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Hintergrund zu der Erfindung
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Feld der Erfindung
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Die
Erfindung auf dem Gebiet der Immunologie und Immuntherapie bezieht
sich auf Peptide und ihre pharmazeutischen Zusammensetzungen, die
in der Lage sind, immunbezogene Krankheiten, wie Autoimmunkrankheiten
und bösartige
Krankheiten zu verhindern, zu unterdrücken oder zu behandeln.
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Beschreibung
des mikrobiologischen Hintergrundes
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Autoimmunkrankheiten
sind durch eine unerwünschte
und unzulässige
Attacke auf das Gewebes des Wirts seitens des Immunsystems gekennzeichnet.
Obwohl der Mechanismus für
das Fortschreiten dieser Krankheiten noch nicht besonders gut verstanden
wird, sind zumindest einige Einzelheiten hinsichtlich der Antigenpräsentation
in diesem (und anderem) Kontext aufgeklärt. Es wird heute angenommen,
dass Antigene einschließlich
der Autoantigene durch Antigen präsentierende Zellen (APC) prozessiert
werden und dass die daraus hervorgehenden Fragmente dann mit einem
der Zelloberflächenproteine
assoziieren, die durch den Haupt-Histokompatibilitäts-Komplex
(major histocompatibility complex, MHC) codiert werden. Folglich
wird die Erkennung eines Antigenpeptids als "MHC beschränkt" bezeichnet. Wenn der MHC/Antigenfragment-Komplex an
einen komplementären
T-Zell-Rezeptor
(TCR) an der Oberfläche
eines T-Lymphozyten bindet, führt
dies zur Aktivierung und Proliferation des Klons oder der Subpopulation
von T-Zellen, die diesen speziellen TCR tragen. Die T-Zellen haben,
einmal aktiviert, die Fähigkeit,
andere Zellen des Immunsystems zu regulieren, die das prozessierte
Antigen präsentieren
und Zellen oder Gewebe zu zerstören,
die Epitope des erkannten Antigens tragen.
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Ein Überblick
von Acha-Orbea, H., et al. (Ann. Rev. Immunol. 7:371–405 (1989)) über die
Rolle von TCR bei Autoimmunkrankheiten diskutiert die überwältige Vielfalt
von TCR, die in dem Immunsystem eines Individuums verfügbar sind
und die Erzeugung dieser Vielfalt durch die Organisation der Keimliniengene
und dem DNA-Rearrangement, das für
die TCR-α-
und -β-Ketten
codiert. Die α-Ketten
werden durch unterschiedliche Kombinationen von Gensegmenten für die variable
(V-)Region, die Junction (J-)Region und die konstante (C-)Region
codiert. Die TCR-β-Ketten
werden zusätzlich
durch ein Gensegment für
die Diversity (-D)Region codiert und enthalten demzufolge eine neu
arrangierte VDJC-Sequenz. Zufolge des allelen Ausschlusses exprimiert
ein Klon von T-Zellen nur einen Typ eines TCR-α-β-Heterodimers.
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Eine
zunehmende Zahl von menschlichen Erkrankungen wird von ihrer Natur
her als autoimmune Krankheiten klas sifiziert (Theofilopoulos, A.,
In: D.P. Stites„ et
al., eds., in Basic and Clinical Immunology, Lange Medical Publications,
Los Altos, CA, 1988), wobei rheumatoide Arthritis (RA), Myasthenia
Gravis (MG), multiple Sklerose (MS), erythematoser systemischer
Lupus (SLE), Autoimmunthyroiditis (Hashimoto's Thyroiditis), Graves' Krankheit, entzündliche
Darmerkrankung, autoimmune Uveoretinitis, Polymyositis und bestimmte
Arten von Diabetes verschiedene Beispiele hiervon sind. Für eine Anzahl
dieser menschlichen Autoimmunerkrankungen wurden Tiermodelle entwickelt.
Experimentelle allergische Encephalomyelitis (EAE, auch experimentelle
Autoimmunencephalomyelitis genannt), ein Modell für MS, gehört zu den
am besten untersuchten Modellen.
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Da
es jetzt bekannt ist, dass bei diesen und anderen Autoimmunkrankheiten
die Wirkung von T-Helfer-Zellen beteiligt ist, die durch das Binden
ihres TCR an einen MHC/Autoantigenkomplex (oder einen Nicht-Autoantigenkomplex)
stimuliert sind, wurden Präventions-
und/oder Behandlungsstrategien vorgeschlagen, die auf der Unterbrechung
der Wechselwirkungen zwischen dem MHC/Antigenkomplex und dem TCR
basieren. Wraith, D.C., et al. in Cell. 57:709–715) (1989)) schlug Lösungen vor,
die auf diesem Prinzip basieren, einschließlich der Impfung mit vollständigen T-Zellen
(wie ursprünglich
durch I.R. Cohen's
Labor vorgeschlagen und weiter unten besprochen), der passiven Blockierung
unter Verwendung von Antikörpern,
die an den TCR binden, der passiven Blockierung unter Verwendung
von Antikörpern,
die an den MHC-Teil des Komplexes binden, der Verabreichung von
Antikörpern,
die mit dem CD4-Marker von T-Helfer-Zellen reaktionsfähig sind,
und der Verwendung von Peptiden, die das interessierende Antigen
nachahmen und um die Bindung an die MHC- oder TCR-Moleküle konkurrieren.
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Das
Myelinbasisprotein, MBP, stellt das hauptsächliche Autoantigen dar, das
an der EAE beteiligt ist, und es ist der führende Kandidat als Encephalitogen,
das an MS beteiligt ist.
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Die
Gruppe um Heber-Katz (Heber-Katz, E., et al., in Ann. N.Y. Acad.
Sci. 540:576–577
(1988); Owhashi, M., et al., in J. Exp. Med. 168:2153–2164 (Dez.
1988)) hat die Feinspezifität
bei der Erkennung von MBP-Epitopen durch die T-Zellen von Ratten
analysiert. Wenn die mit MBP immunisierten T-Zellen von Ratten mit
einer T-Lymphomlinie von Mäusen
hybridisiert und geklont werden, zeigt das Muster der Feinspezifität und die
Sothernblotanalyse des TCR-Vβ-Gen-Arrangements
eine polyklonale Antwort, obwohl 75% des Klons mit der 68–88 Encephalitogendeterminante
reagiert hat. Ein mit 10.18 bezeichneter monoklonaler Antikörper (mAb),
der gegen ein Encephalitogen des T-Zellhybridoms gerichtet ist, erwies
sich als ein Anti-Idiotyp
oder ein Anti-Klonotyp, der nur mit T-Zellen reagierte, die für das MBP
68–88
Epitop spezifisch ist. Der mAb konnte EAE blockieren oder rückgängig machen,
wenn er zusammen mit dem encephalitogenen MBP-Peptid injiziert wurde,
oder 5 Tage später.
Löslicher
10.18 mAb blockierte die spezifischen T-Zell-Klone und immobilisierter 10.18
mAb stimulierte ihre Proliferation. Auf die Induzierung von EAE
mittels MBP hin erhöhte
sich der Anteil von Zellen, die den 10.18 mAb binden, ausgehend
von einer anfangs sehr niedrigen Frequenz. Die Autoren schlossen
daraus, dass die 10.18+ T-Zellen wahrscheinlich das dominante pathogene
T-Zellrepertoire von EAE in Lewis-Ratten darstellten. Jedoch war
es nicht bekannt, ob der 10.18 mAb eine V-Domäne oder eine idiotypische Determinante
erkannte.
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T-Zellen,
die den TCR-αβ-Heterodimer
exprimieren, können
idiotypische Antikörper
und V-Gen-familienspezifische Antikörper exprimieren, die die T-Zellfunktion
regulieren (Owhashi, M., et al., a.a.O.; Gascoigne, N.R.J., J.W.,
et al., in Proc. Natl. Acad. Sci., USA 84:2936 (1987); Kappler,
j.W., et al., in Nature 332:35 (1988); Kappler, J.W., et al., in
Cell 49:263 (1987); MacDonald, H.R., et al., in Nature 332:40 (1988).
Beispielsweise sind Antikörper,
die die TCR Vβ8-Sequenz
erkennen, bei der Prävention
und Behandlung von Autoimmunitäten
in Mäusen
und Ratten wirksam (Owhashi, M., et al., supra; Acha-Orbea, H., et al.,
in Cell 54:263–273 (1988);
Urban, J., et al., in Cell 54:577–592 (1988)). Die Gewinnung
solcher Antikörper,
die für
die Genprodukte in der V-Region selektiv sind, ist von der Verfügbarkeit
von T-Zellklonen abhängig,
die den TCR exprimieren, der durch die relevante V-Genfamilie codiert
wird, und sie erfordert mühsame
Screeningverfahren unter Verwendung von vollständigen Zellen, um die gewünschte Spezifität zu erreichen.
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Obwohl
Antikörpertherapien,
bei denen Antikörper
gegen die MHC-Moleküle
und die CD4-Moleküle gerichtet
sind, bei verschiedenen Tiermodellen mit Autoimmunität erfolgreich
sind, sind diese Lösungen
nicht besonders selektiv und möglicherweise übermäßig suppressiv,
da 70% der T-Zellen den CD4-Marker tragen und da alle T-Zell-vermittelten
Antworten und die meisten Antikörperantworten
eine MHC-assoziierte Antigenpräsentation
erfordern.
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Das
Labor von I.R. Cohen hat eine Lösung
für die
immunspezifische Behandlung von Autoimmunitäten entwickelt, bei der lebende
oder abgeschwächte
vollständige
T-Lymphozyten als
Impfstoff verwendet werden, um EAEn – experimentelle autoimmune
Thyroiditis (EAT) – und
experimentelle Arthritis zu verhindern oder zu behandeln. Diese
Lösung
ist dem Aufsatz von I.R. Cohen in Immunol. Rev. 94:5–21 (1986)
beschrieben, der verschiedene Tiermodelle von Autoimmunkrankheiten
diskutiert, wobei eine Impfung mit krankheitsspezifischen T-Lymphozyten
verwendet wurde, um prophylaktische und therapeutische Effekte zu
erzielen. Die Feinspezifität
der Impfung wurde durch die Feinspezifität der T-Zell-Erkennung diktiert,
die möglicherweise
den TCR mit einschließt.
Beispielsweise wurden zwei unterschiedliche Anti-MBP-T-Zell-Linien
gefunden, von denen jede mit einem anderen Epitop des MBP reagieren
kann, um gegen EAE zu impfen, das durch die speziellen Epitope induziert
wurde, was eine Form der antiidiotypischen Immunität anzeigt.
Als jedoch Versuche unternommen wurden, die Klone mit MBP-spezifischen
T-Zellen oder Thyroglobulin-spezifischen T-Zellen (in einem Thyroiditismodell)
von den nichtklonalen Zell-Linien zu isolieren, wurden nur Klone
gewonnen, die die Krankheit, jedoch keine Widerstandsfähigkeit
hervorrufen. Dies führte
zu der Erkenntnis, dass eine geeignete Aggregation oder Rigidifikation
der Zellmembranen, entweder durch den hydrostatischen Druck oder
chemische Querbindung hervorgerufen, Zellen hervorbrachte, die konsistenter
den Schutz induzieren konnten. In ähnlicher Weise konnten auch
niedrige (subencephalitogene) Dosen von MBP-spezifischen Zellen
eine Resistenz gegen lethale EAE induzieren. Der Schutzzustand wurde
als "Gegen-Autoimmunität" bezeichnet. Bei
diesem Zustand sind T-Zellklone beteiligt, die spezifisch als Antwort
auf die eingeimpften T-Zellen proliferieren können, Effektorklone in vitro
(nichtspezifisch, vermutlich zufolge der Freisetzung eines suppressiven
Lymphokins) unterdrücken
können
und die, wie angenommen, in vivo die Gegenautoimmunität übertragen
können. Solche
Gegen-Autoimmunität
ist von einer unterdrückten
verzögerten Überempfindlichkeitsantwort
(DH) auf die spezifischen Epitope und einer Verhinderung oder Abnahme
der klinischen Erkrankung begleitet.
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Eine
Hauptschwierigkeit bei den vorstehenden Lösungen besteht darin, dass
sie die Verwendung komplexer biologischer Präparationen erfordern, die keine
wohl definierten therapeutischen Wirkstoffe enthalten. Solche Präparationen
leiden darunter, dass sie eine komplexe Produktion und Pflege (beispielsweise
der Notwendigkeit für
Sterilität
und großer
Mengen an Medium zur Produktion einer großen Anzahl von "Impf"-T-Zellen) erfordern
und ihnen die Reproduzierbarkeit von Batch zu Batch fehlt. Die T-Zell-Impfpräparationen,
die für
Menschen verwendbar sind, müssen
sowohl autolog als auch individuell spezifisch sein, d.h. für jeden
Patienten exakt zugeschnitten. Darüber hinaus kann das Vorhandensein
von zusätzlichen
Antigenen auf der Oberfläche
von solchen T-Zellen zu einer breiteren, möglicherweise schädlichen
Immunreaktion führen, die
nicht auf die gewünschten
T-Zellklone beschränkt
ist (Offner, H. et al., in J. Neuroimmunol. 21:13–22 (1989)).
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In
der EP-A-0 340 109 ist die Verwendung von Antikörpern, Oligopeptiden oder antiidiotypischen
Antikörpern
beschrieben, die auf die variablen Regionen von T-Zell-Rezeptoren bezogen
sind, die mit Autoimmunkrankheiten assoziiert sind, um die Funktion
der T-Zell-Rezeptoren zu inhibieren.
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In
der WO90/11294 ist die Verwendung von T-Zellen, T-Zell-Rezeptoren oder
deren Fragmenten als Impfstoff gegen T-Zell-vermittelte Pathologien
vorgeschlagen.
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Es
gibt deswegen einen großen
Bedarf für
Wirkstoffe und pharmazeutische Zusammensetzungen, die die Eigenschaft
der Spezifität
für die
Autoimmunreaktion, auf die gezielt wird, die Vorhersagbarkeit ihrer
Selektion, die Einfachheit und Reproduzierbarkeit der Zubereitung
und der aus reichenden Definition aufweisen, um eine genaue Steuerung
der Dosierung zu ermöglichen.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Diese
Erfindung wurde als Antwort auf einen klaren Bedarf nach therapeutischen
Wirkstoffen und Zusammensetzungen geschaffen, die in der Lage sind,
immunbezogene Krankheiten in einer klonspezifischen Weise zu verhindern,
zu unterdrücken
oder zu behandeln, ohne dass eine allgemeine Unterdrückung des
Immunverhaltens verursacht wird, wie dies im Falle der meisten heute
gebräuchlichen
immuntherapeutischen und immunpharmakologischen Lösungsansätze der
Fall ist. Die Erfindung wurde aus der Kenntnis heraus entwickelt,
dass Linien oder Klone von T-Zellen, die für Autoantigene, die in der
Tat Autoimmunkrankheiten vermitteln, durch komplexe Abschwächungsprotokolle
in Therapeutika umgewandelt und unmittelbar in Tiere injiziert werden
können,
um die Krankheit zu verhindern oder zu behandeln.
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Die
Versuche des Erfinders, eine derartige zelluläre Immuntherapie zu schaffen,
führte
zu suboptimalen Ergebnissen. Bei der Verwendung von Abschwächungsverfahren,
wie sie aus dem Stand der Technik bekannt sind, erhielt der Erfinder
variable unvorhersehbare Schutzwerte und die sich ergebende Immunität war nicht
auf den Klon beschränkt,
vermutlich weil Vollzellenimpfstoffe eine Varietät von Antigenen eingeführt haben.
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Bei
einem Versuch, diese allgemeine Lösung zu vereinfachen und zu
standardisieren und eine sehr spezifische Immunität zu erhalten,
bei der nur jene Klone von T-Zellen, die das Krankheits-assoziierte
Antigen erkannten, bevorzugt wurden, schuf der Erfinder die vorliegende
Erfindung. Der Erfinder hat erstmalig erkannt, dass ein immunogenes
Peptid synthetisiert werden kann, das einen Teil des Krankheits-assoziierten
immunologischen "Markers" nachahmt, beispielsweise
den TCR von T-Zellen, die an dem Krankheitsprozess beteiligt sind.
Unerwarteterweise richtet die Immunisierung eines Individuums mit
dem Peptid die Immunantwort des Wirtes gegen den "Marker" und verhindert dadurch
bzw. unterdrückt
die Entwicklung der Krankheit oder behandelt den Verlauf der Krankheit.
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Ein
Merkmal der Erfindung ist ein Verfahren zum Auswählen, welches Peptid zu verwenden
ist, um eine immunbezogene Krankheit zu verhindern, zu unterdrücken oder
zu behandeln, und zwar basierend auf einer Identifikation der Aminosäuresequenz
des TCR-Markers, der mit der Krankheit assoziiert ist, vorherzusagen,
welches Segment der TCR-Sequenz
auf verschiedenen bekannten Algorithmen immunogen basiert, und zu
bestimmen, welche Stelle oder Stellen in der TCR-Struktur ein geeignetes
Ziel für
eine Immunantwort sind, die zu einem Schutz gegen die Krankheit
führen.
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Ein
Ausführungsbeispiel
der Erfindung ist ein Peptid mit 15–30 Aminosäuren, die eine Aminosäuresequenz
eines T-Zell-Rezeptor-Markers
haben, die für
eine immunbezogene Krankheit charakteristisch ist, wobei das Peptid
in der Lage ist, einen Schutz gegen die Krankheit zu induzieren,
und wenigstens einen Teil des zweiten Komplementaritätsbestimmenden
Abschnitts des T-Zellrezeptors aufweist; oder es handelt sich um ein
funktionales Derivat des Peptids, vorausgesetzt, dass das Peptid
nicht die Sequenz
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Asp-Met-Gly-His-Gly-Leu-Arg-Leu-Ile-His-Tyr-Ser-Tyr-Asp-Val-Asn-Ser-Thr-Glu-Lys aufweist.
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Die
Erfindung schließt
auch das Peptid ein, das mit einem Träger konjugiert ist, beispielsweise
eine zusätzliche
heterologe Aminosäuresequenz,
um die Immunogenität
des Peptids zu verbessern.
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Die
Erfindung ist auch auf eine pharmazeutische Zusammensetzung gerichtet,
die das Peptid oder ein funktionales Derivat in Vermischung mit
einem pharmazeutisch verträglichen
Exzipienten aufweist.
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Somit
liefert die Erfindung chemisch definierte Peptide und Therapeutika,
die bei bestimmten immunbezogenen Krankheiten speziell angewendet
werden können,
um die spezifische immunologische Antwort zu unterbrechen, die für das Induzieren
oder das Verbreiten des Krankheitsprozesses verantwortlich ist.
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Zu
den Krankheiten, bei denen die Erfindung insbesondere einzusetzen
ist, gehören
Autoimmunkrankheiten, wie rheumatoide Arthritis, adjuvante Arthritis,
Myasthenia Gravis, Enzephalomyelitis, multiple Sklerose, Thyroiditis,
Diabetes, entzündliche
Darmerkrankung und systemischer erythematoser Lupus. Die Erfindung
ist auch gegen bösartige
Erkrankungen gerichtet, wie T-Zell-Leukämie und Lymphom, wobei der
TCR als Tumormarker dient.
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Ein
Ausführungsbeispiel
der Erfindung ist ein Verfahren zum Auswählen eines Peptids mit einer
Aminosäuresequenz
eines T-Zell-Rezeptors, wobei der T-Zell-Rezeptor eine T-Zell-Rezeptor-Marker
ist, der für eine
immunbezogene Krankheit charakteristisch und das Peptid in der Lage
ist, einen Schutz gegen die Krankheit zu induzieren, wobei zu dem
Verfahren die Schritte gehören,
dass:
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- (a) die T-Zellen von einem Individuum, das
eine Disposition für
die Krankheit aufweist, entnommen werden;
- (b) die Anzahl der T-Zellen nach Schritt (a) in einer Kultur
in Anwesenheit einer autoantigenen Präparation expandiert werden;
- (c) der T-Zell-Rezeptor, der durch die expandierten T-Zellen
nach Schritt (b) exprimiert wird, identifiziert wird; und
- (d) das Peptid aus der Aminosäuresequenz ausgewählt wird,
das wenigstens einen Teil des zweiten Komplementaritäts-bestimmenden
Abschnitts des T-ZellRezeptors
aufweist.
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Der
TCR kann durch seine Verwendung von TCR-spezifischen Antikörpern oder
durch Bestimmung der TCR-Aminosäuresequenz
identifiziert werden.
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Die
Erfindung schafft ferner ein Verfahren zum Herstellen eines Peptids
mit einer Aminosäuresequenz eines
TCR, wobei der T-Zell-Rezeptor ein T-Zell-Rezeptor-Marker ist, der
für eine
immunbezogene Krankheit charakteristisch ist, das Peptid in der
Lage ist, einen Schutz gegen die Krankheit zu induzieren und zu
dem Verfahren die Schritte gehören,
dass:
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- (a) wie oben beschrieben, ein Peptid ausgewählt wird;
und
- (b) das Peptid oder ein funktionales Derivat hiervon synthetisiert
wird.
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Weitere
Ausführungsbeispiele
der Erfindung sind auf polyklonale, monoklonale oder chimere Antikörper gerichtet,
die für
das TCR-Peptid spezifisch sind, das in der Lage ist, ein Individuum
gegen eine immunbezogene Krank heit zu schützen sowie Verfahren zum Herstellen
solcher Antikörper.
Die Erfindung umfasst auch Antikörper,
die an zytotoxische Wirkstoffe gebunden sind einschließlich ribosomaler
Inhibierungsproteine, wie beispielsweise die Ricin-A-Kette.
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Zu
der Erfindung gehört
auch die Verwendung der obigen Antikörper bei der Herstellung eines
Medikaments, um eine Autoimmunkrankheit zu verhindern, zu unterdrücken oder
zu behandeln.
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Kurze Beschreibung
der Figuren
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1. Peptid-spezifische Inhibierung
einer Antikörperreaktionsfähigkeit.
Antiseren von 4 Ratten, die entweder mit dem TCR Vβ8 (39–59) Peptid
allein oder in Kombination des TCR-Peptids und des GP-S49S MBP-abgeleiteten
Autoantigens kombiniert sind, werden zusammengegossen und 40-360-fach
verdünnt.
Die Antiseren werden auf ihre Reaktionsfähigkeit in ELISA mit 25 ng
Peptid, das an Mikroplattentüpfel
gebunden ist, indirekt getestet. Die Menge an Peptid ist 10 pM TCR
Vβ8 (39–59) (MW
= 2390 Dalton) oder 15 pM GP-549S (MW = 1630 Dalton) äquivalent.
In einem Bereich zwischen 0,005 – 50μg/Tüpfel werden variierende Konzentrationen
des Inhibitorpeptids zugegeben. Die Absorptionsmessungen wurden
in Triplikattüpfeln
bestimmt und die Reaktionsfähigkeit
als Vielfaches der nichtinhibierten Kontrolltüpfel berechnet.
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2. Antikörper gegen
das Peptid TCR Vβ8(39–59) färben Vβ+ encephalitogene
T-Zellen. Normale Thymozyten (A und C) oder GP-S49S-spezifische
T-Zell-Linien (B und D) werden mit Karnickelantikörpern gegen
TCR Vβ8
(39–59)
inkubiert, gefolgt von einem Maus-Anti-Karnickel-IgG- begünstigenden
Antikörper
und einem Fluoreszin-markierten Ziege-Anti-Maus-IgG-Antikörper. Zytrometrische
Strömungsanalyse
der Verfärbung
wird unter Verwendung eines Coulter Epics- C-Zytofluorograph durchgeführt. A und
C entsprechen Dot-Plots von 10 000 Zellen unter Veranschaulichung
der Zellgröße über der
Fluoreszenzintensität;
B und D repräsentieren
die entsprechenden Histogramme. Die Fluoreszenzintensität der T-Linienzellen,
die mit Anti-TCR Vβ8(39–59) Antikörper gefärbt sind
(mehr als 90% gefärbt),
ist, verglichen mit den 5% normalen Thymozyten erhöht, die
mit diesem Antikörper
gefärbt
sind. Sowohl die Thymozyten als auch die T-Linienzellen, die mit
normalem Karnickel-IgG inkubiert sind, als Kontrolle für das Anti-TCR
Vβ8(39–59) IgG
zeigten den Hintergrundwert der Färbung (gestrichelte Linie in
Kasten D).
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3. Prävention, Unterdrückung und
Behandlung von EAE mit 50μg
TCR Vβ8-39–59 Peptid/CFA. Ratten
wurden s.c. mit dem TCR-Peptid 40 Tage zuvor gleichzeitig oder 12
Tage nach dem Einsetzen der Krankheit nach der Induzierung von EAE
mit 50μg
GP-MBP/CFA geimpft.
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4. Die Unterdrückung von
EAE mit 50μg
TCR Vβ8-39–59 Peptid,
das gleichzeitig oder 7 oder 11 Tage nach der Induzierung von EAE
mit 50μg
GP-MBP/CFA i.d. in das Ohr verabreicht wurde.
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5. Behandlung von EAE mit
10 oder 50μg
TCR Vβ8-39-59,
das beim Einsetzen der klinischen Anzeichen (Tag 12) nach der Induzierung
von EAE mit 50μg
GP-MBP/CFA in dem Ohr i.d. verabreicht wurde.
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6. Die Peptidspezifität von MBP-spezifischen
menschlichen T-Zell-Linien aus MS-Patienten und Gesunden.
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7. Verhältnis der Gesamtproliferationsantwort
von T-Zell-Linien, die gegen jedes Peptid gerichtet sind, verglichen
mit dem Anteil aller Klone, die auf jedes Peptid reagieren.
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8. Zellantworten gegen
die TCR Vβ8-
und Vβ14-Peptide bei aus EAE-genesenen
Ratten und TCR-Peptid-immunisierten Ratten. DTH ist in mm/100 und
die Proliferation in CPM/1000 angegeben, wobei jeweils die Hintergrundaktivität abgezogen
ist.
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9. Behandlung von wiederaufflackernder
EAE mit TCR Vβ17-Peptid.
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Beschreibung
der bevorzugten Ausführungsbeispiele
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Die
erfindungsgemäßen Zusammensetzungen,
Verfahren und Produkte sind sowohl bei Menschen als auch beim Tier
anwendbar.
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Die
erfindungsgemäßen Peptide
enthalten Sequenzen von etwa 13–30
Aminosäuren
und sind immunogen, d.h. in der Lage, eine Immunantwort zu induzieren,
wenn sie in ein Individuum injiziert werden.
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Unter "funktionalem Derivat" ist ein "Fragment", eine "Variante", ein "Analogon" oder ein "chemisches Derivat" des Peptids zu verstehen,
dessen Terme nachstehend definiert sind.
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Es
ist verständlich,
dass die Aminosäuresequenz,
die das erfindungsgemäße Peptid
enthält,
alleine verwendet werden kann oder an ein längeres Peptid gebunden oder
innerhalb der Sequenz eines längeren Peptids
enthalten.
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Das
längere
Peptid kann Sequenzen eines nicht verwandten Peptids aufweisen,
beispielsweise ein Carrier-Protein, das dazu verwendet wird, die
Immunogenität
des TCR-Oligopeptids zu verbessern. Solche Carrier sind dem Fachmann
bekannt und es gehören
hierzu heterologe Proteine, so z.B. Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH),
Rinderserumalbumin, Tetanustoxoid u.dgl. In den Umfang der Erfindung
fällt auch
das Peptid, das an einen Antikörper
gebunden ist, ebenso wie ein Peptid, das an ein Toxin gebunden ist.
Zu den erfindungsgemäßen Toxinen
gehören
das ribisomale Inhibitorprotein, beispielsweise die Ricin-A-Kette
oder das Pseudomonas-Toxin.
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In
dem hier gebrauchten Sinne bezeichnet der Ausdruck "Marker TCR" einen TCR, der für eine besondere
immunbezogene Krankheit charakteristisch ist, beispielsweise eine
Autoimmunkrankheit oder eine bösartige
Erkrankung (d.h. Krebs).
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Der
Ausdruck "immunbezogene
Krankheit" bezeichnet
in dem hier verwendeten Sinne eine Krankheit, bei der das Immunsystem
an der Pathogenese der Krankheit beteiligt ist oder bei der eine
geeignete Stimulierung des Immunsystems zu einem Schutz gegen diese
Krankheit führen
kann. Ein bevorzugtes Beispiel für eine
immunbezogene Krankheit, auf die die Erfindung zielt, ist eine Autoimmunkrankheit.
In nicht beschränkender
Weise werden als Beispiele für
Autoimmunkrankheiten bei dieser Erfindung angesehen rheumatoide Arthritis
(RA), Myasthenia Gravis (MG), multiple Sklerose (MS), systemischer
erythematoser Lupus (SLE), autoimmune Thyroiditis (Hashimoto's-Thyroiditis), Graves' Krankheit, entzündliche
Darmerkrankung, Autoimmunuveoretinitis, Polymyositis und bestimmte
Arten von Diabetes.
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Demzufolge
ist ein Marker-TCR für
MS ein TCR, der in der Lage ist, den Komplex zwischen dem eigenen
MHC und dem MBP-Fragment (oder dem MBP-Fragment alleine) zu binden,
wobei der MBP die autoantigene Hauptcharakteristik dieser Krankheit
aufweist. Bei anderen Autoimmunerkrankungen dienen andere TCR als
Marker, da sie für
den Komplex zwischen den MHC-Molekülen und den Autoantigenen spezifisch
sind, die bei diesen Krankheiten beteiligt sind. Bei Myasthenia
Gravis (MG) wird zum Beispiel angenommen, das Autoantigen ist der
Nikotinacetylcholin-Rezeptor (AChR). Deshalb wird ein identifizierbarer
TCR, der AChR im Zusammenhang mit Selbst-MHC (oder direkt) bindet
und durch AChR reaktive T-Zellen exprimiert wird, die die Krankheit
vermitteln, als "Marker-TCR" für MG bezeichnet.
Der Fachmann sieht, dass die Bestimmung eines Marker-TCR und des
immunogenen Peptids durch routinierte Übung unter Verwendung von Screening-Verfahren,
wie sie hinlänglich
bekannt sind, erfolgt, wenn die Lehren der vorliegenden Erfindung
vollständig
verstanden sind.
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Als
immunbezogene Krankheiten sollen auch maligne Erkrankungen angesehen
werden, bei denen die Tumorzelle einen Tumormarker trägt, beispielsweise
ein Tumorantigen, das in der Lage ist, durch das Immunsystem erkannt
zu werden und auf das das Immunsystem reagieren kann. Der TCR kann
als Tumormarker bei T-Zell-Leukämie
oder T-Zell-Lymphom-Zellen
dienen.
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Bei
einem Individuum, das von einer immunbezogenen Krankheit befallen
oder dafür
disponiert ist, führt
das Zuführen
des Peptids, das die Aminosäuresequenz
eines Teils des Marker-TCR trägt,
zum Hervorrufen einer Immunantwort gegen den TCR und einen Schutz
gegen die immunbezogene Krankheit.
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Unter
dem Begriff "Schutz" gegenüber der
Krankheit, wie er hier verwendet wird, soll die Prävention, die
Unterdrückung
oder die Behandlung der Krankheit verstanden sein. Zur "Prävention" gehört die Verabreichung
einer schützenden
Zusammensetzung bevor die Krankheit induziert wird. So führt z.B.
bei dem Tiermodell EAE eine erfolgreiche Verabreichung einer schützenden
Zusammensetzung vor der Injektion des Encephalitogens, das die Krankheit
induziert, zu einem "Schutz" gegen die Krankheit.
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Bei
der "Unterdrückung" wird die Zusammensetzung
nach dem induzierenden Ereignis verabreicht, jedoch bevor die Krankheit
klinisch in Erscheinung tritt. Wiederum beim EAE-Beispiel bedeutet
die erfolgreiche Verabreichung einer schützenden Zusammensetzung nach
der Injektion des Encephalitogens, jedoch vor dem Auftreten neurologischer
Symptome die "Unterdrückung" der Krankheit.
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"Behandlung" meint die Verabreichung
der schützenden
Zusammensetzung nach dem Auftreten der Krankheit. Bei dem EAE-Beispiel
bedeutet die erfolgreiche Verabreichung einer schützenden
Zusammensetzung nach der Injektion des Encephalitogens und nach
dem Entwickeln klinischer Anzeichen die "Behandlung" der Krankheit.
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Es
ist klar, dass in der Humanmedizin es nicht immer möglich ist,
zwischen "Prävention" und "Unterdrückung" zu unterscheiden,
da das schließlich
zur Induktion führende
Ereignis oder die Ereignisse unbekannt oder latent sein können oder
sich der Patient dessen nicht sicher ist, bis das Ereignis oder
die Ereignisse aufgetreten sind. Deswegen ist es üblich, den
Ausdruck "Prophylaxe" zur Unterscheidung
von "Behandlung" zu verwenden, wobei
Prophylaxe beides, die "Prävention" und die "Unterdrückung" einschließt, wie
sie hier definiert wurden. Der Ausdruck "Schutz" soll in dem hier verwendeten Sinne
die "Prophy laxe" einschließen.
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Bei
dem erfindungsgemäßen Ausführungsbeispiel,
das gegen eine autoimmune Krankheit gerichtet ist, richtet sich
die Immunantwort des Individuums gegen die speziellen TCR, die jene
T-Zellen markieren, die den Autoimmunprozess vermitteln sowie die
erfindungsgemäßen Peptide,
die somit in der Lage sind, das Binden des MHC/Antigen-Komplexes
(oder des Antigens alleine) zu stören, der zur Initialisierung
oder Ausbreitung der Autoimmunantwort erforderlich ist.
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Im
Allgemeinen repräsentiert
die Peptidsequenz einen Teil des TCR selbst und muss immunogen sein, wie
dies unten definiert ist, entsprechend wenigstens einem Teil der
zweiten Komplementaritäts-bestimmende Region
(CDR2) des TCR αβ Heterodimers.
Im Bereich dieser Erfindung sollen auch Peptide liegen entsprechend
wenigstens einem Teil der zweiten Komplementaritäts-bestimmende Region der TCR-γ- und TCR-δ-Ketten oder
ihre Homologe in dem γδ-Heterodimer (siehe
Strominger, J.L., in Cell 57:895–898 (1989); und Clevers, H,
et al., in Ann. Rev. Immunol. 6:629–662 (1988)).
-
Die
CDR des TCR sind durch Analogie zu der Struktur des Immunglobulinmoleküls definiert,
wobei die CDR die Aminosäuresequenzen
die variablen Regionen der schweren oder der leichten Kette enthalten,
die mit dem Antigen in Berührung
gekommen sind und die entscheidenden Teile der Antigenbindungsstelle
darstellen. Es wird angenommen, dass alle drei TCR-CDR an der Bindung
an ein Antigen oder MHC beteiligt sind (Davis, M.M., et al., Nature
334:395–402
(1988); Claverie, J.M., et al., in Immun. Tody 10:10–14 (1989)).
Indem die Immunantwort des Individuums oder die erfindungsgemäßen Antikörper gegen
den zweiten Komplemen taritäts-bestimmenden
Abschnitt des "Marker-TCR" gerichtet werden,
wird die Wahrscheinlichkeit einer Unterbrechung der erforderlichen
Bindungs- oder Erkennungsereignisse zwischen den autoimmunassoziierten T-Zellen
und dem Autoantigen und/oder MHC erhöht.
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Ein "Fragment" des erfindungsgemäßen Peptids
bedeutet jeden Unterabschnitt des Moleküls, der wiederum ein kürzeres Peptid
ist.
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Eine "Variante" des Peptids bezeichnet
ein Molekül,
das im Wesentlichen entweder dem gesamten Peptid oder dessen Fragment ähnlich ist.
Peptidvarianten können
unmittelbar durch chemische Synthese der Peptidvariante bequem hergestellt
werden, wobei aus dem Stand der Technik wohlbekannte Verfahren verwendet
werden.
-
Alternativ
können
Aminosäuresequenzvarianten
des Peptids durch Mutationen in der DNA hergestellt werden, die
für das
zu synthetisierende Peptid codieren. Solche Varianten enthalten
beispielsweise Auslassungen von Substitionen innerhalb der Aminosäuresequenz,
Einfügungen
oder Ersetzungen. Jede Kombination von Auslassung, Einfügung oder
Substitution kann zu dem endgültigen
Construct führen,
vorausgesetzt, dass das endgültige
Ergebnis die gewünschte
Aktivität
besitzt. Die Mutationen, die in der DNA, die für die Peptidvariante codiert,
müssen
offensichtlich nicht den Leserahmen verändern und erzeugen vorzugsweise
komplementäre
Bereiche, die eine Sekundär-mRNA-Struktur hervorrufen
könnte
(sie EP-A-0 075 444).
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Auf
dem genetischen Niveau werden diese Varianten für gewöhnlich durch stellenbezogene
Mutagenese der Nukleotide in der DNA erzeugt, die für das Peptidmolekül codiert,
wodurch eine DNA produziert wird, die für die Variante codiert, wobei
anschließend
die DNA in einer rekombinanten Zellkultur exprimiert wird. Die Varianten
zeigen üblicherweise
qualitativ dieselbe biologische Aktivität wie das nicht veränderte Peptid.
-
Die
Herstellung der Peptidvariante, wie hier beschrieben, wird bevorzugt
durch eine stellenspezifische Mutagenese der DNA erreicht, die für eine vorher
zubereitete Variante oder eine nicht variierte Version des TCR-Proteins oder Peptids
codiert. Eine stellenspezifische Mutagenese gestattet die Produktion
von Peptidvarianten unter Verwendung spezifischer Oligonukleotidsequenzen,
die für
die DNA-Sequenz der gewünschten
Mutation codieren ebenso wie eine ausreichende Anzahl benachbarter
Nukleotide, um eine Primersequenz ausreichender Größe und eine
Sequenzkomplexität
bereitzustellen, um einen stabilen Duplex zu beiden Seiten der Auslassungsverknüpfung zu
bilden, die zu überbrücken ist.
Die Technik der stellenspezifischen Mutagenese ist aus dem Stand
der Technik hinreichend bekannt, beispielsweise aus Adelman et al.,
DNA 2:183 (1983). Zu den typischen Vektoren, die für die stellenbezogene
Mutagenese brauchbar sind, gehören
Vektoren, wie beispielsweise der M13-Phage, wie dies von Messing
et al., in Third Cleveland Symposium on Macromolecules and Recombinant
DNA, Walton, A., ed., Elsevier, Amsterdam (1981) berichtet wurde.
Dieser Phage ist auf dem Markt leicht zu bekommen und seine Verwendung
ist für
den Fachmann hinlänglich
bekannt. Alternativ können
Plasmidvektoren, die einen einsträngigen Phagen im Replikationsanfang
enthalten (Veira et al., Meth. Enzymol. 153:3 (1987)) verwendet
werden, um eine einsträngige
DNA zu bekommen.
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Im
Allgemeinen wird die stellengerichtete Mutagenese ausgeführt, indem
zunächst
ein einsträngiger Vektor
erhal ten wird, der innerhalb seiner Sequenz eine DNA-Sequenz enthält, die
für das
relevante Peptid codiert. Dann wird ein Oligonukleotid-Primer, der
die gewünschte
mutierte Sequenz trägt,
für gewöhnlich synthetisch
hergestellt, beispielsweise mittels des Verfahrens nach Crea et
al., in Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 75:5765 (1978). Dieser Primer
wird dann an den einsträngigen,
die Proteinsequenz enthaltenden Vektor gebunden und DNA-polymerisierenden
Enzymen ausgesetzt, beispielsweise dem I Klenow-Polymerasefragment aus
E. coli, um die Synthese des die Mutation tragenden Strangs zu vervollständigen.
Auf diese Weise wird eine mutierte Sequenz erhalten und der zweite
Strang trägt
die gewünschte
Mutation. Dieser Heteroduplexvektor wird dann dazu verwendet, geeignete
Zellen zu transformieren und die Klone, die die rekombinanten Vektoren
enthalten, die das mutierte Sequenz-Arrangement tragen, werden selektiert.
Die mutierte Proteinregion wird dann herausgelöst und in einem geeigneten
Vektor zur Proteinproduktion plaziert, im Allgemeinen einem Exprimierungsvektor
in einer Art, wie er zur Transformation eines geeigneten Wirts verwendet
werden kann.
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Zu
einem Beispiel für
eine terminale Einfügung
gehört
eine Fusion einer Signalsequenz, die entweder zu den Wirtszellen
heterolog oder homolog ist, an den N-Terminus des Peptidmoleküls, um die
Sezernierung des reifen Peptidmoleküls aus dem rekombinanten Wirt
zu erleichtern.
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Eine
andere Variante von Gruppen sind jene, bei denen wenigstens ein
Aminosäurerest
in dem Peptidmolekül,
vorzugsweise nur einer, entfernt wurde und ein anderer Baustein
an seine Stelle gesetzt wurde. Solche Ersetzungen werden vorzugsweise
entsprechend der nachstehenden Auflistung durchgeführt, wenn
es erwünscht
wird, die Eigenschaften des Peptidmoleküls zu modulieren.
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-
Wesentliche Änderungen
hinsichtlich der funktionalen oder immunologischen Eigenschaften
werden erreicht, indem Substitutionen ausgewählt werden, die weniger konservativ
sind als jene in der obigen Liste, d.h. indem Bausteine gewählt werden,
die sich deutlicher in ihrer Auswirkung unterscheiden hinsichtlich
(a) der Aufrechterhaltung der Struktur des Peptidrückrats im
Bereich der Substitution, beispielsweise als blattförmige oder
schraubenförmige
Konformation, (b) der Ladung oder der hydrophoben Eigenschaf des
Moleküls
an der Zielstelle oder (c) dem Volumen der Seitenkette. Die Substitutionen,
von denen im Allgemeinen erwartet wird, dass sie dies erbringen,
beinhalten, dass (a) Glyzin und/oder Prolin durch eine andere Aminosäure ersetzt, entfernt
oder eingeführt
wird; (b) dass ein hydrophiler Baustein, beispielsweise Seryl oder
Threonyl für
oder durch einen hydrophoben Baustein ersetzt wird, beispielsweise
Leuzyl, Isoleuzyl, Phenylalanyl, Valyl oder Alanyl; (c) dass ein
Zysteinbaustein für
oder durch einen anderen Baustein ersetzt wird; (d) dass ein Baustein
mit einer elektropositiven Seitenkette, beispielsweise Lysyl, Arginyl
oder Histidyl durch einen Baustein ersetzt wird, der eine elektronegative
Ladung aufweist, beispielsweise Glutamyl oder Aspartyl; oder (e)
dass ein Baustein mit einer voluminösen Seitenkette, beispielsweise
Phenylalanin für
(oder durch) einen Baustein ersetzt wird, der keine derartige Seitenkette
hat, beispielsweise Glyzin.
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Die
meisten Auslassungen, Einfügungen
und insbesondere Ersetzungen rufen erwartungsgemäß keine radikalen Änderungen
in den Eigenschaften der Peptidmoleküle hervor. Wenn es jedoch schwierig
ist, genau die Wirkung der Substitution, Auslassung oder Einfügung vor
der Ausführung
vorherzusagen, weiß der Fachmann
ohne weiteres, dass er die Wirkung durch Routine-Screening-Tests
evaluieren kann. Beispielsweise wird eine Variante üblicherweise
durch eine stellenspezifische Mutagenese der das Molekül codierenden Peptidnukleinsäure beim
Expremieren der Nukleinsäurevariante
in rekombinanten Zellkulturen und optional der gereinigten Gewinnung
aus der Zellkultur, beispielsweise durch Immunoaffinitätsadsorption
an einer Antipeptid-Antikörpersäule erzeugt
(um die Variante durch Bindung an wenigstens ein Epitop zu absorbieren).
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Die
Aktivität
des Zell-Lysats oder der gereinigten Peptidvariante wird sodann
in einem Screening-Test gescreent, der für die gewünschte Eigenschaft geeignet
ist. Beispielsweise wird eine Änderung
der immunologischen Eigenschaft des Peptidmoleküls, beispielsweise das Binden
an einen vorgegebenen Antikörper, durch
Immunotests mit konkurrierendem Charakter gemessen. Änderungen
bei der T-Zell-Erkennung
der Peptidvariante wird durch einen HD-Test in vivo oder einen T-Zell-Proliferationstest
in vitro gemessen. Modifikationen solcher Peptideigenschaften, wie
Redox oder thermische Stabilität,
Hydrophobigkeit, Empfindlichkeit gegenüber proteolytischem Abbau oder
die Neigung, mit Trägern
oder in Multimere zu aggregieren, werden mittels Verfahren untersucht,
die für
den normalen Fachmann bekannt sind.
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Ein "Analogon" eines Peptids bezeichnet
ein nicht natürliches
Molekül,
das entweder dem gesamten Molekül
oder einem Fragment im Wesentlichen ähnlich ist.
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Ein "chemisches Derivat" eines erfindungsgemäßen Peptids
enthält
zusätzliche
chemische Mengen, die normalerweise nicht Bestandteil des Peptids
sind. Covalente Modifikationen des Peptids liegen innerhalb des
Bereichs dieser Erfindung. Solche Modifikationen können in
das Molekül
eingefügt
werden, indem man den Aminosäurerest
des Peptids, auf den gezielt wird, mit einem organischen derivierenden
Wirkstoff reagieren lässt,
der in der Lage ist, mit den ausgewählten Seitenketten oder terminalen
Bausteinen zu reagieren.
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Für gewöhnlich lässt man
Zysteinbausteine mit α-Haloacetaten
(und entsprechenden Aminen), beispielsweise Chloroaceticsäure oder
Chloroacetamin) reagieren, um Carboxymethyl- oder Carboxyamidomethylderivate
zu bekommen. Zysteinreste werden durch Reaktion mit Bromotrifluoroazeton, α-Bromo-β-(5-Imidozoyl)Propionsäure, Chloroacetylphosphat,
N-Alkylmaleimid, 3-Nitro-2-Pyridyldisulfid, Methyl 2-Pyridyldisulfid,
p-Chloromercuribenzoat, 2-Chloromercuri-4-Nitrophenol oder Chloro-7-Nitrobeno-2-Oxa-1,3-Diazol deriviert.
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Histidylbausteine
werden durch Reaktion mit Diehtylprokarbonat bei einem pH-Wert von
5,5–7,0
deriviert, da dieser Wirkstoff für
die Histidylseitenkette verhältnismäßig spezifisch
ist. Parabromophenacylbromid ist ebenfalls brauchbar; diese Reaktion
wird vorzugsweise in 0,1 M Natriumcacodylat bei einem pH-Wert von 6,0
ausgeführt.
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Lysinyl-
und Amino-terminale Bausteine lässt
man mit Succin oder anderen Karboxylsäureanhydriden reagieren. Die
Derivatbildung mit diesen Wirkstoffen führt zu einer Umkehrung der
Ladung der Lysinylbausteine. Andere geeignete Wirkstoffe zur Derivatbildung
bei dem α-Amino
enthaltenden Baustein sind Imidoester, wie Methylpicolinimidate;
Pyridoxalphosphate; Pyridoxal; Chloroborohydrid; Trinitrobenzensulfonsäure; O-Methylissurea;
2,4 Pentanedion; und die Transaminase-katalysierte Reaktion mit
Glyoxylat.
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Die
Arginylbausteine werden durch Reaktion mit einem oder mehreren konventionellen
Wirkstoffen modifiziert, zu denen Phenylglyoxal, 2,3-Butanedion,
1,2-Cyclohexanedion und Ninhydrin gehören. Die Derivatbildung bei
Argininbausteinen erfordert, dass die Reaktion wegen des hohen pKa der Guanidinfunktionsgruppe unter alkalischen
Bedingungen ausgeführt
wird. Ferner können
diese Wirkstoffe mit in Gruppen von Lysin ebenso wie mit der Argininepsilon-Aminogruppe
reagieren.
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Die
spezifische Modifikation der Tyrosylbausteine per se wurde ausführlich untersucht,
wobei besonderes Interesse dem Einfügen von spektralen Labeln in
die Tyrosylbausteine galt, indem man sie mit aromatischen Diazonverbindungen
oder Tetranitromethan reagieren ließ. Für gewöhnlich werden N-Acetylimidizol
und Tetranitromethan verwendet, um O-Acetyltyrosylspezien bzw. 3-Nitroderivate
zu bilden. Tyrosylbausteine werden unter Verwendung von 125I oder 131I iodiert,
um markierte Proteine zur Verwendung in Radioimmuntests zu bekommen,
wobei die Chloramin-T-Methode
geeignet ist.
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Die
Carboxylseitengruppe (Aspartyl oder Glutamyl) werden durch Reaktion
mit Carbodiimiden (R'-N-C-N-R'), beispielsweise
Cyclohexyl-3-(2-Morpholinyl-(4-Ethyl) Carbodiimid oder 1-Ethyl-3-(4
Azon 4,4-Dimethylpentyl) Carbodiimid modifiziert. Ferner werden
Aspartyl- und Glutamylreste in Asparaginyl- und Glutaminylreste
durch Reaktion mit Ammoniumionen konvertiert.
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Glutaminyl-
und Asparaginylbausteine werden häufig zu den entsprechenden
Glutamyl- und Aspartylbausteinen deamidiert. Alternativ werden diese
Rest in den Bereich der Erfindung.
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Die
Derivatbildung mit bifunktionalen Wirkstoffen ist zum Cross-Linken
mit einer wasserunlöslichen Trägermatrix
oder anderen makromolekularen Trägern
zweckmäßig. Zu
den gebräuchlichen
Cross-Linkwirkstoffen gehören
z.B. 1,1-Bis(Diazoacetyl)-2-Phenylethan,
Glutaraldehyd, N-Hydroxysucciinimidester, beispielsweise Ester mit
4-Azidosalicylsäure,
homobifunktionale Imidoester einschließlich Disuccinimidylester wie 3,3'-Dithiobis(Succinimidylproprionat)
und bifunktionale Maleimide wie Bis-N-Maleimido-1,8-Octan. Derivat bildende
Wirkstoffe, wie Methyl-3-[(p-Azidophanyl)
Dithio] Propioimidat führen
zu fotoaktivierbaren Zwischenstufen, die in der Lage sind, unter
Licht Cross-Links zu bilden. Alternativ werden reaktionsfähige wasserunlösliche Matrizen,
wie Cyanogenbromid-aktivierte Karbohydrate und die reaktionsfähigen Substrate,
wie sie in den US-Patenten 3 969 287, 3 691 016, 4 195 128, 4 247
642, 4 229 537 und 4 330 440 beschrieben sind, verwendet, um das
Protein zu immobilisieren.
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Zu
anderen Modifikationen gehören
die Hydroxylierung von Prolin und Lysin, Phosphorilierung von Hydroxylgruppen
von Seryl und Theonylresten, Methylierung der α-Aminogruppen von Lysin-, Arginin-
und Histidinseitenketten (T.E. Creighton, Proteins: Structure and
Molecule Proper ties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79–86 (1983)),
die Acethylierung des N-terminalen Amins und in einigen Fällen die
Amidierung der C-terminalen Carboxylgruppen.
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Solche
derivierten Teile können
die Löslichkeit,
Absorption, biologische Halbwertszeit u.dgl. des Peptids verbessern.
Diese Teile können
alternativ unerwünschte
Nebeneffekte des Peptids u.dgl. eliminieren oder abschwächen. Teile,
die in der Lage sind, solche Wirkungen zu vermitteln, sind beispielsweise
in Remington's Pharmaceutical
Sciences, 16. Ausgabe, Mack Publishing Co., Easton, PA (1980) veröffentlicht.
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Bösartige
Krankheit
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Auf
die erfindungsgemäßen Verfahren
sprechen auch Lymphome und Leukämien
an. Lymphome und viele Leukämien
sind Tumore, die aus Lymphozyten bestehen, die unkontrollierte proliferieren
(beispielsweise bösartig
sind). Da verschiedene Klassen von Leukämie und Lymphom aus T-Zellen
bestehen, die sich von einem einzigen malignen T-Zell-Vorläufer ableiten,
tragen all diese Tumorzellen denselben TCR, der somit als "Tumor-Marker" dient, auf den die
schützende
Zusammensetzung gemäß der Erfindung
ausgerichtet werden kann. In ähnlicher
Weise können
Oberflächenimmunoglobuline
als Tumor-Marker für
B-Zell-Leukämien
oder Lymphome dienen.
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Ein
Ausführungsbeispiel
der Erfindung ist auf die Verbesserung der Antitumorantwort ausgerichtet,
indem auf den TCR jener T-Zellen gezielt wird, die gegen den "Tumor-Marker" reagieren, anstatt
auf den Tumor-Marker selbst. Somit kann eine Immunantwort, die auf
den TCR auf einer tumorspezifischen T-Zelle gerichtet ist, dazu
verwendet werden, die Antitumorantwort zum Vorteil des Wirtes zu
regulieren.
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In
der Tat ist es verständlich,
dass jede Krankheit, bei der eine Zelle mit einem Oberflächenmolekül beteiligt
ist, das die Zelle von anderen Zellen desselben histologischen Typs
und von allen Zellen mit einem anderen histologischen Typ unterscheidet,
einen charakteristischen "Marker" enthält und für die Behandlung durch
Zusammensetzungen empfindlich ist, die eine Immunantwort auf den "Marker" induzieren und dadurch die
Aktivität
der den "Marker" tragenden Zelle
verändert.
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Erfindungsgemäß kann das
Marker-Molekül
selbst verhältnismäßig nicht-immunogen
sein, es muss nur mindestens ein charakteristisches Antigenepitop
tragen. Dieses Epitop kann selbst inhärent immunogen sein oder es
kann durch bekannte Behandlungsverfahren immunogen gemacht werden,
beispielsweise durch Konjugierung mit einem immunogenen Trägermolekül. Somit
ist ein Epitop eines Marker-Proteins, gleichgültig, ob es sich um ein freies
Peptid handelt oder in einer Form, die es immunogen macht, in der
Lage, eine Antikörperantwort,
eine zellvermittelte Immunantwort oder beides hervorzurufen, wie
dies erfindungsgemäß gemeint
ist. Eine Zusammensetzung, der nicht das gesamte Marker-Protein inkorporiert
ist, sondern besser eine spezifische Peptidregion, die immunogen
oder antigen ist, stellt somit eine Präparation dar, die zur Behandlung einer
immunbezogenen Krankheit, die durch diesen Marker charakterisiert
wird.
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Identifikation von Marker-TCR-tragenden
T-Zellen
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Die
vorliegende Erfindung verwendet ein synthetisches Peptid, das wenigstens
einen Teil des zweiten Komplementaritäts-bestimmenden Abschnitts
des TCR darstellt, der bei der Liganden/MHC-Bindung biologische
Bedeutung hat, und das für
eine TCR V-Genfamilie charakteristisch ist. Die Erfindung schafft
somit eine viel einfachere Lösung,
um TCR V-Region-spezifische Antikörper oder T-Zellen zu erhalten.
Indem andere Sequenzen aus derselben β-Kette verwendet werden, um
ein Spektrum von TCR- V-Region-spezifischen Antikörpern oder
T-Zellen zu induzieren, ist der Fachmann in der Lage, freiliegende
Epitope des TCR zu kartieren und die Bedeutung dieser Regionen bei
der Liganden/MHB-Bindung mit den normalen Routinen herauszufinden.
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Marker-TCR,
die mit einer gegebenen Krankheit assoziiert sind, werden unter
Verwendung bekannter Techniken identifiziert. Eine genetische Lösung unter
Verwendung von Patienten, die bekanntermaßen MG oder MS haben, ist von
Oksenberg, J.R., et al., in Proc. Natl. Acad. Sci USA 86:988–992 (1989)
beschrieben worden. Sequenzen der geeigneten TCR-β-Kette wurden
durch genomische Analyse unter Verwendung von Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus
erhalten, der in Familien gefunden wurde, die eine Disposition für die spezielle
Autoimmunkrankheit haben, wie dies von Seboun, E., et al., in Cell
87:1095–1100
(1989) und Burns, F.R., et al., in J. Exp. Med. 169:27–39 (1989))
beschrieben wurde.
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Es
ist somit ersichtlich, dass für
die Zwecke der vorliegenden Erfindung die Bestimmung des Marker-TCR,
der mit der Autoimmunkrankheit assoziiert ist, und die Identifikation
der Peptide, die eine immunogene Sequenz enthalten, nicht erforderlich
ist, dass das Autoantigen charakterisiert wird. Es reicht aus, wenn
(a) an der Autoimmunkrankheit T-Zell-vermittelte Immunantworten
als wesentli cher Teil des pathogenen Prozesses beteiligt sind und
(b) wenn die Krankheit ein Organ-Gewebe- oder zellspezifisches Ziel
hat. Wie dies in der Mikrobiologie bekannt ist (siehe beispielsweise
Theofilopoulos, A., a.a.O.), braucht an der Autoimmunkrankheit auf
der induzierenden Stufe kein Autoantigen beteiligt zu sein, sondern
es kann sich um eine Antwort auf ein exogenes Antigen handeln, beispielsweise
ein bakterielles oder ein virales Antigen, das mit dem Eigenantigen
cross-reaktiv ist oder das zu einer immunopathogenen Antwort führt, die
gegen das exogene Antigen gerichtet ist, das sich in dem Wirt befindet.
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T-Zellen,
die ein Autoantigen oder ein Antigen erkennen, das mit einer Autoimmunkrankheit
assoziiert ist (beispielsweise bestimmte virale oder bakterielle
Antigene), werden geklont und mit einer immortalisierenden Zelle
verschmolzen, beispielsweise einer Longterm-T-Zell-Linie, einer
T-Zell-Lymphom-Linie oder einem T-Zell-Hybridom und sodann lässt man
sie in Kultur wachsen. Die in Kultur gewachsenen Zellen dienen als Quelle
für die
cDNA, die für
den geeigneten TCR codiert. Diese cDNA wird geklont und durch bekannte
Verfahren exprimiert (siehe beispielsweise Maniatis, T., et al.,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (1982)).
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Zusätzlich zu
den vorstehend erwähnten
Lösungen
wird klar, dass aus Tiermodellen Nutzen gezogen werden kann, um
die Loci für
die variable Region des TCR zu identifizieren, die mit der Autoimmunkrankheit assoziiert
sind. Tiere, die für
eine Anzahl von Autoimmunkrankheiten empfänglich sind, zu denen als nicht
beschränkende
Beispiele EAE-experimentelle MG, experimentelle Autoimmunthyroiditis,
adjuvante Arthritis, Collagen-induzierte Arthritis u.dgl. gehören, haben
einen variablen TCR-Locus, der mit der Krankheit assoziiert ist und
in vitro identifiziert werden kann.
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Unter
dem Begriff "Diposition
für eine
Krankheit" soll
ein Zustand verstanden werden, in dem das Tier ein Gen oder Gene
besitzt, die bekanntermaßen
mit der Krankheit assoziiert sind, wodurch das Risiko, dass das
Individuum mit diesem Gen oder Genen die Krankheit entwickelt, erhöht ist,
verglichen mit der Gesamtpopulation. Gene, die bekanntermaßen mit
Autoimmunkrankheiten assoziiert sind, schließen die MHC-Gene (insbesondere
Klasse II), Immunoglobulin V-Gene, TCR-V-Gene u.dgl. ein. Der Ausdruck "disponiert" soll außerdem jene
Individuen mit umfassen, die tatsächlich erkrankt sind. Obwohl
eine vollständige
Korrelation zwischen einer Autoimmunkrankheit und der Verwendung
eines speziellen TCR weder erwartet noch notwendig ist, um die Erfindung
erfolgreich anwenden zu können,
wurden hohe Korrelationen von etwa 60–70% für das Vorhandensein oder das
Exprimieren eines speziellen Gens für eine variable Region und
einer Disposition für die
Autoimmunkrankheit bei Tieren herausgefunden.
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Bei
einem alternativen Ausführungsbeispiel
der Erfindung wurden T-Zellen, die aus Menschen isoliert wurden,
die für
eine Autoimmunkrankheit disponiert sind und insbesondere disponierte
Individuen, die an der Autoimmunkrankheit erkrankt sind, in Kultur
expandiert. Techniken zur T-Zell-Expandierung sind bei Zamvil et al.,
Nature 317:358 (1985) und Nature 324:258–260 (1986) beschrieben.
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Bei
einem Ausführungsbeispiel,
das dieses Verfahren verwendet, werden periphere Blutlymphozyten von
Patienten entnommen und mit dem Autoantigen oder einem spezifischen
Peptid stimuliert, das von diesem abgeleitet oder mit diesem verwandt
ist und das zu einer Stimulation fähig ist, die der des Autoantigens
vergleichbar ist. Das Auto antigen (oder das verwandte Peptid) wird
für mehrere
Tage den Lymphozytenkulturen zugegeben. Bei einem Ausführungsbeispiel
werden die Zellen mit dem Autoantigen 5–6 Tage stimuliert. Bei anderen
Ausführungsbeispielen
werden die Zellen für
eine längere
Zeitspanne stimuliert. Die Zeit, die zur Stimulation erforderlich
ist, ist eine Funktion des Anteils der reaktionsfähigen Zellen
in der Blutprobe, im Aktivierungszustand dieser Zellen und der Potenz
der Stimulierungszubereitung, wobei die Zeit durch den Fachmann leicht
zu bestimmen ist. Nach der Kultivierung unter diesen selektiven
Bedingungen werden 5 × 105 lebensfähige
Zellen isoliert und mit etwa 3 × 107 autologen Antigen präsentierenden Zellen (die, um
ihre Ausbreitung zu verhindern, mit etwa 2500–4500 rad bestrahlt sind) und
etwa 20μg/ml
des Autoantigens (oder des verwandten Peptids) erneut stimuliert.
Etwa 7 Tage später
werden lebensfähige
Zellen gesammelt und durch limitierende Verdünnung in Anwesenheit von etwa
103 – 106 Antigen präsentierenden Zellen, beispielsweise
etwa 5 × 105 Antigen präsentierenden Zellen und menschlichen
IL-2 oder rohem oder gereinigten Kombinationen von Lymphozytenwachstumsfaktoren
(beispielsweise IL-4) geklont. Die Zellen dieser T-Zell-Linien werden
in Gewebekulturflaschen etwa ein bis zwei Wochen expandiert und
wachsen gelassen. Solche Linien können mit den Antigen präsentierenden
Zellen, autoantigenen Zubereitungen und IL-2 mehrfach restimuliert
werden. Die Restimulation kann typischerweise einmal pro Woche ausgeführt werden.
Falls gewünscht,
können
diese T-Zellen durch eine Vielzahl von Verfahren geklont werden,
beispielsweise Begrenzen der Verdünnung oder Heraussortieren
von Zellen aus Kolonien, die auf weichem Agar wachsen, im Allgemeinen
etwa 2 Tage nach der Restimulierung.
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Bei
einem anderen Ausführungsbeispiel
werden Lymphozyten aus einem Organ oder Körperflüssigkeit zunächst in Anwesenheit
von IL-2 kultiviert. Unter diesen Bedingungen tritt eine Selektion
nach Zellen auf, die bereits aktiviert sind und nur solche Zellen
werden wachsen. Anschließend
werden diese T-Zellen mit den Antigen-präsentierenden Zellen und einer
autoantigenen Zubereitung stimuliert. Unter Verwendung dieser Lösung können MBP-spezifische
T-Zellen aus dem
Rückenmark
von Ratten, die an EAE erkrankt sind, selektiv in vitro expandiert
werden.
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Im
Rahmen der vorliegenden Erfindung soll der Begriff "Autoantigene" nicht im Sinne einer
Beschränkung
auf ein definiertes oder bekanntes Makromolekül verstanden werden. Beispielsweise
im Falle des Diabetes vom Typ I ist das spezielle Antigen, das mit
der Pankreas-Inselzelle (oder β-Zelle)
assoziiert ist und das als Auslöser
oder Zielantigen für
die T-Zell-vermittelte Autoimmunantwort dient, unbekannt. Im Sinne
der Erfindung kann das Autoantigen, das dazu verwendet wird, in
vitro die Zellen, wie oben beschrieben, zu stimulieren, von den
vollen Pankreas-Inselzellen,
rohen Membranpräparationen,
die von diesen Zellen abgeleitet sind, teilweise gereinigten Membrankomponenten
oder, falls identifiziert, dem diabetogenen Autoantigen gebildet
sein. Dasselbe gilt für
andere Autoimmunerkrankungen, bei denen das typische Autoantigen
noch nicht identifiziert wurde, einschließlich Hashimoto's Thyroiditis, Arthritis,
bei der das Autoantigen nicht Collagen ist, Sjogrens-Erkrankung,
Polymyositis, Arteriosklerose u.dgl. Für den Fachmann ist klar, dass,
solange wie der immunogene Teil, auf den die T-Zellen reagieren,
in der stimulierenden Zubereitung enthalten ist, die erfindungsgemäßen Verfahren,
wie beschrieben, ausgeführt
werden können.
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Das
Vorhandensein der Autoantigen-spezifischen reaktionsfähigen T-Zellen
in der geklonten, erweiterten T- Zell-Population
kann leicht bestimmt werden, indem die Fähigkeiten der Zellen getestet
wird, in Anwesenheit des Autoantigens aktiviert zu werden. Viele
Tests sind verfügbar
und bekannt, um frühe
oder späte
Ereignisse in dem T-Zell-Aktivierungsprozess
zu messen. Zu den Beispielen für
solche Verfahren gehören
im nicht ausschließenden
Sinne die T-Zell-Proliferation (die durch die Aufnahme von radiomarkiertem
Thymidin gemessen werden kann), die Sezernierung von Interleukin-2,
die intrazelluläre
Calciummobilisierung, die Translokation von speziellen Membranenzymen,
die an dem Inositolphosphatmetabolismus beteiligt sind, und Änderungen
beim Exprimieren von Zelloberflächenmolekülen (die
durch Strömungszytometrie
bestimmt werden können).
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Der
TCR, der durch einen T-Zell-Klon, der auf ein spezielles Autoantigen
reagiert, exprimiert wird, kann unter Verwendung von TCR-spezifischen
Antikörpern
identifiziert werden, die entweder polyklonal, monoklonal oder chimerisch
sind (siehe unten) und die für
ein variables TCR-Segment spezifisch sind, um die Exprimierung an
der Oberfläche
zu erkennen, indem Techniken wie Fluoreszenzmikroskopie, Strömungszytometrie,
Immunozytochemistrie oder andere bekannte Techniken eingesetzt werden.
Derartige Antikörper
wurden für
eine Vielzahl von TCR α-β-Ketten-V-Regionen beschrieben
(siehe beispielsweise Owhashi, M., et al., a.a.O., Gascoigne, N.R.J.,
et al., a.a.O, Kappler, J.W., et al., 1987, 1988 (a.a.O.) oder MacDonald,
H.R., a.a.O.).
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Alternativ
kann die DNA oder die mRNA von T-Zell-Klonen direkt untersucht werden oder
nach Identifizierung durch die Polymerasekettenreaktion (Synha et
al., Science 239:1026 (1988), Saiki et al., Nature 324:163 (1986),
indem sie mit Nukleinsäuresonden
für die
unterschiedlichen TCR-Genfamilien unter Verwendung von bekannten
Hybridisierungsverfahren spezifisch hybridisiert wird. Die TCR-Sequenz oder ein
Teil davon kann sodann unmittelbar aus der amplifizierten, rearrangten
DNA oder mRNA erhalten werden.
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Das
Exprimieren eines speziellen TCR kann außerdem identifiziert werden,
indem die Nukleotidsäuresequenz,
die für
wenigstens einen Teil des TCR codiert, beispielsweise nach dem Klonen
des TCR-V-Gens bestimmt wird, oder indem die Aminosäuresequenz
wenigstens eines Teil des TCR-Proteins bestimmt wird. Es ist klar,
dass die oben erwähnten
Lösungen
oder weitere Lösungen,
die dem Fachmann bekannt sind, dazu führen, den TCR zu identifizieren,
der auf einer T-Zelle oder einem Klon oder einer Linie von Z-Zellen exprimiert wird.
Diese Information wird zur Selektion einer Aminosäuresequenz
benötigt,
die das erfindungsgemäße Peptid
oder eine pharmazeutische Zubereitung enthält.
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Wenn
kein spezifisches Autoantigen identifiziert wurde, kann die Oligoklonität der T-Zellen
in der anatomischen Region, die mit der Krankheit assoziiert ist,
als Basis zum Anreichern der reaktionsfähigen T-Zellen verwendet werden.
Beispielsweise Zellen, die typisch mit rheumatoider Arthritis assoziiert
sind, fanden sich in dem Synovialfluid des Gelenks; Zellen, die
typischerweise MS-assoziiert
sind, wurden in der cerebrospinalen Flüssigkeit (CSF) aufgefunden;
und Krankheits-assoziierte T-Zell-Infiltrate des Thyroidgewebes bei Hashimoto's Thyroiditis und
bei der Graves' Krankheit.
In diesen Fällen
werden die Zellen aus dem relevanten anatomischen Bereich isoliert
und, wie oben beschrieben, werden die Zellen in Kultur expandiert
(siehe auch Londei, M. et al., in Science 228:85–89 (1985), Londei, M. et al.,
in Acta Endocrinol. 115 (suppl. 281):86–89 (1987), Stamenkovic, I.
et al., in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:1179–1183 (1988), Lipoldova, M.
et al., in J. Autoimmun. 2:1–13
(1989), Oksenberg, J.R., et al., a.a.O.). Die DNA oder mRNA dieser
Zellen wird isoliert, die cDNA erzeugt und die Differenzen in den
Sequenzen der cDNA, die für
die variablen TCR-Loci codiert, durch Vergleich von erkrankten mit
nicht erkrankten Individuen bestimmt. Als Alternative zum Expandieren
der Zellen in Kultur kann zelluläre
DNA oder vorzugsweise cDNA, die aus mRNA hergestellt ist, unmittelbar
aus T-Zellen, die
aus dem Individuum isoliert wurden, erhalten und die Nukleoitidsäure durch
PCR-Reaktion, wie oben beschrieben, vermehrt werden.
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Die
Antigene, die mit einer Vielzahl von menschlichen Autoimmunkrankheiten
oder Tiermodellen von Autoimmunkrankheiten assoziiert sind, sind
gegenwärtig
bekannt. Das Typ II-Collagen und das Wärmeschockprotein 65 kD von
Mycobacterium Tuberculosis sind Antigene, die mit rheumatoider Arthritis
assoziiert sind; AChR ist assoziiert mit MG und mit experimenteller
allergener Myasthenia Gravis (EAMG), die in Mäusen induziert werden kann.
Thyroglobulin ist bekanntermaßen
das Antigen, das mit experimenteller allergener Thyroiditis (EAT)
bei Mäusen
assoziiert ist. Bei einer ähnlichen
Erkrankung, Hashimoto's
Thyroiditis, ist eine Immunreaktion auf ein Antigen auf follicularen
Thyroidzellen beteiligt. Bei Graves' Erkrankung ist die Immunantwort auf
den Thyrotropin-Rezeptor von Thyroidzellen gerichtet. Das Myelinbasisprotein
(MBP) und das Proteolipidprotein (PLP) sind bekanntermaßen mit
experimenteller allergener Encephalomyelitis (EAE) bei Mäusen und
Ratten assoziiert. EAE ist ein anerkanntes Modell für multiple
Sklerose bei Menschen.
-
Für den Fachmann
ist es deshalb klar, dass die vor liegende Erfindung auf einen Aspekt
bei der Identifikation von Peptiden zielt, die für die Prävention oder Therapie von menschlichen
und tierischen Erkrankungen brauchbar sind, die die oben erwähnten einschließen, jedoch
nicht auf diese beschränkt
sind.
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Auswahl der
antigenen Peptide
-
Zu
einem wichtigen Ausführungsbeispiel
dieser Erfindung gehört
eine kombinierte Methode zur Identifikation eines TCR, der mit einer
Autoimmunkrankheit assoziiert ist, der Bestimmung, welche Oligopeptidsequenz
einschließlich
eines Teils des zweiten Komplementaritäts-bestimmenden Abschnitts
des TCRs sowohl immunogen und für
die T-Zell-Aktion
in dem Erkrankungsprozess wichtig ist, der Synthetisierung dieses
Peptids und der Verwendung desselben als therapeutischem Wirkstoff.
-
Regionen
der relevanten TCR-Sequenzen werden zur Synthese auf der Basis ihrer
vorhergesagten antigenen oder immunogenen Eigenschaften identifiziert.
Unter dem Begriff "immunogen" soll hier die Fähigkeit
des Peptids verstanden werden, eine Immunantwort zu induzieren,
und zwar entweder eine zellvermittelte, eine Antikörper- oder
beide. Der Begriff "antigen" soll die Fähigkeit
eines Peptids bezeichnen, in freier Form durch Antikörper erkannt
zu werden und in Verbindung mit MHC-Molekülen im Falle von antigenspezifischen T-Zellen.
Regionen eines Proteins oder Peptids, die wahrscheinlich immunogen
oder antigen für
T-Zellen sind, werden
beispielsweise unter Verwendung von Lösungen und Algorithmen identifiziert,
wie sie von Margalit, H. et al. (J. Immunol. 138:2213–2229 (1987)
und Rothbard, J.B. et al. (EMBO J. 7:93–100 (1988)) beschrieben. Die
Margalit- et al.-Lösung
basiert auf der Analyse der antigenen Stellen von immunodominanten
T-Helfer-Zel len, was zur Entwicklung eines Algorithmus führt, der
auf einem amphipathischen Helix-Model basiert, bei dem die antigenen
Stellen vermutlich Schrauben sind mit einem überwiegend polaren und einem überwiegend
apolaren Stirnende. Die Lösungen
von Rothbard et al. erkennen Motive, die ähnlich den Epitopen sind, die
bevorzugt von T-Helfer- oder
T-zytotoxischen-Zellklonen erkannt werden, was die genauen Bereiche
innerhalb der Proteinsequenz genau vorhersagen kann, die in der
Lage sind, durch die MHC-Klasse I- und Klasse II-Moleküle erkannt
zu werden, wobei diese Erkennung vermutlich für die T-Zell-Immunogenität und Antigenität notwendig
ist.
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Die
Bereiche des TCR, die für
die Zwecke der Erfindung hinsichtlich ihrer immunoregulatorischen
Eigenschaft von Bedeutung sind, erfassen wenigstens einen Teil des
zweiten Komplementaritäts-bestimmenden Abschnitts.
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Die
Verwendung der oben genannten Lösung
zur Auswahl der Peptidsequenzen zur Verwendung bei der Behandlung
von EAE bei Ratten zeigt beispielhaft den Erfolg dieser Lösung. Beispielsweise
wurde durch den obigen Algorithmus vorhergesagt, dass ein Peptid
mit 16 Aminosäuren
entsprechend der CDR1 des Marker-TCR für EAE bei Lewis-Ratten das
Vβ8 (25–41) – für die T-Zellen
nicht immunogen ist. In der Tat induziert diese Peptide keine T-Zell-Immunität und schützen die
Lewis-Ratten nicht gegen EAE. Das Peptid Vβ14 (25–41), das dem CDR1 einer anderen
TCR-β-Kette
entspricht, die nicht mit EAE assoziiert ist, war vorhergesagterweise
für T-Zellen
immunogen, und es stellte sich in der Tat heraus, dass es bei Lewis-Ratten
eine T-Zell-Immunität hervorrufen
konnte, jedoch, wie erwartet, nicht gegen EAE schützen konnte.
In ähnlicher
Weise wurde vorhergesagt, dass das CDR2-Peptid Vβ14 (39–59), das einem nicht mit EAE
assoziierten TCR entspricht, immunogen ist, und die Immunität induzieren,
jedoch wiederum nicht gegen EAE schützen konnte. Erfindungsgemäß wurde
vorhergesagt, dass das CDR2 verwandte Peptid Vβ8(39–59) des relevanten TCR sowohl
für EAE
immunogen als auch schützend
ist und in der Tat, erwies sich dies als richtig (siehe die untenstehenden
Beispiele).
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Die
Größe des Peptids,
die zur Verwendung in dieser Erfindung ausgewählt wird, wird weitgehend durch
das Erfordernis der Immunogenität
bestimmt, während
die minimale Epitop-Struktur aufrecht erhalten bleibt, so dass eine
T-Zelle oder ein Antikörper,
der für
das Peptid spezifisch ist, den TCR auf einer intakten T-Zelle erkennen
und mit ihm reagieren kann. Beispielsweise bewegt sich die Größe der erfindungsgemäßen Peptide
im Bereich von etwa 15–30
Aminosäuren,
damit sie ausreichend immunogen sind und eine hohe Wahrscheinlichkeit
aufweisen, die relevanten Epitope des TCR zu tragen, die zu einer
Modulation der T-Zell-Aktivität
führen
kann, obwohl Peptid-Fragmente
mit anderer Länge
in Betracht gezogen werden. Die erfolgreiche Verwendung eines 21
Aminosäure-langen
TCR-Peptids, das auf der TCR-β-Kette
präsent
ist, die mit EAE in Ratten assoziiert ist, um EAE in erfindungsgemäßen Verfahren
zu behandeln, ist ausführlich
in den nachfolgenden Beispielen demonstriert.
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Die
Immunogenität
von Peptiden, die für
die Erfindung brauchbar sind, kann nach wohlbekannten Verfahren
gescreent werden, beispielsweise die Verwendung einer DH-Antwort in einem
Tier. Für
eine solche Antwort wird ein Tier durch Injektion einer geeigneten
Dosis eines Antigens, typischerweise subkutan (s.c.), häufig mit
einem Adjuvant, beispielsweise einem vollständigen Freund'schen Adjuvant (CFA), "sensibilisiert". 5–15 Tage
später
wird die Antwort "provoziert", indem das Tier
typischerweise intradermal (i.d.) mit einer geeigneten Dosis des
Antigens, typischerweise in physiologischer Salzlösung oder
einem anderen Puffer, abgefragt wird. Die Antwort wird 24-48 Stunden später geprüft. Nicht
beschränkende
Beispiele für
Testmethoden zum Messen des DH erfassen die Größe des Erythems (Rötung) und
die Verhärtung
(Schwellung) an der Stelle der Injektion des Antigens, die Schwellung
des Ohrs, die Schwellung der Fußballen,
die Schwellung des Schwanzes, die Akkumulation von systemisch injizierten 125I-markierten Iododeoxyuridin an der Impfstelle,
die Akkumulation von intravenös
(i.v.) injiziertem Proteinserum, beispielsweise Albumin, an der
Belastungsstelle und die Akkumulation von i.v. injizierten markierten
und eine Entzündung
hervorrufenden Zellen, wie Lymphozyten oder Neutrophilen an der
Impfstelle. Nach einer i.d. Abfrage in der Ohrmuschel von ca. 0,15–0,25 mm,
vorzugsweise etwa 0,2 mm (bei einer Lewis-Ratte) zeigt z.B. eine
Antwort in Gestalt einer Ohrschwellung eine positive DH-Antwort
an. Der Fachmann sieht, dass Veränderungen
in der Peptidgröße, der
Dosierung, dem Weg der Sensibilisierung oder der Abfrage von DH,
dem verwendeten Carriers, des verwendeten Adjuvants etc. dem zeitlichen
Verlauf und dem Ausmaß der
DH-Antwort beeinflussen.
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Bei
einem Peptid, das angenommenermaßen immunogen ist, wie dies
hier beabsichtigt ist, sollte eine Dosis von etwa 10–200μg pro Tier
und vorzugsweise etwa 25–100μg Peptid
pro Tier in der Lage sein, ein Tier für eine DH-Antwort zu sensibilisieren. Ferner ist
bei einem sensibilisierten Tier eine Dosis von etwa 1–100μg, vorzugsweise
etwa 5–50μg des Peptids
in der Lage, bei der i.d. Abfrage eine DH-Antwort auszulösen.
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Synthese von Peptiden und
Versuch
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Die
gewünschten
Peptide mit den Sequenzen, die, wie oben beschrieben, bestimmt sind,
werden unter Verwendung von Standardsynthesetechniken präpariert
einschließlich
sequentieller Aminosäurekonjugation
in der Lösung
oder in der festen Phase und der Rekombinatenproduktion in prokariontischen
oder eukariontischen Wirten. Die Verifikation, dass das zubereitete
Peptid immunogen ist, kann leicht unter Verwendung einer DH-Reaktion
in einem Tier (beispielsweise Maus oder Ratte), wie oben beschrieben,
erfolgen. Das Peptid wird subkutan verabreicht und das Tier etwa
9–14 Tage
später
i.d. in der Ohrmuschel abgefragt. Nach dem Abrufen wird die Antwort
in Gestalt der Ohrschwellung 24 oder 48 Stunden später gemessen
und dient als einfaches und verlässliches
Maß für das Vorliegen
einer T-Zell-vermittelten Immunität gegen das Peptid.
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Die
Verifikation der Fähigkeit
des immunogenen Peptids, um tatsächlich
die Autoimmunität
zu modulieren, kann dadurch erhalten werden, dass ein geeignetes
Tiermodell verwendet wird, wobei die Speziesunterschiede in den
TCR-verwandten Peptiden
berücksichtigt
werden. Obwohl z.B. es bevorzugt wird, eine Sequenz zu verwenden,
die dem CDR2 eines menschlichen TCR-Markers bei der Behandlung von
Menschen entspricht, wird bei der tierischen Erkrankung die entsprechende
Region des TCR-Markers für
die Tiermodellkrankheit verwendet.
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Tiermodellsysteme,
die zum Screenen der Wirksamkeit der Peptide beim Schutz gegen oder
der Behandlung der Krankheit verwendet werden können, sind, wie oben diskutiert,
verfügbar.
Natürlich
können
die identischen Peptide bei Menschen nicht wirksam sein, da sie
nicht mit einer geeigneten Stelle auf dem Krankheit assoziierten
menschlichen TCR korrespondieren oder sie können bei Menschen nicht ausreichend
immunogen wirken. Es ist klar, dass Modifikationen der Peptidsequenz,
die für
ein spezielles Tiermodell abgeleitet ist, erforderlich sind, um
andere Individuen, die zu anderen Spezien gehören, einschließlich den
Menschen zu behandeln. Die Verifikation, dass z.B. eine spezielle
CDR2 assoziierte Peptidsequenz beim Schutz gegen eine spezielle
Krankheit wirksam ist, kann somit mit Hilfe dieser Modelle erhalten
werden, die zu Vorhersagen führen,
dass die entsprechende Humansequenz ein bevorzugter Kandidat als
wirksames therapeutisches Peptid für Menschen darstellt. Die Bestimmung
der entsprechenden TCR-Sequenz
bei Menschen (oder anderen nichtmenschlichen Spezien) unter Verwendung
der oben beschriebenen Lösungsansätze gestattet
somit die Modifikation des Peptids zur Verwendung beim Menschen
(oder anderen Spezies).
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Nachstehend
ist eine nicht abschließende
Liste von Tierkrankheitsmodellen für menschliche Autoimmunkrankheiten
angegeben, bei denen ein TCR-Peptid hinsichtlich seiner Fähigkeit
eingeschätzt
werden kann, die Krankheit zu modifizieren und Antikörper sowie
T-Zellen zu induzieren, die in der Lage sind, bei der Übertragung
die Krankheit zu modifizieren. Systemischer erythematoser Lupus
(SLE) wird in dafür
empfindlichen Mäusen
getestet, wie dies von Knight et al., in J. Exp. Med. 147:1653 (1978)
und Reinertsen et al., in N. Eng.J. Med. 229:515 (1978) beschrieben
ist. MG wird in SJL/J-Mäuseweibchen
getestet, indem die Krankheit mit einem löslichen AChR-Protein von anderen
Spezies induziert wird, wie dies von Lindstrom, J., et al., in Adv. Immunol.
42:233–284
(1988) beschrieben ist. Arthritis wird in einem dafür empfindlichen
Mäusestamm
durch Injektion des Typ II-Collagens induziert, wie dies von Stuart,
J.M., et al., in Ann. Rev. Immunol. 2:199–218 (1984) beschrieben ist.
Adjuvante Arthritis wird durch Injektion des mikrobakteriellen Wärmeschockproteins
in dafür
empfindlichen Ratten induziert, wie dies Van Eden, W., et al., in
Nature 331:171–173
(1988) beschrieben hat. Thyroiditis wird durch Verabreichung von
Thyroglubolin in Mäusen
induziert, was Maron, R., et al., in J. Exp. Med. 152:1115–1120 (1980)
beschrieben hat. Insulinabhängiger
Diabetes mellitus (IDDM) tritt natürlich auf oder kann in bestimmten
Mäusestämmen, wie
in jenen, die durch Kanasawa et al., in Diabetologia 27:113 (1984)
beschrieben sind, induziert werden. Andere Mäusestämme können veranlasst werden, diese
Krankheit zu zeigen, indem Lymphozyten von diesem Stamm übertragen
werden.
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EAE
in Mäusen
und Ratten dient als Modell für
MS bei Menschen. In diesem Modell wird die demyelinierende Krankheit
durch Verabreichung des Myelinbasisproteins (MBP) oder des Proteolipidproteins
(PLP) oder den Theilers Virus induziert, wie dies durch Paterson,
P.Y. in Textbook of Immunopatholpgy (Mischer et al., eds.), Grunde
und Stratton Stratton, New York, pp. 179–213 (1986), McFarlin, D.E.,
et al., in Science 179:478–480
(1973) und Satoh, J., et al., in J.. Immunol. 138:179–184 (1987)
beschrieben ist.
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Zum
Messen der präventiven,
suppressiven und therapeutischen Wirkung der erfindungsgemäßen Zusammenstellung
beim Menschen werden bestimmte klinische Messergebnisse verwendet.
Beispielsweise gehören
bei MS zu den quantitativen Parametern: (a) die klinische Störung, (b)
die Untersuchung der Geschwindigkeit, mit der die Verschlimmerung
eintritt und (c) die Plaquebelastung des Gehirns mittels Kernspinresonanzdarstellung
(MRI) (wobei die Belastung ein wesentlicher neuer Parameter ist,
der zur Bewertung von MS-Patienten verwendet wird). Zu diesen Messungen
gehören
auch getrennte Blind- und Nichtblinduntersuchungen durch den behandelnden
Arzt. Neurophysiologische Messungen der kognitiven Störung werden
als eine unabhängige
Bestimmungsgröße für die Beeinträchtigung verwendet.
Die klinische Beeinträchtigung
wird üblicherweise
nach der McAlpine-Skala, dem Kurtzke-Punktesystem oder einer Modifikation
des Kurtzke-Punktesystems, dem Expanded Disability Status Score
(EDSS), bewertet. Eine Verbesserung von einer halben Einheit in
dem EDSS (Bereich von 1–9)
wird als signifikant angesehen. Ein klinischer Wert, nämlich die Fähigkeit
des Patienten zu gehen, wird durch den Ambulationindex bewertet,
wobei eine Verbesserung um eine oder mehr Einheiten als signifikant
angesehen wird. Diese klinischen Messwerte sind in der Medizin hinreichend
bekannt und im Einzelnen von Mc Alpine, D., et al., in Multiple
Sclerosis, Livingston Press, Edinburgh (1955), Binken, P.J. et al.,
in Handbook of Clinical Neurology, Volume 9, Amsterdam-North Holland
Publishers, Amsterdam (1970) und Field, E.J. et al., in Multiple
Sclerosis: A. Critical Review, M.M.T. P Press, Ltd., Lancaster,
England, (1977) beschrieben.
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Das
Maß der
Verbesserung bei RA z.B. basiert auf einer Anzahl von primären klinischen
Eckwerten einschließlich
der Auflösung
und Verminderung von Schwellungen, der Verminderung der Dauer der
morgendlichen Steifheit, der Abnahme der Erythrozytensedimentationsrate
und/oder des C-reaktionsfähigen
Proteins, der Auflösung
von rheumatoid-assoziierten Zuständen,
wie rheumatoiden Knoten und einer Verminderung der Lymphozytenzahl.
Zu den sekundären
Eckwerten gehört
eine Verminderung der Müdigkeit
und eine Verbesserung der Gesamtkondition, wie sie durch den Patienten
und den Arzt festgestellt wird. Die klinischen Ergebnisse werden
wie folgt aufgeteilt: (a) vollständige
Antwort – die
Abnahme der Gelenkschwellung, die Schwächung und die morgendliche
Steifheit haben um mehr als 90% abgenommen; (b) bemerkenswerte Antwort – die Schwellung
der Gelenke, die Schwachheit und die morgendliche Steifheit haben
um 50–90%
abgenommen; (c) mäßige Reaktion – die Gelenkschwellung,
die Schwachheit und die morgendliche Steifheit haben um 30–50% abgenommen
und (d) keine Reaktion – die
Gelenkschwellung, die Schwachheit und die morgendliche Steifheit
haben um weniger als 30% abgenommen.
-
Ähnliche
Messungen, die eine Evaluierung der präventiven, suppressiven und
Behandlungswirkungen der Peptide, Antikörper und T-Zellen und anderer
Zusammensetzungen gemäß der Erfindung
bei weiteren immunbezogenen Krankheiten gestatten, sind dem Fachmann
bekannt.
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Passive Immunität
-
Zusätzlich zu
der Verwendung eines TCR-Peptids zur aktiven Immunisierung gehören zu weiteren
erfindungsgemäßen Ausführungsbeispielen
Antikörper,
die für
das TCR-Peptid spezifisch sind, um eine Anti-TCR-Immunität passiv
zu übertragen.
Passive Antikörper
vermittelte Immunität
involviert einen der Vielzahl der Effektormechanismen, so z.B. antikörperabhängig zelluläre Cytotoxizität oder komplementabhängige Cytotoxizität. Alternativ
kann der ver wendete Antikörper
einen toxischen Wirkstoff in einer spezifischen Weise, beispielsweise
eine Ricin-A-Kette übermitteln.
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Zur
passiven Schutzimpfung wird einem betroffenen Tier ein geeignetes
Peptid, wie unten beschrieben, injiziert und die peripheren Blutlymphozyten
oder Lymphozyten aus anderen Organen, beispielsweise aus einem Lymphknoten,
werden geerntet. Die B-Zellen können
aus der ursprünglichen
Zellpopulation herausgesucht werden, die aus dem TCR-Peptid-immunisierten
Tier entnommen wurden und durch Fusion mit T-Zell-Linienfusionspartnern
immortalisiert werden, wobei Standardtechniken zum Herstellen der
Hybri dome zur Produktion von monoklonalen Antikörpern verwendet werden, die
für das
TCR-Peptid spezifisch sind. Hybridome, die geeignete Antikörper produzieren,
werden durch gebräuchliche
Immunoessays, beispielsweise dem direkten ELISA-Essay, hinsichtlich
ihrer Reaktionsfähigkeit
mit dem TCR-Peptid-Antigen oder mit den relevanten T-Zellen gescreent.
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Monoklonale
Antikörper
(mAb) gegen spezielle Antigene, beispielsweise TCR-Peptide gemäß der Erfindung,
können
durch für
den Fachmann bekannte Verfahren gewonnen werden. Sie z.B. Kohler
und Milstein in Nature 256:495–497
(1975) und das US-Patent 4 376 110. Diese Antikörper können zu einer der Immunglobulinklassen
einschließlich
der Klasse der IgG, der IgM, der IgE, der IgA, der IgD und beliebigen
Unterklassen gehören.
Alternativ können
die Antikörper
aus polyklonalen Antiseren hergestellt werden, die aus Tieren entnommen
werden, die mit dem TCR-Peptid immunisiert und die verschiedenen
bekannten Reinigungsschemata unterzogen sind und direkt zur passiven Übertragung
der Anti-TCR-Immunität verwendet
werden.
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Monoklonale
Antikörper
mit Nagetierursprung werden "humanisiert", indem ein cDNA-Molekül, das für die V-Region des mAb codiert,
an eine DNA gekoppelt wird, die für die konstante humane Region
codiert, wobei eine der vielen Lösungen
verwendet werden kann, wie sie von Cabilly et al., in dem US-Patent
4 816 567 (3/28/89) und der europäischen Patent-Veröffentlichung
EP-125 023 /11/14/84), Taniguchi et al., in der europäischen Patent-Veröffentlichung
EP-171 496 (2/19/86), Morrison et al., in der europäischen Patent-Veröffentlichung
EP 173 494 (3/5/86), Neuberger
et al., in der PCT-Veröffentlichung
WO 86 01 533 (3/13/86), Kudo et al., in der europäischen Patentveröffentlichung
EP-184 187 (6/11/86), Robinson et al., der PCT-Veröffentlichung
WO 87 02 671 (5/7/87), Cabilly et al., in Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 81:3273–3277
(1984), MOrrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851–6855 (1984),
Boulianne et al., Nature 312:643–646 (1984), Morrison, Science,
229:1202–1207
(1985), Neuberger et al., Nature 314:268–270 (1985), Takeda et al.,
Nature 314:452-454
(1985), Tan et al., J. Immunol. 135:3564–3567 (1985), Jones et al.,
Nature 321:522–525
(1986), Oi et al., Bio-Techniques
4:214 (1986), Sahagan et al., J. Immunol. 137:1066–1074 (1986),
Sun et al., Hybridoma 5 (Supp. 1):S17–S19 (1986), Sun et al., proc.
Natl. Acad. Sci. USA 84:214–218
(1987), Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439–3443 (1987),
Liu et al., J. Immunol. 139:3521–3526 (1987), Better, M., et
al., Science 240:1041–1043
(20. May 1988) und Horwitz, A. H., et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 85:8676–8682 (1988))
beschrieben sind.
-
Das
bevorzugte Verfahren zur Herstellung chimerer Antikörper kombiniert
fünf Elemente:
(1) Isolation der Messenger RNA (mRNA) aus einer B-Zell-Hybridomlinie
von Mäusen,
die den monoklonalen Antikörper produziert,
Klonen und Produzieren der cDNA hieraus; (2) Herstellung einer cDNA-Bibliothek
für die
volle Länge
aus der gereinigten mRNA, aus der die geeigneten Gensegmente für die variable
(V-)Region in den Genen für
die leichte (L) und die schwere (H)-Kette (i) durch geeignete Sonden
identifizieret werden können,
(ii) sequenziert werden können
und (iii) mit einem Gensegment für
die konstante C-Region kompatibel gemacht werden können, (3)
Herstellung der Gensegmentmodule der C-Region durch Herstellung
einer cDNA und Klonen; (4) Konstruktion der kompletten H- oder L-Ketten-Codierungssequenzen
durch Verbinden der geklonten Gensegmente, die für die Immunoglobulin-V-Region
spezifisch ist, wie in (2) oben beschrieben, an geklonte Gensegmentmodule
der menschlichen C-Region, wie unter (3) beschrieben; und (5) Expremieren
und Produzieren von chimeren L- und H-Ketten in ausgewählten Wirten,
zu denen prokariontische und eukariontische Zellen gehören.
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Zum
Exprimieren der geklonten Gene für
die H- und L-Ketten
von Säugetierzellen
sind viele Vektorsysteme verfügbar
(siehe Glover, D.M. ed., DNA Cloning, Vol. II, pp 143–238, IRL
Press, 1985). Andere Lösungen
können
nachgearbeitet werden, um komplette H2L2-Antikörper
zu erhalten. Es ist möglich,
in derselben Zelle H- und L-Ketten zu koexprimieren, um eine intrazelluläre Assoziation
und Kopplung der H- und L-Ketten zu vollständigen tetramären H2L2-Antikörpern zu
erreichen. Das koexprimieren kann unter Verwendung entweder derselben
oder unterschiedlicher Plasmide in demselben Wirt erfolgen. Gene
sowohl für
die H- als auch für
die L-Ketten können
in demselben Plasmid plaziert werden, das dann in die Zellen transfiziert
wird, wodurch unmittelbar nach Zellen selektiert wird, die beide
Ketten exprimieren können.
Alternativ können
Zellen zunächst
mit einem Plasmid, das für
eine Kette codiert, beispielsweise die L-Kette, transfiziert werden
und anschließend
kann die resultierende Zell-Linie mit einem H-Ketten-Plasmid transfiziert werden,
das einen zweiten auswählbaren
Marker enthält.
Zell-Linien, die die H2L2-Moleküle über eine
der Routen reproduzieren, können mit
Plasmiden transfiziert werden, die für zusätzliche Kopien der H-, L- oder
H- plus L-Ketten codieren, in Verbindung mit zusätzlichen auswählbaren
Markern, um Zell-Linien mit verbesserten Eigenschaften zu generieren,
beispielsweise einer größeren Produktion
von assemblierten H2L2-Antikörpermolekülen oder
einer verbesserten Stabilität
der transfizierten Zell-Linien.
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Die
chimeren Antikörper
gemäß der Erfindung
tragen sowohl die TCR-Erkennungsspezifität des Mäuse-mAb als auch die biologischen
Eigenschaften der menschlichen Antikörper, zu denen die Widerstandsfähigkeit
gegen Beseitigung im Menschen und eine weit geringere Immunogenizität gehören (was
die Behandlungen gestattet).
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Die
Anti-TCR-Peptidantikörper
(polyklonal, monoklonal und chimerisch) gemäß der Erfindung können therapeutisch
als Immunokonjugate verwendet werden (siehe Überblick von: Dillman, R.O.,
in Ann. Int. Med. 111:592–603
(1989)). Sie können
an zytotoxische Proteine angekoppelt werden, zu denen inhibierende
Ribosom-Proteine wie Ricin-A, Pseudomonas Toxin und Diphteria Toxin
sowie andere Proteine als Tumornekrosefaktor gehören. Mit Antikörpern oder
anderen Liganden konjugierte Toxine sind bekannt (siehe z.B. Olsnes,
S. et al., Immunol. Today 10:291–295 (1989)). Ein zusätzliches
Beispiel für
solch einen konjugierten Antikörper ist
der XomaZymeR–CD5
Plus, der ein Anti-CD5 mAb ist, der mit einer Ricin-A-Kette konjugiert
ist. Diese Zubereitung ist bei der Prophylaxe und Therapie von Graftversus-Host-Krankheit
oder der refraktorischen rheumatoiden Arthritis beim Menschen wirksam.
Dieser spezielle, toxinkonjugierte Antikörper ist für die meisten T-Lymphozyten
und einen Subset von B-Lymphozyten spezifisch. Zellen, die den CD5-Marker
tragen, fallen in Abhängigkeit
von der Behandlung sehr schnell ab. Da der Antikörper gegen ein TCR-Peptid mit
einem viel kleineren Anteil sämtlicher
Lmphozyten reagiert, wird von den Patienten eine höhere Dosis
des Anti-TCR-Antikörpers,
der mit Ricin-A
konjugiert ist, toleriert oder umgekehrt, es ist bereits eine geringere
Dosis wirksam. Effektive Dosen des mit Ricin-A konjugierten monoklonalen
Antikörpers
gegen das TCR-Peptid, liegen im Bereich von etwa 0,005 bis 0,5 mg/kg/Tag,
wobei die bevorzugte Dosis im Bereich zwischen etwa 0,05 bis 0,2 mg/kg/Tag
liegt.
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Der
erfindungsgemäße Anti-TCR-Peptid-Antikörper kann
mit weiteren Typen therapeutischer Komponenten konjugiert werden,
zu denen als nichtbeschränkende
Aufzählung
Radionuklide und zytotoxische Medikamente gehören, um Individuen mit Autoimmunkrankheiten
oder bösartigen
Krankheiten oder lymphoproliferativen Krankheiten zu behandeln.
Nichtbeschränkende
Beispiele für
Radionuklide, die an die Antikörper
gekoppelt werden und in vivo an die Antigenstellen befördert werden
können,
sind 212Bi, 131I, 186Re und 90Y. Diese Radionukleide
erbringen ihre zytotoxische Wirkung, indem die Zellen lokal bestrahlt
werden, was zu verschiedenen intrazellulären Beschädigungen führt, wie dies auf dem Gebiet
der Radiotherapie hinlänglich
bekannt ist.
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Zytotoxische
Medikamente, die mit den Antikörpern
konjugiert werden und anschließend
zur in vivo-Therapie verwendet werden können, sind ohne Anspruch auf
Vollständigkeit
Daunorubicin, Doxorubicin, Methotrexat und Mitomycin C. Zytotoxische
Medikamente stören
kritische zelluläre
Prozesse einschließlich
der DNA, RNA und Proteinsynthese. Hinsichtlich einer vollständigeren
Darstellung dieser Klassen von Medikamenten, die in der Medizin
bekannt sind und ihrer Mechanismen siehe Goodman, A.G., et al.,
in Goodman and Gilman's
The Pharmocological Basis of Therapeutics, 7. Ed., MacMillan Publishing
Co., (1985).
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Die
Behandlung eines Individuums unter Verwendung der erfindungsgemäßen Antikörper, Fragmente oder
Derivate sieht die parenterale Verabreichung einer einzigen oder
mehrerer Dosen des Antikörpers,
der Fragmente oder der Derivate hiervon vor. Die effektive Dosis
ist eine Funktion des individuellen Antikörpers, des Vorhandenseins und
der Natur eines damit konjugierten therapeutischen Wirkstoffes,
des Individuums und seines klinischen Zustands und kann zwischen
etwa 10 mg/kg Körpergewicht
bis etwa 100 mg/kg Körpergewicht
variieren. Die Verabreichung kann i.v., SC, intramuskulär, intrapulmonar,
intraperitoneal (i.p.), intranasal, intrathecal, intradermal, transdermal
oder auf andere Wege erfolgen.
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Formulierung
der Peptide
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Die
präklinische
und klinische therapeutische Verwendung der Erfindung bei der Behandlung
von Krankheiten oder Störungen
wird am besten durch den Fachmann durchgeführt, wobei die akzeptierten
Prinzipien der Diagnose und Behandlungen eingesetzt werden. Diese
Prinzipien sind bekannt und beispielsweise von Braunwald, E. et
al., eds., in Harrison's
Principles of Internal Medicine, 11. Ed., McGraw Hill, Verleger,
New Nork, N.Y. (1987) dargelegt.
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Die
erfindungsgemäßen Peptide
und Zusammensetzungen bzw. ihre funktionalen Derivate sind zur Herstellung
pharmazeutischer Zusammensetzungen gut geeignet. Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen
können
jedem Tier verabreicht werden, das in den Genuss der vorteilhaften
Wirkungen der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
kommen soll. Diese Tiere sind in erster Linie die Menschen, obwohl
die Erfindung nicht hierauf beschränkt sein soll.
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Die
erfindungsgemäßen pharmazeutischen
Zusammenstellungen können
durch jedes Mittel, mit dem der beabsichtigte Zweck erreicht wird,
verabreicht werden. Beispielsweise kann die Darreichung parenteral, subkutan,
intravenös,
intradermal, intramuskulär,
intraperitoneal, transdermal oder über Schleimhautwege erfolgen.
Alternativ oder konkurrierend kann die Verabreichung über orale
Wege erfol gen. Die Peptide und pharmazeutischen Zusammensetzungen
können
parenteral durch Bolusinjektion oder zeitlich gestreckte, allmähliche Perfusion
verabreicht werden.
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Die
verabreichte Dosierung hängt
von dem Alter, dem Geschlecht, der Gesundheit und dem Gewicht des
Empfängers,
der Art der konkurrierenden Behandlung und, falls geschehen, der
Häufigkeit
der Behandlung sowie der Natur der gewünschten Wirkung ab.
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Die
Dosierungsbereiche bei der Verabreichung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
sind groß genug,
um den gewünschten
Effekt hervorzurufen, durch den beispielsweise eine Immunantwort
auf das Peptid, gemessen als DH- oder
Antikörperproduktion
erreicht wird, und um die immunbezogene Krankheit deutlich zu verhindern,
zu unterdrücken
oder zu behandeln. Die Dosis sollte nicht so groß sein, dass ungünstige Nebeneffekte,
wie unerwünschte
Crossreaktionen oder eine allgemeine Immunosuppression oder anaphylaktische
Reaktionen u.dgl. auftreten.
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Bevorzugte
Dosen bei Menschen rangieren etwa zwischen 0,001 – 25 mg/kg
Körpergewicht.
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Zusätzlich zu
den erfindungsgemäßen Peptiden,
die selbst bereits pharmakologisch wirksam sind, können pharmazeutische
Zusammensetzungen geeignete pharmazeutisch verträgliche Carrier enthalten, zu denen
Exzipienten und Hilfsstoffe gehören,
die das Prozessieren der aktiven Verbindungen in Zubereitungen, die
pharmazeutisch verwendet werden können, erleichtern. Zu den bevorzugten
Zusammensetzungen gehören
der Einschluss eines Adjuvants, beispielsweise Alums, oder anderer
bekannter Adjuvantien (siehe z.B. Warren, H.S. et al., Ann. Rev.
Immunol. 4:369-388
(1986), Chedid, L., Feder. Proc. 45:2531–2560 (1986)).
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Um
das Abliefern oder die Bioaktivität zu verbessern, können die
Peptide unter Verwendung von bekannten Verfahren und Verbindungen
in Liposomen inkorporiert sein.
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Zubereitungen,
die oral in Form von Tabletten oder Kapseln verabreicht werden können, Zubereitungen,
die rektal, beispielsweise als Suppositoren verabreicht werden können und
Zubereitungen in Form von Lösungen
zum Injizieren oder zur oralen Zufuhr enthalten zwischen etwa 0,001
bis etwa 99 Prozent, vorzugsweise von etwa 0,01 bis etwa 95 Prozent
der aktiven Verbindung(en) zusammen mit dem Exzipienten.
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Geeignete
Exzipienten sind insbesondere Füller,
wie Saccharide, beispielsweise Lactose oder Sucrose, Mannitol oder
Sorbitol, Zellulosezubereitungen und/oder Kalziumphosphate, z.B.
Trikalziumphosphat oder Kalziumhydrogenphosphat, ebenso wie Binder,
wie Stärke,
Paste, z.B. Maisstärke,
Weizenstärke,
Reisstärke, Kartoffelstärke, Gelatine,
Tragacanth, Methylzellulose, Hydroxypropylmethylzellulose, Natriumcarboxymethylzellulose
und/oder Polyvinylpyrrolidon.
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Andere
pharmazeutische Zubereitungen, die oral verwendet werden können, sind "Push-Fit"-Kapseln aus Gelatine
sowie weiche verschlossene Kapseln aus Gelatine und einem Plastifizierer,
wie Glyzerol oder Sorbitol. Die "Push-Fit"-Kapseln können die
aktiven Zusammensetzungen in Form von Granulat, das mit Füllern wie
Lactose, Bindern wie Stärke
und/oder Schmiermittel gemischt sind, wie Talkum oder Magnesiumstearat
und, optional, Stabilisierern gemischt sein können, enthalten. In Weichkapseln
sind die aktiven Verbindungen vorzugsweise in geeigneten Flüssigkeiten,
wie fettigen Ölen
oder flüssigem
Paraffin, gelöst
oder suspendiert. Zusätzlich
können
Stabilisierer hin zugegeben sein.
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Zu
den möglichen
pharmazeutischen Zubereitungen, die rektal verwendet werden können, gehören z.B.
Suppositorien, die aus einer Kombination aus einer oder mehreren
der aktiven Verbindungen mit einer Suppositorienbasis bestehen.
Geeignete Suppositoriengrundstoffe sind beispielsweise natürliche oder
synthetische Triglyceride oder Paraffinhydrokarbone. Zusätzlich ist
es ferner möglich,
Gelatine-Rektalkapseln zu verwenden, die aus einer Kombination der
aktiven Wirkstoffe mit einem Grundstoff bestehen. Zu den möglichen Grundstoffmaterialien
gehören
z.B. flüssige
Triglyceride, Polyethylenglykole oder Paraffinhydrokarbone.
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Geeignete
Formulierungen zur parenteralen Verabreichung sind wässrige Lösungen der
Peptide in wasserlöslicher
Form, beispielsweise wasserlöslichen
Salzen. Zusätzlich
können
Suspensionen der Peptide als geeignete ölige Suspensionsinjektionen
verabreicht werden. Geeignete lipophile Lösungsmittel oder Vehikel sind
fettige Öle,
beispielsweise Sesamöl
oder synthetische Fettsäurester,
beispielsweise Ethyloleat oder Triglyceride. Wässrige Injektionssuspensionen
können
Substanzen enthalten, die die Viskosität der Suspension erhöhen und
sind beispielsweise Natriumkarboxylmethylzellulose, Sorbitol und/oder
Dextran. Optional können
die Suspensionen auch noch Stabilisierer enthalten.
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Die
Peptide werden unter Verwendung konventioneller pharmazeutisch verträglicher
parenteraler Vehikel zur Verabreichung mittels Injektion formuliert.
Diese Vehikel sind nicht toxisch und therapeutisch und eine Reihe
von Formulierungen ist in Remington's Pharmaceutical
Sciences, (a.a.O.) geoffenbart. Nichtbeschränkende Beispiele für Exzipienten
sind Wasser, physiologische Kochsalzlösung, Ringer's-Lösung, Dextroselösung und
Hank's balancierte
Salzlösung.
Erfindungsgemäße Formulierungen
können
außerdem
geringe Anteile von Additiven, wie Substanzen enthalten, die die
Isotonizität,
den physiologischen pH-Wert und die Stabilität aufrechterhalten.
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Die
erfindungsgemäßen Peptide
liegen vorzugsweise in gereinigter Form vor, die im Wesentlichen
frei von Aggregaten oder anderem Proteinmaterial ist, vorzugsweise
bei einer Konzentration von etwa 1,0 ng/ml bis zu 100 mg/ml.
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Wirksame
Dosen des erfindungsgemäßen Peptids
zur Verwendung bei der Prävention,
der Unterdrückung
oder der Behandlung von immunbezogenen Krankheiten liegen in dem
Bereich von etwa 1 ng bis 100 mg/kg/ Körpergewicht. Ein bevorzugter
Dosierungsbereich liegt zwischen 10 ng und 10 mg/kg. Ein speziell
bevorzugter Dosisbereich liegt zwischen 100 ng und 1 mg/kg.
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Die
Immunogenizität
des Peptids kann erhöht
werden, indem es in einem längeren
Peptid oder einer Kette enthalten ist oder indem es mit einem "immunologischen" Carrier, beispielsweise
KLH, Albuminserum, Tetanustoxid u.dgl. unter Verwendung von Standardverbindungstechniken
konjugiert wird. Eine Vielzahl dieser Verfahren ist aus dem Stand
der Technik bekannt, beispielsweise die Verwendung von kondensierenden
Wirkstoffen, wie Dicyclohexylcarbodiimid oder der Verwendung von
Linkern, wie jene, die von Pierce Chemical Co., Rockford, IL. gewerblich
zu beziehen sind.
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Die
Dosen für
die TCR-Peptidspezifischen Antikörper
variieren als Funktion des Speziesursprungs für den Anti körper, im Isotyp, der Affinität, seiner
Natur (polyklonal, monoklonal, chimerisch) und anderer Eigenschaften,
wie dies dem Fachmann bekannt ist. Beispielsweise wird ein monoklonaler
Antikörper
gegen ein TCR-Peptid mit einer Dosis zwischen 0,01 – 50 mg/kg
verabreicht.
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Die
nachfolgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung ohne
sie zu beschränken.
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Beispiel 1
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Zusammensetzungen
von Peptiden, die zur Behandlung von EAE, als Modell von MS, verwendbar sind
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Einführung
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EAE
stellt ein anerkanntes Rattenmodell für die menschliche Autoimmunkrankheit
Multiple Sklerose dar. Demgemäß wurde
die Brauchbarkeit der vorliegenden Erfindung nachgewiesen, indem
gezeigt wurde, dass die Verabreichung des Peptids, das das geeignete
CDR2-Peptid des TCR repräsentiert,
der bei Ratten ein TCR-Marker für
EAE darstellt, in diesen Tieren EAE verhindert. Bei diesem Modell
wird die Krankheit durch Injizieren einer encephalitogenen Form
des Myelinbasisproteins, beispielsweise des Basisproteins vom Guineaschwein
(GPBP) oder eines synthetischen Peptids, das mit den Bausteinen
72–89
von GPBP (GPBP(72–89))
korrespondiert, in der jeweilige Ratte induziert. Die Injektion
eines dieser Peptide in einem vollständigen Freund'schen Adjuvant (CFA)
induziert encephalitogene T-Zell-Klone, die vorzugsweise die Rattenhomologe
der Mäuse
TCR Vag und Vβ8
Gene verwenden (Chou, Y.K., et al., J. Neurosci. Res. 22:181–187 (1989),
Burns, F.R., et al., J.Exp. Med. 169:27–39 (1989)).
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Die
Erfinder berichteten über
die vollständige
Nukleotid- und abgeleitete Aminosäuresequenz für die rearrangten
TCR α- und β-Kettengene
(mit der Sequenzhomologie zu den Mäuse-Vα2 bzw. Vβ8-Familien), die in Abhängigkeit
von dem encephalitogenen Hauptepitop des Basisproteins, GPBP(72–89) (Burns,
F.R., et al., a.a.O.) verwendet wurden. Innerhalb der TCR Vβ8-Region
wurde eine 21-Aminosäure-lange
Sequenz identifiziert und synthetisiert, die den zweiten Komplementaritäts-bestimmenden
Abschnitt (CDR2) enthält,
und es wurde vorhergesagt, dass diese für T-Zellen immunogen ist (basierend
auf dem Algorithmus von Margalit et al. und Rothbard et al. (a.a.O.).
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Das
Peptid hat die Sequenz: Asp-Met-Gly-His-Gly-Leu-Arg-Leu-Ile-His-Tyr-Ser-Tyr-Asp-Val-Asn-Ser-Thr-Glu-Lys-Gly und endet mit "TCR Vβ8(39–59)".
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Aus
der entsprechenden Region einer anderen TCR Vβ-Sequenz wurde ein Kontrollpeptid synthetisiert,
das zu der Vβl4-Familie
von Mäusen
(William et al., a.a.O.) homolog war.
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Spezifische
Immunität
gegen das TCR-Peptid
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Durch
subkutane (s.c.) Injektion von 400 μg TCR-Peptid in CFA (100μg Mycobacterium/Ratte) wurden vier
Ratten immunisiert und 30 Tage danach wurden die Peptidspezifischen
Immunantworten gemessen.
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Um
die Antikörper,
die für
das TCR Vβ8(39–59) Peptid
spezifisch sind, wurde Serum aus den immunisierten Ratten durch
Direkt-ELISA getestet. Das TCR-Peptid wurde auf Kunststoffmikroplatten
aufgeschichtet (25 ng TCR-Peptid/Tüpfel). Es wurden Serumverdünnungen
zugegeben und die Platten 2 Stunden lang inkubiert. Die Reaktion
wurde durch Zugabe von Peroxidase-konjugierten Antikörpern, die
für Ig-,
H- und L-Ketten spezifisch sind, entwickelt. Ein chromogenes Substrat
für Peroxidase
wurde zugegeben und es wurde die Absorption der farbigen Reaktionsprodukte
bei 405 nm (A405) unter Verwendung eine
colorimetrischen Platereaders gemessen.
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Eine
1:200 Verdünnung
des Immunserums führt
zu einer Absorption von 0,63 ± 0,12
Einheiten. Kontrollseren aus Ratten, die mit dem Kontrollpeptid
immunisiert waren (aus der entsprechenden CDR2-Region einer nichtverwandten
TCR-Kette Vβ14 abgeleitet),
führte
zu einer Reaktion von nur 0,02 ± 0,01 Einheiten. Somit wurde
eine spezifische Antikörperreaktion
auf das TCR-Peptid erhalten.
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Zusätzlich zeigten
die Ratten eine spezifische T-Zell-Antwort
in vivo, gemessen als verzögerte
Hypersensitivitätsreaktion
(DH) gegen die intradermale Abfrage (i.d.) mit dem Vβ8(39–59) TCR-Peptid,
jedoch keine mit dem Vβ14-Peptid.
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TCR-Peptid-spezifische
Immunität
schützt
gegen klinische EAE
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Zusätzlich dazu,
dass die Peptid-immunisierten Ratten eine spezifische Immunität gegen
das TCR-Peptid zeigten, wurde herausgefunden, dass die Peptid-immunisierten
Ratten gegen klinische EAE geschützt
sind.
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Die
Immunisierung von Lewis-Ratten mit dem TCR Vβ8(39–59) Peptid verhindert vollständig die
Induzierung von EAE (Tabelle 1), jedoch nicht bei dem TCR Vβ14-Peptid
oder physiologischer Kochsalzlösung.
Die mit Vβ8(39–59) immunisierten
Ratten entwickelten sowohl Antikörper,
die spezifisch gegen das Vβ8(39–59)-Peptid
sind, als auch eine verzögerte
Hypersensitivitätsreaktion
(DH) von 0,17 mm Ohrschwellung gegen 50μg TCR Vβ8(39–59) Peptid. Das Vβ14-Kontrollpeptid induzierte
ebenfalls eine Immunität,
die gegen sich selber spezifisch war, konnte jedoch keinen Schutz
gegen EAE hervorbringen.
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TCR-Peptid-spezifische
Immunität
erzeugt spezifische T-Zellen
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Zusätzlich zur
Demonstration der Antikörperproduktion,
der DH-Antwort und dem Schutz gegen EAE führt das TCR-Peptid zu nachweisbaren
antigenspezifischen T-Zellen (d.h. TCR-Peptid-spezifischen) T-Zellen.
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Ratten
wurden s.c. mit 400μg
TCR Vβ8(39–59)-Peptid
in CFA (das 1 mg M. Tuberculosis enthält) immunisiert und wurden
entweder gleichzeitig mit 50μg
GPBP in CFA oder 30 Tage später
mit 100μg
GPBP s.c. abgefragt. Zwanzig Tage nach dem gleichzeitigen Abfragen
wurden wegführende
Lymphknoten (LN) entnommen und Lymphozytensuspensionen zuberei tet.
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Eine
Fraktion der Zellen wurde hinsichtlich der Proliferationsantwort
auf Antigene oder Mitogene in vitro (5 × 105 Zellen/Tüpfel) getestet.
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Der
Rest der Zellen wurde in einer Schüttkultur (Petrischale mit 6
cm Durchmesser) mit dem geeigneten TCR-Peptid (50μg/ml) 3 Tage lang erneut stimuliert,
worauf sie in ein IL-2-reiches Medium weitere 4 Tage lang übertragen
wurden. Diese Zellen wurden anschließend hinsichtlich der Proliferationsantworten
auf Antigene oder Mitogene durch Restimulation in Anwesenheit von
bestrahlten Thymusanhangdrüsenzellen
(2 × 104 Zellen/Tüpfel) restimuliert. In einigen
Fällen
wurde die Stimulation durch das TCR-Peptid in Anwesenheit von 2μg/Tüpfel monoklonaler
Antikörper
ausgeführt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt (unterstrichene Werte zeigen
statistisch signifikante Antworten).
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Lymphknotenzellen
(LN), die aus den geschützten
Ratten isoliert wurden, reagierten auf das TCR Vβ8(39–59)-Peptid ebenso wie auf das GPBP und das
PPD (gereinigtes Proteinderivat aus M. Tuberculosis). Dies war ein
weiterer Beweis für
die konkurrierende Anwesenheit einer TCR-spezifischen T-Zell-Reaktionsfähigkeit
als auch für
eine antigenspezifische T-Zell-Reaktionsfähigkeit.
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Die
T-Zell-Linien wurden aus den LN der geschützten Ratten, die spezifisch
auf das Vβ8(39–59)-Peptid,
jedoch nicht auf das Vβ14-Peptid
reagiert haben, ausgewählt
(Tabelle 2). Die TCR Vβ8(39–59) spezifischen
T-Zellen erwiesen sich als stark positiv bei der Immunofluoreszenzsuche
nach den CD4-Markern und schwach positiv nach den CD8-Markern. Die
proliferative Antwort auf das Vβ8(39–59)- Peptid war nur auf
die MHC-Moleküle
der Klasse I beschränkt.
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Eine
GPBP-spezifische T-Zell-Linie wurde außerdem aus den geschützten Ratten
selektiert, die sowohl mit dem TCR Vβ8(39–59)-Peptid und GPBP immunisiert
waren. Diese Linie zeigte eine uncharakteristisch geringe Antwort
auf das encephalitogene 72-89-Peptid, verglichen mit dem Antwortverhalten
auf GPBP. Einmal selektiert und aktiviert waren Zellen der GPBP-spezifischen
T-Zell-Linien von Ratten, die gegen das TCR-Peptid geschützt waren,
encephalitogen (Verabreichung von 107 Zellen
verursachen bei 3 Ratten eine Paralyse der Hinterbeine), was anzeigt,
dass die Immunisierung mit dem TCR Vβ8(39–59)-Peptid nicht in der Beseitigung
der Vorläufer
der encephalitogenen T-Zellen führte.
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Das
Mischen der TCR Vβ8(39–59)-spezifischen
T-Zellen mit den BP-spezifischen T-Zellen störte nicht die Antwort auf das
GPBP, selbst wenn das TCR-Peptid anwesend war (Tabelle 2). Die Anwesenheit
der TCR Vβ8(39–59)-spezifischen
T-Zellen verursachte jedoch eine gesteigerte Antwort auf alle Peptide
des GPBP mit Ausnahme der encephalitogenen 72–89-Sequenz. Die TCR-Peptid-spezifischen
T-Zellen änderten
deshalb das Peptiderkennungsmuster der mit GPBP reaktionsfähigen T-Zellen,
was den Beweis für
die Existenz von Zelle-Zelle-Interaktionen liefert.
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Unmittelbare
Interaktionen zwischen TCR-Peptid-spezifischen T-Zellen und BP-spezifischen
T-Zellen
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T-Zellen
aus den LN von immunisierten Ratten wurden in vitro auf ihr Antwortverhalten
auf abgeschwächte
Vβ8+- oder
Vβ8–-T-Zellen
untersucht. Die als Stimulator dienenden T-Zellen wurden bestrahlt (2500R)
und 2 × 104-Zellen wurden (beim Fehlen von zusätzlichen
Anhangzellen) 3 Tage lang mit 2 × 105-isolierten
TCR-spezifischen T-Zellen kultiviert, mit 3H-Thymidin
18 Stunden lang gepulst und es wurde die Isotopenaufnahme durch
Flüssigkeitsscintillationsspektroskopie
gemessen.
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Beim
Fehlen einer stimulierenden T-Zell-Linie liegen die "Hintergrund"-Antworten in der
Größenordnung
von 7000 cpm (Tabelle 3). Wenn die stimulierende Linie für das GPBP
572–89
Epitop-spezifisch ist und folglich den Vβ8-TCR exprimiert, beträgt die Antwort
31 000 cpm. Wenn jedoch die Stimulatorlinie für das GPBP 55–74-Peptid
spezifisch ist und nicht den Vβ8-TCR
exprimiert, war keine signifikante Antwort über dem Hintergrund zu beobachten
(8000 cpm). Somit konnte nur die Vβ8+-Zelle
durch die T-Zellen erkannt werden, die für das TCR-Peptid spezifisch
sind, was anzeigt, dass die direkte Erkennung des Vβ8-Peptids
auf den Ziel-T-Zellen durch eine regulatorische Vβ8-spezifische
T-Zelle auftritt. Diese Ergebnisse zeigen die direkte Erkennung
der TCR-Sequenz an der Oberfläche
der Stimulator-T-Zelle an. Die TCR-Peptid-spezifischen T-Zellen jedoch sind
für die
BP-reaktiven Zielzellen nicht zytotoxisch.
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Passive Übertragung des EAE-Schutzes
durch TCR-Peptidspezifische T-Zellen
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Die
Schutzfähigkeit
von Vβ8(39–59) Peptid-spezifischen
T-Zellen wurde durch adoptive Übertragung hergestellt.
Ratten, denen nur 107 Vβ8(39–59)-spezifische T-Zellen injiziert
waren, entwickelten kein EAE (Tabelle 4). Der übertragene Schutz schien T-Zell-vermittelt
zu sein; Vβ8(39–59)-spezifische
Antikörper
wurden in dem Serum der geschützten
Ratten nicht gefunden. Die DT-Ergebnisse (Tabelle 4) haben angezeigt,
dass die adoptiv übertragenen
T-Zellen die Induzierung von EAE verhindern konnten, ohne dass die
T-Zell-Erkennung von anderen Antigenen beeinträchtigt wurde.
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Spezifität von T-Zell-Linien, die von
geschützten
Ratten abgeleitet sind
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Die
Fähigkeit
von Vβ8(39–59)-spezifischen
T-Zellen, (a) die Antwortmuster von GPBP-spezifischen T-Zell-Linien
in vitro zu ändern,
(b) naive Ratten gegen EAE zu schützen und (c) in vivo die DH-Reaktionen
zu vermindern, hat angezeigt, dass das Antwortmuster auf die BP-Epitope
bei Ratten geändert
sein könnte,
die durch die TCR-Peptispezifischen T-Zellen geschützt sind.
Wie in Tabelle 5 gezeigt, haben LN-Zellen aus EAE-geschützten Tieren
gut auf das TCR-Peptid von GPBP reagiert, verglichen mit den LN-Zellen
einer Kontrollgruppe. Im Gegensatz dazu zeigten LN-Zellen aus der
geschützten
Gruppe eine signifikante Antwort auf das 87–99 Peptid von BP, während die
LN-Zellen der Kontrollgruppe auf dieses Peptid nicht reagiert haben. Die
Selektion einer TCR Vβ8(39–59)-spezifischen
T-Zell-Linie aus den LN von adoptiv geschützten Ratten (Tabelle 5) hat
angezeigt, dass die TCR-Peptid-spezifischen T-Zellen in die LN,
die die Stelle der GPBP-Injektion drainiert, gewandert sind und
sich dort eingenistet haben.
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Diskussion
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Die
Ergebnisse demonstrieren zum ersten Mal die Verwendung eines synthetischen
Peptids aus der CDR2-Region des TCR, um Vβ8-spezifische Regulator-T-Zellen
zu induzieren, die die Auslösung
von EAE verhindern. Computer-Modelle der ternären Wechselwirkung unter den
TCR-Ketten, antigenen Peptiden und den MHC-Restriktionsmolekülen ist
mit der CDR-Beteiligung an der Peptid/MHC-Bindung konsistent, wenn
der TCR in eine energetisch günstige
Konformation gefaltet ist (Davis et al. and Claverie et al., a.a.O.).
Die regulatorischen Wirkungen der T-Zellen, die für den CDR2
spezifisch sind, stützen
die Annahme, dass diese Region eine biologische Bedeutung aufweist.
Obwohl die Erfinder nicht an eine spezielle Theorie gebunden sein wollen,
scheint es unwahrscheinlich, dass die Antwort der T-Zelle direkt
mit dem funktionalen TCR Vβ8-Molekül auf der
Oberfläche
der Ziel-T-Zelle wechselwirkt. In der Tat ist es überzeugend,
dass das endogene TCR-Peptid vorzugsweise auf der T-Zell-Oberfläche prozessiert
und exprimiert wird zusammen mit Klasse I-Molekülen (Long, E.O., Immunol. Today
10:232–234
(1989)). Wenn die natürliche
Form des TCR-Peptids mit dem MHC-Molekül an der Oberfläche der
T-Zelle assoziiert
ist, kann die Wechselwirkung der TCR-spezifischen T-Zelle die normale Aktivierung
der T-Zelle durch ein BP-Epitop stören.
-
-
Die
Impfung mit abgeschwächten
T-Zellen zeigt an, dass die schützende
Immunität
gegen Zielstrukturen induziert wird, die sich unterschiedliche T-Zell-Klone
teilen, die für
dasselbe krankheitsinduzierende Epitop spezifisch sind, jedoch den
TCR direkt nicht implizieren. Die hier demonstrierte Immunogenizität und immunregulatorische
Aktivität
einer definierten Region der TCR Vβ8-Kette, die durch die encephalitogenen
T-Zellen exprimiert wird, stellt einen wichtigen Schritt nach vorne
zum Verständnis
der antiidiotypischen Regulierung dar und schafft eine klare Erklärung für die Schutzwirkungen
der Peptidimmunisierungslösung.
Die erfindungsgemäße Lösung, bei
der ein synthetisches Peptid verwendet wird, um die TCR-Peptidspezifischen
Antikörper zu
induzieren, ist bei der Produktion einer Vielfalt von hochspezifischen
Antikörpern
zum Bestimmen von Sequenzen von Wert, die für die TCR-Funktion Bedeutung
haben. Die möglichen
regulatorischen Eigenschaften der Antikörper, die gegen das Vβ8(39–59)-Peptid
gezüchtet
sind, sind in Beispiel II erläutert.
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Die
TCR-Peptid-Impfung findet ihre Anwendung bei humanen Autoimmun-
oder bösartigen
Zuständen,
die durch die gewöhnliche
TCR V-Genverwendung gekennzeichnet sind.
-
Beispiel II
-
Antikörper gegen
ein synthetisches TCR V-Regions-Peptid unterdrücken EAE
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Dieses
Beispiel liefert eine Evaluation der Wirkungen der Immunisierung
mit dem TCR Vβ8(39–59)-Peptid
gegen EAE, die durch das encephalitogene Guineaschweinbasisproteinpeptid
(GPBP), S87–99,
induziert wurde, sowie auf die Antikörperantworten auf die GPBP-Peptide
S49S oder S87–99.
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Die
Antikörperantworten
gegen das TCR Vβ8(39–59)-Peptid
sind beschrieben und die Fähigkeit
dieser Antikörper,
mit den Vβ8+-T-Zellen zu reagieren und die klinischen
Anzeichen von EAE zu unterdrücken
sind bewertet.
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Die
Ergebnisse zeigen, dass das TCR Vβ8(39–59)-Peptid
sowohl den Schutz gegen EAE als auch erhöhte Titer von Antikörpern, die
für eines
der GPBP-Epitope spezifisch sind, induzieren kann, die bei Lewis-Ratten
encephalitogen sind. Ferner wurde gezeigt, dass anti-TCR Vβ8(39–59) Antikörper EAE
unterdrücken,
unabhängig
von regulatorischen T-Zellen. Somit sind nach der Immunisierung
der Lewis-Ratten mit dem TCR Vβ8(39–59)-Peptid
sowohl humorale als auch zelluläre
regulatorische Mechanismen erzeugt worden.
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A. Materialien und Verfahren
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1. Peptidsynthese
und Reinigung
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Alle
in dieser Studie verwendeten Peptide wurden durch eine minore Modifikation
(Hashim, G.A., et al., J. Neurosci. Res. 16:467 (1986) des Festphasenverfahrens
(Merrifield R.B., J. Amer. Chem. Soc. 85:2149 (1963)) unter Verwendung
von Boc-Aminosäure-Harz-Ester
(Peninsula Laboratories, San Carlos, CA) hergestellt worden. Die
Peptide (Tabelle 6) wurden mit t-Boc-L-Aminosäurederivaten synthetisiert,
wobei von dem t-BocL-Glycin-O-Harz-Ester (0,65 mMol/g: 0,78 mMol)
ausgegangen wurde. Die Kopplungs- und
Deblockierungsreaktionen wurden routinemäßig mit Hilfe des Kaiser'schen Tests auf freie
Aminogruppen überwacht (Kaiser,
E., et al., in Anal. Biochem. 34:595 (1970)). Einzelne Deblockierungs-
und gelegentliche doppelte Doppelreaktionsschritte reichten zur
Synthese aller in dieser Studie verwendeten Peptide aus. Das Peptid Gp-S49S
definiert die Region 69–84
von GPBP und trägt
ein C-terminales Glyzin. Die Bausteinnummern der GPBP-Peptide, die
in dieser Studie verwendet wurden, entsprechen denen, die für das bovine
Myelinbasisprotein berichtet werden (Eylar, E.H., et al., J. Biol.
Chem. 246:5770 (1971)).
-
Tryptophan
enthaltende Peptide werden zunächst
30 Minuten lang mit 10% Piperidin behandelt, um die formylblockierenden
Gruppen zu entfernen und sodann werden alle anderen Peptide von
dem Harz gespalten zusammen mit anderen Seitenkettendeprotection,
indem sie 0°C
in Anwesenheit von Anisol mit HF behandelt werden. Nach dem Entfernen
des HF wird die Harz-Peptid-Mischung 4 mal mit Äther gewaschen und getrocknet.
Das Peptid wird mit Wasser extrahiert, lyophilisiert und durch eine
Sephadex G10-Säule
(2,5 × 100 cm)
gefiltert, die mit 5%-iger Essigsäure equilibriert und eluiert
wurde. Die säureunlöslichen
Peptide werden aus der Harz-Peptid-Mischung mit 0,03 M Ammoniumkarbonat
extrahiert, auf einer Sephadex G10-Säule gefiltert, die mit 0,03
M Ammoniumbikarbonat equilibriert und eluiert wurde, und sodann
werden sie lyophilisiert. Die weitere Reinigung des Peptids wurde
unter Verwendung von HPLC mit einer Bondapak C18-Säule erreicht,
die mit 0,1% Trifluor-Essigsäure
(TFA) in Wasser equilibriert wurde und mit einem linearen Gradienten bis
zu 40% Acetonitril enthaltenden 0,1%-igen TFA über eine Zeitspanne von 60
Minuten eluiert wurde. Die Reinheit der Peptide wurde durch HPLC
sowie durch Aminosäurekompositionsanalyse
dokumentiert.
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2. Test- und
Kontrollpeptide
-
Das
TCR Vβ8(39–59)-Peptid
wurde entsprechend der Sequenz, wie sie durch Burns, F.R., et al.,
in J. Exp. Med. 169:27 (1989)) angegeben wurde, synthetisiert. Als Kontrollen
für die
TCR Vβ-Genfamilienspezifität und für die CDR2
hypervariable Region wurden weitere Peptide synthetisiert einschließlich dem
TCR Vβ14(39–59), das
die entsprechenden CDR2 der Vβ14-Genfamilie
(Williams C.B., et al., in J. Immunol. 142:1027 (1989)) sowie dem
TCR Vβ8(25-41), der einer Sequenz
in der CDR1-Region neben dem Peptid TCR Vβ8(39–59) entspricht (Burns, F.R.,
et al., a.a.O.). Zu anderen Kontrollpeptiden gehört eine Serie, die spezielle Regionen
von GPBP definiert. Die Peptide Gp-S49S und Gp-S87–99 definieren
jeweils die große
und die kleine encephalitogene Sequenz bei Lewis-Ratten. Die Peptide
Gp-S67 (Bausteine
69–81)
und Gp-S53 (Bausteine 75–84)
definieren jeweils T-Zell- und B-Zell-Epitope innerhalb des hauptencephalitogenen
Epitops, das in dem Peptid GpS49S (Reste 69–84) enthalten ist. Das Peptid
Gp-S55–74
definiert eine nichtencephalitogene T-Zell-Determinante bei Lewis-Ratten
(Offner, H., et al., in J. Exp. Med. 170:355 (1989)) und Gp-Nac-1-16
umfasst die encephalitogene Sequenz für den PL/J-Mäusestamm
(Zamvil, S.S., et al., Nature 324:258 (1986)).
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3. Peptidkopplung
an KLH
-
Das
Keyhole-Limpithemocyanin (KLH) (Calbiochem Corp., La Jolla, CA)
wurde in Phosphat gepufferter physiologischer Kochsalzlösung (PBS)
gegen PBS bei 4°C über Nacht
dialysiert und lyophilisiert. Eine bekannte Menge von KLH (8 mg
oder 1–2 μMol) zusammen
mit dem Peptid, das zu kuppeln ist (10 μMol), wurde in 1 ml deionisiertem
Wasser gelöst.
Nachdem der pH-Wert mittels 0,01 N HCl auf 4,5 eingestellt war,
wurden 375 mg von 1-Ethyl-3 (3-Dimethylaminopropyl)-Karbodiimid
(Pierce Chemical Co., Rockford, IL) in 0,5 ml Wasser hinzugegeben
und die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur 1 Stunde lang
gerührt.
Die Mischung wurde dann in Dialysesäcke gegeben und gegen 3 Wechsel
von PBS bei 4°C
dialysiert und lyophilisiert. Die Menge an Peptid, das an KLH gebunden
war, wurde aufgrund der Massenzunahme in dem nichtdialysierbaren
Teil der KLH berechnet.
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4. Herstellung
von Antipeptid-Antikörpern
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Lewis-Rattenweibchen
mit einem Gewicht zwischen 200-250g
wurden mit einer einzigen Dosis von 100 μg des freien Peptids immunisiert.
Das Peptid wurde in vollem Freund'schen Adjuvans (CFA) emulgiert und s.c.
injiziert. Jede Ratte erhielt 100 μl der Emulsion, die 100 μg Peptid
und 100 μg
M. Butyricum enthielt. In ähnlicher
Weise wurden Lewis-Ratten mit 100 μg eines speziellen Peptids immunisiert
und entweder gleichzeitig oder zu einem späteren Zeitpunkt mit einem anderen
Peptid abgefragt. Immunisierten Ratten wurden aus der Schwanzvene
vor und in Intervallen nach der Immunisierung Blut entnommen.
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Weißen Neuseeland-Karnickeln
mit einem Gewicht von 6-7
lbs. wurde Blut entnommen und sie wurden mit 0,5 ml CFA Emulsion
immunisiert, die 4mg Peptid und 2mg M. Butyricum enthielt. Die Emulsion
wurde s.c. an mehreren Stellen in dem dorsalen Bereich des Nackens
und des Schwanzes injiziert. Die Karnickel wurden entweder mit dem
freien Peptid oder mit Peptid, das mit KLH konjugiert war, immunisiert.
Die immunisierten Karnickel wurden an den Tagen 7, 14 und 21 mit
1mg Peptid, das in unvollständigem
Freund'schen Adjuvant
emulgiert war und s.c. an der Flanke injiziert wurde, geboosted.
Allen Karnickeln wurde über
die Ohrvene Blut entnommen, nachdem sie in Zwangskäfige überführt waren
und mit Acepromozin beruhigt waren. Um Hypovolemie zu verhindern,
wurde die Blutmenge, die entnommen wurde, durch sterile Kochsalzlösung ersetzt. Die
Seren von einzelnen Ratten oder Karnickeln wurde durch Zentrifugieren
aus geklumptem Blut hergestellt. Alle Seren wurden 30 Minuten lang
bei 56°C
dekomplementiert und in kleinen Aliquoten eingefroren, denen Natriumazid
zugegeben war.
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5. Herstellung
von Immunoglobulin
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Aus
dem Serum wurde nach veröffentlichten
Verfahren (Steinbuch, M., et al., in Arch. Biochem. Biophys. 134:279
(1969)) IgG hergestellt und durch Ionenaustausch-Chromatographie
mit DEAE-Sephadex gereinigt. Das Serum wurde mit einer Volumeneinheit
von 0,06 M Acetatpuffer verdünnt
und der pH-Wert bei Raumtemperatur auf 4,8 eingestellt. In einer
Menge von 6,8g/100 ml Serum wurde Caprylsäure unter heftigem Rühren über 30 Minuten
tröpfchenweise
zugegeben. Die Mischung wurde sodann zentrifugiert und der Überstand
wurde auf einen pH-Wert von 5,7 eingestellt, gegen deionisiertes
Wasser dialysiert und lyophilisiert.
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6. Antikörpertests
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Die
Antikörperreaktionsfähigkeit
wurde durch eine Adaption für
Peptide des Direkt-Enzym-gekoppelten Immunosorptionsversuchs (ELISA)
bestimmt (Hashim, G.A., et al., in J. Neurosci. Res. 24:222 (1989))
und durch den Inhibierungs-ELISA, wie er von Cleveland, W.L., et
al., (Methods in Enzymol. 121:95 (1986)) beschrieben ist. Peroxidasemarkiertes
Karnickel-Anti-Ratten-Immunoglobulin oder Ziegen-Anti-Karnickel-Immunoglobulin
(affinitätsgereinigte
H- und L-Ketten, Cooper Biomedical, Malvern, PA) wurde zusammen
mit O-Phenylendiamin als Enzymsubstrat verwendet und die optische
Dichte wurde bei 450–650
nm in einem kolorimetrischen Platereader (Model Vmax, Molecular
Devices, Mento, CA) gemessen.
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7. EAE-Induktion
-
EAE
wurde, wie von Hashim, G.A., et al., in J. Neu rosci. Res. 24:222
(1989) beschrieben in Lewis-Ratten-Weibchen (225–250g) induziert. Jede Ratte
erhielt eine einzige s.c. Injektion einer CFA-Emulsion, die 100 μg Peptid
und 100 μg
M. Butyricum enthielt. Die immunisierten Ratten wurden täglich auf
klinische Anzeichen von EAE inspiziert und zwischen 25 und 30 Tagen
nach der Abfrage getötet.
Zu diesem Zeitpunkt wurden die Seren von individuellen Ratten gesammelt
und das Rückenmarksgewebe
wurde zum Zweck der histologischen Untersuchung verarbeitet.
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8. Prävention und Unterdrückung von
EAE in Lewis-Ratten
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Weibliche
Lewis-Ratten wurden mit 100 μg
TRC Vβ8(39-59)Peptid immunisiert,
das in CFA emulgiert war und s.c. injiziert wurde. Den immunisierten
Ratten wurde am Schwanz Blut zur Antikörperbestimmung entnommen und
sie wurden mit 100 μg
eines encephalitogenen Peptids (Gp-S49S oder Gp-587–99)
abgefragt. Gruppen von Ratten wurden entweder am selben Tag oder
am Tag 40–41
nach der Immunisierung, basierend auf dem beobachteten zeitlichen
Verlauf der Anti-TCR Vβ8(39–59) Antikörperproduktion,
abgefragt.
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Um
die EAE-Unterdrückung
durch Anti-TCR Vβ8(39–59) Antikörper zu
studieren, wurden die Lewis-Ratten mit dem encephalitogenen Peptid
Gp-S49S abgefragt und es wurde ihnen entweder physiologische Kochsalzlösung intraperitoneal
(Kontrolle) oder entweder Lewis-Ratten-IgG oder Karnickel-Anti-TCR Vβ8(39–59)-IgG
injiziert, das 14 Tage fand jeden zweiten Tag verabreicht wurde.
Jede Ratte erhielt eine Gesamtmenge von entweder 49 oder 70 mg Ratten-
bzw. Karnickel-IgG und sie wurde am 24. Tag nach der Abfrage getötet. Wenn über eine
Zeitspanne von 14 Tagen sterile Kochsalzlösung injiziert wurde, blieb
das Karnickel-IgG im Kreislauf der aufnehmenden Ratten, an den Tagen 12
und 24 nach der Übertragung
auf hohen Werten und sie erzeugte keine Wechselwirkung mit der Entwicklung
der Anti-Gp-S49S-Antikörper.
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9. Antikörperfärbung von Vβ8+ und
Vβ8–-T-Zellen
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Ratten-
oder Karnickel-IgG (10 μg)
von normalen oder TCR Vβ8(39–59) immunisierten
Tieren wurde bei unterschiedlichen Konzentrationen 30 Minuten lang
mit 106 Thymozyten (bekanntlich überwiegend
Vβ8–) von
normalen Ratten oder einer Gp-S49S-reaktionsfähigen, GPBP-spezifischen T-Zell-Linie (bekanntermaßen Vβ8+) inkubiert wurden. Nach mehrmaligem Waschen
wurden die Zellen mit 10 μg
Maus-Anti-Ratten-IgG
oder Anti-Karnickel-IgG für
weitere 30 Minuten als Amplifizierungsschritt inkubiert. Nach dem
weiteren Waschen wurden die Zellen mit fluoresziniertem Ziegen-Anti-Maus-IgG (H-
+ L-kettenspezifisch) gefärbt,
gewaschen, in 2% Formalin fixiert und hinsichtlich der Fluoreszenzintensität bei 488
nm unter Verwendung eines Coulter Epics C-Cytofluorograph evaluiert.
Die Zellen wurden elektronisch basierend auf dem Winkelverhältnis des Musters
der Vorwärtsstreuung
zu der rechtwinkeligen Streuung aussortiert, um die Hauptlymphozytenpopulationen
einzuschließen,
die sodann hinsichtlich der FITC-Fluoreszenz evaluiert wurden.
-
A. Ergebnisse
-
1. Prävention von EAE durch TCR Vβ8(39–59) Peptid-Immunisierung
-
Um
die prophylaktischen Wirkungen der Anti-TCR Vβ8(39–59)-Immunität gegenüber EAE
zu evaluieren, die durch unterschiedliche encephalitogene Epitope
induziert war, wurden die Lewis-Ratten zunächst mit dem TCR Vβ8(39-59)-Peptid 44 Tage
später
immunisiert und EAE wurde entweder mit Gp-S49S oder Gp-S87–99 induziert.
Wie in Tabelle 7 gezeigt, vermindert die Immunisierung mit dem TCR
Vβ8(39-59)-Peptid die Schwere
der Gp-S49S induzierten EAE deutlich und verhindert vollständig die
durch S87–99-induzierte EAE.
Obwohl die histologischen Scores bei beiden geschützten Gruppen
vermindert war, war die Entzündung in
dem CNS zufolge der TCR Vβ8(39–59)-Peptidimmunisierung
weniger beeinflusst als dies die klinischen Parameter waren.
-
2. Unterdrückung von
EAE mit dem TCR Vβ8
(39–59)-Peptid
-
Um
die Unterdrückung
von EAE zu evaluieren, wurde das TCR Vβ8(39–59)-Peptid gleichzeitig mit
der encephalitogenen Dosis von GPBP oder Gp-S49S verabreicht. Wie
in Tabelle 7 gezeigt, verhinderte das TCR Vβ8(39–59)-Peptid die GPBP-induzierte
EAE bei den meisten Ratten und verminderte markant die klinische Schwere
bei den übrigen
Tieren. Ein ähnliches
Ergebnis wurde bei Tieren mit Gp-S49S-induzierter EAE erhalten.
Im Gegensatz dazu hat das TCR Vβ14(39-59)-Kontrollpeptid
keine unterdrückenden
Wirkungen auf die EAE (Tabelle 7). Wiederum waren durch die TCR
Vβ8(39–59) Immunisierung
die histologischen Zeichen der EAE verhältnismäßig weniger beeinflusst als
die klinischen Anzeichen.
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3. Antikörperantworten gegen das TCR
Vβ8(39–59)-Peptid
-
Die
TCR Vβ8-spezifischen
Antikörper,
die gegen intak te T-Zell-Klone gezüchtet waren (Owhashi, M., et
al., J. Exp. Med. 168:2153 (1988), Gascoigne, N.R.J., et al., Proc.
Natl. Acad. Sci., USA 84:2936 (1987), Kappler, J.W., et al., Nature
332:35 (1988), Kappler, J.W., et al., Cell 49:263 (1987), MacDonald,
H.R., et al., Nature 332:40 (1988) haben sich bei der Prävention
und Behandlung von EAE sowohl in Lewis-Ratten (Oshashi, M., et al.,
J. Exp. Med. 168:2153 (1988)) als auch in PL/J-Mäusen (Acha-Orbea, H., et al.,
Cell 54:263 (1988), Urban, J., et al., Cell 54:577 (1988)) als wirksam
erwiesen.
-
-
Es
war somit sehr wichtig, festzustellen, ob Antikörper gegen das synthetische
TCR Vβ8(39–59)-Peptid
gezüchtet
werden können
und wenn, ob sie eine klinische Verwendbarkeit haben.
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Derartige
Antikörper
konnten in der Tat gezüchtet
werden und sie zeigten sich als klinisch wirksam. Antikörper gegen
TCR Vβ8(39–59) wurden
in den Seren von Lewis-Ratten
bereits 7 Tage nach einer einzigen Injektion von 100 μg des freien
Peptids in CFA (Tabelle 8) entdeckt. Obwohl ein hohes Variabilitätsmaß bei der Antikörperreaktion
beobachtet wurde, stiegen die Antikörpertiter allmählich mit
der Zeit. Keine der TCR-Peptid-immunisierten Ratten entwickelte
irgendwelche Zeichen von EAE und alle blieben über die 41-tägige Beobachtungsperiode
gesund.
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Karnickel,
die entweder mit dem freien Peptid oder dem KLH-konjugierten TCR
Vβ8(39–59)-Peptid
immunisiert waren, erzeugten sehr viel höhere Titer an Antikörpern als
Ratten (Tabelle 8). Die Antikörpertiter
blieben 6 Monate lang hoch und zeigten eine erkennbare Reaktionsfähigkeit
bei Verdünnungen
bis zu 1/320 000.
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-
4. Antikörperantworten gegen das encephalitogene
Peptid S49S
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Die
Immunisierung von Lewis-Ratten mit GPBP Peptid oder GP-S49S-Peptid
(Reste 69–84)
induzierte Antikörper,
die mehrere unterschiedliche Epitope erkennen, von denen eines in
den Bausteinen 82–84 (Asp-Glu-Asn)
enthalten ist und durch Antikörperbindung
an Gp-S53 (Bausteine 75–84)
nachgewiesen wurde (Day E.D., et al., J. Neurosci, Res. 18:214 (1987),
Hashim, G.A., et al., J. Neurosci. Res. 17:375 (1987)). Diese Antikörperantworten
hängen
von der Hilfe durch T-Zellen ab, die durch encephalitogene T-Zellen, die für das GP-S49S-Peptid
spezifisch sind, geschaffen werden kann. Obwohl die Immunisierung
mit dem TCR Vβ8(39–59-Peptid
EAE, die durch Gp-S49S-spezifische T-Zellen des Helfer-Phenotyps vermittelt
wird, verhindert oder unterdrückt,
ist es wichtig, die Wirkung dieser Immunisierung auf die Anti-S49S-Antikörperformation zu
bestimmen.
-
Die
Antikörperantwort
auf Gp-S49S wurde bereits 7 Tage nach der Immunisierung mit dem
Gp-S49S in CFA (Tabelle 9) entdeckt. Periodische Blutentnahme aus
den immunisierten Ratten zeigte eine markante Zunahme bei den Antikörpertitern
sowohl gegen Gp-S49S als auch gegen Gp-S53 während der nächsten 48 Tage, wobei die Anti-GpS53-Antwort
nur nach der Entwicklung und dem schließlichen Genesen von der EAE auftrat.
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Nach
der Vorimmunisierung und dem Schutz gegen EAE mittels TCR Vβ8(39–59) waren
die 26 Tage Antworten gegen Gp-S49S und GpS53 zwei- oder vierfach
erhöht,
verglichen mit der bei Ratten, die nicht mit dem TCR-Peptid (Tabelle
9) behandelt waren. In ähnlicher
Weise waren die Anti-S87-99-Antworten
mehr als viermal größer als
in Ratten, die präimmunisiert
und mit dem TCR Vβ8(39–59)-Peptid
geschützt
war (Tabelle 9). Somit verstärkt
eine Immunantwort, die gegen Vβ8+-T-Zellen gerichtet ist, tatsächlich die
Antikörperantworten
gegen mehrere bestimmte B-Zell-Epitope von GPBP.
-
-
5. Spezifität der Antipeptid-Antikörper
-
Um
die Spezifität
verschiedener Antiseren zu evaluieren, wurde die Bindung an eine
Gruppe von synthetischen TCR- und GPBP-Peptiden ermittelt. Die Ergebnisse
(Tabelle 10) zeigen, dass das Anti-Gp-S49-Antiserum, das das GPS49S-
und sein C-terminales Fragment Gp-S53 erkannte, nicht mit dem N-terminalen Fragment
von Gp-S49 (d.h. Gp-S67)
reagiert, nicht mit einer anderen Region und auch nicht mit den
Peptiden der TCR-V-Region. In ähnlicher
Weise erkannten die Ratten oder Karnickel-Antiseren gegen das TCR Vβ8(39–59)-Peptid
nur das Immunogen und nicht andere TCR-Sequenzen (einschließlich der
3 überlappenden
Reste – AspMetGly – die auf
dem TCR Vβ8(25–41) präsentiert
werden) oder die GPBP-Peptide. Antiseren von Ratten, die gleichzeitig
mit dem TCR Vβ8(39–59)-Peptid
plus Gp-S49S oder Gp-S87–99
immunisiert wurden, demonstrierten dieselbe Spezifität für jedes
der Immunogene als Antiseren aus einer einzig immunisierten Ratte
(Tabelle 5). Die Spezifität
der Antikörperreaktionsfähigkeit
mit TCR Vβ8(39–59) und
mit Gp-S49S wurde für
die Peptid-spezifische, dosenabhängige
Inhibierung der Bindung in ELISA bestätigt (1).
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6. Antikörper gegen TCR Vβ8(39–59) erkennen
Vβ8+T-Zellen
-
Um
die potentiellen regulatorischen Wirkungen der Antikörper auf
TCR Vβ8(39–59) zu
interpretieren, war es entscheidend festzustellen, ob die Peptid-spezifischen
Antikörper
mit den Vβ8+-T-Zellen direkt interagieren oder nicht.
Um eine solche Reaktionsfähigkeit
zu bewerten, wurden Vβ8+ encephalitogene T-Zellen oder normale Thymozyten,
die überwiegend
Vβ8– sind
mit Ratten oder Karnickel- Anti-TCR
Vβ8(39–59)-IgG-Antikörpern inkubiert,
gefolgt von Mäuse-Anti-Ratten-
oder Anti-Karnickel-facilisierenden Antikörpern und fluoreszinmarkierten
Ziegen-Anti-Maus-IgG-Antikörper. Wie
in 2 gezeigt, verursachte
das Karnickel-IgG, das gegen das KLH konjugierte, TCR Vβ8(39–59)-Peptid gezüchtet war,
eine erhöhte
Fluoreszenzintensität
bei der gesamten Vβ8+-encephalitogenen
T-Zell-Population (>90%
positiv gegenüber
einem Kontrollantiserum), im Gegensatz zu näherungsweise 5% der normalen
Thymozytenpopulation. Ratten-IgG und Karnickel-IgG, das gegen nichtkonjugiertes
TCR-Peptid gezüchtet
war, färbte
außerdem
selektiv die Vβ8+-T-Zellen, jedoch mit einer geringeren Intensität. Diese
Ergebnisse zeigen an, dass der Antikörper gegen TCR Vβ8(39–59)-Peptid
spezifisch an Vβ8+-T-Zellen binden kann. Keines der Antiseren
war für
Vβ8+-T-Zellen in Anwesenheit von Komplement
zytotoxisch, wie dies sowohl durch Chromfreisetzung oder Farbausschluss
gemessen wurde, was nahelegte, dass die Antikörperbindung die T-Zell-Funktion ändert, ohne
die Zellen zu töten.
-
-
7. Unterdrückung von
EAE mit Anti-TCR Vβ8(39–59) Antikörpern
-
Mit
TCR Vβ8(39–59) immunisierte
Lewis-Ratten waren nicht nur gegen EAE geschützt, sondern entwickelten zirkulierende
Antikörper,
die für
das immunisierende Peptid spezifisch war. Um die Rolle dieser Antikörper beim
Abregeln von EAE zu bewerten, wurden Lewis-Ratten mit Gp-S49S in
CFA abgefragt, und dann mit TCR Vβ8(39–59)- spezifischem
IgG (Ratten oder Karnickel) behandelt. Ratten, die 12 Tage lang
jeden zweiten Tag Lewis-Ratten-IgG erhielten, entwickelten milde
klinische Anzeichen von EAE mit einem verminderten histologischen
Befund im Gehirn, jedoch stärkeren
Beschädigungen
des Rückenmarks,
verglichen mit den Kontrolltieren (Tabelle 11). Ratten, die Karnickel-IgG
bekamen, entwickelten minimale klinische Anzeichen bei geringer Änderung
der histologischen Bewertung (Tabelle 6). Somit unterdrückte eine
12 Tage andauernde Verabreichung von Anti-TCR Vβ8(39–59)-Antikörpern klinische Anzeichen von
EAE, nicht jedoch die histologischen Befunde.
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C. Diskussion
-
Die
hier dargelegten Ergebnisse bilden den ersten Nachweis für die Fähigkeit
eines synthetischen Peptids der TCR V-Region, spezifische Antikörper zu
induzieren, die die Induktion von EAE unterdrücken können. Diese TCR Vβ8(39–59)-Peptid-spezifischen
Antikörper
sind in der Lage, an T-Zellen zu binden, die den gesamten intakten
TCR tragen und hierdurch die Funktion der Zellen, ohne sie zu lysieren,
zu ändern.
Wenn man die im Beispiel I aufgeführten Ergebnisse damit verbindet,
zeigen diese Ergebnisse an, dass sowohl die Antikörper als
auch die zellvermittelte Immunantwort unabhängige immunoregulatorische
Wirkungen auf encephalitogene T-Lymphozyten hat, die die gewöhnlichen
V-Regionsgene in Abhängigkeit
von Epitopen of MBP verwenden. Beide regulatorischen Mechanismen
haben wirksame präventive
und suppressive Auswirkung auf die Induktion von klinischen Anzeigen
der Autoimmunkrankheit.
-
-
Die
TCR Vβ8(39–59)-Peptide,
die basierend auf dem Algorithmus von Margalit et al. und Rothbard
et al. (a.a.O.) vorhergesagtermaßen ein gutes T-Zell-Immunogen
darstellen, erwiesen sich als ein potentes B-Zell-Immunogen, insbesondere
bei Karnickeln. Die Antikörper
waren für
das immunisierende Peptid sehr spezifisch (sowohl bei der direkten
Reaktion als auch bei Inhibierungstests) färbten nur die Vβ8+-T-Zellen und unterdrücken EAE, die durch Vβ8+-T-Zellen vermittelt
war.
-
Zusammengefasst
induzierte das synthetische Peptid TCR Vβ8(39–59) sowohl eine T-Zell-Immunität als auch
eine Antikörperproduktion
in Lewis-Ratten. Sowohl T-Zellen als auch Antikörper alleine oder gemeinsam
sind in der Lage, die Immunantwort auf eine encephalitogene Abfrage
zu regulieren. Die Fähigkeit
dieser TCR-Peptide, die regulatorischen T-Zellen und die schützenden
Antikörper
zu aktivieren, zeigt die Brauchbarkeit dieser Lösung bei der Steuerung von
menschlichen Autoimmunkrankheiten.
-
Beispiel III
-
Klinische
EAE bei Ratten, die mit TCR Vβ8(39–59)-Peptiden vor oder
nach dem Einsetzen der Krankheit behandelt wurden
-
Es
wurde die Fähigkeit
von TCR Vβ8(39–59) getestet,
den Krankheitsprozess zu unterbrechen, wenn es zu unterschiedlichen
Zeiten nach der Induzierung von EAE entweder s.c. (in einem Adjuvants)
oder i.d. (in physiologischer Kochsalzlösung) verabreicht wurde. Bei
dem Experiment 1 wurde das TCR-Peptid entweder am Tag 10 (Linie
2) verabreicht oder zum Zeitpunkt des Beginns, als die erste Ratte
einer Gruppe klinische Anzeichen von EAE zeigte (Linien 3 und 4).
In beiden Fällen
zeigte sich bei beiden Induktionswegen für das Peptid eine signifikante
Verminderung der Dauer der Krankheit, jedoch nicht hinsichtlich
der Schwere oder des Zeitpunkts des Beginns. Die Wirksamkeit des
Peptids, das in physiologischer Kochsalzlösung über den i.d.-Weg verabreicht
wird, ist bei der Humantherapie von besonderer Bedeutung, da er
gegenüber
der s.c. Injektion in einem Adjuvant bevorzugt wird.
-
-
Beim
Experiment 2 wurden die Zeit der i.d. Verabreichung des TCR-Peptids,
ebenso wie die Dosis variiert. Wie in Tabelle 12 gezeigt, wurden
entweder an den Tagen 0 (Tag der EAE-Induzierung) 7 oder 14 50 μg des Peptids
verabreicht, was zu einer signifikanten Verminderung der Dauer der
Krankheit führte.
Eine Verzögerung
beim Einsetzen der Krankheit wurde ebenfalls beobachtet. Außerdem verminderte
sich der Anteil von Tieren, die die Anzeichen der Krankheit zeigten.
Eine größere Dosis
des Peptids (200 μg)
schien weniger wirksam als die niedrigere Dosis, vermutlich zufolge
einer kurzzeitigen Überladung
mit dem Peptid, was die Immunantwort gestört haben könnte, die gegen den TCR erzeugt
wurde. Die Behandlung mit einem ähnlich
bemessenen Peptid, das einem irrelevanten TCR entsprach, hatte keinen
Einfluss auf den Beginn, die Schwere oder das Auftreten von EAE,
mag jedoch die Dauer etwas vermindert haben (letzte Linie von Tabelle
12).
-
Beispiel IV
-
T-Zell-Antworten
von LN-Zellen und TCR-Peptid-selektierten T-Zell-Linien aus Ratten,
die eine TCR-Peptid-Therapie bekommen hatten
-
Die
Proliferationsantworten und die Spezifität von T-Zellen bei den drainierenden LN (popliteal)
von Ratten, die mit TCR Vβ8(39–59)-Peptid
gegen EAE am Tag 13, nachdem die Krankheit induziert wurde, wurde untersucht
(Tabelle 13). Am Tag 0 erhielten die Lewis-Ratten eine EAE-induzierende Menge
von GP–BP
+ CFA s.c. in ihre hinteren Fußballen.
Am Tag 13 wurden sie in drei Gruppen aufgeteilt und bekamen entweder
physiologische Kochsalzlösung
(Spalte 1), s.c., 100 μg
TCR Vβ8(39–59)-Peptid
(+ CFA) in die hinteren Fußballen (Spalte
2) oder i.d. 50 μg
TCR Vβ8(39- 59) in physiologischer
Kochsalzlösung
in die Ohrmuschel. Am tag 20, etwa 7 Tage nach dem Einsetzen von
EAE, wurden popliteale LN entnommen und die Proliferationsaktivität von T-Zellen
in Abhängigkeit
von dem angezeigten Antigen oder Mitogen wurde unmittelbar getestet.
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Die
LN-Zellen von Kontrollratten reagierten am besten auf Con A, PPD,
GPBP und GPBP (72–89)
sowie GPBP (45–89)
(das die 72–89-Sequenz
sowie weitere Immunogene, jedoch nichtencephalitogene Peptide enthält). Im
Gegensatz dazu zeigten die LN-Zellen von Ratten, die s.c. in CFA
das TCR-Peptid erhalten
haben, keine signifikante Profilerationsantwort auf GPBP oder eines
der BP-Fragmente. Die LN-Zellen
von Ratten, die i.d. mit dem TCR-Peptid behandelt waren, reagierten ähnlich mit
der Einschränkung
einer verminderten Antwort auf GPBP(72–89). Zusätzlich zeigte die letztere
Gruppe eine verstärkte
Antwort auf GPBP(90-170),
das bekanntermaßen
nicht encephalitogen ist. Dies zeigt an, dass ein Umschalten der
Epitope stattgefunden hat. Ein Aliquot jeder der oben genannten
3 Gruppen von
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LN-Zellen
wurde in Kultur 3 Tage lang entweder mit GPBP oder dem TCR-Peptid
stimuliert und man ließ die
Zellen für
weitere 5 Tage in IL-2 sich vermehren. Die Proliferationsantworten
auf die unterschiedlichen Antigene und Mitogene dieser ausgewählten T-Zellen
wurde, wie oben beschrieben, geprüft. Die Ergebnisse sind in
Tabelle 14 gezeigt.
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Die
Kontroll-T-Zellen (Tabelle 14, Spalte 1) reagierten gut auf GPBP,
GPBP(72–89),
P1 und Ratten-BP (was eine homologe Erkennung in der CNS anzeigt).
Die letzte Zeile der Tabelle zeigt, dass, wenn die T-Zellen dieser
Gruppe in naive Ratten injiziert wurden, sie encephalitogen wurden.
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Die
T-Zellen von der Gruppe der Tiere, die mit dem TCR-Peptid in CFA
s.c. behandelt waren und mit GPBP in Kultur selektiert waren (Spalte
2), reagierten schwach auf GPBP, GPBP(72–89) und Ratten-BP. Die Antwort
auf GPBP P1 erfolgte offensichtlich zufolge des zweiten (nicht encephalitogenen)
Epitops, da die Antwort auf das GPBP(72–89)-Epitop schwach war. Die kräftige Antwort
auf das TCR-Peptid
zeigt an, dass eine 7 Tage lang dauernde Exposition (ohne weitere
Selektion mit diesem Peptid) für
eine Anti-TCR-Peptid-Immunität ausreichend
war. Von großer
Bedeutung ist die Beobachtung, dass diese Zellen nicht in der Lage
waren, EAE zu übertragen,
was andeutet, dass die encephalitogenen Klone in Anwesenheit des
GPBP-Antigens während
der Kultur nicht selektiert werden konnten.
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Die
Zellen von den obigen TCR-immunisierten Tieren schienen, wenn sie
in vitro mit dem TCR-Peptid anstelle mit dem GPBP selektiert waren
(Spalte 3) nur auf das TCR-Peptid
zu reagieren (und natürlich
auf das T-Zell-Mitogen, Con A).
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Schließlich verhielten
sich Zellen von Ratten, die mit dem TCR-Peptid i.d. behandelt und
in Kultur mit GPBP selektiert waren (Spalte 4) im Wesentlichen ähnlich wie
die Kontrollzellen. D.h. sie erkannten das encephalitogene GPBP(72–89) Epitop
und waren in der Lage EAE zu übertragen.
Dies zeigt, dass die encephalitogenen T-Zell-Vorläufer noch
in den auf diese Weise behandelten Ratten vorhanden waren und in
Kultur selektiert werden konnten. Dies legt die Möglichkeit
nahe, dass die verminderte Dauer von EAE, wie sie in Ratten, die
mit TCR-Peptid i.d. behandelt waren (siehe Beispiel III und Tabelle
12), nicht die Regulierung der drainierenden LN-Zellen beteiligt.
Jedoch ist es wichtig zu beachten, dass die LN, die die Stellen
der i.d. Injektion drainieren, unterschiedliche regulatorische Eigenschaften
zeigen können
(d.h. der cervicale LN, wenn die Injektion in der Ohrmuschel i.d.
erfolgt.
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Beispiel V
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Behandlung
einer Autoimmunkrankheit mit einem Toxinkonjugierten Antikörper gegen
ein TCR-Peptid
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Bei
diesem Beispiel wird ein mAb durch Immunisierung von Mäusen mittels
des TCR Vβ8(39–59)-Peptids
produziert, wobei die Verfahren zum Herstellen eines Hybridoms,
wie oben beschrieben, angewendet werden. Der mAb wird sodann mit
einer Ricin-A-Kette konjugiert, um ein Immunotoxin zu schaffen.
Der Toxin-konjugierte Antikörper
wird in Ratten gleichzeitig zusammen mit einer encephalitogenen
Dosis von GPBP (Prophylaxe) und in andere Ratten nach dem Einsetzen
von EAE (Therapie) injiziert.
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Die
prophylaktische Behandlung mit dem Anti-TCR-Peptid- Antikörper, der mit der Ricin-A-Kette
konjugiert ist (1–4
Injektionen mit einer Dosis von 0,05 bis 0,2mg/kg) führt zu einem
deutlich verminderten Einsetzen und Schwere von EAE. Die therapeutische
Behandlung mit ähnlichen
Dosen des Konjugats führte
zu einer deutlichen Verkürzung
der Dauer und einer Verminderung der Schwere der Krankheit.
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Beispiel VI
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Behandlung
von Arthritis mit TCR-Peptiden
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Dieses
Beispiel beschreibt, wie humane rheumatoide Arthritis durch die
erfindungsgemäße Zusammensetzung
und Verfahren behandelt wird. Sie wird durch zwei Tiermodelle modelliert:
(1) Durch Injektion des Typ II-Collagens wird Arthritis in disponierten
Mäusen
induziert (Stuart, J.M. et al., Ann. Rev. Immunol. 2:199–218 (1984)
und (2) Arthritis wird durch Injektion des mycobakteriellen Hitze schockproteins
(HSP) in disponierten Ratten induziert (Van Eden, W., et al., Nature
331:171–173
(1988)). In vitro werden die arthritogenen T-Zellen, die mit dem
Collagen oder HSP reaktionsfähig
und in der Lage sind, diese Krankheit zu übertragen, in Anwesenheit des
Collagens oder HSP unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren
selektiert. Der TCR, der mit den krankheitsvermittelten T-Zellen assoziiert
ist, wird identifiziert und die vermutliche Aminosäuresequenz,
wie oben, durch Nukleinsäuresequenzieren
bestimmt. Unter Verwendung des Algorithmus nach Margalit et al.
und Rothbard et al. (a.a.O.) wird ein immunogener Teil des TCR,
der wenigstens einen Teil des zweiten Komplementaritäts-bestimmenden
Abschnitts trägt,
synthetisiert und dazu verwendet, Mäuse (gegen collagene Arthritis)
und Ratten (gegen adjuvante Arthritis) zu immunisieren.
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Die
in Verbindung mit der Krankheitsinduktion mit dem TCR-Peptid behandelten
Tiere sind deutlich gegen die Entwicklung von Arthritis geschützt, und
zwar gemessen durch Gelenkschwellung und durch die T-Zell-Reaktionsfähigkeit
gegenüber
dem Arthritogen. Tiere, die mit dem TCR-Peptid nach dem Einsetzen
der Krankheit behandelt wurden, zeigen eine deutliche Verkürzung der
Dauer und eine Verminderung der Schwere der Symptome der Arthritis.
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Passive
Immunisierung mit Antikörpern,
die gegen das TCR-Peptid induziert waren, das mit Arthritis assoziiert
ist, zeigen ebenfalls ähnliche
prophylaktische und therapeutische Wirkungen bei der Arthritisinduktion.
Eine erfolgreiche Behandlung wird durch polyklonale Antikörper, mAb,
chimere Antikörper
und immunotoxin-konjugierte Antikörper erreicht.
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Beispiel VII
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Behandlung
von Thyroiditis mit TCR-Peptiden
-
Humane
Thyroiditis einschließlich
Hashimoto's Thyroiditis
und Graves' Krankheit
wird durch die erfindungsgemäße Zusammensetzung
und Verfahren, wie sie in diesem Beispiel beschrieben ist, behandelt.
Obwohl die genaue Natur des Zielantigens ungewiss ist, ist die Immunreaktionsfähigkeit
mit Thyroglobulin- bzw. dem Thyrotrophin-Rezeptor mit dieser Krankheit assoziiert.
Thyroiditis wird in Mäusen
durch die Verabreichung von Thyroglobulin modelliert (Maron, R.,
et al., J. Exp. Med. 152:1115–1120
(1980)). T-Zellen, die mit Thyroglobulin und Thyroid-Follicular-Zellantigenen
reaktionsfähig
und in der Lage sind, die Krankheit zu übertragen, werden in vitro
in Anwesenheit von entweder Thyroglobulin, Thyroidzellen oder Thyroidzellmembran-Zubereitungen
unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren selektiert. Der
TCR, der mit den krankheitsvermittelnden T-Zellen assoziiert ist,
wird identifiziert und die vermutliche Aminosäuresequenz wird durch Nukleinsäuresequenzieren,
wie oben, bestimmt. Unter Verwendung der Algorithmen nach Margalit
et al. und Rothbard et al. (a.a.O.) wird ein immunogener Teil des
TCR, der wenigstens einen Teil des zweiten Komplementaritätsbestimmenden
Abschnitts aufweist, synthetisiert und zum Immunisieren von Mäusen verwendet.
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Tiere,
die mit dem TCR-Peptid in Verbindung mit der Krankheitsinduktion
behandelt wurden, sind deutlich gegen die Entwicklung von Thyroiditis
und einer T-Zell-Reaktivität
mit den Thyroidantigenen geschützt.
Tiere, die nach dem Einsetzen der Krankheit mit dem TCR-Peptid behandelt
wurden, zeigen eine deutliche Verkürzung der Dauer und eine Verminderung
bei der Schwere der Symptome der Thyroiditis.
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Die
passive Immunisierung mit Antikörpern,
die gegen das TCR-Peptid induziert und mit der Thyroiditis assoziiert
sind, zeigen auch ähnliche
prophylaktische und therapeutische Effekte gegen die Induktion der Krankheit.
Die erfolgreiche Behandlung wird durch polyklonale Antikörper, mAb,
chimere Antikörper
und Immunotoxin-konjugierte Antikörper erreicht.
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Beispiel VIII
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Behandlung
von Diabetes mit TCR-Peptiden
-
Insulinabhängiger Diabetes
Mellitus (IDDM) oder Typ I-Diabetes stellt eine Autoimmunkrankheit
dar, die durch eine Reaktionsfähigkeit
gekennzeichnet ist, die gegen die Pankreas-Inselzellen (oder β-Zellen)
gerichtet ist, was zu einer Zellzerstörung und einem Versiegen der
Insulinproduktion führt.
Die Zielantigene für diesen
Immunangriff wurden noch nicht mit Sicherheit gekennzeichnet. Das
vorliegende Beispiel beschreibt, wie IDDM durch die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
und Verfahren behandelt wird.
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Die
Krankheit wird in Tieren modelliert, in denen sie natürlich auftritt
oder in bestimmten Mäusestämmen induziert
werden kann (Kanasawa et al., Diabetologia 27:113 (1984). Andere
Mäusestämme können dazu veranlasst
werden, diese Krankheit zu zeigen, indem Lymphozyten von disponierten
Stämmen übertragen werden.
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T-Zellen,
die mit den Antigenen der Pankreas-Inselzellen reagieren und in
der Lage sind, die Krankheit zu übertragen,
werden in vitro in Anwesenheit entweder der Inselzellen oder Inselzellmembranzubereitungen unter
Verwendung der oben beschriebenen Methoden selektiert. Der TCR,
der mit diesen die Krankheit vermittelnden T-Zellen assoziiert ist,
wird identifiziert und die mutmaßliche Aminosäuresequenz
wird durch Nukleinsäuresequenzierung
bestimmt, wie oben angegeben. Unter Verwendung der Algorithmen nach
Margalit et al. und Rothbard et al. (a.a.O.) wird ein immunogener
Teil des TCR, der wenigstens einen Teil des zweiten Komplementaritäts-bestimmenden
Abschnitts enthält,
synthetisiert und zum Immunisieren der Mäuse verwendet.
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Tiere,
die mit dem TCR-Peptid in Verbindung mit der Krankheitsinduktion
behandelt werden, sind deutlich gegenüber der Entwicklung von Diabetes
und gegen die T-Zell-Reaktionsfähigkeit
gegenüber
den Inselzellenantigenen geschützt.
Tiere, die mit dem TCR-Peptid nach dem Einsetzen der Krankheit behandelt
wurden, zeigen eine deutliche Verkürzung der Dauer und eine Verminderung
der Schwere der Symptome von Diabetes.
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Die
Passivimmunisierung mit Antikörpern,
die gegen das TCR-Peptid induziert und mit dem Diabetes assoziiert
sind, zeigen ähnliche
prophylaktische und therapeutische Wirkungen gegen die Krankheitsinduktion. Eine
erfolgreiche Behandlung durch polyklonale Antikörper, mAb, chimere Antikörper und
Immunotoxin-konjugierte Antikörper
wird erreicht.
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Beispiel IX
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Behandlung
von experimenteller Autoimmunencephalomyelitis mit dem V-Region-Peptid
des T-Zell-Rezeptors
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Die
Immunisierung von Ratten und Mäusen
mit dem Myelinbasisprotein (MBP) induziert encephalitogene T-Zellen, die ein begrenztes
Repertoire der T-Zellgene für die
Rezeptor-V-Region exprimieren. Die vorausgehenden Beispiele demonstrieren,
dass ein synthetisches Peptid aus der Vβ8-Sequenz von den meisten encephalitogenen
T-Zell-Klonen der
Ratten geteilt wird und dass dieses einen Schutz gegen EAE induziert, indem
spezielle regulatorische T-Zellen und Antikörper stimuliert werden. Bei
dem vorliegenden Beispiel wird gezeigt, dass dasselbe TCR-Peptid,
das den Bausteinen 39–59
der Vβ8-Sequenz
entspricht und den zweiten Komplementaritäts-bestimmenden Abschnitt enthält, als
Therapie bei EAE sehr wirksam ist.
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Wenn
das TCR Vβ8-(39–59)-Peptid
in vollständigem
Freund'schen Adjuvants
Ratten mit moderater EAE verabreicht wird, hemmt es den Fortschritt
der Krankheit und verkürzt
deutlich den Krankheitsverlauf. Wenn das TCR-Peptid i.d. in das Ohr gegeben wird,
wurden die Wirkungen um 1 Tag verzögert, führten jedoch wiederum zu einer
schnelleren Auflösung
der klinischen Anzeichen. MBP-selektierte T-Zell-Linien aus den
behandelten Ratten reagierten mäßig auf
das MBP, behielten jedoch ihre Reaktionsfähigkeit gegenüber dem TCR-Peptid
und war nicht auf normale Rezipienten übertragbar. Der schnelle klinische
Effekt des TCR-Peptids legt es nahe, dass ein vorher existierende
regulatorisches Netzwerk ausgelöst
wird, das als Antwort auf die EAE-Entwicklung aufgeweckt wird. Als
Stütze
für dieses
Konzept wird in diesem Beispiel für die T-Zell-Erkennung des TCR-Peptids
bei unbehandelten Ratten, die an EAE erkranken, der direkte Beweis
geliefert.
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A. Materialien und Verfahren
-
Tiere:
Lewis-Rattenweibchen, 6–8
Wochen alt, wurden von Harlan Sprague Dawley (Indianapolis, IN) bezogen.
Die Ratten wurden bei der Portland VAMC Animal Resource Faci lity
entsprechend den Federal and Institutional guidelines untergebracht
und gehalten.
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Antigene:
GP- oder Rt-MBP wurde entsprechend dem Verfahren nach Eylar, (Eylar,
E.H., et al., J. Biol. Chem. 246:5770 (1971)) extrahiert und gereinigt.
Enzymrestriktionsfragmente von GP-MBP, die die Bausteine 1–37, 43–89 und
90–169
enthalten, ein synthetisches Peptid von GP-MBP entsprechend den
Bausteinen 72–89
und die synthetischen Peptide entsprechend den Bausteinen 39–59 von
TCR Vβ8
und TCR Vβ14
wurden, wie vorstehend beschrieben, synthetisiert und gereinigt
(Vandenbark, A. A., et al., Nature 341:541 (1989), Eylar, E. H.,
et al., J. Biol. Chem. 246:5770 (1971)). Diese Peptide waren zufolge
Hochdruckflüssigkeitschromatographieanalyse
zu mehr als 90% rein.
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Klinische
Protokolle: Bei allen Experimenten wurde EAE durch eine einzige
subkutane (s.c.)-Injektion von 50 μg GP-MBP in vollständigen Freund'schen Adjuvant mit
100 μg wärmegetöteten M.
Tuberculosis H37RA (DIFCO, Detroit, MI) in einen hinteren Fußballen
induziert. Bei dem Präventionsprotokoll
wurden Ratten 40 Tage vor der EAE-Induzierung 100 μg TCR Vβ8-(39–59) oder
TCR Vβ14-(39–59) in
CFA mit 100 μg
M. Tuberculosis in einen hinteren Fußballen s.c. injiziert. Bei
dem Suppressionsprotokollen wurden die TCR-Peptide gleichzeitig
(100 μg
s.c. in CFA oder 50 μg
i.d. in 0,1 ml physiologischer Kochsalzlösung im Ohr), 7 Tage nach (i.d.)
oder 11 Tage (i.d.) nach der Abfrage mit GP-MBP injiziert. Bei den
Behandlungsprotokollen wurden die TCR-Peptide entweder s.c. in CFA
oder i.d. in das Ohr am ersten Tage verabreicht, an dem klinische
Anzeichen von EAE zu erkennen waren (üblicherweise 12 Tage nach der
Abfrage mit GP-MBP). Die Tiere wurden täglich hinsichtlich der klinischen
Anzeichen von EAE mit Punkten bewertet, wobei eine Bewertungsskala
von 0–4
verwendet wurde, bei der 0 = keine Anzeichen, 1 = kraftloser Schwanz,
2 = Hinterbeinschwäche,
Ataxie, 3 = Paralyse des hinteren Viertels, 4 = Paralyse des vorderen
und hinteren Viertels, sterbend. Die behandelten Gruppen wurden
mit Kontrollgruppen hinsichtlich der Unterschiede der maximalen
Schwere der Krankheit und der Dauer der klinischen Anzeichen mittels
des Student's ungepaarten
t-Test verglichen. Hypsersensivitätsreaktionen des verzögerten Typs
wurden mittels des Ohrschwellungstests 24 und 48 Stunden nach der
i.d.-Injektion von 50 g Antigen gemessen (Offner, H., et al., J.
Exper, Med. 170:355 (1989)). Aus den TCR-Peptid behandelten und
unbehandelten Ratten wurden, wie oben beschrieben, GP-MBP-spezifische
T-Zell-Linien selektiert (Vandenbark, A. A., et al., J. Immunol.
135:223 (1985)). Zehn Millionen GP-MBP-aktivierte, zu einer Linie
gehörende
Zellen wurden i.p. in naive Ratten übertragen, um die encephalitogene
Aktivität
zu testen und sie wurden nach Punkten hinsichtlich der aktiv induzierten
EAE, wie oben beschrieben, bewertet.
-
Lymphozytenproliferation:
Die Aktivierung von T-Zellen
wurde durch 3H-Tdy-Aufnahme gemessen. 500
000 Lymphknotenzellen oder 20 000 Linienzellen wurden in Anwesenheit
von 1 Million Zellen der Thymusanhangdrüse in Kulturmedium und Antigenen
in Mikrotiter-Tüpfeln
18 Stunden inkubiert, ehe 0,5 μBq-markiertes
Thymidin zugegeben wurde. Die Zellkulturen wurden auf Glasfaserfilter
geerntet und mittels Flüssigkeitsscintillationstechniken
gezählt.
Der mittlere CPM wurde aus Dreifachkulturen berechnet. Die Standardabweichungen
(DD) von Wiederholungskulturen variierten um <10% gegenüber dem Mittelwert.
-
B. Ergebnisse
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Um
die regulatorische Wirkung der TCR-Peptide bei EAE zu evaluieren,
wurden das Vβ8-(39–39)-Peptid,
ein Kontrollpeptid Vβ14-(39–59) oder
physiologische Kochsalzlösung
vor, gleichzeitig oder nach der Injektion der encephalitogenen Emulsion,
GP-MBP/CFA injiziert. Die durchschnittlichen täglichen klinischen Bewertungspunkte
der am meisten wirksamen Prävention,
Suppression und Behandlungsprotokolle sind in den 3–5 wiedergegeben, während alle
untersuchten Gruppen in Tabelle 15 zusammengefasst sind.
-
Klinische
Wirkungen bei TCR/CFA: Die Injektion des Vβ8-(39–59)-Peptids in CFA 40 Tage
vor der Abfrage mit GP-MBP
induzierte einen vollständigen
Schutz gegen klinische EAE (3).
Die gleichzeitige Injektion des Peptids in CFA zusammen mit der
encephalitogenen Emulsion unterdrückte ferner EAE, verminderte das
Auftreten (8/13 in der behandelten Gruppe gegenüber 26/26 in der Kontrollgruppe),
verminderte die Schwere (1,3 gegenüber 3,4 Punkten) und die Dauer
(2,0 gegenüber
6,6 Tagen) der klinischen Erkrankung (3, Tabelle 15). Ratten, denen 40 Tage
zuvor oder zusammen mit der EAE-Induktion durch Vβ14-(39–59)-Peptid in CFA oder
mit CFA allein injiziert wurde, entwickelten EAE, die von den Kontrolltieren nicht
unterscheidbar war (Tabelle 15).
-
-
Um
seine therapeutischen Wirkungen zu bewerten, wurde das TCR Vβ8-(39–599-Peptid
in CFA s.c. in Ratten am ersten Tag oder beim Beginn der klinischen
Anzeichen injiziert. Zum Zeitpunkt dieser Behandlung zeigten die
Ratten eine Hinterbeinschwäche,
Ataxie und Inkontinenz (ein durchschnittlicher Wert von 1,8). Wie in 3 gezeigt, verhinderte
die Behandlung mit dem TCR-Peptid/CFA die weitere Verstärkung der
klinischen Anzeichen und verkürzte
die Dauer der EAE von 6,6 Tagen (Kontrolltiere) auf 3,5 Tage. Die
Behandlung mit TCR Vβ14-(39–59)/CFA
oder CFA alleine hatte keine Auswirkung auf die klinische EAE (Tabelle
15).
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Klinische Wirkungen des
TCR-Peptids i.d. verabreicht
-
Um
die Verwendung von CFA zu vermeiden, wurde eine Evaluation der Auswirkungen
auf EAE beim Verabreichen einer physiologischen Kochsalzlösung des
TCR-Peptides intradermal in dem Ohr durchgeführt. Wie in 4 gezeigt, hatte die i.d. Verabreichung
von 50 g des TCR-Peptids gleichzeitig mit der encephalitogenen Abfrage
(Tag 0) oder am Tag 7 oder am Tag 11 nach der Abfrage dieselben
unterdrückenden
Wirkungen auf die EAE, die Verminderung der maximalen klinischen
Schwere von 3,5 auf 1,7–1,8
und die Verkürzung
der Dauer von EAE von 6,6 Tagen auf 3–4 Tage zur Folge (Tabelle
17).
-
Wenn
das TCR-Peptid an dem Tag injiziert wurde, an dem die klinischen
Anzeichen zuerst bemerkt wurden (durchschnittlicher Score von 1,9),
wurde während
des ersten Tages keine klinische Auswirkung auf die EAE beobachtet;
jedoch wurde die Schwere der EAE während der nachfolgenden Tage
gegenüber
den Kontrolltieren (5)
deutlich vermindert. Eine Dosis von 50 μg/Ratte an TCR-Peptid verursachte
eine schnellere Auflösung
der EAE (3,1 Tag) als die niedrigere Peptiddosis von 10 μg/Ratte (4,0
Tage) verglichen mit 6,6 Tagen für
die Kontrolltiere.
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Die
schnelle Wirkung des TCR Vβ-(39–59)-Peptids
beim Auflösen
der klinischen EAE legt es nahe, dass die Behandlung mit dem Peptid
eine Erinnerungsantwort auf den TCR getriggert hat, die ursprünglich als Antwort
auf die EAE induziert wurde. Um diese Möglichkeit in vivo zu dokumentieren,
zeigten Ratten, die an EAE erkrankt oder von dieser genesen sind,
die mittels GP-MBP/CFA induziert war (ohne vorherige Exposition gegenüber dem
TCR-Peptid), eine deutliche DTH-Antwort auf das Vβ8-Peptid
(p < 0,01 verglichen
mit naiven oder CFA-immunisierten Ratten), jedoch keine Antwort
auf das Vβ14-Peptid
(Tabelle 16). Die Stärke
der Antwort auf das Vβ8-Peptid
bei Ratten, die an EAE litten, war unverständlicherweise geringer als
die Antwort in Ratten, die zuvor mit einer schützenden Menge des TCR-Peptids in CFA immunisiert
wurden (Tabelle 16).
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T-Zellantworten
in geschützten
Ratten: Um die Wirkungen der TCR Vβ8-Peptid-Therapie auf T-Zell-Antworten
zu evaluieren, wurden Lymphknotenzellen (LNC), die die Injektionsstelle
für das GP-MBP/CFA
drainieren, hinsichtlich der antigen induzierten Proliferation getestet
und sodann zu T-Zell-Linien expandiert. Wie in Tabelle 17 gezeigt,
ergaben LNC von mit TCR Vβ8-39–59 behandelten
Ratten ein hohes Maß der
Hintergrundproliferation (47 000 CPM) und ähnliche Antworten auf GP-MBP
sowie weitere Testantigene. Mit GP-MBP (MBP/1.) selektierte T-Zell-Linien
reagierten schwach auf das selektierende Antigen und überhaupt
nicht auf Rt-MBP und GP-S72–89.
Die stärkste
Antwort dieser Linie erfolgte gegen das TCR Vβ8-(39–59)-Peptid. Bei der schwachen
Erkennung von GP-MBP und der starken Antwort auf TCR war es nicht überraschend,
dass die T-Zell-Linien keine klinischen Anzeichen von EAE auf naive
Ratten (Ta belle 17) übertragen
konnte. Ein ähnliches
Muster der starken Antwort auf TCR und der schwachen Reaktionsfähigkeit mit
GP-MBP sowie anderen Antigenen wurden außerdem in der T-Zell-Linie
(Vβ8/1.)
beobachtet, die mit TCR Vβ8-(39-59) selektiert wurde
(Tabelle 17).
-
Im
Gegensatz dazu reagierten die LNC von unbehandelten, von der EAE
genesenen Ratten in vorhergesagter Weise auf GP-MBP, Rt-MBP und
GP-S72–89
(Tabelle 17). Es war jedoch unerwartet, dass diese LNC auch auf
das TCR Vβ8-(39–59)-Peptid
reagierten und zu einem geringeren Grad auf das TCR Vβ14-(39–59)-Peptid.
Bei einer Selektion mit GP-MBP
reagierte die erhaltene T-Zell-Linie stark auf MBP-Epitope und übertrug
schwere klinische EAE auf naive Rezipienten trotz einer niedrigen
Restaktivität
gegenüber dem
TCR Vβ8-Peptid
(Tabelle 17). Bei weiterer Selektion mit dem TCR Vβ8-Peptid
wurde die spezifische Antwort auf dieses TCR-Peptid verstärkt, obwohl
eine Antwort auf niedrigem Niveau gegenüber dem GP-MBP und dem 572–89 bestehen
blieb. Eine weitere Selektion mit dem TCR Vβ14-Peptid amplifizierte nur die mit Vβ14 reaktiven
T-Zellen. Somit verifizierten die Reaktionsmuster in beiden TCR-selektierten Linien
die Anwesenheit von TCR-reaktiven T-Zellen aus den LN von Ratten, die von
der EAE genesen waren.
-
-
-
Wie
in 8 gezeigt, wurden
starke DTH und Proliferationsantworten bei Tieren beobachtet, die
zuvor mit dem entsprechenden TCR-Peptiden/CFA immunisiert waren.
Mit TCR Vβ8,
jedoch nicht mit Vβ14-Peptiden präimmunisierte
Ratten waren gegenüber
einer nachfolgenden Abfrage mit GP-MBP/CFA geschützt. Signifikante DTH und starke
Proliferationsantworten auf das TCR Vβ8-Peptid wurden außerdem bei
Ratten beobachtet, die von der EAE genesen waren und die nie zuvor
mit dem synthetischen Peptid immunisiert waren, was anzeigt, dass
eine natürliche
regulatorische Antwort auf das TCR Vβ8-Peptid als Folge auf den EAE-Erkrankungsprozess
induziert wurde.
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Ein
weiteres anerkanntes Modell für
MS stellt die EAE in Mäusen
dar, die, im Gegensatz zu der EAE in Ratten, durch einen rückfallenden
klinischen Fortschritt gekennzeichnet ist. Gruppen von je sechs SJL/J-Mäusen wurde
das 139–151-Peptid
des Proteolipidapoproteins (PLP) in CFA injiziert. Am ersten Tag
des Einsetzens von klinischen Anzeichen (Tag 14) bekamen die Mäuse 50 μg eines synthetischen
Peptids entsprechend den Bausteinen 1–17 der TCR Vβ17-Sequenz
i.v., i.d. oder s.c. verabreicht. Wie in 9 gezeigt, vermindert sowohl die s.c.
als auch die i.d. Injektion des TCR-Peptids die Schwere der Erkrankung
und verkürzt die
Erkrankungsdauer während
der ersten Periode und beim Rezidiv von EAE.
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C. Diskussion
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Dieses
Beispiel demonstriert klar, dass die therapeutische Verabreichung
des TCR Vβ8-(39–59)-Peptids
bei EAE die EAE verhindern und unterdrücken kann, was mit den vorherigen
Beispielen, die die Wirksamkeit des TCR-Peptids demonstriert haben,
konsistent ist. Der schnelle klinische Effekt, ebenso wie die DTH- und
die Lymphozytenproliferationsantworten auf das TCR-Peptid zeigen
an, dass die T-Zell-Antworten
auf das TCR Vβ8-Peptid
in den an EAE leidenden Ratten bereits vorhanden war, die nie zuvor
mit dem synthetischen Peptid zu diesem Zweck immunisiert waren.
-
Eine
Präimmunisation
mit dem Vβ8-Peptid
in CFA 40 Tage vor der GP-MBP-Abfrage war das effektivste untersuchte
Protokoll (3 und Tabelle
15). Es ist ersichtlich, dass diese Zeitspanne für die Immunisation optimal
ist, um sowohl schützende
T-Zellen als auch Antikörper
gegen das TCR Vβ8-Peptid
zu induzieren. Die Injektion des TCR Vβ8-Peptids gleichzeitig mit der
GP-MBP-Abfrage war weniger schützend
als die Präimmunisation,
jedoch unterdrückte
dieses Protokoll immer noch vollständig sämtliche klinischen Anzeigen
von EAE bei mehr als 30% der Ratten (6/19) (Tabelle 15). Beim Rest
war der klinische Verlauf der EAE kürzer und milder. Die Injektion
des TCR Vβ8-Peptids nach der
GP-MBP-Abfrage, jedoch vor dem Einsetzen der klinischen EAE war
ebenfalls wirksam und unterdrückte
den Beginn der EAE bei 4 von 19 Ratten und verminderte die Schwere
der Erkrankung und die Dauer beim Rest (Tabelle 15).
-
Ein überraschender
Aspekt dieses Beispiels ist der weitgehend sofortige klinische Effekt
des TCR Vβ-Peptids,
das in kranke Tiere injiziert wurde. Alle Ratten, die die TCR-Peptid-Therapie
erhielten, genasen von der EAE schneller als die Kontrolltiere.
Bei jenen Tieren, denen TCR-Peptid
in CFA injiziert wurde, traten keine klinischen Verschlimmerungen
vor der Heilung ein. Jenen Tieren, denen das TCR-Peptid intradermal verabreicht
wurde, zeigten am ersten Tag eine Verschlechterung, genasen dann
genauso schnell wie die Ratten, denen TCR/CFA injiziert wurde. Sowohl
die 10 μg
als auch die 50 μg
Dosis des Peptids be schleunigten die Genesung, jedoch beseitigte
die höhere
Dosis die EAE einen Tag früher
als die niedrige Dosis.
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Die
TCR-Peptid-Therapie schien beim Abregulieren der T-Zell-Antworten
auf encephalitogene Determinanten von GP-MBP wirksam. Lymphknotenzellen von den
mit GP-MBP abgefragten und mit dem TCR-Peptid behandelten Ratten
zeigten eine höhere
Rate der proliferierenden Zellen, jedoch keine spezifischen BP-Antworten
(Tabelle 17). T-Zell-Linien, die mit GP-MBP selektiert wurden, proliferierten
in Anwesenheit von GP-MBP und TCR Vβ8-Peptid, jedoch nicht in Anwesenheit
von TCR Vβ14-Peptid,
was anzeigt, dass sowohl Effektor als auch regulatorische T-Zell-Spezifitäten vorhanden
sind. Dass diese Zellmischung die EAE nicht übertragen konnte, ist der anscheinenden
Dominanz der TCR Vβ8-reaktionsfähigen Zellen
(netto 49 000 CPM) gegenüber
den GP-MBP-reaktiven Zellen (nettomäßig 12 000 CPM) oder den 572-89-reaktiven
Zellen (netto 3 000 CPM) zuzurechnen. Im Gegensatz dazu haben die
LNC von aus der EAE-genesenen Ratten, die ursprünglich mit GP-MBP abgefragt,
jedoch nicht mit dem TCR Vβ8-Peptid
behandelt wurden, GP-MBP, Rt-MBP
und 572–389)
erkannt sowie zu einem geringeren Grad auch die TCR Vβ8- und die
TCR Vβ14-Peptide (Tabelle
17). Die T-Zell-Linien, die mit GP-MBP selektiert waren, waren stark
encephalitogenen, höchst
wahrscheinlich wegen der Dominanz der GP-MBP-reaktiven T-Zellen
(netto 84 000 CPM) gegenüber
den TCR Vβ-reaktiven
T-Zellen (netto 9 000 CPM). Der Fortbestand von TCR Vβ-Peptid-reaktiven
T-Zellen in Linien, die mit GP-MBP selektiert wurden, ist etwas
ungewöhnlich
insofern, als die T-Zell-Linien, die mit einem Antigen selektiert
werden, üblicherweise
die Antworten auf alle anderen Antigene verlieren. Es wurde keine
Querreaktionsfähigkeit
zwischen GP-MBP und dem TCR Vβ8-Peptid
entdeckt.
-
Lewis-Ratten
zeigten keinen spontanen Rückfall,
wenn die EAE mit MBP/CFA induziert wird. Obwohl dieser Monophasenverlauf
der EAE nicht als Test der Therapie mit TCR Vβ8-(39–59)-Peptids bei Rückfallerkrankung
gestattet, schafft es die Möglichkeit
festzustellen, ob die starken Heilungsmechanismen in diesem Stamm
die Immunantworten auf das TCR Vβ8-Peptid
beinhalten. Die T-Zellen von Lewis-Ratten, die auf die encephalitogene
Determinante (Sequenz 72–84
oder Sequenz 87–99)
von MBP reagieren, verwenden vorzugsweise die Vα2/Vβ8-Gen-Kombination in ihren TCR.
Die Injektion von lebenden oder abgeschwächten encephalitogenen T-Zellen
kann einen Schutz gegen die EAE hervorrufen, ebenso wie idiotypische
und "ergotypische" Antworten. Die zunehmende
Häufigkeit
von encephalitogenen T-Zellen, die während der die EAE induziert
wurden, haben dieselbe Wirkung und stören das regulatorische Netzwerk
und es ist überzeugend,
dass wenigstens ein Teil dieses Netzwerkes in natürlicher
Weise auf die TCR Vβ8-(39–59)-Sequenz
gerichtet ist.
-
Die
vorliegenden Daten stützen
diese Annahme. Wenn erkrankten oder genesenen Ratten das TCR Vβ-Peptid i.d.
verabreicht wurde, zeigten sie geringe, jedoch deutliche DTH-Antworten
auf dieses Peptid, jedoch keine DTH auf das entsprechende Vβ14-Peptid
(Tabelle 16). Ferner reagierten Lymphknotenzellen von genesenen
Ratten besser auf das Vβ8-TCR-Peptid und T-Zellen,
die auf eines der Peptide spezifisch waren und konnten durch in
vitro-Selektionstechniken (Tabelle 17) angereichert werden. Diese
Erkenntnisse zusammengenommen liefern den unmittelbaren Beweis für die natürliche Induktion
der Immunität
gegen die TCR Vβ8-(39-59)-Sequenz, die
durch die encephalitogenen T-Zellen exprimiert wird. Jedoch kann
dies möglicherweise
nicht die einzige wichtige Determinante auf dem TCR sein, da andere
Sequenzen innerhalb der TCR α- oder β-Ketten auch
regula torische T-Zellen und Antikörper induzieren. Der schützende,
der unterdrückende und
der therapeutische Effekt dieser TCR Vβ8-(39–59)-Region zeigt deutlich
seine Bedeutung als eine Determinante für die idiotypische Regulierung
der EAE.
-
Daten,
die für
SJL/J-Mäuse
präsentiert
wurden, die einen biphasischen klinischen Verlauf der EAE zeigten,
demonstrieren ferner, dass die Verabreichung des TCR Vβ17-Peptids beim Einsetzen
der klinischen Anzeigen die Schwere und die Dauer der Symptome sowohl
während
der ersten Phase als auch während
des Rückfalls
vermindern. Dies stellt eine zusätzliche
Stütze
für die
Bedeutung der TCR V-Region-Peptids als Werkzeug bei der Behandlung
von Autoimmunkrankheiten dar, die durch die EAE modelliert sind.
-
Beispiel X
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Spezifität von menschlichen
Z-Zell-Klonen, die mit immunodominanten Epitopen des Myelinbasisproteins
reaktionsfähig
sind
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Einleitung
-
Myelinbasisprotein
(MBP) ist stark antigen und verursacht experimentelle Autoimmunencephalomyelitis
(EAE) bei verschiedenen Tierspezien, wenn es zusammen mit Adjavantien
injiziert wird (Alvord, E.C., Jr., in Experimental Allergic Encephalomyelitis:
A useful model for multiple sclerosis, Alvord, E.C., Jr. et al.
(eds.), Alan R. Liss, Inc., New York, pp. 523–537 (1984)).
-
Die
encephalitogene Eigenschaft von MBP wird von einer diskreten Anzahl
von immunodominanten Epitopen (etwa 10) eingeschlossen. Innerhalb
jedes Stammes induzieren eines oder mehrere dieser Epitope zusammen
mit den verfügbaren
Klasse II-MHC-Molekülen
CD4+-T-Effektor-Lymphozyten, die sich auf das zentrale Nervensystem
(CNS) ausrichten, wobei sie perivaskuläre entzündlich Läsionen und Dysfunktionen der
Nerven hervorrufen (Zamvil, S.S., et al., J. Immumol. 139:1075 (1987),
Offner, H., et al., J.. Exp. Med. 170:355 (1989)).
-
Der
genetische Hintergrund, zu dem sowohl das MHC- als auch Nicht-MHC-Gene gehören, beeinflusst,
welche MBP-Epitope
encephalitogen sind (Beraud, E., et al., J. Immunol. 136:511 (1986),
Zamvil, S.S. et al., J. Exp. Med. 162:2107 (1985)), beeinflusst
den klinischen Verlauf und die Schwere der Erkrankung (Fritz, R.B.,
et al., J. Immunol. 134:2328 (1985), Hinrich, D.J., et al., J. Exp.
Med. 166:1906 (1987), Linthicum, D.S., et al., J. Exp. Med. 155:31
(1982), Diethsch, G.E., et al., J. Immunol. 142:1476 (1989), Mokhtarian,
F., et al., Nature (London) 309:356 (1984)) beeinflusst die Demyelination
(Mokhtarian, F., et al., Nature (London) 309:356 (1984)) und die
Widerstandsmechanismen (Bernard, C.C., Clin. Exp. Immunol. 29:100
(1977), Welch, A.M., et al., J. Immunol. 125:186 (1980) Varriale,
S., et al., J. Immunol. 125:186 (1989), Whitman, R.H., et al., Cell.
Immunol. 126:290) 1990)).
-
Das
Spektrum der klinischen und der histologischen Befunde, die durch
MBP-spezifische T-Zellen hervorgerufen wurden, ähneln in vieler Hinsicht den
menschlichen Erkrankungen, wie multiple Sklerose (MS) und verbreiteter
Encephalomyelitis (ADE) (Paterson, P.Y., Adv. Immunol. 5:131 (1966),
Waksman, B.H., et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 175:282 (1984)).
Dementsprechend ist die MBP-Erkennung durch menschliche T-Zellen von
besonderem Interesse.
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Es
gibt unterschiedliche Beweisführungen,
die es nahelegen, dass T-Zellen einschließlich solcher, die für menschliches
MBP spezifisch sind, an der Pathogenese von MS beteiligt sind. Genetische
Studien zeigen ein Verknüpfungsungleichgewicht
zwischen den Genen für
die V- und C-Regionen
der T-Zell-Rezeptoren innerhalb der Familien mit MS (Hauser, S.L.,
et al., Neurology 39:275 (1989), Beall, S.S., et al., J. Cell. Biochem. 11D:223
(1987)) oder unter Patienten insgesamt (Oksenberg, J.R., et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:988 (1989)). Jedoch kann die tatsächliche
Beteiligung von T-Zellen, die mit MBP reaktivfähig sind, an der Pathogenese
von MS nur demonstriert werden, wenn die selektive Regulierung oder
die Beseitigung der mit MBP-reaktiven T-Zellen den Krankheitsprozess
beeinflussen kann. Eine solche selektive Regulation ist nun bei
EAE möglich.
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Bei
diesem Beispiel wurde ein synthetisches TCR-Peptid verwendet, um regulatorische
T-Zellen und Antikörper
zu induzieren, die gegen den TCR auf den zerstörerischen- T-Zellen gerichtet
sind. Diese Lösung verhindert
die Induzierung von EAE. Wie bei dem vorherigen Beispiel demonstriert,
stoppte die Verabreichung des TCR-Peptids an klinisch erkrankte
Ratten den Krankheitsverlauf und beschleunigte die Heilung. Die
Anwendung dieser Lösung
zur Regulierung potenziell encephalitogener T-Zellen bei MS-Patienten hängt davon ab,
ob MBP-reaktive T-Zellen vorzugsweise eine begrenzte Anzahl der
Gene für
die TCR- V-Region
in Abhängigkeit
von den immunodominanten Epitopen von menschlichem MBP verwenden.
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Zu
diesem Zweck wurden T-Zell-Linien von MS-Patienten und Kontrollpersonen
in einer Weise gesammelt, die das Hervortreten von T-Zellen gestattete,
die immunodominante MBP-Epitope erkennen. Aus diesen Linien wurden
109 T-Zell-Klone,
die MBP-spezifisch sind, isoliert und hinsichtlich des Phenotyps,
der Spezifität des
Epitops, der MHC-Restriktion und dem Exprimieren des TCR-V-Gens
charakterisiert. Diese Daten zeigen auf der Ebene des Klons, dass
T-Zellen von MS-Patienten
mehr und andere MBP-Epitope erkennen als dies die T-Zellen von normalen
Spendern tun. Ferner haben bei einem MS-Spender mit dem Krankheits-assoziierten HLA-DR2/DQwl-Haplotyp
4 von 8 untersuchten T-Zell-Klonen
den Vβ5.2-Phenotyp
exprimiert, was die bevorzugte TCR V-Genverwendung in der Antwort
auf MBP anzeigt.
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A. Materialien und Verfahren
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Menschliche
Probanden: Zu den in dieser Studie bewerteten MS-Patienten gehörten 11
Patienten mit einer klinisch- oder labormäßig gestützten MS, die durch die Oregon
Health Sciences University MS-Klinik betreut wurden. Unter ihnen
waren 7 Frauen und 5 Männer
(Durchschnittsalter 46, bei einem Bereich zwischen 34–67 Jahren),
die an MS zwischen 6–35
Jahren litten. Die Patienten hatten einen durchschnittlichen Ambulation-Index
(AI) von 3,4 ±1,6
(Bereich 1–6)
und einen Kurtzke-Score für
die Behinderung (KDSS) von 4,3 ±2,0 (Bereich 2–4) (Kurtzke,
J.F., Neurology 15:654 (1965)).
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Zu
den normalen Personen gehörten
6 weibliche und 3 männliche
Angestellte (Durchschnittsalter 36, Alter zwischen 25–55 Jahre)
des Veterans Affairs Medical Center und der Oregon Health Science
University. Diese normalen Personen wurden auf der Basis der positiven
PBL-Proliferationsantwort auf menschliches MBP selektiert, wie dies
oben beschrieben ist (Vandenbark, A.A., et al., J. Neurosci. Res.
23:21 (1989)).
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Alle
Personen waren HLA-Typen, wie sich aus T-Zell- Linienselektion mittels standardmäßiger sereologischer
Verfahren erwies, die durch das Oregon Health Sciences University
Transplantation Laboratory verwendet wurden. Die Häufigkeit
der HLA-Klasse II-Allele (DR,DQ) zeigte eine ungleichmäßige Verteilung
für DR2
(7 von 11 Patienten waren DR2 positiv, entsprechend 63%; 3 von 9
Normalen waren DR2 positiv, entsprechend 33%), was im Allgemeinen
dem erwarteten Auftreten für
diese zwei Gruppen entspricht (Theofilopoulos, A.N., in Basic and
Clinical Immunology, Stites, D.P., et al., (eds.), Appleton and
Lange Publishers, Los Altos, CA, pp. 151–154 (1987)).
-
Antigene:
Menschliches (Hu-) MBP wurde aus schockgefrorenem menschlichen Gehirn
extrahiert und gereinigt (Eylar, E.H., et al., Arch. Biochem. Biophys.
132:34 (1969)). Durch Spalten mittels Peptid und Reinigen mittels
Sephadex, Ionenaustauschchromatographie sowie Hochdruckflüssigkeitschromatographie
(Chou, C.H.-J., et al., J. Neurochem. 28:115 (1977)) wurden Peptide
von Hu-MBP einschließlich
P1 (Bausteine 45–89),
P2 (Bausteine 1–38)
und P4 (Bausteine 90–170)
erhalten. Eine Serie von synthetischen Peptiden entsprechend den
Hu-MBP-Sequenzen 13–28,
39–54,
55–74,
72–84,
87–99,
90–109,
110–129,
130–149
und 149–170
wurde mittels der Merrifield Fest-Phasen-Methode synthetisiert und
mittels HPLC entsprechend dem oben beschriebenen Verfahren gereinigt
(Hashim, G.A., et al., J. Neurosci. Res. 16:467 (1986)).
-
T-Zell-Linien:
Menschliche T-Zellen, die mit MBP reaktionsfähig waren, wurden aus dem Blut
von 11 MS-Patienten und 9 normalen Personen selektiert, die in vorherigen
Screening-Tests Antworten auf Hu-MBP zeigten (Vandenbark, A.A.,
et al., J. Neurosci. Res. 23:21 (1989)). Mononukleare Blutzellen
(MNC) wurden mittels Ficoll-Dichtegradienten-Zentrifugierung abgetrennt
und in vollständi gem
Medium (RPMI 1640 mit 10% menschlichem AB-Serum, L-Glutamin, Natriumpyruvat
und Antibiotika) mit 50 μg/ml
Hu-MBP bei einer
Zelldichte von 5×105 pro Tüpfel
einer flachbödigen
96-Tüpfelplatte
5 Tage lang bei 37°C
in einer 5%-igen
CO2 Atmosphäre kultiviert. Die stimulierten
Zellen wurden in ein IL-2-reiches Medium übertragen (es enthielt 50 μg/ml rekombinantes
IL-2, AMGEN Biologicals, Thousand Oaks, CA), um die aktiven Zellen
zu expandieren. Sobald sich das Wachstum in dem IL-2 verlangsamte,
wurden die T-Zellen
mit 25 μg/ml
Hu-MBP erneut stimuliert, das durch autologe Monozyten präsentiert
wurde, die in bestrahlten peripheren Blut MNC (4 500 rad) in einem
Verhältnis
von 1:10 (T:MNC) erhalten waren. Die T-Zell-Linien wurden 4–5 Mal erneut
stimuliert, bis die Zellanzahl ausreichte, um die MBP-Epitopspezifität, die MHC-Restriktion
und den Phenotyp zu untersuchen.
-
Klonen
der T-Zellen: Durch beschränkte
Verdünnung
von MBP-spezifischen T-Zell-Linien, die zwei Mal mit Hu-MBP restimuliert
wurden, wurden T-Zell-Klone erhalten. Nach 4 Tagen in IL-2-angereichertem
Medium wurden die T-Lymphoblasten auf 1, 10 bzw. 30 Zellen/20 μl Kulturmedium
verdünnt,
das Hu-MBP (50 μg/ml), IL-2
(50 μg/ml)
und bestrahltes MNC (1,5 × 106) enthält,
wobei jede Zellmischung in einen Tüpfel einer 60 Tüpfel enthaltenden
Tarasaki Microtest Schale verteilt wurde (NUNC Inc., Naperville,
IL) (Lamb. J.R., et al., J. Immunol. 128:233 (1982)). Die Rückgewinnung
von menschlichen MBP-spezifischem Klonen war besonders effizient,
wenn wenigstens 10 Hu-MBP-reaktive Zellen einer Linie pro Tüpfel ausgesät wurde,
was eine 20%-ige Rückgewinnungsrate
hervorrief. Wenn nur eine Linienzelle pro Tüpfel ausgesät wurde, betrug die Wiedergewinnungsrate
2%. Hu-MBP-reaktive T-Zellen wurden durch Säen von einer Zelle/Tüpfel erneut
geklont. Die Tarasaki-Schalen wurden bei 37°C und 5% CO2 7
Tage lang inkubiert. Zum Restimulieren wurden die Zellen aus jedem
positiven Tüpfel
in einen einzigen Tüpfel
einer 96 Tüpfelplatte
mit runden Böden übertragen,
wobei 200 μl
des kompletten Mediums mit 25 μg/ml
Hu-MBP und 2×105 bestrahlte MNC zugegeben wurden. Zu den
Zellen wurden 50 μg/ml
von IL-2 zu den Zellen am dritten Tag nach der Stimulation hinzugefügt und die
Zellen wurden weitere vier Tage lang in IL-2 gehalten. Sobald die
Zellenzahl 2–4×105 erreicht hatte, wurden die Kulturen in
eine 24 Tüpfelplatte
in 1 ml überführt und
mit Hu-MBP in Anwesenheit von 3×106 autologen bestrahlten MNC restimuliert,
worauf sie dann in 2ml IL-2-reichem
Medium vermehrt wurden.
-
Proliferationsuntersuchung:
Die Spezifität
der Zellantwort wurde bewerten, indem 2×104-T-Zellen
mit 1×105 bestrahlten (4 500 rad) autologem Blut-MNC
in 0,2 ml Dreifachkulturen in einer 96 Mikrotiter Tüpfelplatte mit
runden Böden
inkubiert wurden, wobei Antigene gefehlt haben und 2 μg/ml Con
A, 50 μg/ml
Hu-MBP, 50 μg/ml
Hu-MBP-MBP-Fragmente
(P1, P2 und P4), 50 μg/ml
synthetischer Peptide von Hu-MBP und 1/200 verdünntes Antigen von Herpes Simplex-Virus
(HSV) (Whittaker M.A. Bioproducts, Walkersville, MD) anwesend war.
Die Mikrotiterkulturen wurden 3 Tage lang bei 37°C und 5% CO2 inkubiert
und mit 0,5 μBq 3H-TdR
wenigstens 18 Stunden lang gepulst. Die Zellen wurden auf Glasfaserfilter
geerntet und es wurde die 3H-TdR-Aufnahme
unter Verwendung eines β-Scintillationszählers gezählt. Die
Proliferation wurde als CPM der stimulierten Kulturen ±SD ausgedrückt (Hintergrund
abgezogen). Das Hintergrundsignal bewegte sich zwischen 299 und 2
000 CPM. Die MHC-Restriktion wurde bewertet, indem die T-Zellen
mit Hu-MBP, Hu-MBP-Fragmenten oder synthetischen Peptiden von Hu-MBP
in Anwesenheit von Antikörpern
inkubiert wurden, die für
die Netzwerkdeterminanten von Molekülen aus dem HLA-DP, –DQ oder
-DR-Locus spezifisch waren (die Antikörper wurden bei Becton Dickinson
Pharmaceuticals, Mountain View, CA). gekauft.
-
Bestimmung
des Phenotyps der T-Zellen: Die T-Zell-Linien und -Klone wurden hinsichtlich
des Phenotyps unter Verwendung von Leu 3a (Anti-CD4+ T-Helfer) und
Leu 2a (Anti-CD8+ T zytotoxisch/Suppressor) monoklonaler Antikörper (Becton
Dickinson), wie oben beschrieben, untersucht (Vandenbark, A.A.,
et al., in J. Neuroimmunol. 8:103 (1985)). Die T-Zell-Klone wurden
hinsichtlich dem Exprimieren der TCR Vβ-Ketten-Genprodukte phenotypisch
untersucht, wobei monoklonale Mäuse-Antikörper verwendet
wurden, die für
TCR Vβ5.2/5.3
(5A), Vβ5.3
(5B), Vβ6.7,
Vβ8.1 und
Vβ12 spezifisch
waren (DIVERSI-Tm aβ TcR-Screening Panel 1A, T Cell
Sciences Inc., Cambridge, MA). 2×105 T-Zellen wurden mit
5 μl jedes
Antikörpers
1 Stunde lang bei 4°C
inkubiert, anschließend
3 Mal mit Medium gewaschen, das 5% menschliches AB-Serum enthielt,
und daraufhin mit FITC-konjugierten
Ziegen-Anti-Maus IgG 30 min lang inkubiert. Nachdem 2 Mal gewaschen
und mit 2% Formaldehyd fixiert wurde, wurden die gefärbten Zellen
unter Verwendung eines FACScan-Strömungszytometers hinsichtlich
der Immunofluoreszenz bewertet.
-
B. Ergebnisse
-
Kennzeichnung
der Hu-MBP-spezifischen T-Zell-Linien von MS-Patienten und Normalen.
Aus dem Blut von 11 Patienten mit MS und 9 normalen Spendern mit
den zuvor erläuterten
Proliferationsantworten auf Hu-MBP wurden Hu-MBP-spezifische T-Zell-Linien selektiert.
Jede Linie wurde aus 30–50
Millionen Blutzellen durch wiederholte Stimulation mit vollem Hu-MBP
selektiert und mit IL-2 expandiert.
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Aufgrund
der vorherigen Erfahrung beim Selektieren von T-Zell-Linien von Nagetieren sollten diese Bedingungen
die Expansion und die Fokussierung der repräsentativen T-Zell-Antworten auf die
immunodominanten Hu-MBP-Epitope gestatten.
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Die
T-Zell-Linien von MS-Patienten und normalen Spendern antworteten
gleich gut sowohl auf das Hu-MBP als auch auf das Con A bei vernachlässigbaren
Antworten auf die HSV-Antigene (6).
Die T-Zell-Linien wurden hinsichtlich ihrer Antwort auf hoch-gereinigte
Enzymspaltprodukte untersucht, die die gesamte Sequenz von Hu-MBP
einschließlich
P1 (Bausteine 45–89),
P2 (Bausteine 1–38)
und P4 (Bausteine 90–170) überspannten.
8 von 11 MS-Linien reagierten auf alle drei Hu-MBP-Fragmente, 2
reagierten auf 2 von 3 Fragmenten und nur 1 Linie reagierte auf
ein einziges Fragment. Im Gegensatz dazu haben 5 von 9 normalen Linien
auf ein einziges Fragment, 3 Linien auf alle Fragmente und 1 Linie
auf überhaupt
kein Fragment reagiert. Die Rate derjenigen, die auf das 45–89-Fragment
geantwortet hat, war in der MS-Gruppe deutlich größer als bei
den Kontrollpersonen, im Durchschnitt waren die MS-T-Zell-Linien signifikant
stärker
reaktionsfähig
sowohl gegenüber
dem 45–89-Fragment
(P1) als auch dem 1–38-Fragment
(P2) von Hu-MBP (6).
Jedoch gab es keine Unterschiede in der Häufigkeit und der Stärke der
Antwort auf das 90–170-Fragment
(P4). Alle menschlichen T-Zell-Linien wiesen eine gemischten Phenotyp
von CD4+-T-Zellen und CD8+-T-Zellen auf. Jedoch enthielten die T-Zell-Linien
von MS-Patienten eine verhältnismäßig höhere Rate
von CD4+ Subpopulationen und eine niedrige Rate CD8+Subpopulationen
auf, verglichen mit normalen Spendern (78 ±13% gegenüber 58 ±8% bei CD4+-Zellen; 15 ±6% gegenüber 30 ±12% bei
CD8+-Zellen, Tabelle
18).
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Selektion
und Charakterisierung der Hu-MBP-spezifischen T-Zell-Klone: Obwohl
der Gesamtbereich der immunodominaten T-Zell-Epitope auf dem Hu-MBP
aus dem Reaktionsmuster der T-Zell-Linien gegen die Hu-MBP-Peptide
geschlossen werden kann, muss der Beweis der T-Zell-Erkennung aus
der Analyse der Klone abgeleitet werden. Zu diesem Zweck wurden
insgesamt 109 menschliche MBP-spezifische T-Zell-Klone von 7 MS-T-Zell-Linien
(50 Klone) und 6 normale T-Zell-Linien (59 Klone) hinsichtlich ihrer
Antwort auf Hu-MBP und Hu-MBP-Fragmente sowie synthetische Peptide
bewertet. Die T-Zell-Linien der Spender waren mit Ausnahme der HLA-DR2-Verteilung
vergleichbar (86% der MS-Patienten
gegenüber
33% der normalen Spender waren DR2-positiv; siehe Tabelle 19).
-
Sämtliche
T-Zell-Klone reagierten auf Hu-MBP, jedoch nicht auf das Antigen
von Herpes simplex-Virus (HSV) bei ähnlichen Antwortwerten in beiden
Gruppen. Insgesamt konnten 48 T-Zell-Klone als für CD4- und CDB-Marker phenotypisch
bestimmt werden (gleichmäßig zwischen
den Gruppen verteilt). Von diesen waren 45 Klone CD4+ und 3 (von
einem normalen Spender) CD8+ (Tabelle 18). Diese Dominanz der CD4+-Klone war
aufgrund der vorherigen Erfahrungen bei Ratten und Mäusen zu
erwarten, selektierte jedoch nicht den relativen Anteil dieser Untergruppen
in den T-Zell-Linien,
aus denen die Klone abgeleitet waren (Tabelle 18).
-
Klonabhängige Spezifitäten reflektieren
das Muster der T-Zell-Linienantworten. Um die Gültigkeit der Klonanalyse abzusichern,
ist es wichtig zu bewerten, wie gut die Kloneigenschaften der T-Zellen
die Antworten der T-Zell-Linien
repräsentieren.
Bei den Linien, die zum Vergleich ausreichend Klone hervorbrachten,
zeigte die Anzahl der Klone, die spezifisch auf ein bestimmtes Fragment
von MBP reagierten, eine signifikante Korrelation mit der Direktantwort
auf das Hu-MBP-Fragment der elterlichen T-Zell-Linie (gepaarter ξ2-Test,
p < 0,05).
-
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-
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Repräsentative
Vergleiche zwischen 3 MS-Patienten und 2 normalen Spendern sind
in 7 gezeigt. Ausgehend
von dem Muster der Antworten der T-Zell-Linien wurde erwartet, dass
mehr Klone, die mit P1 und P2 reagieren, aus den MS-T-Zell-Linien selektierbar
wären als
aus den Kontroll-Linien,
jedoch die Häufigkeit der
mit P4 reagierenden Klone verhältnismäßig gleich
wäre. Dies
war in der Tat der Fall, wie in Tabelle 19 gezeigt. Unerwarteterweise
haben jedoch 46 der insgesamt 109 MBP-reaktiven T-Zell-Klone nicht
auf ein einziges Fragment von Hu-MBP reagiert, obwohl die Antwort
auf Hu-MBP gewaltig war und zwischen 10 000 und 27 000 cpm rangierte
bei nur 1 000 – 2
000 cpm-Hintergrundsignal.
Dieses Ergebnis war in der normalen Gruppe wesentlich häufiger als
in der MS-Gruppe, und zwar weitgehend aufgrund des einzigen normalen
Spenders (Tabelle 19).
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Verschobene
klonale Spezifität
innerhalb von P4. Obwohl die P4-Region des Hu-MBP die C-Terminal-Hälfte des
Moleküls
darstellt, haben näherungsweise
2/3 (41 von 63) der Klone, die mit den Hu-MBP-Peptiden reaktiv sind,
auf dieses Fragment reagiert. Um die Epitopspezifitäten zu identifizieren,
wurden 23 dieser Klone von 4 normalen Spendern und 4 MS-Patienten
in einem Proliferations-Test untersucht, bei dem gegen eine Serie
von synthetischen Peptiden getestet wurde, die unterschiedlichen
Abschnitten der P4-Region entsprechen. Wie in Tabelle 20 gezeigt,
war die klonale Verteilung bei den normalen Spendern in Richtung
auf die 120–129-
Sequenz verschoben und bei den MS-Spendern in Richtung auf die 130–149-Sequenz.
In beiden Gruppen waren die Antworten auf die 149–171-Sequenz ähnlich und
nur der MS-Klon reagierte auf die 87–99-Sequenz (Tabelle 20).
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HLA–DR2 ist
zur Restriktion von Hu-MBP-Mehrfachepito pe in der Lage Die Assoziation
des HLA-DR2/pQwl Haplotyps mit MS legt es nahe, dass diese Klasse
II-Moleküle,
insbesondere DR2, eine kritische Rolle bei der Restriktion der CD+-T-Zell-Antworten
auf die CNS-Autoantigene spielen könnte. Zu diesem Zweck wurden
die Hu-MBP-Epitope, die durch 17 T-Zell-Klone von 3 HLA-DR2/DQwl-Spendern
erkannt wurden, in Tabelle 21 zusammengefasst. Dieser Satz von T-Zell-Klonen erkannte
insgesamt P2 (3 Klone), P1 (1 Klon), P4 (8 Klone) oder kein Peptid
(5 Klone). Innerhalb von P4 erkannte 1 MS-Klon das 87–99 Epitop,
1 normaler Klon erkannte das 110–129 Epitop, 1 MS-Klon erkannte
das 130-149 Epitop
und 4 Klone (3 MA und 1 normaler) erkannten das 149–171 Epitop.
Bei 7 von 7 P4-reaktiven Klonen, die untersucht wurden, wurden die Antworten
mittels Anti-HLA-DR-Antikörpern inhibiert,
was klar DR2 als Restriktionselement (Tabelle 21) impliziert. Da
der DR-Locus überwiegend
bei der Beschränkung
der menschlichen T-Zell-Antworten
auf MBP verwendet wird, ist es wahrscheinlich, dass die Mehrheit
der 10 nicht getesteten Klone auf DR2 beschränkt ist. In jedem Falle ist
es klar, dass DR2 eine große
Varietät
von Hu-MBP-Epitopen beim Menschen beschränken kann.
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Verwendung
des TCR Vβ-Gens
durch die Hu-MBP-reaktiven T-Zell-Klone. Die bevorzugte Verwendung
der TCR Vα-
und Vβ-Gen-Familien
durch encephalitogene MBP-spezifische T-Zellen aus Ratten und Mäusen führt zu einer
erfolgreichen Impfung und erfolgreichen therapeutischen Strategien,
die gegen gewöhnliche
TCR-Sequenzen auf den zerstörerischen
T-Zellen gerichtet
sind. Es ist jedoch unbekannt, ob ein ähnlicher Mechanismus beim Menschen
zu der beschränkten
Verwendung der TCR V-Gene bei der Antwort auf MBP oder andere Antigene
führt.
Zu Beginn der Analyse der Verwendung des TCR V-Gens wurden 38 T-Zell-Klone
(19 von jeder
Gruppe)
hinsichtlich der Exprimierung von Vβ-Gen-Produkten unter Verwendung
eines Panels von 5 monoklonalen Antikörpern für Vβ5.2, Vβ5.3, Vβ6.7, Vβ8.1 und Vβ12 (Tabelle 22) spezifisch sind,
hinsichtlich des Phenotyps festgelegt. Die TCR V-Gen-Exprimierung
konnte bei sechs Klonen von allen MS-Spendern positiv festgestellt
werden: Zwei von diesen Klonen expremierten Vβ6.7, während die anderen 4 Klone Vβ5.2 exprimierten.
Von den Vβ5.2+-Klonen
stammt der eine von einem DR2,4 Spender und 3 von einem DR2 homozygoten Spender.
Ein zusätzlicher
Klon von dem DR2 homozygoten Spender exprimierte eine umarrangierte
mRNA für Vβ5.2, was
anzeigt, dass bei dieser Person 4/8 analysierte Klone dasselbe TCR
Vβ-Gen bei
der Antwort auf Hu-MBP verwendet, obwohl jeder eine bestimmte Epitopspezifität aufweist
(Tabelle 22).
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C. Diskussion
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Dieses
Beispiel demonstriert klar auf der Klonebene, dass MS-Patienten
ein komplexeres und geändertes
T-Zell-Erkennungsmuster
für immunodominante
Hu-MBP-Epitope haben, als dies für
normal reagierende Hu-MBP Personen gilt. Diese Daten legen eine
verstärkte
Exposition gegenüber
immunogenen Formen von Hu-MBP bei MS-Patienten dar, wodurch die
Wahrscheinlichkeit erhöht
wird, dass encephalitogene T-Zellen einmal induziert immerwährend fortbestehen.
Die potenzielle Bedeutung der T-Zell-Erkennung von Hu-MBP unter
paralytischen Bedingungen beim Menschen, beispielsweise MS muss
im Licht der potenten encephalitogenen Funktion von MBP-reaktiven
T-Zellen bei Tieren gesehen werden und der zunehmenden Häufigkeit von
aktivierten MBP-reaktiven T-Zellen im Blut und der CSF von MS-Patienten (Allegretta,
M., et al., Science 247:718 (1990), Link H., et al., Neurology 40(Suppl.
1):283 (1990)).
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Die
in dieser Studie evaluierten T-Zell-Klone wurden aus Hu-MBP-spezifischen
T-Zell-Linien isoliert, die in vitro selektiert waren, um das Auftauchen
von Spezifitäten
zu ermöglichen,
die gegen immunodominante Hu-MBP-Epitope gerichtet sind. Encephalitogene
Determinanten zeigen eine Immunodominanz während der Selektion bei den
T-Zell-Linien von Ratten und Mäusen
mittels des vollen MBP (Bourdette, D., et al., Cell. Immunol. 112:351
(1988), Vandenbark, A.A., et al., J.
Immunol. 135:229 (1985)), wobei es wahrscheinlich ist, dass die
T-Zellen für
immunodominante Hu-MBP-Determinanten
unter günstigen
Bedingungen auch encephalitogen sein können. In dieser Studie zeigten
die immunodominanten Epitope, die von T-Zell-Linien- Antworten abgeleitet
wurden, eine signifikante Korrelation mit den Spezifitäten, die
durch Klonanalyse identifiziert wurden (7).
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Diese
Ergebnisse führen
dazu, dass die Schlüsse
gültig
werden, die aus den Liniendaten hinsichtlich der Spezifität abgeleitet
wurden und dokumentieren, dass die Klone, die in der Selektionsprozedur überlebten, für die T-Zell-Population,
die auf Hu-MBP reagierte, innerhalb der Linien repräsentativ
waren.
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Jedoch
war der Phenotyp der Klone einheitlich CD4+ (mit der Ausnahme von
3 Klonen von einem einzigen normalen Spender), obwohl sämtliche
T-Zell-Linien im Wesentlichen gleiche Werte an CD8+-T-Zellen enthielten.
Es ist nicht klar, ob diese CD8+-T-Zellen innerhalb der Linien Hu-MBP-spezifisch sind oder
ob sie einfach nur durch die verhältnismäßig hohen Werte des den Kulturen
zugegebenen IL-2 in die Linien eingeführt wurden. Jedoch war ersichtlich,
dass die normalen T-Zell-Linien durchgehend einen höheren Anteil
von CD8+-Zellen enthielten als die MS-Linien. Es ist interessant
und möglicherweise
für die
Regulierung der T-Zell-Funktion von Bedeutung, dass einer der CD8+-Klone
die MBP-induzierte Proliferation eines CD4+-Klons von demselben
normalen Spender inhibieren konnte. Solche regulatorischen CD8+-T-Zellen könnten, wenn
sie in erhöhter
Anzahl in vivo vorhanden sind, zu dem Ausbleiben der klinischen
Erkrankung bei normalen Personen mit Hu-MBP-reaktiven T-Zellen beitragen. Ein kritischer
Wert dieser CD8+-T-Zellen in Verbindung mit erhöhten Werten der zugehörigen Suppressorzellen
(ähnlich
jenen, wie sie in Mäusen
beobachtet wurden) (Whitham, R.H., et al., Cell. Immunol. 126:290
(1990) könnte
zu der Unfähigkeit
beitragen, Hu-MBP-spezifische T-Zell-Linien von nicht mehr als 60%
der normalen Spender zu selektieren (Vandenbark, A.A., et al., J.
Neurosci. Res. 23:21 (1989)).
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Im
Gegensatz dazu können
T-Zell-Linien von mehr als 80% der MS-Patienten selektiert werden.
Von diesen regulatorischen Zelltypen würde nicht erwartet werden,
dass sie die Wirksamkeit der Rückgewinnung der
MBP-spezifischen T-Zell-Klone
beeinflussen, indem die Verdünnung
unmittelbar aus dem Blut ohne vorhergehende Linienselektion beschränkt wird,
wie dies von anderen berichtet wird (Hafler, D.A., et al. J. Immunol.
139:68 (1987), Richert, J.R., et al., J. Neuroimmunol. 23:55 (1989),
Richert, J.R., et al., Ann. Neurol. 26:342 (1989)).
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Die
T-Zell-Antworten auf Hu-MBP bei MS-Patienten beinhaltet einen weiteren
Bereich von Spezifitäten als
die Antworten bei normalen Personen (6).
Zusätzlich
zu den gemeinsamen Epitopen zeigten die T-Zellen von MS-Patienten eine Antwort,
die zu der N-terminalen Hälfte
von MBP und wenigstens einem Epitop in der C-terminalen Hälfte des
Moleküls
verschoben ist. Der am besten konsistente Unterschied in der Antwort zwischen
MS- und normalen Spendern bestand in dem P1 (Baustein 45–89). Frühere Studien
haben gezeigt, dass bei MS in der cerebrospinalen Flüssigkeit
(CSF) immunoreaktive Fragmente von Hu-MBP ähnlichem Material vorhanden
sind, wobei die dominante antigene Form, die Baustein 45–89 überspannt
(Whitaker, J.N., J. Immunol. 129:2729 (1982)). Die erkennbare Konzentration
dieses Fragmentes stieg nach einer Verletzung des zentralen Nervensystems
in der CSF an, was eine einfache Erklärung für das erhöhte Auftreten von P1-reaktiven
T-Zellen bei MS-Patienten
liefert. Die Verschiebung der MS-Antwort
nach P2 und zu dem 130–149-Epitop innerhalb
von P4 konnte auch durch die Freigabe von immunoreaktiven Fragmenten
aus dem Hu-MBP während
der Demyelination erklärt
werden, obwohl MHC-Restriktionswirkungen noch nicht ausgegrenzt
werden können.
Aus Tierstudien ist es bekannt, dass Langzeitimmunisierung mit MBP
ein erweitertes Repertoire von T-Zellen gegen weniger und weniger
dominante Kombinationen von MHC- und MBP-Epitopen induziert (Offner,
H. et al., J. Exp. Med. 170:355 (1989)). Diese zusätzlichen
T-Zell-Spezifitäten können, abhängig von
ihrer Fähigkeit,
homologes MBP zu erkennen, encephalitogen sein, brauchen dies aber
nicht. Die verstärkte
Komplexität
der Spezifitäten
von T-Zellen von MS-Patienten, die auf Hu-MBP reagieren, ist mit
der Exposition gegenüber
den immunogenen Fragmenten von MBP konsistent, die während der
Demyelination freigesetzt werden, und es ist überzeugend, dass die lang andauernde
chronische Natur von MS die kontinuierliche Induktion oder Restimulation
von encephalitogenen T-Zell-Spezifitäten beteiligt.
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Näherungsweise
40% der Hu-MBP-reaktiven T-Zell-Klone, insbesondere der Klone von
normalen T-Zell-Linien, reagierte auf keines der Hu-MBP-Fragmente.
Eine solche Antwort könnte
die Junction-Epitope beteiligen, die die Spaltstellen von Hu-MBP überspannen
(beispielsweise die Bausteine 30–55 oder 80–100), durch Spaltung zerstörte konforme
Epitope oder isoforme oder posttranslatorische Varianten von Hu-MBP,
die während
der Reinigung der Spaltfragmente verlorgengeangen sind. Obwohl die
Funktion dieser Zellen bei Menschen unklar ist, treten ähnliche
Zellen mit großer
Häufigkeit
(50%) bei Lewis-Ratten auf, die von der EAE genesen sind. Solche
T-Zellen übertrugen
verzögerte
Hypersensitivitätsantworten
auf MBP, jedoch nicht EAE oder einen Schutz gegen die EAE.
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Sowohl
bei MS als auch bei normalen T-Zell-Klonen waren die Antworten überwiegend
durch HLA-DR beschränkt,
obwohl keine strenge Klassenzugehörigkeit zwischen irgendeinem
spezifischen Epitop und einem gegebenen DR-Allel aufgefunden werden
konnte. HLA-DR2, das bei MS-Patienten überrepräsentiert ist, war in der Lage,
Mehrfachepitope von Hu-MBP zu beschränken und einige Epitope (beispielsweise
(149–171) konnten
durch unterschiedliche HLA-DR-Allele
beschränkt
werden. Bei einer früheren
T-Zell-Linien-Untersuchung (Chou, Y.K., et al., J. Neurosci. Res.
23:207 (1989)) wurde berichtet, dass HLA-DR Allele auf 26/33 Hu-MBP
Epitop-spezifische T-Zell-Antworten beschränkt seien, während HLA-DQ
6/33 Antworten nur bei Patienten beschränkte und HLA-DP die Antwort
auf P2 bei einem einzigen normalen Spender beschränkte.
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Die
vorliegenden Daten von T-Zell-Klonen bestätigen die überwältigende Restriktionsfunktion
der HLA-DR-Moleküle
bei der Hu-MBP-Erkennung ebenso wie die Fähigkeit eines undefinierten
HLA-DP-Allel (von einem anderen normalen Spender, DR7,?/DQw2,3)
innerhalb der 1–38-Region
von Hu-MBP die Epitope zu
beschränken,
die durch drei individuelle Klone erkannt werden. Es wurden jedoch
keine HLA-DQ beschränkten
Klone aufgefunden.
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Eine
Hauptfrage bei der Verwendung von TCR Vβ-Peptiden zur Regulierung der
T-Zell-Antworten bei Menschen ist, ob die MBP-spezifischen T-Zellen
einen eingeschränkten
Satz von V-Genen verwenden oder nicht. Die vorliegenden Daten, bei
denen Antikörper
verwendet wurden, die nur für
ca. 1/10 des TCR Vβ-Repertoires
spezifisch sind, identifizieren definitiv 6/38 Klone, die alle von
MS-Patienten stammen. Bei einem HLA-DR2/DQwl homozygoten Spender
mit chronisch fortschreitender MS exprimierten 4 von 8 T-Zell-Klone, die für unterschiedliche
Hu-MBP-Epitope spezifisch sind, dasselbe Vβ5.2-Gen in den T-Zell-Rezeptor
(alle Vβ5.2,
phenotypisch positive Klone wurden durch PcR bestätigt), was
zum ersten Mal eine Verschiebung der TCR V-Gen-Verwendung bei Menschen bei der Antwort
auf Hu-MBP nahelegt. Die Verwendung derselben TCR V-Region bei der
Antwort auf unterschiedliche Hu-MBP-Epitope ist ähnlich den MBP-Antworten bei
Ratten und Mäusen
und zeigt, dass die Wahl des TCR nicht durch das Epitop veranlasst
wird.
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Ein
wichtiger praktischer Teil dieser Beobachtung besteht darin, dass
Verschiebungen in dem TCR-Repertoire herausgefunden werden können, ohne
die Epitopspezifitäten
des MBP-reaktiven Klons zu bestimmen. Tabelle 23 zeigt die PcR-Daten,
die demonstrieren, dass die MBP-spezifischen T-Zell-Klone von menschlichen MS-Patienten
in ihren TCR Vβ-Gen-Gebrauch verschoben
sind. Voll-mRNA wurde von individuellen T-Zell-Klonen extrahiert,
die für
menschliches MBP bei MS-Patienten und normalen Spendern spezifisch sind
und die umarrangierte TCR Vβ-Nachricht
wurde durch PcR verstärkt
und durch spezifische Sonden identifiziert. Es wurde die bevorzugte
Verwendung von Vβ5.2
bei den MS-Patienten
MS-1 und MS-2 sowie die bevorzugte Verwendung von Vβ14 bei dem
normalen Spender N-1 durch die MBP-spezifischen T-Zell-Klone demonstriert.
Dies liefert eine zusätzliche
Stütze
für die
Annahme, dass bei Menschen auch bevorzugt die V-Region-Gene auf
Autoantigene wie MBP antworten.
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Die
Erfindung ist nunmehr vollständig
beschrieben und es ist für
den Fachmann klar, dass sie innerhalb eines weiten Bereiches äquivalenter
Parameter, Konzentrationen und Bedingungen ausgeführt werden kann,
ohne das Wesen und den Kern der Erfindung zu verlassen und ohne übermäßige Experimente
durchführen
zu müssen.
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Obwohl
diese Erfindung in Verbindung mit speziellen Ausführungsbeispielen
beschrieben ist, ist klar, dass sie zu weiteren Modifikationen fähig ist.
Diese Anmeldung soll jede Veränderung,
Gebrauch oder Adaption abdecken, die im Wesentlichen den Prinzipien
der Erfindung folgt und auch alle Abweichungen von dieser Offenbarung
umschließen,
wie sie in diesem technischen Bereich, auf den sich die Erfindung
bezieht, bekannt werden oder zur geläufigen Praxis wird, wie sie
auch auf die wesentlichen Merkmale angewendet werden können, die,
wie sie hier geoffenbart und in den beigefügten Ansprüchen enthalten sind.