DE69221823T2

DE69221823T2 - Oxytocin-Rezeptor, dafür kodierende DNS

Info

Publication number: DE69221823T2
Application number: DE69221823T
Authority: DE
Inventors: Chihiro Azuma; Tadashi Kimura; Hiroto Okayama; Fumitaka Saji; Osamu Tanizawa
Original assignee: Rohto Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Rohto Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1991-10-09
Filing date: 1992-10-09
Publication date: 1998-01-02
Anticipated expiration: 2012-10-10
Also published as: EP0542424B1; DE69221823D1; EP0811684A2; EP0542424A1; JP2904993B2; US5846766A; JPH05184367A; EP0811684A3; US5466584A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Rezeptor für Oxytocin, bei dem es sich um ein Hormon der hinteren Hypophyse handelt, das weitverbeitet in der allgemeinen Klinik als uterotonisches Mittel verwendet wird, eine für diesen codierende DNS, eine diese DNS enthaltende rekombinante DNS sowie einen Transformanten mit der rekombinanten DNS.
Oxytocin, bei dem es sich um ein Hormon der hinteren Hypophyse handelt, weist eine die Uteruskontraktion verursachende Wirkung auf und wird weit verbreitet zur Induktion und verstärkung von Wehenschmerzen im Bereich der obstetrischen Klinik verwendet. Hinsichtlich dieser Wirkung bestehen jedoch große individuelle Schwankungen. Außerdem wirkt Oxytocin in dieser Hinsicht nur auf den schwangeren Uterus. Man hat angenommen, daß die Steigerung des Oxytocinrezeptors notwendig ist, damit das Myometrium für Oxytocin empfindlich wird.
Daher ist es notwendig, einen Oxytocinrezeptor und eine für diesen codierende DNS-Sequenz zu erhalten, um eine Reihe biologischer Reaktionsmechanismen zwischen Oxytocin und dem Oxytocinrezeptor am lebenden Gewebe genauer zu erhellen und weiter um die Messung des Expressionsgrades des Oxytocinrezeptors vor und während der Wehen zu ermöglichen, ein Serientestverfahren zur Bestimmung der Oxytocinaktivität zu entwickeln und durch einen Antikörper gegen den Oxytocinrezeptor von den Wehenschmerzen zu befreien; um den Oxytocinrezeptor zu erhalten, eine für diesen codierende DNS-Sequenz, eine die DNS enthaltende DNS und einen Transformanten mit der DNS. Untersuchungen zur Isolierung, Reinigung und der Strukturanalyse des Oxytocinrezeptors sind bislang kaum durchgeführt worden.
Im Hinblick auf diese Umstände ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen Oxytocinrezeptor, einen für diesen codierende DNS, eine die DNS enthaltende rekombinante DNS und einen Transformanten mit der rekombinanten DNS zu erhalten.
M.S. Soloff et al. beschreiben in Endocrinology, Bd. 122, S. 1769 - 1772, 1998 Ratten-Oxytocinrezeptoren, die aus dem Myometrium des Rattenuterus aufgereinigt wurden, sowie die Bestimmung der Größe dieses Rezeptors. Oxytocinrezeptoren aus der Ratten-Brustdrüse wurden von M.S. Soloff in Collogue Inserm, Bd. 208, S.65 - 33, 1991, beschrieben.
Erfindungsgemäß wird ein isolierter Oxytocinrezeptor, umfassend die in SEQ ID Nr.1 dargestellte Sequenz von 389 Aminosäuren, eine Variante desselben oder ein Teil dieser Sequenz oder Variante zur Verfügung gestellt.
Die variierte Aminosäuresequenz unterscheidet sich von der Sequenz aus SEQ ID Nr.1 in bis zu 4 Aminosäuresubstitutionen, -additionen oder -deletionen und gemäß einer speziellen Ausführungsform durch keine oder eine Substitution, Addition oder Deletion.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung werden die Substitutionen der Aminosäuresequenz aus SEQ ID Nr.1 gemäß der folgenden Tabelle ausgeführt:
Das Teilstück umfaßt mindestens 350 Aminosäuren der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr.1 oder der Variante; gemäß einer speziellen Ausführungsform umfaßt es eine zusammenhängende Sequenz von mindestens 350 Aminosäureresten in der Sequenz SEQ ID Nr.1.
Nach einem zweiten Aspekt der Erfindung wird ein DNS-Segment zur Verfügung gestellt, das für den Oxytocinrezeptor des ersten Aspekts der Erfindung codiert. Gemäß einer Ausführungsform des zweiten Aspekts der Erfindung codiert das DNS-Segment die in SEQ ID Nr.1 dargestellte Aminosäuresequenz. Gemäß einer weiteren Ausführungsform des zweiten Aspekts der Erfindung weist das Segment die in SEQ ID Nr.2 dargestellte Nukleotidsequenz auf.
Gemäß noch einer weiteren Ausführungsform des zweiten Aspekts der Erfindung wird ein DNS-Segment zur Verfügung gestellt, das der Sequenz aus SEQ ID Nr.2 zu mindestens 75 % homolog ist; gemäß einer speziellen Ausführungsform ist dieses der Sequenz aus SEQ ID Nr.2 im wesentlichen homolog.
Nach einem dritten Aspekt der Erfindung wird ein rekombinantes DNS-Molekül zur Verfügung gestellt, das eine DNS gemäß einer der Ausführungsformen des zweiten Aspekts der Erfindung enthält.
Nach einem vierten Aspekt der Erfindung wird eine DNS zur Verfügung gestellt, die mit einer DNS gemäß einer der Ausführungsformen nach dem zweiten Aspekt der Erfindung hybridisiert.
Nach einem fünften Aspekt der Erfindung wird eine mit einer DNS gemäß dem dritten Aspekt der Erfindung transformierte Zelle zur Verfügung gestellt.
Nach einem sechsten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines Oxytocinrezeptors zur Verfügung gestellt, bei dem man eine Zelle gemäß dem fünften Aspekt der Erfindung unter Bedingungen kultiviert, so daß das DNS-Segment exprimiert und der Oxytocinrezeptor hergestellt wird, und den Oxytocinrezeptor isoliert.
Nach einem siebten Aspekt der Erfindung wird ein Kit bereitgestellt, der einen in einem Behälter angeordneten Oxytocinrezeptor oder einen Antikörper dagegen und einen Puffer aufweist.
Als Ergebnis kontinuierlicher Bestrebungen, den erfindungsgemäßen Oxytocinrezeptor zu erhalten, wurde gefunden, daß sich ein Phänomen hoch empfindlich als Membranstrom nachweisen läßt, bei dem an Oozyten der afrikanischen Klauenkröte (Xenopus laevis) ein von einer spezifischen mRNS codiertes Protein bei der Perfusion mit Oxytocin das intrazelluläre Calcium erhöht und einen Choridioneneinstrom verursacht. Üblicherweise wird eine über das Sucrosedichtegradientenverfahren oder dergleichen fraktionierte mRNS verwendet. Beim Ausgangsmaterial für diese mRNS handelt es sich jedoch um eine menschliche pathologische Probe einer außerordentlich spezifischen Acosmie und dieses Material steht nur begrenzt zur Verfügung. Das Material kann nicht nochmals verwendet werden. Aus diesem Grund waren die Erfinder erfolgreich bei der Clonierung eines Gens, das für ein biologisch aktives Protein codiert, welches bei der Perfusion mit Oxytocin einen Membranstrom verursacht, d.h. einen Oxytocinrezeptor, und zwar erstmalig über die Herstellung einer cDNS-Bank aus der gesamten mRNS unter Verwendung eines Plasmidvektors und anschließender Fraktionierung der Bank über die Größe. Dadurch wurde die Erfindung gemacht.
Im folgenden werden der Oxytocinrezeptor, die DNS-Sequenz, die rekombinante DNS und der Transformt der Erfindung erläutert.
Der erfindungsgemäße Oxytocinrezeptor ist ein Polypeptid oder Protein, das die gesamte oder einen Teil der in SEQ ID Nr.1 dargestellten Aminosäuresequenz aufweist oder eine Variante derselben, und ein biologisch aktives Polypeptid oder Protein, das den Anstieg der Konzentrationen an intrazellulärem Calcium und Inositoltriphosphat verursacht. Insebesondere ist der erfindungsgemäße Oxytocinrezeptor ein Polypeptid oder Protein mit einer Aminosäuresequenz, in der eine oder mehrere Aminosäurereste der in SEQ ID Nr.1 dargestellten Aminosäuresequenz substituiert sind, einer oder mehrere Aminosäurereste fehlen, oder weiterhin einer oder mehrere Aminosäurereste zu der in SEQ ID Nr.1 dargestellten Aminosäuresequenz zugefügt wurden.
Die erfindungsgemäße DNS-Sequenz ist eine DNS-Sequenz, die für den erfindungsgemäßen Oxytocinrezeptor codiert. Beispiele für die erfindungsgemäße DNS-Sequenz sind z.B. eine DNS-Sequenz, die einen Teil oder die gesamte in SEQ ID Nr.2 dargestellte Basensequenz enthält, oder eine davon abgewandelte DNS. Genauer kann eine DNS als Beispiel angeführt werden, bei der eines oder mehrere Nukleotide in der in SEQ ID NR.2 dargestellten DNS-Sequenz durch andere Nukleotide substituiert sind, eines oder mehrere Nukleotide fehlen oder weiterhin eines oder mehrere Nukleotide zu der in SEQ ID Nr.2 gezeigten Sequenz addiert wurden.
Die erfindungsgemäße rekombinante DNS ist eine DNS, die die erfindungsgemäße DNS in einem geeigneten Expressionsvektor enthält. Die erfindungsgemäße rekombinante DNS kann eine Sequenz zur Steuerung der Expression enthalten, die funktional mit der erfindungsgemäßen DNS-Sequenz kombiniert ist. Der erfindungsgemäß verwendete Vektor unterliegt keinen spezifischen Beschränkungen, solange sich der Vektor in einem geeigneten Wirt replizieren läßt und exprimiert werden kann. Als Beispiele für den erfindungsgemäß verwendeten Vektor lassen sich der pcD-Vektor und der im folgenden Beispiel 1 beschriebene, abgewandelte pcD-Vektor anführen.
Die Erfindung wird anhand des folgenden Beispiels genauer beschrieben und erklärt. Die Erfindung ist jedoch nicht auf dieses Beispiel beschränkt.

Beispiel 1

Menschliches Myometriumgewebe, das durch Zufall erhalten werden konnte (die pathologische Probe eines Falles, bei dem aufgrund eines Risses des Uterus gerade nach der vaginalen Geburt eine exzessive Blutung auftrat und der gesamte Uterus entfernt werden mußte), wurde schnell in flüssigem Stickstoff gefroren und bei -70 ºC gelagert.

(1) Abschätzung der Größe der für den Oxytocinrezeptor codierenden mRNS

Das menschliche Myometriumgewebe wurde in flüssigem Stickstoff pulverisiert. Das pulverisierte Gewebe wurde in einer Lösung homogenisiert, die 5,5 M Guanidinisothiocyanat, 100 mM 2-Mercaptoethanol, 0,5 % Natrium-N-laurylsarcosin und 2,5 mM Natriumcitrat (pH 7,0) enthielt, auf ein Kissen der Lösung enthaltend 5,7 M CsCl und 0,1 M EDTA (pH 7,0), geschichtet und zum Erhalt der gesamten RNS als Niederschlag ultrazentrifugiert. Der so erhaltene Niederschlag der Gesamt-RNS wurde durch wiederholte Fällung mit Ethanol gereinigt. Die polyadenylierte RNS wurde unter Verwendung einer Oligo-(dT)-Cellulosesäule aus der Gesamt-RNS isoliert.
In einer 10 mM Tris-HCl und 1 mM EDTA (pH 7,0) enthaltenden Lösung wurden 160 µg der polyadenylierten RNS gelöst. Nach Durchführung einer Hitzedenaturierung wurde die Lösung mit 0,1 % Natrium-N-laurylsarcosin auf einen diskontinuierlichen Sucrosegradienten (8 Schichten, 5 - 25 % Sucrose) geschichtet und 7,5 Stunden mit 35.000 rpm ultrazentrifugiert. Die ultrazentrifugierten Schichten wurden ausgehend von der niedrigen Sucrosekonzentration mit Hilfe eines Fraktionssammlers zum Erhalt von 25 Fraktionen 0,4 ml fraktioniert. Jede größenfraktionierte mRNS wurde mittels Fällung mit Ethanol gewonnen. Die Gesamt-RNS wurde in einem Verhältnis von 1 mg/ml in Wasser und die größenfraktionierte mRNS in 5 µl Wasser gelöst, um Proben zur Mikroinjektion in Xenopus-Oozyten zu erhalten. Die Proben wurden in Xenopus- Oozyten injiziert, die bei Raumtemperatur 3 Stunden lang mit einem modifizierten Barth's-Medium behandelt worden waren, aus dem das Calcium entfernt worden war (vgl. Beschreibung und Übersetzung aus B. Hames, S. Higgins (Hrsg.) IRL Press 1984, Oxford, S.271 - 301) und in dem 2 mg/ml Collagenase gelöst waren. Mit Hilfe einer mit einer Mikrokapillare ausgestatteten, hydraulischen Mikrospritze wurden 50 nl jeder größenfraktionierten mRNS in die Xenopus-Oozyten injiziert. Diese Oozyten wurden 72 Stunden lang bei 19 ºC im modifizierten Barth's-Medium kultiviert.
Anschließend wurden in diese Oozyten 2 mit 3 M KCl gefüllte Mikroelektroden gemäß dem Verfahren von Dascal et al. (vgl. J. Physiol. 366, 299 - 313 (1985)) insertiert. Eine Elektrode wurde zur Einstellung eines Membranpotentials von -60 mV elektrifiziert. Die andere wurde an ein System zur Messung eines Membranstromes angeschlossen. Die Oozyte war mit normaler Ringerlösung (115 mM NaCl, 1 mM KCl, 1,8 M CaCl&sub2; und 5 mM Tris pH 7,4) und anschließend für nur 1 Minute mit 1 µM Oxytocm perfundiert worden. Unter 1 µM Oxytocin wurde sowohl bei der Oozyte, in die die Gesamt-RNS injiziert worden war, als auch bei derjenigen, in die die 19. bis 21. Fraktion der größenfraktionierten mRNS injiziert worden war, ein Membranstrom beobachtet. Daraus, daß durch die Perfusion mit Oxytocin ein Membranstrom hervorgerufen wurde, wird geschlossen, daß ein zur Bindung von Oxytocin befähigter Oxytocinrezeptor auf den Oozyten exprimiert wurde. Diese Tatsache weist darauf hin, daß eine mRNS von etwa 4 - 5 kB (Kilobasen), die die Aktivität des Oxytocinrezeptor aufweisen kann, im fraglichen menschlichen Myometriumgewebe vorhanden ist.

(2) Herstellung der cDNS-Bank

Nach dem Verfahren von Okayama et al. (vgl. Methods in Enzymology 154, 3 - 28 (1987)) wurde die gesamte RNS aus menschlichem Myometrium aufgereinigt. Mittels einer Oligo-(dT)-Cellulosesäule wurde die Gesamt-mRNS aus der gereinigten Gesamt- RNS erhalten.
Als Vektor zur Herstellung der Bank wurde ein von M. Brownstein der NIH, USA (unveröffentlicht) erzeugter, variierter Vektor verwendet. Bei diesem variierten Vektor handelt es sich um einen Vektor, der durch Verbesserung des Expressionsvektors pcD für tierische Zellen erhalten wurde, der von Okayama-Berg entwickelt wurde (vgl. Hiroto Okayama und Paul Berg "Molecular Celll Biology" 3, 280 (1983) und 2, 161 (1982)). Bei dem variierten Vektor handelt es sich dem Vektorprimer pcDV1, der durch Insertion des T7-RNS-Polymerasepromoters und von Schnittstellen der Restriktionsenzyme NotI, BstXI und XbaI modifiziert wurde. Der erfindungsgemäß verwendete Linker ist der Linker pLl, in den der Promoterbereich der SP6-RNS-Polymerase insertiert wurde.
Der Vektorprimer und der Linker wurden von Mr.Brownstein des NIH, USA, in dem Zustand bereitgestellt, daß an den Vektorprimer und den Linker ein dG- bzw. dT- Schwanz mittels der terminalen Desoxynukleotidyltransferase (TdT) angehängt und diese anschließend mittels niedrigschmelzender Agarose und einer Oligo-(dA)-Cellulosesäule aufgereinigt worden waren.
Unter Einsatz von 7 µg der gereinigten Gesamt-RNS wurde die cDNS des Primärstrangs gemäß dem oben angesprochenen Verfahren aus Methods in Enzymology 154, 3 - 28 (1987) synthetisiert. cDNS' einer mittleren Länge von 630 BP wurden über diese Reaktion synthetisiert. Anschließend wurde diese cDNS durch Umsetzung mit 10 Einheiten TdT bei 37 ºC für 5 Minuten in Anwesenheit von dCTP mit dC-Schwänzen versehen. Die so erhaltenen mRNS-cDNS-Hybridvektorprimer wurden abgedaut und bei 37 ºC eine Stunde lang mit 28 Einheiten HindIII umgesetzt.
Ein Zehntel der Menge dieses mit HindIII abgedauten mRNS-cDNS-Hybridvektorprimers wurde danach mit 0,25 pM des variierten pLl-Linkers, der zuvor hergestellt wurde, gemischt und annealt. Nach dem Annealing wurden die Hybridvektorprimer mit dem Linker über Nacht bei 12 ºC durch Umsetzung mit 100 Einheiten DNS-Ligase (aus E.Coli) in Anwesenheit von 0,1 mM β-NAD zyklisiert. Das zyklisierte mRNScDNS-Hybrid wurde in Anwesenheit von 40 µM dNTD mit 30 Einheiten RNase H, 50 Einheiten DNS-Ligase (aus E.Coli) und 3 Einheiten DNS-Polymerase I 60 Minuten lang bei 12 ºC und anschließend 60 Minuten bei Raumtemperatur zur Umwandlung in eine Doppelstrang-cDNS umgesetzt. Dadurch wurde im variierten pcD-Vektor eine von menschlichem Myometrium abstammende cDNS-Bank konstruiert.
Anschließend wurde die cDNS-Bank in hoch effiziente, kompetente Zellen von E.Coli DH5 transformiert, die gemäß dem von Inoue und Okayama (vgl. Gene 96, 23 -28 (1990)) entwickelten Verfahren hergestellt waren, um 4 x 10&sup7; Zellen von unabhängigen Transformanten zur erhalten. Nach Proliferation dieser Tranformanten in L-Brühemedium, enthaltend 100 µg Ampicillin/ml, wurden Plasmide zum Erhalt einer Plasmidbank gemäß den Standardverfahren zur Herstellung von Plasmid-DNS isoliert.

(3) Herstellung einer Subbank

Wie in (1) beschrieben, weist die für den Oxytocinrezeptor codierende cDNS etwa 4 bis 5 kBP oder ähnlich auf. Der variierte pcD-Vektor hat etwa 3 kBP. Je 40 µg der cDNS-Bank wurden mit jeweils 80 Einheiten NotI und PvuI abgedaut und die so erhaltene lineare cDNS zu linearer cDNS mit einer Länge von 7 kBP bis 23 kBP aufgetrennt und zwar mittels Elektrophorese unter Verwendung eines Gels aus niedrigschmelzender Agarose. Jeder der so erhaltenen linearen cDNS' wurde zur Rezyklisierung bei 4 ºC über Nacht in Anwesenheit von 66 µM ATP in einem Reaktionssystem von 200 µl mit 1,2 Einheiten T4-DNS-Ligase umgesetzt. Die Subbank, die nach dem Abbau mit NotI rezyklisiert wurde (NotI-Subbank), enthielt 60.000 bis 90.000 Clone. Die Subbank, die nach dem Abbau mit PvuI rezyklisiert wurde (PvuI-Subbank), enthielt 600.000 Clone.

(4) In-vitro-Transcription

(a) Herstellung des DNS-Templates

Ein Zwanzigstel der NotI-Subbank sowie ein Zweihundertstel der PvuI-Subbank, die in (3) erhalten wurden, wurde zum Erhalt von Transformaten in DHS eingeführt. Von diesen Transformanten wurden je 8 Pools, 16 Pools insgesamt, in 50 ml eines 100 µg Ampicillin/ml enthaltenden L-Brühemediums kultiviert, bis die optischen Dichte bei 600 nm (OD&sup6;&sup0;&sup0;) etwa 1 betrug (2 ml jeder Kultur wurden entnommen und zur Aufbewahrung in Anwesenheit von 7 % DMSO eingefroren). Anschließend wurden 7,5 mg Chloramphenicol zur Kulturlösung zugegeben und die Kultivierung für weitere 16 Stunden fortgesetzt. Die Zellen wurden gesammelt und die Plasmide gemäß einem Standardverfahren zur Herstellung von Plasmiden isoliert. Zehn µg jedes aus der NotI- Subbank hergestellten Pools (N1 - N8) wurden 60 Minuten lang bei 37 ºC zum Erhalt linearer DNS' mit 12 Einheiten NotI abgedaut. Gleichfalls wurden je 10 µg jedes aus der PvuI-Subbank hergestellten Pools (P1 - P8) mit 12 Einheiten BstXI 90 Minuten lang bei 50 ºC zum Erhalt linearer DNS' abgedaut. Diese wurden mittels der üblichen Behandlung mit Phenol/Chloroform und Fällung mit Ethanol gereinigt. Die gereinigten cDNS' wurden zum Erhalt von Konzentrationen von 1 µg/ml in einer Lösung gelöst, die 10 mM Tris (pH 7,0) und 1 mM EDTA enthielt. Die erhaltene Lösung wurde als Template-DNS-Lösung verwendet.

(b) In-vitro-Transcription

Fünf Einheiten SP6-RNS-Polymerase (Bethesda Research Laboratories) wurden zu 25 µl der Reaktionsflüssigkeit aus den im folgenden angegebenen Bestandteilen gegeben (Verwendet wurden 40 mM Tris (pH 7,9), 6 mM MgCl&sub2; und 2 mM Spermidinhydrochlorid als Puffer, sowie ein Substrat (Mischung aus ATP, CTP, GTP und UTP), m7G(5')ppp(5')G und DTT aus dem mRNS-Caping Kit der Stratagene Cloning Systems). Anschließend ließ man die Mischung unter Verwendung von 5 µg jeder Template-DNS, erhalten in (a), 90 Minuten bei 39 ºC reagieren. Weiter wurden 10 Einheiten der RNase-freien DNaseI (Stratagene Cloning Systems) zugegeben und 5 Minuten bei 37 ºC reagieren gelassen, um die Template-DNS zu zersetzen. Anschließend wurde die Reaktionsflüssigkeit auf eine Sephadex G50-Zentrifugensäule (Boehringer Mannheim GmbH) aufgegeben. Die Reaktionsflüssigkeit wurde mittels Zentrifugation bei 2200 rpm für 5 Minuten durch die Säule geführt und überschüssiges Substrat entfernt. Schließlich wurde die Reaktionsflüssigkeit mit Hilfe der üblichen Behandlung mit Phenol/Chloroform und Fällung mit Ethanol gereinigt. Es wurden etwa 2 - 3 µg jeder synthetisierten mRNS gewonnen.

(5) Messung der Oxytocinrezeptoraktivität

Jeder der 16 in (4)-(b) erhaltenen Pools an synthetisierter mRNS wurde in 2,5 µl Wasser gelöst. Mit Hilfe des in (1) beschriebenen Verfahrens wurde die so erhaltene Lösung in 15 - 20 Xenopus-Oozyten (pro Pool) injiziert. Die Oozyten wurden 3 Tage lang bei 19 ºC im modifizierten Barths-Medium kultiviert. Gemäß dem in (1) beschriebenen Verfahren wurden die Oozyten, in die die von jedem Pool stammende mRNS injiziert worden war, anschließend perfundiert und die Änderung des Membranstroms im Falle der 1 minütigen Perfusion mit 1 µm Oxytocin untersucht. In den Oozyten, in die einer von der NotI-Subbank abgeleiteten Pools unter den in (4) hergestellten Pools injiziert worden war, wurde ein von Oxytocin verursachter Membranstrom beobachtet. Aus dem Grund, daß durch die Perfusion mit Oxytocin ein Membranstrom verursacht wurde, wurde geschlossen, daß in dieser Oozyte ein Oxytocinrezeptor exprimiert wird, der Oxytocin binden kann. Da dieser Pool aus etwa 6.000 Clonen bestand, wurde ein Teil der in (4)-(a) erhaltenen und gelagerten Zellen verdünnt und 8 Pools, die je 1.500 Clone enthielten, hergestellt. Gemäß dem unter (4) beschriebenen Verfahren wurde eine Template-DNS hergestellt und die synthetisierte mRNS mittels in vitro-Transcription erzeugt. Anschließend wurde der Serientest, bei dem die Injektion in Xenopus-Oozyten durchgeführt wurde, wiederholt. Im Ergebnis wurden 4 auf die Oxytocinrezeptoraktivität positive Pools erhalten. Diese Pools wurden mit Hilfe des oben beschriebenen Serientests selektiert, um schließlich 2 Clone zu erhalten, die eine Oxytocinrezeptoraktivität aufwiesen. Als Ergebnis des Abbaus mit Restriktionsenzymen zeigte sich, daß diese Clone identisch waren. Die Länge ihrer cDNS betrug etwa 4 kBP.
Diese cDNS wurde der Sequenzierung gemäß dem Didesoxyverfahren von Sänger et al. unterworfen. Die von der bestimmten Basensequenz (die cDNS liegt in Form eines Doppeistranges vor) abgeleitete Aminosäuresequenz ist in SEQ ID Nr.1 gezeigt.

(6) Untersuchung der Spezifität des exprimierten Oxytocinrezeptors

Der in (5) erhaltene, einzelne Clon des Oxytocinrezeptors wurde wiederum vermehrt und in Form eines Plasmids gereinigt. Anschließend wurden 10 µg des Plasmids zum Erhalt einer linearen DNS mit dem Restriktionsenzym NotI abgedaut. Gemäß dem in (4) beschriebenen Verfahren wurde unter Verwendung von 1 µg der linearen DNS als Template eine synthetisierte mRNS erhalten. Die mRNS wurde in einer Menge von 2 -5 ng pro Oozyte in Xenopus-Oozyten injiziert und die injizierten Oozyten kultiviert. Diese Oozyten wurden jeweils 1 Minute lang mit 10&supmin;¹&sup0; - 10&supmin;&sup5; M Oxytocin und 10&supmin;&sup8; - 10&supmin;&sup5; M Arg&sup8;-Vasopressin perfundiert, und die Dimensionen ihrer Membranströme verglichen. Das Verhältnis jedes Stroms zu dem während der Perfusion mit 10&supmin;&sup6; M Oxytocm, der auf 100 % gesetzt wurde, ist in Fig. 1 gezeigt. Aus Fig. 1 wird deutlich, daß Arg&sup8;-Vasopressin nicht annähernd denselben Membranstrom hervorrufen konnte wie Oxytocin bis die Konzentration in der Perfusion nahezu das Hundertfache derjenigen von Oxytocin beträgt. Die zum Hervorrufen eines 50 % des Maximalstroms entsprechenden Stromes erforderlichen Konzentrationen beider Substanzen lagen im Falle des Oxytocins bei etwa 10&supmin;&sup8; M und in der Nähe eine physiologischen Konzentration. Im Gegensatz dazu betrug diejenige von Vasopressin etwa 10&supmin;&sup6; M. Daher wurde gefunden, daß die von uns isolierte cDNS für einen Oxytocin-spezifischen Rezeptor codiert. Bei einer 1 minütigen Vorabperfusion mit 10&supmin;&sup6; M eines Vasotocins, das als spezifischer Oxytocin-Antagonist bekannt ist ([d(CH&sub2;)&sub5;, Tyr(Me)&sub2;, Orn&sup8;]-Vasotocin) (vgl. K. Bankowski et al., Int. J. Peptide Protein Res. 16, 382 (1980)) unmittelbar vor der Perfusion mit Oxytocin sank auch der direkt danach durch Perfusion mit Oxytocin hervorgerufene Membranstrom auf nicht mehr als 50 % des Maximalstroms bei 10&supmin;&sup6; M Oxytocin. Weiterhin wurde bei Verwendung von 10&supmin;&sup6; M oder 10&supmin;&sup5; M [Phe², Ile³, Orn&sup8;]-Vasopressin, das ein Vasopressin selektiver Agonist ist, keine Reaktion beobachtet.
Derartige Beobachtungen zeigen an, daß die von uns erhaltene cDNS für einen Rezeptor codiert, der spezifisch mit Oxytocin reagieren kann und Oxytocin bindet.
Weil nun der erfindungsgemäße Rezeptor, die DNS-Sequenz, die rekombinante DNS und der Transformant erhalten wurden, wird es möglich:
1) unter Verwendung von Endometriumzellen des Uterus die Entbindungszeit aus dem Ausmaß der Expression des Oxytocinrezeptors abzuschätzen, aus dem Grund, daß der Oxytocinrezeptor auCD4den Uterusendometriumzellen gerade vor der Entbindung ansteigt.
2) wissenschaftlich und semiquantitativ vorherzusagen, ob Wehenschmerzen von Patientinnen bei Frühgeburten gelindert werden können oder nicht, da der Oxytocinrezeptor auch im Fall von Frühgeburten ansteigt.
3) Vorbeugung einer hypertonischen Uterusdysfunktion oder die Bestimmung des Zeitpunkts der Geburtseinleitung lassen sich auf objektiven Gründen bewirken, indem man die Oxytocinrezeptorkonzentration abschätzt, bevor ein die Geburt einleitendes Mittel verwendet wird.
4) Die Expression des erfindungsgemäßen Rezeptors in einer tierischen Zelle oder in einer Xenopus-Oozyte ermöglicht Serientests zur Bestimmung der Oxytocinaktivität.
5) Die Linderung des Wehenschmerzes wird möglich, indem man einen Antikörper gegen den erfindungsgemäßen Rezeptor herstellt und dadurch die Bindung des Oxytocins inhibiert.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig.1
Auftragung, die die Konzentration der perfundierten Substanzen auf der Abszisse (Oxytocinkonzentration bei 10&supmin;&sup6; M Vasotocin + Oxytocin) und auf der Ordinate jeweils das Verhältnis des Stromes zum Strom während der Perfusion mit 10&supmin;&sup6; M Oxytocin, der als 100 % gesetzt wurde.
Die unter (5) oben angesprochenen Clone, also JM103, der von E.Coli K12 abstammt und in den die rekombinante DNS eingebracht wurde, wurden beim Fermentation Research Institute hinterlegt (Hinterlegungsnummer Bikouken 12907 (Ferm P- 12907)).

Sequenz ID Nr.1

Länge der Sequenz :389 Aminosäuren
Art der Sequenz :Aminosäure
Molekültypus :Protein
Hypothetische Sequenz :ja
Organismus der ursp. Quelle :Homo sapiens
Gewebetyp :Myometriumgewebe Sequenz:

Sequenz ID Nr.2

Länge der Sequenz :1167 Nukleotide
Art der Sequenz :Nukleinsäure
Strangtyp :Doppelstrang
Molekültypus :cDNS einer mRNS
Hypothetische Sequenz :nein
Organismus der ursp. Quelle :Homo sapiens
Gewebetyp :Myometriumgewebe Sequenz:

Claims

1. Isolierter Oxytocinrezeptor, umfassend die in SEQ ID Nr.1 dargestellte Sequenz von 389 Aminosäuren.

2. Isolierter Oxytocinrezeptor, umfassend eine dahingehende Variante der in SEQ ID Nr.1 dargestellten Sequenz von 389 Aminosäuren, daß mindestens eine, aber nicht mehr als vier Aminosäuren substituiert, zugefügt oder deletiert sind.

3. Oxytocinrezeptor nach Anspruch 2, bei dem sich die variierte Aminosäuresequenz von der Aminosäuresequenz nach SEQ ID Nr.1 dadurch unterscheidet, daß nur eine Aminosäure substituiert, zugefügt oder deletiert wurde.

4. Oxytocinrezeptor gemäß Anspruch 2 oder 3, bei dem die Aminosäuren aus SEQ ID Nr. 1, wenn sie substituiert werden, gemäß der folgenden Tabelle ersetzt werden:

5. Isolierter Oxytocinrezeptor, der einen Teil mit 350 Aminosäuren des Oxytocinrezeptors gemäß einem der vorstehenden Ansprüche umfaßt.

6. Oxytocinrezeptor gemäß Anspruch 1, bestehend aus SEQ ID Nr.1

7. Isolierte DNS, die für einen Oxytocinrezeptor gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 codiert.

8. DNS gemäß Anspruch 7, die SEQ ID Nr.2 umfaßt.

9. DNS gemäß Anspruch 7, die zu mindestens 75 % der Sequenz von SEQ ID Nr.2 homolog ist.

10. Rekombinante DNS, enthaltend einen Vektor, der eine DNS gemäß einem der Ansprüche 7 bis 9 enthält.

11. DNS, die mit der DNS gemäß einem der Ansprüche 7 bis 9 hybridisiert.

12. Mit der DNS gemäß Anspruch 10 transformierte Zelle.

13. Verfahren zur Herstellung eines Oxytocinrezeptors, bei dem man eine Zelle gemäß Anspruch 12 und solchen Bedingungen kultiviert, daß die DNS exprimiert wird, so daß der Oxytocinrezeptor hergestellt wird, und den Oxytocinrezeptor isoliert.

14. Kit, der, in einem Behälter angeordnet, einen Oxytocinrezeptor oder einen Antikörper dagegen und einen Puffer enthält.