DE69332665T2

DE69332665T2 - Methode um mrna zu klonieren

Info

Publication number: DE69332665T2
Application number: DE69332665T
Authority: DE
Inventors: F. Bianchi; Peng Liang; B. Pardee
Original assignee: Harvard College; Dana Farber Cancer Institute Inc
Current assignee: Harvard College; Dana Farber Cancer Institute Inc
Priority date: 1992-03-11
Filing date: 1993-03-11
Publication date: 2003-11-27
Anticipated expiration: 2013-03-12
Also published as: US5665547A; EP0592626B1; WO1993018176A1; US5965409A; JPH07500735A; EP0592626A1; ATE231920T1; CA2102784A1; DE69332665D1; JP2843675B2; EP0592626A4; US5599672A

Description

Diese Erfindung betrifft Verfahren zum Nachweis und zur Klonierung einzelner mRNAs.
Die Aktivität von Genen in Zellen spiegelt sich in der Art und Menge ihrer mRNA und Proteinarten wider. Die Genexpression ist für Prozesse wie beispielsweise Alterung, Entwicklung, Differenzierung, Stoffwechselproduktion, Progression des Zellzyklus und infektiöse oder genetische oder andere Krankheitsstadien entscheidend. Die Identifizierung exprimierter mRNAs ist für die Aufklärung der molekularen Mechanismen und für Anwendungen auf die oben erwähnten Prozesse wertvoll.
Säugerzellen enthalten ungefähr 15.000 verschiedene mRNA-Sequenzen, allerdings liegt jede mRNA-Sequenz in verschiedener Häufigkeit in der Zelle vor. Im Allgemeinen sind mRNAs in einem von drei Levelsexprimiert. Einige wenige "reichliche" mRNAs liegen mit etwa 10.000 Kopien pro Zelle vor, etwa 3.000- 4.000 "intermediäre" mRNAs liegen mit 300-500 Kopien pro Zelle vor, und etwa 11.000 "gering reichliche" oder "seltene" mRNAs liegen mit etwa 15 Kopien pro Zelle vor. Die zahlreichen Gene, die von den intermediären und weniger häufigen mRNAs repräsentiert sind, können mit verschiedenen, gut etablierten Techniken kloniert werden (siehe zum Beispiel Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Press, Seiten 8.6-8.35). Falls etwas über die Gensequenz oder das Protein bekannt ist, stehen mehrere direkte Klonierungsverfahren zur Verfügung. Falls allerdings die Identität des gewünschten Gens nicht bekannt ist, muss man in der Lage sein, das gewünschte Genprodukt zu selektieren oder anzureichern, um das "unbekannte" Gen zu identifizieren, ohne viel Zeit und Ressourcen aufzuwenden.
Die Identifizierung unbekannter Gene kann oft die Anwendung subtraktiver oder differentieller Hybridisierungstechniken mit einschließen. Subtraktive Hybridisierungstechniken beruhen auf der Verwendung sehr eng verwandter Zellpopulationen, so dass Unterschiede in der Genexpression primär das/die Gen(e) von Interesse repräsentieren. Ein Schlüsselelement der subtraktiven Hybridisierungstechnik ist der Aufbau einer umfassenden komplementär-DNA ("cDNA") Bibliothek.
Der Aufbau einer umfassenden cDNA-Bibliothek ist jetzt geradezu ein Routineverfahren. PolyA mRNA wird aus den gewünschten Zellen hergestellt und der erste Strang der cDNA wird unter Verwendung einer RNA-abhängigen DNA- Polymerase ("reverse Transcriptase") und eines Oligodesoxynucleotid-Primers mit 12 bis 18 Thymidin-Resten synthetisiert. Der zweite Strang der cDNA kann mit mehreren Verfahren synthetisiert sein, wobei die effizientesten von diesen als "Ersetzungssynthese" und "Primed-Synthese" bekannt sind.
Ersetzungssynthese beinhaltet die Verwendung von Ribonuclease H ("RNAase H"), die das Phosphodiester-Rückgrat der RNA in einem RNA : DNA Hybridmolekül schneidet und ein 3'-Hydoxyl- und ein 5'-Phosphatende zurücklässt, um Einzelstrangbrüche und Lücken im mRNA-Strang zu bilden, um so eine Reihe an RNA- Primer zu schaffen, die von der E. coli DNA-Polymerase I oder ihrem "Klenow" Fragment genutzt werden, um den zweiten cDNA-Strang zu synthetisieren. Diese Reaktion ist hoch effizient; allerdings fehlt den produzierten cDNAs sehr häufig der 5'-Terminus der mRNA-Sequenz.
Die Primed-Synthese zur Erzeugung des zweiten cDNA-Strangs ist die allgemeine Bezeichnung für verschiedene Verfahren, die schwieriger als die Ersetzungssynthese sind, jedoch die 5'-terminalen Sequenzen mit hoher Effizienz klonieren. Im Allgemeinen wird nach der Synthese des ersten cDNA-Strangs das 3'- Ende der cDNA mit terminaler Transferase verlängert, ein Enzym, das einen homopolymeren "Schwanz" aus Desoxynucleotiden, normalerweise Desoxycytidylat, anfügt. Dieser Schwanz wird dann an einen Oligodesoxyguanidylat-Primer oder an ein synthetisches DNA-Fragment mit einem Desoxyguanidylat-Schwanz hybridisiert und der zweite cDNA-Strang wird unter Verwendung einer DNA-abhängigen DNA- Polymerase synthetisiert.
Die Primed-Synthese ist ein effektives Verfahren, aber das Verfahren ist arbeitsaufwändig und alle resultierenden cDNA-Klone besitzen einen Desoxyguanidylat-Abschnitt unmittelbar stromaufwärts der mRNA-Sequenz. Dieser Desoxyguanidylat-Abschnitt kann mit der Transcription der DNA in vitro oder in vivo und mit der Sequenzierung der Klone nach der Sanger Didesoxynucleotid- Sequenzierungsmethode interferieren.
Sobald beide cDNA-Stränge synthetisiert worden sind, wird eine cDNA- Bibliothek mittels Klonierung der cDNA in ein geeignetes Plasmid oder viralen Vektor konstruiert. In der Praxis geschieht dies durch direktes Ligieren der stumpfen Enden der cDNAs in einen Vektor, der mit einer Restriktionsendonuclease verdaut worden ist, um stumpfe Enden zu bilden. Ligationen stumpfer Enden sind allerdings ineffizient, und somit nicht ein Verfahren der ersten Wahl. Ein normalerweise angewandtes Verfahren beinhaltet ein Anfügen synthetischer Linker oder Adaptoren, die Restriktionsendonucleasen-Erkennungssequenzen enthalten, an die Enden der cDNAs. Die cDNAs können dann in den gewünschten Vektor mit höherer Effizienz kloniert werden.
Sobald eine umfassende cDNA-Bibliothek aus einer Zelllinie konstruiert ist, können die gewünschten Gene unter Zuhilfenahme der subtraktiven Hybridisierung identifiziert werden (siehe zum Beispiel Sargent, T. D., 1987, Meth. Enzymol., Vol. 152, Seiten 423-432; Lee et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, Vol. 88, Seiten 2825-2830). Ein allgemeines Verfahren zur subtraktiven Hybridisierung erfolgt folgendermaßen. Der komplementäre cDNA-Strang wird synthetisiert und radiomarkiert. Diese einzelsträngige cDNA kann aus PolyA mRNA oder von einer vorhandenen cDNA-Bibliothek hergestellt sein. Die radiomarkierte cDNA wird an einen großen Überschuss mRNA einer engverwandten Zeilpopulation hybridisiert. Nach Hybridisierung werden die cDNA : mRNA Hybride aus der Lösung durch Chromatographie auf einer Hydroxylapatit-Säule entfernt. Die verbleibende "subtrahierte" radiomarkierte cDNA kann dann zur Durchmusterung einer cDNA oder genomischen DNA-Bibliothek der selben Zeilpopulation verwendet werden.
Die subtraktive Hybridisierung entfernt den Großteil der in beiden Zellpopulationen exprimierten Gene und reichert folglich die Gene an, die nur in der gewünschten Zellpopulation vorhanden sind. Falls die Expression einer bestimmten mRNA-Sequenz nur etwas höher in der gewünschten Zeilpopulation ist als in der subtraktiven Population, ist es allerdings nicht möglich, das Gen mit Hilfe der subtraktiven Hybridisierung zu isolieren.
In Proc. Natl. Acad. Sci., USA, Vol. 86, Seiten 5673-5677, August 1989 Biochemistry, ist eine einseitige Polymerase-Kettenreaktion offengelegt: Die Amplifizierung von cDNA ist eine schnelle Technik, die auf der Polymerase- Kettenreaktion (PCR) beruht, zum direkten Zielen, Verstärken und Sequenzieren von zuvor nicht charakterisierter cDNA. Dieses Verfahren ist nicht auf zuvor sequenzierte Transcripte beschränkt, da es nur zwei aneinander grenzende oder teilweise überlappende spezifische Primer von nur einer Seite des zu amplifizierenden Bereichs erfordert. Diese Primer können beliebig innerhalb der Message lokalisiert sein. Die spezifischen Primer Werden gemeinsam mit nichtspezifischen Primern verwendet, die entweder auf die PolyA+ Region der Message oder auf einen enzymatisch synthetisierten d(A) Schwanz zielen. Paarweise Kombinationen von spezifischen und allgemeinen Primern berücksichtigen die Amplifikation von Regionen sowohl 3' als auch 5' zum Eintrittspunkt in die Message. Die amplifizierten PCR-Produkte können kloniert, direkt mittels genomisches Sequenzieren sequenziert oder zum Sequenzieren mittels Amplifizieren mit einem radioaktiven Primer radiomarkiert werden. Wir verdeutlichen die Leistungsfähigkeiten dieses Versuchsansatzes mit der Gewinnung der cDNA-Sequenzen für α-Troponomyosine des Skelettmuskels vom gemeinen europäischen Frosch (Rana temporaria) und des Zebrafisches (Brachydanio rerio) unter Verwendung von nur 300 ng Gesamt-Poly(A)&spplus; Präparation. In diesen Beispielen erreichten wir einen ersten Zugang in die Tropomyosin-Messages unter Verwendung heterologer Primer (für konservierte Regionen), die von einer α- Tropomyosin-Sequenz des Rattenskelettmuskels abstammen. Die Frosch- und Zebrafisch-Sequenzen werden in einer Untersuchung der Tropomyosin-Evolution über den ganzen Vertebraten-Stammbaum verwendet. Die Ergebnisse unterstreichen die konservative Natur des Tropomyosin-Moleküls und stützen die Vorstellung einer zwingenden Heptapeptid-Einheit als das fundamentale Strukturmotiv von Tropomyosin.
In Nucleic Acids Research, Vol. 19, Nr. 7, ist eine effiziente doppelsträngige Sequenzierung von cDNA-Klonen, die lange Poly(A) Schwänze enthalten, unter Verwendung von Anker-Poly(DT) Primern offengelegt.
Eine Sequenzierung doppelsträngiger DNA-Templates ist zu einem gewöhnlichen und effizienten Verfahren (1) zur schnellen Gewinnung von Sequenz- Daten geworden, während eine Präparation von einzelsträngiger DNA umgangen wird. Wir zeigen hier die Anwendbarkeit dieses Verfahrens beim Sequenzieren von cDNA-Klonen, die lange Poly(A) Abschnitte enthalten. Doppelsträngige cDNAs- Templates, die lange Poly(A) Stränge enthalten, sind mit Vektor-Primern (z. B. universellen M13), der stromabwärts des Poly(A) Schwanzes assoziiert, schwierig zu sequenzieren. Sequenzieren mit diesen Primern führt zu einer langen Poly(T) Leiter, die von einer schlecht zu lesenden Sequenz gefolgt ist (Fig. 1). Bei einem Versuch, dieses Problem zu lösen, synthetisierten wir drei Primer, die (dT)&sub1;&sub7; und entweder (dA) oder (dC) oder (dG) am 3'-Ende enthalten. Wir folgerten, dass das Vorhandensein dieser drei Basen am 3'-Ende die Primer an dem stromaufwärts liegenden Ende des Poly(A) Schwanzes "verankern" würde und ein Sequenzieren der Region unmittelbar stromaufwärts der Poly(A) Region erlauben würde.
Verankerte Primer wurden auf einem Applied Biosystems (ABI) 391 DNA- Synthesierer synthetisiert und nach Reinigung mit Oligonucleotid-Reinigungskartuschen (ABI) verwendet. Für eine Sequenzierung mit verankerten Primern wurde 5-10 ug Plasmid-DNA in einem Gesamtvolumen von 50 ul bestehend aus 0,2 M Natriumhydroxid und 0,16 mM EDTA durch 10 Minuten Inkubation bei 65ºC denaturiert. Die drei Poly(dT) verankerten Primer (jeweils 2 umol) wurden zugegeben und die Mischung sofort auf Eis verbracht. Die Lösung wurde dann durch Zugabe von 5 ul 5 M Ammoniumacetat pH 7,0 neutralisiert. Die DNA wurde durch Zugabe von 150 ul kaltem 95% Ethanol gefällt und das Pellet zweimal mit kaltem 70% Ethanol gewaschen. Das Pellet wurde 5 Minuten getrocknet und dann in 1x Sequenzierungspuffer (1x = 40 mM Tris-HCl, pH 7,5, 20 mM MgCL&sub2;, 50 mM NaCl) resuspendiert. Primer wurden durch 2 Minuten Erhitzen der Lösung auf 65ºC und anschließendes langsames Abkühlen auf Raumtemperatur assoziiert. Sequenzierungsreaktionen unter Verwendung modifizierter T7-DNA-Polymerase (Sequenase, United States Biochemicals) wurden dann unter Verwendung von [³²P]α-dATP (> 1000 Ci/mmol) gemäß dem mit dem Sequenase Kit mitgelieferten Protokoll durchgeführt. Unter diesen Bedingungen konnten über 300 bp lesbare Sequenz erhalten werden (Fig. 1). Wir haben diesen Versuchsansatz auf mehrere andere Poly(A)-haltige cDNA-Klone mit ähnlichen Ergebnissen angewandt. Sequenzierung des Gegenstrangs dieser cDNA unter Verwendung Insert-spezifischer Primer bestätigte, dass die mit den verankerten Primern erhaltenen Sequenzen direkt stromaufwärts der Poly(A) Region vorkamen (Daten nicht gezeigt).
Die Möglichkeit, Sequenzen unmittelbar stromaufwärts des Poly(A)-Schwanzes von cDNAs direkt zu erhalten, wie hier gezeigt ist, sollte von besonderer Bedeutung für noch größere Anstrengungen für "gene sequence-tagged sites (STSs)" (2) aus cDNAs (3) sein.
In Nucleic Acids Research, Vol. 19, Nr. 13, Seite 3747, ist eine neue 3' Erweiterungstechnik unter Verwendung von Zufallsprimern in RNA-PCT offengelegt.
Um die Sequenz 3' zu einer partiellen ~2 kb Titin-Sequenz der > 21 kb Titin mRNA zu erhalten (1), die zu weit von dem Poly(A) Schwanz für 3' RACE Methodik entfernt war (2), wurde RNA-PCR (3, 4) unter Verwendung eines Primers durchgeführt, der ein zufälliges Hexamer an seinem 3'-Ende enthält. Vier ug Gesamt-RNA des Kaninchenherzmuskels (5) in 25 ul wurden entsprechend der Empfehlung von BRL unter Verwendung von 100 ng RT-Primer (Fig. 1) und 200 E MLV reverser Transcriptase (BRL) revers transcribiert. Nach RNAse H Verdau wurden 10 ul für eine PCR in 100 ul unter Verwendung von zu jeder bekannten Titin-Sequenz komplementären Primern (Fig. 1, TS 1) oder des RT-Primers (Fig. 1, Y-Primer) und 30 Zyklen mit 93ºC 45 sec; 45ºC 1,5 min, 72ºC 3,0 min verwendet. Obwohl definierte Fragmente von 100 bis 1000 bp nach der ersten PCR beobachtet wurden (Fig. 2a), wurden nur Fragmente < 700 bp mittels Geneclean (Bio 101) gereinigt, während einer zweiten PCR unter Verwendung von Primern reamplifiziert, die zum RT-Primer (Fig. 1, X-Primer mit einer SalI Stelle) oder zur bekannten Titin-Sequenz (Fig. 1, TS2 mit einer NotI Stelle) komplementär sind. Geringere oder höhere Konzentrationen des RT-Primers ergaben keine beziehungsweise sehr kleine Amplifikationsprodukte. Nur der zufällige Hexamer-Teil des RT-Primers initiierte eine reverse Transcription von 6 bp Sequenzen der Titin-RNA, die wenigstens 50% G/C-Gehalt besaß.
Die Produkte der letzten Amplifikation (Fig. 2b) wurden mit Didesoxy- Kettenabbruch-Verfahren unter Verwendung von Sequenase (US Biochemical) nach Verdau mit NotI und SalI Restriktionsenzymen und Ligation in pBluescript (Stratagene) sequenziert. Zwei Klone wurden auf Grund einer möglichen Ungenauigkeit der Taq-Polymerase sequenziert. Nach dreimaligem Wiederholen der gesamten Prozedur unter Verwendung neuer Sätze Titin-spezifischer Primer wurde die Titin-Sequenz auf 1109 bp erweitert (EMBL Hinterlegungsnummer X59596). Der zweite Amplifizierungsschritt könnte möglicherweise weggelassen werden oder zum Sequenzieren asymmetrisch erfolgen.
Diese Technik sollte ebenfalls auf 5'-Erweiterungen von cDNA-Klonen anwendbar sein. Vielleicht könnte eine Modifikation von ihr auf Erweiterungen von bekannter genomischer DNA in jede Richtung angewandt werden.
Im Journal of Cell Biology, Vol. 115, Nr. 4, November 1991, Seiten 887-903, ist eine Analyse von Vertebraten mRNA offengelegt: Mitteilungen über eine translationale Kontrolle.
Es wurde festgestellt, dass fünf Strukturmerkmale in mRNAs zur Genauigkeit und Effizienz der Initiation von eukaryotischen Ribosomen beitragen. Eine Überprüfung von Vertebraten cDNA-Sequenzen im Lichte dieser Kriterien ergab eine Reihe von Transcripten - die Onkoproteine, Wachstumsfaktoren, Transcriptionsfaktoren und weitere regulatorische Proteine codieren - die für eine geringe Translation konstruiert zu sein scheinen. Folglich kann eine Drosselung auf Translationsebene ein wichtiger Bestandteil der Genregulation in Vertebraten sein. Eine alternative Interpretation ist, dass einige (vielleicht viele) cDNAs mit 5'-nichtcodierenden Sequenzen, die mRNA-Vorläufer darstellen, belastet sind, was eine beträchtliche Regulation bei einem posttranscriptionalen Schritt implizieren würde, der der Translation vorhergeht.
Wir haben ein Verfahren zur Identifizierung, Isolierung und Klonierung von mRNAs wie auch cDNAs unter Verwendung eines Polymerase-Amplifikationsverfahrens entwickelt, in dem mindestens zwei Oligodesoxynucleotid-Primer eingesetzt sind. In einem Versuchsansatz enthält der erste Primer eine Sequenz mit der Fähigkeit, an eine Stelle zu hybridisieren, die eine Sequenz umfasst, die unmittelbar stromaufwärts des ersten A-Ribonucleotids des PolyA-Schwanzes der mRNA liegt, und der zweite Primer enthält eine beliebige Sequenz. In einem anderen Versuchsansatz enthält der erste Primer eine Sequenz mit der Fähigkeit, an eine Stelle zu hybridisieren, die die PolyA-Signal-Sequenz der mRNA umfasst, und der zweite Primer enthält eine beliebige Sequenz. In einem weiteren Versuchsansatz enthält der erste Primer eine beliebige Sequenz und der zweite Primer enthält eine Sequenz mit der Fähigkeit, an eine Stelle zu hybridisieren, die die Kozak-Sequenz der mRNA umfasst. In einem weiteren Versuchsansatz enthält der erste Primer eine Sequenz, die zu der Sequenz einer mRNA mit einer bekannten Sequenz im Wesentlichen komplementär ist, und der zweite Primer enthält eine beliebige Sequenz. In einem weiteren Versuchsansatz enthält der erste Primer eine beliebige Sequenz und der zweite Primer enthält eine Sequenz, die zu der Sequenz einer mRNA mit einer bekannten Sequenz im Wesentlichen identisch ist. Der erste Primer wird als ein Primer für reverse Transcription der mRNA verwendet und die resultierende cDNA wird mit einer Polymerase unter Verwendung sowohl des ersten als auch des zweiten Primers als einen Primer-Satz amplifiziert.
Durch Anwendung dieses Verfahrens mit verschiedenen Paaren aus den alternierenden Primern können praktisch beliebige oder alle mRNAs von beliebigen Zelltypen oder beliebigen Stadien des Zellzyklus, einschließlich in sehr geringen Mengen vorliegende mRNAs, identifiziert und isoliert werden. Zusätzlich kann ein Vergleich der mRNAs eng verwandter Zellen, die zum Beispiel aus verschiedenen Entwicklungsstadien oder verschiedenen Stadien des Zellzyklus sein können, zeigen, welche der mRNAs konstitutiv exprimiert und welche differentiell exprimiert sind, sowie ihre jeweilige Expressionshäufigkeit aufzeigen.
Der "erste Primer" oder das "erste Oligodesoxynucleotid", wie hier verwendet, ist als der Oligodesoxynucleotid-Primer definiert, der für die reverse Transcription der mRNA verwendet ist, um einen ersten cDNA-Strang herzustellen, und dann ebenfalls zur Amplifikation der cDNA verwendet ist. Der erste Primer kann ebenfalls als der 3'-Primer bezeichnet sein, da dieser Primer an die mRNA hybridisiert und das 3'-Ende des ersten cDNA-Strangs definiert. Der "zweite Primer", wie hier verwendet, ist als der Oligodesoxynucleotid-Primer definiert, der zur Herstellung des zweiten cDNA-Strang verwendet ist, und dann ebenfalls zur Amplifikation der cDNA verwendet ist. Der zweite Primer kann ebenfalls als der 5'-Primer bezeichnet sein, da dieser Primer an den ersten cDNA-Strang hybridisiert und das 5'-Ende des zweiten cDNA-Strangs definiert.
Die "beliebige" Sequenz eines Oligodesoxynucleotid-Primers, wie hier verwendet, ist definiert als beruhend auf oder als Gegenstand individueller Beurteilung oder individuellen Ermessens.
In einigen Fällen kann die beliebige Sequenz vollständig zufällig oder teilweise zufällig für eine oder mehrere Basen sein. In anderen Fällen kann die beliebige Sequenz ausgewählt sein, ein bestimmtes Verhältnis von jedem Desoxynucleotid, zum Beispiel in etwa gleiche Anteile eines jeden Desoxynucleotids oder überwiegend ein Desoxynucleotid zu enthalten, oder ein bestimmtes Desoxynucleotid nicht zu enthalten. Die beliebige Sequenz kann ausgewählt sein, eine Erkennungsstelle für eine bestimmte Restriktionsendonuclease zu enthalten oder nicht zu enthalten. Die beliebige Sequenz kann ausgewählt sein, entweder eine Sequenz zu enthalten, die zu einer mRNA mit bekannter Sequenz im Wesentlichen identisch ist (wenigstens 50 Homologe) oder keine Sequenz von einer mRNA bekannter Sequenz zu enthalten.
Ein Oligodesoxynucleotid-Primer kann entweder "komplementär" zu einer Sequenz oder "im Wesentlichen identisch" zu einer Sequenz sein. Wie hier definiert, ist ein komplementärer Oligodesoxynucleotid-Primer ein Primer, der eine Sequenz enthält, die an eine mRNA hybridisiert, das heißt, die Basen sind zueinander komplementär und eine reverse Transcriptase ist in der Lage, den Primer zu erweitern, um einen cDNA-Strang von der mRNA zu bilden. Wie hier definiert, ist ein im Wesentlichen identischer Primer ein Primer, der eine Sequenz enthält, die dieselbe ist wie die Sequenz einer mRNA, die zu mehr als 50% identisch ist, und der Primer die selbe Orientierung besitzt wie eine mRNA, folglich wird er nicht an eine mRNA hybridisieren oder diese ergänzen, sondern ein derartiger Primer kann verwendet sein, um an den ersten cDNA-Strang zu hybridisieren und kann von einer Polymerase erweitert werden, um den zweiten cDNA-Strang zu bilden. Die Fachausdrücke "Hybridisierung" oder "hybridisieren", wie sie hier verwendet sind, sind als Basenpaarung eines Oligodesoxynucleotid-Primers mit einem mRNA- oder cDNA-Strang definiert. Die "Bedingungen, unter denen" ein Oligodesoxynucleotid mit einer mRNA oder cDNA hybridisiert, wie hier verwendet, sind als Temperatur- und Pufferbedingungen definiert (die später beschrieben sind), unter denen die Basenpaarung des Oligodesoxynucleotid-Primers entweder mit einer mRNA oder cDNA erfolgt und nur wenige Fehlpaarungen (eine oder zwei) der Basenpaarung erlaubt sind.
Ein Oligodesoxynucleotid-Primer kann eine Sequenz enthalten, die auch als "Konsensus-Sequenz" einer bekannten mRNA Sequenz bekannt ist. Wie es hier definiert ist, ist eine "Konsensus-Sequenz" eine Sequenz, die in einer Genfamilie von Proteinen mit einer ähnlichen Funktion oder ähnlichen Eigenschaften gefunden worden ist. Die Verwendung eines Primers, der eine Konsensus-Sequenz umfasst, kann zu einer Klonierung zusätzlicher Mitglieder einer gewünschten Genfamilie führen.
Die "bevorzugte Länge" eines Oligodesoxynucleotid-Primers, wie sie hier verwendet ist, ist durch die gewünschte Spezifität der Assoziierung und der Anzahl an Oligodesoxynucleotiden mit der gewünschten Spezifität, die für eine Hybridisierung an alle mRNAs in einer Zelle erforderlich ist, bestimmt. Ein Oligodesoxynucleotid-Primer mit 20 Nucleotiden ist spezifischer als ein Oligodesoxynucleotid- Primer mit 10 Nucleotiden; allerdings erhöht eine Addition von jedem zufälligen Nucleotid an einen Oligodesoxynucleotid-Primer, die Anzahl an Oligodesoxynucleotid Primern um Faktor vier, die benötigt werden, um an jede mRNA in einer Zelle zu hybridisieren.
In einem Aspekt kennzeichnet die Erfindung allgemein ein Verfahren zur Identifizierung und Isolierung von mRNAs durch Priming einer mRNA-Präparation für eine reverse Transcription mit einem ersten Oligodesoxynucleotid-Primer, der eine Sequenz mit der Fähigkeit enthält, an eine Stelle einschließlich der Sequenz, die unmittelbar stromaufwärts des ersten A-Ribonucleotids des PolyA-Schwanzes der mRNA liegt, zu hybridisieren, und die cDNA mit Hilfe eines Polymerase- Amplifikationsverfahrens unter Verwendung des ersten Primers und eines zweiten Oligodesoxynucleotid-Primers, zum Beispiel ein Primer mit einer beliebigen Sequenz als einen Primer-Satz, zu amplifizieren.
In bevorzugten Anwendungsformen enthält der erste Primer mindestens 1 Nucleotid am 3'-Ende des Oligodesoxynucleotids, das an eine mRNA-Sequenz hybridisieren kann, die unmittelbar stromaufwärts des PolyA-Schwanzes liegt, und mindestens 11 Nucleotide am 5'-Ende enthält, die an den PolyA-Schwanz hybridisieren. Das vollständige 3'-Oligodesoxynucleotid ist vorzugsweise 13 Nucleotide lang und kann bis zu 20 Nucleotide lang sein.
Am bevorzugtesten enthält der erste Primer 2 Nucleotide am 3'-Ende des Oligodesoxynucleotids, das an eine mRNA-Sequenz hybridisieren kann, die unmittelbar stromaufwärts des PolyA-Schwanzes liegt. Vorzugsweise besitzen die 2 PolyA-nichtkomplementären Nucleotide die Sequenz VN, wo V Desoxyadenylat ("dA"), Desoxyguanylat ("dG") oder Desoxycytidylat ("dC") ist und N, das 3'- terminale Nucleotid, dA, dG, dC oder Desoxythymidylat ("dT") ist. Folglich ist die Sequenz eines bevorzugten ersten Primers 5'-TTTTTTTTTTTVN [Seq. ID: Nr. 1]. Die Verwendung von 2 Nucleotiden kann für eine korrekte Positionierung des ersten Primers an der Verbindungsstelle zwischen der mRNA und deren PolyA-Schwanz sorgen, da gut alinierte Oligodesoxynucleotid : mRNA Hybride stabiler sind als nicht so gut alinierte Hybride, und folglich sich gut alinierte Hybride bilden und bei höheren Temperaturen hybridisiert bleiben. In bevorzugten Anwendungen wird die mRNA-Probe in mindestens zwölf Aliquote aufgeteilt und eine der 12 möglichen VN-Sequenzen des ersten Primers wird in jeder Reaktion zum Starten der reversen Transcription der mRNA verwendet. Die Verwendung eines Oligodesoxynucleotids mit einer einzigen Sequenz vermindert die Anzahl an mRNAs, die in jeder Probe untersucht werden sollen, durch Binden an eine Untergruppe der mRNA, statistisch 1/12, was folglich die Identifizierung der mRNAs in jeder Probe vereinfacht.
In manchen Anwendungsformen kann das 3'-Ende des ersten Primers 1 Nucleotid, das an eine mRNA-Sequenz hybridisieren kann, die unmittelbar stromaufwärts des PolyA-Schwanzes liegt, und 12 Nucleotide am 5'-Ende besitzen, die an den PolyA-Schwanz hybridisieren, folglich besitzt der Primer die Sequenz 5'- TTTTTTTTTTTTV [Seq. ID. Nr. 2]. Die Verwendung eines einzigen nicht-PolyA- komplementären Desoxynucleotids würde die Anzahl an Oligodesoxynucleotiden auf 3 vermindern, die zur Identifizierung jeder mRNA erforderlich sind, allerdings kann die Verwendung eines einzigen Nucleotids zur Positionierung der Assoziierung vom Primer an die Verbindungsstelle der mRNA-Sequenz und des PolyA-Schwanzes zu einer signifikanten Verringerung der Spezifität der Assoziierung führen und 2 nicht- PolyA-komplementäre Nucleotide sind bevorzugt.
In manchen Anwendungsformen kann das 3'-Ende des ersten Primers 3 oder mehr Nucleotide besitzen, die an eine mRNA-Sequenz hybridisieren können, die unmittelbar stromaufwärts des PolyA-Schwanzes liegt. Die Addition von jedem Nucleotid an das 3'-Ende wird außerdem die Stabilität korrekt alinierter Hybride erhöhen, und die Sequenz für eine Hybridisierung an den PolyA-Schwanz kann um ein Nucleotid für jedes zusätzliche addierte nicht-PolyA-komplementäre Nucleotid vermindert werden. Die Verwendung eines derartigen ersten Primers kann für eine schnelle Durchmusterung von in einer gegebenen Zelllinie enthaltenen mRNAs nicht praktisch sein, da die Verwendung eines ersten Primers mit mehr als zwei Nucleotiden, die an die mRNA unmittelbar stromaufwärts des PolyA-Schwanzes hybridisieren, die Anzahl der zur Identifizierung jeder RNA erforderlichen Oligodesoxynucleotide signifikant erhöht. Zum Beispiel würde der Primer 5'- TTTTTTTTTTVNN [Seq. ID. Nr. 3] die Verwendung von 48 separaten ersten Primern erfordern, um jede mRNA zu binden, und würde die Anzahl der Reaktionen, die zum Durchmusterung der mRNA einer gegebenen Zelllinie erforderlich sind, signifikant erhöhen. Die Verwendung von Oligodesoxynucleotiden mit einem einzigen zufälligen Nucleotid in einer Position als eine Gruppe aus vier kann dieses Problem umgehen, dass 48 separat angesetzte Reaktion zur Identifizierung jeder mRNA notwendig sind. Allerdings, wenn die PolyA-nichtkomplementäre Sequenz länger wird, wird es schnell notwendig, die Anzahl an Reaktionen, die zur Identifizierung jeder mRNA erforderlich sind, zu erhöhen.
In bevorzugten Anwendungsformen besteht der zweite Primer aus einer beliebigen Sequenz und ist mindestens 9 Nucleotide lang. Vorzugsweise ist der zweite Primer meistens 13 Nucleotide lang und kann bis zu 20 Nucleotide lang sein.
In einem weiteren Aspekt kennzeichnet die Erfindung allgemein ein Verfahren zur Herstellung und Isolieren von mRNAs mit Hilfe von Priming einer mRNA- Präparation zur reversen Transcription mit einem ersten Primer, der eine Sequenz mit der Fähigkeit, an die Polyadenylierungssignalsequenz zu hybridisieren, und mindestens 4 Nucleotiden, die 5' oder 3' oder sowohl als auch der Polyadenylierungssignalsequenz positioniert sind, enthält; dieser ganze erste Primer ist vorzugsweise mindestens 10 Nucleotide lang und kann bis zu 20 Nucleotide lang sein. In einer bevorzugten Anwendungsform kann die Sequenz 5'-NNTTTATTNN [Seq. ID. Nr. 4] gewählt sein, so dass die Sequenz 5'-GCTTTATTNC [Seq. ID. Nr. 5] ist und die vier resultierenden Primer sind in einer einzigen Reaktion für das Starten der mRNA für eine reverse Transcription gemeinsam verwendet. Sobald der erste cDNA-Strang durch die reverse Transcription gebildet worden ist, kann der erste Primer mit einem zweiten Primer, zum Beispiel einen beliebigen Sequenz-Primer, für die Amplifikation der cDNA verwendet werden.
In einem weiteren Aspekt kennzeichnet die Erfindung allgemein ein Verfahren zur Identifizieren und Isolieren von mRNAs mit Hilfe von Priming einer mRNA- Präparation zur reversen Transcription mit einem ersten Oligodesoxynucleotid- Primer, um einen ersten cDNA-Strang zu erzeugen, und Priming der Präparation des zweiten cDNA-Strangs mit einem zweiten Primer, der eine im Wesentlichen mit der Kozak-Sequenz der mRNA identische Sequenz enthält, und Amplifizieren der cDNA mit Hilfe eines Polymeraseamplifikationsverfahrens unter Verwendung eines ersten und zweiten Primers als einen Primer-Satz.
In bevorzugten Anwendungsformen sind der erste und zweite Primer mindestens 9 Desoxynucleotide lang und sind meistens 13 Nucleotide lang und können bis zu 20 Nucleotide lang sein. Noch bevorzugter sind der erste und zweite Primer 10 Desoxynucleotide lang.
In bevorzugten Anwendungsformen ist die Sequenz des ersten Primers zufällig ausgewählt oder der erste Primer enthält eine beliebig ausgewählte Sequenz oder der erste Primer enthält eine Restriktionsendonuclease-Erkennungssequenz.
In bevorzugten Anwendungsformen hat die Sequenz des zweiten Primers, der eine im Wesentlichen mit der Kozak-Sequenz identische mRNA-Sequenz enthält, die Sequenz NNNANNATGN [Seq. ID. Nr. 6] oder hat die Sequenz NNNANNATGG [Seq. ID. Nr. 7]. Wo N ein beliebiges der vier Desoxynucleotide ist. Vorzugsweise hat der zweite Primer die Sequenz GCCACCATGG [Seq. ID. Nr. 8]. In einigen Anwendungsformen kann außerdem der erste Primer eine Restriktionsendonuclease- Erkennungssequenz umfassen, die entweder an das 5' oder 3'-Ende des Primers angehängt ist, was die Länge des Primers um mindestens 5 Nucleotide erhöht.
In einem weiteren Aspekt kennzeichnet die Erfindung allgemein ein Verfahren zur Identifizierung und Isolierung von mRNAs durch Priming einer mRNA- Präparation zur reversen Transcription mit einem ersten Oligodesoxynucleotid- Primer, der eine im Wesentlichen komplementäre Sequenz zu einer mRNA-Sequenz mit einer bekannten Sequenz enthält, und Priming der Präparation des zweiten cDNA-Strangs mit einem zweiten Primer und Amplifizieren der cDNA mit Hilfe eines Polymeraseamplifikationsverfahrens unter Verwendung eines ersten und zweiten Primers als einen Primer-Satz.
In bevorzugten Anwendungsverfahren sind der erste und zweite Primer mindestens 9 Desoxynucleotide lang und sind meistens 13 Nucleotide lang und können bis zu 20 Nucleotide lang sein. Am bevorzugtesten sind der erste und zweite Primer 10 Desoxynucleotide lang.
In bevorzugten Anwendungsformen umfasst die Sequenz des ersten Primers außerdem eine Restriktionsendonuclease-Sequenz, die innerhalb der bevorzugten 10 Nucleotide des Primers enthalten ist oder entweder an das 3' oder 5'-Ende des Primers angehängt sein kann, was die Länge des Olidodesoxynucleotid-Primers um mindestens 5 Nucleotide erhöht.
In bevorzugten Anwendungsformen ist die Sequenz des ersten Primers zufällig ausgewählt oder der erste Primer enthält eine beliebige ausgewählte Sequenz oder der zweite Primer enthält eine Restriktionsendonuclease-Erkennungssequenz.
In einem weiteren Aspekt kennzeichnet die Erfindung allgemein ein Verfahren zur Identifizierung und Isolierung von mRNAs durch Priming einer mRNA- Präparation zur reversen Transcription mit einem ersten Oligodesoxynucleotid-Primer und Priming der Präparation des zweiten cDNA-Strangs mit einem zweiten Primer, der eine Sequenz enthält, die im Wesentlichen mit der mRNA-Sequenz mit einer bekannten Sequenz identisch ist, und Amplifizieren der cDNA mit Hilfe eines Polymeraseamplifikationsverfahrens unter Verwendung eines ersten und zweiten Primers als einen Primer-Satz.
In bevorzugten Anwendungsverfahren sind der erste und zweite Primer mindestens 9 Desoxynucleotide lang und sind meistens 13 Nucleotide lang und können bis zu 20 Nucleotide lang sein. Am bevorzugtesten sind der erste und zweite Primer 10 Desoxynucleotide lang.
In bevorzugten Anwendungsformen ist die Sequenz des ersten Primers zufällig ausgewählt oder der erste Primer enthält eine beliebige ausgewählte Sequenz oder der erste Primer enthält eine Restriktionsendonuclease-Erkennungssequenz.
In bevorzugten Anwendungsformen umfasst die Sequenz des zweiten Primers, der eine Sequenz besitzt, die im Wesentlichen zu der Sequenz einer mRNA mit bekannter Sequenz komplementär ist, außerdem eine Restriktionsendonuclease- Sequenz, die innerhalb der bevorzugten 10 Nucleotide des Primers liegt oder entweder an das 3' oder 5'-Ende des Primers angehängt sein kann, was die Länge des Oligodesoxynucleotid-Primers um mindestens 5 Nucleotide erhöht.
In einem weiteren Aspekt kennzeichnet die Erfindung allgemein ein Verfahren zur Identifizierung und Isolierung von mRNAs durch Priming einer mRNA- Präparation zur reversen Transcription mit einem ersten Oligodesoxynucleotid- Primer, der eine Sequenz enthält, die im Wesentlichen zu der Sequenz einer mRNA mit einer bekannten Sequenz komplementär ist, und Priming der Präparation des zweiten cDNA-Strangs mit einem zweiten Primer, der eine Sequenz enthält, die im Wesentlichen mit der Kozak-Sequenz der mRNA identisch ist, und Amplifizieren der cDNA mit Hilfe eines Polymeraseamplifikationsverfahrens unter Verwendung eines ersten und zweiten Primers als einen Primer-Satz.
In bevorzugten Anwendungsverfahren sind der erste und zweite Primer mindestens 9 Desoxynucleotide lang und sind meistens 13 Nucleotide lang und können bis zu 20 Nucleotide lang sein. Am bevorzugtesten sind der erste und zweite Primer 10 Desoxynucleotide lang.
In einigen bevorzugten Anwendungsformen sind jeweils die allgemeinen Aspekte der Erfindung, dass die amplifizierte cDNAs abgetrennt wird und dann die gewünschten cDNAs mit Hilfe der Polymerase-Amplifikationsreaktionsreaktion und dem ersten und zweiten Oligodesoynucleotid-Primer reamplifiziert werden.
In bevorzugten Anwendungsformen sind jeweils die allgemeinen Aspekte der Erfindung, dass ein Satz aus erstem und zweitem Oligodesoxynucleotid-Primer verwendet sein kann, der aus mehr als je einem Primer besteht. In einigen Anwendungsformen ist mehr als einer des ersten Primers an der reversen Transcriptionsreaktion beteiligt und mehr als einer des ersten und zweiten Primers ist an den Amplifikationsreaktionen beteiligt. Die Verwendung von mehr als einem von jedem Primer erhöht die Anzahl an in jeder Reaktion identifizierten mRNAs und die Geamtanzahl an einzusetzenden Primern wird in Abhängigkeit des gewünschten Verfahrens zur Trennung der cDNAs bestimmt, so dass es möglich bleibt, jede einzelne cDNA vollständig zu isolieren. In bevorzugten Anwendungsformen können einige wenige Hundert cDNAs unter Verwendung einer denaturierenden Polyacrylamidgel-Elektrophorese isoliert und identifiziert werden.
Das Verfahren gemäß der Erfindung stellt einen signifikanten Fortschritt gegenüber heutigen Klonierungstechniken dar, die eine subtraktive Hybridisierung nutzen. In einem Aspekt ermöglicht das Verfahren gemäß der Erfindung die Gene, deren Expressionshäufigkeit sich ändert wie auch mRNAs, die konstitutiv und differenziell exprimiert sind, mit einer einfachen optischen Inspektion zu identifizieren und zu isolieren. In einem anderen Aspekt stellt das Verfahrens gemäß der Erfindung spezifische Oligodesoxynucleotid-Primer für eine Amplifikation der gewünschten mRNA wie auch cDNA bereit und macht einen Zwischenschritt der Addition eines homopolymeren Schwanzes an den ersten cDNA-Strang zum Primen eines zweiten cDNA-Strangs überflüssig und vermeidet dadurch jegliche Interferenz des homopolymeren Schwanzes mit der nachfolgenden Analyse des isolierten Gens und seines Produkts. Ein weiterer Aspekt des Verfahrens gemäß der Erfindung erlaubt die Klonierung und Sequenzierung von ausgewählten mRNAs, so dass der Forscher die relative Erwünschtheit des Gens vor Durchmusterung einer umfangreichen cDNA-Bibliothek auf das vollständig lange Genprodukt bestimmen kann.

Beschreibung der bevorzugten Anwendungsformen

Zeichnungen

Fig. 1 ist eine schematische Darstellung des Verfahrens gemäß der Erfindung.
Fig. 2 ist die Sequenz des 3'-Endes des N1-Gens von normalen Fibroblastenzellen der Maus (A31) [Seq. ID. Nr. 9].
Fig. 3 ist ein Northern Blot der N1-Sequenz auf zellulärer Gesamt-RNA von normalen und tumorgenen Fibroblastenzellen der Maus.
Fig. 4 ist ein Sequenzierungsgel, das die Ergebnisse einer Amplifikation von mRNA zeigt, die aus vier Quellen (Spuren 1-4) präpariert wurde, unter Verwendung ausschließlich des Kozak-Primers, ausschließlich des AP-1 Primers, des Kozak und AP-1 Primers, des Kozak und AP-2 Primers, des Kozak und AP-3 Primers, des Kozak und AP-4 Primers und des Kozak und AP-5 Primers, Dieses Gel wird später ausführlicher beschrieben.
Fig. 5 ist eine partielle Sequenz des 5'-Endes eines Klons, K1, der aus der A1-5 Zelllinie kloniert war, die bei der nicht permissiven Temperatur kultiviert war und dann bei der permissiven Temperatur (32,5ºC) 24 h vor der mRNA-Präparation gehalten war. Die A1-5 Zellinie ist von einer primären Rattenembryo- Fibroblastenzelllinie, die mit ras und einer temperatursensitiven Mutation von P&sup5;³ ("P53ts") doppelt transformiert worden ist.

Allgemeine Beschreibung, Entwicklung des Verfahrens

Zur Erläuterung folgt eine Beschreibung von Beispielen der Erfindung mit einer Beschreibung, wie die bestimmten illustrierenden Beispiele entwickelt wurden.
Bei Durchführung des Verfahrens ist es wichtig, dass die Länge des Oligodesoxynucleotids für eine spezifische Hybridisierung an mRNA geeignet ist.
Um eine spezifische Hybridisierung zu erhalten, sei es für herkömmliche Klonierungsverfahren oder PCR, werden normalerweise Oligodesoxynucleotide mit 20 oder mehr Nucleotiden gewählt. Die Verwendung langer Oligodesoxynucleotide in diesem Fall würde die Anzahl an in jedem Versuch identifizierter mRNAs vermindern und die Anzahl an Oligodesoxynucleotiden erhöhen, die für eine Identifizierung jeder mRNA erforderlich wäre. Vor kurzem wurde gezeigt, dass Primer mit 9-10 Nucleotiden zur DNA Polymorphismus-Analyse mittels PCR verwendet werden können (Williams et al., 1991, Nuc. Acids Res., Vol. 18, Seiten 6531-6535).
Das Plasmid, das das klonierte murine Thymidinkinase-Gen ("TK cDNA Plasmid") enthält, wurde als ein Modell-Template zur Bestimmung der erforderlichen Längen der Oligodesoxynucleotide für eine spezifische Hybridisierung an mRNA und zur Herstellung spezifischer PCR-Produkte verwendet. Die Länge des Oligodesoxynucleotid-Primer, der zur Hybridisierung innerhalb der mRNA gewählt wurde, variierte zwischen 6 und 13 Nucleotiden und die Länge des Oligodesoxynucleotid- Primer, der zur Hybridisierung am stromaufwärts liegenden Ende des PolyA- Schwanz gewählt wurde, variierte zwischen 7 und 14 Nucleotiden. Nach zahlreichen Versuchen mit verschiedenen Primer-Sätzen und Längen, wurde ermittelt, dass die Assoziierungstemperatur mit 42ºC für eine Produktspezifität optimal ist und das intern hybridisierende Oligodesoxynucleotid sollte mindestens 9 Nucleotide lang sein und ein Oligodesoxynucleotid, das mindestens 13 Nucleotide lang ist, für eine Bindung am stromaufwärts liegenden Ende des PolyA-Schwanzes erforderlich ist.
Bezugnehmend auf Fig. 1, wo das Verfahren gemäß der Erfindung schematisch dargestellt ist. Die mRNAs Werden mit einem ersten Primer, zum Beispiel TTTTTTTTTTTVN [Seq. ID. Nr. 2] (T&sub1;&sub1;VN) 1, gemischt und revers transcribiert 2, um den ersten cDNA-Strang herzustellen. Die cDNA wird folgendermaßen amplifiziert. Der erste cDNA-Strang wird zu dem zweiten Primer und dem ersten Primer und der Polymerase in dem Standardpuffer mit den geeigneten Konzentrationen an Nucleotiden gegeben und die Komponenten werden auf 94ºC erhitzt, um die mRNA : cDNA Hybride zu denaturieren 3, die Temperatur wird auf 42ºC gesenkt, um den zweiten Primer assoziieren zu lassen 4 und dann wird die Temperatur auf 72ºC erhöht, um der Polymerase zu ermöglichen den zweiten Primer zu erweitern 5. Der Temperaturzyklus wird dann wiederholt 6, 7, 8, um die Amplifikation der Sequenzen zu starten, die von dem ersten und zweiten Primer hybridisiert sind. Der Temperaturzyklus läuft, bis die gewünschte Anzahl an Kopien hergestellt worden sind.
Wie in der Wissenschaft bekannt ist, kann dieses Amplifikationsverfahren unter Verwendung einer thermisch stabilen Polymerase oder einer Polymerase, die nicht thermisch stabil ist, durchgeführt werden. Wenn eine thermisch nicht stabile Polymerase verwendet wird, muss frische Polymerase nach der Assoziierung der Primer an die Templates beim Start des Elongations- oder Erweiterungsschritts zugegeben werden und der Erweiterungsschritt muss bei einer Temperatur durchgeführt werden, die für die gewählte Polymerase zulässig ist.
Die folgenden Beispiele des Verfahrens der Erfindung dienen nur zu deren Erläuterung. Es ist einzusehen, dass das Verfahren gemäß der Erfindung zur Isolierung von PolyA mRNA aus einer beliebigen Quelle angewandt werden kann und zur Isolierung von Genen, die entweder differentiell oder konstitutiv auf jedem Niveau von selten bis hoch exprimiert sind, angewandt werden kann.

Beispiel 1

Experimente mit den für genaue und reproduzierbare Ergebnisse mittels PCR erforderlichen Bedingungen wurden mit dem TK cDNA Plasmid und einem einzigen Satz Oligodesoxynucleotid-Primer ausgeführt; die Sequenz TTTTTTTTTTTCA ("T&sub1;&sub1;CA") [Seq. ID. Nr. 10] wurde gewählt, um an das stromaufwärts liegende Ende des PolyA-Schwanzes zu hybridisieren, und die Sequenz CTTGATTGCC ("Ltk3") [Seq. ID. Nr. 11] wurde gewählt, um 288 Basenpaare ("bp") stromaufwärts des PolyA-Schwanzes zu hybridisieren. Die erwartete Fragmentgröße bei Verwendung dieser beiden Primer ist 299 bp.
PCR wurde mit in der Wissenschaft bekannten Standardpufferbedingungen mit 10 ng TK cDNA (Puffer und Polymerase sind von Perkin Elmer-Cetus erhältlich) durchgeführt. Die Standardbedingungen wurden geändert, da die Primer in Konzentrationen von 2,5 uM T&sub1;&sub1;0A [Seq. ID. Nr. 10], 0,5 uM Ltk3 [Seq. ID. Nr. 11] anstatt jeweils 1 uM Primer eingesetzt waren. Die Konzentration der Nucleotide ("dNTPs") wurde ebenfalls über einen 100fachen Bereich, von 200 uM als Standard bis zu 2 uM, variiert. Die PCR-Parameter waren 40 Zyklen mit je einem Denaturierungsschritt von 30 Sekunden bei 94ºC, einem Assoziierungsschritt von 1 Minute bei 42ºC und einem Erweiterungsschritt von 30 Sekunden bei 72ºC. Signifikante Mengen nichtspezifischer PCR-Produkte wurden beobachtet, wenn die dNTP-Konzentration 200 uM war, dNTP-Konzentrationen von oder unter 20 uM ergab spezifisch amplifizierte PCR-Produkte. Die Spezifität der PCR-Produkte wurde mit Hilfe eines Restriktionsendonuclease-Verdaus der amplifizierten DNA überprüft, der die erwarteten Größen der Restriktionsfragmente ergab. In manchen Fällen wurde festgestellt, dass die Verwendung vom bis zum 5fachen Überschuss des ersten Primers im Vergleich zum zweiten Primer zur Erhöhung der Spezifität des Produkts beitrug. Eine Verringerung der dNTP-Konzentration auf 2 uM erlaubte die Markierung der PCR-Produkte mit einer hohen spezifischen Aktivität mit [α- ³&sup5;S]dATP, 0,5 uM [α-³&sup5;S]dATP (Sp. Akt. 1200 Ci/mmol), die für eine Unterscheidung der PCR-Produkte notwendig ist, wenn diese mit einer hoch auflösenden denaturierenden Polyacrylamidgel-Elektrophorese aufgelöst werden, in diesem Fall ein DNA-Sequenzierungsgel.

Beispiel 2

Das PCR-Amplifikationsverfahren mit kurzen Oligodesoxynucleotid-Primern wurde dann zum Detektieren einer Untergruppe mRNAs in Säugerzellen angewandt. Gesamt-RNAs und mRNAs wurden aus Fibroblastenzellen der Maus hergestellt, die entweder normal wuchsen, "teilende", oder unter Serum-Mangel wuchsen, "ruhende". Die RNAs und mRNAs wurden mit T&sub1;&sub1;CA [Seq. ID. Nr. 10] als Primer revers transcribiert. Der T&sub1;&sub1;CA Primer[Seq. ID. Nr. 10] wurde durch gemeinsames Erhitzen der mRNA und des Primers auf 65ºC und langsamen abkühlen lassen der Mischung auf 35ºC an die mRNA assoziiert. Die reverse Transcriptionsreaktion wurde mit Moloney murinem Leukämie Virus reverse Transcriptase bei 35ºC durchgeführt. Die resultierenden eDNAs wurden mittels PCR in Gegenwart von T&sub1;&sub1;CA [Seq. ID. Nr. 10] und Ltk3 [Seq. ID. Nr. 11], wie in Beispiel 1 beschrieben, unter Verwendung von 2 uM dNTPs amplifiziert. Die Verwendung der T&sub1;&sub1;CA [Seq. ID. Nr. 10] und Ltk3 [Seq. ID. Nr. 11] Primer erlaubte die Verwendung der TK mRNA als eine interne Kontrolle für eine differentielle Expression eines seltenen mRNA-Transcripts; TK mRNA liegt mit ungefähr 30 Kopien pro Zelle vor. Das DNA-Sequenzierungsgel zeigte 50 bis 100 amplifizierte mRNAs in dem Größenbereich zwischen 100 und 500 Nucleotiden, der für eine weitere Analyse optimal ist. Die Muster der mRNA- Species, die in teilenden und ruhenden Zellen beobachtet wurden, waren wie erwartet sehr ähnlich, obwohl einige Unterschiede offensichtlich waren. Anzumerken ist, dass die TK-Gen mRNA, die während der G1 und S-Phase exprimiert wird, nur in RNA- Präparationen aus teilenden Zellen, wie erwartet, gefunden wurde, was folglich die Fähigkeit dieses Verfahrens zeigt, seltene mRNA-Arten wie beispielsweise TK zu trennen und zu isolieren.

Beispiel 3

Die Expression von mRNAs in normalen und tumorgenen Fibroblastenzellen der Maus wurde ebenfalls unter Verwendung der T&sub1;&sub1;CA [Seq. ID. Nr. 10] und Ltk3 [Seq. ID. Nr. 11] Primer für die PCR-Amplifikation verglichen. Die mRNA wurde unter Verwendung von T&sub1;&sub1;CA [Seq. ID. Nr. 10] als Primer revers transcribiert und die resultierende cDNA wurde mittels PCR unter Verwendung von 2 uM dNTPs und der oben beschriebenen PCR-Parameter amplifiziert. Die PCR-Produkte wurden auf einem DNA-Sequenzierungsgel getrennt. Die TK mRNA war auf demselben Niveau sowohl in den normalen als auch tumorgenen mRNA-Präparationen wie erwartet vorhanden und lieferte eine gute interne Kontrolle, um das Vorliegen seltener mRNA- Arten zu zeigen. Mehrere weitere Banden waren in der einen Präparation vorhanden und in der arideren nicht, mit wenigen Banden, die nur in der mRNA-Präparation aus normalen Zellen und wenigen Banden nur in der mRNA aus den tumorgenen Zellen vorhanden waren; und einige Banden waren zu verschiedenen Niveaus in den normalen und tumorgenen Zellen exprimiert. Folglich kann das Verfahren gemäß der Erfindung zur Identifizierung von Genen angewandt werden, die normalerweise kontinuierlich exprimiert (konstitutiv) und differentiell exprimiert, supprimiert und andersweitig in ihren Expressionsniveaus verändert sind.

Klonierung der in Beispiel 3 identifizierten mRNA

Drei cDNAs, das sind die TK cDNA, eine nur in normalen Zellen exprimierte cDNA ("N1") und eine nur in tumorgenen Zellen exprimierte cDNA ("T1"), wurden aus dem DNA-Sequenzierungsgel durch Elektroelution, Ethanol-Fällung zwecks Entfernen von Harnstoff und anderen Kontaminten wiedergewonnen und mit Hilfe der PCR in zwei aufeinanderfolgenden PCR-Amplifikationen mit jeweils 40 Zyklen mit den Primern T&sub1;&sub1;CA [Seq. ID. Nr. 10] und Ltk3 [Seq. ID. Nr. 11] in Anwesenheit von 20 uM dNTPs reamplifiziert, um eine optimale Ausbeute ohne Spezifitätseinbußen zu erzielen. Es wurde bestätigt, dass die reamplifizierten PCR-Produkte die geeigneten Größen besitzen und Primer-Abhängigkeiten als eine zusätzliche Kontrolle der reamplifizierten TK cDNA wurde mit zwei getrennten Restriktionsendonucleasen verdaut und von den Produkten des Verdaus wurde ebenfalls bestätigt, dass sie die korrekte Größe besitzen.
Die reamplifizierte N1 [Seq. ID. Nr. 9] wurde mit dem TA-Klonierungssystem, Invitrogen Inc., in das Plasmid pCR1000 kloniert und sequenziert. Bezugnehmend auf Fig. 2, zeigt die Nucleotid-Sequenz eindeutig das N1-Fragment [Seq. ID. Nr. 9] flankiert wie erwartet von dem unterstrichenen Ltk3 Primer 15 am 5'-Ende und dem unterstrichenen T&sub1;&sub1;CA Primer 16 am 3'-Ende.
Eine Nothern Analyse der zellulären Gesamt-RNA unter Verwendung einer radiomarkierten N1-Sonde bestätigte wiederum, dass die N1 RNA nur in normalen Maus-Fibroblastenzellen und nicht in den tumorgenen Maus-Fibroblastenzellen vorhanden war. Bezugnehmend auf Fig. 3 ist die zur Detektion der mRNA verwendete Sonde im rechten Bereich der Figur markiert und die Größe der N1 mRNA kann durch die 28S und 18S Marker dargestellt im linken Bereich der Figur abgeschätzt werden. Die N1 mRNA ist sowohl in exponentiell wachsenden als auch in ruhenden normalen Zellen geringer vorhanden, Spur 1 und 3, und fehlt sowohl in exponentiell wachsenden als auch ruhenden tumorgenen Zellen, Spur 2 und 4. Als Kontrolle wurde derselbe Nothern Blot mit einer radioaktiv markierten Sonde für 36B4, ein Gen, das sowohl in normalen als tumorgenen Zellen exprimiert wird, erneut sondiert, um zu zeigen, dass gleiche Mengen an mRNA, Spur 1-4, auf dem Nothern Blot vorhanden waren.

Beispiel 4

Es wurde die mRNA-Expression in drei Zeillinien verglichen, wobei eine davon nach Kultivieren unter zwei unterschiedlichen Bedingungen getestet wurde. Die Zeillinien waren eine primäre Rattenembryo-Fibroblastenzelllinie ("REF"), die REF- Zelllinie, die mit ras und einer Mutante von P&sup5;³ ("T101-4") doppelt transformiert worden ist, und die REF-Zelllinie, die mit ras und einer temperatursensitiven Mutation von P&sup5;³ ("A1-5") doppelt transformiert worden ist. Die A1-5 Zelllinie wurde bei einer nicht permissiven Temperatur von 37ºC kultiviert und ebenfalls bei 37ºC kultiviert und dann auf die permissive Temperatur von 32,5ºC 24 h vor der mRNA- Präparation gehalten. Das Verfahren der Erfindung wurde unter Verwendung der Primer "Kozak" und einem von fünf Primern mit beliebiger Sequenz, "AP-1, AP-2, AP-3, AP-4 oder AP-5", als den zweiten beziehungsweise den ersten Primer durchgeführt.
Die Sequenz des "Kozak" Primers wurde basierend auf der veröffentlichten Konsensus-Sequenz für die Translationsstartpunkt-Konsensus-Sequenz von mRNAs gewählt (Kozak, 1991, Jour. Cell Biology, Vol. 115, Seiten 887-903). Ein degenerierter Kozak-Primer mit einer im Wesentlichen zur Translationsstartpunkt- Konsensus-Sequenz identischen Sequenz wurde gleichzeitig verwendet, diese Sequenzen waren 5'-GCCRCCATGG [Seq. ID. Nr. 12], in der R dA oder dG ist, und folglich hat der Oligodesoxynucleotid-Primer nur eines der gegebenen Nucleotide, was zu einer Mischung aus Primern führt.
Die Sequenz der fünf beliebigen Primer war folgendermaßen: AP-1 hatte die Sequenz 5'-AGCCAGCGAA [Seq. ID. Nr. 13]; AP-2 hatte die Sequenz 5'- GACCGCTTGT [Seq. ID. Nr. 14]; AP-3 hatte die Sequenz 5'-AGGTGACCGT [Seq. ID. Nr. 15]; AP-4 hatte die Sequenz 5'-GGTACTCCAC [Seq. ID. Nr. 16]; und AP-5 hatte die Sequenz 5'-GTTGCGATCC [Seq. ID. Nr. 17]. Diese Primer mit beliebiger Sequenz wurden willkürlich gewählt. Im Allgemeinen wurden Primer gewählt, deren GC-Gehalt 50-70% betrug.
Die mRNA wurde unter Verwendung von einem AP-Primer als den ersten Primer revers transcribiert und der resultierende erste cDNA-Strang wurde in Anwesenheit beider Primer, des AP-Primers und des degenerierten Kozak-Primers, mittels PCR unter Verwendung von 2 uM NTPs und der oben beschriebenen PCR- Parameter amplifiziert. Die PCR-Produkte wurden auf einem DNA-Sequenzierungsgel getrennt. Mindestens 50-100 amplifizierte cDNA-Banden waren bei jeder getesteten Zellinie vorhanden und einige Banden wurden auf verschiedenen Levels in verschiedenen Zelllinien exprimiert. Als Kontrolle wurde eine Reaktion unter Verwendung jedes beliebigen Primers ohne des Kozak-Primers durchgeführt. Keine cDNA wurde vom beliebigen Primer allein generiert, was folglich zeigt, dass beide Primer zur Amplifizierung einer mRNA in eine cDNA erforderlich sind.
Bezugnehmend auf Fig. 4, sind die für jede Reaktion verwendeten Primer im oberen Bereich der Figur in der Zeile "Primer" gezeigt. Als Kontrolle wurde die Reaktion unter Verwendung der Primer ohne mRNA und Verwendung von AP-1 mit mRNA ohne den Kozak-Primer durchgeführt. Keine cDNA wurde von den Primern bei Fehlen der mRNA oder ausschließlich von dem beliebigen Primer generiert, was folglich zeigt, dass mRNA für eine Amplifikation erforderlich ist und dass beide Primer erforderlich waren, um mRNA in cDNA zu amplifizieren. Die cDNA- Produkte der Amplifikation wurden in der selben Reihenfolge auf das Gel geladen, folglich ist die REF-Zelllinie jeweils in Spur 1 gezeigt, Zelllinie T101-4 ist jeweils in Spur 2 gezeigt, Zelllinie A1-5, kultiviert bei 37ºC, ist jeweils in Spur 3 gezeigt, Zellinie A1-5, kultiviert bei 32,5ºC, ist jeweils in Spur 4 gezeigt. Jedes Primer-Paar führte zur Amplifikation eines unterschiedlichen Satzes von mRNAs von den Zeillinien. Die Reaktionen, die unter Verwendung des Kozak-Primers und einem der AP-1, AP-2, AP-3, AP4 oder AP-5 Primer als einen Primer-Satz durchgeführt wurden, führte zur Amplifikation desselben cDNA-Musters von jeder Zelllinie REF, T101-4, A1-5, kultiviert bei 37ºC, und A1-5, kultiviert bei 32,5ºC. Die Amplifikation von mRNA von jeder Zelllinie und Temperatur unter Verwendung des degenerierten Kozak-Primers und des AP-3 Primers führte zur Feststellung einer speziellen Bande, die in der mRNA vorhanden war, die aus der bei 32,5ºC 24 h kultivierten A1-5 Zelllinie präpariert war und nicht in einer der anderen mRNA-Präparate vorhanden war, wie es in Fig. 4, als K1 gekennzeichnet, zu sehen ist. Folglich kann das Verfahren gemäß der Erfindung zur Identifizierung von Genen, die in mutierten Zeillinien differentiell exprimiert sind, angewandt werden.

Klonierung der in Beispiel 4 identifizierten mRNA

Die cDNA ("K1"), die nur in der A1-5 Zelllinie exprimiert war, wenn diese bei 32,5ºC kultiviert wurde, wurde aus dem DNA-Sequenzierungsgel wiedergewonnen und unter Verwendung der Primer Kozak und AP-3, wie oben beschrieben, reamplifiziert. Es wurde bestätigt, dass die reamplifizierte K1 cDNA die geeignete Größe von ca. 450 bp aufwies und wurde mit dem TA-Klonierungssystem, Invitrogen Inc., in den Vektor pCRII (Invitrogen, Inc.) gemäß Herstelleranleitung kloniert und sequenziert. Bezugnehmend auf Fig. 5 zeigt die Nucleotid-Sequenz eindeutig den K1- Klon, wie erwartet, flankiert von dem unterstrichenen Kozak-Primer 20 an dem 5'- Ende und dem unterstrichenen AP-3 Primer 21 an dem 3'-Ende. Das 5'-Ende dieser partiellen cDNA ist als Seq. ID. Nr. 18 identifiziert und das 3'-Ende dieser cDNA ist als Seq. ID. Nr. 19 identifiziert. Diese partielle Sequenz ist ein offener Leserahmen und eine Recherche in den Gendatenbanken EMBO und Genbank hat ergeben, dass die translatierte Aminosäure-Sequenz vom 3'-Teil von K1 zu der Ubiquitin konjugierten Enzymfamilie (UBC-Enzym) homolog ist. Die translatierte Aminosäure- Sequenz des 3'-Teils von K1 ist zu 100% identisch mit einem UBC-Enzym von D. melanogaster und zu 75% identisch mit dem UBC-4 Enzym und zu 79% identisch mit dem UBC-5 Enzym von der Hefe S. saccharomyces und zu 75% identisch mit dem UBC-Enzym von Arabidopsis thaliana. Der K1-Klon kann das tatsächliche 5'- Ende dieses Gens enthalten, im übrigen hybridisierte der Kozak-Primer genau hinter dem 5'-Ende. Dieses Ergebnis zeigt, dass das Verfahren gemäß der Erfindung zur Klonierung der 5'-codierenden Sequenz eines Gens angewandt werden kann.

Anwendung

Das Verfahren gemäß der Erfindung kann zur Identifizierung, Isolierung und Klonierung von mRNAs aus einer beliebigen Anzahl an Quellen angewandt werden. Das Verfahren stellt die Identifizierung erwünschter mRNAs mit Hilfe einfacher optischer Prüfungen nach Trennung bereit und kann für Anwendungen in der Forschung, in der Industrie und Medizin angewandt werden.
Zum Beispiel können die reamplifizierten cDNAs sequenziert werden oder zur Durchmusterung einer DNA-Bibliothek verwendet werden, um das Gen in vollständiger Länge zu erhalten. Sobald die cDNA-Sequenz bekannt ist, können Aminosäure-Peptide aus der translatierten Protein-Sequenz hergestellt werden und zur Herstellung von Antikörpern genutzt werden. Diese Antikörper können für eine weitere Erforschung des Genprodukts und seiner Funktion genutzt werden oder können zur Diagnose und Prognose in der Medizin eingesetzt werden. Die reamplifizierten cDNAs können zur weiteren Vermehrung in einen geeigneten Vektor kloniert werden oder in einen geeigneten Expressionsvektor kloniert werden, uni entweder in vitro oder in vivo exprimiert zu werden. Die cDNAs, die in Expressionsvektoren kloniert worden sind, können in der Industrie zur Überproduktion des Proteinprodukts verwendet werden. In anderen Anwendungen werden die reamplifizierten cDNAs oder ihre jeweiligen Klone als Sonden für in situ Hybridisierungen eingesetzt. Derartige Sonden können zur Diagnose oder Prognose von Krankheiten eingesetzt sein.

Weitere Anwendungsformen

Weitere Anwendungsformen liegen innerhalb der nachfolgenden Ansprüche.
Die Länge des Oligodesoxynucleotids kann in Abhängigkeit der gewählten Assoziierungstemperatur variiert werden. In bevorzugten Anwendungsformen wurde eine Temperatur von 42ºC gewählt und die Oligodesoxynucleotid-Primer wurden mit einer Mindestlänge von 9 Nucleotiden gewählt. Falls die Assoziierungstemperatur auf 35ºC gesenkt wurde, dann kann die Mindestlänge der Oligodesoxynucleotide auf 6 Nucleotide verringert werden.
Die cDNA könnte mit anderen radioaktiven Nucleotiden als ³&sup5;S, beispielsweise mit ³²P und ³³P, radiomarkiert sein. Wenn erwünscht, können ebenfalls nichtradioaktive bildgebende Verfahren auf das Verfahren gemäß der Erfindung angewandt werden.
Die Amplifikation von cDNA könnte mit einer Polymerasekettenreaktion mit zyklischer Temperatursteuerung erreicht werden, wie es beschrieben wurde, unter Verwendung einer hitzestabilen DNA-Polymerase für das repetitive Kopieren der cDNA, während die Temperatur für kontinuierliche Denaturierungs-, Assoziierungs- und Extensionsrunden zyklisch gesteuert ist. Oder es könnte die Amplifikation mit einem isothermalen DNA-Amplifikationsverfahren durchgeführt werden (Walker et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci., Vol. 89, Seiten 392-396). Das isothermale Amplifikationsverfahren wäre für eine Anwendung zur Amplifikation von cDNA durch Beteiligung einer geeigneten Restriktionsendonuclease anzupassen, eine die an der Hämophosphothionat-Erkennungsstelle spaltet und deren Erkennungsstelle während der Synthese mit α-³&sup5;S markierten dNTPs regeneriert werden kann.
Proteine mit ähnlicher Funktion oder ähnlichen funktionalen Domänen werden oft als Teil einer Genfamilie bezeichnet. Viel derartige Proteine sind kloniert worden und es wurde erkannt, dass sie Konsensus-Sequenzen enthalten, die unter den Familienmitgliedern hoch konserviert sind. Diese Sequenzkonservierung kann zur Entwicklung von Oligodesoxynucleotid-Primern für die Klonierung von neuen Mitgliedern oder verwandten Familienmitgliedern verwendet werden. Unter Verwendung des Verfahrens der Erfindung kann die mRNA einer Zelle revers transcribiert werden und eine cDNA könnte unter Verwendung mindestens eines Primers amplifiziert werden, der eine im Wesentlichen identische Sequenz zu der mRNA-Sequenz einer bekannten Sequenz besitzt. Konsensus-Sequenzen sind für mindestens die folgenden Familien und funktionalen Domänen in der Literatur beschrieben worden: Protein-Tyrosin-Kinase (Hanks et al., 1991, Methods on Enzymology, Vol. 200, Seiten 38-81; Wilks, 1991, Methods in Enzymology, Vol. 200; Seiten 533-546); Homöobox-Gene; Zinkfinger-DNA bindende Proteine (Miller et al., 1985, EMBO Jour., Vol. 4. Seiten 1609-1614); Rezeptor-Proteine; die Signalpeptidsequenz von sezernierten Proteinen; Proteine, die auf den Nucleus beschränkt sind (Guiochon-Mantel et al., 1989, Vol. 57, Seiten 1147-1154); Serinproteasen, Inhibitoren der Serinproteasen; Cytokine; die SH2- und SH3-Domänen, die in Tyrosinkinasen und anderen Proteinen beschrieben worden sind (Pawson et al., 1992, Cell, Vol. 71, Seiten 359-362); Serin/Threonin- und Tyrosinphosphatasen (Cohen, 1991, Methods in Enzymology, Vol. 201, Seiten 398-408); Cycline und Cyclinabhängige Proteinkinasen (CDKs)) (siehe zum Beispiel, Keyomarsi et al., 1993, PYOC. Natl. Acad. Sci., USA, Vol. 90; Seiten 1112-1116).
Primer für eine beliebige Konsensus-Sequenz können einfach basierend auf der Codon-Verwendung der Aminosäure entwickelt werden. Der Einbau einer Degeneration an einer oder mehreren Stellen erlaubt die Entwicklung eines Primers, der zu einem hohen Prozentsatz von mehr als 50% an die mRNAs hybridisiert, die die gewünschte Konsensus-Sequenz enthalten.
Primer zur Verwendung in dem Verfahren gemäß der Erfindung könnten basierend auf der Konsensus-Sequenz der Zinkfinger-DNA bindenden Proteine, zum Beispiel basierend auf der Aminosäure-Konsensus-Sequenz der Proteine PYVC entwickelt werden. Für die Klonierung von weiteren Mitgliedern dieser Familie können zweckdienliche Primer folgende Sequenzen besitzen: 5'-GTAYGCNTGT [Seq. ID. Nr. 20] oder 5'-GTAYGCNTGC [Seq. ID. Nr. 21], in denen Y für die Desoxynucleotide dT oder dC steht, für die der Primer an dieser Position degeneriert ist, und N für Inosin ("I") steht. Die Base Inosin kann mit all den anderen Basen paaren und wurde für diese Position des Oligodesoxynucleotids gewählt, da das Codon für Valin "V" in dieser Position hoch degeneriert ist. Die beschriebenen Oligodesoxynucleotid-Primer werden als eine Mischung aus 5'-GTATGCITGT und 5'-GTACGCITGT oder als eine Mischung aus 5'-GTATGCITGC und 5'- GTACGCITGC verwendet.

SEQUENZLISTE

(1) ALLGEMEINE INFORMATION:
(i) ANMELDER: Liang, Peng
Pardee, Arthur B.
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Identifizierung, Isolierung und Klonierung von Boten RNAs
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 21
(iv) ANSCHRIFT:
(A) EMPFÄNGER: Choate, Hall & Stewart
(B) STRASSE: Exchange Place, 53 State Street
(C) STADT: Boston
(D) BUNDESSTAAT: Massachusetts
(E) STAAT: USA
(F) POSTLEITZAHL (PLZ) 02190
(v) COMPUTER LESBARE FORM
(A) MEDIUM TYP: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.25
(vi) AKTUELLE ANMELDUNGSDATEN:
(A) ANMELDUNGSNUMMER: US
(B) EINREICHUNGSDATUM: 11. März 1993
(C) KLASSIFIZIERUNG:
(vii) FRÜHERE ANMELDUNGSDATEN
(A) ANMELDUNGSNUMMER: US 07/850.343
(B) EINREICHUNGSDATUM: 11. März 1992
(viii) PATENTANWALT
(A) NAME: Pasternack, Sam
(B) REGISTRIERUNGSNUMMER: 29.576
(C) AKTENZEICHEN: DFCI234CIP
(ix) TELEKOMMUNIKATION
(A) TELEFON: 617 227-5020
(B) FAX: 617 227-7566
(2) INFORMATION ÜBER SEQ ID NR. 1:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 13 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: andere Nucleinsäure
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENS: nein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 1
(2) INFORMATION ÜBER SEQ ID NR. 2:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 13 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: andere Nucleinsäure
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENS: nein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 2:
(2) INFORMATION ÜBER SEQ ID NR. 3:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 13 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: andere Nucleinsäure
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENS: nein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 3:
(2) INFORMATION ÜBER SEQ ID NR. 4:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 10 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: andere Nucleinsäure
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENS: nein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 4:
(2) INFORMATION ÜBER SEQ ID NR. 5:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 10 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: andere Nucleinsäure
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENS: nein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 5:
(2) INFORMATION ÜBER SEQ ID NR. 6:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 10 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: andere Nucleinsäure
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENS: nein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 6:
(2) INFORMATION ÜBER SEQ ID NR. 7:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 10 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: andere Nucleinsäure
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENS: nein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 7:
(2) INFORMATION ÜBER SEQ ID NR. 8:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 10 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: andere Nucleinsäure
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENS: nein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 8:
(2) INFORMATION ÜBER SEQ ID NR. 9:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 260 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENS: nein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 9:
(2) INFORMATION ÜBER SEQ ID NR. 10:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 13 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: andere Nucleinsäure
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENS: nein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 10:
(2) INFORMATION ÜBER SEQ ID NR. 11:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 10 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: andere Nucleinsäure
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENS: nein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 11:
(2) INFORMATION ÜBER SEQ ID NR. 12:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 10 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: andere Nucleinsäure
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENS: nein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 12:
(2) INFORMATION ÜBER SEQ ID NR. 13:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 10 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einzel
(D) TOPOLOGIE; linear
(ii) MOLEKÜLTYP: andere Nucleinsäure
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENS: nein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 13:
(2) INFORMATION ÜBER SEQ ID NR. 14:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 10 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: andere Nucleinsäure
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENS: nein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 14:
(2) INFORMATION ÜBER SEQ ID NR. 15:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 10 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: andere Nucleinsäure
(iii) HYPOTHETISCH: nein.
(iv) ANTISENS: nein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 15:
(2) INFORMATION ÜBER SEQ ID NR. 16:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 10 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: andere Nucleinsäure
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENS: nein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 16:
(2) INFORMATION ÜBER SEQ ID NR. 17:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 10 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: andere Nucleinsäure
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENS: nein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 17:
(2) INFORMATION ÜBER SEQ ID NR. 18:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 42 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENS: nein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 18:
(2) INFORMATION ÜBER SEQ ID NR. 19:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 78 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENS: nein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 19:
(2) INFORMATION ÜBER SEQ ID NR. 20:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 10 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: andere Nucleinsäure
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENS: nein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 20:
(2) INFORMATION ÜBER SEQ ID NR. 21:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 10 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: andere Nucleinsaüre
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENS: nein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 21:

Claims

1. Ein Verfahren zur Isolierung einer DNA, die zu einer mRNA in einer Nucleinsäure-Probe komplementär ist, umfassend die Schritte:

a) Inkontaktbringen der Probe mit einem ersten Oligonucleotid-Primer unter Bedingungen, bei denen besagter erster Primer mit beliebiger mRNA an einer ersten Stelle mit einer komplementären Basensequenz hybridisiert;

b) reverses Transkribieren der mRMA unter Verwendung einer reversen Transkriptase und besagten ersten Primers, um einen ersten DNA-Strang herzustellen, der mindestens zu einem Teil der mRNA stromaufwärts von besagter erster Stelle komplementär ist;

c) Inkontaktbringen des ersten DNA-Strangs mit einem zweiten Oligodesoxynucleotid-Primer unter Bedingungen, bei denen besagter zweiter Primer mit komplementärer DNA an einer zweiten Stelle hybridisiert;

d) Extension des zweiten Primers unter Verwendung einer DNA-Polymerase, um einen zweiten DNA-Strang herzustellen, der zu dem ersten DNA-Strang stromabwärts von besagter zweiter Stelle komplementär ist; und

e) Amplifizieren des ersten und zweiten DNA-Strangs unter Verwendung einer Polymerase, besagten ersten Primers und besagten zweiten Primers, um die komplementäre DNA zu bilden; worin:

i) besagter erster Primer mit mRNA an einer Stelle hybridisiert, die eine polyA-Signalsequenz mit einschließt; und/oder

ii) besagter erster Primer an einen Teil des Polyadenosin (polyA) Schwanzes von besagter mRNA und mindestens an ein nicht-polyA Nucleotid unmittelbar stromaufwärts von besagtem Teil hybridisiert; und/oder

iii) besagter erster Primer an eine Stelle hybridisiert, einschließlich einer Sequenz unmittelbar stromaufwärts eines ersten A-Ribonucleotids des polyA Schwanzes der mRNA; und/oder

iv) besagter zweiter Primer mit einer Basensequenz aus mindestens 6 Nucleotiden und enthaltend eine beliebige Sequenz und eine Basensequenz, die eine Kozak- Sequenz enthält.

2. Das Verfahren nach Anspruch 1, worin besagter erster Primer:

a) mit mRNA hybridisiert, die mindestens zwei Nucleotide stromaufwärts von und angrenzend an das erste A-Ribonucleotid des polyA-Schwanzes mit einschließt;

b) mindestens 13 Nucleotide umfasst;

c) eine polyA-komplementäre Region, umfassend mindestens 11 Nucleotide und, stromaufwärts von besagter polyA-komplementärer Region, eine nicht-polyA-komplementäre Region mit einschließt, umfassend mindestens ein Nucleotid gegebenenfalls die nicht-polyA- komplementäre Region, umfassend mindestens 2 benachbarte Nucleotide.

3. Das Verfahren nach Anspruch 2c), worin besagte nicht-polyA-komplementäre Region 3'-NV umfasst, worin V ein Desoxyadenosin, Desoxycytidin oder Desoxyguanosin ist und N ein Desoxyadenosin, Desoxycytidin, Desoxyguanosin oder Desoxythymidin ist.

4. Das Verfahren nach Anspruch 1a), worin besagter erster Primer mindestens 6 Desoxyribonucleotide umfasst.

5. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin

a) besagter zweiter Primer mindestens 6 Desoxyribonucleotide umfasst; oder

b) besagter zweiter Primer eine zufällig ausgewählte Nucleotid-Sequenz mit einschließt; oder

c) besagter erster oder der zweite Primer Desoxyadenosin, Desoxycytidin, Desoxyguanosin und Desoxythymidin mit einschließt; oder

d) besagter erster oder zweiter Primer eine Restriktionsendonuclease-Erkennungssequenz, mit einschließt; oder

e) besagter zweiter Primer eine Sequenz mit einschließt, die mit einer Sequenz identisch ist, die in einer mRNA bekannter Sequenz enthalten ist; oder

f) mindestens besagter erster oder zweiter Primer eine Vielzahl an Oligodesoxynucleotiden umfasst.

6. Ein Verfahren nach Anspruch 1, umfassend: Inkontaktbringen der mRNA mit dem ersten Primer unter Bedingungen, bei denen besagter erster Primer mit mRNA an einer Stelle hybridisiert, reverses Transkribieren der mRNA unter Verwendung der reversen Transkriptase und besagten ersten Primers, um einen ersten DNA-Strang herzustellen, Inkontaktbringen des ersten DNA-Strangs mit dem zweiten Primer unter Bedingungen, bei denen besagter zweiter Primer mit dem ersten DNA-Strang an der zweiten Stelle hybridisiert, der eine Kozak-Sequenz mit einschließt, Extension des zweiten Primers unter Verwendung einer DNA-Polymerase, um einen zweiten DNA-Strang herzustellen, der zu dem ersten DNA-Strang stromabwärts von der Stelle, wo besagter zweiter Primer mit besagtem ersten DNA-Strang hybridisiert, komplementär ist, und Amplifizieren des ersten und zweiten DNA- Strangs unter Verwendung einer DNA-Polymerase und besagten ersten und zweiten Primers.

7. Das Verfahren nach Anspruch 6, worin besagter erster Primer eine Sequenz mit einschließt, die im Wesentlichen mit einer Sequenz identisch ist, die in einer mRNA bekannter Sequenz enthalten ist.

8. Das Verfahren gemäß einem der vorausgehenden Ansprüche, worin

a) besagter erster Primer mindestens 9 Desoxyribonucleotide, gegebenenfalls mindestens 10 Desoxyribinucleotide, umfasst; oder

b) besagter zweiter Primer mindestens 9 Desoxyribonucleotide, gegebenenfalls mindestens 10 Desoxyribinucleotide, umfasst; oder

c) besagter erster Primer eine ausgewählte beliebige Sequenz aus Desoxyribonucleotiden mit einschließt; oder

d) besagter erster oder besagter zweiter Primer eine Restriktionsendonuclease-Erkennungssequenz mit einschließt; oder

e) mindestens besagter erster Primer oder zweiter Primer eine Vielzahl an Oligodesoxynucleotiden umfasst.

9. Ein Verfahren zum Vergleich des Vorhandenseins oder Levels individueller mRNA-Moleküle in zwei oder mehr Nucleinsäure-Proben, umfassend die Schritte:

a) Bereitstellen einer ersten mRNA-Moleküle enthaltenden Nucleinsäure-Probe und Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 9, um eine erste Population Amplifikationsprodukte herzustellen, die die komplementäre DNA umfassen;

b) Bereitstellen einer zweiten mRNA-Moleküle enthaltenden Nucleinsäure-Probe und Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 9, um eine zweite Population Amplifikationsprodukte herzustellen, die die komplementäre DNA umfassen;

c) Vergleich des Vorhandenseins oder Levels individueller Amplifikationsprodukte in der ersten und zweiten Population Amplifikationsprodukte.

10. Das Verfahren nach Anspruch 9, worin:

a) besagte erste Nucleinsäure-Probe mRNAs umfasst, die in einer ersten Zelle exprimiert sind, und besagte zweite Nucleinsäure-Probe aus mRNAs besteht, die in einer zweiten Zelle exprimiert sind; oder

b) besagte erste Nucleinsäure-Probe mRNAs umfasst, die in einer, Zelle in einem ersten Entwicklungsstadium exprimiert sind, und besagte zweite Nucleinsäure- Probe mRNAs umfasst, die in besagter Zelle in einem zweiten Entwicklungsstadium exprimiert sind.

11. Das Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, worin besagter erster Primer eine polyA-komplementäre Region, umfassend mindestens 11 Nucleotide und, unmittelbar stromabwärts von besagter polyA-komplementärer Region, eine nicht-polyA-komplementäre Region mit einschließt, umfassend mindestens ein Nucleotid, und gegebenenfalls besagte polyA-komplementäre Region mindestens 11 aneinander liegende Thymidine umfasst.

12. Das Verfahren nach Anspruch 11, worin besagter erster Primer mindestens 13 Nucleotide umfasst.

13. Das Verfahren nach Anspruch 9, worin die Nucleotid- Sequenz von besagtem ersten oder besagtem zweiten Primer eine Restriktionsendonuclease-Erkennungsstelle enthält und gegebenenfalls mindestens besagter erster oder besagter zweiter Primer eine Vielzahl an Oligodesoxynucleotiden umfasst, und außerdem gegebenenfalls besagte Vielzahl an Oligonucleotiden eine Vielzahl an Oligodesoxynucleotid-Molekülen mit der gleichen Nucleotid-Sequenz umfasst, oder einzelne Oligodesoxynucleotid-Moleküle in besagter Vielzahl an Oligodesoxynucleotiden verschiedene Nucleotid-Sequenzen besitzen..

14. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 9 bis 13, außerdem umfassend den Schritt der Detektion einer Differenz bei Vorhandensein oder Level eines individuellen Amplifikationsprodukts in besagter erster Population Amplifikationsprodukte verglichen mit besagter zweiter Population Amplifikationsprodukte.

15. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 9 bis 14, worin die Amplifizierungsschritte jeweils eine Durchführung einer Polymerase-Kettenreaktion umfassen, bei der die Konzentration an dNTPs bei oder unter ungefähr 20 uM liegt, und/oder die Amplifizierungsschritte jeweils eine Durchführung einer Polymerase-Kettenreaktion umfassen, bei der die Konzentration an dNTPs ungefähr 2 uM ist.

16. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 9 bis 15, worin der Vergleichsschritt eine Auftrennung jeweils der ersten und zweiten Population Amplifikationsprodukte mittels Gelelektrophorese und Vergleich des Vorhandenseins oder Levels von Banden bestimmter Größen umfasst.

17. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 9 bis 16, worin besagte erste Zelle eine Tumoren-bildende Zelle umfasst und besagte zweite Zelle eine gesunde Zelle umfasst.

16. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 9 bis 17, außerdem umfassend einen Schritt der Klonierung individueller Amplifikationsprodukte von besagter erster oder zweiter Population Amplifikationsprodukte.

19. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 9 bis 18, worin der zweite Primer, der an eine zweite Stelle in besagter erster und zweiter Probe hybridisiert, an die zweite Stelle, die NNNRNNATGN einschließt, hybridisiert.

20. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 9 bis 19, worin besagter erster Primer einen GC-Gehalt im Bereich von etwa 50-70% besitzt.

21. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 9 bis 20, worin die Nucleotid-Sequenz von besagtem ersten Primer eine Sequenz mit einschließt, die zu einer in einer Genfamilie gefundenen Consensus-Sequenz komplementär ist.

22. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 9 bis 21, worin besagte erste und zweite Stelle voneinander getrennt sind, so dass mindestens einige Amplifikationsprodukte in besagter erster und zweiter Population Amplifikationsprodukte eine Größe im Bereich von ungefähr 100-500 Basenpaare besitzen.

23. Das Verfahren gemäß Anspruch 14, außerdem umfassend einen Schritt der Isolierung eines individuellen Amplifikationsprodukts, dessen Vorhandensein oder Level in besagter erster und zweiter Population Amplifikationsprodukte unterschiedlich ist.

24. Das Verfahren nach Anspruch 23, außerdem umfassend einen Schritt der Klonierung besagten isolierten Amplifikationsprodukts in einen Vektor.

25. Das Verfahren nach Anspruch 23 oder 24, außerdem umfassend entweder einen Schritt der Durchmusterung einer Nucleinsäure-Bibliothek mit besagtem isolierten Amplifikationsprodukt oder einen Schritt der Bestimmung der Nucleotid-Sequenz mindestens eines Teils von besagtem isolierten Amplifikationsprodukt.