DE69804216T2

DE69804216T2 - Verhinderung der koagulation von blut-, blutplasma- bzw. synovialflüssigkeitsprodukten

Info

Publication number: DE69804216T2
Application number: DE69804216T
Authority: DE
Inventors: Mats Raenby
Original assignee: Global Hemostasis Institute MGR AB
Current assignee: Global Hemostasis Institute MGR AB
Priority date: 1997-06-05
Filing date: 1998-05-29
Publication date: 2002-11-07
Anticipated expiration: 2018-05-30
Also published as: ES2174446T3; CN1104902C; JP2001527530A; EP0986394B1; CA2292595A1; ATE214282T1; EP0986394A1; CN1265036A; AU8045498A; US6368785B1; WO1998055129A1; DE69804216D1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Koagulationshemmung von Blut-, Blutplasma- oder Synovialflüssigkeitsprodukten mit Isocitrat, und gegebenenfalls dem Einstellen der Calciumionenaktivität mit einem löslichen Calciumsalz auf physiologische Niveaus.

Hintergrund

Biologische Flüssigkeiten, insbesondere Blut, Lymphe, Synovialflüssigkeit und Cerebralliquor und zellfreie Präparate daraus, zum Beispiel Blutplasma, können drastische Veränderungen der rheologischen, d. h. viskoelastischen, Eigenschaften durchlaufen. Die Flüssigkeiten können sich von einer Flüssigkeit mit rheologischen Eigenschaften ähnlich Wasser, in ein Gel mit rheologischen Eigenschaften verändern, die eher Hüttenkäse ähneln. Der beschriebene rheologische Übergang, der allgemein als Koagulierung oder Verklumpung bezeichnet wird, kann dann auftreten, wenn biologische Flüssigkeit aus ihrem natürlichen Umfeld entfernt und in einem vom Menschen hergestellten Behälter gesammelt wird.
Um die Koagulierung nach dem Sammeln der biologischen Flüssigkeit zu verhindern, kann es notwendig sein, eine Substanz mit koagulierungshemmenden Eigenschaften hinzuzufügen. Substanzen, die zum Inhibieren der Koagulierung verwendet werden, die auch als Koagulierungshemmer bezeichnet werden, schließen Oxalat, EDTA, Citrat, Heparin und Hirudin ein. Diese Koagulierungshemmer verursachen entweder eine spezifische Inhibierung von Enzymen, die an der Koagulierung beteiligt sind, oder sich verändern die Bedingungen innerhalb der biologischen Flüssigkeit, so dass die Koagulierungsvorgänge nicht vonstatten gehen können. Diese Bedingungen schließen freie Calciumionenkonzentration, auch als Ca²&spplus;-Aktivität bezeichnet, und den pH- Wert ein.
Gemäß der Theorie des Stands der Technik ist der Wirkmechanismus einiger Koagulierungshemmer derjenige, Komplexe mit Ca²&spplus;-Ionen zu bilden und dadurch die Niveaus an freiem Ca²&spplus; zu reduzieren, d. h. die Ca²&spplus;-Aktivität in einer biologischen Flüssigkeit auf nicht wirksame Niveaus zu senken. Darunter versteht man, dass eine Ca²&spplus;-Aktivität auf einem bestimmten Niveau benötigt wird, damit die Koagulierungsvorgänge vonstatten gehen.
Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere Koagulierungshemmer des zuletzt genannten Typs, wenn die Koagulierung gestört ist, da die Ca²&spplus;-Aktivität unter 0,8 mmol oder der pH-Wert unter 7 liegt.
Wenn die Koagulierung einer biologischen Flüssigkeit durch Reduzieren der Ca²&spplus;-Aktivität gehemmt wurde, kann die biologische Flüssigkeit in einen koagulierungsfähigen Zustand zurückversetzt werden, indem Ca²&spplus; hinzugegeben wird, zum Beispiel in Form einer CaCl&sub2;-Lösung, um die Ca²&spplus;-Aktivität auf Niveaus, die eine Koagulierung erlauben, wiederherzustellen.
Ein Verfahren zum Hemmen der Koagulierung einer biologischen Flüssigkeit in reversibler Weise, d. h. auf eine Weise, die erlaubt, dass die Flüssigkeit in einen Zustand zurückkehrt, der eine Koagulierung erlaubt, ist bekannt und notwendig zur Analyse der Koagulierungsaktivität der Flüssigkeit. Oxalat, EDTA und Citrat sind Beispiele von Koagulierungshemmern, die gemäß des Stands der Technik dadurch wirken, dass sie die Ca²&spplus;-Aktivität in der biologischen Flüssigkeit reduzieren. Des weiteren kann jede Substanz, die die Ca²&spplus;-Aktivität einer biologischen Flüssigkeit ausreichend reduziert, nach dem Stands der Technik als Koagulierungshemmer wirken.
Gemäß des Stands der Technik bilden alle Substanzen, die durch die Reduzierung der Ca²&spplus;-Aktivität wirken als Koagulierungshemmer, relativ stabile Ca²&spplus;-Komplexe, die durch auftretende Dissoziierungskonstanten von 0,5 mmol oder weniger charakterisiert sind. Citrat beispielsweise, welches mit EDTA der meistverwendete Koagulierungshemmer dieser Art ist, bildet Ca²&spplus;- Komplexe mit einer auftretenden Dissoziationskonstante unter physiologischen Bedingungen von ungefähr 0,4 mmol. Die Ca²&spplus;-EDTA-Komplexe und Ca²&spplus;- Oxalatkomplexe sind bemerkenswert fester.
Wie oben diskutiert wurde, wird die Analyse von Koagulierungsanalyten in biologischen Flüssigkeiten im allgemeinen mit Citrat an der Koagulierung gehemmten Proben durchgeführt. Aufgrund seiner relativ geringen Affinität für Ca²&spplus; und durch die Verwendung minimaler Mengen, wird die Koagulierungshemmung mit Citrat im Hinblick auf die Verursachung einer Denaturierung und Destabilisierung von Proteinen und Lipidproteinstrukturen der biologischen Flüssigkeiten als sanft betrachtet. Dennoch kann davon ausgegangen werden, dass die Koagulierungshemmung durch Citrat einige Nebeneffekte hat. Faktor VIII ist zum Beispiel in citriertem Blut und Blutplasma weniger stabil als in der Zirkulation. Auf die Ergebnisse der aktivierten Prothrombinzeit (APTT)-Analyse von citriertem Blut oder Blutplasma zeigen eine limitierte Stabilität. Das heißt, dass gemäß des Stands der Technik einige Koagulierungsanalyte einen Instabilitätsgrad aufweisen, der besondere Beachtung in der klinischen Laborroutine notwendig macht. Diese rigoroseren Maßnahmen steigern die Kosten und die Unannehmlichkeiten bei medizinischen Laborverfahren.
Wenn eine an der Koagulierung gehemmte Probe einer biologischen Flüssigkeit auf zahlreiche Koagulierungsaktivitäten getestet wird, wird die Probe mit Reagenzien gemischt, die Ca²&spplus; einschließen. Die Menge des hinzugegebenen Ca²&spplus; ist ausreichend, um der Reaktionsmischung eine Ca²&spplus;-Konzentration im Bereich von 0,8 bis 8 mmol zu geben, bei der die Koagulierungsaktivitäten auftreten.
Obwohl es im allgemeinen verwendet wird, ist das Verfahren, eine Probe einer biologischen Flüssigkeit durch Reduzieren der Ca²&spplus;-Aktivität zuerst an der Koagulierung zu hemmen, nicht wünschenswert. Beispielsweise durch die Denaturierung und Destabilisierung der Strukturen von Interesse, wie oben beschrieben wurde. Des weiteren ist es unmöglich, die Wirkungen des hinzugegebenen Koagulierungshemmers durch die Zugabe von Ca²&spplus; in einem gegebenen Verfahren exakt auszubalancieren. Das Ca²&spplus; der recalcifizierten Probe ist wahrscheinlich von der Ausgangsflüssigkeit unterschiedlich, und in einer Probenreihe dieser Flüssigkeiten ist die Variation der Ca²&spplus;-Aktivität wahrscheinlich größer als die Variation in der ursprünglichen Ausgangsflüssigkeit. Diese Abweichung von normalen Niveaus der Ca²&spplus;-Aktivität, die auch als physiologische Niveaus bezeichnet werden, die in den recalcifizierten biologischen Flüssigkeiten auftreten, hat höchstwahrscheinlich unerwünschten Einfluss auf das Koagulierungstest system und dessen Ergebnisse.
Ein verwandtes medizinisches Gebiet, indem die Koagulierungshemmung durch Reduzieren von Ca²&spplus; praktische Bedenken erzeugt, liegt in Blutbanken. Blut oder Blutplasma, das für Transfusionen verwendet werden soll, wird im allgemeinen an der Koagulierung gehemmt. Das liegt daran, dass mit den vorhandenen Techniken natives Blut und Blutplasma nur für einen kurzen Zeitraum außerhalb des Organismus behandelt werden kann, ohne zu gerinnen.
Aufgrund der geringen Toxizität, der schnellen Metabolisierung und der relativ guten koagulierungshemmenden Eigenschaften ist Citrat das allgemein verwendete Koagulierungshemmungsmittel in Blutbanken. In vielen Fällen verursacht der Citratgehalt im transfundierten Blut oder Blutplasma keine Nebeneffekte im Empfängerpatienten. Aber in einigen Fällen, insbesondere bei Patienten mit Leberfehlfunktionen, wird mit Citrat an der Koagulierung gehemmtes Blut und Blutplasma nicht gut vertragen. Aufgrund des langsamen Metabolismus von Citrat in diesen Patienten, verursacht das Citrat eine auffällige Reduzierung der Ca²&spplus;-Aktivität, die zu Krämpfen und gastrointestinalen Beschwerden führt.
Es gibt einen Bedarf für verbesserte Verfahren zur Koagulierungshemmung von Blut, Blutplasma und Synovialflüssigkeitsprodukten, um die Eigenschaften der Produkte für solche Anwendungen, wie Transport und Aufbewahrung der Produkte, die Verwendung der Produkte für Transfusionszwecke und die Analyse von hämostatischen und Koagulierungseigenschaften der Produkte zu verbessern.

Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bietet ein Verfahren zum Hemmen der Koagulierung von Blut, Blutplasma und Synovialflüssigkeitsprodukten. Das Verfahren umfasst die Zugabe von Isocitrat und gegebenenfalls einem löslichen Calciumsalz.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist beispielsweise nützlich zum Erreichen von 1) der erhöhten Stabilität und reduzierten Denaturierung von Koagulierungsanalyten in dem koagulierungsgehemmten Produkt, 2) näher an physiologischen Niveaus liegender Ca²&spplus;-Aktivität und einer abgesenkten Variation der Ca²&spplus;-Aktivität in Testsystemen für Koagulierungsanalyte, und 3) einer Reduzierung des Ca²&spplus; senkenden Effektes, wenn mit Citrat an der Koagulierung gehemmtes Blut oder Blutplasma in Patienten transfundiert wird.
Daher richtet sich ein erfindungsgemäßer Aspekt auf ein Verfahren zum Hemmen der Koagulierung von Blut, Blutplasma oder Synovialflüssigkeitsprodukten, das den Schritt einer Zugabe einer wirksamen Menge Isocitrat zu dem Produkt umfasst.
In einer Ausführung dieses erfindungsgemäßen Aspekts umfasst das Verfahren zusätzlich den Schritt die Calciumionenaktivität des an der Koagulierung gehemmten Produktes mit einem löslichen Calciumsalz auf physiologische Niveaus einzustellen.
In diesem Zusammenhang kann erwähnt werden, dass die Calciumionenaktivität des an der Koagulierung gehemmten Produktes der Erfindung durch die Zugabe von Citrat, oder anderer Calcium bindender Substanzen erzielt werden kann und dass der pH-Wert für spezielle Zwecke eingestellt werden kann.
Die wirksame Menge an Isocitrat liegt bei 15-50 mmol pro Liter des Blutproduktes oder 25-70 mmol pro Liter Blutplasma oder Synovialflüssigkeitsprodukt, und in einer am meisten bevorzugten Ausführungsform liegt die Menge an Isocitrat bei 15-25 mmol je Liter des Blutproduktes oder 25-35 mmol je Liter Blutplasma oder Synovialflüssigkeit.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Aspekt ist auf Blut, Blutplasma oder Synovialflüssigkeitsprodukte gerichtet, die eine an der Koagulierung hemmende Menge an Koagulierungshemmern umfassen, die Isocitrat einschließen. In einer Ausführungsform dieses Aspektes der Erfindung umfasst der Koagulierungshemmer zusätzlich zum Isocitrat noch Citrat.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieses erfindungsgemäßen Aspektes liegt die Koagulierungshemmende Menge an Isocitrat bei 15-50 mmol pro Liter Blutprodukt oder 25-70 mmol pro Liter Blutplasma oder Synovialflüssigkeit, und in einer am meisten bevorzugten Ausführungsform liegt die Koagulierungshemmende Menge an Isocitrat bei 15-25 mmol pro Liter des Blutproduktes oder 25-35 mmol pro Liter Blutplasma oder Synovialflüssigkeitsprodukt.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Aspekt richtet sich auf die Verwendung von erfindungsgemäßem Blut, Blutplasma oder Synovialflüssigkeit zum Transport und die Aufbewahrung des Produktes. Das transportierte und aufbewahrte Blut, Blutplasma oder Synovialflüssigkeitsprodukt kann dann direkt für die Transfusion in Patienten verwendet werden.
Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung richtet sich auf die Verwendung von erfindungsgemäßem Blut, Blutplasma oder Synovialflüssigkeitsprodukt zur Analyse hämostatischer oder koagulativer Eigenschaften des Produktes, d. h. für diagnostische Zwecke.
Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung richtet sich auf Blutprobencontainer, die eine isotonische oder leicht hypertone Isocitratlösung umfassen.
Eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Blutprobenbehälters umfasst eine Lösung von 0,1-0,5 mol Isocitrat in einem Zehntel des Volumens des Behälters.
Die erfindungsgemäßen Blutprobenbehälter können zusätzlich, zusammen mit dem Isocitrat, eine wirksame Menge an Calciumchlorid umfassen, was zu einer Calciumionenaktivität von bis zu ungefähr 1 mmol führt.
Die Blutprobenbehälter der Erfindung sind bevorzugt konventionelle, gegebenenfalls evakuierte Teströhrchen, Spritzen oder Plastikbeutel, die zum Behandeln von Blut und Blutplasmaprodukten verwendet werden und fertig sind für die Auslieferung an Laboratorien, die für die Behandlung von Blutproben und deren Analyse verantwortlich sind.
Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung richtet sich auf Reagenzien zur Analyse von Blut, Blutplasma oder Synovialflüssigkeitsprodukten, die Isocitrat umfassen. Diese Reagenzien werden in Behältnissen mit Etiketten und Gebrauchsanweisungen zur Verfügung gestellt.

Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 6 Prothrombinkomplexzeit (PK) des zugegebenen Citrats im PK-System, kein Citrat (gefüllter Kreis), 5 mmol/L Citrat (leerer Kreis), 10 mmol/L Citrat (gefülltes Dreieck) und 20 mmol/L Citrat (leeres Dreieck). Die Calciumaktivität wurde potentiometrisch für jeden Datenpunkt bestimmt. Die experimentellen Punkte stellen gepooltes Plasma dar.
Fig. 7 Prothrombinkomplexzeit (PK) für zugegebenes Isocitrat im PK-System, kein Isocitrat (gefüllter Kreis), 5 mmol/L Isocitrat (leerer Kreis), 10 mmol/L Isocitrat (gefülltes Dreieck) und 20 mmol/L Isocitrat (leeres Dreieck). Die Calciumaktivität wurde potentiometrisch für jeden Datenpunkt bestimmt. Die experimentellen Punkte stellen gepooltes Plasma dar.
Fig. 8 Prothrombinkomplexzeit (PK) des zugegebenen Liganden im PK-System, Citrat (gefüllter Kreis) und Isocitrat (leerer Kreis). Die Calciumaktivität betrug ungefähr 2 mmol/L bei jedem Datenpunkt. Die experimentellen Punkte stellen gepooltes Plasma dar.
Fig. 4 Ca²&spplus;-Pufferungsleistung eines Systems, das für die Koagulierungsanalyse verwendet wird. Die Pufferungskapazität wurde bei einer Ca²&spplus;-Aktivität im Bereich von 1 bis 4 mmol bestimmt. Die Ergebnisse gelten für eine finale Zugabe von 5 mmol Citrat oder Isocitrat.
Fig. 5 Ca²&spplus;-Pufferungskapazität eines Systems, das für die Koagulierungsanalyse verwendet wird. Die Pufferungskapazität wurde bei einer Ca²&spplus;-Aktivität im Bereich von 1 bis 4 mmol bestimmt. Die Ergebnisse gelten für eine finale Zugabe von 10 mmol Citrat oder Isocitrat.
Fig. 1 Stabilität von Faktor VIII:C-Aktivität im Blut, das in einer Mischung vorliegt, die 0,05 mol/L Citrat und 0,08 mol/L Isocitrat (gefüllte Kreise), 0,20 mol/L Isocitrat (leere Kreise) und auf 0,13 mol/L Citrat (Dreieck) enthält. Die Faktor VIII:C-Aktivität wurde im Plasma, das 0,5 Stunden, 6 Stunden, 1 Tag und 2 Tage bei Raumtemperatur aufbewahrt, bestimmt, das aus Blut isoliert wurde. Die experimentellen Punkte stellen den Mittelwert eines Ergebnisses mit dem Blut von 5 Individuen dar.
Fig. 2 Stabilität der aktivierten partiellen Thromboplastinzeit, APTT, im Blut, das in einer Mischung, die 0,05 mol/L Citrat und 0,08 mol/L Isocitrat (gefüllte Kreise), 0,20 mol/L Isocitrat (leerer Kreis) und 0,13 mol/L Citrat (Dreieck) gesammelt wurde. Die APTT wurde an Plasma bestimmt, das nach 0,5 Stunden, 6 Stunden, 1 Tag und 2 Tagen aus Blut, das bei Raumtemperatur aufbewahrt wurde, isoliert wurde. Die experimentellen Punkte stellen den Mittelwert von Ergebnissen mit dem Blut von 5 Individuen dar.
Fig. 3 Stabilität der Prothrombinzeit, PT, im Blut, das auf einer Blend, die 0,05 mol/L Citrat und 0,08 mol/L Isocitrat (gefüllte Kreise), 0,20 mol/L Isocitrat (leerer Kreis) und auf 0,13 mol/L Citrat (Dreieck) gesammelt wurde. PT wurde an Plasma bestimmt, das nach 0,5 Stunden, 6 Stunden, 1 Tag und 2 Tagen aus Blut, das bei Raumtemperatur aufbewahrt wurde, isoliert wurde. Die experimentellen Punkte stellen den Mittelwert von Ergebnissen mit dem Blut von 5 Individuen dar.

Beschreibung der Experimente

Materiale und Methoden

Die aktivierte partielle Thromboplastinzeit (APTT), die Prothrombinzeit (PT), der Prothrombinkomplexassay (PK), Faktor VIII und Fibrin D-Dimer wurden in Übereinstimmung mit den Empfehlungen der Hersteller unter Verwendung der folgenden Reagenzien bestimmt; PTT Automate, Diagnostica Stago, Asnieres-sur-Seine, Frankreich; Thromborel® S, Behring Diagnostics GmbH, Marburg, Deutschland; PK-reagent GHI 129, Global Hemostasis Institute MGR, Linköping, Schweden; und Coamatic® Faktor VIII, Chromogenix, Mölndal, Schweden. Die Tests wurden mit einem Automated Coagulation Laboratory Instrument, ACL, Modell 810 (Instrumentation Laboratory, Mailand, Italien) durchgeführt.
Das Blut wurde aus Antekubitalvene durch Füllen einer 4,5 ml Monovette® gesammelt (Sarstedt, Nürnberg, Deutschland)-Röhrchen, das 0,5 ml Koagulierungshemmer enthielt. Die Monovette®-Röhrchen enthalten Koagulierungshemmer gemäß des Stands der Technik. Für zahlreiche Experimente mit erfindungsgemäßem Koagulierungshemmern wurden die Monovette®-Röhrchen geöffnet, das ursprüngliche Koagulierungshemmungsmittel verworfen, die Röhrchen mit 0,15 mol NaCl gespült und mit 0,5 ml des Koagulierungshemmers der Wahl gefüllt. Das Plasma wurde durch Zentrifugieren von 2 ml an der Koagulierung gehemmten Bluts für 3 Minuten bei 8000 · g und durch den Transfer des Plasmas in Plastikröhrchen erhalten, die bei einigen Experimenten bis zu 20 Tage bei -70ºC vor der Analyse aufbewahrt wurden. In Beispiel 7 wurde Plasma von 22 gesunden Individuen und von 120 Patienten als freundliche Gaben der Abteilung für klinische Chemie und dem Labor für klinische Chemie, Universitätskrankenhaus Linköping, freundlicherweise von Dr. Thomas Lindahl zur Verfügung gestellt, das mit Citrat an der Koagulierung gehemmt wurde, wobei jedoch die Identifizierungsetiketten, die die Herkunft angeben, entfernt waren. Vor der Analyse wurden die Plasmas von gesunden Individuen für ungefähr 6 Monate bei -70ºC aufbewahrt. Die Plasmas von Patienten wurden innerhalb von sechs Stunden nach dem Sammeln analysiert.
Trinatrium-DL-isocitrat, Phthalatsäure, 2,6-Diaminopurin (Hemisulfatsalz), trans-Aconitinsäure, Tricarballylsäure und Adenin sind die Produkte I-1252, P-2944, D-3289, A-7376, T-9251 und A-8626 von Sigma Chemical Co. St. Louis, MO. CaCl&sub2;, Zitronensäure und Oxalsäure sind die Produkte 2382, 244 und 495 von Merck, Darmstadt, Deutschland. Trinatriumcitrat war das Produkt 32320 von Riedel-de Haen, Seelze, Deutschland, Ethylacetat, Produkt 10108 von BDH, England, Methylmalonsäure, Produkt 17503 43 von Fluka AG, Buchs SG, Schweiz, Dimethylmalonsäure, Produkt D16 800-9 von Aldrich- Chemie, Steinheim, Deutschland, Iminiodiacetat Produkt-Nummer I 120-0 war von Ega-Chemie KG, Steinheim bei Heidenheim, Deutschland.
Die Isozitronensäure wurde durch Lösen von Trinatriumisocitrat in einer minimalen Menge verdünnter Salzsäure, pH zwischen Null und Eins, 5-mal wiederholte Extraktion mit Ethylacetat und Trocknen mit einer Ausbeute von 36% hergestellt. Rinderplasmafreie, Vitamin K-abhängige Koagulierungsfaktoren und Thromboplastin aus Kaninchenhirn waren die entsprechenden Bestandteile des PK-Reagens GHI 129, das oben detailliert beschrieben wurde. Die Ca²&spplus;-Aktivität und der pH-Wert im Plasma wurden mit einem Potentiometer mit einem ICA 2 Apparat (Radiometer, Kopenhagen, Dänemark) bestimmt.

Beispiel 1

Um Komponenten zu identifizieren, die als Puffer für Ca²&spplus; bei physiologischen Niveaus, d. h. bei ungefähr 1,3 mmol an Ca²&spplus; dienen könnten, wurden wasserlösliche Bestandteile, die entweder Dissoziationskonstanten im Bereich von 0,5 bis 5 mmol, oder die sonst interessant erschienen, experimentell untersucht. Nachfolgend werden diese Bestandteile als Ca²&spplus;-Liganden oder einfach Liganden bezeichnet. Die unten beschriebenen Experimente wurden durchgeführt, um die scheinbaren Dissoziationskonstanten unter physiologisch ähnlichen Bedingungen und bei Ligandenkonzentrationen, die für die Ca²&spplus;-Pufferung abzuleiten.
Eine 200 mmol Lösung des Liganden, die 20 mmol Hepes enthält, wurde auf einen pH-Wert von 7,4 eingestellt und mit dem gleichen Volumen einer 100 mmol CaCl&sub2;-Lösung gemischt. Diese Mischungen wurden 1 : 2, 1 : 4, 1 : 8 und 1 : 16 mit 0,15 mmol NaCl verdünnt. Für alle Mischungen und Verdünnungen mit Ca²&spplus;-Aktivität unter 10 mmol und einem pH-Wert zwischen 7,0 bis 7,6 wurde die Ca²&spplus;-Aktivität und der pH-Wert potentiometrisch bestimmt. Aus der experimentell bestimmten Ca²&spplus;-Aktivität und den stöchiometrischen Niveaus des Liganden und Ca²&spplus; wurde die augenscheinliche Dissoziationskonstante für einen möglichen Ca*-Ligandenkomplex als Durchschnitt aller erhältlichen Daten bestimmt. Für jeden Liganden wurden dieser Durchschnitt und SD, die Anzahl an Bestimmungen gemittelt (n) und die publizierten Schätzungen werden in Tabelle I dargestellt. Tabelle I
Die Experimente zeigen an, dass Citrat und Isocitrat in unseren Händen die einzigen zwei identifizierten Bestandteile waren, die Komplexe mit augenscheinlichen Dissoziationskonstanten nahe der physiologischen Ca²&spplus;-Aktivitätsniveau, d. h. ungefähr 1,5 mmol bilden. Diese zwei Liganden wurden als Ca²&spplus;-Puffersubstanzen und als Koagulierungshemmer weiter untersucht. Es ist jedoch wahrscheinlich, dass andere Liganden mit der benötigten Affinität gefunden werden können. Insbesondere liegt es im Bereich dieser Erfindung, Derivate zu untersuchen, d. h. methylierte, halogenierte, nitrierte und hydroxylierte Formen der obengenannten Substanzen. Insbesondere können Derivate des Citrats mit elektrophilen Gruppen, d. h. Derivate mit Fluor, Chlor oder Nitrat, die am Tricarboxylkohlenstoff-Skelett angehängt sind, die benötigten Eigenschaften haben. Der Grund hierfür ist, dass elektrophile Gruppen die Elektronendichte der Carboxyle reduzieren und dadurch deren Fähigkeit, mit Ca²&spplus; zu interagieren, senken.
Bei einigen Liganden, zum Beispiel Methylmalonat, Dimethylmalonat und Citrat, waren unsere Schätzungen der Dissoziationskonstanten ähnlich denen der publizierten Werte. Bei anderen Liganden, insbesondere bei Phthalat, 2,6-Diaminopurin und Adenin, wichen die publizierten Werte eine Größenordnung und mehr von dem ab, was beobachtet wurde.
Vielleicht bilden die Liganden bei höheren Konzentrationen einen Komplex, der eine reduzierte Aktivität für Ca²&spplus; hat, auf jeden Fall sind sie im vorliegenden Kontext nutzlos.

Beispiel 2

In den Experimenten, die im Beispiel 6 beschrieben wurde, wurde klar, dass Citrat und, in einem geringeren Ausmaß, Isocitrat selbst, und nicht nur durch ihre Ca²&spplus;-Bindung, inhibitorisch für Koagulierungsreaktionen im Blut sind. Das gab Anlass für die Idee, dass diese Substanzen als Koagulierungshemmer auch nahe physiologischen Niveaus der Ca²&spplus;-Aktivität wirken könnten. Aus diesem Grund wurde eine CaCl&sub2;-Lösung zu Citrat- und Isocitratlösungen hinzugefügt, um Lösungen dieser Ca²&spplus; bindenden Substanzen mit physiologischen Niveaus an Ca²&spplus; herzustellen. Das war mit Isocitrat möglich aber nicht mit Citrat. Lösungen mit sowohl Citrat als auch CaCl&sub2; bildeten Präzipitate. Im folgenden werden daher nur Experimente mit Isocitrat beschrieben.
Neun Teile (4,5 ml) Blut eines Individuums wurden in vier evakuierte Plastikbehältnisse mit einem Teil (0,5 ml) eines Koagulierungshemmers gesogen. Der Koagulierungshemmer waren Lösungen von 0,3, 0,4, 0,6 oder 0,8 mol Trinatriumisocitrat mit ausreichenden Mengen gelöstem CaCl&sub2;, um eine Ca²&spplus;- Aktivität von ungefähr 1 mmol zu ergeben. In den Tabellen 2 und 3 wurden die Koagulierungsgehemmten Blutproben durch ihren entsprechenden Gehalt an Koagulierungshemmer, d. h. als 30, 40, 60 und 80 mmol Isocitrat bezeichnet.
Aus jedem Behälter wurde innerhalb von 15 Minuten nach dem Einsammeln ungefähr 2 ml des an der Koagulierung gehemmten Blutes unter Verwendung einer dünnen hypodermischen Nadel, die durch die elastische Membran des Behälters gesteckt wurde, entfernt, um den Gasaustausch mit der Umgebung einzuschränken. Dieses Blut wurde sofort bei 10.000 · g für 3 Minuten zentrifugiert, um die Blutzellen zu pelletieren und ungefähr 0,8 ml Plasma zu gewinnen. Neben der kleinen Menge, die zur Bestimmung der Ca²&spplus;-Aktivität und des pH-Wertes verwendet wurde, siehe Tabellen II und III, wurde das Plasma in ein Polystyrol-Röhrchen überführt. In den Tabellen II und III werden zahlreiche Plasma und Blutprodukte durch die Menge des Koagulierungshemmers im Blut angezeigt, d. h. als 30, 40, 60 oder 80 mmol Isocitrat. (Die tatsächlichen Mengen an Koagulierungshemmer in den Plasmaprodukten sind ungefähr 1,4fach höher als in den Blutprodukten, wie aus Berichten über den Citratgehalt im Plasma von mit Citrat an der Koagulierung gehemmtem Blut abgeleitet werden kann.)
Die Blutprodukte in ihren Originalbehältern und die entsprechenden Plasmaprodukte in verschlossenen 3 ml Polystyrolröhrchen wurden bei Raumtemperatur aufbewahrt und regelmäßig auf das Vorhandensein einer Koagulierung untersucht. In den Tabellen II und III wird die Koagulierungsbildung durch ein großes C angezeigt und keine Koagulierung ist durch NC angezeigt. Die Zeiträume, die in den Tabellen angegeben sind, zeigen die Zeiträume an, in denen die Beobachtungen durchgeführt wurden. Die Ergebnisse für das Blut und das Plasma werden in den Tabellen II bzw. III angegeben. Tabelle II. Blut Tabelle III. Plasma
Die Ergebnisse der oben beschriebenen Experimente mit Isocitrat zeigen, dass es möglich ist, eine biologische Flüssigkeit gemäß der Erfindung, insbesondere Blut und Blutplasma, mit Substanzen wie Isocitrat, das eine begrenzte Affinität gegenüber Ca²&spplus; hat, an der Koagulierung zu hemmen, ohne die Ca²&spplus;-Aktivität der Flüssigkeit zu reduzieren. Die typische physiologische Ca²&spplus;-Aktivität extrazellulärer biologischer Flüssigkeiten beträgt ungefähr 1,2 mmol. Substanzen mit bescheidener Ca²&spplus;-Affinität werden als solche definiert, die Komplexe mit Ca²&spplus; bilden, die dadurch charakterisiert sind, dass sie Dissoziationskonstanten von 0,8 bis 8 mmol bei physiologischen Bedingungen haben, d. h. bei einer Temperatur von ungefähr 37ºC, einem ph-Wert von ungefähr 7,3 und eine ionische Stärke von ungefähr 150 mmol.
Die Ergebnisse zeigen an, dass die Substanz mit bescheidener Ca²&spplus;-Affinität und höchstwahrscheinlich auch Substanzen mit höherer Affinität für Ca²&spplus; einen Wirkmechanismus haben, der bisher noch nicht beschrieben wurde, oder zumindest kaum erkannt wurde. Dieser koagulierungshemmende Mechanismus wirkt direkt auf die Substanzen der biologischen Flüssigkeiten ein, die an den Koagulierungsabläufen beteiligt sind, und nicht über die Reduzierung der Ca²&spplus;-Aktivität. Die Reduzierung der Ca²&spplus;-Aktivität, die der allgemein bekannte Mechanismus der koagulierungshemmenden Wirkung ist, die der Gruppe der Calcium bindenden koagulierungshemmenden Substanzen zugeschrieben wird. Aus den oben gezeigten Ergebnissen wird deutlich, dass nahe physiologischen Niveaus einer Ca²&spplus;-Aktivität Substanzen mit bescheidener Ca²&spplus;-Affinität effizienter zur Koagulierungshemmung von Plasma als von Blut sind, d. h. weniger koagulierungshemmende Substanzen werden zur Koagulierungshemmung von Plasma benötigt.

Beispiel 3

Die Experimente wurden auf gleiche Weise wie in Beispiel 2. Neun Teile Blut wurden in einem evakuierten Plastikbehälter mit einem Teil einer koagulierungshemmenden Lösung gesammelt. Die zahlreichenden koagulierungshemmenden Lösungen waren Trinatriumisocitrat im Bereich von 50 bis 300 mmol, die in Wasser gelöst waren, was zu Isocitratniveaus im Bereich von 5 bis 30 mmol in dem gesammelten Blut führte. Kurz nach dem Einsammeln wurden kleine Mengen des an der Koagulierung gehemmten Blutes aus den Behältnissen abgenommen und die Ca²&spplus;-Aktivität und der pH-Wert wurden bestimmt. Die ursprünglichen Behältnisse mit dem an der Koagulierung gehemmten Blut wurden bei Raumtemperatur untersucht und regelmäßig auf die Gegenwart einer Koagulierung untersucht, d. h. geronnenes Material oder Klumpen. Die Bezeichnungen sind wie im Beispiel 2, "C" für Koagulierung und "NC" für keine Koagulierung etc. Die Ergebnisse werden in Tabelle IV gezeigt. Tabelle IV. Blut
* im Serum bestimmt
Aus den oben gezeigten Ergebnissen scheint es so zu sein, dass 20 mmol Isocitrat die geringste Menge ist, die benötigt wird, um Blut über einen ausgedehnten Zeitraum an der Koagulierung zu hemmen. Die Ca²&spplus;-Aktivität in dem an der Koagulierung gehemmten Blut beträgt 0,18 mmol, was ungefähr 10fach höher ist, als die im Blut mit 1,3 mmol Trinatriumcitrat, d. h. Blut, das in Behältnissen mit 1/9 Volumen an 0,13 mol an Trinatriumcitrat gemäß des Stands der Technik gesammelt wurde. Aufgrund der Ergebnisse in Beispiel 2 kann angenommen werden, dass die Koagulierungshemmung des Blutplasmas weniger Isocitrat als Koagulierungshemmer benötigt.
Im Bereich der Erfindung wird vorausgesetzt, dass die Koagulierungshemmung durch Isocitrat durch Zugabe von Citrat oder durch das Reduzieren des pH-Wertes verstärkt werden kann. Die Reduzierung des pH-Wertes kann durch Isozitronensäure oder Zitronensäure anstelle von Natrium, Kalium oder Lithiumsalzen erreicht werden. Ergebnisse aus Experimenten, die wie oben beschrieben durchgeführt wurden, außer dass die Koagulierungshemmer Mischungen aus (Na+)Isocitrat, (Na+)Citrat, (H+)Isocitrat und/oder (H+)Citrat sind, sind in Tabellen V, VI und VII zusammengefasst. Tabelle V. Blut Koagulierungshemmung mit Mischungen aus (Na+)Isocitrat und (Na+)Citrat. Die Summe der Konzentrationen beträgt 13 mmol im Blut. Das Citratverhältnis wird in Prozent dargestellt. Tabelle VI Koagulierungshemmung mit 13 mmol Mischungen aus (H+)Isocitrat und (H+)Citrat Tabelle VII Koagulierungshemmung mit 11 mmol Mischungen aus H+)Isocitrat und (H+)Citrat

Beispiel 4

Im folgenden wird gezeigt, dass Blut, das gemäß der Erfindung an der Koagulierung gehemmt wurde, hinsichtlich der Koagulierungsreaktionen stabiler ist. Demnach ist Blut und Blutplasma, das erfindungsgemäß an der Koagulierung gehemmt wurde, für Koagulierungsanalysen besser geeignet als Blut, das nach Verfahren des Stands der Technik an der Koagulierung gehemmt wurde, geeignet.
Drei verschiedene Arten von Blutsammelröhrchen, die alle 4,5 ml Blut aufnehmen, wurden hergestellt. Diese drei Arten von Blutsammelröhrchen wurden als Citrat, Isocitrat und Citrat/Isocitrat-Mischung bezeichnet. Das Röhrchen Citrat war gemäß dem Stand der Technik und enthielt 0,5 ml 0,13 mol Trinatriumcitrat. Das Röhrchen Isocitrat war erfindungsgemäß und enthielt 0,5 ml an 0,2 mol Trinatriumisocitrat. Das Röhrchen Isocitrat/Citrat- Mischung war ebenfalls erfindungsgemäß und enthielt 0,5 ml an 0,078 mol Trinatriumisocitrat und 0,052 mol Trinatriumcitrat.
Innerhalb einer Zeitspanne von weniger als fünf Minuten wurde Blut vom gleichen Individuum in jedes der Blutsammelröhrchen Citrat, Isocitrat und Isocitrat/Citrat-Mischung abgenommen.
Innerhalb eines Minimums an Zeitverzögerung wurden 1 ml des an der Koagulierung gehemmten Blutes aus jedem der drei Testsammelröhrchen abgenommen. Das Blut wurde für drei Minuten bei 5000 · g zentrifugiert. So schnell wie möglich wurden ungefähr 0,4 ml Plasma gesichert und auf die Koagulierungsfaktor VIII Verklumpungswirkung, die aktivierte partielle Thromboplastinzeit (APTT) und die Prothrombinzeit (PT) analysiert. Diese analytischen Ergebnisse wurden innerhalb von 20 Minuten nach der Blutabnahme erhalten und sind in den folgenden Fig. 1, 2 und 3 als Ausgangswerte genommen.
Das restliche Blut wurde bei Raumtemperatur in den drei Blutsammelröhrchen aufbewahrt. Die Röhrchen wurden verschlossen, um einen Verlust durch Verdunstung zu verhindern. Nach 5 Stunden, 24 Stunden und 48 Stunden nach der Blutabnahme, die oben beschrieben wurde, wurde Blut abgenommen, das Plasma gesichert und dieses Plasma analysiert. Die Ergebnisse dieser Analysen, die in Beziehung auf die Ausgangswerte ausgedrückt werden, sind in den Fig. 1, 2 und 3 dargestellt.
Fig. 1 zeigt, dass die Faktor VIII-Verklumpungsaktivität im Blut, das erfindungsgemäß an der Koagulierung gehemmt wurde, stabiler ist. Insbesondere war erfindungsgemäß gesammeltes Blut in dem Röhrchen, das mit Isocitrat bezeichnet wurde, über die 48 Stunden bei Raumtemperaturaufbewahrung sehr stabil und die Faktor VIII-Verklumpungsaktivität war innerhalb der 10% des Ausgangswertes. Blut, das gemäß des Stands der Technik an der Koagulierung gehemmt wurde, im Röhrchen, das mit Citrat bezeichnet wurde, fiel sehr schnell auf 75% der ursprünglichen Aktivität innerhalb der ersten 5 Stunden und fiel dann weiter, bis es nach 48 Stunden 55% erreichte. Verglichen mit dem Blut, das gemäß des Stands der Technik an der Koagulierung gehemmt wurde, war das Blut, das erfindungsgemäß an der Koagulierung gehemmt wurde, in dem Röhrchen, das als Isocitrat/Citrat-Mischung bezeichnet wurde, von besserer Faktor VIII-Stabilität in den ersten 15 Stunden der Aufbewahrung und danach ungefähr gleich.
Fig. 2 zeigt, dass APTT stabiler beim Blut, das erfindungsgemäß an der Koagulierung gehemmt wurde als beim Blut, das gemäß des Stands der Technik an der Koagulierung gehemmt wurde, ist. Innerhalb von 48 Stunden bei Raumtemperatur zeigte das Blut, das in dem Röhrchen Isocitrat aufbewahrt wurde, eine APTT innerhalb von 5% des Ausgangswertes. Blut, das in dem Röhrchen Citrat aufbewahrt wurde, zeigte eine APTT, die auf 113% anstieg. Blut, das in dem Röhrchen Isocitrat/Citrat-Mischung aufbewahrt wurde, zeigte eine APTT mit dazwischen liegender Stabilität.
Fig. 3 zeigt, dass PT stabiler beim Blut, das gemäß der Erfindung an der Koagulierung gehemmt wurde. In dem Röhrchen Isocitrat ist PT innerhalb 2% der Ausgangswerte, in dem Röhrchen Isocitrat/Citrat-Mischung innerhalb von 4% und in dem Röhrchen Citrat innerhalb von 7%.

Beispiel 5

Die Koagulierungsanalyse von Blut und Blutplasma wird auf verschiedene Weisen durchgeführt. Die meisten Analysen haben das folgende gemeinsam. Blut- oder Blutplasmaproben werden nach dem Stand der Technik mit Citrat oder erfindungsgemäß mit Isocitrat an der Koagulierung gehemmt. Das an der Koagulierung gehemmte Blut oder Blutplasma wird mit Reagenzien, die Ca²&spplus;-Ionen enthalten, gemischt, die Ca²&spplus;-senkenden Effekt der Koagulierungshemmer in der Probe wiederherstellen und dem entgegenwirken. Da die Ca²&spplus;- Aktivität die Koagulierungsreaktionen stark beeinflusst und daher auch die Ergebnisse der Analysen, ist es wichtig, dass die Ca²&spplus;-Aktivität äußerst gut definiert ist. Das heißt, dass die Variation der Ca²&spplus;-Aktivität in der Mischung der Probe und das Reaktionsmittel so klein wie möglich sein sollte. Die Größe dieser Variation wird durch die Ca²&spplus;-Pufferungskapazität der Probe entschieden. Diese Pufferungskapazität ist die stöchiometrische Veränderung des Ca²&spplus; je Liter der Lösung, die durch die Veränderung der Ca²&spplus;-Aktivität geteilt wird. Diese Ca²&spplus;-Pufferungskapazität wurde in einem System, das aus der Probe, Rinderplasma-freiem und Vitamin K-abhängigen Koagulierungsfaktoren und Kaninchenhirn-Thromboplastin zusammengesetzt. Solche Analysesysteme werden verwendet, um die Prothrombin-Komplexaktivität (PK-Aktivität) zu messen, da das System gegenüber der kombinierten Aktivität der Koagulierungsfaktoren VII, X und II (den Prothrombin-Komplexfaktoren) des Systems empfindlich ist. Solch ein System wurde im vorliegenden Beispiel entweder durch Zugabe von Citrat oder durch die Zugabe von Isocitrat modifiziert. Das System wurde entweder durch Zugabe von 5 oder 10 mmol finaler Konzentration der Calciumionen-bindenden Substanzen modifiziert. Für jedes Niveau der Zugabe wurde die Calciumionen-Pufferungskapazität des Analysesystems bestimmt. Die Pufferungskapazität wurde bei einer Ca²&spplus;-Aktivität im Bereich von 1 bis 4 mmol bestimmt. die Ergebnisse einer finalen Zugabe von 5 mmol Citrat oder Isocitrat werden in der Fig. 4 und für 10 mmol in Fig. 5 gezeigt.
Die Fig. 4 und 5 zeigen, dass Isocitrat eine größere Wirkung beim Erhöhen der Ca²&spplus;-Pufferungskapazität eines für die Koagulierungsanalyse verwendeten Systems besitzt. Die erhöhte Ca²&spplus;-Pufferungskapazität ist auffälliger, wenn die Ca²&spplus;-Aktivität über 1 mmol liegt, was das wichtige Ca²&spplus;-Aktivitätsniveau von 1,3 mmol, das dem physiologischen Niveau entspricht, einschließt.

Beispiel 6

Die Testantwort des in Beispiel 5 beschriebenen Systems wird untersucht. Die Probe, Reagenzien und CaCl&sub2;-Lösung werden gemischt. Die Koagulierungszeit wird aufgezeichnet. Und nach dem Kompaktieren des Coagulums durch Zentrifugieren für 3 Minuten bei 10.000 · g wird die Ca²&spplus;-Aktivität bestimmt. Zu diesem Reagens wird entweder eine Menge Citrat oder Isocitrat hinzugefügt. Die Menge des hinzugefügten Citrates oder Isocitrates ist so, dass die finale Konzentration der derart zugegebenen Substanzen 5, 10 oder 20 mmol beträgt. Die Experimente werden bei verschiedenen CaCl&sub2;-Niveaus durchgeführt, so dass das Ca²&spplus;-Aktivitätsniveau des Systems schrittweise im Bereich von 0,7 bis 9 mmol variiert wird.
Fig. 6 zeigt, wie die Koagulierungszeit (KT) von der Ca²&spplus;-Aktivität abhängt. Dies wird bei Null, 5, 10 und 20 mmol zugegebenen Citrats gezeigt. Das gleiche Experiment, das mit der Zugabe von Null, 5, 10 und 20 mmol Isocitrat durchgeführt wurde, ist in Figur gezeigt.
Die Analyse der Fig. 6 und 7 zeigt, dass sowohl Citrat und Isocitrat die Koagulierung bei allen Ca²&spplus;-Aktivitätsniveaus hemmen. Der inhibitorische Effekt ist jedoch bei Isocitrat geringer als bei Citrat. Das wird sehr deutlich, wenn die Koagulierungszeit bei einem Ca²&spplus;-Aktivitätsniveau gegen die zugegebene finale Konzentration an Citrat oder Isocitrat aufgetragen wird. Für eine Ca²&spplus;-Aktivität von 1,5 wird ein solcher Graph in Fig. 8 dargestellt. Die Fig. 8 zeigt, dass Citrat je molarer Einheit zweimal so inhibitorisch wirkt wie Isocitrat.

Beispiel 7

Eine APTT-Analyse wird in zwei Schritten durchgeführt. Im ersten Schritt wird ein Volumen mit Citrat an der Koagulierung gehemmten Plasmas mit einem Volumenaktivator/Cephalinlösung gemischt und die Mischung wird für fünf Minuten inkubiert. Im zweiten Schritt wird ein Volumen einer 25 mmol CaCl&sub2;-Lösung hinzugegeben und die Koagulierungszeit aufgezeichnet. Dieser Test wurde erfindungsgemäß durch Verwendung von 25 mmol CaCl&sub2;-Lösung modifiziert, die auch 30 mmol Isocitrat enthielt. Nachfolgend wird die Aktivator/Cephalinlösung und 25 mmol CaCl&sub2;-Lösung als originales APTT-Reagens bezeichnet und die Aktivator/Cephalinlösung und 25 mmol CaCl&sub2;-Lösung mit 30 mmol Isocitrat als modifizierte APPT-Reagens.
Die Calciumionenaktivität in der Zwei-Schritt-Lösung, d. h. die finale Calciumionenaktivität, beträgt 2,73 ± 0,20 mmcl beim originalen APTT-Reagens und 1,60 ±0,07 mmol bei dem modifizierten.
Sowohl mit dem ursprünglichen wie dem modifizierten APTT-Reagens wurde citriertes, an der Koagulierung gehemmtes Plasma von 22 normalen Personen und 120 Patienten analysiert. Die durchschnittliche Koagulierungszeit und die SD bei den gesunden Individuen beträgt. 32,5 ±3,0 Sekunden mit dem originalen APTT-Reagens und 4,4 ±4,6 Sekunden mit dem modifizierten. Mit diesem Durchschnitt und den SD-Werten kann die Abweichung von der Norm bei den Patienten ausgerechnet werden, indem der Durchschnitt des normalen APTT vom Patienten APTT abgezogen wird und die Differenz durch die normale SD geteilt wird.
Beim ursprünglichen APTT ist die durchschnittliche Abweichung vom Normalen und die SD 3,6 ±5,0. Bei dem modifizierten APTT-Reagens ist der entsprechende Wert 4,3 ±5,7. Diese Differenz ist statistisch gemäß des Two-tailed Student's T-Test statistisch hochsignifikant, p < 0,006. Das heißt, dass die Patienten APTT eine stärkere Abweichung mit dem erfindungsgemäßen APTT-Reagens, als mit dem APTT-Reagens gemäß des Stands der Technik zeigt.

Claims

1. Verfahren zur Verhinderung der Koagulation eines Blut-, Blutplasma- oder Synovialflüssigkeitsprodukts, umfassend den Schritt der Hinzugabe einer effektiven Menge von 15 bis 50 mmol Isocitrat je Liter des antikoagulierten Blutprodukts oder 25 bis 70 mmol je Liter des antikoagulierten Blutplasma- oder Synovialflüssigkeitsprodukts.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, welches zusätzlich den Schritt der Regulierung der Calciumionenaktivität des antikoagulierten Produkts mit einem löslichen Kalziumsalz bis auf ein physiologisches Niveau umfasst.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die antikoagulierende Wirkung verstärkt wird, oder die effektive Menge an Isocitrat durch die Hinzugabe von Citrat oder einer den pH-Wert senkenden Substanz, die aus Isozitronenäure und Zitronensäure ausgewählt wird, reduziert wird.

4. Antikoaguliertes Blut-, Blutplasma- oder Synovialflüssigkeitsprodukt, das eine antikoagulierende Menge von 15 bis 50 mmol Isocitrat je Liter des antikoagulierten Blutprodukts oder 25 bis 70 mmol je Liter des antikoagulierten Blutplasma- oder Synovialflüssigkeitsprodukts enthält.

5. Antikoaguliertes Blut-, Blutplasma- oder Synovialflüssigkeitsprodukt gemäß Anspruch 4, das außerdem ein lösliches Kalziumsalz in einer Menge enthält, das die Calciumionenaktivität des antikoagulierten Produkts auf physiologische Niveaus einstellt.

6. Antikoaguliertes Blut-, Blutplasma- oder Synovialflüssigkeitsprodukt gemäß Anspruch 4 oder 5, wobei die Menge des Isocitrats durch die Hinzugabe einer den pH senkenden Menge an Citrat oder einer den pH senkenden Substanz, die aus Isozitronensäure und Zitronensäure ausgewählt wird, reduziert wird.

7. Verwendung von Isocitrat in Mengen, die in Ansprüchen 4 bis 6 angegeben sind, zur Antikoagulation eines Blut-, Blutplasma- oder Synovialflüssigkeitsprodukts während des Transports und der Lagerung des Produkts.

8. Verwendung gemäß Anspruch 7, wobei das transportierte und gelagerte Produkt zur Transfusion in einen Patienten benutzt wird.

9. Verwendung eines antikoagulierten Blut-, Blutplasma- oder Synovialflüssigkeitsprodukts gemäß einem der Ansprüche 4 bis 6 zur Analyse der hämostatischen oder Koagulationseigenschaften des Produkts.

10. Blutkonservenbehälter umfassend eine Lösung einer 0,15 bis 0,5 M Isocitratlösung in einem Volumen von einem Zehntel des Behältervolumens.

11. Blutkonservenbehälter gemäß Anspruch 10, der zusammen mit dem Isocitrat außerdem eine effektive Menge an Kalziumchlorid umfasst, eine Calciumionenaktivität von bis zu 1 mmol ergebend.

12. Blutkonservenbehälter gemäß einem der Ansprüche 10 bis 11, wobei die Menge des Isocitrats zusammen mit einer Menge an Citrat oder einer pH senkenden Substanz, ausgewählt aus Isozitronensäure und Zitronensäure, ausreicht, das Volumen des Bluts, das im Behälter enthalten sein soll, in der Koagulation zu hemmen.