EA005097B1 - Синтез 1,3-оксаселеноланнуклеозидов, обладающих активностью против вируса иммунодефицита человека и против вируса гепатита-b - Google Patents

Abstract

Представляется способ получения 1,3-оксаселеноланнуклеозида или его фармацевтически приемлемой соли, эффективных при лечении инфекций ВИЧ, инфекций вируса гепатита-В или аномальной пролиферации клеток у человека и других животных.

Description

Предпосылки изобретения

Настоящее изобретение относится к области синтеза нуклеозидов и конкретно направлено на 1,3-оксаселеноланнуклеозиды и их фармацевтически приемлемые производные.

В 1981 году синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД) был определен как заболевание, которое в значительной степени нарушает иммунную систему человека и которое практически без исключений приводит к смерти. В 1983 году была определена этиология СПИДа, в основе которой находится вирус иммунодефицита человека - ВИЧ.

В 1985 году было сообщено, что синтетический нуклеозид 3'-азидо-3'-дезокситимидин (ΑΖΤ) подавляет репликацию вируса иммунодефицита человека. Затем была подтверждена эффективность в отношении ВИЧ ряда других синтетических нуклеозидов, включая 2',3'дидезоксиинозин (ΟΟΙ). 2',3'-дидезоксицитидин (ООС), 2',3'-дидезокси-2',3'-дидегидротимидин (Ο4Τ) и (18,4К)-4-[2-амино-6-циклопропиламино)-9Н-пурин-9-ил]-2-циклопентен-1-метанолсукцинат (159и89). В целом, после внутриклеточного фосфорилирования с участием клеточных киназ с образованием 5'-трифосфата эти синтетические нуклеозиды инкорпорируются в виде необычных нуклеотидов в растущую цепь вирусной ДНК, обусловливая тем самым терминацию цепи из-за отсутствия 3'-гидроксильной группы. Также они могут либо ингибировать активность вирусной обратной транскриптазы, либо активность ДНК-полимеразы.

Успешность подавления репликации ВИЧ ίη νίνο или ίη νίΐΓΟ различными синтетическими нуклеозидами позволила ряду исследователей сконструировать и протестировать нуклеозиды, которые замещают гетероатом на атом углерода в положении 3' в составе нуклеозида. Норбек с соавт. (№гЬсек с1 а1., 1989, ТеБгайебгоп ЬеББ., 30 [46], 6246) представил, что (±)-1-[(2β,4β-2(гидроксиметил)-4-диоксоланил]тимин (обозначенный как [±]-диоксолан-Т) проявляет активность средней степени в отношении ВИЧ (ЕС₅₀=20 мкМ в клетках АТН8) и не является токсичным для незараженных контрольных клеток в концентрации 200 мкМ. Заявка на европейский патент № 0337713 и патент США № 5041449, представленный фирмой ВюСйеш Рйагша 1пс., представляет рацемические 2замещенные-4-замещенные 1,3-диоксоланы, которые обладают антивирусной активностью. Опубликованные заявки РСТ/и8 91/09124 и РСТ/И8 93/08044 представляют очищенные βО-1,3-диоксоланилнуклеозиды, предназначенные для лечения ВИЧ-инфекции. РСТ представляет применение очищенных в-О-1,3-диоксоланилнуклеозидов для лечения ВИЧ-инфекции.

Заявка РСТ/и8 95/11464 представляет, что (-)-(28,48)-1-(2-гидроксиметил-1,3-диоксолан-4ил)цитозин применим для лечения опухолей и других случаев аномальной пролиферации клеток.

Патент США № 5047407 и заявка на европейский патент № 0382526 (в обоих случаях выполнены ВюСйеш 1пс.) представляют наличие антивирусной активности у ряда рацемических 2-замещенных-5-замещенных 1,3-оксатиоланнуклеозидов, а также сообщают в конкретном варианте, что рацемическая смесь 2гидроксиметил-5-(цитозин-1-ил)-1,3-оксатиолана (обозначаемого далее как ВСН-189) обладает примерно равной активностью в отношении ВИЧ, что и ΑΖΤ, характеризуясь при этом меньшим уровнем токсичности. Патент США № 5539116, авторы ЬюББа е1 а1., представляет (-)-энантиомер ВСН-189, известный как 3ТС, который в настоящее время используется в практике лечения ВИЧ-инфекции у человека в Соединенных Штатах Америки.

Также было представлено, что цис-2гидроксиметил-5-(5-фторцитозин-1-ил)-1,3-оксатиолан (РТС) обладает активностью против ВИЧ: 8с1ипа/1 еБ а1., №уетЬег 1992, 8е1есБше БпйБЬББюп оГ йитап БттипобейсБепсу У1гике8 Ьу гасетаБек апб епапБютегк οί с1ь-5-Пиого-1-|2(йубгоху теБйу 1)-1,3 -охаБйю1апе-5 -у1] су Бок ί пе. 1п АпББтБсгоЬБа1 АдепБк апб СйетоБйегару, рр. 2423-2431; также см. патент США № 5210085, патент США № 5204466, заявки на международный патент \УО 91/11186 и \УО 92/14743.

Другой вирус, который вызывает серьезную проблему со здоровьем человека, - это вирус гепатита-В (далее обозначаемый как ВГБ). ВГБ уступает только курительному табаку как причина рака у человека. Механизм, определяющий индукцию рака при заражении ВГБ, пока не выяснен. Предполагается, что он может напрямую опосредовать развитие опухоли или же косвенно вызывать развитие опухоли через механизмы индукции хронических воспалений, цирроза и регенерации клеток, ассоциированных с заражением этим вирусом.

После двух-шести месяцев инкубационного периода, в течение которых пораженный субъект не подозревает о заражении, ВГБинфекция может приводить к острому гепатиту и поражению печени, которые обусловливают боли в области брюшной полости, желтуху и повышение уровня некоторых ферментов в крови. ВГБ может обусловливать молниеносное развитие быстро прогрессирующего гепатита, часто фатальную форму заболевания, при которой разрушаются массивные области печени.

Обычно от острого гепатита пациентов вылечивают. Однако в некоторых случаях высокие уровни вирусного антигена персистируют в крови в течение протяженного или даже неопределенного периода времени, обусловливая тем самым хроническую инфекцию. Хронические инфекции могут приводить к хроническому персистирующему гепатиту. Наиболее часто пациенты, у которых имеется хроническая пер систирующая ВГБ-инфекция, отмечаются в развивающихся странах. По состоянию на середину 1991 года только в Азии насчитывалось 225 миллионов носителей хронической ВГБинфекции, а в мире в целом число носителей оценивалось в 300 миллионов человек. Хронический персистирующий гепатит может обусловливать утомляемость, цирроз печени и гепатоклеточную карциному, являющуюся первичным раком печени.

В индустриальных западных странах к группе повышенного риска по ВГБ-инфекции относятся те лица, которые контактируют с ВГБ-носителями или соответствующими пробами крови. Эпидемиология ВГБ в значительной степени сходна с таковой у синдрома приобретенного иммунодефицита, что объясняет, в частности, то, почему ВГБ-инфекция часто встречается у пациентов со СПИДом или СПИД-подобными комплексами. Однако, ВГБ более заразен в сравнении с ВИЧ.

И ЕТС, и 3ТС проявляют активность против ВГБ: см. Еигтап е1 а1., ПесетЬет 1992, ТЬе апй-Ьераййк В νίπΐδ асйуШек, су1о1ох1сШе8, апб апаЬойс ртоШек о£ 1Ье (-) апб (+) епапйотега о£ с18-5-11иого-1-[2-(йубгохуте1йу1)-1,3-оха1Ыо1апе5-у1|су1ойпе. 1п Апйт1сгоЫа1 Адепй апб СЬето1Ьетару, рр. 2686-2692; и СЬепд е1 а1., 1992, 1. Бю1. СЬет., 267(20), 13938-13942.

Полученная на основе сыворотки крови человека вакцина была создана для иммунизации пациентов против ВГБ. Однако позднее вакцины также были созданы с применением технологий генной инженерии, которые в настоящее время нашли широкое применение. К сожалению, вакцины не в состоянии помочь тем, кто уже инфицирован вирусом ВГБ. Ежедневное введение α-интерферона, полученного в виде генно-инженерного белка, является многообещающим, однако такое лечение оказывается успешным только примерно в одном случае из трех. Кроме того, интерферон не может применяться перорально.

С учетом того, что 1,3-диоксолан- и 1,3оксатиоланнуклеозиды обладают перспективной антивирусной и противоопухолевой активностью, представлялось интересным синтезировать класс изостерических соединений - 1,3оксаселеноланнуклеозидов - с точки зрения поиска нуклеозидов, представляющих биологический интерес. Несмотря на свое структурное сходство с замещенными по 3'-гетероатому нуклеозидами, синтез 1,3-оксаселеноланнуклеозидов был трудным из-за проблем с конструированием оксаселеноланового кольца. Скорее всего, именно этим объясняется то, что, повидимому, об 1,3-оксаселеноланнуклеозидах никогда ранее не сообщалось.

В свете того факта, что синдром приобретенного иммунодефицита, СПИД-родственный комплекс и вирусный гепатит В достигли уровня эпидемий во всем мире и обладают трагиче ским эффектом для зараженного пациента, сохраняется насущная необходимость в разработке новых эффективных лекарственных средств для лечения этих заболеваний.

Соответственно, объектом настоящего изобретения является представление соединений ряда 1,3-оксаселенола.

Другим объектом настоящего изобретения является представление способа и композиции для лечения пациентов или каких-либо животных, инфицированных ВГБ.

Другим объектом настоящего изобретения является представление способа синтеза 1,3оксаселеноланилнуклеозидов.

Еще одним вариантом настоящего изобретения является представление 1,3-оксаселеноланилнуклеозидов и фармацевтических композиций, включающих 1,3-оксаселеноланил нуклеозиды.

Резюме изобретения

Представляются оксаселеноланы, эффективные при лечении ВИЧ- и ВГБ-инфекций у человека и различных животных.

В одном из вариантов 1,3-оксаселеноланнуклеозид имеет такую формулу

где В - пуриновое или пиримидиновое основание, а К - водород, ацил или эфиры фосфорной кислоты, включая фосфорные моно-, ди- и триэфиры. В другом варианте 1,3-оксаселеноланилнуклеозид представляется в виде липофильного или гидрофильного пролекарства, что более подробно рассматривается ниже. В другом варианте атом селена в составе молекулы окислен. Предпочтительными 1,3 -оксаселеноланилнуклеозидами являются те, которые проявляют активность против ВИЧ или ВГБ в концентрации, которая не превышает 5 мкмоль, а наиболее предпочтительно - приблизительно 1 мкмоль или менее в тесте ш уйго, таком, которые подробно описаны в настоящей заявке. Для лечения ВИЧ и ВГБ также предпочтительно, чтобы 1,3оксаселеноланилнуклеозид характеризовался показателем токсичности 1С₅₀ в тесте ш уйго, таком, которые описаны в данном тексте, на уровне выше 50 мкмоль, а более предпочтительно на уровне приблизительно 100 ммоль или более.

1,3-оксаселеноланнуклеозид является преимущественно либо β-Ь-нуклеозидом, либо β-Όнуклеозидом в виде выделенного энантиомера. В одном из вариантов нуклеозидом являтся (βЬ- или β-Ό-нуклеозид в существенно очищенной форме, т. е. обеспечивается существенное отсутствие соответствующих β-Ь- или β-Όнуклеозидов.

Предпочтительными соединениями являются 2-гидроксиметил-4-(Х-5'-цитозин-1'-ил)1,3-оксаселенолан и 2-гидроксиметил-4-(Ы-5' фторцитозин-1'-ил)-1,3-оксаселенолан. Было установлено, что отдельный (-)-Р-Ь-энантиомер этих нуклеозидов оказывается более активным в сравнении с его β-Ό-вариантами. Однако (+)энантиомеры этих соединений нетоксичны в отношении клеток СЕМ.

Активное соединение, или его производные, или соли могут быть введены в сочетании или в чередовании с другим антивирусным средством, таким как иное анти-ВИЧ средство или анти-ВГБ средство, в соответствии с описанным в разделе IV. В целом, в ходе альтернационной терапии эффективные дозировки каждого средства вводят серийно, в то время как в комбинирующей терапии эффективные дозировки двух или большего числа средств вводят вместе. Дозировки зависят от уровня поглощения, темпа инактивации и уровня экскреции лекарственного средства в организме, равно как и от других факторов, известных специалистам в данной области техники. Необходимо отметить, что величины дозировок могут также варьироваться в зависимости от тяжести состояния, подвергаемого лечению. Также должно быть понятным, что в отношении конкретного пациента специфические дозировки и рекомендации могут быть скорректированы во времени в соответствии с индивидуальными потребностями и профессиональным уровнем специалиста, проводящего лечение с применением данных композиций .

Соединения также могут быть использованы для лечения заболеваний, вызываемых вирусом инфекционной анемии лошадей (ΕΙΑν), вирусом иммунодефицита кошачьих и вируса иммунодефицита обезьян (\Уап§ 8., Моп!е1ато В., 8ο1ιίηαζί ВВ, 1адет8к1 В., Ме11от§ Τ\ν.. ЭееешЬет, 12-13, 1993, АсДуйу оГ пие1ео81бе апй поп-пис1ео81бе теуеше 1гап5спр1а5е 1пЫЬйот8 (ΝΝΒΤΙ) адашй ес.|шпе шГесйоик апеш1а νίη.ΐ5 (ΕΙΑν), Είτδΐ №Шопа1 СопГегепсе оп Нитап Ве1гоу1Ш5е5 & Ве1а1ей 1пГес1юп5, '№а8Ыпд1оп, ИС; 8е11оп Э.С., 1993, Ес.|шпе 1пГесйои§ Апет1а, Vеΐ. С1ш. №г111 Агпег. Ес.|шпе Ргаск И8, 9, 321336; РЫ1рой М.8., ЕЬпег Ι.Ρ., Нооуег Ε.Α., 1992, Еуа1иаНоп оГ 9-(2-р11о5р1юпу1те111охуе111у1) айешпе 1йегару Гог Гейне нптипойеПаепсу νίη.ΐ5 ихшд а циап111а11уе ро1утета§е скат геасйоп. Vеΐ. 1ттипо1. 1ттипора1йо1, 35, 155-166).

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 показывает процесс получения 1,3оксаселеноланилнуклеозида в соответствии с настоящим изобретением, так как это описано в примере 1.

Фиг. 2 показывает процесс получения (βΌ- и β-Ь-форм 1,3-оксаселеноланилнуклеозидов в соответствии с настоящим изобретением, как описано в примере 3.

Фиг. 3 представляет рентгенографию кристаллической структуры [2-(1'В,2'8,5'В)-метил(5-он-1,3 -оксаселенолан)] -Ь-карбоксилата.

Фиг. 4 показывает структуры энантиомеров (+)-в-8е-ййС, (-)-в-8е-ййС, (+)-в-8е-ЕййС и (-)-в-8е-ЕййС.

Подробное описание изобретения

По использованию в данном тексте понятие выделенный энантиомер обозначает нуклеозидную композицию, которая включает по крайней мере приблизительно 95-100%, а более предпочтительно - свыше 97% отдельного энантиомера данного нуклеозида.

Термин существенно очищенная форма обозначает нуклеозидную композицию одного энантиомера, которая включает не более чем примерно 5% (вес. проценты) другого энантиомера, более предпочтительно не более примерно 2%, а наиболее предпочтительно - менее чем примерно 1% (вес. проценты).

Термин пуриновое или пиримидиновое основание включает, тем самым не ограничиваясь, Ц’-алилпурины, Ц’-ацилпурины, Ν⁶бензилпурин, Ц⁶-галопурин, Ц⁶-винилпурин, Ν⁶ацетиленпурин, Ц⁶-ацилпурин, Ц⁶-гидроксиалкилпурин, Ц⁶-тиоалкилпурин, Ц²-алкилпурины, Ц⁴-алкилпиримидины, Ц⁴-ацилпиримидины, Ν⁴бензилпурин, ^-галопиримидины, М'-винилпиримидины, N⁴-ацетиленпиримидины, Ν⁴ацилпиримидины, N⁴-гидроксиалкилпиримидины, N⁶-тиоалкилпиримидины, тимин, цитозин, 6-азапиримидин, включая 6-азацитозин, 2-й (или) 4-меркаптопиримидин, урацил, С⁵-алкилпиримидины, С⁵-бензилпиримидины, С⁵-галопиримидины, С⁵-винилпиримидин, С⁵-ацетиленпиримидин, С⁵-ацилпиримидин, С⁵-гидроксиалкилпурин, С⁵-амидопиримидин, С⁵-цианопиримидин, С⁵-нитропиримидин, С⁵-аминопиримидин, ^-алкилпурины, N²-алкил-6-тиопурины, 5азацитидинил, 5-азаурацилил, тразолопиридинил, имидазолопиридинил, пирролопиримидинил и пиразолопиримидинил. Активные группы кислорода и азота в основании могут быть защищены, если это является необходимым или желательным. Подходящие защитные группы хорошо известны специалистам в данной области техники: они включают триметилсилил, диметилгексилсилил, ΐ-бутилдиметилсилил и Iбутилдифенилсилил, тритил, алкильные группы, ацильные группы, такие как ацетил и пропионил, метансульфонил и р-толуолсульфонил. Предпочтительными основаниями являются цитозин, 5-фторцитозин, урацил, тимин, аденин, гуанин, ксантин, 2,6-диаминопурин, 6-аминопурин и 6-хлорпурин.

По использованию в данном тексте термин алкил, за исключением специально оговариваемых случаев, обозначает насыщенную прямую, разветвленную или циклическую первичную, вторичную или третичную цепочку атомов углерода, обычно от С1 до С₁₈, и конкретно включает метил, этил, пропил, изопропил, бутил, изобутил, ΐ-бутил, пентил, циклопентил, изопентил, неопентил, гексил, изогексил, цикΊ логексил, циклогексилметил, 3-метилпентил,

2,2-диметилбутил и 2,3-диметилбутил. Произвольно алкильная группа может быть замещена одной или большим числом составляющих, выбираемых из группы, включающей гидроксил, аминогруппу, алкиламин, ариламин, алкокси, арилокси, нитрогруппу, цианогруппу, сульфокислоту, сульфат, фосфокислоту, фосфат или фосфонат, как незащищенную, так и, если необходимо, защищенную в соответствии с хорошо известным в данной области техники, так, как, например, описано у Сгеепе е! а1., 1991, Рго1есОус Сгоирк ίη Огдашс 8уп1йе818, 1. АПеу & 8опк. 26 еб. (включено в виде библиографической ссылки).

Термин низший алкил по использованию в данном тексте, если это не оговаривается отдельно, обозначает насыщенные прямые или разветвленные углеродные цепи С₁-С₄.

Термин защищенный по использованию в данном тексте, если это не оговаривается специально, обозначает группу, присоединенную к атому кислорода, азота или фосфора с целью предотвращения их участия в других реакциях или для иных целей. Значительное число разнообразных защитных групп для атомов кислорода и азота хорошо известно специалистам в данной области техники - органическом синтезе.

Термин арил по использованию в данном тексте, если это дополнительно не оговаривается, обозначает фенил, бифенил или нафтил, а предпочтительно - фенил. Арильная группа может быть произвольно замещена одной или большим числом составляющих, выбираемых из группы, включающей гидроксил, галоген, алкил, алкенил, алкинил, алкарил, аралкил, аминогруппу, алкиламин, алкокси, арилокси, нитрогруппу, цианогруппу, сульфокислоту, сульфат, фосфокислоту, фосфат или фосфонат, как незащищенную, так и, если необходимо, защищенную в соответствии с хорошо известным в данной области техники, так, как, например, описано у Сгеепе е! а1., 1991, Рго1есбуе Сгоирк ίη Огдашс 8уп1йе818, 1. АПеу & 8опк. 2б еб.

Термин алкарил или алкиларил обозначает алкильную группу, включающую арильную составляющую.

Термин аралкил или арилалкил обозначает арильную группу, включающую алкильную составляющую.

Термин галоген по использованию в данном тексте включает хлор, бром, йод или фтор.

Термин ацил обозначает составляющую, имеющую формулу -С(О)К', где К' - алкил, арил, алкарил, аралкил, гетероароматическая группа, алкоксиалкил, включая метоксиметил; арилалкил, включая бензил; арилоксиалкил, такой как феноксиметил; арил, включая фенил, произвольно замещенный галогеном, С1_-4-алкилом или С1-С₄-алкокси группой, или остатком аминокислоты.

По использованию в данном тексте термин отщепляемая группа обозначает функциональную группу, которая отщепляется от молекулы, к которой она была присоединена при создании подходящих условий.

Термин аминокислота включает естественно встречающиеся и синтетические аминокислоты и включает, не исчерпываясь этим, аланил, валинил, лейцинил, изолейцинил, пролинил, фенилаланинил, триптофанил, метионинил, глицинил, серинил, треонинил, цистеинил, тирозинил, аспарагинил, глутаминил, аспартоил, глутароил, лизинил, аргининил и гистидинил.

Термин гетероарил или гетероароматическая группа по использованию в данном тексте обозначает ароматическую составляющую, включая по крайней мере один атом серы, кислорода или азота в составе ароматического кольца. Не ограничивающими примерами к ним относятся фурил, пиридил, пиримидил, тиенил, изотиазолил, имидазолил, тетразолил, пиразинил, бензофуранил, бензотиофенил, хинолил, изохинолил, бензотиенил, изобензофурил, пиразолил, индолил, изоиндолил, бензимидаэолил, пуринил, карбазолил, оксазолил, тиазолил, изотиазолил, 1,2,4-тиадиазолил, изооксазолил, пирролил, хиназолинил, пиридазинил, пиразинил, циннолинил, фталазинил, хиноксалинил, ксантинил, гипоксантинил и птеридинил. Функциональные группы кислорода и азота в составе гетероциклического основания могут быть защищены в случае, если это является необходимым или желательным. Подходящие защитные группы хорошо известны специалистам в данной области техники и включают триметилсилил, диметилгексилсилил, 1-бутилдиметилсилил и ΐ-бутилдифенилсилил, тритил или замещенный тритил, алкильные группы, ацильные группы, такие как ацетил и пропионил, метансульфонил и р-толуолсульфонил.

Термин липофильное пролекарство обозначает 1,3-оксаселеноланилнуклеозид, который включает ковалентно присоединенную составляющую, которая может быть отщеплена по 5'гидроксильному положению, в результате чего нуклеозид становится более липофильным по сравнению с исходным нуклеозидом, имеющим 5'-гидроксильную группу.

Термин гидрофильное пролекарство обозначает 1,3-оксаселеноланилнуклеозид, который включает ковалентно присоединенную составляющую по 5'-гидроксильному положению, в результате чего нуклеозид становится более гидрофильным по сравнению с исходным нуклеозидом, имеющим 5'-гидроксильную группу.

Настоящее изобретение в соответствии с описанным обеспечивает реализацию способа и создание композиции для лечения заболеваний человека и различных животных, вызываемых ВИЧ- и ВГБ-инфекциями и другими болезнетворными вирусами, воспроизводящимися по тому же типу, включающий введение эффективного количества 1,3-оксаселеноланилнуклеозида, его фармацевтически приемлемого производного, включая 1,3-оксаселеноланилнуклеозид с 5'-отщепляемой группой, включая ацилированное и фосфорилированное производное или его фармацевтически приемлемую соль, произвольно в составе фармацевтически приемлемого носителя. Соединения по настоящему изобретению либо сами проявляют антивирусную активность, такую как активность против ВИЧ-1, против ВИЧ-2, против ВГБ или против вируса иммунодефицита обезьян (ВИО), либо могут метаболизироваться в соединение, которое проявит такую антивирусную активность.

Представляемые соединения, или их фармацевтически приемлемые производные, или соли, или фармацевтически приемлемые препараты, включающие эти соединения, применимы для профилактики и лечения заболеваний, вызываемых ВИЧ-инфекцией, и других родственных состояний, таких как СПИД-подобный комплекс (ЛЯС), персистентная генерализованная лимфаденопатия (РСЬ), СПИД-связанное неврологическое состояние, позитивные по антителам к ВИЧ и ВИЧ-позитивные состояния, саркома Капоши, пурпурная тромбоцитопения и условно-патогенные инфекции. Кроме того, данные соединения или препараты могут быть применены профилактически с целью предотвращения или замедления развития клинических симптомов у пациентов, у которых отмечаются антитела к ВИЧ или они позитивны по присутствию антигена ВИЧ, или у тех, кто имел контакт с ВИЧ.

Данное соединение или его фармацевтически приемлемое производное, или соль, или фармацевтически приемлемые препараты, включающие соединение или производные, или соли, также применимы для предотвращения и лечения заболеваний, обусловливаемых ВГБинфекцией, и других родственных состояний, таких как позитивность по антителам к ВГБ и позитивность по ВГБ, обусловливаемое ВГБ хроническое воспаление печени, цирроз, острый гепатит, фульминантный гепатит, хронический персистентный гепатит и утомляемость. Эти соединения или препараты также могут быть использованы профилактически с целью предотвращения или замедления развития клинических симптомов у пациентов, у которых отмечаются антитела к ВГБ или они позитивны по присутствию антигена ВГБ, или у тех, кто имел контакт с ВГБ.

Соединение может быть конвертировано в фармацевтически приемлемый эфир путем реакции с подходящим этерифицирующим агентом, например галогенангидридами или ангидридами. Соединение или его фармацевтически приемлемое производное могут быть конвертированы в фармацевтически приемлемую соль стандартными путями, например путем обра ботки подходящей щелочью. Эфир или соль данного соединения могут быть конвертированы в исходное соединение, например, путем гидролиза.

Суммируя сказанное, настоящее изобретение включает следующие элементы:

(a) 1,3-оксаселеноланнуклеозиды, определенные выше, и их фармацевтически приемлемые производные и соли;

(b) 1,3-оксаселеноланнуклеозиды и их фармацевтически приемлемые производные и соли для применения в медицинской практике, например, для лечения или профилактики заболеваний, вызываемых ВИЧ- и ВГБ-инфекциями;

(c) применение 1,3-оксаселеноланнуклеозидов и фармацевтически приемлемых производных и солей в производстве медикаментов, предназначенных для лечения заболеваний, вызываемых ВИЧ- и ВГБ-инфекциями;

(б) фармацевтические препараты, включающие 1,3-оксаселеноланнуклеозиды или их фармацевтически приемлемые производное или соль вместе с фармацевтически приемлемым носителем или растворителем;

(е) способы получения 1,3-оксаселеноланнуклеозидов и (1) применение 1,3-оксаселеноланилнуклеозидов для лечения вирусных инфекций путем введения в сочетании или чередовании с другим антивирусным агентом.

I. Активное соединение и его физиологически приемлемые производные и соли

Активными соединениями, представляемыми настоящим изобретением, являются 1,3оксаселеноланнуклеозиды, находящиеся в форме рацемата или отдельных энантиомеров.

Активное соединение может быть введено в виде любого производного, которое по введению реципиенту способно прямо или косвенно обеспечивать появление исходного вещества или же обладает его активностью. Не служащими ограничением примерами являются фармацевтически приемлемые соли (также обозначаемые как физиологически приемлемые соли) и 5'- и ^-пиримидин- или Х’-пуринацетилированные или алкилированные производные активного соединения (также обозначаемые как физиологически активные производные). В одном из вариантов ацильная группа - это эфир карбоновой кислоты, в котором некарбонильная составляющая эфирной группы выбирается из группы, включающей прямой, разветвленный или циклический алкил или низший алкил, алкоксиалкил, включая метоксиметил, аралкил, включая бензил, арилоксиалкил, такой как феноксиметил, арил, включая фенил, произвольно замещенный галогеном, С1-С4-алкилом или С1-С4алкоксигруппой, сульфонатный эфир, такой как алкил- или аралкилсульфонил, включая метансульфонил, фосфат, включая, но тем самым не ограничиваясь, моно-, ди- или трифосфат, тритил или монометокситритил, замещенный бен зил, триалкилсилил (например, диметил-5бутилсилил) или дифенилметилсилил. Арильные группы эфиров произвольно могут включать фенильную группу.

Модификации активного соединения и особенно по Ы⁴-пиримидинилу или №-пурину и 5'-О-положениям могут влиять на биологическую доступность и скорость метаболизма активного соединения, что тем самым дает возможность контролировать доставку организму активного соединения. Кроме того, модификации могут влиять на антивирусную активность соединения, в ряде случаев повышая эту активность по сравнению с исходным соединением. Этот эффект может быть легко протестирован путем получения производного и анализа его антивирусной активности в соответствии с описанными в данном тексте методами или другими методами, известными в данной области техники.

Нуклеотидные пролекарства

Любой из описанных в данном тексте нуклеотидов может быть введен в качестве нуклеотидного пролекарства с целью повышения активности, биологической доступности, стабильности или какого-либо иного изменения свойств конкретного нуклеозида. Известен ряд лигандов нуклеотидных пролекарств. В целом, алкилирование, ацилирование или иные липофильные модификации моно-, ди- или трифосфата в составе нуклеозида обусловливают повышение стабильности нуклеотида. Примерами замещающих групп, которые могут заменять один или большее число атомов водорода в фосфатной составляющей, являются алкил, арил, стероиды, углеводы, включая сахара, 1,2диацилглицерин и спирты. Многие из них описаны: Я. 1оиек & N. В1ксйоГЬегдег, 1995, Аи1Мга1 Яек., 27, 1-17. Любые из них могут быть использованы в сочетании с представляемыми нуклеозидами с целью достижения желаемого эффекта.

В одном из вариантов 1,3-оксаселеноланилнуклеозид представляется в виде 5'-гидроксильного липофильного пролекарства. Не служащими ограничением примерами патентов США, которые представляют подходящие липофильные замещающие группы, которые могут быть ковалентно встроены в состав нуклеозида, предпочтительно по положению 5'-ОН в составе этого нуклеозида, или липофильные препараты, являются патенты США №№ 5149794 (22 сентября 1992 г.: УаМи е! а1.), 5194 654 (16 марта 1993 г.: Нок!е!1ег е! а1.), 5223263 (29 июня 1993 г.: Нок!е11ег е! а1.), 5256641 (26 октября 1993 г.: ΥηΙνίη е! а1.), 5411947 (2 мая 1995 г.: Нок!е!1ег е! а1.), 5463092 (31 октября 1995 г.: Нок!е!1ег е! а1.), 5543389 (6 августа 1996 г.: Υа!ν^и е! а1.), 5543390 (6 августа 1996 г.: Υа!ν^и е! а1.), 5543391 (6 августа 1996 г.: Υа!ν^и е! а1.) и 5554728 (10 сентября 1996 г.: Вакауа е! а1.); все они включены в данный текст в виде библиографических ссылок.

Зарубежные патентные заявки, в которых представляются липофильные замещающие группы, которые могут быть присоединены к 1,3-оксаселеноланилнуклеозидам по настоящему изобретению, или липофильные препараты, включают №О 89/02733, №О 90/00555, №О 91/16920, №О 91/18914, №О 93/00910, №О 94/26273, XV О 96/15132, европейские патенты 0350287 и 93917054.4 и №О 91/19721.

Дополнительными, не служащими ограничением примерами производных 1,3оксаселеноланилнуклеозидов являются те, которые содержат замещающие группы в соответствии с нижеследующими публикациями. Эти измененные 1,3-оксаселеноланилнуклеозиды могут быть использованы для анализа в соответствии с описанным здесь или другими методами антивирусной активности, включая активность против ВИЧ или ВГБ. Но И.Н.№., 1973, ОМпЬиОоп оГ кгиаке апб беаштаке оГ 1-β-ΌагаЬшоГцгаиоку1су!окте ίη йккиек оГ таи аиб тоике. Саисег Яек., 33, 2816-2820; Но1у А., 1993, 1коро1аг рйокрйогоик-тобШеб иис1ео!1бе аиа1одиек. 1и Абуаисек ш Аийу1га1 Эгид Иек1ди, Эе С1егсс.| (еб.), Уо1. I, 1А1 Ргекк, рр. 179231; Ноид С.1., ХесКаех А., №ек! С.Я., 1979а, Зуи1йек1к аиб аий!итог асйуйу оГ 1-β-ΌагаЬшоГцгаиоку1су!окте сои)цда!ек оГ согйко1 аиб согйкоие, Вюсйет. Вюрйук. Яек. Соттии., 88, 1223-1229; Ноид С.1., №сйаеу А., Кткйк АД., Висййей ИД., №ек! С.Я., 1980, ШДеоДбе соищда1ек ак ро!еийа1 аиШитог адеи!к. 3. Зуи!йек1к аиб аиб!итог асйуйу оГ Еф-И-агаЬтоГигаиоку1)су!окте сои)цда!ек оГ согОсоЧегспбк аиб ке1ес!еб йрорйШс а1сойо1к, 1. Меб. Сйет., 28, 171177; Нок!е!1ег Κ.Υ., 3!ийтй1ег Ь.М., Ьеийид Н.В.М., уаи беи Воксй Н., Яюйтаи Ό.Ό., 1990, Зуи!йек1к аиб аийге!гоу1га1 асйуйу оГ рйокрйо11р1б аиа1одк оГ а/|бо1йут1бте аиб о!йег аийу1га1 иис1еок1бек, 1. Вю1. Сйет., 266, 11714-11717; Нок!е11ег Κ.Υ., КогЬа В., Зпбйаг С., Сагбеиег М., 1994а, Аийу1га1 асйуйу оГ рйокрйайбу1б1беохусуйбше ш йераййк В-1иГес!еб се11к аиб еийаисеб йерайс ир!аке ш писе. Аийу1га1 Яек., 24, 59-67; Нок!е11ег Κ.Υ., Якйтаи Ό.Ό., Зпбйаг С.К, Бе1диег Р.Ь., Бе1диег 1., Я1сс1 1., Сегбеиег М.Р., Зе11еке!й ϋ.№., ЕШк М.К, 1994Ь, Рйокрйа11бу 1ахлбо(йу т1б1ие аиб рйокрйайбу1-ббС: Аккекктеи! оГ ир!аке ш тоике 1утрйо1б йккиек аиб аийу1га1 асйуШек т йитаи 1ттииобейс1еису у1шк-1иГес!еб се11к аиб ш гаиксйег 1еикет1а У1гик1иГес!еб тке, Аийт1сгоЫа1 Адеи!к Сйето!йегару, 38, 2792-2797; Ниик!ои Ρ.Ν., 1оиек А.А., МсСшдаи С., №а1кег Я.Т., Вайапш 1., Эе С1егсс.| Е., 1984, Зуи1йек1к аиб Ью1од1са1 ргорегйек оГ коте сусйс рйокрйо!пек!егк бепуеб Ггот 2'беоху-5-йиогоипбше, 1. Меб. Сйет., 27, 440444; Л ΥΠ., Моод С, Зсйтй! С., В1ксйоГГ Р., Ьцц В., 1990, Моиорйокрйопс ааб б1ек!егк оГ 7βйубгохусйо1ек!его1 аиб оГ рупт1бше иис1еок1бек ак ро!еийа1 аий!итог адеи!к; куи!йек1к аиб рге13

11Ш1пагу еуа1иабоп οί апб!итог αοίίνίΐν. 1. Меб. СЬет., 33, 2264-2270; 1опек А.8., МсСшдап С, Аа11ег В.Т., Вакапш 1., Ве С1егсс.| Е., 1984, 8уп111е515. ргорегбек, апб Ыо1од1са1 асбубу οί коте пис1еок1бе сусбс рЬокрЬогат1ба!ек, 1. СЬет. 8ос. Регкт Тгапк., I, 1471-1474; 1иобка В.А., 8таб 1., 1974, 8уп1Ьек1к οί бтЬопис1ео81бе а (Ρ->Ν) атшо ас1б бепуа!ек. Со11. Схеск. СЬет. Сотт., 39, 363-368; Ка1аока 8., 1та1 1., Уатар Ν., Ка1о М., 8або М., Катеаба Т., 1та1 8., 1989, А1ку1ас1еб сАМР бепуабуек; ке1есбуе куп1Ьек1к апб Ыо1од1са1 асбу1бек, №с1. Ас1бк Век. 8ут. 8ег., 21, 1-2; Ка1аока 8., ИсЫба В., Уатар N. 1991, А сопуешеп! купбюбк οί абепокше 3',5'-сус11с рЬокрЬа!е (сАМР) Ьепху1 апб те1Ьу1 !нек!егк, Не1егосус1ек, 32, 1351-1356; КтсЫпд!оп Ό., Нагуеу ЕЕ, О'Соппог Т.Е, 1опек В.С'.КМ., Беуте К.С., Тау1ог-ВоЫпкоп Ό., 1еГГнек Ό.Ι, МсСшдап С, 1992, Сотрапкоп οί ап11У1га1 еГГес!к οί х1боуибте рЬокрЬогат1ба!е апб рЬокрЬогоб1ат1ба!е бепуабуек адашк! Ηΐν апб ИЬУ ш уйго. Апбу1га1 СЬет. СЬето1Ьегару, 3, 107-112; Кобата К., Могохит1 М., 8айоЬ К.1., Кишпака Н., УокЫпо Н., 8апеуокЬ1 М., 1989, АпРРппог асбубу апб рЬагтасо1оду οί 1-β-ΌагаЬтоГигапоку1су!окте-5'-к!еагу1рЬокрЬа!е; ап ога11у асбуе бепуабуе οί 1-в-В-агаЬтоГигапоку1су!окше, 1ар. 1. Сапсег Век., 80, 679-685; Койу М., Епде1к 1., 1979, ТЬе еГГес!к оГ абепокше- апб диапо киче 3',5'-рЬокрЬопс апб асчб Ьепху1 ек!егк оп дшпеа-рчд уеп!пси1аг туосагбшт, №шпуп8сЬт1ебеЬегд'к АгсЬ. РЬагтасо1, 310, 103-111; Китаг А., Сое Р.Ь., 1опек А.8., Аа1кег В.Т., Ва1хапш 1., Бе С1егсс| Е., 1990, 8уп1Ьек1к апб Ыо1од1са1 еуа1иабоп оГ коте сусбс рЬокрЬогат1ба!е пис1еок1бе бепуабуек, 1. Меб. СЬет., 33, 23682375; ЬеВес С, НиупЬбшЬ Т., 1991, 8уп1Ьек1к оГ ЬрорЫЬс рЬокрЬа!е !нек!ег бепуабуек оГ 5Пиогоипбте апб агаЬтосуббше ак апбсапсег ргобгидк. Те1гаЬебгоп Ьеб., 32, 6553-6556; ЫсЬ!епк!еш 1., Вагпег Н.Б., СоЬеп 8.8., 1960, ТЬе те!аЬобкт оГ еходепоик1у киррбеб пис1еоббек Ьу ЕксЬепсЫа со11, 1. Вю1. СЬет., 235, 457-465; Ьис1Ьу 1., уоп Баешкеп А., ЕнебенсЬ 1., Мап!Ьеу В., Ζ\\όιΚ1 1., 8сЬ1абег С, Вепп М.Н., 1981, 8уп111ек1к апб 1ох1со1од1са1 ргорегбек оГ !Ьгее па!ига11у осситпд суапоербЫоа1капек. Мб!. Сед. ЬеЬепкт1бе1ип!егк. Нуд., 72, 131-133 (СЬет. АЬкб. 95, 127093); МсСшдап С, То11егбе1б 8.М., Вбеу Р.А., 1989, 8уп1Ьек1к апб Ью1од1са1 еуа1иабоп оГ коте рЬокрЬа!е !нек!ег бепуабуек оГ !Ье апбу1га1 бгид Ага, Шс1е1с Асчбк Век., 17, 60656075; МсСшдап С, Беуте К.С., О'Соппог Т.Е, Са1рш 8.А., 1ейпек Ό.Ε, КтсЫпд!оп Ό., 1990а, 8уп1Ьек1к апб еуа1иабоп оГ коте поуе1 рЬокрЬогат1ба!е бепуабуек оГ 3'-ах1бо-3'беоху1Ьут1бте (А2Т) ак апб-Н^ сотроипбк. Апбу1га1 СЬет. СЬето1Ьегару, 1, 107-113;

МсСшдап С, О'Соппог Т.Е, №сЬо11к 8.В., №сккоп С, КтсЫпд!оп С, 1990Ь, 8уп!Ьек1к апб апбН^ асбубу оГ коте поуе1 киЬкб!и!еб б1а1ку1 рЬокрЬа!е бепуабуек оГ А2Т апб ббСуб, Апбучга1 СЬет. СЬето1Ьегару, 1, 355-360; МсСшдап С, №сЬо11к 8.В., О'Соппог Т.Е, КтсЫпд!оп Ό., 1990с, 8уп1Ьек1к оГ коте поуе1 б1а1ку1 рЬокрЬа!е бепуабуе оГ 3'-тобШеб пис1еок1бек ак ро!епба1 апб-АГО8 бгидк. Апбу1га1 СЬет. СЬето1Ьегару, 1, 25-33; МсСшдап С, Беуше К.С., О'Соппог Т.Е, КтсЫпд!оп Ό., 1991, 8уп1Ьек1к апб апбН^ асбуйу оГ коте Ьа1оа1ку1 рЬокрЬогат1ба!е бепуабуек оГ 3'-ах1бо-3'-беоху1Ьут1бше (А2Т): ро!еп! асбуйу оГ !Ье б1сЬ1огое1Ьу1 те!Ьохуа1ашпу1 сотроипб, Апбу1га1 Век., 15, 255-263; МсСшдап С, Ра1Ыгапа В.К, МаЬтооб Ν., Беуте К. С., Нау А.Е, 1992, Агу1 рЬокрЬа!е бепуабуек оГ А2Т ге!аш асбуйу адашк! Н^1 ш се11 бпек теЫсЬ аге гек1к(ап! !о !Ье асбоп оГ А2Т, Апбу1га1 Век., 17, 311-321; МсСшдап С, Ра!Ыгапа В.К, СЬо1 8.М., КтсЫпд!оп Ό., О'Соппог Т.Е, 1993а, РЬокрЬогат1ба1е бепуабуек оГ А2Т ак чпЫЬйогк оГ Н^: к!иб1ек оп !Ье сагЬоху1 !егтшик. Апбу1га1 СЬет. СЬето1Ьегару, 4, 97-101; МсСшдап С, Ра1Ыгапа В.К, ВаПапш 1., Бе С1егсд Е., 1993Ь, 1пбасе11и1аг бебуегу оГ Ыоасбуе А2Т пис1еоббек Ьу агу1 рЬокрЬа!е бепуабуек оГ А2Т, 1. Меб. СЬет., 36, 1048-1052.

А1ку1 Ьубгодеп рЬокрЬопа!е бепуабуек оГ !Ье апб-Н^ адеп! А2Т тау Ье 1екк 1ох1с !Ьап !Ье рагеп! пис1еок1бе апа1одие, Апбу1га1 СЬет. СЬето!Ьегару, 5, 271-277; Меуег В.В., 1г., 8Ьитап Б.А., ВоЬшк В.К., 1973, 8уп!Ьек1к оГ риппе пис1еок1бе 3',5'-сус11с рЬокрЬогат1ба!ек. ТебаЬебгоп Ьеб., 269-272; №1дууагу 1., СоЬб В.К, КбсНпег С.В., 8!еуепк ΕΌ., 1973, 8!иб1ек оп пеи!га1 ек!егк оГ сусбс АМР, ВюсЬет. ВюрЬук. Век. Соттип., 55, 1072-1077; Nатаηе А., Соуе!!е С, ИШоп М.Р., ИШоп С., НиупЬ-ВшЬ Т., 1992, 'Ттргоуеб Ьгат бебуегу оГ А2Т иктд а д1усоку1 рЬокрЬоб1ек!ег ргобгод, 1. Меб. СЬет., 35, 3939-3944; №1гдео1 1., №гЬоппе ЕМ., Епде1к

1., Ьекег Н.А., 1983, Ргос. №б. Асаб. 8с1. И8А, 80, 2395-2399; Уе1коп К.А., Вепбибе А.С., 8!кег Α.Ν., Ни!сЫпкоп ЕР., 1987, ТЬе диекбоп оГ сЬа1г-!те1к! ес.|т1|Ьпа Гог !Ье рЬокрЬа!е ппдк оГ пис1еок1бе сусбс 3^!,5'-топорЬокрЬа!ек: 'Н NМВ апб х-гау сгук!а11одгарЫс к!ибу оГ !Ье б1ак!еготегк оГ 1Ьут1бте рЬепу1 сусбс 3',5'-топорЬокрЬа!е, 1. Атег. СЬет. 8ос, 109, 4058-4064; №гЬоппе ЕМ., ВюЬагб 8., №пдео1 1., Ьек!ег Н.А., 1984, №те рЬо!оасбуа!аЬ1е сусбс пис1еоббек ргобисе шбасе11и1аг _)итрк т сусбс АМР апб сусбс СМР сопсепбабопк. №!иге, 301, 74-76; №итапп ЕМ., Негуе М., ОеЬоиху ЕС., Сиена Е.Е, Соиуебе С, Виргах В., НиупЬ-ОшЬ Т., 1989, 8уп1Ьек1к апб !гапктетЬгапе Вапкроб к!иб1ек Ьу NМВ оГ а д1исоку1 рЬокрЬобр1б оГ 1Ьут1бше, 1. Атег. СЬет. 8ос, 111, 4270-4277; ОЬпо В., Та!кит1 Ν., Нбапо М. , 1та1 К., М1ходисЫ Н., Nакати^а Т., Кокака М., Така!икк1 К., Уатауа Т., Тоуата К., УокЫба Т., Макаока Т., НакЫто!о 8., ОЬкЫта Т., К1тига

1., Уатаба К., К1тига 1., 1991, Тгеа1теп! оГ туе1обукр1акбс купбготек тейб ога11у абт1шк!егеб 1-в-В-агаЬто1игапоку1су!окте-5'-к!еагу115 рНокрНаГе. Опсо1оду, 48, 451-455; Ра1ош1по Е., Кекк1е ^., Ногтекх ЕР., 1989, А б1Нубгорупбте сатег кукГет Гог кикГатеб бейуегу о! 2',3'б1беохупис1еок1бек Го 1Пе Ьгаш, 1. Меб. СНет., 32, 622-625; Регктк Р.М., Вагпеу 8., ^кГгоск К., С1агк Р.Н., Ьеуш К., ЬатЬегГ ^.М., Райетеау 8.К., 8егайпотекка Н.Т., Вайеу 8.М., 1асккоп 8., Нагпбеп М.К., АкНГоп К., 8иГГоп ^., Нагуеу ЕЕ, Вго\уп А.С., 1993, Асйуйу оГ ВКБ47923 апб 1Гк ога1 ргобгид, 8В203657А адашкГ а гаиксНег тиг1пе 1еикет1а У1гик тГескоп ίη тке. Апкуйа1 Кек., 20, кирр1. N 1, 84; Р1ап!абок1 С, Магаксо С.Е, 1г., Могпк-№11кс11ке 8.Б., Меуег К.Ь., Ситик Р., 8иг1ек ЕК., 1к11ас.| К.8., Кисета Ь.8., 1уег Ν., ^а11еп С.А., Р1ап!абок1 8., МобекГ Е.Е, 1991, 8упГНек1к апб еуа1иайоп оГ поуе1 е111ег Нр1б пис1еок1бе сопщдШек Гог апк-Н1У-1 асйуйу, 1. Меб. СНет., 34, 1408-1414; Ротроп А., ЬеГеЬуге

I., 1тЬасН ЕЬ., КаНп 8., РащиНаг ^., 1994, Ьесотрокйюп раГНтеаук оГ ГНе топо- апб Ык(ргуа1оу1охутеШу1) екГегк оГ ах|бо111упибте-5'топорНокрНаГе ίη се11 ехГгасГ апб ίη Пккие си1Гиге тебтат; ап аррйсайоп оГ 1Не оп-1те 18КРс1еашпд' НРЬС ГесНщдие, Апкуйа1 СНет. СНетоШегару, 5, 91-98; РокГетагк Т., 1974, Сус1к АМР апб сусйс СМР, Аппи. Кеу. РНагтасо1., 14, 23-33; РпкЬе Е.Е, Магйп ЕС.М., МсСее ^.Р.С., Вагкег М.Р., 8тее ^.Р., Энке А.Е., МаГШетек Т.К., УегНеубеп ЕР.Е, 1986, 8уп111ек1к апб апйНегрек уйик асйуйу оГ рНокрНаГе апб рНокрНопаГе бепуайуек оГ 9-[(1,3-б1Нубгоху-2-ргороху) теГНу1]диапте, 1. Меб. СНет., 29, 671-675; РиссН Р., Соккейп С., ЬеГеЬуге I., Ротроп А., АиЬегйп А.М., Эйн А., 1тЬасН ЕЬ., 1993, 1пГгасе11и1аг бейуегу оГ пис1еок1бе топорНокрНаГе 1НтоидН а гебисГаке-теб1аГеб асйуайоп ргосекк. Апйуйа1 Кек., 22, 155-174; Ридаеуа У.Р.,

КосНкеуа 8.Ι., МакНЬйк Р.Ь., МхепдаП К.8., 1969, Тохко1одка1 аккекктепГ апб Неа1ГН кГапбагб га11 пдк Гог е111у1епе ки1йбе ш Йе шбикГпа1 аГтокрНеге. Οί§. ТгГ. РгоГ. 2аЬо1, 13, 47-48 (СНет. АЬкй. 72, 212); КоЬшк К.К., 1984, ТНе роГепйа1 оГ пис1еокбе апа1одк ак 1пН1Ьйогк оГ геГгоуйикек апб Гитогк, РНагт. Кек., 11-18; Кокотекку А., К1т 8.Н., Кокк 1., ХУАсЬ М.М., 1982, ЫрорЫНс 5¹-(а1ку1рйокрйаГе) екГегк оГ 1-β-ΟагаЬтоГигапоку1суГокте апб Йк У-асу1 апб 2,2'апНубго-3'0-асу1 бепуакуек ак роГепйа1 ргобгидк, 1. Меб. СНет., 25, 171-178; Кокк V., 1961, 1псгеакеб кепкШуНу оГ 1Не теа1кег ГигпоиГ Готеагбк аготакс пйгодеп тик1агбк сапушд Ьакк к1бе сНашк Го11отешд д1исоке ргейеаГтепГ, ВюсНет. РНагт., 8, 235-240; Куи Е.К., Кокк К.Е, МаГкикНГа Т., МасСокк М., Нопд С.1., \Уек1 С.К., 1982, РНокрНойр1б-пис1еок1бе соп)ида1ек 3. 8упйек1к апб ргейттату Ью1одка1 еуа1иаГкп оГ 1-β-ΟагаЬшоГигапокукуГокте 5'-б1рНокрНаГе[-], 2б1асу1д1усего1к, 1. Меб. СНет., 25, 1322-1329; 8аГГЪй1 К., Ните ν.Ε, 1986, ТНе бедгабакоп оГ 5-кбобеохуипбте апб 5-Ьготобеохуипбте Ьу кегит Ггот бйГегепГ коигсек апб йк сопкедиепсек

Гог ГНе ике оГ ГНеке сотроипбк Гог тсогрогакоп 1пГо ^NА, СНет. Вю1. 1пГегасГ., 57, 347-355; 8апеуокЫ М., Могохит! М., Кобата К., МасЫба

1., Кишпака А., УокЫпо Н., 1980, 8упГНеГк пис1еок1бек апб пис1еоГ1бек XVI. 8упГНек1к апб Ью1одка1 еуа1иакопк оГ а 9 кепек оГ 1-β-ΟагаЬшоГигапоку1суГокше 5'-а1ку1 ог агу1рНокрНаГек, СНет. РНагт. Ви11., 28, 2915-2923; 8акйу 1.К., №НеГе ₽.Ν., КНап 8., №\уак В.Ь, Р1ипкеГ1 V., АгйпдНаик К.В., Рагдийаг Ь., 1992, МетЬгапе-регтеаЬ1е б1беохуипбте 5'-топорНокрНаГе апа1одие 1пН1Ьйк Нитап 1ттипобейскпсу У1гик тГесйоп, Мо1. РНагтасо1., 41, 441-445; 8Нате ЕР., 1опек К.Е, Аптйй М.К, Ьоше М.8., Ьее ν.Ά, Сипбу К.С., 1994, Ога1 ЬюауайаЬййу оГ РМЕА Ггот РМЕА ргобгидк т та1е 8ргадиеЬа\у1еу гаГк. АЬкГгасГ 9111 Аппиа1 ААР8 Меейпд, 8ап ^^едо. СА; 8НиГо 8., Иеба 8., 1татига 8., Рикикиатеа К., МаГкиба А., Иеба Т., 1987, А Гас11е опе-кГер купГНекк оГ 5 -рНокрНаГ1бу1пис1еок1бек Ьу ап епхутакс 1тео-рНаке геасЙоп, Тейайебгоп Ьей., 28, 199-202; 8НиГо 8., 1ГоН Н., Иеба 8., 1татига 8., Кикикатеа К., Тки) то М., МаГкиба А., Иеба Т., 1988, А Гас11е епхутайс купГНекк оГ 5'-(3-кп-рНокрНайбу1) пис1еок1бек апб 1Не1г апй1еикетк асйуйкк, СНет. РНагт. Ви11., 36, 209-217. Одной из предпочтительных фосфатных групп в пролекарствах является 8-ацил-8-тиоэтиловая группа, также обозначаемая как 8АТЕ.

II. Получение активных соединений

Получение 1,3 -оксаселеноланилнуклеозидов до настоящего времени не удавалось из-за трудностей, обусловливаемых конструированием 1,3-оксаселеноланового кольца. Процесс получения такого кольца представляется в настоящем изобретении. Один из вариантов этого процесса проиллюстрирован на фиг. 1. Также представляется процесс получения выделенных β-Ο- (т.е. 28,5К) и в-Ь-1,3-оксаселеноланиловых (т.е. 2К, 58) нуклеозидов. Один из примеров такого процесса проиллюстрирован на фиг. 2. На фиг. 1 показана схема нумерации соединений, применяемая в примерах.

Пример 1. Получение 1,3-оксаселеноланового кольца.

Селеноцианат был получен по методу Кирби. На первом этапе проводили реакцию этилбромацетата (ВгСН₂СО₂ЕГ) с селенилацетатом калия в спирте с образованием селеноцианата 2.

С целью конструирования лактона 5 изначально была предпринята попытка восстановить селеноцианат 2 с использованием NаВН₄ и гидролизовать полученный в результате эфир водным раствором едкого натра с образованием селенолуксусной кислоты, которая может быть использована для конструирования системы оксаселеноланового кольца 5. Однако селенолуксусная кислота разлагается в ходе подкисления соляной кислотой при рН=2. Было сообще но о том, что селенолы могут быть легко окислены кислородом воздуха с образованием стабильных димеров, которые можно снова восстановить в селенолы с помощью Н₃РО₂. Было установлено, что восстановление бис(селеноуксусной кислоты) в селенол, равно как и циклизация могут иметь место в одноэтапной реакции без образования промежуточных соединений. Соответственно, димер 3 был получен с выходом на уровне 81% путем нагревания 1 с обратным холодильником с К8еСЫ в этиловом спирте в течение 1 ч с последующим восстановлением ΝαΒΗ₄ при 0°С в течение 20-30 мин. Проводя сравнение с недавно опубликованными данными по процедуре получения диселенидов, становится ясно, что данный метод имеет преимущества, связанные с более мягкими условиями реакции, более высоким выходом и большей простотой работы. Лактон 5 был затем получен с 33%-ным выходом путем гидролиза 3 с обратным холодильником с водным раствором уксусной кислоты (50%) в течение 24 ч с последующим восстановлением селенолуксусной кислоты с помощью Н₃РО₂, которую конденсировали ίη 811и с 2-бензоилоксицетальдегидом в присутствии Н₃РО₂ в атмосфере азота. В связи с необходимостью восстановления лактона 5 было установлено, что ΌΙΒΆΤ-Η может избирательно восстанавливать лактон по отношению к эфиру в ТГФ, в то время как в толуоле такая избирательность не проявляется. Соответственно, ацетат сахара 7 был получен восстановлением 5 с помощью ΌΙΒΆΤ-Η в ТГФ с последующим ацетилированием ίη 8Йи с помощью уксусного ангидрида. Конденсирование ацетата 7 без этапа очистки с силилированными основаниями в присутствии хлорида олова или ΤΜ8ΟΤΤ позволило получить неразделимую смесь α- и βизомеров 8а и 8Ь. Удаление защитной бензоильной группы из состава 8а и 8Ь метиламином или аммиаком в метаноле приводит к получению конечных нуклеозидов в виде α/β-смеси. αЦитозин был получен путем повторяющейся рекристаллизации α/β-смеси из МеОН/Е1₂О и затем метанола, в то время как β-цитозин 9а был получен с помощью ВЭЖХ-разделения материнского раствора (С18-колонка, 20%-ный метанол в воде). Нуклеозиды β- и α-5-фторцитозина были получены путем хроматографического разделения α/β-смеси в силикагеле. Структура синтезированных селеноланнуклеозидов была подтверждена с применением элементного анализа, ¹Н и ^Ι3Ο-ΝΜΡ (ЯМР - ядерно-магнитного резонанса). Стереохимический анализ был осуществлен на основании экспериментов 2ΌΝΟΕ8Υ, в которых была выявлена корреляция между 2'-Н и 5'-Н β-изомера 9Ь, в то время как у α-изомера 10Ь такая корреляция отсутствовала. Также стереохимические оценки были подтверждены на основании сильнопольного химического сдвига (в ЯМР) 2'-Н в составе 9а и 9Ь в сравнении с таковыми у 10а и 10Ь вследствие дезэкранирования гетероциклическими основаниями.

Стереохимия

Благодаря хиральности атомов углерода 1' и 4' в составе 1,3-оксаселеноланиловой составляющей нуклеозида, их неводородные замещающие группы (соответственно пуриновые/ пиримидиновые основания и группы СНОВ) могут иметь либо цис-положение (с той же стороны), либо транс-положение (по другую сторону) по отношению к кольцу сахара. Таким образом, четыре оптических изомера представлены следующими конфигурациями (принимая ориентацию сахарной составляющей в горизонтальной плоскости с расположением атома кислорода позади ее): цис (обе группы находятся сверху, что соответствует конфигурации естественно встречающихся нуклеозидов), цис (обе группы расположены снизу: такая конфигурация является неестественной), транс (замещающая группа С2' находится сверху, а замещающая группа С4' -снизу) и транс (замещающая группа С2' находится снизу, а замещающая группа С4' - сверху). Ό-нуклеозиды - это цис-нуклеозиды в их естественной конфигурации, а Ь-нуклеозиды - это циснуклеозиды в их неестественной конфигурации.

Энантиомеры 1,3-оксаселеноланилнуклеозида были получены двумя путями: разделение с помощью хиральной (стереоселективной) хроматографии нуклеозида в соответствии с описанным в примере 2 и путем фракционированной кристаллизации Ь-ментоловых диастереомеров 1,3-оксаселенолана с последующей конденсацией растворенного 1,3-оксаселеноланилнуклеозида с желательным основанием в присутствии кислоты Льюиса, которая не способна рацемизовать оксаселенолановое кольцо.

Пример 2. Разделение β-Ό- и β-Ьэнантиомеров 2-гидроксиметил-4-(№5'-цитозин1'-ил)-1,3-оксаселенолана и 2-гидроксиметил-4(№5'-фторцитозин-1'-ил)-1,3 -оксаселенолана с помощью хиральной хроматографии.

2-гидроксиметил-4-(№5'-цитозин-1'-ил)1,3-оксаселенолан и 2-гидроксиметил-4-(№5'фторцитозин-1'-ил)-1,3 -оксаселенолан разделяли с помощью хиральной хроматографии. Соединение в форме рацемата (~ 2 мг) растворили в минимальном количестве (~ 400 мкл) метанола (ВЭЖХ-чистоты). Для разделения были использованы следующие условия: водная ВЭЖХсистема; колонка -СЫга1рак А8 4,6x250 мм; подвижная фаза - 2-пропанол; скорость потока 0,80 мл/мин; детектор - УФ-260 нм; барботажный газ - гелий; скорость барботажа - 25 мл/мин на сольвентную емкость; инъецируемое количество 20 мкл раствора за один раз; время удерживания - 5,50 мин для (-)-(28,5Κ)-β-Τ-2',3'дидезокси-3'-селеноцитидина; 6,92 мин для (+)19 (2В,58)-в-О-2',3'-дидезокси-3'-селеноцитидина; 5,97 мин для (-)-(28,5В)-в-Ь-2',3'-дидезокси-5фтор-З'-селеноцитидина; 9,62 мин для (+)-(2В, 58)-β-Ό-2', 3'-дидезокси-5-фтор-3'-селеноцитидина. Оптическая чистота разделенных соединений превышала 95%.

Пример 3. Разделение β-Ό- и β-Ьэнантиомеров 1,3-оксаселеноланиловых промежуточных продуктов конверсии диастереомеров с последующим разделением диастереомеров с помощью фракционированной кристаллизации.

(-)-Ь-ментолкарбоксиаль. К смеси (-)-Ьментола (30 г, 0,2 моль) и глиоксиловой кислоты (36,8 г, 0,4 моль) в толуоле (1 л) добавляли рТкОН (5 г) и реакционную смесь перемешивали при 100°С в течение 3 ч. По окончании реакции р-ТкОН нейтрализовали Εΐ₃Ν и выпаривали досуха. Остаток растворили с хлороформом (500 мл), промывали водой (3 раза по 500 мл), собирали органический слой, высушивали над №1₂8О₄ и выпаривали. Масляную фракцию кристаллизовали из петролейного эфира с получением (-)-Ь-ментолкарбоксиаля в виде белых кристаллов - 20 г (выход 50%) : точка плавления - 82°С; ¹Н-ЯМР (хлороформ) δ (м.д.) 9,40 (с, 1Н, СНО), 4,78 (дт, 1=4,45, 11 Гц, 1Н, 1-Н), 0,75-2,03 (ср, 19Н), ¹³С-ЯМР (хлороформ) δ (м.д.) 184,41, 170,22, 87,13, 46,79, 40,40, 34,00, 31,42, 26,11, 23,28, 21,94, 20,68, 16,15; аналитический расчет для С12Н20О3: С - 67,89; Н - 9,50; найдено: С 67,65; Н - 9,67. Мол. масса: т/е 212,3 (М+).

[2-( 1'В,2'8,5'В)-ментил-(5-он-1,3-оксаселенолан)]-Е-карбоксилат 11 и |2-(1'Р.2'8.8'Рментил-(5-он-1,3 -оксаселенолан)] -Э-карбоксилат.

К раствору (-)-Ь-ментолкарбоксиаля (6,4 г, 30 ммоль) в толуоле (100 мл) добавляли (8еСН₂СООН)₂ (4,15 г, 15 ммоль) и реакционную смесь аккуратно нагревали до 100°С в атмосфере аргона при перемешивании. В течение

I ч по каплям добавляли фосфорноватистую кислоту (50%-ный водный раствор, 2,7 мл). Затем реакционную смесь подвергали нагреванию с обратным холодильником еще в течение 1 ч при мощном перемешивании в атмосфере аргона. Реакционную смесь выпаривали до 20 мл, растворили в ЕЮАс (250 мл) и промывали водой (трижды по 500 мл). Отбирали органический слой, высушивали над №-ь8О₄ и выпаривали. Остаток очищали хроматографически на силикагелевых колонках с использованием смеси ЕЮАс/Нех (1:10, объемное соотношение) в качестве элюента с получением 11 в качестве твердого вещества - 3,9 г (77,6%). В результате кристаллизации реакционной смеси из гексана при комнатной температуре позволило получить

II соединение в виде бесцветных игольчатых кристаллов: точка плавления 106,5°С; [α]²⁵ _Β=59,86° (конц. 0,5, хлороформ); ¹Н ЯМР (хлороформ) δ (м.д.) 5,83 (с, 1Н, 2'-Н), 4,77 (дт, 1=4,45, 12 Гц, 1Н, 1-Н), 3,97 (д, 1=15,34 Гц, 1Н,

4'-Н_ь), 3,67 (дт, 1=15,35 Гц, ⁴1=21,17 Гц, 1Н, 4'На), 0,75-2,03 (ср., 19Н); ¹³С ЯМР (хлороформ) δ (м.д.) 173,97, 168,67, 76,88, 63,84, 47,07, 40,46, 34,02, 31,38, 26,07, 23,23, 22,65, 21,93, 20,71, 16,11. Аналитический расчет для С44Н22О48е: С 50,45; Н - 6,65; найдено: С - 50,65; Н - 6,62; Мол. масса: т/е 333 (М+). Материнский кристаллизующий раствор при -5°С; [а]²⁵с=111, 71° (с 0,5, хлороформ); ¹Н ЯМР (хлороформ) δ (м.д.) 5,83 (с, 1Н, 2'-Н), 4,78 (дт, 1=4,45, 12 Гц, 1Н, 1-Н),

3,95 (д, 1=15,41 Гц, 1Н, 4'-Н_а), 3,68 (дт, 1=15,45 Гц, ⁴1=19,35 Гц, 1Н, 4'-Н_а), 0,75-2,03 (ср., 19Н); ¹³С ЯМР (хлороформ) δ (м.д.) 173,98, 168,63, 76,15, 63,76, 46,95, 39,88, 34,01, 31,32, 26,22, 23,24, 22,98, 21,94, 20,74, 16,14; аналитический расчет для С14Н22О48е: С - 50,45; Н - 6,65; найдено: С - 50,47; Н - 6,63; Мол. масса: т/е 333 (М+).

1-в-Ь-(2'-гидроксиметил-1',3'-оксаселенолан-5'-ил)-5-фторцитозин 15 и 1-а-Ь-(2'-гидроксиметил-1',3'-оксаселенолан-5'-ил)-5-фторцитозин 16.

К раствору три-трет-бутоксиалюмогидрида лития (6 ммоль, 6 мл 1М раствора в ТГФ) раствор лактона 11 (1 г, 3,33 ммоль) в 5 мл ТГФ добавляли по каплям при 10°С в течение одного часа при перемешивании в атмосфере аргона. Затем медленно добавляли уксусный ангидрид (2 г, 20 ммоль) при перемешивании при -5-0°С. Реакционную смесь дополнительно перемешивали в течение 1 ч, растворили в ЕЮАс (100 мл), промывали водой (3х100 мл), высушивали над №₂8О₄ и выпаривали досуха с получением неочищенного 5'-ацетата 13. Ацетат сахара 13 растворили в СН₂С1₂ (5 мл) и медленно добавляли к сиалилированному 5-фторцитозину, полученному путем перемешивания смеси 5фторцитозина (0,34 г, 2,63 ммоль), 2,4,6коллидина (0,8 мл, 6,61 ммоль) и третбутилдиметилсилилтрифторметансульфоната (1,32 г, 5,08 ммоль) в течение 1 ч в атмосфере аргона. К полученной в результате смеси добавляли йодтриметилсилан (0,35 г, 1,75 ммоль), перемешивали при комнатной температуре в течение 18 ч, растворили в хлороформе (100 мл), вливали в водный раствор №₂8₂О₃ (100 мл), промывали водой, высушивали над №₂8О₄ и выпаривали досуха. Полученный остаток очищали с помощью тонкослойной хроматографии на силикагеле с использованием хлороформа в качестве элюента с получением неочищенного твердого вещества 13 (0,15 г, выход 11,2%). ¹Н ЯМР С1)С1_; δ (м.д.) 8,35 (д, 1=6,3 Гц, 1Н, 6-Н), 7,55, 7,53 (2х шир. с, 2Н, N1₄) , 6,45 (ср., 1Н, 5'Н), 6,14 (ср., 1Н, 2'-Н), 4,79 (ср., 1Н, 1-Н) , 3,66 (ср., 2Н, 6'-Н_аЬ). Раствор вещества 14 (0,15 г, 0,33 ммоль) в ТГФ (10 мл) при комнатной температуре выдерживали в атмосфере аргона в течение 1 ч. Реакционную смесь перемешивали дополнительно в течение 1 ч, добавляли МеОН (5 мл) и полученную в результате смесь направ ляли в короткую колонку с силикагелем. Колонку элюировали смесью ЕЮАс/Нех/МеОН (1:1:1; объемное соотношение, 100 мл). Элюент упаривали досуха и полученное твердое вещество очищали на силикагеле с использованием смеси хлороформа/этанола (20:1; объемное соотношение) в качестве элюента с получением смеси βЬ- 15 и α-Ь-нуклеозидов 16 в виде белого твердого вещества - 0,033 г (выход 34%). Смесь повторно разделяли на колонке с силикагелем, с использованием для элюции смеси четырех растворителей Е1ОАс/Нех/СНС1₃/Е1ОН (5:5:2:1; объемное соотношение).

1-в-Ь-(2'-гидроксиметил-1',3'-оксаселенолан-5'-ил)-5-фторцитозин 15/

Белое твердое вещество (0,01 г, выход 10,2%); точка плавления 186-189°С (из метанола); [α]²⁵ϋ=-55,69° (конц. 0,35 метанол); УФ (Н2О): Дтах=280,0 нм (ε 10646, рН=2), 280,0 нм (ε 7764, рН=11). '11 ЯМР (ДМСО-66) δ (м.д.) 8,07 (д, 1=7,1 Гц, 1Н, 6-Н) , 7,92, 7,67 (2х шир.с, 2Н, ЦН2, Э2О. обмениваемые), 6,06 (т, 1=2,96 Гц, 1Н, 5'-Н), 5,42 (т, 1=4,82 Гц, 1Н, 2'-Н), 5,34 (т, 1=5,68 Гц, 1Н, ОН, Э2О. обмениваемый), 3,81 (ср., 1Н, 6'-На), 3,68 (ср., 1Н, 6'-Нь), 3,39 (дд, 1=4,84 Гц, 1Н, 4'-Нь), 3,08 (дд, 1=8,11 Гц, 1Н, 4'На); ¹³С ЯМР (ДМСО-66) δ (м.д.) 157,7 (С=0), 153,3 (4-С), 137,6 (6-С), 135,2 (5-С), 88,3 (5'-С), 78,2 (2'-С), 64,0 (6'-С), 28,9 (4'-С). Аналитический расчет для С₈Н1₀О₃Ы₃Е8е: С - 32,67; Н 3,43; N - 14,29; найдено: С - 32,62; Н - 3,51; N 14,41; Мол. масса: т/е 295 (М+).

1-а-Ь-(2'-гидроксиметил-1',3'-оксаселенолан-5'-ил) -5-фторцитозин 16/

Белое твердое вещество (0,013 г, выход 13,2%); точка плавления 193-195°С (из метанола); [α] ²⁵с=+84,20° (конц. 0,26, метанол); УФ (Н2О) : Хтах 279,5 нм (ε 7638, рН=7), 287,5 нм (ε 9015, рН=2); 281,0 нм (ε 6929, рН=11). Ή ЯМР (ДМСО-б⁶) δ (м.д.) 7,91 (д, 1=7,1 Гц, 1Н, 6-Н), 7,88, 7,63 (2х шир.с, 2Н, ΝΉ2, Э₂О. обмениваемые), 6,35 (т, 1=4,95 Гц, 1-Н, 5'-Н), 5,63 (дд, 1=4,83 Гц, 1Н, 2'-Н), 5,28 (т, 1=5,67 Гц, 1Н, ОН, Э₂О. обмениваемый), 3,70 (ср., 1Н, 6'-Н₂), 3,53 (ср., 1Н, 6'-Н_ь), 3,47 (дд, 1=4,82 Гц, 1Н, 4'-Н_а), 3,24 (дд, 1=7,88 Гц, 1Н, 4'-Н_ь); ¹³С ЯМР (ДМСОбе) δ (м.д.) 157,8 (С=0), 153,2 (4-С), 137,3 (6-С), 134,9 (5-С), 88,6 (5'-С), 80,9 (2'-С), 65,5 (6'-С), 29,4 (4'-С). Аналитический расчет для С8Н10О3ЩЕ8е: С - 32,67; Н - 3,43; N - 14,29; найдено: С - 32,59; Н - 3,49; N - 14,20; Мол. масса: т/е 295 (М+). Синтез нуклеозидов 8 и 9 проводится тем же путем из лактона 3 (1 г, 3,33 ммоль) с получением 1-в-Э-(2'-гидроксиметил1',3'-оксаселенолан-5'-ил)-5-фторцитозин 8. Белое твердое вещество (0,007 г, выход 8,5%); точка плавления 186-189°С (из метанола); [α]²⁵Β=+56,21° (конц. 0,33, метанол); УФ (Н₂О): Д_тах 280,0 нм (ε 8576, рН=7) 289,0 нм (ε 10456, рН=2); 280,0 нм (ε 7795, рН=11). Ή ЯМР (ДМСО-сГ) δ (м.д.) 8,07 (д, 1=7,1 Гц, 1Н, 6-Н), 7,92, 7,67 (2х шир.с, 2Н, ДН₂. Э₂О. обмениваемые), 6,06 (т, 1=2,96 Гц, 1Н, 5'-Н), 5,42 (т, 1=4,82 Гц, 1Н, 2'-Н), 5,34 (т, 1=5,68 Гц, 1Н, ОН, 1ГО. обмениваемый), 3,81 (ср., 1Н, 6'-Н_а), 3,68 (ср., 1Н, 6'-Н_ь), 3,39 (дд, 1=4,84 Гц, 1Н, 4'-Н_ь), 3,08 (дд, 1=8,11 Гц, 1Н, 4'-Н_а); ¹³С ЯМР (ДМСО-6₆) δ (м.д.) 157,7 (С=0), 153,3 (4-С), 137,6 (6-С), 135,2 (5-С), 88,3 (5'-С), 78,2 (2'-С), 64,0 (6'-С), 28,9 (4'С).

Аналитический расчет для С₈Н1₀О₃ЩЕ8е: С - 32,67; Н - 3,43; N - 14,29; найдено: С - 32,57; Н - 3,39; N - 14,35; Мол. масса: т/е 295 (М+).

1-а-Э-(2'-гидроксиметил-1',3'-оксаселенолан-5'-ил)-5-фторцитозин 9/

Белое твердое вещество (0,01 г, выход 10%); точка плавления - 193-195°С (из метанола); [ε]²⁵Β=-85,49° (конц. 0,31, метанол); УФ (Н2О) : Дтах 279,5 нм (ε 7644, рН=7), 287,5 нм (ε 9067, рН=2); 281,0 нм (ε 6983, рН=11). Ή ЯМР (ДМСО-сГ) δ (м.д.) 7,91 (д, 1=7,1 Гц, 1Н, 6Н), 7,88, 7,63 (2х шир.с, 8Н, ДН2. Э2О. обмениваемые), 6,35 (т, 1=4,95 Гц, 1Н, 5'-Н), 5,63 (дд, 1=4,83 Гц, 1Н, 2'-Н), 5,28 (т, 1=5,67 Гц, 1Н, ОН, Э2О. обмениваемый), 3,70 (ср., 1Н, 6'-На); ¹³С ЯМР (ДМСО-сГ) δ (м.д.) 157,8 (С=0), 153,2 (4С), 137,3 (6-С), 134,9 (5-С), 88,6 (5'-С), 80,9 (2'С), 65,5 (6'-С), 29,4 (4'-С). Аналитический расчет для С8Н₁₀О₃ЩЕ8е: С - 32,67; Н - 3,43; N - 14,29; найдено: С - 32,67; Н - 3,48; N - 14,47; Мол. масса: т/е 295 (М+).

Табл. 1 представляет данные по разделению (+)-в-8е-Еб6С, (-)-в-8е-Еб6С, (+)-а-8еГббС. (-)-а-8е-Еб6С и (-)-в-8е-66С и проводит сравнение времени удерживания и длины волн поглощения этих соединений и (-)-β-ΓΤΟ и (+)β-ЕТС.

Таблица 1. Результаты разделения

Соединение	Время удерживания (мин)	Длина волны поглощения (нм)	Оптическое вращение (градусы)	Чистота
(-)-р-Зе-ЕШС	4,8	247,3; 285,1	-103,2 (с0,5; метанол)	100
( + )-р-Зе-ГсйС	7,7	247,3; 285,1	+96,8 (с0,5; метанол)	100
(-)-а-5е-ГсИС	4,8	247,3; 285,1	н/о	100
( + )-а-Зе-ЕШС	6,6	247,3; 285,1	н/о	90
(-)-р-ГГС	4,7	242,6; 285,1	___	—
(+)-β-ЕТС	6,9	242,6; 285,1	___	___
(-)-р-Зе-сйС	9,5	242,6; 270,9	-72,4 (с1; ДМСО)	100
(-Н-р-Зе-сйС	11,9	242,6; 270,9	+56,4 (с1; ДМСО)	96
(-)-а-Зе-сйС	н/о	242,6; 270,9	-46,7 (с1; ДМСО)	100
(+)-а-Зе-сйС	н/о	242,6; 270,9	+26,1 (с1; ДМСО)	94

Табл. 2 представляет индексы разрешения и разделения соединений в хроматографической колонке СЫга1Рак А8. Индекс разделения определен как время удержания второго элюированного изомера за вычетом латентного времени в расчете на разницу между временем удержания первого элюированного изомера и латентным временем. Индекс разрешения определен как удвоенная разница времени удержания изоме23 ров (+) и (-) в расчете на ширину бэнда в двух пиках.

Таблица 2. Сравнение разделений на СЫга1Рак Л8. Условия проведения хроматографии:

подвижная фаза - 2-пропанол: вводили 100 мкт в 10 мкл метанола; УФ-выявление при 254 нм; скорость потока - в мл/мин

^аИндекс разделения = (время удержания второго элюированного изомера - латентное время)/(время удержания первого элюированного изомера - латентное время).

^ЬИндекс разрешения = 2 х [разница времени удержания изомеров ( + ) и (-)]/(ширина бэнда в двух пиках).

Табл. 3 показывает влияние различных соотношений растворителей и скорости потока на хиральные пары в рацематах р-8с-ббС.

Таблица 3. Влияние различных соотношений растворителей и скоростей потока на хиральные пары в рацематах Р-8с-ббС

Соотношение этанол/гексан	Скорость потока (мл/мин)	Разрешение В.	Площадь первого элкмрованного пика (мкВ*сек*107)	Время удержания первого пика (мин)
100:0	0,8	1,25	1,25	4,65
50:50	0,8	1,48	1,13	6,06
40:60	0,8	1,76	1,11	7,21
30:70	0,8	2,05	1,08	9,71
30:70	ЕО	1,98	0,88	7,83
30:70	1,4	1,90	0,64	5,59
20:80	1,4	2,12	0,61	9,78
40:60	0,6	1,75	1,46	9,53

Моно-, ди- и трифосфатные производные активных нуклеозидов могут быть получены в соответствии с описанными методами. Монофосфат может быть получен в соответствии с процедурой 1та1 е! а1., 1969, 1. Отд. СЬеш., 34 (6), 1547-1550. Дифосфат может быть получен в соответствии с процедурой Ωανίκκοη е! а1., 1987, 1. Огд. СЬеш., 52 (9), 1794-1801. Трифосфат может быть получен в соответствии с процедурой Ноатб е! а1., 1965, 1. Ашег. СЬеш. 8ос, 87 (8), 1785-1788.

III. Комбинированная и чередовательная терапия

Было установлено, что после продолжительного применения для лечения антивирусного средства могут появляться резистентные к лекарствам варианты ВИЧ и ВГБ. Резистентность к лекарствам обычно происходит в результате мутаций в гене, который кодирует фермент, участвующий в жизненном цикле вируса: наиболее типично для ВИЧ - в гене обратной транскриптазы, протеазы или ДНК полимеразы, а в случае ВГБ - ДНК-полимеразы. Недавно было продемонстрировано, что эффективность применения лекарственного средства против ВИЧ-инфекции может быть удлинена, обеспечена или восстановлена введением соединения в сочетании или в чередовании со вторым, а возможно и третьим антивирусным соединением, что индуцирует другую мутацию по сравнению с той, которую индуцирует исходное лекарственное средство. С другой стороны, фармакокинетические, биодистрибутивные и иные параметры лекарства могут быть изменены с помощью такой комбинированной или чередовательной (альтернационной) терапии. В целом, комбинированная терапия обычно имеет преимущества перед чередовательной терапией благодаря тому, что она индуцирует множественные одновременные стрессовые воздействия на конкретный вирус.

В одном из вариантов второе антивирусное средство для лечения ВИЧ-инфекции может быть ингибитором обратной транскриптазы (ИОТ), который может являться либо синтетическим нуклеозидом (Н-ИОТ) или не являющимся нуклеозидом соединением (НН-ИОТ). В другом варианте в случае с ВИЧ второе (или третье) антивирусное средство может быть протеазным ингибитором. В других вариантах второе (или третье) соединение может быть пирофосфатным аналогом или химерным связывающим ингибитором. Сводные данные по резистентности ίη νίίτο и ίη νίνο для ряда антивирусных соединений можно найти у Шинаци с соавт. (8с1ппа/1 е! а1., 1996, Ми1а!юпк ίη ге(гох'1га1 демек аккос1а!еб \νίΐ1ι бтид геЕй-шсе. БИегпаΙίοηη1 ΑηίίνίΓη1 №\\ъ. Уо1ите 1(4), Iηΐетаί^οηа1 Меб1са1 Ргекк).

Предпочтительные соединения для комбинационной или чередовательной терапии для лечения ВИЧ-инфекции включают ЕТС ((-)энантиомер или рацемат), Ь-ЕМАи, интерферон, β-Ό-диоксоланилгуанин (ΌΧΟ), βП-диоксоланил-2,6-диаминопурин (ΌΑΡΌ) и βО-диоксоланил-6-хлорпурин (АСР), фамцикловир, пенцикловир, ВМ8-200475, Ь1к-Ьош-РМЕА (адельфовир, дипивоксил), лобукавир, ганцикловир и рибаварин.

Предпочтительными примерами антивирусных средств, которые могут быть использованы в сочетании или для чередования с соединениями, которые представляются в настоящем изобретении для лечения ВИЧ-инфекции, включают 2-гидроксиметил-5-(5-фторцитозин-1-ил)1,3-оксатиолан (ЕТС), (-)-энантиомер 2-гидроксиметил-5-(цитозин-1-ил)-1,3-оксатиолан (3ТС), карбовир, ацикловир, интерферон, ΑΖΤ, ΌΌΙ, ΌΟΟ Ό4Τ, С8-92 (3'-азидо-2',3-дидезокси-5метилцитидин) и β-Ό-диоксоланнуклеозиды, такие как β-Ό-диоксоланилгуанин (ΌΧΟ), β-Όдиоксоланил-6-хлорпурин (АСР) и МКС-442 (6бензил-1-(этоксиметил)-5-изопропилурацил).

Предпочтительные протеазные ингибиторы включают криксован (Мегск), нельфиновир (Адоигоп), ритонавир (АЬЬо1). сакинавир (Воске) и ИМР-450 (ЭиРоп! Мегск).

Не служащими ограничением примерами соединений, которые могут быть введены в сочетании или в чередовании с одним из любых 1,3-оксаселеноленилнуклеозидов, являются (18, 4В)-4-[2-амино-6-циклопропиламино)-9Н-пурин-9-ил]-2-циклопентен-1 -метанолсукцинат (1592 - аналог карбовира: 61ахо \Уе11соте); 3ТС - (-)-в-Ь-2',3'-дидезокси-3'-трицитидин (61ахо Сексоте); а-АРА В18893 - а-нитроанилинфенилацетамид; А-77003 - ингибитор протеазы, различающий С₂ (зеркальную) симметрию (АЬЬой); А-75925 - ингибитор протеазы, различающий С₂-симметрию (АЬЬой); ААРВНАР - аналог бисгетероарилпиперазина (Ир)окп); АВТ-538 - ингибитор протеазы, различающей С₂-симметрию (АЬЬой); Ахййи - 3'азидо-2',3'-дидезоксиуридин; А2Т - 3'-азидо-3'дезокситимидин (61ахо \Уе11соше); А2Т-р-йй1 3'-азидо-3'-деокситимидилил-(5',5')-2',3'дидезок-сиинозиновая кислота (Пах); ВНАР бис-гетероарилпиперазин; ВША - 1906-Ν-{18{{{3-[28-{(1,1-диметилэтил)амино }карбонил]4В(3 -пиримидинилметил)тио-1-пиперидинил}2В-гидрокси-18-(фенилэтил)пропил}амино }] карбонил-2-метилпропил-2-хинолинкарбоксамид (ВюМеда/Воекппдег-1пде1ке1т); ВША-2185

- N-(1,1 -диметилэтил)-1-[28-[[2-2,6-диметилфе- нокси)-1-оксоэтил])амино]2-В-гидрокси-4-фенилбу тил]4В-пиридинилтио -2-пиперидинкарбо ксамид (ВюМеда/Воекппдет-1пде1ке1т); ВМ+ 51.0836 - тиазолоизоиндолиноновое производное; ВМ8-186318 - аминодиоловое производное ингибитора протеазы вируса ВИЧ-1 (ВпйоМуег8-8с.|шЬЬ); й4АР1-9-[2,5-дигидро-5-(фосфонометокси)-2-фуран]аденин (Сйеай); й4С - 2',3'дидегидро-2',3'-диде-зоксицитидин; й4Т - 2',3'дидегидро-3'-дезокситимидин (Впйо1-Муетк8с.|шЬЬ); ййС - 2',3'-дидезоксицитидин (Воске); йй1 - 2',3'-дидезоксиинозин (Впйо1-Муетк8с.|шЬЬ); ИМР-266 - 1,4-дигидро-2Н-3,1бензоксазин-2-он; ИМР-450 - {[4В-(4-а,5-а,6-Ь,7Ь)] -гексагидро-5,6-бис(гидрокси)-1,3-бис(3-амино)фенил]метил)-4,7-бис(фенилметил)-2Н-1,3диазепин-2-он}-бисмезилат (Ау1й); ΌΧ6 - (-)-βΌ-диоксолангуанозин (Тпапд1е); ЕВИ-йМ - 5этил-1-этоксиметил-6-(3,5-диметилбензил)урацил; Е-ЕВи - 5-этил-1-этоксиметил-6-бензилурацил; Ό8 - декстрансульфат; Е-ЕР8еИ - 1(этоксиметил)-(6-фенилселенил)-5-этилурацил; Е-ЕРи - 1-(этоксиметил)-(6-фенилтио)-5-этилурацил; ЕТС - в-2',3'-дидезокси-5-фтор-3'-тиацитидин (Тпапд1е); НВУ097 - 8-4-изопропоксикарбонил-6-метокси-3-(метилтиометил)-3,4-дигидрохиноксалин-2(1Н)-тион; НЕРТ - 1-[2-(гидроксиэтокси)метил]-6-(фенилтио)тимин; ВИЧ-1

- вирус иммунодефицита человека 1-го типа; 1М2763 - 1,1'-(1, 3-пропандиил)-бис-1,4,8,11- тетраазациклотетрадекан Докпкоп Майкеу); 1М3100 - 1,1'-[1,4-фенилен-бис-(метилен) ] -бис1, 4, 8, 11-тетраазациклотетрадекан Докпкоп Майкеу); ΚΝΙ-272 - трипептид, включающий (28,38)-3-амино-2-гидрокси-4-фенилбутировую кислоту; Ь-697593 - 5-этил-6-метил-3-(2-фталимидоэтил)пиридин-2(1Н)-он; Ь-735524 - гидроксиаминопентанамид ингибитора протеазы ВИЧ1 (Мегск); Ь-697661 - 3-{[(-4,7-дихлор-1,3бензоксазол-2 -ил)метил] амино }-5-этил-6-метилпиридин-2(1Н)-он; Й-ЕООС - (0)-в-Ь-5-фтор2',3'-дидезоксицитидин; Ь-РИОС - (-)-β-Ε-5фтордиоксоланцитозин; МКС-442 - 6-бензил-1этоксиметил-5-изопропилурацил (Ι-ЕВИ: Тпапд1е/МйкиЬ1кЫ); невирапин - 11-циклопропил5,11-дигидро-4-метил-6Н-дипиридол[3,2-Ь:2',3'е]диазепин-6-он (Воекппдет-1пде1ке1т);

N80’648400 - 1-бензилоксиметил-5-этил-6-(апиридилтио)урацил (Е-ВРТИ); Р9941 - [2пиридилацетилизолейцинфенилаланиналанин(СНОН)]₂ (Иирой Мегск); РЕА - фосфоноформиат (фоскарнет: Акйа); РМЕА - 9-(2фосфонилметоксиэтил)аденин (Ойеай); РМРА (В)-9-(2-фосфонилметоксипропил)аденин (611еай); Во 31-8959 - гидроксиэтиламиновое производное ингибитора протеазы ВИЧ-1 (Воске); ВР1-312 - ингибитор пептидилпротеазы, 1-[(38)3-(п-а-бензилоксикарбонил)-1-аспаргинил)-амино-2-гидрокси-4-фенилбутирил]-п-трет-бутил-1пролинамид; 2720 - 6-хлор-3,3-диметил-4(изопропенилоксикарбонил)-3,4-дигидрохиноксалин-2(1Н)-тион; 8С-52151 - ингибитор изостерической протеазы гидроксиэтилмочевины (8еаг1е); 8С-55389А - ингибитор изостерической протеазы гидроксиэтилмочевины (8еаг1е); Т1ВО В82150 - ( + )-(58)-4,5,6,7-тетрагидро-5-метил-6(3 -метил-2-бутенил)имидазо [4,5,1-]к]-[1,4] -бензодиазепин-2(1Н)-тион (1апккеп); Т1ВО 82913 (+)-(58)-4,5,6,7-тетрагидро-9-хлор-5-метил-6-(3метил-2-бутенил)имидазо [4,5,1-]к]-[1,4] -бензодиазепин-2(1Н)-тион (1апккеп); Т8АО-т3Т [2',5'-бис-О-(трет-бутилдиметилсилил)-3'-спиро5'-(4'-амино-1',2'-оксатиол-2',2'-диоксид)]-Ь-Эпентофуранозил-№-метилтимин; И90152 - 1-[3[1-(метилэтил)амино]-2-пиридинил]-4-[[5-[(метилсульфонил)амино]-1Н-индол-2-ил]карбонил] пиперазин; ИС тиокарбоксанилидные производные (Ип1гоуа1); ИС-781 - №[4-хлор-3-(3-метил-2-бутенилокси)фенил]-2-метил-3-фуранкарботиоамид; ИС-82 - №[4-хлор-3-(3-метил-2бутенилокси)фенил]-2-метил-3-тиофенкарботиоамид; УВ 11328 - гидроксиэтилсульфонамид ингибитора протеазы (Уейех); У8-478 - гидроксиэтилсульфонамид ингибитора протеазы (Уейех); ХМ-323 - цикломочевой ингибитор протеазы (Иирой Мегск).

IV. Способность 1,3-оксаселеноланилнуклеозидов подавлять репликацию ВИЧ и ВГБ Способность нуклеозидов подавлять ВИЧ может быть определена с помощью различных экспериментальных методик. Использованная в данном случае методика, подробно описанная ниже, позволяет измерять уровень подавления репликации вирусов в стимулированных фитогемагглютинином (ФГА) моноядерных клетках периферической крови человека (РВМ), зараженных вирусом ВИЧ-1 штамма ЬАУ. Количество образующегося вируса определяется с помощью измерения уровня кодируемой вирусным геномом обратной транскриптазы. Количество вырабатываемого фермента пропорционально количеству образующегося вируса.

Пример 4. Анти-ВИЧ активность 1,3-оксаселеноланилнуклеозидов.

По анти-ВИЧ активности были тестированы 2-гидроксиметил-4-(Х-5'-цитозин-1'-ил)-1,3оксаселенолан и 2-гидроксиметил-4-(№5'-фторцитозин-1'-ил)-1,3-оксаселенолан.

Трехдневные стимулированные фитогемагглютинином клетки РВМ (1 млн. клеток на 1 мл), выделенные у доноров, которые при серологическом анализе были негативны по вирусам ВИЧ-1 и гепатита-В, инфицировали ВИЧ-1 (штамм ЬЛУ) в концентрации приблизительно в 100 раз превышающей 50% инфекционную дозу в тканевой культуре (Т1СО₅₀) на 1 мл и культивировали в присутствии или отсутствии антивирусных соединений с различными концентрациями .

Примерно через 1 ч после инфицирования среду с тестируемым соединением (двукратно по отношению к конечной концентрации в среде) или не содержащую соединение, добавляли в колбы (5 мл; конечный объем - 10 мл). В качестве позитивного контроля использовали ΑΖΤ.

Клетки подвергали заражению вирусом (примерно 2х10⁵ ед/мл, по данным теста на обратную транскриптазу) и затем помещали в углекислотный инкубатор. Вирус ВИЧ-1 (штамм ЬАУ) был получен из Центра по контролю за заболеваемостью Атланты, штат Джорджия (США). Методы, использовавшиеся для культивирования клеток РВМС, сбора вируса и определения активности обратной транскриптазы соответствовали тем, которые описаны у МсОоида1 е! а1., 1985, 1. 1ттипо1. Ме!коб§, 76, 171-183 и 8р1га е! а1., 1987, I. С1т. МеШобк, 25, 97-99, за исключением того, что в среду не включали фунгизон (см. 8с1ипа/1 е! а1., 1988, АпбтюгоЬ. Адеп!к Скето!кегару, 32, 1784-1787; тоже, 34, 1061-1067 (1990)).

На 6-й день клетки и надосадочную фракцию переносили в 15 мл пробирку и центрифугировали при 900д в течение 10 мин. Пять мл надосадочной фракции удаляли и вирус концентрировали центрифугированием при 40000 об/мин в течение 30 мин (центрифуга Весктап 70,1-Τί). Солюбилизованный вирусный осадок тестировали для определения уровней обратной транскриптазы. Полученные результаты выражали в ед. на мл тестируемого супернатанта. Вирусы из меньших объемов надосадочных фракций (1 мл) также могут быть концентрированы центрифугированием до солюбилизации и определения уровней обратной транскриптазы.

Среднюю эффективную концентрацию (ЕС₅₀) определяли по методу среднего эффекта (АпбтюгоЬ. Адеп!к СкетоШегару, 30, 491498, 1986). Вкратце, процент подавления вируса, определяемый путем измерения уровня обратной транскриптазы, соотносили с микромолярными концентрациями тестируемого соединения. Величина ЕС₅₀ - концентрация соединения, при которой имело место 50%-ное подавление роста вирусов.

Стимулированные митогеном неинфицированные клетки РВМ человека (3,8х10⁵ клеток/мл) культивировали в присутствии или отсутствие лекарственного средства при тех же условиях, которые были использованы в тестировании антивирусной активности, описанном выше. Клетки подсчитывали через 6 дней с использованием гемоцитометра и методом исключения с трипановым синим в соответствии с описанным у 5>с1ипа/1 е! а1., 1982, Апбт1сгоЬ1а1 Адеп!к СкетоЛегару, 22(3), 499. Величина 1С₅₀ - концентрация соединения, которая подавляет нормальный рост клеток на 50%.

Табл. 4 показывает значения ЕС₅₀ (концентрации нуклеозида, которые подавляют репликацию вируса на 50% в клетках РВМ, определенные с учетом 10%-ной ошибки) и величины 1С₅₀ (концентрации нуклеозида, которые подавляют на 50% рост стимулированных митогеном неинфицированных клеток РВМ человека, клеток СЕМ и клеток Уего) для 2-гидроксиметил-4(Х-5'-цитозин-1'-ил)-1,3-оксаселенолана и 2гидроксиметил-4-(Х-5'-фторцитозин-1'-ил)-1,3оксаселенолана.

Таблица 4. Анти-ВИЧ активность оксаселеноланнуклеозидов

Основание	Анти-ВИЧ активность в клетках РВМ (ЕС50, мкМ)	Токсичность (Юбо, мкМ) для клеток
РВМ	СЕМ	Уего
Цитозин	0,88	> 100	> 100	> 100
5-фторцитозин	0,07	> 100	> 100	> 100

Табл. 5 показывает уровень чистоты, величины ЕС50 (мкМ), величины ЕС90 (мкМ) и величины 1С₅₀ в клетках РВМС для рацемата β-ЗеРббС, его отдельных изомеров ( + ) и (-) , рацемата β-Зе-РббС и его отдельных изомеров (+) и (-).

Таблица 5. Анти-ВИЧ активность и цитотоксичность рацематов и энантиомеров оксаленоланцитозиновых нуклеозидов

Соединение	Энантиомер	Чистота, %	ЕС», мкМ	ЕСдо, мкМ	1СМ РВМ
β-Зе-аас	±	50	2,69	209	> 100
β-Зе-аас	-	* 100	0,88	5,42	> 100
β-Зе-аас	+	* 96	3,39	677	> 100
р-зе-гаас	+	50	5,55	16,41	> 100
β-зе-гаас	-	* 100	0,21	1,05	> 100
р-зе-гаас	+	= 100	41,9	164	> 100

Анти-ВИЧ активность β-Зе-ббС, его отдельных изомеров ( + ) и (-), а также β-Зе-РббС и его отдельных изомеров ( + ) и (-) была также протестирована в клетках РВМ, инфицированных вирусом ВИЧ, который характеризуется мутацией в 184-м кодоне гена обратной транскриптазы. Результаты этого теста приведены в табл. 6. Как видно из нее, рацемат и изомер (-)-в-8е-ббС проявляют существенную активность по отношению к мутантному вирусу. Таблица 6. Влияние оксаселеноланцитозиновых нуклеозидов на клонированный М184 ВИЧ-1

Соединение	Энантиомер	Чистота, %	Шрус	ЕС», мкМ	ЕС», мхМ	ΕΙ ЕСк>	П ЕСМ
р-зе-аас	+	50	ххвки	1,84	6,90	-	-
β-зе-аас	-	* 100	ххвки	0,11	0,95	-	-
р-зе-аас	+	• 96	ххвки	8,62	35,1	-
р-зе-гаас	±	50	М184У	108	337	59	49
р-зе-гаас	-	• 100	М184У	> 50	> 50	> 455	> 53
р-зе-гаас	+	« 96	Μ184ν	> 50	> 50	> 6	> 1

Примечание: ΡΙ (степень увеличения) ЕС₉₀ = отношение ЕС₅₀ для клонированного вируса к ЕС₅₀ для вируса ххВКИ

Пример 5. Анти-ВИЧ активность 1,3-оксаселеноланилнуклеозидов.

Способность активных соединений подавлять рост вируса в культивируемых клетках 2.2.15 (клетки НерС2, трансформированные вирионами гепатита) может быть оценена так, как это подробно описано ниже.

Принцип и описание такого теста для выявления антивирусных проявлений в данной культуральной системе и анализ ДНК ВГБ был описан (КогЬа & МПтап. 1991, ΑηίίνίΓαΙ Кек., 15, 217). Оценки антивирусного влияния проводят в двух раздельных клеточных пассажах. Все лунки на всех планшетах засевают при одинаковой плотности и в одно и то же время.

Из-за врожденной изменчивости уровней внутриклеточной и внеклеточной ДНК гепатита-В, лишь величины подавления, превышающие в 3,5 раз (для ДНК вирусного вириона) или в 3 раза (для репликационных интермедиатов ДНК ВГБ) по отношению к средним уровням этих ДНК-форм вируса в неподвергавшихся дополнительному воздействию клетках будут статистически достоверными (Р < 0,05). Уровни интеграции ДНК ВГБ в каждом клеточном препарате ДНК (которые остаются постоянными в расчете на 1 клетку благодаря выбранной схеме эксперимента) используют для расчета внутри клеточных форм ДНК ВГБ, что тем самым обеспечивает уверенность в одинаковом количестве клеточной ДНК, сравниваемой при сопоставлении отдельных образцов.

Типичные значения внеклеточной вирионной ДНК ВГБ в неподвергающихся воздействию клетках варьируются от 50 до 150 пкг/мл культуральной среды (в среднем приблизительно 76 пкг/мл). Внутриклеточные репликационные интермедиаты ДНК ВГБ в неподвергающихся воздействию клетках варьируются от 50 до 100 пкг/мкг клеточной ДНК (в среднем 74 пкг/мкг клеточной ДНК). В целом, подавление уровней внутриклеточной ДНК ВГБ в результате обработки клеток антивирусными соединениями менее выражено и происходит с меньшей скоростью по сравнению с подавлением уровней вирионной ДНК ВГБ (КогЬа & МПтап, 1991, Ап1Мга1 Кек., 15, 217).

Подход, с помощью которого в данном эксперименте проводился гибридизационный анализ, который показал эквивалентность приблизительно 1,0 пкг внутриклеточной ДНК ВГБ двум-трем копиям вирусного генома на 1 клетку, а 1,0 пкг/мл внеклеточной ДНК ВГБ - 300 тысячам вирусных частиц на 1 мл.

Анализ токсичности может быть проведен с целью выяснения того, обусловлено ли любое из наблюдаемых антивирусных проявлений принципиальным влиянием на жизнеспособность клеток. Одним из методов, который может быть в данном случае применен, является измерение поглощения нейтрального красного красителя, являющегося стандартным и широко применяемым в тестах на клеточную жизнеспособность в различных системах вирус-хозяин, включая вирусы ВГБ и ВИЧ. Анализ токсичности проводят на 96-луночных плоскодонных планшетах для тканевого культивирования. Клетки для анализа токсичности культивируют и обрабатывают тестируемыми соединениями таким же образом, как это подробно описано ниже для оценок антивирусной активности. Каждое соединение тестировали в четырех концентрациях, в каждом случае - в трех повторностях (лунки А, В и С). Уровень поглощения нейтрального красного красителя использовали в качестве меры относительного уровня токсичности. Для количественного анализа использовали показатели поглощения внедрившегося в клетки красителя при 510 нм (А_к1п). Значения для тестируемых соединений представлены в виде процентных долей от величины А_кш в 9 отдельных культурах, не подвергавшихся воздействию клеток, выращиваемых на одном и том же 96-луночном планшете.

Пример 6. Применение 1,3-оксаселеноланилнукдеозидов для лечения аномальной пролиферации клеток.

Некоторые из описанных в данном тексте 1,3-оксаселеноланилнуклеозидов могут быть применены для лечения аномальной пролифе рации клеток, включая опухоли вообще и раковые опухоли в частности. Уровень антипролиферационной активности может быть легко оценен путем тестирования соединения в соответствии с процедурой, описанной ниже для клеток СЕМ, или с использованием тестов на других опухолевых или пролиферативных клеточных линиях. Клетки СЕМ являются лимфомными клетками человека (Т-лимфобластоидная клеточная линия, которая доступна из Американской коллекции типовых культур в Роквилле, штат Мэриленд, США). Токсичность соединения в отношении клеток СЕМ дает информацию, отражающую активность соединения в отношении опухолей. Токсичность определяют как индекс 1С₅₀, выраженный в микромолях. Индекс 1С₅₀ обозначает ту концентрацию тестируемого соединения, которая подавляет рост опухолевых клеток в культуре на 50%. Чем ниже величина 1С₅₀, тем более активно конкретное соединение в качестве противоопухолевого агента. В целом, 1,3-оксаселеноланилнуклеозид проявляет противоопухолевую активность и может быть применен для лечения аномальной пролиферации клеток, если он проявляет токсичность в отношении клеток СЕМ или других иммортализованных опухолевых клеточных линий на уровне менее 10 микромолей, более предпочтительно менее приблизительно 5 микромолей, а наиболее предпочтительно на уровне менее 1 микромоля.

Растворы лекарственного средства, включая циклогексимид, взятый в качестве позитивного контроля, используют в трех повторностях в 50 мкл питательной среды в удвоенной конечной концентрации с последующим уравновешиванием при 37°С в углекислотном (5%) инкубаторе. Клетки, находящиеся на логарифмической фазе роста, добавляют в 50 мкл культуральной среды до конечной концентрации 2500 клеток на лунку (СЕМ и 8К-МЕБ-28), 5000 клеток на лунку (ΜΝΑΝ, МОА-МВ-4358, 8КМЕ8-1, υυ-145, 1.\СаР) или 10000 клеток на лунку (РС-3, МСЕ-7) и инкубируют в течение 3 дней (Όυ-145, РС-3, ΜΝΑΝ), 4 дней (МСЕ-7, 8К-МЕБ-28, СЕМ) или 5 дней (8КМЕ8-1, М1ААМВ-4358, ЙНСаР) при 37°С в условиях атмосферы воздуха с 5% углекислого газа. Контрольные лунки включают только культуральную среду (чистые) и клетки в культуральной среде без лекарственного агента. После периода роста в каждую лунку добавляют по 15 мкл раствора красителя из набора реактивов для титрования клеток Се11 Тйег 96 кй (Рготеда, Майкоп, XVI) и планшеты инкубируют в течение 8 ч при 37°С в углекислотном (5%) инкубаторе. Затем добавляют останавливающий раствор из того же набора реактивов (Се11 Тйег 96 кй: Рготеда) и инкубируют в течение 4-8 ч в том же инкубаторе. Величины поглощения определяют при 570 нм с пропусками лунок, содержащих только культуральную среду, с использованием план шета-ридера Вю1ек Вюктейск (Вю1ек. Ашооккц УТ). Подсчитывают средний уровень подавления роста в сравнении с не подвергавшимся обработке контролем. С использованием метода Чоу-Талалаи определяют величины 1С₅₀, 1С₉₀, коэффициент регрессии и угловой коэффициент (СЬои Т. С. & Та1а1ау, Р. 1984, фиапШайуе апа1ук18 о Г боке-еГГес! ге1айопкЫр8: !Ье сотЬтеб еГГес1к оГ ти1йр1е бгидк ог епхуте тЫЬйогк, Абу. Епхуте Ке§и1., 22, 27-55).

IV. Приготовление фармацевтических композиций

Пациенты, страдающие от любого из описанных в настоящем тексте заболеваний, включая ВИЧ- и ВГБ-инфекции, или характеризующиеся аномальной пролиферацией клеток, могут быть подвергнуты лечению путем введения эффективного количества 1,3-оксаселеноланилнуклеозида, произвольно в фармацевтически приемлемом носителе или растворителе. Активные компоненты могут быть введены любым подходящим способом, например перорально, парентерально, внутривенно, внутрикожно, подкожно или местно, в жидкой или твердой форме.

Активное соединение включают в фармацевтически приемлемый носитель или растворитель в количестве, достаточном для доставки пациенту терапевтически эффективного количества соединения, предназначенного для подавления репликации вирусов ш у1уо, в первую очередь, репликации вирусов ВИЧ и ВГБ, без проявления серьезных токсических последствий у таких пациентов. Понятие ингибирующее количество обозначает такое количество активного компонента, которого достаточно для достижения ингибирующего эффекта, который может быть оценен, например, методом как один из описанных здесь тестов.

Предпочтительная доза соединения для применения в обозначенных выше условиях должна находиться в пределах от 1 до 50 мг на 1 кг веса тела пациента, предпочтительно от 1 до 20 мг/кг в день, а в более общем плане - от 0,1 до примерно 100 мг на 1 кг веса тела пациента в день. Эффективные дозировки для фармацевтически приемлемых производных препаратов могут быть определены, исходя из веса предназначенного для введения исходного нуклеозида в этом препарате. Если производный препарат характеризуется собственной активностью, то эффективные дозировки могут быть определены так, как это описано выше для производного препарата, или с помощью других подходов, известных специалистам в данной области техники.

Соединение вводят стандартными дозами или любыми другими подходящими формами дозировки, включая, но тем самым не ограничиваясь, дозировочные единицы (стандартные дозы), содержащие от 7 до 3000 мг, предпочтительно от 70 до 1400 мг активного компонента.

Обычно стандартным для перорального введения является использование единичных дозировок по 50-1000 мг.

В идеале активный компонент должен вводиться таким образом, чтобы достигался пик концентрации в плазме крови примерно от 0,2 до 70 мкМ, предпочтительно примерно от 1,0 до 10 мкМ. Этого можно добиться, например, путем внутривенных инъекций 0,1-5%-ного раствора активного компонента, произвольно в солевом растворе, или путем введения активного компонента в виде болюса.

Концентрация активного компонента в лекарственной композиции должна зависеть от уровней поглощения, инактивации в организме и экскреции лекарственного средства, а также от других факторов, известных специалистам в данной области техники. Необходимо отметить, что величины дозировок также будут варьироваться в зависимости от тяжести состояния. Также должно быть понятно, что для конкретного пациента может быть разработан индивидуальный режим дозировок в течение того периода времени, когда требуется учет индивидуальных потребностей, и исходя из профессиональных оценок врача, назначающего введение данных композиций, а также должно быть понятно, что приведенный в данном тексте диапазон концентраций является лишь примером и, соответственно, не претендует на ограничение масштаба или практики применения композиций, представляемых настоящим изобретением. Активный компонент может быть введен однократно или может быть разделен на серию меньших доз, которые вводят на протяжении какого-либо периода времени.

Предпочтительным путем введения активного соединения является пероральный путь. Композиции для перорального введение в принципе должны содержать инертный растворитель либо съедобный носитель. Они могут быть упакованы в желатиновые капсулы или спрессованы в таблетки. Для целей перорального терапевтического применения активное соединение может быть соединено с наполнителем и применено в форме таблеток, капсул или пастилок. Как компоненты композиций, могут быть включены фармацевтически совместимые агенты и (или) адъюванты.

Таблетки, драже, капсулы, пастилки и подобное могут содержать любой из следующих ингредиентов или соединений сходной природы: связывающий компонент, такой как микрокристаллическая целлюлоза, смола трагаканта или желатин; наполнитель, такой как крахмал или лактоза; дезинтегрирующий компонент, такой как альгиновая кислота, примогель или кукурузный крахмал; лубрикант, такой как стеарат магния или стеротес; скользящее вещество, такое как коллоидный раствор двуокиси кремния; подслащивающий компонент, такой как сахароза или сахарин; или ароматизатор, такой как перечная мята, метилсалицилат или экстракт цитрусовых. В случае, когда единицей дозировки является капсула, она может, в дополнение к обозначенным выше компонентам, содержать жидкий носитель, такой как масло. Кроме того, стандартные дозы могут содержать различные иные материалы, которые бы модифицировали ее физическое состояние, например, покрытие сахаром, шеллаком или другими съедобными ингредиентами.

Соединение может быть введено в виде компонента бальзама, суспензии, сиропа, облатки, жевательной резины и подобного. Сироп в дополнение к активным компонентам может включать сахарозу (как подслащивающий компонент) и некоторые консерванты, красители и ароматизаторы.

Соединение по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемые производные или соли также могут быть смешаны с другими активными компонентами, которые не нарушают их желательную активность, или с компонентами, усиливающими желательную функцию, такими как антибиотики, противогрибковые препараты, противовоспалительные средства, протеазные ингибиторы или другие нуклеозидные или не являющиеся нуклеозидами антивирусные агенты, которые более подробно обсуждались в данном тексте выше. Растворы или суспензии, применяемые для парентерального, внутрикожного, подкожного или местного введения, могут включать следующие компоненты: стерильный растворитель, такой как вода для инъекций, солевой раствор, стойкие масла, полиэтиленгликоль, глицерин, пропиленгликоль или другие синтетические растворители; противобактериальные агенты, такие как бензиловый спирт или метилпарабен; антиокислители, такие как аскорбиновая кислота или бисульфит натрия; деминерализирующий компонент, такой как этилендиаминтетрауксусная кислота; буферы, такие как ацетатный, цитратный или фосфатный; и изотонические компоненты, такие как хлорид натрия или декстроза. Исходный препарат может быть помещен в ампулы, одноразовые шприцы или ампулы с серийными дозами, изготовленные из стекла или пластика.

При внутривенном введении предпочтительными носителями являются физиологический раствор или фосфатный буфер.

В предпочтительном варианте активные соединения объединяют с носителями, которые бы защищали данное соединение от быстрого удаления из организма, например в форме, обеспечивающей регулируемый выход препарата, включая имплантаты и микрокапсульные системы. Могут быть использованы биологически разрушаемые, биологически совместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полимеризованная молочная кислота. Способы приготовления таких препаратов хорошо известны специалистам в данной области техники. Материалы также могут быть приобретены в Αίζα СогрогаНоп на коммерческой основе.

Липосомные суспензии (включая липосомы, с моноклональными антителами к вирусным антигенам), нацеленные на инфицированные клетки также являются целесообразными в качестве фармацевтически приемлемых носителей. Они могут быть приготовлены в соответствии со способами, известными специалистам в данной области техники, например в соответствии с описанным в патенте США № 4522811 (включен в данный текст путем цитирования). Например, липосомные препараты могут быть приготовлены путем растворения подходящих липидов, таких как стеароилфосфатидилэта-ноламин, стеароилфосфатидилхолин, арахадоилфосфатидилхолин и холестерин, в неорганическом растворителе, который затем упаривают до получения тонкой пленки высушенного липида на поверхности контейнера. Водный раствор активного компонента или его монофосфатного, дифосфатного и(или) трифосфатного производного затем вносят в этот контейнер. Затем контейнер вручную вращают для освобождения липидного материала от стенок контейнера и диспергирования липидных агрегатов, тем самым образуя липосомную суспензию.

Настоящее изобретение было описано со ссылками на его предпочтительные варианты. Изменения и модификации настоящего изобретения могут быть очевидны для специалистов в данной области техники, исходя из предшествующего подробного описания настоящего изобретения. Подразумевается, что все такие изменения и модификации должны быть включены в объем настоящего изобретения.

Claims (13)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. 1,3-Оксаселеноланлактон формулы где В обозначает водород, ацил, моно-, ди- или триэфир фосфорной кислоты, стабилизированный фосфат или остаток липида, или его фармацевтически приемлемая соль.
2. 2. Способ получения 1,3-оксаселеноланлактона формулы где В обозначает водород, ацил, моно-, ди- или триэфир фосфорной кислоты, стабилизированный фосфат или остаток липида, или его фармацевтически приемлемой соли, включающий

   a) получение димера селенола формулы (8еСН₂СООН)₂;

   b) восстановление указанного димера и

   с) взаимодействие восстановленного продукта с ВОСН₂СНО с образованием 1,3-оксаселеноланлактона.
3. 3. Способ по п.2, где ВОСН₂СНО обозначает ΒζОСН₂СНО.
4. 4. Способ по п.2, где восстановление и взаимодействие осуществляют без выделения каких-либо промежуточных соединений.
5. 5. Способ по пп.2-4, где восстановление осуществляется с использованием Н3РО2.
6. 6. Способ по п.2, где димер селенола получают из селенилцианида, включающий

   a) взаимодействие селенилцианида формулы К-8еСЫ с Вг-СН₂СО₂Е1 с образованием ЫС8еСН2СО2Е1;

   b) димеризацию ЫС8еСН₂СО₂Е1 с образованием (8еСН₂СО₂Е1)₂ и, при необходимости,

   c) активирование (8еСН₂СО₂Е1)₂ с образованием (8еСН₂СО₂Н)₂.
7. 7. Способ получения 1,3-оксаселеноланнуклеозида формулы где В обозначает пуриновое или пиримидиновое основание, а В обозначает водород, ацил, моно-, ди- или триэфир фосфорной кислоты, стабилизированный фосфат или остаток липида, или его фармацевтически приемлемой соли, включающий

   а) получение 1,3-оксаселеноланлактона формулы

   Ь) активирование указанного лактона в соединение формулы где Ь обозначает соответствующую удаляемую группу, галоген или ацил, такой как ОАс;

   с) взаимодействие активированного лактона с необязательно силилированным основанием с образованием 1,3-оксаленоланнуклеозида; и, при необходимости

   б) депротектирование указанного нуклеозида с образованием 1,3-оксаленоланнуклеозида формулы где В обозначает пуриновое или пиримидиновое основание, а В обозначает водород; и, необяза тельно

   е) активирование указанного нуклеозида с образованием 1,3-оксаленоланнуклеозида фор мулы где В обозначает пуриновое или пиримидиновое основание, а В обозначает ацил, моно-, ди- или триэфир фосфорной кислоты, стабилизированный фосфат или остаток липида, или его фармацевтически приемлемой соли.
8. 8. Способ по п.7, где взаимодействие осуществляется в присутствии триметилсилилтрифлата.
9. 9. Способ по п.7, где Ь обозначает ацил.
10. 10. Способ по п.7, где Ь обозначает ОАс.
11. 11. Способ по п.9 или 10, где активирование лактона осуществляют действием на лактон восстанавливающим агентом с образованием спирта формулы

    КЗеСИ/ЕЮН

    ΝαΒΗ₄/

    ЕЮАс/ЕЮН

    Фиг. 1 силилированное основание ТМ5ОТ1/СН с последующим активированием спирта с образованием соединения формулы
12. 12. Способ по п.10, где восстанавливающим агентом является диизобутилалюминийгидрид (ΌΙΒΑΒ-Η).
13. 13. Способ по п.11, где активирование спирта осуществляется уксусным ангидридом.