DK173490B1

DK173490B1 - Pharmaceutical excipient for reducing transdermal flux

Info

Publication number: DK173490B1
Application number: DK198606349A
Authority: DK
Inventors: Larry M Allen
Original assignee: Access Pharma Inc
Priority date: 1985-05-03
Filing date: 1986-12-30
Publication date: 2000-12-27
Also published as: DK634986A; NO870001L; DK634986D0; NO870001D0

Description

1 DK 173490 B1 OPFINDELSENS OMRÅDE.FIELD OF THE INVENTION.

55

Opfindelsen angår en farmaceutisk formulering til indførelse af reservoirvirkning i hud og slimhinder for at forøge indtrængningen og opholdstiden for farmakologisk aktive stoffer deri.The invention relates to a pharmaceutical formulation for introducing reservoir action into the skin and mucosa to increase the penetration and residence time of pharmacologically active substances therein.

10 OPFINDELSENS BAGGRUND.BACKGROUND OF THE INVENTION.

Der er mange lokaliserede sygdomstilstande, der behandles effektivt ved lokal påføring af passende fysiologiske stoffer. For at sådanne behandlinger kan være maksimalt effektive, er det nødvendigt, at så meget som muligt af det far-15 makologisk aktive stof absorberes af huden, hvor det kan komme i kontakt med sygdomstilstanden i hudvævene uden at gå tabt ved at blive gnedet af på tøjet eller ved fordampning. Samtidig må stoffet ikke trænge så effektivt igennem huden, at det hurtigt tabes til lymfe- eller blodkredsløbet. Denne sidste faktor er navnlig vigtig, når det farmakologisk aktive stof er toksisk, når det bruges 20 systemisk.There are many localized disease states that are effectively treated by local application of appropriate physiological agents. For such treatments to be maximally effective, it is necessary that as much as possible of the pharmacologically active substance is absorbed by the skin, where it can come into contact with the disease state of the skin tissues without being lost by being rubbed off on the skin. the clothes or by evaporation. At the same time, the drug must not penetrate the skin so effectively that it is quickly lost to the lymphatic or bloodstream. This last factor is particularly important when the pharmacologically active substance is toxic when used systemically.

Det ideelle bærestof for lægemidler til lokalt brug er derfor et, der kan give en "reservoirvirkning" i den hud eller de slimhinder, som påføres den lokale behandling. Denne "reservoirvirkning" defineres som en forøgelse af hudens eller 25 slimhindens evne til at absorbere og tilbageholde farmakologisk aktive stoffer, det vil sige, at forøge opholdstiden i huden eller hinden, nedsætte transittiden for lægemidlet og reducere den transdermale flux.Therefore, the ideal carrier for topical drugs is one that can provide a "reservoir effect" in the skin or mucous membranes applied to the local treatment. This "reservoir effect" is defined as an increase in the ability of the skin or mucosa to absorb and retain pharmacologically active substances, that is, to increase the residence time in the skin or the brain, reduce the transit time of the drug and reduce the transdermal flux.

Forskellige stoffer vides at forøge farmakologisk aktive stoffers evne til at trænge 30 igennem huden og slimhinder, for eksempel N-bis-azacyclopentan-2-onyl-alkaner, 1-substituerede azacycloheptan-2-oner og højere alkylsubstituerede azacyclo-pentan-2-oner, så vel som dimethylsulfoxid og lavere alkylsulfoxider. Disse stoffer har imidlertid den ulempe, at de giver en hurtig spredning af de farmakologisk aktive stoffer væk fra det lokaliserede syge sted. Mange medikamenter til lokalt brug, 35 såsom retinoideme, der bruges i behandlingen af acne, og methotrexat, der 2 DK 173490 B1 bruges i behandlingen af psoriasis, er systemisk toksiske. Retinoideme for eksempel vides at skade ufødte fostre. Der er således behov for en metode til at forøge evnen hos sådanne medikamenter til at trænge ind i huden eller slimhinderne, således at der kan anvendes en lavere total dosis, samtidig med at 5 den hæmmer deres evne til at trænge fra huden og ind i det indre af kroppen.Various substances are known to increase the ability of pharmacologically active substances to penetrate the skin and mucous membranes, for example N-bis-azacyclopentan-2-onyl alkanes, 1-substituted azacycloheptan-2-ones and higher alkyl-substituted azacyclopentan-2-ones. , as well as dimethyl sulfoxide and lower alkyl sulfoxides. However, these substances have the disadvantage that they cause a rapid spread of the pharmacologically active substances away from the localized sick place. Many topical drugs, such as the retinoids used in the treatment of acne, and methotrexate used in the treatment of psoriasis, are systemically toxic. For example, the retinoids are known to harm unborn fetuses. Thus, there is a need for a method of increasing the ability of such drugs to penetrate the skin or mucous membranes so that a lower total dose can be used while at the same time inhibiting their ability to penetrate the skin and into it. the interior of the body.

Det problem, der udgøres af det paradoksale behov for, at et systemisk toksisk lægemiddel til lokal anvendelse skal absorberes effektivt ind i, men ikke igennem huden, har hidtil været uerkendt. Der har ikke været nogen bærestofadditiver til 10 rådighed for den farmakologiske industri, der bevirker en forøgelse af "reservoirkapaciteten" i huden og slimhinderne således, at mængden af farmakologisk aktive stoffer, der når frem til og fastholdes til det lokaliserede, syge sted maksimeres.The problem posed by the paradoxical need for a systemic toxic drug for local use to be effectively absorbed into, but not through the skin, has so far been unknown. There have been no carrier additives available to the pharmacological industry which increase the "reservoir capacity" of the skin and mucous membranes so as to maximize the amount of pharmacologically active substances reaching and retained to the localized sick site.

15 RESUMÉ AF OPFINDELSEN.SUMMARY OF THE INVENTION.

Det er derfor formålet med den foreliggende opfindelse at angive en farmaceutisk formulering til at indføre en reservoireffekt i hud og slimhinder for at forøge indtrængningen og tilbageholdelsen af lokalt påførte farmakologisk aktive 20 terapeutiske og kosmetiske stoffer deri. Det omhandlede formål opnås ved en farmaceutisk formulering, der ifølge opfindelsen er særegen ved, at formuleringen omfatter et farmakologisk aktivt stof udvalgt af gruppen bestående af NDGA (nordihydroguaiaretsyre); VP-16 (epipodophyliotoxin-beta-D-ethyliden giuco-pyranosidetoposid); VM-26 (epipodo-phyllotoxin-beta-D-thenyliden glucopyrano-25 sidteniposid); ^-demethylepipodophyllotoxin; diethyistilbøstrol; dithranol; cyclo- phosphamid; mitomycin; daunomycin; cisdiamindichloridplatin; adriamycin og allopurinol samt en effektiv mængde af en vandopløselig, zinkhoidig forbindelse.It is therefore the object of the present invention to provide a pharmaceutical formulation for introducing a reservoir effect into the skin and mucosa to enhance the penetration and retention of locally applied pharmacologically active therapeutic and cosmetic substances therein. The object of the invention is achieved by a pharmaceutical formulation which according to the invention is peculiar in that the formulation comprises a pharmacologically active substance selected by the group consisting of NDGA (nordihydroguaiaretic acid); VP-16 (epipodophyliotoxin-beta-D-ethylidene giucopyranoside ethoposide); VM-26 (epipodo-phyllotoxin-beta-D-thenylidene glucopyranoside liposide); ^ -Demethylepipodophyllotoxin; diethyistilbøstrol; dithranol; cyclophosphamide; mitomycin; daunomycin; cisdiamindichloridplatin; adriamycin and allopurinol as well as an effective amount of a water-soluble zinc-containing compound.

Additiverne ifølge denne opfindelse er vandopløselige, zinkholdige forbindelser, 30 fortrinsvis zinkhalogenider, zinksulfat, zinknitrat, zinkacetat og/éfier zinkstearat, og mest foretrukket zinkchlorid.The additives of this invention are water-soluble zinc containing compounds, preferably zinc halides, zinc sulfate, zinc nitrate, zinc acetate and / or zinc stearate, and most preferably zinc chloride.

Ved at indføre en reservoirvirkning i huden og slimhinderne for at reducere den transdermale flux, så lægemidler absorberes og tilbageholdes deri i større 35 mængder og i længere tidsrum end det hidtil har været muligt, virker de vandopløselige, zinkholdige forbindelser ifølge opfindelsen potentierende på de 3 DK 173490 B1 farmakologisk aktive stoffer. Potentiering defineres som elimination eller reduktion af uønskede virkninger, såsom systemisk toksicitet og udvidelse af effektivitetsområdet for det farmakologisk aktive stof eller begge dele.By introducing a reservoir action into the skin and mucous membranes to reduce the transdermal flux so that drugs are absorbed and retained therein for greater amounts and for longer than has hitherto been possible, the water-soluble zinc-containing compounds of the invention potentiate the 173490 B1 pharmacologically active substances. Potentiation is defined as the elimination or reduction of undesirable effects, such as systemic toxicity and widening the efficacy range of the pharmacologically active substance or both.

5 Effektiviteten af indførelsen af NDGA (nordihydroguaiaretsyre) fremgår af det neden for angivne eksempel 2, medens effektiviteten af de øvrige stoffer fremgår af det efterfølgende eksempel 3 og den tilhørende tabel 3.5 The effectiveness of the introduction of NDGA (Northern Hydrogaiaretic Acid) is shown in Example 2 below, while the effectiveness of the other substances is shown in Example 3 below and the accompanying Table 3.

BESKRIVELSE AF TEGNINGEN.DESCRIPTION OF THE DRAWING.

1010

Tegningen er en grafisk afbildning af forsøgsresultater, som viser hudreser-voirvirkningen opnået ved fremgangsmåden ifølge denne opfindelse ved at benytte nordihydroguaiaretsyre med zinkchlorid sammenlignet med den samme forbindelse uden zinkchlorid. Nordihydroguaiaretsyren blev mærket med carbon-15 14 med henblik på radiotraceranalyse. Den grafiske afbildning viser omgående absorption og længere tilbageholdelse af større mængder af nordihydroguaiaretsyren med zinkchlorid tilstede end uden. Tilgængeligheden af nordi-hydroguaiaretsyre, der er en lipoxygenaseinhibitor, til terapeutisk at virke på lokaliserede sygdomstilstande, både med og uden zinkchlorid tilsat, måles ved 20 arealerne under de respektive kurver. Det fremgår, at hudbiotilgængeligheden er stærkt forøget ved tilstedeværelsen af en zinkholdig forbindelse. Fluxhastigheden for lægemidlet kan beregnes som en funktion af arealet under kurven ved at dividere dette areal med dosis. Som det fremgår er fluxhastigheden for lægemidlet stærkt nedsat over hele dosisintervallet ved tilsæjning af zinkchlorid.The drawing is a graphical representation of test results showing the skin reserve effect obtained by the process of this invention using nordihydroguaiaretic acid with zinc chloride compared to the same compound without zinc chloride. The Northern Hydroguaric Acid was labeled with carbon-14 for radiotracer analysis. The graph depicts immediate absorption and longer retention of larger amounts of the zinc chloride present in the hydrohydrogaiaric acid than without. The availability of nordihydroguaiaretic acid, a lipoxygenase inhibitor, for therapeutically acting on localized disease states, both with and without zinc chloride added, is measured at the 20 areas under the respective curves. It is seen that skin bioavailability is greatly increased by the presence of a zinc containing compound. The flux rate of the drug can be calculated as a function of area under the curve by dividing this area by dose. As can be seen, the flux rate of the drug is greatly reduced over the entire dose range by the addition of zinc chloride.

25 DETALJERET BESKRIVELSE AF OPFINDELSEN.DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION.

De zinkholdige forbindelser ifølge denne opfindelse er i almindelighed et hvilket som helst vandopløseligt, organisk eller uorganisk zinksalt, der dissocierer i det til 30 lokalt brug beregnede bærestof, således at der fremkommer zinktoner til kompleksdannelse eller chelatdannelse med de farmakologisk aktive stoffer, der er tilstede i bærestoffet. Eksempler på velegnede zinkholdige forbindelser er zinkhalo genid, zinksulfat, zinknitrat, zinkacetat og/eller zinkstearat. Den mest foretrukne zinkholdige forbindelse er zinkchlorid.The zinc-containing compounds of this invention are generally any water-soluble, organic or inorganic zinc salt that dissociates in the carrier for use locally to produce zinc tones for complexing or chelating with the pharmacologically active substances present in carrier. Examples of suitable zinc containing compounds are zinc halide, zinc sulphate, zinc nitrate, zinc acetate and / or zinc stearate. The most preferred zinc containing compound is zinc chloride.

35 4 DK 173490 B1 Sådanne vandopløselige zinkholdige forbindelser kan fremstilles ved metoder, der er kendt inden for.faget, og mange er kommercielt tilgængelige.Such water-soluble zinc-containing compounds can be prepared by methods known in the art, and many are commercially available.

Præparaterne til lokalt brug med forøgede reservoirdannende egenskaber ifølge 5 denne opfindelse kan fremstilles ved at blande en vandopløselig, zinkholdig forbindelse i det farmaceutiske præparat eller bærestof, hvori en reservoirdannende egenskab ønskes frembragt ved hjælp af midler der er kendt inden for faget for at fremme kompleksdannelse eller chelatdannelse med de farmakologisk aktive stoffer deri med zinkioner. Tilstedeværelsen af andre metalioner, der på u-10 gunstig måde ville konkurrere med zink om bindingsstederne til kompleksdannelse eller chelatdannelse, bør undgås. Zinksaltet kan også blandes med det phamakologisk aktive stof under dannelse af et chelat eller et kompleks, som derefter blandes i det farmaceutiske bærestof.The topical compositions for enhanced use of reservoir forming properties of this invention can be prepared by mixing a water-soluble, zinc-containing compound in the pharmaceutical composition or carrier wherein a reservoir forming property is desired by means known in the art to promote complex formation or chelating with the pharmacologically active substances therein with zinc ions. The presence of other metal ions that would favorably compete with zinc for the complex or chelate binding sites should be avoided. The zinc salt can also be mixed with the pharmacologically active substance to form a chelate or complex, which is then mixed in the pharmaceutical carrier.

15 De zinkholdige forbindelser er fortrinsvis tilstede i et forhold equimofært med de farmakologisk aktive stoffer for at bevirke maksimal kompleksdannelse eller chelatdannelse. Hvor ødelæggelse af stratum comeum, d.v.s afhoming, ønskes, kan der benyttes et overskud af sådanne zinkholdige forbindelser, der også virker som ætsmidler, for eksempel zinkchlorid. (/Umindeligvis vil zinkchtorid-20 koncentrationer på 35% (0,257 mol pr. 100 g) eller mere forårsage vævsødelæggelse ved lokal anvendelse.) Normalt vil brug af equimolære koncentrationer af zinkchlorid og det farmakologisk aktive stof ikke indebære brugen af ætsende mængder af zinkchlorid, imidlertid bør mindre end 35% zinkchlorid betragtes som en øvre grænse, når ingen ætsvirkning ønskes..Mindre end equimolært forhold af 25 zinkholdig forbindelse i forhold til farmakologisk aktivt stof kan anvendes, når det ikke ønskes, at alt medikamentet skal absorberes i huden eller slimhinderne, for eksempel i forbindelse med mundskyinings- og udskylningspræparater, hvor angreb på fritsvømmende organismer også ønskes.Preferably, the zinc-containing compounds are present in a relationship equal to that of the pharmacologically active substances to effect maximum complexation or chelation. Where destruction of the stratum coma, i.e., dehumidification, is desired, an excess of such zinc containing compounds may also be used which also act as corrosive agents, for example zinc chloride. (/ Usually, zinc chloride 20 concentrations of 35% (0.257 mol per 100 g) or more will cause tissue destruction by local application.) Normally, use of equimolar zinc chloride and pharmacologically active substances will not involve the use of corrosive zinc chloride, however, less than 35% zinc chloride should be considered an upper limit when no etching effect is desired. Less than an equimolar ratio of 25 zinc containing compound to pharmacologically active substance may be used when it is not desired that all the drug be absorbed into the skin or mucous membranes. , for example, in the case of mouthwash and rinse preparations, where attacks on free-flowing organisms are also desired.

30 Andre ingredienser kan sættes til præparaterne inklusive farvestoffer, stabilitetsforbedrende stoffer, antioxidanter og lignende. Fortrinsvis konkurrerer disse tilsætningsstoffer ikke med det farmakologisk aktive stof om zinken, når det imidlertid er nødvendigt, kan overskud af zinkholdig forbindelse bruges for at kompensere for den zinkkompleksdannende eller chelerende effekt hos sådanne 35 additiver.Other ingredients may be added to the formulations including dyes, stability enhancers, antioxidants and the like. Preferably, these additives do not compete with the pharmacologically active substance for zinc, however, when needed, excess zinc containing compound can be used to offset the zinc complexing or chelating effect of such additives.

5 DK 173490 B15 DK 173490 B1

De farmakologisk aktive stoffer ifølge denne opfindelse er sådanne, der er beregnet til lokal påføring for at opnå lokaliseret terapeutisk eller kosmetisk virkning.The pharmacologically active substances of this invention are those intended for topical application to achieve localized therapeutic or cosmetic effect.

5 Mekanismen, hvorved den reservoirdannende virkning ifølge denne opfindelse fremkommer, kendes ikke; imidlertid foretrækkes det, at de farmakologiske stoffer indeholder hydro xy, oxo, sulfydryl, amin, carboxyl eller andre anioniske grupper eller kombinationer deraf i konformationer, som muliggør kompleksdannelse og/eller chelatdannelse med zinkioner.The mechanism by which the reservoir-forming effect of this invention is obtained is unknown; however, it is preferred that the pharmacological substances contain hydroxy, oxo, sulfydryl, amine, carboxyl or other anionic groups or combinations thereof in conformations which allow complexation and / or chelating with zinc ions.

1010

Farmakologisk aktive stoffer ifølge opfindelsen enPharmacologically active substances according to the invention

De antineoplastiske stoffer NDGA (nordihydroguaiaretsyre), VP-16 (epipodo-phyllotoxin-beta-D-ethyliden glucopyranosid-etoposid), VM-26 (epipodophyilotoxin-beta-D-thenyliden glucopyranosid-teniposid), 4’-demethylepipodophyllotoxin1 di-15 ethylstilbøstrol, dithranol, cyclophosphamid, mitomycin, daunomycin, cis-diamin- dichlorplatin, adriamycin, allopurinol, 5-fluoruracil og methotrexat.The antineoplastic agents NDGA (Northern Hydroguaretic Acid), VP-16 (epipodophyllophoxin-beta-D-ethylidene glucopyranoside-etoposide), VM-26 (epipodophyilotoxin-beta-D-thenylidene glucopyranoside-teniposide), 4'-demethylpyxyl-diphylpiperidylpiperidine , dithranol, cyclophosphamide, mitomycin, daunomycin, cis-diaminodichloroplatin, adriamycin, allopurinol, 5-fluorouracil and methotrexate.

Dispenseringsformer for lokal anvendelse kan omfatte lotioner, salver, cremer, geler, suppositorier, næsedråber, mundskyllemidler, sprøjtevæsker, aerosoler og 20 lignende. Typiske bærestoffer, der udgør de foregående dispenseringsformer omfatter vand, acetone, isopropylaikohol, stearylalkohol, freoner, ethylalkohol, polyvinylpyrrolidon, propylenglycol, polyethylenglycol, duftstoffer, geldannende stoffer, mineralolie, stearinsyre. spermacet, sorbitan, monoleat, polysorbater, "Tweens", sorbitol, methylcellulose, etc. r 25 Mængden af formuleringen, og således af det farmakologisk aktive stof, der skal administreres deri, vil naturligvis være en effektiv mængde til opnåelse af det ønskede resultat, der ventes deraf. Dette vil naturligvis blive fastslå et af den praktiserende læge ved hjælp af hans almindelige viden. Efter almindelig god 30 formuleringspraksis anvendes indledningsvis en dosering i den lave ende af det brugbare interval for et bestemt stof, og doseringen forøges, som den iagttagede virkning viser behov for.Dispensing forms for topical use may include lotions, ointments, creams, gels, suppositories, nasal drops, mouthwashes, sprays, aerosols and the like. Typical carriers constituting the foregoing dispensing forms include water, acetone, isopropyl alcohol, stearyl alcohol, freons, ethyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, propylene glycol, polyethylene glycol, fragrances, gelling agents, mineral oil, stearic acid. spermacet, sorbitan, monoleate, polysorbates, "Tweens", sorbitol, methylcellulose, etc. r The amount of the formulation, and thus of the pharmacologically active substance to be administered therein, will of course be an effective amount to achieve the desired result. that is expected. This will, of course, be ascertained by one of the practitioners by means of his ordinary knowledge. Following generally good formulation practice, initially a dosage is used at the low end of the usable range for a particular substance, and the dosage is increased as the observed effect shows need.

6 DK 173490 B16 DK 173490 B1

Foretrukne formuleringer illustreres i de følgende eksempien EKSEMPEL 1Preferred formulations are illustrated in the following Example EXAMPLE 1

5 ANTINEOPLASTISKE PRÆPARATER5 ANTINEOPLASTIC PREPARATIONS

To formuleringer indeholdende zinkchlorid, nordihydroguaiaretsyre (NDGA), syre (EDTA), butylhydroxytolulen (BHT), stearylalkohol, renset vand, polyethylenglycol med en gennemsnitlig molekylvægt på 400 (PEGO 400), og polyethylengiycol 10 med en gennemsnitlig molekylvægt på 3350 (PEGO 3350) blev fremstillet på følgende måde: det rensede vand blev anbragt i en ren glasbeholder af passende størrelse. Vandet blev opvarmet til omkring 80-90°C under omrøring og zinkchloridet blev sat til det opvarmede vand, idet omrøringen blev fortsat indtil zinkchloridet gik i opløsning. Ethylendiamintetraeddikesyre blev derefter langsomt 15 tilsat under omrøring indtil den var opløst. I en anden glasbeholder af passende størrelse blev polyethylenglycol 400 opvarmet til omkring 80-90°C under omrøring.Two formulations containing zinc chloride, nordihydroguaiaretic acid (NDGA), acid (EDTA), butyl hydroxytolule (BHT), stearyl alcohol, purified water, polyethylene glycol having an average molecular weight of 400 (PEGO 400), and polyethylene glycol 10 with an average molecular weight of 3350 (3350) was prepared as follows: the purified water was placed in a clean glass container of appropriate size. The water was heated to about 80-90 ° C with stirring and the zinc chloride was added to the heated water, stirring continued until the zinc chloride dissolved. Ethylenediaminetetraacetic acid was then slowly added with stirring until dissolved. In another glass container of appropriate size, polyethylene glycol 400 was heated to about 80-90 ° C with stirring.

NDGA blev tilsat, og derefter BHT, og denne blanding blev sat til zinkchlorid-ethylendiamintetraeddikesyreopløsningen under omrøring. Hele blandingen blev så afkølet til omkring stuetemperatur og kørt gennem en valsemølle nummer 3 20 indtil den var jævn. Polyethylenglycol 3350 blev så opvarmet til omkring 80-90°C i en passende beholder og de møllede ingredienser blev tilsat under blanding.NDGA was added, and then BHT, and this mixture was added to the zinc chloride-ethylenediaminetetraacetic acid solution with stirring. The whole mixture was then cooled to about room temperature and run through a rolling mill number 3 20 until smooth. Polyethylene glycol 3350 was then heated to about 80-90 ° C in a suitable container and the milled ingredients added with mixing.

Den endelige sammensætning i vægt/vægt% varsom følgen TABEL 1 -* 25 _Blanding_The final composition in w / w% due to the sequence TABLE 1 - * 25

Sammensætning_A_B_Sammensætning_A_B_

Zinkchlorid 29,8 10,0 NDGA 4,6 4,6 EDTA 14,7 4,93 BHT 1,1 1,1Zinc chloride 29.8 10.0 NDGA 4.6 4.6 EDTA 14.7 4.93 BHT 1.1 1.1

Stearylalkohol 0,5 0,5 H20 18,3 18,3 PEGO 400 26,4 26,4 PEGO 3350 4,5 4,5 EKSEMPEL 2 7 DK 173490 B1Stearyl alcohol 0.5 0.5 H2 O 18.3 18.3 PEGO 400 26.4 26.4 PEGO 3350 4.5 4.5 EXAMPLE 2 7 DK 173490 B1

RESERVOIRVIRKNINGRESERVOIR EFFECT

5 Denne undersøgelse blev planlagt for at tilvejebringe grundlæggende farmakokinetiske data om, hvad der sker med carbon 14 (14C) mærket nordihydroguaiaretsyre (NDGA), der påføres huden i de modificerede blandinger A og B, der beskrives i eksempel 1. Desuden blev fordelingen af zink målt for den dermalt påførte blanding A.This study was planned to provide basic pharmacokinetic data on what happens to carbon 14 (14C) labeled nordihydroguaretic acid (NDGA) applied to the skin in the modified blends A and B described in Example 1. In addition, the distribution of zinc measured for the dermally applied mixture A.

10 14C-NDGA forbindelsen havde en specifik radioaktivitet på 20,2 Ci/mol (66,9 pCi/mg) og en renhed på 96,9% ifølge massespektrometri og ved radioautografi af tyndtlagsplader udviklet i benzen:isopropanol:eddikesyre:vand (25:5:2:10).The 14C-NDGA compound had a specific radioactivity of 20.2 Ci / mol (66.9 pCi / mg) and a purity of 96.9% by mass spectrometry and by radioautography of thin-layer plates developed in benzene: isopropanol: acetic acid: water (25 : 5: 2: 10).

15 Herefter blev 25,1 mg af 14C-NDGA forbindelsen (66,9 pCi/mg) blandet med 12,35 g af blanding A. Tredobbelte analyser af slutblandingen for 14C ved tælling og for NDGA ved højttryksvæskechromatografi (HPLC) viste homogenitet med et indhold på 51 pg af 14C-NDGA-forbindelse/mg af blanding A. Den specifikke radioaktivitet for NDGA var 3,00 x 103 pCi/pg.Thereafter, 25.1 mg of the 14C-NDGA compound (66.9 µCi / mg) was mixed with 12.35 g of mixture A. Triple analyzes of the final mixture for 14C by counting and for NDGA by high pressure liquid chromatography (HPLC) showed homogeneity with a content of 51 µg of 14C-NDGA compound / mg of mixture A. The specific radioactivity for NDGA was 3.00 x 103 µCi / µg.

2020

Tilsvarende blev 26,3 mg af den originale 14C-NDGA-blanding (66,9 pCi/mg) blandet med 12,55 g af blanding A uden Zn og EDTA for at få en blanding til undersøgelsen af den dermale indtrængning af NDGA fra blanding A uden Zn og EDTA. Analyser af tredobbelte prøver af den modificerede blanding A viste, at 25 slutblandingen var homogen med hensyn til 14C og NDGA. Den indeholdt 53 pg 14C-NDGA-forbindelse/mg bærestof. Den specifikke radioaktivitet af det fortyndede NDGA var 3,41 x 10"3 pCi/pg.Similarly, 26.3 mg of the original 14C NDGA mixture (66.9 µCi / mg) was mixed with 12.55 g of mixture A without Zn and EDTA to obtain a mixture for the study of the dermal penetration of NDGA from mixture A without Zn and EDTA. Analyzes of triple samples of the modified mixture A showed that the final mixture was homogeneous with respect to 14C and NDGA. It contained 53 µg of 14C-NDGA compound / mg of carrier. The specific radioactivity of the diluted NDGA was 3.41 x 10 "3 pCi / pg.

Blandingerne blev anbragt på huden af unge voksne Sprague- Dawiey rotter efter 30 følgende protokol: under etheranæsthesi blev rygskindet af rotten forberedt ved at fjerne hårene fra et 5 x 5 cm område med en klippemaskine og de tilbageværende hårstubbe blev fjernet ved hjælp af en depileringsvoks. Huden blev så trukket af gentagne gange (5x) med selvklæbende tape indtil stratum comeum var fjernet.The blends were applied to the skin of young adult Sprague-Dawiey rats following the following protocol: under ether anesthesia, the rat's back skin was prepared by removing the hairs from a 5 x 5 cm area with a mower and the remaining hair stumps were removed using a depilatory wax. The skin was then pulled off repeatedly (5x) with adhesive tape until the stratum comeum was removed.

Så blev 0,5 g af formuleringen afvejet på et stykke polypropylenfolie på 5 x 5 cm, 35 som blev anbragt på huden. Det blev holdt på plads ved hjælp af hypoallergen tape. Til sidst blev bandagen viklet ind i plaster. Efter behandling blev rotterne sat i 8 DK 173490 B1 bur hver for sig i metabolismebure, der gav fri adgang til foder og vand og var indrettet til separat opsamling af urin og fæces.Then, 0.5 g of the formulation was weighed on a 5 x 5 cm polypropylene film 35 applied to the skin. It was held in place using hypoallergenic tape. Eventually, the bandage was wrapped in patch. After treatment, the rats were placed separately in metabolism cages that provided free access to feed and water and were designed for separate collection of urine and faeces.

Undersøgelsen af blanding A med 14C-NDGA blev udført på 15 Sprague-Dawley 5 han-rotter (middelvægt 339 ± 16 g). De fik i gennemsnit 0,520 (± 0,032) g af blanding A indeholdende 14C-NDGA. Middeldosis af 14C-NDGA var 78,5 (± 7,0) mg/kg legemsvægt. Rotterne blev opstaldet individuelt i metabolismebure, der gav fri adgang til foder og vand og var indrettet til separat opsamling af urin og fæces. Grupper å tre rotter blev aflivet efter 4, 24, 48, 72 og 96 timer og ekskreta blev 10 opsamlet fra hver rotte i perioder af 24 timer. I tilgift til den sædvanlige udtagning af vævsprøver, blev huden fra appllcationsstedet skåret ud efter aftøring af stedet med vandfugtede renseservietter. Materialet fra aftørringerne blev føjet til bandagerne, som blev neddyppet i en lille beholder med acetone.The study of mixture A with 14C-NDGA was performed on 15 male Sprague-Dawley 5 rats (mean weight 339 ± 16 g). On average, they received 0.520 (± 0.032) g of mixture A containing 14C-NDGA. The mean dose of 14C-NDGA was 78.5 (± 7.0) mg / kg body weight. The rats were housed individually in metabolism cages which provided free access to feed and water and were arranged for separate collection of urine and faeces. Groups of three rats were sacrificed after 4, 24, 48, 72 and 96 hours and excreta was collected from each rat for 24 hours. In addition to the usual tissue sampling, the skin from the application site was excised after wiping the site with water-moistened wipes. The wipe material was added to the dressings, which were immersed in a small container of acetone.

15 Undersøgelsen af blanding A uden zink og EDTA blev udført på 15 Sprague-Dawley han-rotter (middelvægt 241 ± 7 g). De fik i gennemsnit 0,390 (± 0,019) g zinkfri C205 indeholdende 14C-NDGA. Gennemsnitsdosis af 14C-NDGA var 83,2 mg/kg legemsvægt. Grupper å tre rotter blev aflivet ved forblødning og vævsprøver blev taget 4, 24, 48, 72 og 96 timer efter doseringen. På hvert 20 aflivningstidspunkt blev der også fra de rotter, som det var planlagt at aflive næste gang, taget blodprøver fra sinus orbitaiis på en sådan måde, at de ikke døde af det. Bandagerne og renseservietterne fra aftørring af hudområdet på aflivningstidspunktet blev taget fra og lagt i acetone, som beskrevet ovenfor.The study of mixture A without zinc and EDTA was performed on 15 male Sprague-Dawley rats (mean weight 241 ± 7 g). They obtained an average of 0.390 (± 0.019) g of zinc-free C205 containing 14C-NDGA. The average dose of 14C-NDGA was 83.2 mg / kg body weight. Groups of three rats were sacrificed by bleeding and tissue samples were taken 4, 24, 48, 72 and 96 hours after dosing. At every time of killing, from the rats that were scheduled to be killed next time, blood samples were taken from sinus orbitaiis in such a way that they did not die from it. The dressings and cleansing wipes from wiping the skin area at the time of killing were removed and placed in acetone, as described above.

25 Resultaterne af undersøgelserne er anført i tabel 2A for blanding A med indhold af 14C-NDGA og tabel 2B for Zn-fri blanding A med indhold af 14C-NDGA. Analyseresultaterne for vævsfordelingen af zink som procent af dosis I rotter doseret med blanding A med indhold af 14C-NDGA er anført i tabel 2C.The results of the studies are listed in Table 2A for mixture A containing 14C-NDGA and Table 2B for Zn-free mixture A containing 14C-NDGA. The assay results for the tissue distribution of zinc as a percentage of dose I in rats dosed with mixture A containing 14C-NDGA are listed in Table 2C.

TABEL2ATABEL2A

g DK 173490 B1 Vævsfordeling af 14C som procent af dosis i rotter doseret dermalt med blanding A med indhold af 14C-NDGA.g DK 173490 B1 Tissue distribution of 14C as a percentage of dose in rats dosed dermally with mixture A containing 14C-NDGA.

5 _Middel (±S.D) * procent af dosis af 14C fundet efter (timer) Væv_4_ 24_48_72_965 _ Mean (± S.D) * percent of dose of 14C found after (hours) Tissue_4_ 24_48_72_96

Organer 4,62 7,55 10,29 10,43 13,45 (%) (±2,27) (±1,85) (±8,8) (±6,94) (±3,45)Organs 4.62 7.55 10.29 10.43 13.45 (%) (± 2.27) (± 1.85) (± 8.8) (± 6.94) (± 3.45)

Hudområde 20,8 19,6 11,1 8,58 7,01 (%) (±8,4) (±5,2) (±1,4) (±5,41) (±2,28)Skin range 20.8 19.6 11.1 8.58 7.01 (%) (± 8.4) (± 5.2) (± 1.4) (± 5.41) (± 2.28)

*N = 3 TABEL2B* N = 3 TABLE 2B

Vævsfordeling af 14C som procent af dosis i rotter doseret dermalt med Zn-fri 10 blanding A med indhold af 14C-NDGA.Tissue distribution of 14C as a percentage of dose in rats dosed dermally with Zn-free 10 mixture A containing 14C-NDGA.

_Middel (±S.D) * procent af dosis af UC fundet efter (timer) Væv_4_24_48 72_96Mean (± S.D) * Percent of dose of UC found after (hours) Tissue_4_24_48 72_96

Organer 10.28 11,08 10,47 5,41 8,03 (%) (±6,12) (±9,65) (±10,33) (±4,21) (±1,48)Organs 10.28 11.08 10.47 5.41 8.03 (%) (± 6.12) (± 9.65) (± 10.33) (± 4.21) (± 1.48)

Hudområde 4,15 12,20 7.86 4,72 1.43 (%) (±0,76) (±5,9) (±3,75) (±3,18) (±0,55) *N = 3Skin area 4.15 12.20 7.86 4.72 1.43 (%) (± 0.76) (± 5.9) (± 3.75) (± 3.18) (± 0.55) * N = 3

TABEL 2CTABLE 2C

10 DK 173490 B1 Vævsfordeling af Zn som procent åf dosis i rotter doseret dermalt med blanding A.10 DK 173490 B1 Tissue distribution of Zn as a percentage of dose in rats dosed dermally with mixture A.

Middel (±S,P) * procent af dosis af 14C fundet efter (timer) Væv_4_24_48_72_96Mean (± S, P) * percent of dose of 14C found after (hours) Tissue_4_24_48_72_96

Organer (%) 3,28 6,54 6,79 11,47 12,69Organs (%) 3.28 6.54 6.79 11.47 12.69

Hudområde 10,5 11,8 9,58 6,46 4,99 (%) *N = 3 5Skin range 10.5 11.8 9.58 6.46 4.99 (%) * N = 3.5

Undersøgelsen blev fortsat for at prøve Blanding B med 14C- NDGA, Zn- og EDTA-fri blanding B; og modificeret blanding B uden BHT og 0,10 EDTA. Den følgende tabel 2D viser sammensætningerne af blandingerne og mængderne af stoffer brugt til fremstilling af blandinger indeholdende 14C-NDGA. Disse 10 blandinger blev analyseret for 14C ved scintillationtælling og for NDGA ved væskechromatografi.The study was continued to test Mixture B with 14C-NDGA, Zn- and EDTA-free Mixture B; and modified blend B without BHT and 0.10 EDTA. The following Table 2D shows the compositions of the mixtures and amounts of substances used to prepare mixtures containing 14C-NDGA. These 10 mixtures were analyzed for 14C by scintillation counting and for NDGA by liquid chromatography.

TABEL 2DTABLE 2D

u DK 173490 B1 __Sammensætning (%)_u DK 173490 B1 __ Composition (%) _

Modificeretmodified

Blanding B Zn-fri Blanding B Blanding BMixture B Zn-free Mixture B Mixture B

Bestanddel_Formulering_Formulering_FormuleringBestanddel_Formulering_Formulering_Formulering

Forbindelse, Zn 10,00 0,00 10,00Compound, Zn 10.00 0.00 10.00

Forbindelse, EDTA 4,93 0,00 0,10Compound, EDTA 4.93 0.00 0.10

Forbindelse, NDGA 4,60 4,60 4,60Connection, NDGA 4.60 4.60 4.60

Forbindelse, BHT 1,10 ; 1,10 0,00Compound, BHT 1.10; 1.10 0.00

Vand, renset 18,32 18,32 19,42 PEG 400 2,60 14,50 14,19 PEG 8000 53,45 49,39 46,69Water, purified 18.32 18.32 19.42 PEG 400 2.60 14.50 14.19 PEG 8000 53.45 49.39 46.69

Stearylalkohol_5,00_;_12,09_5,00_ 100% 100% 100%Stearyl alcohol_5.00 _; _ 12.09_5.00_ 100% 100% 100%

Blandinger Indeholdende 14C-NDGA:Mixtures Containing 14C-NDGA:

Mg 14C-NDGA 25,75 25,40 25,20 g Formulering 12,55 12,55 12,75 % NDGA i slutblandingen 4,80 4,79 4,78 5Mg 14C-NDGA 25.75 25.40 25.20 g Formulation 12.55 12.55 12.75% NDGA in the final mixture 4.80 4.79 4.78 5

Rotternes middelvægt, den gennemsnitlige dosis af formuleringerne og middeldosis af 14C-NDGA i mg/kg legemsvægt for de tre nærværende protokoller van 297 ± 15 g (standard afvigelse), 512 ± 28 mg, og 82,7 ± 2,0 mg/kg for blanding B; 325 ± 12 g, 570 ± 26 mg, og 84,0 ±1,4 mg/kg for Zn-fri blanding B; og 10 328 ± 27 g, 575 ± 45 mg, og 84,2 ± 2,8 mg/kg for modificeret blanding B. Der blev benyttet 15 rotter til hver undersøgelse og grupper å tre rotter blev aflivet efter 4, 24,48,48, 72 og 96 timer efter dosering. Hver gang blev blod, lever, hudområde, tarme med indhold, kroppen og bandager samt renseservietter fra aftørringen isoleret. Fra grupperne, der blev aflivet efter 24, 48, 72 og 96 timer blev urin, 15 fæces og vaskevand fra burene også isoleretThe average weight of the rats, the mean dose of the formulations and the mean dose of 14C-NDGA in mg / kg body weight for the three present protocols of 297 ± 15 g (standard deviation), 512 ± 28 mg, and 82.7 ± 2.0 mg / kg for mixture B; 325 ± 12 g, 570 ± 26 mg, and 84.0 ± 1.4 mg / kg for Zn-free mixture B; and 10 328 ± 27 g, 575 ± 45 mg, and 84.2 ± 2.8 mg / kg for modified blend B. 15 rats were used for each study and three rats were sacrificed after 4, 24.48, 48, 72 and 96 hours after dosing. Each time, blood, liver, skin area, intestines with contents, body and bandages as well as wipes from the wipe were isolated. From the groups sacrificed after 24, 48, 72 and 96 hours, urine, 15 faeces and wash water from the cages were also isolated

Resultaterne af undersøgelserne er vist i tabel 2E for blanding B, tabel 2F for Zn-fri blanding B og tabel 2G for modificeret blanding B.The results of the studies are shown in Table 2E for mixture B, table 2F for Zn-free mixture B and table 2G for modified mixture B.

2020

TABEL2ETABEL2E

12 DK 173490 B1 * ·** Vævsfordeling af 14C som procent af dosis i rotter doseret dermalt med blanding B med Indhold af 14C-NDGA.12 DK 173490 B1 * · ** Tissue distribution of 14C as a percentage of dose in rats dosed dermally with mixture B with content of 14C-NDGA.

SS

_Middel (±S.D) * procent af dosis af 14C fundet efter (timer) Væv_4 24_48_72_96Mean (± S.D) * Percent of dose of 14C found after (hours) Tissue_4 24_48_72_96

Organer 1,92 4,41 4,31 3,38 1,87 (%) (±1,34) (±1,44) (±2,5) (±0,52) (±1,1)Organs 1.92 4.41 4.31 3.38 1.87 (%) (± 1.34) (± 1.44) (± 2.5) (± 0.52) (± 1.1)

Hudområde 16,3 11,9 8,92 6,55 5,11 (%) (±9,2) (±6,1) (±4,10) (±1,76) (±3,01)Skin range 16.3 11.9 8.92 6.55 5.11 (%) (± 9.2) (± 6.1) (± 4.10) (± 1.76) (± 3.01)

*N = 3 TABEL2F* N = 3 TABLE 2F

Vævsfordeling af 14C som procent af dosis i rotter doseret dermalt med Zn-fri 10 blanding B med indhold af 14C-NDGA.Tissue distribution of 14C as a percentage of dose in rats dosed dermally with Zn-free mixture B containing 14C-NDGA.

Middel (±S.D) * procent af dosis af 14C fundet efter (timer) Væv_4_24_48_72_96Mean (± S.D) * percent of dose of 14C found after (hours) Tissue_4_24_48_72_96

Organer 1,16 2,29 2,38 7,39 7,73 (%) (±0,92) (±2,26) (±1,73) (±10,05) (±10,9)Organs 1.16 2.29 2.38 7.39 7.73 (%) (± 0.92) (± 2.26) (± 1.73) (± 10.05) (± 10.9)

Hudområde 2,21 4,45 6,07 18,6 12,0 (%) (±1,44) (±4,36) (±2,90) (±6,3) (±4,99) *N = 3Skin range 2.21 4.45 6.07 18.6 12.0 (%) (± 1.44) (± 4.36) (± 2.90) (± 6.3) (± 4.99) * N = 3

TABEL2GTABEL2G

13 DK 173490 B1 Vævsfordeling af 14C som procent af dosis i rotter doseret dermalt med modificeret blanding B med indhold af 14C-NDGA.13 DK 173490 B1 Tissue distribution of 14C as a percentage of dose in rats dosed dermally with modified mixture B containing 14C-NDGA.

55

Organer 4,35 1,65 4,41 2,54 0,97 (%) (+3,06) (±0,68) (±3,57) (±2,05) (±0,19)Organs 4.35 1.65 4.41 2.54 0.97 (%) (+3.06) (± 0.68) (± 3.57) (± 2.05) (± 0.19)

Hudområde 14,4 23,0 17,1 16,3 17,7 (%) (±7,1) (±5,5) (±4,7) . (±0,6) (±6,2) *N = 3Skin range 14.4 23.0 17.1 16.3 17.7 (%) (± 7.1) (± 5.5) (± 4.7). (± 0.6) (± 6.2) * N = 3

De ovenstående resultater viser at tilsætningen af den vandopløselige zinkholdige forbindelse får det organiske molekyle til at absorberes hurtigere I huden i større mængder og til at blive tilbageholdt i huden længere end når den zinkholdige 10 forbindelse ikke er tilstede.The above results show that the addition of the water-soluble zinc-containing compound causes the organic molecule to be absorbed faster into the skin in greater amounts and to be retained in the skin longer than when the zinc-containing compound is not present.

EKSEMPEL 3EXAMPLE 3

FORØGELSE AF ANTINEOPLASTISK VIRKNINGINCREASE OF ANTINEOPLASTIC EFFECT

1515

Af de i listen anførte organiske forbindelser blev der af de forbindelser der har to eller flere benzenringe brugt 0,0145 mol pr. 100 cm3, og af dem, der har en eller ingen benzenringe, blev der brugt 0,029 mol pr. 100 cm3. Den organiske forbindelse blev afmålt i et rent hætteglas og PEGO 400 blev tilsat under omrøring 20 indtil den gik i opløsning.Of the organic compounds listed, of the compounds having two or more benzene rings, 0.0145 moles per mole was used. 100 cm3, and of those having one or no benzene rings, 0.029 mol. 100 cm3. The organic compound was measured in a clean vial and PEGO 400 was added with stirring 20 until dissolved.

Til de testblandinger, der indeholdt zinkchlorid, blev zinkchlorid først opløst i PEGO 400 til fremstilling afen stamopløsning, der indeholdt 0,69 % zinkchlorid, og denne opløsning blev tilsat under omrøring til de hætteglas, der indeholdt de 25 organiske forbindelser, der var under afprøvning.For the test mixtures containing zinc chloride, zinc chloride was first dissolved in PEGO 400 to prepare a stock solution containing 0.69% zinc chloride and this solution was added with stirring to the vials containing the 25 organic compounds under test. .

Disse forbindelser blev undersøgt med og uden zinkchlorid og deres effektivitet som antitumormidler over for heterotransplantater af human brystadenocarcinom.These compounds were studied with and without zinc chloride and their efficacy as antitumor agents against human breast adenocarcinoma heterologous grafts.

14 DK 173490 B1 MX-1, dyrket i thymusløse (nøgne) mus med Balb/c afstamning ved intratumoral injektion efter den følgende protokol: hvert dyr blev podet intradermalt på ryggen nærved nakken med 0,05 ml af et MX-1 tumorhomogenat Vægten af tumorerne i mg blev beregnet ud fra måling af længden, bredden og højden i mm af tumorerne 5 ved hjælp af formlen (LxBx H)/2. Dyrene blev randomiseret i grupper for at sikre fordelingen af mindre og større tumorer. Tumorerne bfev behandlet ved intratumoral injektion af 0,05 ml af hver testblanding. Hver blanding blev undersøgt på fem dyr. Dyrene blev kun behandlet én gang. Resultaterne er vist i tabel 3.14 DK 173490 B1 MX-1, cultured in thymus (nude) mice with Balb / c lineage by intratumoral injection following the following protocol: each animal was grafted intradermally on the back near the neck with 0.05 ml of an MX-1 tumor homogenate. The tumors in mg were calculated from the measurement of the length, width and height in mm of the tumors 5 by the formula (LxWx H) / 2. The animals were randomized into groups to ensure the distribution of smaller and larger tumors. The tumors were treated by intratumoral injection of 0.05 ml of each test mixture. Each mixture was examined on five animals. The animals were treated only once. The results are shown in Table 3.

10 TABEL3TABLE 3

Organisk forbindelse Tumorfri For tidligt Tumor ved TumorOrganic compound Tumor-free Premature Tumor by Tumor

Forbindelse kendt Anti- 60 dage døde død tilbagefald cancermiddel _ VP-16 Zn-fri 2 2 3 0 VP-16+ Zn 5 0 0 0 ‘1/5 VP-16+ Zn 3 0 2 2 VM-26 Zn-fri 0 0 5 0 VM-26 + Zn 5 0 0 0 * 1/5 VM-26 + Zn 5 0 0 0 4'-demethylepipodophyilo- 10 4 3 toxin Zn-fri 4’-demethylepipodophyllo- 5 0 0 0 toxin+ ZnCompound known Anti-60 days dead recurrence cancer agent _ VP-16 Zn-free 2 2 3 0 VP-16 + Zn 5 0 0 0 '1/5 VP-16 + Zn 3 0 2 2 VM-26 Zn-free 0 0 5 0 VM-26 + Zn 5 0 0 0 * 1/5 VM-26 + Zn 5 0 0 0 4'-demethylpipodophyilo-10 4 3 toxin Zn-free 4'-demethylpipodophyllo-5 0 0 0 toxin + Zn

Diethylstilbøstrol Zn-fri 0 2 5 0Diethylstilbøstrol Zn-free 0 2 5 0

Diethylstilbøstrol + Zn 3 0 2 1Diethylstilbøstrol + Zn 3 0 2 1

Dithrano! Zn-fri 10 4 0Dithrano! Zn-free 10 4 0

Dithranol + Zn 4 Ότ 1 1Dithranol + Zn 4 Ότ 1 1

Cyclophosphamid Zn-fri 0 0 5 0Cyclophosphamide Zn-free 0 0 5 0

Cydophosphamid + Zn 3 2 0 0Cydophosphamide + Zn 3 2 0 0

Mitomycin Zn-fri 14 2 0Mitomycin Zn-free 14 2 0

Mitomycin+Zn 5 0 0 0Mitomycin + Zn 5 0 0 0

Daunomycin Zn-fri 3 2 5 3Daunomycin Zn-free 3 2 5 3

Daunomycln Zn 5 0 0 0 TABEL 3 (fortsat) 15 DK 173490 B1Daunomycline Zn 5 0 0 0 TABLE 3 (continued) 15 DK 173490 B1

Organisk forbindelse Tumor fri Fortidligt Tumor ved TumorOrganic compound Tumor free Premature Tumor by Tumor

Forbindelse kendt Anti- 60 dage døde død tilbagefald cancermiddel________Compound known Anti-60 days dead recurrence cancer agent________

Cisdiamindichloridplatin Zn- 1 0 4 0 friCisdiamine dichloride platinum Zn- 1 0 4 0 free

Cisdiamindichloridplatin + Zn 5 0 0 0Cisdiamine dichloride platinum + Zn 5 0 0 0

Adriamycin Zn-fri 0 12 4 *1/10 Adriamycin Zn-fri 2 12 2Adriamycin Zn-free 0 12 4 * 1/10 Adriamycin Zn-free 2 12 2

Adriamycin + Zn 4 0 1 1 *1/10 Adriamycin + Zn 13 11Adriamycin + Zn 4 0 1 1 * 1/10 Adriamycin + Zn 13 11

Allopurino! Zn-fri** 0 - 5 *5/2 Allopurinol + Zn 0 0 5 0Allopurino! Zn-free ** 0 - 5 * 5/2 Allopurinol + Zn 0 0 5 0

Aliopurinol + Zn 10 4 4 *5/2 Allopurinol+ Zn 10 4 4 * Dosisniveau forhøjet eller sat ned som anført.Aliopurinol + Zn 10 4 4 * 5/2 Allopurinol + Zn 10 4 4 * Dose level increased or decreased as indicated.

5 ** Alle aflivet på dag 25.5 ** All killed on day 25.

Disse resultater viser den reducerede toksicitet og forøgede antineoplastiske virkning opnået ved tilsætning af zinkioner.These results show the reduced toxicity and increased antineoplastic effect obtained by the addition of zinc ions.

10 EKSEMPLERNE 4-9 POTENTIERING AF ANTINEOPLASTISKE MIDLER BEREGNET TIL LOKALT BRUG _ t 15 I eksemplerne 4-9, hvori der henvises til afprøvningen af blandinger for antitumoraktivitet mod B-16 melanom og Sarcom-180 fast tumorvækst i mus blev følgende fremgangsmåder benyttet. I den udstrækning at et bestemt eksempel modificerede fremgangsmåden, vil sådan modification blive anført ved det enkelte eksempel.EXAMPLES 4-9 POTENTIZATION OF ANTINEOPLASTIC AGENTS CALCULATED FOR LOCAL USE - t 15 In Examples 4-9, referring to the assay of antitumor activity mixtures against B-16 melanoma and Sarcom-180 solid tumor growth in mice, the following procedures were used. To the extent that a particular example modified the method, such modification will be cited by the individual example.

2020

Begge typer af tumorer blev dyrket intradermalt eller subcutant i musene. B-16 melanom blev dyrket i BDFi mus og S-180 tumoren blev dyrket i ICR mus. Hver mus blev injiceret intradermalt på et barberet område bag på musens hals med omkring 0,01 ml afen saltvandssuspension indeholdende omkring 1 x 10® celler af 25 tumorcedeme pr. 0,01 ml. Tumorerne fik lov til at vokse til de havde nået en 16 DK 173490 B1 * % omtrentlig størrelse på omkring 25-100 mg, beregnet ved at multiplicere længden af tumoren med -bredden og højden målt i mm og dividere produktet med 2. På den første behandlingsdag blev dyrene med tumorstørrelse uden for størrelsesintervallet sorteret fra og de resterende dyr blev tilfældigt delt i kontrol-5 og forsøgsgrupper. Når tumorerne havde nået en passende størrelse, sædvanligvis omkring dag 6, blev tumorerne punkteret ens, og derpå behandlet med enten en testblanding eder en kontrol ved lokal· påføring på overfladen af tumoren. Sædvanligvis blev der foretaget to lokale påføringer med 24 timers mellemrum. Stofferne blev påført således, at der opnåedes et lag på fra omkring 1 10 til omkring 2 mm over hele overfladen af tumoren. Dyrene blev derefter observeret og deres vægt og størrelsen af deres tumor blev målt periodisk.Both types of tumors were cultured intradermally or subcutaneously in the mice. B-16 melanoma was grown in BDFi mice and the S-180 tumor was grown in ICR mice. Each mouse was injected intradermally onto a shaved area at the back of the mouse neck with about 0.01 ml of saline suspension containing about 1 x 10 0.01 ml. The tumors were allowed to grow until they reached an approximate size of about 25-100 mg, calculated by multiplying the length of the tumor by the width and height measured in mm and dividing the product by 2. At the first On the day of treatment, the out-of-range tumor size animals were sorted and the remaining animals were randomly divided into control-5 and experimental groups. Once the tumors had reached an appropriate size, usually around day 6, the tumors were punctured similarly and then treated with either a test mixture or a control by local application to the surface of the tumor. Usually two local applications were made at 24 hour intervals. The fabrics were applied such that a layer of from about 10 to about 2 mm was obtained over the entire surface of the tumor. The animals were then observed and their weight and the size of their tumor measured periodically.

Resultaterne fra hvert af eksperimenterne omfatter følgende: (a) begyndelsesantallet (n) af dyr i hver behandlingsgruppe af et forsøg; 15 (b) den gennemsnitlige tumorstørrelse i mg på de dyr, der blev behandlet med blandingen og den gennemsnitlige tumorstørrelse for kontroldyrene; 20 (c) forholdet ganget med 100 af gennemsnitsstørrelsen af tumorerne hos de behandlede dyr i forhold til hos kontroldyrene (T/C), hvor T » gennemsnitsstørrelse af behandlede mus og C « gennemsnitstumorstørrelse hos kontroimus; 25 (d) procentdel af både behandlede og kontroldyr uden tumor; (e) procentdel af dyr af det oprindelige antal, der overlevede.The results from each of the experiments include the following: (a) the initial number (s) of animals in each treatment group of an experiment; (B) the average tumor size in mg of the animals treated with the mixture and the average tumor size of the control animals; (C) the ratio multiplied by 100 of the average size of the tumors in the treated animals relative to the control animals (T / C), where T is the "average size of treated mice and C" average tumor size in control mice; (D) percentage of both treated and control animals without tumor; (e) percentage of animals of the original number that survived.

De sidste tre målinger fra et bestemt eksperiment blev alle foretaget på samme tid 3° og varierer i almindelighed fra 21 til omkring 33 dage efter tumorpodning. En T/C værdi på 42 eller mindre viser aktivitet, i alle de følgende tabeller for eksemplerne 4-9 er kontrolresultaterne givet i parentes.The last three measurements from a particular experiment were all made at the same time 3 ° and generally range from 21 to about 33 days after tumor grafting. A T / C value of 42 or less shows activity, in all of the following tables for Examples 4-9 the control results are given in parentheses.

35 17 DK 173490 B1 EKSEMPEL 4EXAMPLE 4

Der blev fremstillet to meso-NDGA formuleringer med et PEGO grundlag. Deres sammensætninger er som vist i tabel 4.Two meso-NDGA formulations with a PEGO basis were prepared. Their compositions are as shown in Table 4.

5 TABEL 4TABLE 4

Blanding_NDGA (meso)_HgO_EtOH_PEGO 3350 1 3,6 24,3 48,5 23,4 2 6,9 0 0 93.1Mixture_NDGA (meso) _HgO_EtOH_PEGO 3350 1 3.6 24.3 48.5 23.4 2 6.9 0 0 93.1

Blanding nr. 1 blev fremstillet ved at opløse NDGA i absolut ethanol ved 10 opvarmning og omrøring; derefter blev vandet langsomt sat til NDGA opløsningen.Mixture # 1 was prepared by dissolving NDGA in absolute ethanol by heating and stirring; then the water was slowly added to the NDGA solution.

Blandingen blev opvarmet for at fordampe tilstrækkeligt meget af opløsningsmidlet til at man fik en blanding med omkring 130 % af NDGA's vægt, og den blev så blandet i PEGO grundlaget. Blanding nr. 2 blev fremstillet ved simpelthen at opløse NDGA i PEGO grundlaget ved opvarmning og omrøring.The mixture was heated to evaporate enough of the solvent to give a mixture of about 130% of the weight of the NDGA, and it was then mixed in the PEGO basis. Mixture # 2 was prepared by simply dissolving NDGA in the PEGO base by heating and stirring.

15 EKSEMPEL 5 NDGA formuleringerne fia eksempel 4 blev undersøgt for potentiel antitumoraktivitet mod B-16 melanom dyrket i mus. Den benyttede 20 fremgangsmåde var den, der er beskrevet tidligere. Resultaterne er vist i tabel 5.EXAMPLE 5 The NDGA formulations of Example 4 were tested for potential antitumor activity against B-16 melanoma grown in mice. The method used was that described earlier. The results are shown in Table 5.

TABEL 5 ' -i 18 DK 173490 B1TABLE 5 '-i 18 DK 173490 B1

Tumorstørreise % Tumorfri Overievende _n_ T/C1_(kontrol)_(kontrol)_(kontrol) 9 87 954±698 0 33 (1091 ±547) (0) (80) 9 114 748±621 0 77 (645±335) (0) (77) 10* 24 138199 20 100 (5751270) (0) (60) 1T/C forholdet blev beregnet mellem dag 21 og dag 24.Tumor-free travel% Tumor-free Surviving _n_ T / C1_ (control) _ (control) _ (control) 9 87 954 ± 698 0 33 (1091 ± 547) (0) (80) 9 114 748 ± 621 0 77 (645 ± 335) ( 0) (77) 10 * 24 138199 20 100 (5751270) (0) (60) 1T / C ratio was calculated between day 21 and day 24.

5 * Dyr behandlet én gang ved en 0,05 ml intratumoral injektion dag 6 efter tumorpodning.5 * Animals treated once by a 0.05 ml intratumoral injection on day 6 after tumor grafting.

EKSEMPEL 6 10 Adskillige formuleringer af zinkchlorid i et PEGO grundlag blev fremstillet ved først at opløse zinkchloridet i vand og så blande zinkchloridopløsningen i PEGO grundlaget Formuleringerne havde omtrent de følgende vægt/vægt% sammensætninger, som er vist i tabel 6.EXAMPLE 6 Several zinc chloride formulations in a PEGO base were prepared by first dissolving the zinc chloride in water and then mixing the zinc chloride solution in the PEGO basis. The formulations had approximately the following w / w% compositions shown in Table 6.

15 TABEL 6 TTABLE 6 T

Blanding_ZnCI2_HjjO_PEGO_ 3 41,9 11,6 46,5 4 30 16 53,8 5 14,6 4,1 81,3 6 28,6 7,9 63,5 7 46,1 13,8 40 8 15 8 77 9 13,8 9,2 77 10 5,5 3.7 90,8 19 DK 173490 Bl « EKSEMPEL 7Mixture_ZnCl2_Hy2O_PEGO_3 41.9 11.6 46.5 4 30 16 53.8 5 14.6 4.1 81.3 6 28.6 7.9 63.5 7 46.1 13.8 40 8 15 8 77 9 EXAMPLE 7 13.8 9.2 77 10 5.5 3.7 90.8 19 DK 173490 B1

Blandingerne fra eksempel 6 blev undersøgt for potentiel antitumoraktivitet mod B-16 melanom og S-180 fast tumorvækst i mus i overensstemmelse med de 5 fremgangsmåder, der tidligere er beskrevet. Resultaterne er vist i tabel 7.The mixtures of Example 6 were tested for potential antitumor activity against B-16 melanoma and S-180 solid tumor growth in mice according to the 5 methods previously described. The results are shown in Table 7.

TABEL7 S-180TABLE 7 S-180

Tumorstørrelse % tumorfri Overlevende Blanding_n_T/C1_(kontrol) (kontrol) (kontrol) 3 8 51 559±476 25 100 (1095±360) (10) (100) 3 10 40 366±345 11 90 (934±656) (10) (100) 6 8 48 524±462 12 100 (1095±360) (10) (100) 6 10 115 1074±687 10 100 (934±656) (10) (100) 7 5 0 0 100 80 (752±511) (0) (100) 7 10 0 α - 100 90 (550±184) (0) (100) 7 10 0 0 100 100 (997±421) (0) 10 8 74 815±472 0 87 (1095±360) (10) (100) 1T/C forholdet blev beregnet mellem dag 20 og dag 23.Tumor size% tumor-free Survivor Mixture_n_T / C1_ (control) (control) (control) 3 8 51 559 ± 476 25 100 (1095 ± 360) (10) (100) 3 10 40 366 ± 345 11 90 (934 ± 656) (10 (100) 6 8 48 524 ± 462 12 100 (1095 ± 360) (10) (100) 6 10 115 1074 ± 687 10 100 (934 ± 656) (10) (100) 7 5 0 0 100 80 (752 ± 511) (0) (100) 7 10 0 α - 100 90 (550 ± 184) (0) (100) 7 10 0 0 100 100 (997 ± 421) (0) 10 8 74 815 ± 472 0 87 ( 1095 ± 360) (10) (100) 1T / C ratio was calculated between day 20 and day 23.

TABEL 7 (fortsat) 20 OK 173490 Bl B-16TABLE 7 (continued) 20 OK 173490 Bl B-16

Tumorstørrelse % tumorfri Overlevende Blanding_n_T/C1_(kontrol)_(kontrol) (kontrol) 3 10 6 162±253 60 100 (2505±1844) (0) (100) 4 10 16 106±114 30 100 (644±342) (0) (70) 5 10 47 1191±764 22 90 (2505±1844) (0) (100) 6 10 4 94±217 80 100 (2505±1844) (0) (100) 7 9 15 169±216 37 88 (1091 ±547) (0) (80) 7 9 0 0 100 88 (654±335) (0) (77) 7 10 2 31±100 90 100 (1805±968) (0) (80) 8 10 43 277±209 10 40 (644±342 (0) (70) 9 10 1,0 25±63 80 90 (1733±2254) (70) (80) 1T/C forholdet blev beregnet mellem dag 21 og dag 25.Tumor size% tumor-free Survivor Mixture_n_T / C1_ (control) _ (control) (control) 3 10 6 162 ± 253 60 100 (2505 ± 1844) (0) (100) 4 10 16 106 ± 114 30 100 (644 ± 342) ( 0) (70) 5 10 47 1191 ± 764 22 90 (2505 ± 1844) (0) (100) 6 10 4 94 ± 217 80 100 (2505 ± 1844) (0) (100) 7 9 15 169 ± 216 37 88 (1091 ± 547) (0) (80) 7 9 0 0 100 88 (654 ± 335) (0) (77) 7 10 2 31 ± 100 90 100 (1805 ± 968) (0) (80) 8 10 43 277 ± 209 10 40 (644 ± 342 (0) (70) 9 10 1.0 25 ± 63 80 90 (1733 ± 2254) (70) (80) The 1T / C ratio was calculated between day 21 and day 25.

5 EKSEMPEL 8EXAMPLE 8

Blandinger af zinkchlorid, EDTA og NDGA, blev fremstillet og formuleret i et PEGO grundlag. Blandingerne blev fremstillet ved at opløse NDGA og EDTA i en del af PEGO grundlaget ved opvarmning og omrøring indtil det var i opløsning.Mixtures of zinc chloride, EDTA and NDGA, were prepared and formulated on a PEGO basis. The mixtures were prepared by dissolving NDGA and EDTA in a portion of the PEGO base by heating and stirring until dissolved.

10 Zinkchloridet blev opløst i vand og opvarmet. Den varme zinkchloridopløsning blev 21 DK173490 B1 % * v' sat til den varme PEGO indeholdende NDGA og EDtA og omrørt til det var afkølet til stuetemperatur. Sammensætningen af blandingerne er givet i omtrentlig vægt/vægt%, som vist i tabel 8.The zinc chloride was dissolved in water and heated. The hot zinc chloride solution was added to the hot PEGO containing NDGA and EDtA and stirred until cooled to room temperature. The composition of the blends is given in approximate w / w%, as shown in Table 8.

5 TABEL 8TABLE 8

Blanding ZnCI2 NDGA EDTA H2O PEGOMixture ZnCl2 NDGA EDTA H2O PEGO

11 27,5 6,9 14,7 18,3 32,6 12 28 6,81 14,7 18,2 32,9 EKSEMPEL 9 10 Blandingerne fra eksempel 8 blev undersøgt for deres potentielle antitumoraktivitet mod B-16 melanom dyrket i mus i overensstemmelse med den fremgangsmåde, der tidligere er beskrevet. Resultaterne er vist I tabel 9.EXAMPLE 9 10 The mixtures of Example 8 were tested for their potential anti-tumor activity against B-16 melanoma grown in mice according to the procedure previously described. The results are shown in Table 9.

TABEL 9 15 B-16TABLE 9 B-16

Tumorstørrelse % tumorfri Overlevende Blanding_n_T/C1 (kontrol)_(kontrol) (kontrol) 11 10 8 51±118 70 100 (711±286) (0) (100) 12 10 0 0 60 100 (7111286) (0) (100) 1T/C forholdet beregnet på dag 24 undtagen for blanding 11, hvor den blev beregnet på dag 21.Tumor size% tumor free Survivor Mixture_n_T / C1 (control) _ (control) (control) 11 10 8 51 ± 118 70 100 (711 ± 286) (0) (100) 12 10 0 0 60 100 (7111286) (0) (100) ) 1T / C ratio calculated on day 24 except for mix 11 where it was calculated on day 21.

20 De foregående eksempler 4-9 viser den potentierende virkning af zinkchlorid på antineoplastiske midler, der påføres lokalt idet de viser forbedring i forhold til den antineoplastiske virkning af zinkchlorid alene og i forhold til sammenlignelige mængder af NDGA, selv når NDGA injiceres i tumoren.The foregoing Examples 4-9 show the potentiating effect of zinc chloride on antineoplastic agents applied locally, showing improvement over the antineoplastic effect of zinc chloride alone and in comparable amounts of NDGA, even when NDGA is injected into the tumor.

25 EKSEMPEL 10 22 DK 173490 B1 * ♦EXAMPLE 10 22 DK 173490 B1 * ♦

Passende humanmodeller og dyremodeller vælges for de sygdomstilstande, der .» behandles med de følgende forbindelser, som beskrevet ovenfor, og forbindelserne undersøges for at bestemme den effektive og den toksiske dosis med og uden tilsætning af equimolære mængder af zinkchlorid, zinkiodid, 5 zinkbromid,zinksulfat, zinknitrat, zinkstearat og zinkacetat Ud fra resultaterne beregnes det terapeutiske index, der er lig med forholdet mellem den toksiske og den effektive dosis, og dette index for forbindelser med og uden zinktilsætning sammenlignes for at vise en forøgelse i terapeutisk index for forbindelser med indhold af zinkforbindelser i sammenligning med forbindelserne uden sådan til 10 sætning; NDGA (nordihydroguaiaretsyre), VP-16 (epipodophyllotoxin-beta-D-ethyliden glucopyranosid-etoposid), VM-26 (epipodophyllotoxin-beta-D-thenyliden glucopyranosid-teniposid), ^-demethylepipodophyllotoxin, diethylstilbøstrol, dithranol, cydophosphamid, mitomycin, daunomycin, cis-diamindichlorplatin, adriamycin og allopurinol.Appropriate human and animal models are selected for the disease conditions. " are treated with the following compounds as described above, and the compounds are tested to determine the effective and toxic dose with and without the addition of equimolar amounts of zinc chloride, zinc iodide, zinc bromide, zinc sulfate, zinc nitrate, zinc stearate and zinc acetate. index equal to the toxic to effective dose ratio and this index for compounds with and without zinc addition is compared to show an increase in therapeutic index for compounds containing zinc compounds as compared to the compounds without such to 10 phrase; NDGA (nordihydroguaiaretic acid), VP-16 (epipodophyllotoxin-beta-D-ethylidene glucopyranoside etoposide), VM-26 (epipodophyllotoxin-beta-D-thenylidene glucopyranoside teniposide), , cis-diamindichloroplatin, adriamycin and allopurinol.

1515

Claims

23 DK 173490 B1

A pharmaceutical formulation which provides increased retention in skin and mucous membranes, characterized in that the formulation comprises a pharmacologically active substance selected by the group consisting of NDGA (Northern Hydroguaric Acid); VP-16 (epipodop-hylotoxin beta-D-ethylidene glucopyranoside ethoposide); VM-26 (epipodophyllotoxin beta-D-thenylidene glucopyranoside teniposide); 4'-demethylepipodo-phyllotoxin; diethylstilbestrol; dithranol; Cyclophos-phamid; mitomycin; Dauno-mycin; cisdiamin-dichloridplatin; adriamycin and allo-purinol as well as an effective amount of a water-soluble zinc-containing compound.

Formulation according to claim 1, characterized in that the zinc containing compound is zinc doride. 15