175 <211> 33 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 175

Arg Ser Pro Asp Leu Gln Gly Ser Trp Gln Trp Ser Asp Arg Thr Pro 1 5 10 15

Val Ser Thr Ile Ile Met Pro Asn Glu Phe Gln Gln Asp Tyr Asp Ile 20 25 30

Arg <210> 176 <211> 19 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 176

Thr Pro Val Ser Thr Ile Ile Met Pro Asn Glu Phe Gln Gln Asp Tyr 1 5 10 15

- 112 046736

Asp Ile Arg <210> 177 <211> 20 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 177

Pro Trp Arg Arg Gly Trp His Phe Tyr Asp Asp Arg Glu Phe Ile Tyr 1 5 10 15

Leu Arg Pro Phe 20 <210> 178 <211>8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 178

Gly Trp His Phe Tyr Asp Asp Arg

5 <210> 179 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 179

Ile Ser Glu Trp Pro Ile Asp Asp His Phe Thr Tyr Ser Arg 1 5 10 <210> 180 <211> 19 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 180

- 113 046736

Asp Asp His Phe Thr Tyr Ser Arg Tyr Pro Trp His Arg Phe Pro Val 1 5 10 15

Thr Phe Gly <210> 181 <211> 30 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 181

Phe Pro Val Thr Phe Gly Glu Glu Cys Leu Tyr Met Ser Ala Lys Thr 1 5 10 15

Trp Leu Ile Asp Leu Gly Lys Pro Thr Asp Cys Ser Thr Lys 20 25 30 <210> 182 <211> 15 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 182

Thr Trp Leu Ile Asp Leu Gly Lys Pro Thr Asp Cys Ser Thr Lys 1 5 10 15 <210> 183 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 183

Tyr Asn Val Ser Ser Leu Glu Lys

5 <210> 184 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид

- 114 046736 <400> 184

Val Gln Cys Ser Glu Gln Trp Ile Pro Phe Gln Asn 1 5 10 <210> 185 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 185

Arg Glu Leu Thr Tyr Ser Asn Phe His Pro Leu Leu 1 5 10 <210> 186 <211> 39 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 186

Glu Leu Thr Tyr Ser Asn Phe His Pro Leu Leu Val Ser Gly Arg Leu 1 5 10 15

Arg Ile Pro Glu Asn Phe Phe Glu Glu Glu Ser Arg Tyr His Cys Ala 20 25 30

Leu Ile Leu Asn Leu Gln Lys 35 <210> 187 <211> 11 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 187

Tyr His Cys Ala Leu Ile Leu Asn Leu Gln Lys

5 10 <210> 188 <211> 17 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

- 115 046736 <223> Пептид <400> 188

Phe Thr Ser Cys Ser Glu Arg His Phe Val Ser Leu Cys Gln Lys Tyr 1 5 10 15

Ser <210> 189 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 189

His Phe Val Ser Leu Cys Gln Lys

5 <210> 190 <211> 11 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 190

Gln Thr Leu Gln Asn Ala Ser Glu Thr Val Lys

5 10 <210> 191 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 191

Thr Val Lys Tyr Leu Asn Asn Leu Tyr Lys Ile Ile

5 10 <210> 192 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид

- 116 046736 <400> 192

Thr Leu Thr Trp His Ser Ala Lys 1 5 <210> 193 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 193

Asn Arg His Met Ala Thr Thr Gln Asp Glu Val His Thr Lys 1 5 10 <210> 194 <211>7 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 194

Ser His Ile Leu Ser Ile Arg

5 <210> 195 <211> 16 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 195

Ser Leu Met Trp Phe Asp Lys Thr Pro Leu Ser Tyr Thr His Trp Arg 1 5 10 15 <210> 196 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 196

Ser Leu Met Trp Phe Asp Lys

5

- 117 046736 <210> 197 <211> 11 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 197

Glu Ala Val Tyr Phe His Gln His Ser Ile Leu

5 10 <210> 198 <211> 10 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 198

Lys Lys Leu Ser Arg Leu Thr Tyr Ser Ser

5 10 <210> 199 <211> 20 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 199

Asn Gly Ser Arg Trp Ile Gln Tyr Lys Gly His Cys Tyr Lys Ser Asp 1 5 10 15

Gln Ala Leu His 20 <210> 200 <211> 21 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 200

His Asp His Ser Ala Thr Ile Val Ser Ile Lys Asp Glu Asp Glu Asn 1 5 10 15

Lys Phe Val Ser Arg

- 118 046736 <210> 201 <211>9 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пептид <400> 201

Val Glu Cys Glu His Gly Phe Gly Arg

5 <210> 202 <211> 1404 <212> ДНК <213> Homo sapiens <400> 202 atggaatgga gctgggtgtt cctgttcttt ctgtccgtga ccacaggcgt gcattctgaa 60 gttcagctgg tcgaaagcgg aggaggtctg gtgaaacccg gtggctccct gaggctgagc 120 tgcgccgcct ccggctttac ttacagtaat gcctggatgt cctgggtcag acaggcccca 180 ggtaagggtc tggagtgggt gggtaggatt aagtctaaaa ctgatggcgg gacaacagac 240 tatgccgccc cagtgcaagg acggttcacc atttctaggg acgactctaa gaatacactg 300 tatctgcaga tgaacagcct caaaacagaa gacactgccg tttactactg taccatcttt 360 ggcgttgtct cctttgatta ttggggacag ggtacactcg tgaccgtttc ttccgcaagt 420 acaaaggggc catcagtgtt tccactggcc ccatcctcta agagcactag tggcggcaca 480 gccgccctgg gatgtctggt gaaggactat ttcccagagc ctgtgaccgt cagctggaac 540 agtggtgctc tcacctcagg tgtgcacaca ttccccgctg tgctccaatc cagtggcctc 600 tacagtctga gcagcgttgt gactgttccc agtagctcac tgggcaccca aacctacata 660 tgcaatgtga accataaacc tagcaatacc aaagtggaca agaaagtgga acctaagtcc 720 tgtgacaaga ctcatacctg tcctccttgt cctgccccag agctgctcgg aggcccttcc 780 gtctttctct tcccaccaaa gccaaaggat accctgatga tcagccggac acctgaggtt 840 acctgcgttg tggtcgacgt ttcacacgag gatcctgaag tcaaattcaa ctggtacgtt 900 gatggagtcg aggtccacaa cgccaaaacc aagcctcgcg aagaacaata caatagcaca 960 tatagggtgg tgtctgtgct cactgtcctg caccaggact ggctgaacgg caaggagtac 1020 aaatgcaagg ttagtaacaa ggccctgccc gcacccattg agaagactat cagtaaagct 1080 aagggccagc ctcgcgagcc tcaggtttac accctgcctc cctctagaga ggaaatgaca 1140 aagaaccagg tgtctctcac ctgcctggtt aaaggattct atccatccga cattgctgtg 1200

- 119 -

Claims (1)

1. gaatgggaat ccaacggaca gcccgaaaac aactataaga caacaccacc tgttctggat 1260 tccgatggtt ccttctttct gtattccaaa ctcacagtgg acaagagtcg ctggcagcaa 1320 ggtaacgtgt tttcttgctc cgtgatgcac gaagcactcc acaatcacta cactcagaag 1380 agtctcagcc tctctccagg caaa 1404 <210> 203 <211> 702 <212> ДНК <213> homo sapiens <400> 203 atgtctgtgc ctacccaggt gctgggactg ctgctgctgt ggctgacaga cgcccgctgt 60 gatgttcaga tgacacagtc tccaagtagt ctcagcgcaa gcgttggcga cagagtgact 120 atcacatgca gagcctctca gtctatctct gactatctgt cttggtacca gcagaggcca 180 ggcaaagctc caaacctcct gatctatgct gccagtaatc tgaagacagg cgtgcctagt 240 agattctccg ggtccggtag tgggactgat ttcaccctga caatctccac actgcaacct 300 gaggattttg ctacctacta ttgtcagcaa tcttatcgca gcccttggac cttcggacag 360 gggactaagg ttgagattaa acgcaccgtg gcagcaccca gcgtctttat ctttcctccc 420 tccgacgagc agctcaagtc cggaacagca tcagtcgttt gcctcctgaa taacttttat 480 ccaagggagg ccaaggtcca gtggaaagtc gacaatgccc tccaatctgg taactcccag 540 gagtctgtga ctgaacaaga ttctaaggac agtacctatt cactcagctc caccctgacc 600 ctcagcaaag cagactacga aaagcataaa gtttacgctt gcgaagtgac ccaccaaggc 660 ctgtcttctc ctgtcacaaa gagttttaat agaggggagt gt 702

   ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Фармацевтическая комбинация, содержащая (A) антитело к LY75 или его антигенсвязывающую часть, при этом указанные антитело или часть содержат:

   a) вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит:

   i) первую vhCDR, содержащую SEQ ID NO: 5;

   ii) вторую vhCDR, содержащую SEQ ID NO: 6; и iii) третью vhCDR, содержащую SEQ ID NO: 7; и

   b) вариабельную область легкой цепи, которая содержит:

   i) первую vlCDR, содержащую SEQ ID NO: 8;

   ii) вторую vlCDR, содержащую SEQ ID NO: 9; и iii) третью vlCDR, содержащую SEQ ID NO: 10; или антитело к LY75 или его антигенсвязывающую часть, при этом указанные антитело или часть содержат:

   a) вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит:

   i) первую vhCDR, содержащую SEQ ID NO: 5;

   ii) вторую vhCDR, содержащую SEQ ID NO: 6; и iii) третью vhCDR, содержащую SEQ ID NO: 7; и

   b) вариабельную область легкой цепи, которая содержит:

   i) первую vlCDR, содержащую SEQ ID NO: 8;

   ii) вторую vlCDR, содержащую SEQ ID NO: 9; и

   - 120 -