DE69411812T2

DE69411812T2 - Kosmetisches oder pharmazeutisches Präparat zur topischer Verwendung gegen freien Radikale

Info

Publication number: DE69411812T2
Application number: DE69411812T
Authority: DE
Inventors: Andre-Jean F-78290 Croissy Sur Seine Brin; Nadine F-95270 Chaumontel Goutelard
Original assignee: PAYOT N G LAB
Current assignee: PAYOT N G LAB
Priority date: 1993-06-15
Filing date: 1994-06-14
Publication date: 1999-01-28
Anticipated expiration: 2014-06-15
Also published as: FR2706305A1; EP0629397A1; ATE168555T1; FR2706305B1; EP0629397B1; DE69411812D1; JPH07145067A; ES2120585T3; GR3027749T3

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein kosmetisches oder pharmazeutisches Präparat zur topischen Anwendung, welches einen Hydroglykolextrakt aus den Algen Chlorella, Scenedesmus und Spirulina in Verbindung mit einem Extrakt aus grünem Kaffee enthält.
Ebenso bezieht sie sich auf die Verwendung eines Hydroglykolextrakts aus den Algen Chlorella, Scenedesmus und Spirulina in Verbindung mit einem Extrakt aus grünem Kaffee zur Herstellung kosmetischer oder pharmazeutischer Präparate, die zur Behandlung der Haut oder des Haarsystems bestimmt sind.
Schließlich betrifft sie ein Verfahren zur kosmetischen Behandlung der Haut und des Haarsystems.
Auf Haut und Haar wirken wiederholt verschiedene oxidierende Stoffe aggressiv ein, die durch ihre direkte oder indirekte Wirkung unerwünschte und schädliche Wirkungen hervorrufen, darunter vornehmlich eine beschleunigte Hautalterung. Die schädlichen Wirkungen, die durch freie Radikale, d. h. ephemere chemische Einheiten innerhalb des Organismus, unter anderem auch in der Haut, herbeigeführt werden, wurden mehrfach in der medizinischen, dermatologischen und kosmetischen Fachliteratur beschrieben. Die freien Radikale können sich auch in Gegenwart von Sauerstoff und ultravioletter Strahlung bilden und reagieren vornehmlich mit den mehrfach ungesättigten Fettsäuren, den Grundbestandteilen im Zellaufbau, wobei sie als Folgeerscheinung tiefgreifende Veränderungen auf der Oberhaut hervorrufen. Die Glykolipide, Sphingolipide und Phospholipide, wesentliche Bestandteile der Zellmembranen, enthalten tatsächlich eine große Zahl mehrfach ungesättigter Fettsäuren, auf die Radikale ihre Wirkung ausüben können. Somit führen die Perioxidationsherde durch Vervielfachung zu einer Instabilität in der körnigen Schicht und in der Hautwand.
Ferner können Haut und Haar in ungünstiger Weise durch die Sonnenstrahlung oder gewisse Stoffe, die in der Luft in der Atmosphäre vorhanden sind, wie beispielsweise Schwefeldioxid, Stickstoffdioxid, Kohlenwasserstoffe, Halogenderivate oder Kohlensäure, beeinflußt werden.
Deswegen sucht man nach Zusammensetzungen, welche einen wirksamen Schutz der Haut bzw. des Haarsystems vor den vorgenannten Angriffen ermöglichen, und derzeit wird insbesondere nach pharmazeutischen oder kosmetischen Präparaten gearbeitet, die eine zufriedenstellende Wirkung gegenüber freien Radikalen entwickeln.
Die Anmelderin hat jedoch überraschend und unerwartet festgestellt, daß sich die Verbindung eines Hydroglykolextrakts aus den Mikroalgen Chlorella, Scenedesmus und Spirulina mit einem Extrakt aus grünem Kaffee nicht nur beim Schutz der Oberhaut vor den Wirkungen der Radikalen sondern auch gegen die Bildung freier Radikale als sehr wirksam und aktiv erweist. Es zeigte sich überraschend und unerwartet, daß diese Kombination auch eine sehr erhebliche entzündungshemmende Wirkung besitzt.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen und kosmetischen Präparate zeichnen sich somit dadurch aus, daß sie eine wirksame Menge mindestens eines Hydroglykolextrakts aus den Algen Chlorella, Scenedesmus und Spirulina und mindestens einen Extrakt aus grünem Kaffee enthalten.
Den Hydroglykolextrakt aus den Algen Chlorella, Scenedesmus und Spirulina erhält man durch ein Extraktionsverfahren, bei dem Bestandteile der Mikroalgen Chlorella, Scenedesmus und Spirulina in einem Hydroglykolmedium verarbeitet werden.
Spirulina gehört zur Klasse der Cyanophyten. Dabei handelt es sich um eine Süßwasseralge, deren qualitative Zusammensetzung im wesentlichen äquivalent zur Zusammensetzung von Meeresalgen ist. Es bestehen jedoch in quantitativer Hinsicht ausgeprägte Unterschiede. So beträgt der Zuckeranteil 18%, und nicht 60% wie bei den Meeresalgen, während der Lipidanteil höher ist, nämlich 8% (gegenüber 5%), bei 6,5% Anteil an ungesättigten essentiellen Fettsäuren (wovon ein hoher Prozentsatz Gamma-Linolsäure ist) und 1,5% unverseifbaren Stoffen. Der Anteil stickstoffhaltiger organischer Substanzen ist ebenfalls stark verschieden, da er statt nur 10% hier 65 bis 70% beträgt, was dazu führt, daß diese Alge eine natürliche Quelle darstellt, die an allen essentiellen Aminosäuren sehr reich ist, wobei diese außerdem in hohen Anteilen vorhanden sind. Schließlich macht der ausgeprägte Reichtum an Vitaminen und insbesondere Vitamin B12 sowie an Provitamin A und Vitamin E diese Alge interessant.
Chlorella gehört zur Klasse der Chlorophyten. Hierbei handelt es sich um Grünalgen, die in Seen und Teichen weltweit stark verbreitet sind und feinen sehr hohen Chlorophyllanteil enthalten, der etwa zehnmal höher liegt als bei Spirulina.
Scenedesmus gehört zur selben Klasse wie Chlorella. Auch hierbei handelt es sich um eine Süßwasseralge.
Diese beiden Algen vom Stamm Scenedesmus und Chlorella bieten den Vorteil, daß sie einen interessanten Anteil an wasserlöslichen Vitaminen B1, B2 und PP enthalten. Die Wahl dieser drei Algen Chlorella, Scenedesmus und Spirulina ermöglicht die Erzielung eines Extrakts, der in überraschender und unerwarteter Weise eine hohe Aktivität gegen freie Radikale und auch andere Eigenschaften besitzt, die für die Kosmetologie interessant sind.
Vorzugsweise erhält man den erfindungsgemäß verwendeten Algenextrakt durch Extraktion in einem Hydroalkoholmedium mit einem Wasser/Glykol-Verhältnis zwischen 5/95 und 95/5, vorzugsweise zwischen 10/90 und 90/10. Die dabei bevorzugten Glykole sind Glyzerin und Glykolpropylen.
Die Extraktion wird mit einem Verhältnis zwischen dem Hydroalkohol und den Algen zwischen 2/1 und 10/1, vorzugsweise zwischen 3/1 und 8/1, vorgenommen.
Um die höchstmögliche Wirksamkeit zu erzielen, ist jede der drei Algen in dem Gemisch, daß der Hydroalkoholextraktion unterzogen wird, in einem prozentualen Anteil von mindestens 5%, vorzugsweise mindestens 10%, vorhanden.
Nach der Extraktion wird eine Reinigung durch selektive Ausfällung vorgenommen, und anschließend wird der Extrakt durch ein Filter mit einer Feinheit von 0,22 um, abgefiltert und konserviert.
Der erfindungsgemäß eingesetzte Extrakt aus grünem Kaffee ist eine gereinigte Fraktion eines Extrakts aus grünem Kaffee (Coffea arabica Rubiacea). Die wichtigsten Verbindungen sind Phenolsäuren, deren chemische Grundstruktur wie folgt ist:
Der Extrakt aus grünem Kaffee enthält Koffeinsäure in einer Konzentration von mehr als 40%, vorzugsweise von mehr als 45%, und besonders bevorzugter Weise von mehr als 50%, bezogen auf die Trockenmasse des Extrakts.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform enthält der erfindungsgemäß verwendete Extrakt aus grünem Kaffee 40% bis 85%, vorzugsweise 50 bis 80%, und besonders bevorzugter Weise 60 bis 77%, an Koffeinsäure und 1 bis 10%, vorzugsweise 2 bis 8%, Chlorgensäure.
Der in Frage stehende Extrakt aus grünem Kaffee liegt im allgemeinen in Form eines weißlichen, leiht aromatischen Pulvers vor, das auf einen Matodextrinträger aufgesprüht ist. Dabei sieht eine typische Analyse wie folgt aus:
Koffeinsäure 50-55%
Chlorgensäure 2-5%
andere Phenolsäuren 2-5%
Maltodextrin 15-22%
Wasser 5% max.
Die molare Absorption des größten Teils der in dem Extrakt aus grünem Kaffee vorhandenen Moleküle liegt über 20.000 bei 321 nm, so daß dieser Extrakt einen Extinktionskoeffizienten bei 321 nm von etwa 500 besitzt. Dieser vergleichsweise hohe Wert verleiht dem Extrakt gute Schutzeigenschaften gegenüber UV-Strahlung, vornehmlich gegenüber der UV-B-Strahlung.
Der Synergieeffekt, den man durch die Kombination von Extrakt aus den Algen Chlorella, Scenedesmus und Spirulina mit einem Extrakt aus grünem Kaffee erzielt, ist besonders ausgeprägt, wenn das Gewichtsverhältnis des Algenextrakts zum Extrakt aus grünem Kaffee zwischen 1/1 und 30/1 liegt, vorzugsweise zwischen 2/l und 20/l, und besonders bevorzugter Weise zwischen 3/1 und 15/1.
Die erfindungsgemäße binäre Kombination gegen freie Radikale kann bei kosmetischen oder pharmazeutischen Zusammensetzungen eingesetzt werden, die zur Behandlung der Haut oder des Haarsystems bestimmt sind, oder auch zur Behandlung zur Bekämpfung von Entzündungen. Somit sieht die Erfindung kosmetische oder pharmazeutische Präparate vor, die sich dadurch auszeichnen, daß sie eine wirksame Menge mindestens eines Hydroglykolextrakts der Algen Chlorella, Scenedesmus und Spirulina in Verbindung mit mindestens einem Extrakt aus grünem Kaffee enthalten.
Unter wirksamer Menge ist hier die Menge zu verstehen, die es möglich macht, die gewünschte Schutzwirkung und/oder entzündungshemmende Wirkung zu erzielen. Ganz allgemein liegt diese Menge zwischen 0,02% und 8 Gew.-%, vorzugsweise zwischen 0,02% und 5%, und ganz besonders wird ein Wert zwischen 0,05 und 5% Gew.-% an Extrakt aus grünem Kaffee, und zwischen 0,1% und 15%, vorzugsweise zwischen 0,2% und 12%, und besonders bevorzugter Weise zwischen 0,5 Gew.-% und 8% Gew.-% für den Extrakt aus den Algen Chlorella, Scenedesmus und Spirulina.
Die für eine topische Anwendung bestimmten erfindungsgemäßen Präparate können vornehmlich Lösungen oder Dispersionen in der Art einer Lotion oder eines Serums, Emulsionen von flüssiger oder halbflüssiger Konsistenz in der Art einer Milch sein, die man durch Dispersion einer Fettphase in einer wäßrigen Phase (ÖL/W) oder umgekehrt (W/ÖL) erhält, oder auch Suspensionen oder Emulsionen von weicher Konsistenz in der Art einer Creme oder eines Gels, oder Mikrokügelchen, Mikrogranulat oder blasige Stoffe vom ionischen und/oder nichtionischen Typ.
Diese Zusammensetzungen können in an sich bekannter Weise hergestellt werden und stellen insbesondere Produkte in Form von Reinigungscreme, schützender oder pflegender Gesichtscreme, Handcreme oder Körpercreme dar, beispielsweise Tagescreme, Nachtcreme, Abschminkcreme, flüssiges Make-up, entzündungshemmende Cremes oder Pomaden, Abschminkmilch, schützende oder pflegende Körpermilch, Sonnenmilch, Reinigungslotion, Sonnenlotion, Bräunungslotion, Badezusätze, desodorierende Produkte mit bakterizidem Wirkstoff, Haarshampoo, Haarlotionen, Haarcreme. Diese Produkte können auch aus einem festen Präparat bestehen, beispielsweise in Form einer Seife. Die Zusammensetzungen in flüssiger Form können ihrerseits auch in Form Sprayflaschen angeboten werden.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthalten die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen neben der binären Kombination aus einem Hydroalkoholextrakt der Algen Chlorella, Scenedesmus und Spirulina und einem Extrakt aus grünem Kaffee auch Tocopherole in einer Menge von 0,01 Gew.-% bis 6 Gew.-%, insbesondere Tocopherol-Linoleat. Tocopherol-Linoleat ist ein Gemisch aus verschiedenen Fettsäureestern von Tocopherolen. Es enthält mindestens 51% Tocopherol-Linoleat, mindestens 25% Tocopherololeat, Tocopherolpalmitat und Tocopherolmyristat.
Es stellt einen Faktor mit Wirkung gegen freie Radikale dar und führt der Haut eine der essentiellen Fettsäuren zu, nämlich Linolsäure, doch wirkt es auch als was seranreichernder Faktor und verhindert die Verhärtung der Hornhautschicht infolge der Bestrahlung mit UV-Strahlen. Somit ist seine Verwendung insbesondere in Produkten zur Vorbehandlung vor einem Sonnenbad und in Sonnenschutzprodukten vorgesehen.
Neben der erfindungsgemäßen binären Kombination und gegebenenfalls zusätzlich zu Tocopherol-Linoleat können die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen auch Wirkstoffe oder Arzneimittelträger jeder Art enthalten, wie sie herkömmlicherweise in kosmetischen oder pharmazeutischen Präparaten verwendet werden, die für die Haut oder das Haarsystem bestimmt sind.
Vorteilhafterweise weisen die erfindungsgemäßen Präparate einen Komplexbildner wie Dinatrium-EDTA auf, der dazu vorgesehen ist, die zweiwertigen oder dreiwertigen Ionen zu binden, welche als Katalysator für die Oxidationsreaktionen dienen.
Sonnenfilter, vorzugsweise solche, die Radikale nicht fördern und die unter den Warenzeichen EUSOLEX 6300 oder UVINUL MS40 vertrieben werden, können in diesen Präparaten vorhanden sein. Ebenso können diese auch Pigmente wie Titanoxid, das gegebenenfalls mit Silikon ummantelt ist, gegebenenfalls ummanteltes Glimmertitan, gegebenenfalls ebenso ummantelten Glimmer oder Polymethylmethacrylat, enthalten.
Die im allgemeinen verwendeten Mengen dieser verschiedenen Bestandteile betragen zwischen 0,01 und 5 Gew.-% bei den Sonnenfiltern, 0,1 bis 5 Gew.-% bei den Pigmenten und 0,001% bis 0,1% bei einem Komplexbildner wie Natrium-EDTA.
Wie bei allen kosmetischen Produkten können außerdem bei Bedarf Weichmacher, Parfümzusätze, Konservierungsmittel, Farbstoffe und Emulgatoren zugesetzt werden.
Die erfindungsgemäßen kosmetischen Präparate können auch verwendungsfertige Produkte wie konzentrierte Lösungen oder Pasten sein, die vor Verwendung noch verdünnt werden müssen.
Die Erfindung sieht auch die Verwendung der Kombination aus einem Hydroglykolextrakt der Algen Chlorella, Scenedesmus und Spirulina und einem Extrakt aus grünem Kaffee bei der Herstellung kosmetischer oder pharmazeutischer Zusammensetzungen vor, die zur Behandlung der Haut oder des Haarsystems bzw. zur Behandlung bei der Bekämpfung von Entzündungen vorgesehen sind.
Darüber hinaus ist auch eine kosmetische Behandlung Gegenstand der Erfindung, die dadurch gekennzeichnet ist, daß auf die Haut oder das Haarsystem eine Zusammensetzung aufgetragen wird, die mindestens einen Hydroglykolextrakt aus den Algen Chlorella, Scenedesmus und Spirulina in Verbindung mit mindestens einem Extrakt aus grünem Kaffee enthält.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur kosmetischen Behandlung kann dadurch vorgenommen werden, daß kosmetische Präparate wie sie beispielsweise vorstehend definiert wurden, entsprechend den für diese Präparate herkömmlichen Einsatztechniken aufgetragen werden. Dieses Verfahren zur kosmetischen Behandlung wird in der Weise ausgeführt, daß eine wirksame Menge der erfindungsgemäßen Kombination aufgetragen wird, d. h. einer wirklich ausreichenden Menge, um die gewünschte Schutzwirkung zu erzielen.
Dieses Verfahren zur kosmetischen Behandlung ist dazu bestimmt, die Haut oder das Haarsystem vor äußeren angreifenden Einwirkungen zu schützen, wie beispielsweise oxidierenden Stoffen, Sonnenstrahlen, Verschmutzungsstoffen, und soll die Struktur der Haut oder der Haare aufrechterhalten und die Eigenschaften der Haut verbessern.
Zum besseren Verständnis wird die Erfindung nachstehend anhand von Bewertungstests und Anwendungsbeispielen rein exemplarisch beschrieben.

BEISPIEL 1: Bewertung des Potentials der Wirkung des verwendeten erfindungsgemäßen Algenextrakts gegen Radikale

1. Schutz in vitro vor Lipid-Peroxidation

Es wird eine 3%ige Dispersion von Phospholipiden in Form von Liposomen einer Angriffswirkung gemäß einem vorgegebenen Protokoll (vgl. unten) ausgesetzt. Unter diesen Bedingungen wird die Wirkung eines Produkts gegen Radikale nach seiner Fähigkeit bewertet, den Lipidabbau zu verhindern. Dieser Lipidabbau kann mittels eines UV-Spektrophotometers gemessen werden, wobei sich ein Absorptionsmaximum bei 233 nm zeigt, was den konjugierten Dienen entspricht.
Das Nachweisprotokoll ist wie folgt:
Einer 3%igen Liposomenlösung werden 0,02% FeCl&sub2; und 0,3% KSCH zusetzt und dann wird zehnfach verdünntes, mit Sauerstoff auf 100 Volumenanteile angereichtertes Wasser zugegeben.
Vor Zugabe von FeCl&sub2; wird eine Probe in Abwesenheit eines Oxidationsmittels im Kühlen gehalten, die als Vergleichsprobe bzw. Referenz für die Spektrophotometrie dienen soll. Die zu untersuchenden Proben läßt man sechs Stunden im Wasserbad bei 45ºC und eine Nacht bei Raumtemperatur stehen. Die Handhabung erfolgte ohne Konservierungsmittel.
Die in Fig. 1 dargestellten Kurven zeigen, daß die Vergleichsprobe (die keinen Algenextrakt enthält) stark oxidiert ist, da bei 233 nm eine für konjugierte Diene typische Spitze zu erkennen ist. Die Kurve für das untersuchte Gemisch, die 5% Hydroglykolextrakt aus den Algen Chlorella, Scenedesmus und Spirulina (nachstehend als ARL bezeichnet) enthielt, zeigt die sehr gute inhibierende Wirkung gegen die Peroxidation von Lipiden und liegt höher als 85%.

2. Schutz vor freien Radikalen in vitro

Die Bewertung der Wirkung gegen freie Radikale "in vivo" auf der Haut erfolgt auf dem Unterarm und wird in der Weise vorgenommen, daß nach Entfärbung des β- Karotins durch zeitabhängige UVA-Bestrahlung in Gegenwart oder bei Abwesenheit des ARL-Extrakts gemessen wird. Die Wirkung der freien Radikalen führt zu einer Entfärbung des β-Karotins durch Oxidation.
Nach Vorbereitung der Haut (Unterarm) durch Reinigung mit Ether wird unter leichter Massage auf eine Fläche von 5 cm² eine abgemessene Menge (50 ul) des Produkts (in Form einer Creme oder einer Milch) aufgetragen, das den zu untersuchenden Wirkstoff enthält.
Gemessen wird die Farbe der Haut an den behandelten Stellen mit Hilfe eines Chromameters der Marke MINOLTA (Wert B&sup0;).
Dreißig Minuten später wird eine Lösung, die β-Karotin enthält, auf jede Stelle aufgetragen, woraufhin die Farbe der Haut erneut gemessen wird (Wert B¹&sup0;&sup0;).
Nun wird der Vorderarm mit UVA-Licht bestrahlt (wobei jede Bestrahlung einer Menge von 2 Joule/cm² entspricht). Nach jeder Behandlung wird die Farbe der Haut gemessen (Wert B², Wert B&sup4;, Wert B&sup8;, Wert B¹&sup0;, Wert B¹²). Anhand dieser am Chromameter abgelesenen Werte wird der Farbindex gemäß folgender Formel berechnet:
wobei n = 2,4,6,8,10,12.
In allen Fällen dieser Figur verringert sich der Farbindex mit der zunehmenden Bestrahlungsmenge. Zur besseren Bewertung der Schutzwirkung von ARL wird der Index der Schutzwirkung gegen freie Radikale nach folgender Formel berechnet:
wobei x das zu untersuchende Produkt ist und p für ein Placebo steht.
Die Untersuchung wurde bei fünf Freiwilligen im Alter zwischen 27 und 42 Jahren (2 Männer, 3 Frauen) vorgenommen. Dadurch, daß beide Unterarme herangezogen werden, kann die Anzahl der Messungen verdoppelt werden. Die Wirksamkeit von zwei ÖL/W-Cremes, die jeweils 3 und 6% ARL enthalten, wird nun mit der Wirkung einer Placebo-Creme verglichen.
Fig. 2 zeigt die Indizes der Schutzwirkung gegen freie Radikale (IARL) für die beiden ARL-Konzentrationen.
Es ist festzustellen, daß sich die Wirksamkeit mit der Bestrahlungsdosis erhöht.
Diese Versuche zeigen, daß ARL Schutzwirkung gegen Radikale besitzt, indem es als Falle für die freien Radikale ab deren Entstehung wirksam ist und dabei die Radikalreaktionen in Kaskade blockiert.

BEISPIEL 2: Vergleich des Potentials der Wirkung gegen Radikale bei ARL und einer Superoxid-Dismutase (SOD)

Die Wirkung von ARL gegen Radikale wurde durch Vergleich mit einem wegen seiner guten Antiradikalen-Eigenschaften bekannten Produkts, im vorliegenden Fall Superoxid-Dismutase, nachstehend als SOD bezeichnet, (ein beispielsweise unter der Nummer S 3589 von der Firm SIGMA vertriebenes Produkt) bewertet.
Das Prinzip dieses Verfahrens beruht auf der Bewertung im Vergleich mit der Zytotoxizität, die in Gegenwart des untersuchten Wirkstoffs in verschiedenen Konzentrationen von dem System Hypoxanthin-Xanthin-Oxydase (HX-XO) herbeigeführt wird. Das Enzymsystem HX-XO bildet den größten Teil der mit Sauerstoff angereicherten Radikale. Verschiedene Arbeiten haben jedoch nachgewiesen, daß H&sub2;O&sub2; der wichtigste Aggressor ist.
Hierbei ist das Untersuchungsprotokoll wie folgt. In Mikroplatten mit 96 Vertiefungen werden Fibroblasten von Mäusen (Stamm L929) in einer Menge von 25.000 Zellen/Vertiefung geimpft. 24 Stunden nach Impfung wird das Kulturmedium entfernt und durch frisches Medium ersetzt. Die Plättchen werden 48 Stunden lang bei 37ºC zur Untersuchung umgesetzt.
Nach dieser Inkubationszeit wird das Kulturmedium entfernt. Die Zellen werden der Wirkung freier Radikale mittels des Systems HX-XO ausgesetzt, und zwar werden 100 ul einer XO-Lösung von 8 mU/ml, angesetzt in einer PBS+-Pufferlösung, sowie 100 ul einer HX-Lösung in zunehmenden Konzentrationen in jede Vertiefung eingebracht,
Nach zweieinhalbstündiger Inkubation werden die Plättchen abgegossen, gespült und erneut mit Kulturlösung gefüllt. Anschließend werden sie 24 Stunden lang zur Untersuchung umgesetzt. Nach der Inkubation wird die Lebensfähigkeit der Zellen durch einen Test mit MTT 3(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenol-Bromidtetrazol bewertet. Das Prinzip dieser Untersuchung baut auf dem Umstand auf, daß MTT durch die Succinyldeshydrogenase in den Mitochondrien der Zellen mit aktivem Stoffwechsel in unlöslichem blauviolettem Formazan reduziert wird. Somit besteht dieser Test darin, daß nach Zugabe von MTT und dreistündiger Inkubationszeit das gebildete Formazan in Lösung geht. Die optische Dichte der blauvioletten Lösung wird anschließend spektrophotometrisch gemessen. Diese ist nun proportional zur Anzahl der Zellen mit aktivem Stoffwechsel.
Hypoxanthin in einer Konzentration von 15 ug/l wurde zum Vergleich bei der Untersuchung der Schutzwirkung abgenommen.

Schutzwirkung der untersuchten wasserlöslichen Wirkstoffe ARL und SOD

Die Schutzwirkung wurde entsprechend dem folgenden Versuchsprotokoll bewertet. Fibroblasten von Mäusen (Stamm L929) wurden in Mikroplatten mit 96 Vertiefungen in einer Menge von 25.000 Zellen pro Vertiefung geimpft. 24 Stunden nach Impfung wurde das Medium entfernt und durch ein Medium ersetzt, welches das untersuchte Produkt enthielt ("präventive" Behandlung).
Es wurden für jeden Wirkstoff drei Dosen eingesetzt, und zwar DNC, ½ DNC und 1/10 DNC.
Nach 48stündiger "Behandlung" wurden die Plättchen abgegossen und zweieinhalb Stunden lang in Gegenwart des untersuchten Wirkstoffs ("sofort wirksame" Behandlung) der Wirkung des HX-XO-Systems ausgesetzt (HX = 15 pg/ml und XO = 8 mU/ml).
Nach zweieinhalbstündiger Inkubationszeit werden die Plättchen abgegossen und gespült, um das System zu entfernen, welches die freien Radikalen bildet. Anschließend erhalten die Zellen frisches Medium, in welchem das Produkt ("kurative" Behandlung) enthalten ist.
Nach vierundzwanzigstündiger Inkubationszeit wird die Lebensfähigkeit der Zellen in den "Vergleichskulturen" und der "behandelten" Zellen in einem Test zur Prüfung der Lebensfähigkeit von Zellen mit MTT bewertet.
Der prozentuale Wert der Toxizität wird nach den folgenden Formeln berechnet:
und
für den Fall, daß die Zellen mit einer vorgegebenen Substanz "behandelt" werden.
Die prozentuale Schutzwirkung des untersuchten Produkts wird anschließend mit der folgenden Formel bestimmt:
In der nachstehenden Tabelle 1 sind die für ARL einerseits und SOD andererseits erhaltenen Ergebnisse dargestellt: TABELLE 1
(S. statistisch erheblich (p < 0,05)
Testverfahren: Varianzanalyse und Dunnett-Test)
Es kann festgestellt werden, daß die beiden untersuchten Produkte eine gute Aktivität gegen freie Radikale besitzen. Das Produkt ARL weist jedoch eine geringere Aktivität als das SOD-Produkt auf. Bei beiden Produkten ist die Schutzwirkung jedoch von der verabreichten Dosis abhängig.

BEISPIEL 3: Bewertung des Potentials der Wirkung gegen Radikale beim Extrakt aus grünem Kaffee

Diese Bewertung wurde durch Vergleich der Zytotoxizität vorgenommen, die durch ultraviolette Strahlung (UV-B) bei Vergleichskulturen und bei Kulturen hervorgerufen wird, die mit dem Extrakt aus grünem Kaffee (nachstehend ECV genannt) in unterschiedlichen Konzentrationen hervorgerufen werden.

Zyoxizität bei UV-Bestrahlung

Hierzu wird nach folgendem Versuchsprotokoll gearbeitet.
Fibroblasten von der Maus (Stamm L929) werden in einer Menge von 30.000 ZellenNertiefung in Kulturplättchen mit 96 Vertiefungen geimpft. 24 Stunden nach Impfung wird das Kulturmedium entfernt und durch frisches Kulturmedium ersetzt. Die Plättchen werden zur 48stündigen Inkubation in im Wärmeschrank mit CO&sub2; gesetzt. Nach dieser Inkubation werden die Plättchen abgegossen. Die Zellen werden durch eine Salzlösung nach Hank ohne Phenolrot hindurch mit UV-B-Licht bestrahlt (Röhre: Philips TL 20 w/12).
Nach der Bestrahlung werden die Plättchen abgegossen und mit frischem Kulturmedium aufgefüllt. Nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden mit CO&sub2; zur Untersuchung wird die Lebensfähigkeit der Zellen mit einem Kolorimetertest mit MTT bewertet.
Zwischen der Zellsterblichkeit und der Bestrahlungsdauer, logarithmisch ausgedrückt, besteht eine lineare Beziehung:
Wahrscheinlichkeit (% Sterblichkeit) = 1,309 10 g (Zeit) + 4,167.
Eine Regressionsstrecke ermöglicht die Berechnung der Expositionszeit, die zu einer 50%igen Sterblichkeit der Zellen (TL50 = 4 Min) führt, bzw. der Expositionszeit, bei der eine 70%ige Sterblichkeit der Zellen (TL70 = 11 Min) gegeben ist.

Schutzwirkung von ECV

Hierbei wird entsprechend dem folgenden Versuchsprotokoll gearbeitet.
Fibroblasten von Mäusen (Stamm L929) werden in Mikroplatten mit 96 Vertiefungen in einer Menge von 30.000 Zellen pro Vertiefung geimpft. 24 Stunden nach Impfung wird das Medium entfernt und durch frisches Medium ersetzt, in welchem das untersuchte Produkt vorhanden ist ("präventive" Behandlung). Untersucht wird mit ECV in drei Konzentrationen, und zwar DNC, ½ DNC und 1/10 DNC (jeweils zwei Spalten à 8 Vertiefungen pro Konzentration).
Nach 48stündiger "präventiver" Behandlung werden die Plättchen abgegossen und die Zellen mit UV-Licht (UV-B) durch eine Hank-Lösung ohne Phenolrot hindurch in Gegenwart von ECV ("sofort wirksame" Behandlung) bestrahlt.
Nach der Bestrahlung wird die Salzlösung abgegossen und durch frisches Kulturmedium ersetzt, welches den Wirkstoff in unterschiedlichen Konzentrationen ("kurative" Behandlung) enthält; dies dauert 24 Stunden.
Bei Versuchsende wird die Lebensfähigkeit der Zellen durch einen Test mit MTT bewertet.
Dir prozentuale Toxizität, die durch die UV-B-Bestrahlung herbeigeführt wurde, wird für jede Konzentration des Wirkstoffs bewertet, wobei auf eine unbestrahlte interne Vergleichsprobe Bezug genommen wird; zur Bewertung dient die folgende Formel:
Dabei wurden die Kulturen mit den Vergleichspartien und die Kulturen mit den behandelten Partien zweimal mit UV-B-Licht bestrahlt:
- t1 : 2 Minuten (bei 93 mJ/cm²), also über eine Zeit, welche zu einer Zellsterblichkeit von etwa 30% in der Vergleichspartie führen muß (nach der Gleichung der zuvor erhaltenen Regressionsstrecke);
- t2 : 2 Minuten (bei 280 mJ/cm²), also über eine Zeit, welche zu einer Zellsterblichkeit von etwa 65% bei den unbehandelten Kulturen führen muß.
In der nachstehenden Tabelle 2 sind die dabei erhaltenen Ergebnisse dargestellt: TABELLE 2
Es kann festgestellt werden, daß die Schutzwirkung, die mit Hilfe von ECV erzielt wird, nach einer Bestrahlung mit 93 mJ/cm² bei den Partien DNC und ½ DNC total ist, und zwar wird in diesen Partien keinerlei Zellsterblichkeit festgestellt, während in der unbehandelten Vergleichspartie eine Sterblichkeit von etwa 40% festzustellen ist. Die Schutzwirkung bleibt auch bei 1/10 DNC erheblich.
Nach einer Bestrahlung mit 280 mJ/cm², die zu einer 67%igen Sterblichkeit in der unbehandelten Vergleichspartie führt, erhält man identische Ergebnisse.
Daraus kann gefolgert werden, daß der Extrakt aus grünem Kaffee eine beträchtliche Aktivität gegen Radikale besitzt.

BEISPIEL 4: Bewertung der Aktivität beim Einfangen freier Radikale verschiedener pflanzlicher Extrakte

Für diese Bewertung wird natürliches, mit Licht bestrahltes Pheomelanin als Muster für die Bildung freier Radikale herangezogen. Diese Substanz besitzt in ihrer Struktur ein spezifisches freies Radikal und eine Oxidation unter Lichteinwirkung führt zu einer Erhöhung der Arten von Radikalen.
Die Erfassung wird nach einer direkten Methode vorgenommen, und zwar durch Messung der elektronischen paramagnetischen Resonanz (RPE-Verfahren), der spektroskopischen Untersuchungsmethode erster Wahl, um freie Radikale nachzuweisen.
Die Aktivität des untersuchten Produkts beim Einfangen freier Radikale wird dadurch bewertet, daß seine Fähigkeit bestimmt wird, die Produktion von Radikalen zu unterbinden.
Hierbei wird das aus rotem Haar extrahierte natürliche Pheomelanin eingesetzt. Dabei handelt es sich um ein Heteropolymer, dessen häufigstes Monomer eine an ein Protein gebundene 4-Hydroxybenzothiazol-Einheit ist.
Es wurden mehrere pflanzliche Extrakte, mit den Kennummern 1 bis 10 bezeichnet, auf ihre eventuelle Aktivität gegen Radikale untersucht. Die Konzentration wurde in Abhängigkeit von der Wasserlöslichkeit jedes Produkts gewählt, wobei die Konzentration maximal 5% betrug. Hinsichtlich der fettlöslichen Produkte (mit den Kennummern 6 und 10) wurde die Löslichkeit mit Hilfe eines Tensids, und zwar MontanoxR 80, erreicht.
Da das Produkt 1 bei 2% eine stark oxidierende Wirkung hatte, wurde eine Konzentration von 0,5% eingehalten.
Zur Bestimmung der Dosierungen wurde ein Spektrophotometer vom Typ PERKIN ELMER verwendet. Die Photolyse erfolgte jeweils durch Stimulation mit Sonnenlicht, wozu eine Xenonbogenlampe eingesetzt wurde.
Zur Erfassung der stabilen freien Radikale wird ein Spektrometer vom Typ ER 200 BRUKER verwendet.
In eine in den Innenraum des RPE-Geräts eingesetzte Quarzzelle werden 200 ul einer Pheomelaninlösung (2 mg/ml, pH-Wert 7,4) gegeben. Der Lichtstrahl der Lampe wird auf den Innenraum so fokussiert, daß die Bestrahlung in situ im RPE- Gerät erfolgt.
Das RPE-Spektrum erhält man vor (spezifisches Signal) und nach der Bestrahlung (Bestrahlungssignal).
Ein Vergleich der Amplitude des Bestrahlungssignals von Pheomelanin in Gegenwart und bei Abwesenheit des Produkts wird anschließend vorgenommen. Dabei wird die Amplitude des Signals der Pheomelaninlösung vor und nach Bestrahlung, zunächst bei Abwesenheit des untersuchten Produkts, anschließend in Anwesenheit des Produkts, gemessen.
Dann werden die mittlere Amplitude und der Abstandstypus der spezifischen Signale (AIN) und der Bestrahlungssignale AILL) von Pheomelanin in Anwesenheit und bei Abwesenheit des Produkts berechnet. Die Wirkung des untersuchten Produkts wird rechnerisch nach folgender Beziehung ermittelt, welche die prozentuale Veränderung der Amplitude V ausdrückt:
Die Werte der prozentuale Veränderung der Amplitude des Bestrahlungssignals bei Anwesenheit des untersuchten Produkts sind in der nachstehenden Tabelle 3 ausgewiesen. TABELLE 3
Eine Verringerung der Amplitude des Signals des mit Licht bestrahlten Pheomelanins wird bei Anwesenheit von 5 Produkten beobachtet, doch kann festgestellt werden, daß diese Verringerung nur bei 3 Produkten wirklich erheblich ist, und zwar beim Extrakt aus grünem Kaffee ERL, bei Tocopherol-Linoleat und beim Algenextrakt ARL.
Diese Produkte zeigen somit eine gute Wirksamkeit bei der Unterbindung der Bildung freier Radikale.
Die anderen Produkte führen zu einer Erhöhung des Signals des mit Licht bestrahlten Pheomelanins, insbesondere das Produkt 1 bei 0,5% und das Produkt 3 bei 2%, so daß diese Produkte als oxidationsfördernd gelten.

BEISPIEL 5: Wirkung gegen Radikale in Abhängigkeit von Konzentration und Synergie zwischen ARL und ECV

Hierzu wird nach derselben Vorgehensweise wie zuvor gearbeitet, und die Werte der prozentualen Veränderung der Amplitude des Bestrahlungssignals in Abhängigkeit von den Konzentrationen der Produkte sind in der nachfolgenden Tabelle 4 für ECV, für Tocopherol-Linoleat und schließlich für ARL ausgewiesen. TABELLE 4
Es ist festzustellen, daß das Produkt ECV im wesentlichen dieselbe Verringerung der Bildung von Radikalen herbeiführt, wenn seine Konzentration zwischen 0,5 und 4% schwankt.
Das Tocopherol-Linoleat führt zu einer konzentrationsabhängigen Verringerung der Bildung von Radikalen. Diese Verminderung ist erst ab 2% erheblich.
Das Produkt ARL führt zu einer konzentrationsabhängigen Verringerung der Bildung von Radikalen, die erst ab einer Konzentration von 2% erheblich ist und sich ab 4% nicht mehr erhöht.
Anschließend wurden zwei Gemische aus diesen Produkten untersucht, und zwar
- ECV bei 0,5% + Tocopherol-Linoleat bei 2%
- ECV bei 0,5% + ARL bei 4%.
Die prozentualen Werte der Veränderung der Amplitude des Bestrahlungssignals in Abhängigkeit von diesen Kombinationen sind in Tabelle 5 dargestellt. TABELLE 5 Prozentuale Veränderung der Amplitude des Bestrahlungssignals in Anwesenheit von Kombinationen der Produkte
Es kann festgestellt werden, daß die beiden untersuchten Produkt-Kombinationen zu einer Verringerung der Bildung von Radikalen führen, doch kann ebenfalls festgestellt werden, daß die aus den Produkten ECV und ARL gebildete Kombination die weitaus stärkere Verringerung herbeiführt, da bei Anwesenheit dieser Kombination die prozentuale Veränderung der Amplitude des Bestrahlungssignals von Pheomelanin -56,33% ü/- 4,37 beträgt.
Die aus ECV bei 0,5% und ARL bei 4% gebildete Kombination entwickelt somit eine stark ausgeprägte Fähigkeit zur Unterdrückung der Bildung freier Radikale durch mit Licht bestrahltes Pheomelanin.
Was an dieser Kombination von Wirkstoffen interessant ist, ist die Synergiewirkung hinsichtlich der Aktivität zwischen diesen Produkten, wobei ARL durch seine Eigenschaften gegen Radikale, gegen Verschmutzungsstoffe wirksam ist und somit die Zellen der Haut äußerlich und innerlich vor der Wirkung stark oxidierender Stoffe wie Hydroxylgruppen schützt, während der Extrakt aus grünem Kaffee einen Schutz vor dem Angriff von Radikalen bietet, die mit der UV-Bestrahlung verbunden sind.

BEISPIEL 6: Tagescreme und Nachtcreme

Nachstehend werden mehrere Beispiele für erfindungsgemäße kosmetische Präparate rein exemplarisch ohne jegliche Einschränkung aufgeführt. Im ersteren Fall handelt es sich um eine Tagescreme und im zweiten Fall um eine Nachtcreme, deren jeweilige Zusammensetzung in der nachfolgenden Tabelle 6 angegeben ist: TABELLE 6

Beispiel 7: Make-up

- Wasser auf 100,000
- Propylenglykol 10,000
- Xanthangummi 0,300
- Dimethicon 2,000
- mineralisches Öl 5,000
- Sorbitanstearat 2,000
- Sorbitanstearat PEO 2,000
- Isostearyl-Neopentanoat 5,000
- Capryl-Caprin-Triglycerid 4,000
- Talkum 2,000
- Eisenoxidpigmente (rot, braun-gelb, schwarz) 2,500
- Titanoxid 8,000
- Glimmer 1,000
- Phenoxyethanol 0,400
- Methylparaben 0,300
- Butylparaben 0,100
- Isobutylparaben 0,050
- Propylparaben 0,100
- Ethylparaben 0,050
- Tocopherol-Linoleat 3%
- ARL-Extrakt 4%
- ECV

BEISPIEL 8

Die erfindungsgemäße Kombination aus ARL und einem Extrakt aus grünem Kaffee weist nicht nur sehr interessante Eigenschaften auf, die Radikalen und Verschmutzungsstoffen entgegenwirken, sondern sie besitzt auch entzündungshemmende Wirkung, wie das nachfolgende Beispiel zeigt, das mittels der Tagescreme hergestellt wurde, deren Zusammensetzung aus Tabelle 6 hervorgeht.
Die entzündungshemmende Wirkung wurde am Menschen durch Messung der Hautdurchblutung auf der Grundlage eines Modells der Entzündung durch Methylnicotinat bewertet.
Die untersuchten Produkte waren wie folgt:
- Tagescreme mit der Zusammensetzung gemäß Tabelle 6, wobei diese Tagescreme allerdings die erfindungsgemäße Kombination umfaßte;
- ein Präparat auf der Grundlage von Niflumsäure (NiflurilR) als positive Vergleichssubstanz, und
- eine unbehandelte unbedeckte Haut als negative Vergleichsprobe.
Die Versuche wurden an zehn freiwilligen gesunden Versuchspersonen vorgenommen, die zuvor über die Art der Versuche informiert worden waren und ihre Zustimmung erklärt hatten (9 Frauen, 1 Mann, durchschnittliches Alter: 26 Jahre).
Die Veränderungen in der Mikrozirkulation in der Haut wurden durch Dopplerlaser-Velocimetrie (Periflux PF2B) gemessen.

Versuchsprotokoll

Das Untersuchungsgebiet besteht aus der Innenfläche des Unterarms. Die Messungen wurden in gesteuerter Atmosphäre mit einer gleichbleibenden Temperatur von 22ºC und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 55% vorgenommen.
Vor Erfassung ließ man die Versuchspersonen fünfzehn Minuten ruhen. Nach zufälliger Zuordnung wurden die Creme und die positive Vergleichsprobe in einer Menge von 4 mg/cm² aufgetragen. Durch Vorversuche war es möglich, die Okklusionszeit zu bestimmen, die erforderlich ist, um eine optimale pharmakologische Reaktion zu erhalten. Diese Zeit beträgt 3 Stunden.
Jeder Bereich, darunter auch ein Vergleichsbereich mit unbehandelter Haut, wird dann drei Stunden lang mit einem Okklusionsverband abgedeckt.
Der Okklusionsverband wird anschließend abgenommen und die Bereiche werden gewaschen und gereinigt.
Nach fünf Minuten wird auf die Versuchsbereiche eine wäßrige Lösung von 0,5% Methylnicotinat aufgetragen, um die Entzündung hervorzurufen.
Nun wird die Hautdurchblutung über einen Zeitraum von 30 Minuten aufgezeichnet.

Ergebnisse

Die Ergebnisse der Untersuchung der Wirkung der Präparate in vivo auf die Hautdurchblutung werden durch die Berechnung der Flächen unter den Kurven (ASC) bezüglich der physiologischen Basislinie ausgedrückt, die auf einem unbehandelten und nicht okklusiv abgedeckten Bereich gemessen wird.
Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 7 ausgewiesen.
TABELLE 6
Ergebnisse der Flächendaten unter den unbearbeiteten Kurven
Der Prozentsatz der Unterdrückung der Entzündung wurde für die Tagescreme berechnet, in welcher die Kombination der erfindungsgemäßen Wirkstoffe enthalten war, sowie für die NiflurilR-Creme, jeweils nach der folgenden Formel:
Die für das Produkt NiflurilR ermittelte prozentuale Entzündungshemmung beträgt 81,26%.
Die für die erfindungsgemäße Creme ermittelte prozentuale Entzündungshemmung beträgt 75,84%.
Die erfindungsgemäße Pflegecreme verringert somit die durch Methylnicotinat hervorgerufene Entzündung stark.
Diese hemmende Wirkung ist nahezu äquivalent zu der Wirkung, die mit der entzündungshemmenden Creme NiflurilR erzielt wird, was ein absolut bemerkenswertes Ergebnis darstellt.
Die Kombination der erfindungsgemäßen Wirkstoffe besitzt somit neben ihren Eigenschaften der Wirkung gegen Radikale und gegen Verschmutzungsstoffe eine ganz erhebliche und sehr interessante Wirkung auf eine mit Methylnicotinat herbei geführte Entzündung und bewirkt dabei eine beträchtliche Hemmung der Entzündungsreaktion.

Claims

1. Kosmetisches oder pharmazeutisches Präparat zur topischen Verwendung, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens einen Hydroglykolextrakt aus den Algen Chlorella, Scenedesmus und Spirulina und mindestens einen Extrakt aus grünem Kaffee in wirksamer Menge enthält.

2. Kosmetisches oder pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Gewichtsverhältnis zwischen dem Algenextrakt und dem Extrakt aus grünem Kaffee zwischen 1/1 und 30/1 liegt, vorzugsweise zwischen 2/l und 20/l und in besonders bevorzugter Weise zwischen 3/1 und 15/1.

3. Präparat nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß es 0,01 Gew.-% bis 8 Gew.-%, vorzugsweise 0,02 bis 5 Gew.-% und in besonders bevorzugter Weise 0,05 bis 5 Gew.-% an Extrakt aus grünem Kaffee enthält.

4. Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es 0,1 Gew.-% bis 15 Gew.-%, vorzugsweise 0,2 bis 12 Gew.-% und in besonders bevorzugter Weise 0,5 bis 8 Gew.-% an Algenextrakt enthält.

5. Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Algenextrakt durch Hydroglykolextraktion aus einem Gemisch erhalten wird, welches jede der Algen Chlorella, Scenedesmus und Spirulina in einer Menge von mindestens 5%, vorzugsweise mindestens 10%, enthält.

6. Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß in dem Extrakt aus grünem Kaffee Kaffeesäure in einer Konzentration vorliegt, die, bezogen auf die Trockenmasse des Extrakts, höher ist als 40%, vorzugsweise höher als 45% und in besonders bevorzugter Weise höher ist als 50%.

7. Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß es außerdem 0,01 bis 6 Gew.-% Tocopherole enthält, die vorzugsweise aus Tocopherol-Linoleat bestehen.

8. Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß es des weiteren 0,001% bis 0,1% eines Komplexbildners enthält, der vorzugsweise aus Natrium-EDTA besteht.

9. Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß es in Form einer Lotion, einer Emulsion, einer Milch, von Mikrokügelchen, von Mikrogranulat, einer Creme, eines Gels, eines Balsams oder eines Aerosolsprays, von Liposomen oder ionischen bzw. nichtionischen Bläschen vorliegt.

10. Verwendung eines Hydroglykolextrakts aus den Algen Chlorella, Scenedesmus und Spirulina in Verbindung mit einem Extrakt aus grünem Kaffee zur Herstellung kosmetischer oder pharmazeutischer Präparate, die zur Behandlung der Haut oder des Haarsystems und zur Behandlung zur Entzündungsbekämpfung bestimmt sind.

11. Verfahren zur kosmetischen Behandlung der Haut und des Haarsystems, dadurch gekennzeichnet, daß auf die Haut bzw. das Haarsystem eine wirksame Menge eines Hydroglykolextrakts aus den Algen Chlorella, Scenedesmus und Spirulina in Verbindung mit einem Extrakt aus grünem Kaffee aufgetragen wird.