DE69733150T2

DE69733150T2 - Verfahren zur herstellung von nukleotiden oder oligonukleotiden phosphoramitiden

Info

Publication number: DE69733150T2
Application number: DE69733150T
Authority: DE
Inventors: H. Richard GRIFFEY; L. Douglas COLE; Vasulinga Ravikumar
Original assignee: Isis Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Ionis Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1996-12-27
Filing date: 1997-12-16
Publication date: 2006-03-02
Anticipated expiration: 2017-12-17
Also published as: JP2000509724A; WO1998029429A1; EP0948514B1; DE69733150D1; JP3675847B2; ATE294186T1; EP0948514A4; EP0948514A1; AU5529398A; US5955600A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft neue Verfahren zur Herstellung von Phosphoramiditen und Oligophosphoramiditen. Die Verfahren sind, inter alia, zur Herstellung von Phosphoramiditen geeignet, die wiederum bei der Synthese von diagnostischen Oligonucleotidreagentien, Forschungsreagentien und therapeutischen Mitteln geeignet sind.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Es ist gut bekannt, dass die meisten der körperlichen Zustände bei Säugern, einschließlich der meisten Krankheitszustände, von Proteinen beeinflusst werden. Solche Proteine, die entweder direkt oder über ihre Enzymfunktionen wirken, haben großen Anteil an vielen Krankheiten bei Tieren und beim Menschen bei. Die klassischen Therapeutika haben sich bei den Bestrebungen, ihre krankheitsverursachenden oder krankheitspotenzierenden Funktionen zu moderieren, im Allgemeinen auf Wechselwirkungen mit solchen Proteinen konzentriert. Neuerdings allerdings wurden Versuche unternommen, die eigentliche Produktion solcher Proteine durch Wechselwirkungen mit Molekülen, die ihre Synthese steuern, wie intrazelluläre DNA, zu moderieren. Es besteht die Hoffnung, durch Eingreifen in die Produktion von Proteinen, die therapeutischen Ergebnisse mit maximaler Wirkung und minimalen Nebenwirkungen zu beeinflussen. Das allgemeine Ziel solcher therapeutischer Wege besteht darin, in die Genexpression, die zu unerwünschter Proteinbildung führt, einzugreifen oder sie anderweitig zu modulieren.
Ein Verfahren zur Hemmung der spezifischen Genexpression besteht in der Verwendung von Oligonucleotiden und Oligonucleotid-Analogen als "Antisense"-Mittel. Eingesetzt werden die Oligonucleotide oder Oligonucleotid-Analoge, die zu einer spezifischen Ziel-Messenger-RNA (mRNA)-Sequenz komplementär sind. Die Antisense-Methode betrifft oft die komplementäre Hybridisierung von relativ kurzen Oligonucleotiden und Oligonucleotid-Analogen zu einzelsträngiger mRNA oder einzelsträngiger DNA, derart, dass die normalen essentiellen Funktionen dieser intrazellulären Nucleinsäuren unterbunden werden. Die Hybridisierung ist das sequenzspezifische Wasserstoffbrückenbinden von Oligonucleotiden oder Oligonucleotid-Analogen an Watson-Crick-Basenpaare von RNA oder einzelsträngiger DNA. Es wird gesagt, dass solche Basenpaare komplementär zueinander sind.
Die bisherigen Versuche in der Antisense-Therapie haben Oligonucleotide oder Oligonucleotid-Analoge bereitgestellt, die dazu ausgelegt sind, auf spezifische Weise durch Hybridisierung an eine spezifische mRNA zu binden (d.h. Oligonucleotide, die mit einer Ziel-mRNA spezifisch hybridisierbar sind). Solche Oligonucleotide und Oligonucleotid-Analoge sollen die Aktivität der gewählten mRNA durch einen beliebigen aus einer Anzahl von Mechanismen hemmen, d.h. in die Translationsreaktionen eingreifen, durch die Proteine, die durch die mRNA kodiert werden, erzeugt werden. Es gestand die Hoffnung, dass die Hemmung der Bildung der spezifischen Proteine, die durch die mRNA-Sequenzen, in die eingriffen wird, kodiert werden, zu therapeutischen Vorteilen führt; allerdings sind immer noch Probleme zu lösen. Siehe allgemein Cook, P. D. Anti-Cancer Drug Design 1991, 6, 585; Cook, P. D. Medicinal Chemistry Strategies for Antisense Research, in Antisense Research & Applications, Crooke, et al., CRC Press, Inc.; Boca Raton, FL, 1993; Uhlmann, et al., A. Chem. Rev. 1990, 90, 543.
Oligonucleotide und Oligonucleotid-Analoge sind nun als viel versprechende therapeutische Mittel für therapeutische und diagnostische Verfahren akzep tiert. Allerdings erfordern die Anwendungen von Oligonucleotiden und Oligonucleotid-Analogen als Antisense-Mittel für therapeutische Zwecke, diagnostische Zwecke und als Forschungsreagentien oft, dass die Oligonucleotide oder Oligonucleotid-Analoge in großen Mengen synthetisiert werden, über die Zellmembranen transportiert oder von Zellen aufgenommen werden, an Ziel-RNA oder Ziel-DNA entsprechend hybridisieren und anschließend die Nucleinsäurefunktion stoppen oder unterbinden. Diese kritischen Funktionen hängen von der Anfangsstabilität der Oligonucleotide und Oligonucleotid-Analoge gegenüber einem Nucleaseabbau ab.
Ein schwerwiegender Mangel von unmodifizierten Oligonucleotiden für diese Zwecke, insbesondere für Antisense-Therapeutika, besteht im enzymatischen Abbau der verabreichten Oligonucleotide durch eine Vielzahl von intrazellulären und extrazellulären ubiquitären nucleolytischen Enzymen.
Eine Anzahl von chemischen Modifikationen wurde bereits in Antisense-Mittel (d.h. Oligonucleotide und Oligonucleotid-Analoge) eingebaut, um ihre therapeutische Aktivität zu steigern. Solche Modifikationen sind zur Erhöhung der Zellpenetration der Antisense-Mittel, zur Stabilisierung der Antisense-Mittel gegenüber Nucleasen und anderen Enzymen, die ihre Struktur oder Aktivität im Körper abbauen oder beeinträchtigen, zur Verstärkung des Bindens der Antisense-Mittel an Ziel-RNA, zur Bereitstellung eines Unterbindungsmodus (Terminierungsereignis), nachdem die Antisense-Mittel sequenzspezifisch an Ziel-RNA gebunden wurden, und zur Verbesserung der pharmakokinetischen und pharmakodynamischen Eigenschaften der Antisensemittel ausgelegt. Es ist unwahrscheinlich, dass unmodifizierte, "Wildtyp", Oligonucleotide geeignete therapeutische Mittel sind, da sie sehr schnell durch Nucleasen abgebaut werden.
Die möglichen Anwendungen dieser Oligonucleotide und ihrer modifizierten Derivate als Arzneimittel haben neue Herausforderungen bei der großtechnischen Synthese dieser Verbindungen entstehen lassen.
Die Festphasensynthese von Oligonucleotiden ist von Natur aus insofern materialintensiv als mehr als ein Äquivalent von nucleotidischen Phosphoramidit-Synthonen verwendet wird, vermutlich, um die Reaktion bis zur Vollständigkeit voran zu treiben. Angesicht der sehr großen Mengen an Oligonucleotidsynthesen, die für Forschungsanwendungen und zur großtechnischen Herstellung entsprechend der klinischen Tests durchgeführt werden, ist die Verwendung von teuren Nucleosid-Phosphoramiditen ein wesentliches wirtschaftliches und ökologisches Problem. Dieses Problem wird akuter, wenn das Monomer über eine mehrstufige Synthese synthetisiert werden muss, bevor das Phosphoramidit-Stadium erreicht ist, wie im Falle der Verwendung modifizierter Zucker- oder Nucleobase-enthaltender Synthone in Oligonucleotid-Therapeutika.
W. K.-D. Brill, Tetrahedron Letters 35(19), Ss. 3041–3044, 1994, beschreibt die Gewinnung von vollständig geschützten Nucleosiden aus DNA-Synthesegerät-Abwässern.
In der Technik bedarf es immer noch synthetischer Verfahren, wobei es nicht erforderlich ist, dass eine große Menge an Phosphoramidit-Reagens vergeudet wird. Die vorliegende Erfindung behandelt dieses als auch andere Bedürfnisse.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Verfahren zur Gewinnung von Phosphoramiditen aus Abfallprodukten der traditionellen Phosphoramidit-Synthese. Bei den bevorzugten Ausführungsformen werden Verfahren zur Herstellung von Phosphoramiditen bereitgestellt, umfassend die Schritte:
Umsetzen einer Verbindung der Formel:
wobei:
Z eine Interzuckerverknüpfung ist;
R₁ eine Hydroxyl-Schutzgruppe ist;
R₂ H, OH, O-Alkyl, O-Alkylamino, O-Alkylalkoxy, ein Polyether der Formel (O-Alkyl)_m, wobei m 1 bis 10 ist, oder eine geschützte Hydroxylgruppe ist;
R₃ eine Phosphoryl-Schutzgruppe ist;
B eine Nucleobase ist; und
n 0 bis 100 ist;
mit einer Verbindung der Formel:
wobei
X₁ Br oder Cl ist;
X₂ und X₃ unabhängig H, Br oder Cl sind;
X und Y jeweils unabhängig 2 oder 3 sind und die Summe von X und Y 5 ist; und
Zusammenbringen des Produkts der Reaktion mit einer Verbindung der Formel HN(Q)₂ unter Erhalt eines Phosphoramidits der Formel:
Bei einigen bevorzugten Ausführungsformen ist Q Alkyl, vorzugsweise Isopropyl.
R₂ ist vorzugsweise H, eine geschützte Hydroxylgruppe, O-Alkyl oder O-Alkylalkoxy. Bei mehr bevorzugten Ausführungsformen ist R₂ Methoxyethoxy. Bei einigen bevorzugten Ausführungsformen ist R₃ Cyanoethyl, 4-Cyano-2-butenyl oder Diphenylmethylsilylethyl. Vorzugsweise ist x 3, und y ist 2.
Bei den bevorzugten Ausführungsformen wird die Umsetzung in einem Lösungsmittel durchgeführt, das vorzugsweise Acetonitril ist.
Bei einigen bevorzugten Ausführungsformen ist die Nucleobase Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin, Uracil, 5-Methylcytosin oder ein geschütztes Derivat davon.
Bei weiteren bevorzugten Ausführungsformen ist Z eine Phosphodiesterverknüpfung, eine Phosphorothioatverknüpfung, eine Phosphorodithioatverknüpfung; oder eine Phosphonatverknüpfung. Bei den besonders bevorzugten Ausführungsformen ist Z eine Phosphodiesterverknüpfung oder eine Phosphorothioatverknüpfung.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die vorliegende Erfindung zeigt neue Verfahren zur Herstellung von Phosphoramiditen auf. Die Verfahren sind zur Gewinnung einer breiten Vielzahl von Spezies geeignet, die als Abfallprodukte bei der Oligonucleotidsynthese produziert werden. Bei den bevorzugten Ausführungsformen werden Verfahren zur Herstellung von Phosphoramiditen der Formel:
bereitgestellt, wobei Z eine Internucleosidverknüpfung ist; R₁ eine Hydroxyl-Schutzgruppe ist; R₂ H, Halogen, OH, O-Alkyl, O-Alkylamino, O-Alkylalkoxy, ein Polyether der Formel (O-Alkyl)_m ist, wobei m 1 bis 10 ist, oder eine geschützte Hydroxylgruppe ist; R₃ eine Phosphoryl-Schutzgruppe ist; B eine Nucleobase ist; n 0 bis 100 ist und Q jeweils unabhängig Alkyl mit 1 bis 15 Kohlenstoffen, Aryl mit 6 bis 14 Kohlenstoffen bedeutet oder (Q)₂ zusammen mit dem Phosphoamidit-Stickstoff einen heterocyclischen Ring mit 2 bis 10 Kohlenstoffen bilden kann. Die Verfahren umfassen die Schritte der Umsetzung einer Verbindung der Formel I oder II:
mit einem Halogenphenoxychlorphosphoran der Formel III:
wobei:
X₁ Br oder Cl ist;
X₂ und X₃, unabhängig, H, Br oder Cl sind;
X und Y unabhängig 2 oder 3 bedeuten, wobei die Summe von x und y 5 ist; und
Zusammenbringen des Produkts der Reaktion mit einer Verbindung der Formel HN(Q)₂.
Die Verbindungen der Formel I oder II können aus überschüssigen Phosphoramiditreagens-Abfällen stammen, die bei der traditionellen Oligonucleotidsynthese verwendet werden, wie beispielsweise in Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Eckstein, F., Hrsg. IRL Press, Oxford, U.K. 1991 beschrieben.
Bei einer typischen Oligonucleotid-Synthesevorschrift wird das freie 5-Hydroxyl der wachsenden Oligonucleotidkette mit einem siebenfachen molaren Überschuss des Nucleosids N,N-Dialkylphosphoramidit in Gegenwart von überschüssigem Tetrazol umgesetzt. Es wird angenommen, dass der Tetrazol-Katalysator zuerst die sekundäre Aminogruppe des Phosphoramidits unter Bildung eines Tetrazolid-Addukts verdrängt. Anschließend reagiert das Tetrazolid mit dem freien 5'-Hydroxyl der wachsenden Kette unter Bildung eines Phosphits, das anschließend, beispielsweise durch Oxidation, in die gewünschte Verknüpfung, übergeführt wird. Das überschüssige (d.h. nicht umgesetzte) Tetrazolid-Addukt wird aus der Reaktionskammer ausgewaschen und reagiert anschließend mit dem Umgebungswasser unter Bildung einer H-Phosphonatspezies, die durch die Formel I dargestellt ist, die im Gleichgewicht mit ihrem Tautomer, das durch die Formel II dargestellt ist, existiert. Somit stellt die vorliegende Erfindung bei einem Aspekt ein zweckmäßiges Verfahren zur Gewinnung von Phosphoramidit-Synthonen aus Abfallprodukten der Oligonucleotidsynthese bereit.
Die erfindungsgemäßen Verfahren stellen wesentliche wirtschaftliche und ökologische Vorteile bei der Oligonucleotidsynthese bereit. Obgleich die Festlegung auf eine bestimmte Theorie nicht gewünscht ist, wird angenommen, dass die Phosphonat-Spezies (Formel I) und ihr Phosphit-Tautomer (Formel II) in Lösung im Gleichgewicht existieren, wobei die Phosphonat-Spezies stark begünstigt ist. Es wird angenommen, dass das Halogenphenoxychlorphosphoran, vorzugsweise Tris(2,4,6-tribromphenoxy)dichlorphosphoran oder Bis[2,4,6-tribromphenoxy]trichlorphosphoran, vorzugsweise mit der Phosphitspezies unter Bildung eines Halogenid-Addukts reagiert, das anschließend unter Bildung des Phosphoramiditprodukts mit einem sekundären Amin reagiert. Demnach können die erfindungsgemäßen Verfahren zweckmäßigerweise in einem einzigen Reaktionsbehälter oder in Stufen durchgeführt werden.
Die Synthone der Formel I oder II stammen von einer aus der breiten Vielzahl von Phosphoramidit-Spezies ab, die bei der Phosphoramidit-Oligomersynthese verwendet werden können. Die Synthone können demnach monomere, dimere oder Synthone höherer Ordnung (d.h. Oligophosphoramidite) sein, und können eines aus der breiten Vielzahl von Internucleosidverknüpfungen, Zuckern, Nucleobasen und modifizierten Derivaten davon, die aus der Technik bekannt sind, umfassen.
Beispiele für die Internucleosidverknüpfungen, die in den Synthonen der Formel I oder II zugegen sein können, umfassen Phosphodiester-, Phosphorothioat-, Phosphorodithioat- und Phosphonatverknüpfungen. Weitere repräsentative Internucleotidverknüpfungen umfassen Amid- oder substituierte Amidverknüpfungen, wie diejenigen, die beschrieben sind bei Waldner et al., Synlett, 1, 57–61 (1994), De Mesmaeker et al., Synlett, 10, 733–736 (1993), Lebreton et al., Synlett, 2, 137–140 (1994), De Mesmaeker et al., Bioorg. Medic. Chem. Lett. 4, 395–398 (1994), De Mesmaeker et al., Bioorg. Medic. Chem. Lett. 4, 873–878 (1994), Lebreton et al., Tet. Letters 34, 6383–6386 (1993), Lebreton et al., Tet. Letters 35, 5225–5228 (1994), Waldner et al., Bioorg. Medic. Chem. Lett. 4, 405–408 (1994), und die Verknüpfungen, die in der U.S.-Patentschrift Nr. 5,489,677, U.S.-Serien-Nr. 08/317,289, eingereicht am 3. Oktober 1994, U.S.-Serien-Nr. 08/395,168, eingereicht am 27. Februar 1995, beschrieben sind.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Begriff "Oligonucleotid" auf eine Vielzahl von verknüpften Nucleotideinheiten, die in einer spezifischen Sequenz ausgebildet sind. Der Begriff Nucleotid besitzt seine gewohnte Bedeutung als Phosphorylester eines Nucleosids. Der Begriff "Nucleosid" besitzt ebenfalls seine gewohnte Bedeutung als Pentafuranosylzucker, der an eine nucleosidische Base (d.h. eine stickstoffhaltige heterocyclische Base oder "Nucleobase") gebunden ist.
Es wird davon ausgegangen, dass die erfindungsgemäßen Verfahren zur Synthese von Phosphoramiditen mit sowohl natürlich vorkommenden als auch nicht natürlich vorkommenden Zuckerbestandteilen, Internucleosidverknüpfungen und/oder Nucleobasen (d.h. nucleosidische Basen) verwendet werden können. Nicht natürlich vorkommende Zucker, Internucleosidverknüpfungen und Nucleobasen sind typischerweise strukturell unterscheidbar von den dennoch funktionell damit austauschbaren, natürlich vorkommenden Zuckern (z.B. Ribose und Deoxyribose), Internucleosidverknüpfungen (d.h. Phosphodiesterverknüpfungen), und nucleosidischen Basen (d.h. Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin). Somit umfassen die nicht natürlich vorkommenden Gruppierungen sämtliche derartigen Strukturen, die die Struktur und/oder Funktion der natürlich vorkommenden Gruppierungen nachahmen und die das Binden des Oligonucleotid-Analogs an ein Ziel unterstützen oder anderweitig in vorteilhafter Weise zu den Eigenschaften des Phosphorothioat-Oligomers beitragen.
Repräsentative Beispiele für nicht natürlich vorkommende Zucker umfassen Zucker mit einem aus einer Vielzahl von Substituenten, die über ihre 2'-Positionen verknüpft sind. Diese umfassen beispielsweise Halogenide, O-Alkyl, O-Alkylamino, O-Alkylalkoxy, geschütztes O-Alkylamino, O-Alkylaminoalkyl, O-Alkylimidazol und Polyether der Formel (O-Alkyl)_m, wo bei m 1 bis etwa 10 ist. Bevorzugt unter diesen Polyethern sind lineare und cyclische Polyethylenglycole(PEGs) und (PEG)-enthaltende Gruppen, wie Kronenether, und diejenigen, die von Ouchi et al., Drug Design und Discovery 1992, 9, 93, Ravasio, et al., J. Org. Chem, 1991, 56, 4329 und Delgardo et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 1992, 9, 249 offenbart sind. Weitere Zuckermodifikationen sind bei Cook, P. D., supra, offenbart. Die Fluor-, O-Alkyl-, O-Alkylamino-, O-Alkylimidazol-, O-Alkylaminoalkyl- und Alkylaminosubstitution ist in der U.S.-Anmeldung mit der Serien-Nr. 08/398,901, eingereicht am 6. März 1995, mit dem Titel Oligomeric Compounds having Pyrimidine Nucleotide(s) with 2' und 5' Substitutions beschrieben.
Zucker mit O-Substitutionen am Ribosylring sind ebenfalls für die vorliegende Erfindung geeignet. Repräsentative Substitutionen für Ring-O umfassen S, CH₂, CHF und CF₂, siehe z.B. Secrist, et al., Abstract 21, Program & Abstracts, Tenth International Roundtable, Nucleosides, Nucleotides and their Biological Applications, Park City, Utah, Sept. 16–20, 1992.
Repräsentative Nucleobasen, die zur Verwendung bei den erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, umfassen Adenin, Guanin, Cytosin, Uridin und Thymin sowie andere nicht natürlich vorkommende und natürliche Nucleobasen, wie Xanthin, Hypoxanthin, 2-Aminoadenin, 6-Methyl- und andere Alkylderivate von Adenin und Guanin, 2-Propyl- und andere Alkylderivate von Adenin und Guanin, 5-Halogenuracil und Cytosin, 6-Azouracil, Cytosin und Thymin, 5-Uracil (Pseudouracil), 4-Thiouracil, 8-Halogen-, Oxa-, Amino-, Thiol-, Thioalkyl-, Hydroxyl- und andere 8-substituierte Adenine und Guanine, 5-Trifluormethyl- und andere 5-substituierte Uracile und Cytosine, 7-Methylguanin. Weitere natürlich und nicht natürlich vorkommende Nucleobasen umfassen diejenigen, die in der U.S.-Patentschrift Nr. 3,687,808 (Merigan, et al.), von Sanghvi Y. in Kapitel 15 von Antisense Research and Application, Ed. S. T. Crooke and B. Lebleu, CRC Press, 1993, bei Englisch et al., Angewandte Chemie, Internationale Ausgabe, 1991, 30, 613–722 (siehe ins besondere Seiten. 622 und 623), in Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, J. I. Kroschwitz Hrsg., John Wiley & Sons, 1990, Seiten 858–859 und in Cook, P. D., Anti-Cancer Drug Design, 1991, 6, 585–607, offenbart sind. Die Begriffe "nucleosidische Base" und "Nucleobase" sollen weiterhin heterocyclische Verbindungen umfassen, die als nucleosidische Basen dienen können, einschließlich bestimmter 'universeller Basen', die im strengen klassischen Sinn keine nucleosidischen Basen sind, sondern ähnlich wie nucleosidische Basen funktionieren. Ein repräsentatives Beispiel für eine solche universelle Base ist 3-Nitropyrrol.
R₁ ist eine Hydroxyl-Schutzgruppe. Bei den erfindungsgemäßen Verfahren kann eine breite Vielzahl von Hydroxyl-Schutzgruppen angewandt werden. Vorzugsweise ist die Schutzgruppe unter basischen Bedingungen stabil, kann allerdings unter sauren Bedingungen entfernt werden. Repräsentative Hydroxyl-Schutzgruppen sind bei Beaucage et al., Tetrahedron 1992, 48, 2223–2311 und auch bei Green und Wuts Protective Groups in Organic Synthesis, 2. Ausgabe, John Wiley & Sons, New York, 1991, in Kapitel 2 offenbart. Bevorzugte Schutzgruppen, die für R₁ verwendet werden, umfassen Dimethoxytrityl (DMT), Monomethoxytrityl, 9-Phenylxanthen-9-yl (Pixyl) und 9-(p-Methoxyphenyl)xanthen-9-yl (Mox). Die R₁-Gruppe kann aus den erfindungsgemäßen oligomeren Verbindungen durch aus der Technik gut bekannte Techniken zur Bildung des freien Hydroxyls entfernt werden. Beispielsweise können Dimethoxytritiyl-Schutzgruppen durch protische Säuren, wie Ameisensäure, Dichloressigsäure, Trichloressigsäure, p-Toluosulfonsäure, oder Lewis-Säuren, wie beispielsweise Zinkbromid, entfernt werden.
R₃ ist eine Phosphoryl-Schutzgruppe. Die Phosphoryl-Schutzgruppe ist an den Phosphor-gebundenen Sauerstoff gebunden und dient dem Schutz des Phosphors während der Oligonucleotidsynthese. Siehe Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, supra. Eine repräsentative Phosphoryl-Schutzgruppe ist die Cyanoethylgruppe. Weitere repräsentative Phosphoryl- Schutzgruppen umfassen 4-Cyano-2-butenylgruppen, Methyl- und Diphenylmethylsilylethyl(DPSE)-Gruppen.
Im Allgemeinen werden die Schutzgruppen bei den erfindungsgemäßen Oligonucleotidsyntheseverfahren zum Schutze mehrerer verschiedener Funktionalitätstypen verwendet. Im Allgemeinen machen die Schutzgruppen eine chemische Funktionalität gegenüber spezifischen Reaktionsbedingungen inert und können an eine solche Funktionalität in einem Molekül ohne nennenswerte Beschädigung des Restes des Moleküls angefügt und davon entfernt werden. Repräsentative Schutzgruppen, die zum Schutze der Nucleotide während der Phosphorothioatsynthese nützlich sind, umfassen basenlabile Schutzgruppen und säurelabile Schutzgruppen. Basenlabile Schutzgruppen werden zum Schutze der exocyclischen Aminogruppen der heterocyclischen Nucleobasen verwendet. Dieser Typ von Schutz wird im Allgemeinen durch Acylierung erzielt. Zwei üblicherweise verwendete Acylierungsgruppen sind Benzoylchlorid und Isobutyrylchlorid. Diese Schutzgruppen sind gegenüber den Reaktionsbedingungen, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren angewandt werden, und während der Oligonucleotidsynthese stabil und werden bei ungefähr gleichen Geschwindigkeiten während der Basenbehandlung am Ende der Oligonucleotidsynthese abgespalten. Der zweite Typ von Schutz, der ebenfalls bei den erfindungsgemäßen Verfahren angewandt wird, ist eine säurelabile Schutzgruppe, die zum Schutze des Nucleotid-5'-Hydroxyls während der Synthese verwendet wird.
Tris[2,4,6-tribromphenoxy]dichlorphosphoran oder Bis[2,4,6-tribromphenoxy]trichlorphosphoran kann nach dem Verfahren von Hotoda et al., Tetrahedron Letters 1987, 28, (15) 1681–1684, synthetisiert werden.
Bei den erfindungsgemäßen Verfahren reagiert das Produkt der Umsetzung zwischen der Verbindung der Formel I oder II und dem Tribromphenoxychlorphosphoran mit einem sekundären Amin unter Bildung des Phosphoramiditprodukts. Die Substituenten des sekundären Amins können unter den vielen Spezies gewählt werden, die bekanntlich als Phosphoramidit-Stickstoffsubstituenten funktionieren. Repräsentative Beispiele umfassen Niederalkylgruppen, Arylgruppen, cyclische Strukturen, wobei der Phosphoramiditstickstoff Teil eines N-Morpholin-Ringsystems bildet. Bei besonders bevorzugten Ausführungsformen sind die Substituenten Niederalkylgruppen, insbesondere Isopropylgruppen. Weitere Beispiele für geeignete Amine sind in verschiedenen U.S.-Patentschriften beschrieben, im Prinzip in denjenigen von M. Caruthers und Kollegen. Diese umfassen die U.S.-Patentschriften 4,668,777; 4,458,066; 4,415,732; und 4,500,707.
Wie hier verwendet, umfasst der Begriff "Alkyl" geradkettige verzweigte und alicyclische Kohlenwasserstoffgruppen, ist jedoch nicht darauf beschränkt. Die Alkylgruppen für die vorliegende Erfindung können substituiert sein. Repräsentative Alkylsubstituenten sind in der U.S.-Patentschrift Nr. 5,212,295, in Spalte 12, Zeilen 41–50, offenbart.
Wie hier verwendet, bezeichnet der Begriff "Aralkyl" Alkylgruppen, die Arylgruppen, beispielsweise Benzylgruppen, tragen. Der Begriff "Alkaryl" bezeichnet Arylgruppen, die Alkylgruppen tragen, beispielsweise Methylphenylgruppen. "Aryl"-Gruppen sind aromatische cyclische Verbindungen, einschließlich Phenyl, Naphthyl, Anthracyl, Phenanthryl, Pyrenyl und Xylyl, jedoch nicht darauf beschränkt.
Bei einigen bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung sind Aminogruppen an die Alkyl- oder anderen Gruppen angeknüpft, wie beispielsweise 2'-Alkoxygruppen (z.B., wobei R₂ Alkoxy ist). Solche Aminogruppen sind auch üblicherweise in natürlich vorkommenden und nicht natürlich vorkommenden Nucleobasen zugegen. Es ist im Allgemeinen bevorzugt, dass diese Aminogruppen während der Synthese der erfindungsgemäßen oligomeren Verbindungen in geschützter Form vorliegen. Repräsentative Amino-Schutzgruppen, die für diese Zwecke geeignet sind, sind in Kapitel 7 von Green und Wuts, supra, offenbart. Wie hier verwendet, umfasst der Begriff "Nucleobase" im Allgemeinen geschützte Derivate davon.
Oligomere Phosphoramidite, die durch die erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt werden, umfassen vorzugsweise etwa 1 bis etwa 100 monomere Untereinheiten. Es ist mehr bevorzugt, dass solche Verbindungen etwa 1 bis etwa 30 monomere Untereinheiten umfassen, wobei 1 bis 10 monomere Untereinheiten mehr bevorzugt und 1 bis 5 monomere Untereinheiten besonders bevorzugt sind.
HERSTELLUNGSBEISPIEL 1
Herstellung von Tris(2,4,6-tribromphenoxy)dichlorphosphoran
Die Verbindung wurde nach der Verfahrensweise von Hotoda, H. et al., Tetrahedron Letters, 1987, Bd. 28, 1681–1684, synthetisiert.
BEISPIEL 2
Herstellung von 5'-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)thymidin-3'-O-(2-diphenylmethylsilylethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit)
Ein 250-ml-Zweihalskolben, ausgestattet mit einem Magnetrührer, Gaseinlass für Argon und einem Septum, wird unter einer Argonatmosphäre zusammengebaut. Sämtliche Glasgeräte werden 1 h bei 120°C getrocknet. Der Kolben wird mit 5'-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)thymidin-3'-O-(2-diphenylmethylsilylethylphosphonat) (0,015 mol) und Diisopropylamin (0,12 mol) beschickt. Wasserfreies Acetonitril (200 ml) wird zugesetzt. Diesem gerührten Gemisch wird unter Argon bei Raumtemperatur, wird Tris(2,4,6-tribromphenoxy)dichlorphosphoran (0,225 mol) zugesetzt. Nach 3 h Rühren wird das Reaktionsgemisch filtriert und unter reduziertem Druck konzentriert. Das Rohprodukt wird durch Flashchromatographie unter Verwendung von Kieselgel unter Erhalt des gewünschten Produkts gereinigt. Während der Reinigung wird Triethylamin (1%) verwendet. ³¹P-NMR (CDCl₃) 145,5, 146,1.
BEISPIEL 3
Herstellung von N²-Isobutyryl-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-deoxyguanosin-3'-O-(2-diphenylmethylsilylethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit)
Ein 250-ml-Zweihalskolben, ausgestattet mit einem Magnetrührer, Gaseinlass für Argon und einem Septum, wird unter Argonatmosphäre zusammengebaut. Sämtliche Glasgeräte werden 1 h bei 120°C getrocknet. Der Kolben wird mit N²-Isobutyryl-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-deoxyguanosin-3'-O-(2-diphenylmethylsilylethylphosphonat) (0,015 mol) und Diisopropylamin (0,12 mol) beschickt. Wasserfreies Acetonitril (200 ml) wird zugesetzt. Diesem gerührten Gemisch unter Argon bei Raumtemperatur wird Tris(2,4,6-tribromphenoxy)dichlorphosphoran (0,225 mol) zugesetzt. Nach 3 h Rühren wird das Reaktionsgemisch abfiltriert und unter reduziertem Druck konzentriert. Das Rohprodukt wird durch Flashchromatographie unter Verwendung von Kieselgel unter Erhalt des gewünschten Produkts gereinigt. Während der Reinigung wird Triethylamin (1%) verwendet.
BEISPIEL 4
Herstellung von N⁶-Benzoyl-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-deoxyadenosin-3'-O-(2-diphenylmethylsilylethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit)
Ein 250-ml-Zweihalskolben, ausgestattet mit Magnetrührer, Gaseinlass für Argon und einem Septum, wird unter Argonatmosphäre zusammengebaut. Sämtliche Glasgeräte werden 1 h bei 120°C getrocknet. Der Kolben wird mit N⁶-Benzoyl-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-deoxyadenosin-3'-O-(2-diphenylmethylsilylethylphosphonat) (0,015 mol) und Diisopropylamin (0,12 mol) beschickt. Wasserfreies Acetonitril (200 ml) wird zugesetzt. Diesem gerührten Gemisch unter Argon bei Raumtemperatur wird Tris(2,4,6-tribromphenoxy)dichlorphosphoran (0,225 mol) zugesetzt. Nach 3 h Rühren wird das Reaktionsgemisch filtriert und unter reduziertem Druck konzentriert. Das Rohprodukt wird durch Flashchromatographie unter Verwendung von Kieselgel unter Erhalt des gewünschten Produkts gereinigt. Während der Reinigung wird Triethylamin (1%) verwendet.
BEISPIEL 5
Herstellung von N⁴-Benzoyl-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-deoxycytidin-3'-O-(2-diphenylmethylsilylethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit)
Ein 250-ml-Zweihalskolben, ausgestattet mit Magnetrührer, Gaseinlass für Argon und Septum, wird unter einer Argonatmosphäre zusammengebaut. Sämtliche Glasgeräte werden 1 h bei 120°C getrocknet. Der Kolben wird mit N⁴-Benzoyl-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-deoxycytidin-3'-O-(2-diphenylmethylsilylethylphosphonat) (0,015 mol) und Diisopropylamin (0,12 mol) beschickt. Wasserfreies Acetonitril (200 ml) wird zugesetzt. Diesem gerührten Gemisch unter Argon bei Raumtemperatur wird Tris(2,4,6-tribromphenoxy)dichlorphosphoran (0,225 mol) zugesetzt. Nach 3 h Rühren wird das Reaktionsgemisch filtriert und unter reduziertem Druck konzentriert. Das Rohprodukt wird durch Flashchromatographie unter Verwendung von Kieselgel unter Erhalt des gewünschten Produkts gereinigt. Während der Reinigung wird Triethylamin (1%) verwendet.
BEISPIEL 6
2-Diphenylmethylsilylethyl-5'-(O-4,4'-dimethoxytrityl)-thymidinyl-thymidin-Dimer-Amidit
Ein 250-ml-Zweihalskolben, ausgestattet mit einem Magnetrührer, Gaseinlass für Argon und Septum, wird unter Argonatmosphäre zusammengebaut. Sämtliche Glasgeräte werden 1 h bei 120°C getrocknet. Der Kolben wird mit 2-Diphenylmethylsilylethyl-5'-(O-4,4'-dimethoxytrityl)-thymidinyl-thymidin-Dimer-Phosphonat (0,015 mol) und Diisopropylamin (0,12 mol) beschickt. Wasserfreies Acetonitril (200 ml) wird zugesetzt. Diesem gerührten Gemisch unter Argon bei Raumtemperatur wird Tris(2,4,6-tribromphenoxy)dichlorphosphoran (0,225 mol) zugesetzt. Nach 3 h Rühren wird das Reaktionsge misch filtriert und unter reduziertem Druck konzentriert. Das Rohprodukt wird durch Flashchromatographie unter Verwendung von Kieselgel unter Erhalt des gewünschten Produkts gereinigt. Triethylamin (1%) wird während der Reaktion verwendet.
BEISPIEL 7
2-Diphenylmethylsilylethyl-5'-(O-4,4'-dimethoxytrityl)-N4-benzoyl-2'-deoxycytidinyl-thymidin-Dimer-Amidit
Einem 250-ml-Zweihalskolben, ausgestattet mit Magnetrührer, Gaseinlass für Argon und Septum, wird unter einer Argonatmosphäre zusammenbaut. Sämtliche Glasgeräte werden 1 h bei 120°C getrocknet. Der Kolben wird mit 2-Diphenylmethylsilylethyl-5'-(O-4,4'-dimethoxytrityl)-N4-benzoyl-2'-deoxycytidinyl-thymidin-Dimer-Phosphonat (0,015 mol) und Diisopropylamin (0,12 mol) beschickt. Wasserfreies Acetonitril (200 ml) wird zugesetzt. Diesem gerührten Gemisch unter Argon bei Raumtemperatur wird Tris(2,4,6-tribromphenoxy)dichlorphosphoran (0,225 mol) zugesetzt. Nach 3 h Rühren wird das Reaktionsgemisch filtriert und unter reduziertem Druck konzentriert. Das Rohprodukt wird durch Flashchromatographie unter Verwendung von Kieselgel unter Erhalt des gewünschten Produkts gereinigt. Während der Reinigung wird Triethylamin (1%) verwendet.
BEISPIEL 8
2-Diphenylmethylsilylethyl-5'-(O-4,4'-dimethoxytrityl)-N2-isobutyryl-2'-deoxyguanosinyl-thymidin-Dimer-Amidit
Ein 250-ml-Zweihalskolben, ausgestattet mit Magnetrührer, Gaseinlass für Argon und einem Septum, wird unter einer Argonatmosphäre zusammengebaut. Sämtliche Glasgeräte werden 1 h bei 120°C getrocknet. Der Kolben wird mit 2-Diphenylmethylsilylethyl-5'-(O-4,4'-dimethoxytrityl)-N2-isobutyryl-2'-deoxyguanosinyl-thymidin-Dimer-Phosphonat (0,015 mol) und Diisopropylamin (0,12 mol) beschickt. Wasserfreies Acetonitril (200 ml) wird zugesetzt.
Diesem gerührten Gemisch unter Argon bei Raumtemperatur wird Tris(2,4,6-tribromphenoxy)dichlorphosphoran (0,225 mol) zugesetzt. Nach 3 h Rühren wird das Reaktionsgemisch filtriert und unter reduziertem Druck konzentriert. Das Rohprodukt wird durch Flashchromatographie unter Verwendung von Kieselgel unter Erhalt des gewünschten Produkts gereinigt. Während der Reinigung wird Triethylamin (1%) verwendet.
BEISPIEL 9
2-Diphenylmethylsilylethyl-5'-(O-4,4'-dimethoxytrityl)-N6-benzoyl-2'-deoxyadenosinyl-thymidin-Dimer-Amidit
Ein 250-ml-Zweihalskolben, ausgestattet mit Magnetrührer, Gaseinlass für Argon und einem Septum, wird unter einer Argonatmosphäre zusammengebaut. Sämtliche Glasgeräte werden 1 h bei 120°C getrocknet. Der Kolben wird mit 2-Diphenylmethylsilylethyl-5'-(O-4,4'-dimethoxytrityl)-N6-benzoyl-2'-deoxyadenosinyl-thymidin-Dimer-Phosphonat (0,015 mol) und Diisopropylamin (0,12 mol) beschickt. Wasserfreies Acetonitril (200 ml) wird zugesetzt. Diesem gerührten Gemisch unter Argon bei Raumtemperatur wird Tris(2,4,6-tribromphenoxy)dichlorphosphoran (0,225 mol) zugesetzt. Nach 3 h Rühren wird das Reaktionsgemisch filtriert und unter reduziertem Druck konzentriert. Das Rohprodukt wird durch Flashchromatographie unter Verwendung von Kieselgel unter Erhalt des gewünschten Produkts gereinigt. Während der Reinigung wird Triethylamin (1%) verwendet.
BEISPIEL 10
2-Diphenylmethylsilylethyl-5'-(O-4,4'-dimethoxytrityl)-N2-isobutyryl-2'-deoxyguanosinyl-N6-benzoyl-2'-deoxyadenosinyl-Dimer-Amidit
Ein 250-ml-Zweihalskolben, ausgestattet mit Magnetrührer, Gaseinlass für Argon und einem Septum, wird unter einer Argonatmosphäre zusammengebaut. Sämtliche Glasgeräte werden 1 h bei 120°C getrocknet. Der Kolben wird mit 2-Diphenylmethylsilylethyl-5'-(O-4,4'-dimethoxytrityl)-N2-isobutyryl- 2'-deoxyguanosinyl-N6-benzoyl-2'-deoxyadenosinyl-Dimer-Phosphonat (0,015 mol) und Diisopropylamin (0,12 mol) beschickt. Wasserfreies Acetonitril (200 ml) wird zugesetzt. Diesem gerührten Gemisch unter Argon bei Raumtemperatur wird Tris(2,4,6-tribromphenoxy)dichlorphosphoran (0,225 mol) zugesetzt. Nach 3 h Rühren wird das Reaktionsgemisch filtriert und unter reduziertem Druck konzentriert. Das Rohprodukt wird durch Flashchromatographie unter Verwendung von Kieselgel unter Erhalt des gewünschten Produkts gereinigt. Während der Reinigung wird Triethylamin (1%) verwendet.
BEISPIEL 11
Herstellung von 5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)uridin-2'-O-methoxyethyl-3'-O-(2-diphenylmethylsilylethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit)
Ein 250-ml-Zweihalskolben, ausgestattet mit Magnetrührer, Gaseinlass für Argon und einem Septum, wird unter einer Argonatmosphäre zusammengebaut. Sämtliche Glasgeräte werden 1 h bei 120°C getrocknet. Der Kolben wird mit 5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)uridin-2'-O-methoxyethyl-3'-O-(2-diphenylmethylsilylethylphosphonat) (0,015 mol) und Diisopropylamin (0,12 mol) beschickt. Wasserfreies Acetonitril (200 ml) wird zugesetzt. Diesem gerührten Gemisch unter Argon bei Raumtemperatur wird Tris(2,4,6-tribromphenoxy)dichlorphosphoran (0,225 mol) zugesetzt. Nach 3 h Rühren wird das Reaktionsgemisch filtriert und unter reduziertem Druck konzentriert. Das Rohprodukt wird durch Flashchromatographie unter Verwendung von Kieselgel unter Erhalt des gewünschten Produkts gereinigt. Während der Reinigung wird Triethylamin (1%) verwendet. ³¹P-NMR (CDCl₃) 145,5, 146,1.
BEISPIEL 12
Herstellung von N²-Isobutyryl-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-O-methoxyethylguanosin-3'-O-(2-diphenylmethylsilylethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit)
Ein 250-ml-Zweihalskolben, ausgestattet mit Magnetrührer, Gaseinlass für Argon und einem Septum, wird unter einer Argonatmosphäre zusammengebaut. Sämtliche Glasgeräte werden 1 h bei 120°C getrocknet. Der Kolben wird mit N²-Isobutyryl-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-O-methoxyethylguanosin-3'-O-(2-diphenylmethylsilylethylphosphonat) (0,015 mol) und Diisopropylamin (0,12 mol) beschickt. Wasserfreies Acetonitril (200 ml) wird zugesetzt. Diesem gerührten Gemisch unter Argon bei Raumtemperatur wird Tris(2,4,6-tribromphenoxy)dichlorphosphoran (0,225 mol) zugesetzt. Nach 3 h Rühren wird das Reaktionsgemisch filtriert und unter reduziertem Druck konzentriert. Das Rohprodukt wird durch Flashchromatographie unter Verwendung von Kieselgel unter Erhalt des gewünschten Produkts gereinigt. Während der Reinigung wird Triethylamin (1%) verwendet.
BEISPIEL 13
Herstellung von N⁶-Benzoyl-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-O-methoxyethyladenosin-3'-O-(2-diphenylmethylsilylethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit)
Ein 250-ml-Zweihalskolben, ausgestattet mit einem Magnetrührer, Gaseinlass für Argon und Septum, wird unter einer Argonatmosphäre zusammengebaut. Sämtliche Glasgeräte werden 1 h bei 120°C getrocknet. Der Kolben wird mit N⁶-Benzoyl-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-O-methoxyethyladenosin-3'-O-(2-diphenylmethylsilylethylphosphonat) (0,015 mol) und Diisopropylamin (0,12 mol) beschickt. Wasserfreies Acetonitril (200 ml) wird zugesetzt. Diesem gerührten Gemisch unter Argon bei Raumtemperatur wird Tris(2,4,6-tribromphenoxy)dichlorphosphoran (0,225 mol) zugesetzt. Nach 3 h Rühren wird das Reaktionsgemisch filtriert und unter reduziertem Druck konzentriert. Das Rohprodukt wird durch Flashchromatographie unter Verwendung von Kieselgel unter Erhalt des gewünschten Produkts gereinigt. Während der Reinigung wird Triethylamin (1%) verwendet.
BEISPIEL 14
Herstellung von N⁴-Benzoyl-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-O-methoxyethylcytidin-3'-O-(2-diphenylmethylsilylethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit)
Ein 250-ml-Zweihalskolben, ausgestattet mit einem Magnetrührer, Gaseinlass für Argon und Septum, wird unter einer Argonatmosphäre zusammengebaut. Sämtliche Glasgeräte werden 1 h bei 120°C getrocknet. Der Kolben wird mit N⁴-Benzoyl-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-O-methoxyethylcytidin-3'-O-(2-diphenylmethylsilylethylphosphonat) (0,015 mol) und Diisopropylamin (0,12 mol) beschickt. Wasserfreies Acetonitril (200 ml) wird zugesetzt. Diesem gerührten Gemisch unter Argon bei Raumtemperatur wird Tris(2,4,6-tribromphenoxy)dichlorphosphoran (0,225 mol) zugesetzt. Nach 3 h Rühren wird das Reaktionsgemisch filtriert und unter reduziertem Druck konzentriert. Das Rohprodukt wird durch Flashchromatographie unter Verwendung von Kieselgel unter Erhalt des gewünschten Produkts gereinigt. Während der Reinigung wird Triethylamin (1%) verwendet.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines Phosphoramidits, umfassend die Schritte: Umsetzen einer Verbindung der Formel:
wobei: Z eine Interzuckerverknüpfung ist; R₁ eine Hydroxyl-Schutzgruppe ist; R₂ H, OH, O-Alkyl, O-Alkylamino, O-Alkylalkoxy, ein Polyether der Formel (O-Alkyl)_m, wobei m 1 bis 10 ist, oder eine geschützte Hydroxylgruppe ist; R₃ eine Phosphoryl-Schutzgruppe ist; B eine Nucleobase ist; und n 0 bis 100 ist; mit einer Verbindung der Formel:
wobei X₁ Br oder Cl ist; X₂ und X₃ unabhängig H, Br oder Cl sind; X und Y jeweils unabhängig 2 oder 3 sind und die Summe von X und Y 5 ist; und Zusammenbringen des Produkts der Reaktion mit einer Verbindung der Formel HN(Q)₂, unter Erhalt eines Phosphoramidits der Formel:
wobei Q jeweils unabhängig Alkyl mit 1 bis 15 Kohlenstoffen, Aryl mit 6 bis 14 Kohlenstoffen ist oder einen heterocyclischen Ring mit 2 bis 10 Kohlenstoffen mit dem Stickstoff des Phosphoramidits bilden kann, wobei Alkyl substituiert sein kann.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei Q Isopropyl ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei R₂ H ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei R₂ eine geschützte Hydroxylgruppe ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei R₂ O-Alkyl oder O-Alkylalkoxy ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei R₂ O-Alkylalkoxy ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei R₂ 2-Methoxyethoxy ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei R₃ Cyanoethyl, 4-Cyano-2-butenyl oder Diphenylmethylsilylethyl ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei X 2 ist und Y 3 ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei X 3 ist und Y 2 ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Reaktion in Gegenwart eines Lösungsmittels durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Reaktion in Gegenwart eines Lösungsmittels, das Acetonitril ist, durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Nucleobase Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin, Uracil, 5-Methylcytosin oder ein geschütztes Derivat davon ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei Z eine Phosphodiesterverknüpfung ist, eine Phosphorothioatverknüpfung, eine Phosphorodithioatverknüpfung ist; oder eine Phosphonatverknüpfung ist.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei Z eine Phosphodiesterverknüpfung oder eine Phosphorothioatverknüpfung ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei R₃ Cyanoethyl ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei R₃ 4-Cyano-2-butenyl ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei X₁, X₂ und X₃, Br sind, das in den Positionen 2, 4 und 6 des Phenylrings angeordnet ist.
Verbindung der Formel:
wobei Z eine Interzuckerverknüpfung ist; R₁ eine Hydroxyl-Schutzgruppe ist; R₂ H, OH, O-Alkyl, O-Alkylamino, O-Alkylalkoxy, ein Polyether der Formel (O-Alkyl)_m ist, wobei m 1 bis 10 ist oder eine geschützte Hydroxylgruppe ist; R₃ 4-Cyano-2-butenyl ist; B eine Nucleobase ist, und n 1 bis 100 ist, wobei Alkyl substituiert sein kann.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei R₂ H ist.
Verbindung nach Anspruch 19, wobei R₂ eine geschützte Hydroxylgruppe ist.
Verbindung nach Anspruch 19, wobei R₂ O-Alkyl oder O-Alkylalkoxy ist.
Verbindung nach Anspruch 19, wobei R₂ O-Alkylalkoxy ist.
Verbindung nach Anspruch 19, wobei R₂ Methoxyethoxy ist.
Verbindung nach Anspruch 19, wobei die Nucleobase Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin, Uracil, 5-Methylcytosin oder ein geschütztes Derivat davon ist.
Verbindung nach Anspruch 19, wobei Z eine Phosphodiesterverknüpfung, eine Phosphorothioatverknüpfung, eine Phosphorodithioatverknüpfung; oder eine Phosphonatverknüpfung ist.
Verbindung nach Anspruch 26, wobei Z eine Phosphodiesterverknüpfung oder eine Phosphorothioatverknüpfung ist.
Verbindung nach Anspruch 19, wobei B Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin, Uracil, 5-Methylcytosin oder ein geschütztes Derivat davon ist; und Z eine Phosphodiesterverknüpfung oder eine Phosphorothioatverknüpfung ist.
Verbindung der Formel:
wobei Z eine Interzuckerverknüpfung ist; R₁ eine Hydroxyl-Schutzgruppe ist; R₂ H, OH, O-Alkyl, O-Alkylamino, O-Alkylalkoxy, ein Polyether der Formel (O-Alkyl)_m, wobei m 1 bis 10 ist, oder eine geschützte Hydroxylgruppe ist; R₃ 4-Cyano-2-butenyl ist; B eine Nucleobase ist, und n 1 bis 100 ist, wobei Alkyl substituiert sein kann.
Verbindung nach Anspruch 29, wobei R₂ H ist.
Verbindung nach Anspruch 29, wobei R₂ eine geschützte Hydroxylgruppe ist.
Verbindung nach Anspruch 29, wobei R₂ O-Alkyl oder O-Alkylalkoxy ist.
Verbindung nach Anspruch 29, wobei R₂ O-Alkylalkoxy ist.
Verbindung nach Anspruch 29, wobei R₂ Methoxyethoxy ist.
Verbindung nach Anspruch 29, wobei die Nucleobase Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin, Uracil, 5-Methylcytosin oder ein geschütztes Derivat davon ist.
Verbindung nach Anspruch 29, wobei Z eine Phosphodiesterverknüpfung, eine Phosphorothioatverknüpfung, eine Phosphorodithioatverknüpfung; oder eine Phosphonatverknüpfung ist.
Verbindung nach Anspruch 36, wobei Z eine Phosphodiesterverknüpfung oder eine Phosphorothioatverknüpfung ist.
Verbindung nach Anspruch 29, wobei B Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin, Uracil, 5-Methylcytosin oder ein geschütztes Derivat davon ist; und Z eine Phosphodiesterverknüpfung oder eine Phosphorothioatverknüpfung ist.