DE69609054T2 - Ein prozess für die herstellung von faktor ix biologischen ursprungs - Google Patents
Ein prozess für die herstellung von faktor ix biologischen ursprungsInfo
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Description
- Gegenstand der folgenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Faktor IX aus biologischen Quellen mittels Chromatographie sowie Faktor IX, der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich ist.
- Bei der Herstellung von Faktor IX aus beispielsweise Blutplasma wird zunächst das Kryopräzipitat abgetrennt. Das gefrorene Citratplasma wird aufgetaut, wobei die Hauptmenge an Faktor VIII und Fibrinogen durch Zentrifugation abgetrennt wird. Das so erhaltene Cryopoorplasma enthält die Vitamin-K-abhängigen Gerinnungsfaktoren mit einer Aktivität, die in der Größenordnung von 0,01 IU/mg Protein liegt.
- WO-A-92/15324 offenbart ein Präparationsschema für Faktor IX, wobei für die Proteinfällung tiefe Temperatur und/oder Auftauen verwendet werden. Das Präzipitat wird durch Chromatographie weiter aufgearbeitet.
- R. K. Scopes offenbart in "Protein Purification, Principles and Practice", 2. Auflage (1987), Springer-Verlag, S. 41-55 und 176-182; dass Aussalzen eine der am meisten verwendeten Techniken bei der Enzymreinigung ist. Als Fällungsmittel wird Ammoniumsulfat empfohlen.
- Nach dem aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren werden die Vitamin-K-abhängigen Gerinnungsfaktoren ohne Beeinträchtigung der Albumingewinnung durch Extraktion mit Anionenaustauschern, wie beispielsweise DEAE-Sephadex, gebunden. Wegen der schlechten Flusseigenschaften von DEAE-Sephadex muss dieser Schritt jedoch üblicherwei se als Festphasenextraktion im Batchverfahren durchgeführt werden. Die nach der Elution des DEAE-Sephadex anfallenden Fraktionen dienen dann als Ausgangsmaterial für die Faktor-IX-Reinigung. In dieser Fraktion werden allerdings auch im Plasma enthaltende Proteasen angereichert, so dass es durch proteolytischen Abbau zu Ausbeuteverlusten an dem interessierenden Faktor IX kommt und das Risiko der Thrombogenität des Präparats zunimmt.
- Das der Erfindung zugrunde liegende technische Problem besteht darin, ein Verfahren anzugeben, dass die genannten Risiken vermindert, und zwar ohne Zusatz von Proteasehemmern.
- Überraschenderweise wird das der Erfindung zugrunde liegende technische Problem gelöst durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1. Die den Faktor IX enthaltende biologische Quelle wird dabei mit Ammoniumsulfat in einer Endkonzentration von 1,5 bis 2,3 mol/l behandelt. Als biologische Quelle kommen insbesondere Blutplasma oder an Faktor VIII und Fibrinogen abgereichertes Kryopräzipitat (Cryopoorplasma) in Frage.
- Die Konzentration des Protein-Fällungsmittels beträgt insbesondere 1,75 bis 1,9 mol/l. Die Angaben beziehen sich auf die Ammoniumsulfatkonzentrationen, die in den Faktor IX enthaltenden Quellen vorliegen (Endkonzentration).
- Das erfindungsgemäße Verfahren verringert die proteolytische Aktivität um mindestens eine Größenordnung. Außerdem werden durch den Präzipitationsschritt vor der eigentlichen chromatographischen Reinigung des Faktors IX störende Bestandteile, wie Faktor VII und Faktor II, entfernt. Auch die Proteine C und S werden abgereichert. Im Falle des Faktors VII kann eine fast vollständige Elimination erreicht werden. Faktor II wird ebenfalls sehr vollständig (70 bis 90%) abgereichert, wohingegen die Abreicherung an Protein C und S etwa 50% beträgt.
- Im Überstand der Fraktion, die mit dem Protein-Fällungsmittel behandelt wurde, beträgt die Faktor-IX-Aktivität typischerweise 20 bis 30 IU/ml, entsprechend einer spezifischen Aktivität von 1 bis 5 IU/mg.
- An den erfindungsgemäßen Präzipitationsschritt unter Verwendung von Ammoniumsulfat schließt sich dann die chromatographische Trennung der an Faktor IX angereicherten Fraktion an. Dabei wird der Umstand ausgenutzt, dass Proteine bei hohen Salzkonzentrationen unterschiedlich stark ausgeprägte hydrophobe Wechselwirkungen eingehen können. Erfindungsgemäß wird vorzugsweise der Faktor IX in Gegenwart relativ hoher Salzkonzentrationen, die aus der Proteinfällung vorhanden sind, an ein Chromatographiematerial gebunden, das für die hydrophobe Interaktions- Chromatographie (HIC) einsetzbar ist. Damit wird gleichzeitig die hohe Salzkonzentration, die durch die Proteinfällung bedingt ist, verringert. Es kommt insbesondere ein Chromatographiematerial in Frage, das auf dem Trägermaterial einen hydrophilen beweglichen Arm (Tentakel) gebunden hat. An diese Spacer sind dann die entsprechenden Liganden, insbesondere hydrophobe Liganden, wie Propyl-, Butyl-, Phenylgruppen, kovalent gebunden.
- Der Überstand der Fraktion, die mit Ammoniumsulfat behandelt worden ist, wird auf das entsprechende Chromatographiematerial aufgetragen und gegebenenfalls gewaschen. Die Elution des an der Säule gebundenen, noch Faktor X enthaltenden Faktor IX kann mit einem Puffer erfolgen, der Ammoniumsulfat in geringerer Konzentration enthält. Dadurch ist die Ionenstärke der Elutionslösung im Vergleich zur Auftragungslösung reduziert. Die aus der Chromatographiesäule, die das HIC-Material enthält, eluierende Fraktion mit Faktor IX wird aufgefangen und weiteren Entsal zungsschritten mit geeigneten Mitteln unterzogen. Dies kann beispielsweise durch Ultra- und/oder Diafiltration erfolgen.
- Die weitere Trennung des Faktors IX, beispielsweise vom begleitenden Faktor X, erfolgt in einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung durch Affinitätschromatographie an einem. Heparin-modifizierten Träger. Bei relativ geringer Ionenstärke der die Faktoren enthaltenden Lösung binden diese an das Chromatographiematerial. Die Elution von gegebenenfalls störendem Faktor X wird durch Behandeln mit einer Natriumchlorid enthaltenden Lösung in Konzentrationen von 150 bis 300 mmol/l erreicht. Unter diesen Bedingungen verbleibt der Faktor IX an dem Heparin-Affinitätsträger gebunden. Durch Erhöhung der Ionenstärke der wässrigen Lösung auf etwa das Doppelte beginnt der Faktor IX sich von der Oberfläche des Affinitätsträgers zu lösen.
- Durch chemische und/oder physikalische Verfahren kann eine Virusinaktivierung erfolgen. Die physikalische Virusinaktivierungsmethode besteht im wesentlichen aus einer Wärmebehandlung der entsprechenden Fraktion bei 60 bis 65ºC während 5 bis 30 Stunden. Diese Wärmebehandlung kann sich insbesondere an die Heparin-Affinitätschromatographie anschließen. Die chemische Virusinaktivierung besteht beispielsweise in einer Behandlung einer Faktor IX enthaltenden Fraktion mit nichtionischen Tensiden und Di- oder Trialkylphosphaten. Insbesondere kommen hier Kombinationen von Tween und Tri-n-butylphosphat (TNBP) in Betracht. Virusinaktivierungsmethoden sind beschrieben in der EP 0 131 740 oder Horowitz et al., Blood, 79 (1992) 826.
- Die Virusinaktivierungsmethoden können auch kombiniert werden, wie dies beschrieben ist in der WO 94/17834. Vorzugsweise wird die chemische Virusinaktivierung nach der Ultra/Diafiltration nach der hydrophoben Chromatographie durchgeführt.
- Durch Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens lässt sich die Gesamtausbeute von Faktor IX mit hoher Reinheit auf 20 bis 30%, bezogen auf Plasma, steigern.
- Die Figur zeigt das erfindungsgemäße Verfahren mit angeschlossenen chromatographischen Reinigungsschritten in Form eines Flussdiagramms. Dabei wird durch die Pfeile angedeutet, welche Fraktionen abgetrennt werden und welche in den entsprechenden Eluaten und Überständen verbleiben.
- Das nachfolgende Beispiel verdeutlicht die Erfindung.
- Gefrorenes Citratplasma wird aufgetaut und bei 0 bis 3ºC gerührt. Faktor VIII und Fibrinogen werden durch Zentrifugation abgetrennt. Die erhaltene Cryopoorplasma-Fraktion enthält Vitamin-K-abhängige Gerinnungsfaktoren mit einer spezifischen Aktivität von ca. 0,01 IU/mg Protein. Der nachfolgende Capture-Schritt beinhaltet eine Festphasenextraktion oder Chromatographie an DEAE-Ionenaustauschern. Hierbei werden IgG und Albumin abgetrennt. Die Vitamin-K-abhängigen Gerinnungsfaktoren liegen in einer Aktivität von 10 bis 50 IU/ml vor, was einem Anreicherungsfaktor bezüglich Faktor IX von ca. 3500 entspricht.
- An den Capture-Schritt wird nun die eigentliche Reinigung angeschlossen. Die nach dem Capture-Schritt anfallende Fraktion wird mit einer Ammoniumsulfatlösung versetzt, so dass sich eine Endkonzentration von etwa 1,9 mol/l ergibt. Die Proteine C/S werden zu ca. 50% entfernt, wohingegen Faktor II zu 70 bis 90% und Faktor VII fast quantitativ entfernt wird. Der nach der Ammoniumsulfat-Fällung erhaltene Überstand wird einer hydrophoben Interaktions-Chromatographie an einem entsprechend modifizierten Tentakelgel unterzogen. Die Konzentration des Ammoniumsulfats in der Auftragelösung betrug ungefähr 1,75 mol/l. Der Auftragepuffer enthält auch Phosphat-Ionen. Die hydrophobe Interaktions-Chromatographie führt zur Bindung von restlichem Faktor VII und Faktor IX. Faktor X bindet an dem Material zu 70 bis 80%. Die Elution des Faktor-IX/Faktor-X-Gemischs erfolgt mit einer 1, 2 bis 1,4 mol/l enthaltenden Ammoniumsulfatlösung. Das eluierende Material ist frei von Faktor VII und weist keine wesentliche proteolytische Aktivität auf. Die spezifische Aktivität von Faktor IX in der Faktor-IX/Faktor-X-Mischung beträgt 5 bis 15 IU/mg Protein.
- Das im Eluat befindliche Ammoniumsulfat wird durch Ultra- und Diafiltration entfernt. Die Virusinaktivierung mittels Detergentien erfolgt durch Behandlung mit ca. 1% Tween 80/0,3% TNBP.
- Danach wird die erhaltene Fraktion nach Abtrennung des Detergens einer Heparin-Affinitätschromatographie unterzogen. Bei niedriger Osmolarität binden die Faktoren X und IX an das Heparin-Gel. Faktor X wird durch Waschen mit einem Puffer erhalten, der 0,25 mol/l NaCl enthält. Faktor IX eluiert nach Erhöhung der Natriumchforidkonzentration auf 0,45 mol/l. Im Eluat liegt Faktor IX danach mit 30 bis 50 IU/ml und einer spezifischen Aktivität von > 100 vor.
- Die so erhaltene, Faktor IX enthaltende Fraktion wird entsalzt und lyophilisiert.
Claims (9)
1. Verfahren zur Herstellung von Faktor IX aus biologischen Quellen
mittels Chromatographie, dadurch gekennzeichnet, dass vor
affinitätschromatographischen Trennungen die Quelle mit
Ammoniumsulfat in einer Konzentration von 1,5 bis 2,3 mol/l (Endkonzentration)
behandelt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die biologische Quelle Blutplasma
oder durch Abtrennung des Kryopräzipitats an Faktor VIII und
Fibrinogen abgereichertes Plasma (Cryopoorplasma) ist.
3. Verfahren nach wenigstens einem der Ansprüche 1 und/oder 2,
wobei nach der Proteinfällung eine Entfernung des
Ammoniumsulfats und Anreicherung des Faktors IX durch eine Adsorption des
Faktors IX an ein Chromatographie-Material, das für die hydrophobe
Interaktions-Chromatographie (HIC) einsetzbar ist, erfolgt.
4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das chromatographische
Material. das den Faktor IX adsorbiert hat, mit einer wässrigen Lösung mit
einer Ionenstärke, die zur Ablösung des Faktors IX von dem HIC-
Material führt, behandelt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 3 und/oder 4, wobei die nach Ablösung
des Faktors IX von dem HIC-Material erhaltenen Fraktionen einem
Verfahrensschritt unterworfen werden, der die Salzkonzentration
der den Faktor IX enthaltenden Lösung reduziert, z. B. durch
Ultrafiltration/Diafiltration.
6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei sich eine
Affinitätschromatographie an Heparin-modifiziertem Trägermaterial anschließt.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei eine
Virusinaktivierung auf chemischem und/oder physikalischem Weg
durchgeführt wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die physikalische
Virusinaktivierung eine Wärmebehandlung bei 60 bis 65ºC während 5 bis 30
Stunden umfasst, insbesondere nach der Affinitätschromatographie
an Heparin gemäß Anspruch 6.
9. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die chemische Virusinaktivierung
eine Behandlung der Faktor IX enthaltenden Probe mit
nichtionischen Detergentien/di- oder trialkylierten Phosphaten umfasst.
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