DE68927479T2

DE68927479T2 - Verbindungen, zusammensetzungen und verfahren zum binden von bio-affektions-substanzen an oberflächenmembranen von bioteilchen

Info

Publication number: DE68927479T2
Application number: DE68927479T
Authority: DE
Inventors: Georges Dunn; Brian Gray; Paul Horan; Sue Slezak
Original assignee: Phanos Tech Inc
Current assignee: Phanos Tech Inc
Priority date: 1988-05-02
Filing date: 1989-01-10
Publication date: 1997-04-03
Anticipated expiration: 2009-01-11
Also published as: CA1336272C; IL90030A; JPH04502755A; IL90030A0; JP3038339B2; WO1989010758A1; ATE145337T1; EP0430968A4; AU3968589A; EP0430968A1; AU641361B2; US5667764A; US5665328A; DE68927479D1; EP0430968B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen zur Bindung von Bio-Affektions-Substanzen, wie Diagnostika, an die Oberflächenmembran von lebensfähigen Bioteilchen einschließlich eukaryotischer, prokaryotischer Zellen und Viren, ohne nennenswerte schädliche Effekte auf die Morphologie oder physiologische Funktion des Bioteilchens, an das die Verbindungen gebunden sind, auszuüben.iso-
Es sind zahlreiche Verbindungen und Zusammensetzungen bekannt, die dazu fähig sind, für verschiedene diagnostische Anwendungen Bio- Affektions-Substanzen an Trägerzellen zu binden. Es wurden Fluoreszenz- Markierungstechniken beschrieben, die einen breiten Bereich von Fluorochromen verwenden, wie z.B. Cyaninderivate - US-Patent Nr. 4343782 -, Fluoresceinisothiocyanat - Butcher et al., J. Immunol. Methods 37 (1980) 109-21 und Butcher et al., J. Immunol. Methods 37 (1980) 97-108 -, und Fluorescein oder Rhodamin mit einem einzigen relativ langkettigen aliphatischen Kohlenwasserstoffrest - Wanda et al., J. Histochem. Cytochem. 30 (1982) 1297-1300. Es wurde auch über eine nicht reproduzierbare Markierungstechnik unter Verwendung von 3,3' -Di-n- Octodecyloxacarbocyanin für eine retrograde Markierung von Neuronen berichtet - Honig et al., J. Cell Biology 103 (1986) 171-87. Es wurde gefunden, daß diese Verbindungen des Standes der Technik zur Markierung von Zellen: (1) in der Plasmamembran während eines langen Zeitraums instabil sind, und/oder (2) gegenüber der Zellfunktion oder Morphologie cytotoxisch oder auf andere Weise schädlich sind, und/oder (3) nicht dazu fähig sind, reproduzierbare Ergebnisse zu liefern.
Diagnostische Verfahren unter Verwendung von Chelat- Metallionenkomplexen zur Abbildung durch Radiographie und kernmagnetische Resonanz sind ziemlich gut entwickelt. Es wurde weit verbreitet über die Verwendung von Komplexen von Gallium-67, Indium-111 und Technetium-99m in radiographischen Abbildungsverfahren berichtet; vgl. z.B. Holman ed., Radionudide Imaging of the Brain (New York: Churchill Livingstone, 1985). Die Verwendung paramagnetischer Komplexe bei der NMR-Abbildung wurde ausführlich untersucht und Zusammensetzungen, die solche Komplexe enthalten, wurden zur Verabreichung als Bildverstärker vorgeschlagen. Siehe die Australische Patentanmeldung 86 330/82 von Greis et al., angemeldet am 22. Juli 1982. Es ist jedoch bekannt, daß solche Abbildungsverfahren nicht zu einer Membranbindung führen, sondern der abbildende Komplex vielmehr in die Zelle aufgenommen wird und an das Retikulum der Zelle bindet. Bei diesen Applikationen besitzen die Chelatbildner, z.B. Oxin, Tropolon oder Merc, eine toxische Wirkung auf viele Zellen, wie z.B. Lymphocyten, und sind für eine Abbildung nicht optimal. Da das bestimmbare Metallion in die Zelle aufgenommen wird, kann der Isotopenzerfall außerdem leichter Strahlungsschäden des genetischen Materials der Zelle hervorrufen. Die Europäische Patentanmeldung Nr. 86103694.5, veröffentlicht am 22. Oktober 1986 (veröffentlichte Anmeldung Nr. 0198251) beschreibt ein Verfahren zur selektiven Bestrahlung von biologischen Materialien, insbesondere von Geweben, Zellen oder Zellkomponenten, in dem die Mößbauer-Absorptionsfrequenz einer Komponente des zu bestrahlenden Materials bestimmt wird und das Material dann mit γ-Strahlung der entsprechenden Mößbauer- Absorptionsfrequenz mit interner Konversion und Emission von γ-Strahlung und/oder Auger-Elektronen bestrahlt wird. Es wird beschrieben, daß das Verfahren brauchbar ist zur selektiven Bestrahlungstherapie, indem sie selektive Gewebschäden oder Nekrosen hervorruft, z.B. in der Krebstherapie, und zur Differenzierung zwischen erkrankten und gesunden Geweben. Bei der praktischen Durchführung dieses Verfahrens werden Mößbauer-Isotopen parenteral verabreicht, aber nicht selektiv an die Tumorzellen abgegeben. Es wird angenommen, daß die Selektivität im Tumorzellentod entweder durch Differenzen in den Absorptionswellenlängen der Mößbauer-Atome innerhalb der Tumorzellen und normalen Zellen oder durch eine spezifische Fokussierung der absorbierten Strahlung am Tumor selbst erreicht wird.
Eines der Hauptziele jeder pharmazeutischen Entwicklung ist es, eine Arzneimitteltherapie bereitzustellen, die vollständig spezifisch für einen Zielzellentyp oder eine Krankheitsstelle ist. In einigen Fällen sind die verwendeten Verbindungen Antagonisten oder Agonisten, wenn an Zellen, auf die sich die Therapie richtet, spezifische Repzeptoren gefunden werden und geringere Affinitätsgrade bei anderen Zelltypen. In anderen Fällen wird das Arzneimittel von Zellen spezifisch an der Stelle der Erkrankung aufgenommen oder an der Stelle der Erkrankung auf einem Weg metabolisiert, der verschieden ist vom Metabolismus nicht erkrankter Stellen.
Bei der Behandlung von Krebs erfolgen viele Arzneimitteltherapien in der Annahme, daß die Krebszellen mit einer Geschwindigkeit wachsen und metabolisieren, die größer ist als von den meisten Nicht-Tumorzellen. Diese Annahme erweist sich im allgemeinen aufgrund der Tatsache, daß Haarfollikel, Knochenmarkszellen und Gastro-intestinale Zellen sogar mit einer größeren Geschwindigkeit wachsen und oft durch diese Therapien ziemlich beeinträchtigt werden, als fehlerhaft. Aber auch in der Krebstherapie ist es das Ziel, zu versuchen, die Therapie nur auf die Tumorzellen zu richten.
Ein jüngster Versuch in dieser Richtung ist die Verwendung monoklonaler Antikörper, wie in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 83400461.6 (veröffentlichte Anmeldung Nr. 0088695) beschrieben. In dieser Therapie besitzt der monoklonale Antikörper eine "spezifische" Bindungsaffinität für die Tumorzellen. Radiotherapeutische oder chemotherapeutische Moleküle werden (kovalent oder ionisch) an den monoklonalen Antikörper gebunden und dem Patienten intravenöse injiziert. Der monoklonale Antikörper wandert dann an die Tumorstelle, wo er an die Tumorzellen mit einer ausreichend hohen Affinität bindet, um eine Anreicherung der Strahlung oder chemischen Schädigung an den Tumorzellen zu erlauben. Diese "Therapie" ist mit einer Vielzahl von Problemen verbunden, von denen die große Menge an Protein, die bei jeder Behandlung injiziert werden muß, wodurch diese Therapie ziemlich kostspielig wird, nicht das geringste darstellt. Darüberhinaus sind die injizierten monoklonalen Antikörper fremde Proteine, und führen oft dazu, daß der Patient Antikörper gegen das therapeutische Molekül ausbildet. Außerdem stellt die Spezifität der Bindung oft ein Problem dar und eine nicht- spezifische Toxizität ist das Ergebnis. Bei diesem Verfahren ist auch die Verbreitung oder Modulierung von Antigenen ein Problem, sowie die begrenzte Fähigkeit, in schwach vaskularisierte Tumore einzutreten. Für eine pharmazeutische Substanz ist im allgemeinen ein Verfahren, das eine gewünschte therapeutische Wirkung spezifisch an Tumorzellen bewirkt, ein wünschenswertes Attribut.
In der US-Patentanmeldung Serial Nr. 925192, angemeldet am 31. Oktober 1986 (späteres US-Patent 4783401) werden Verfahren zur reproduzierbaren Markierung lebensfähiger Zellen mit symmetrischen Cyaninfarbstoffen, die die Lebensfähigkeit der Zelle nicht signifikant beeinträchtigen, beschrieben. Applikationen für solche markierte Zellen schließen die Verwendung markierter roter Blutkörperchen ein, um eine post-transfusionale Blutung von einer immunologischen Reaktion zu unterscheiden, und die Verwendung einer Verdünnung zur Messung der Wachstumsgeschwindigkeit von kultivierten Zellen.
In der US-Patentanmeldung Serial Nr. 925445, angemeldet am 31. Oktober 1986 (späteres US-Patent 4762701) werden Verfahren zur Bestimmung von Zellen in vivo und zur Bestimmung der in vivo- Zellebensdauer beschrieben. Bei der Durchführung solcher Verfahren werden Zellen mit Cyaninfarbstoffen markiert und die Bestimmung durch Messung der Fluoreszenz, Absorption, oder durch Bestimmung von in den Cyaninfarbstoffen enthaltenen kernmagnetischen Resonanzsonden durchgeführt. Die Methoden sind z.B. brauchbar, um die Lebensdauer von roten Blutkörperchen und Plättchen zu messen, um Zellen aufzuspüren, um die Zellen primärer oder metastatischer Tumore zu bestimmen, oder Stellen einer verdeckten Infektion, und um die Geschwindigkeiten zu bestimmen, mit denen die Zellen durch Blutgefäße hindurchströmen, um die Kapazität der Blutgefäße und die Plättchenaggregation einzuschätzen.
In der US-Patentanmeldung Serial Nr. 925429, angemeldet am 31. Oktober 1986 (späteres US-Patent 4859584) werden Verfahren zur Bestimmung der Wachstumsgeschwindigkeit von Zellen, die in vivo und in vitro wachsen, beschrieben. Bei der Durchführung solcher Verfahren werden die Zellen mit Cyaninfarbstoffen markiert und die Veränderungen im Cyaninfarbstoffgehalt in der Plasmamembran werden verwendet, um die Wachstumsgeschwindigkeit zu bestimmen. Die sich daraus ergebenden Bestimmungen der Zellwachstumsgeschwindigkeit werden verwendet, um das Wachstum von transplantierten Knochenmarkszellen-Transplantaten und post- chirurgischen cornealen Epithelzellen zu verfolgen. Solche Verfahren sind auch brauchbar zur Bestimmung der Tumorzellensensitivität gegenüber therapeutischen Krebsmitteln, der Hefesensitivität gegenüber Fungiziden, der Fungiziden, und der Bakterienempfindlichkeit gegenüber Bakteriziden.

Zusammenfassung der Erfindung

Es wurde nun gefunden, daß Bio-Affektions-Verbindungen, insbesondere diagnostische Mittel, reproduzierbar an die Oberflächenmembran von eukaryotischen und prokaryotischen Zellen und Viren mit einer ausreichenden Affinität gebunden werden können, um die Dissoziation der Verbindung von der Membran zu verhindern und ohne die normalen Funktionen der Zelle oder des Virus gegenteilig zu beeinträchtigen.
Die vorliegende Erfindung stellt eine Zusammensetzung bereit, die die Fähigkeit besitzt, an die Lipidphase der Oberflächenmembran von lebensfähigen Bioteilchen mit einer physiologischen Funktion, wie z.B. von Zellen oder Viren, zu binden. Diese Zusammensetzungen umfassen eine Bio-Affektions-Einheit, spezifischerweise ein diagnostisches Mittel, und mindestens einen Kohlenwasserstoffrest, der so ausgewählt ist, daß die Verbindung ausreichend nicht-polar ist, um während 24 Stunden in 10 % Serum enthaltender Kochsalzlösung einen Oberflächenmembran- Retentionskoeffizienten von mindestens 90 aufzuweisen, und ferner so ausgewählt ist, daß der Löslichkeitsfaktor der Verbindung während einer Zeitraums von 2 Stunden im ausgewählten Bindungsmedium nicht mehr als eine 20 %-ige Veränderung besitzt. Geeignete Verbindungen sind solche der Formel R-B-R&sub1;, worin B die Bio-Affektions-Einheit darstellt und R und/oder R&sub1; relativ langkettige Kohlenwasserstoffsubstituenten oder "Schwänze" darstellen, die den Verbindungen die erforderliche Lipophilität verleiht, wobei R und R&sub1; verschieden sind. Wenn die Verbindungen einmal in die Membran einer Zelle oder eines Virus eingebettet sind, beeinträchtigen sie ihre normale Funktion nicht in einem nennenswerten Ausmaß nachteilig, oder haben keine schädliche Wirkung auf die Lebensfähigkeit der Zellen oder Viren, an die sie gebunden sind, wobei diese Zellen hier manchmal als Trägerzellen oder Viren bezeichnet werden.
Die Zahl der geradkettigen Kohlenwasserstoffe im Kohlenwasserstoffschwanz (den Kohlenwasserstoffschwänzen) der erfindungsgemäßen Verbindungen ist ein wichtiger Faktor, um zu erreichen, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen an die Oberflächenmembranen prokaryotischer oder eukaryotischer Zellen oder Viren binden. Die Erfahrung bei der Verwendung von Cyaninderivaten als Diagnostika zeigt an, daß Kohlenwasserstoffschwänze von weniger als 3 Kohlenstoffatomen verursachen, daß das Cyanin durch die Plasmamembran hindurchtritt, was zu einer Anfärbung von RNA und DNA in der Nucleus-Membran der Zellen führt. Wenn die Kohlenwasserstoffschwänze eine Länge von mehr als 3 Kohlenstoffatomen und weniger als 12 Kohlenstoffatomen besitzen, binden die Verbindungen nicht mehr an PNA und DNA, reagieren aber auf das Membranpotential und treten in die Mitochondrien ein (US-Patent Nr. 4343782, Shapiro; und US-Patent Nr. 4424201, T.J. Valinsky; Lampidis et al. Agents and Actions 14 (1984) 751-757). Wenn die Summe der geradkettigen Kohlenstoffatome im Kohlenwasserstoffschwanz (in den Kohlenwasserstoffschwänzen) 23 oder mehr beträgt, wird die Lipophilität des Moleküls so erhöht, daß es in der Plasmamembran zurückgehalten wird und nicht ausläuft oder in andere Zellen übergeht. Im allgemeinen ist die Lipophilität umso höher, je länger der Kohlenwasserstoffschwanz ist. Die Kohlenwasserstoffschwänze mit mehr als 30 geradkettigen Kohlenstoffatomen können jedoch ein Problem ergeben, weil die Bio-Affektions-Einheit und der zur Bereitstellung des Kohlenwasserstoffschwanzes verwendete Reaktant nicht im gleichen Lösungsmittel löslich sein könnten, was die Chemie der Verbindung des Kohlenwasserstoffschwanzes mit der Bio-Affektions-Einheit ziemlich schwierig macht. Es kann sich deshalb abhängig von der chemischen Natur der Bio-Affektions-Einheit eine praktische Begrenzung der Länge des Kohlenwasserstoffschwanzes (der Kohlenwasserstoffschwänze), die an diesen gebunden sind, ergeben.
Erfindungsgemäß wird deshalb eine Zusammensetzung bereitgestellt zur Bindung einer Bio-Affektions-Einheit, die ein Diagnostikum ist, an die Oberflächenmembran eines lebensfähigen Bioteilchens, wie einer Trägerzelle oder eines Virus, welche eine physiologische Funktion ausüben können, die dadurch gekennzeichnet ist, daß diese Zusammensetzung umfaßt: eine Verbindung der Formel R-B-R&sub1;, worin B das Diagnostikum darstellt, und R und R&sub1; verschieden sind und Substituenten darstellen, die unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe Wasserstoff, Alkyl, Alkenyl, Alkynyl, Alkaryl oder Aralkyl, deren Kohlenwasserstoffketten geradkettig oder verzweigt sind, und wobei die Substituenten unsubstituiert oder durch ein oder mehrere nicht-polare funktionelle Gruppen substituiert sind, und einer der Reste R&sub1; und R&sub2; mindestens mindestens 12 geradkettige Kohlenstoffatome besitzt, und die Summe der geradkettigen Kohlenstoffatome in R&sub1; und R&sub1; mindestens 23 ergibt, und ein kompatibles Bindungsmedium, in dem diese Verbindung gelöst ist, wobei das Medium mit dem Bioteilchen, an das die Verbindung gebunden werden soll, iso-osmotisch ist.
Das Bindungsmedium, das bei der praktischen Durchführung der Erfindung verwendet werden kann, umfaßt Zucker, Zucker-alkohole, Aminosäuren, Good-Puffer, oder eine Kombination davon, worin die Verbindungen der Formel R-B-R&sub1; stabil löslich sind.
Die Erfindung kann verwendet werden zur Herstellung einer Trägerzelle, die eine Bio-Affektions-Einheit trägt, die dazu fähig ist, in vivo eine reproduzierbare bestimmte Stellen spezifische Wirkung auszuüben, d.h. eine diagnostische Wirkung. Die gewünschte Wirkung kann z.B. direkt auf eine Trägerzelle, oder eine Zellgruppe, die eine solche Trägerzelle umfaßt, ausgeübt werden. Das präparative Verfahren umfaßt im wesentlichen das in-Kontakt-bringen einer Verbindung der Formel R-B-R&sub1; mit der Trägerzelle oder dem Virus in Gegenwart eines Mediums des vorstehend beschriebenen Typs unter Bedingungen, die die Bindung der Verbindung an die Trägerzelle oder den Virus verursachen. Das präparative erfindungsgemäße Verfahren verläuft ohne nennenswerte Verringerung der Lebensfähigkeit der Trägerzelle oder des Virus, oder einer anderweitigen gegenteiligen Beeinträchtigung ihrer gewünschten phyisiologischen Funktion.
Eine stellenspezifische bestimmte Wirkung in vivo kann erreicht werden, indem man die Zielstelle einer Bio-Affektions-Einheit aussetzt, die dazu fähig ist, den gewünschten Effekt zu erzeugen. Das Verfahren umfaßt die Bereitstellung einer Trägerzelle oder eines Virus, an die eine Verbindung der Formel R-B-R&sub1; gebunden ist, und Zuführen der so gebundenen Trägerzelle oder des Virus an die Stelle, an der die Bio-Affektions- Einheit ihre beabsichtigte Wirkung erzeugen soll.
Die vorliegende Erfindung besitzt eine Anzahl von Vorteilen im Vergleich zum vorstehend diskutierten Stand der Technik, insbesondere im Hinblick auf Applikationen, die die Zellbindung umfassen. Erstens sind die erfindungsgemäßen Verbindungen auf eine solche Weise an Trägerzellen gebunden, daß der Bio-Affektions-Substituent an das Äußere der Zelle plaziert wird. In vielen Applikationen stellt dies einen deutlichen Vorteil gegenüber den Verfahren des Standes der Technik zur Bindung von Bio-Affektions-Substanzen an Zellen dar, weil bei den letzteren die Bio- Affektions-Substanz durch die Plasmamembran hindurch in das Cytoplasma oder Mitochondrium gezwungen wird. Bei einer Radioisotopen-Markierung verringert z.B. die Plazierung von Indium oder Technetium an der Außenseite der Plasmamembran die Wahrscheinlichkeit, daß emittierte Gammastrahlung durch den Zellkern hindurchtritt, wodurch das Risiko einer unerwünschten Mutation oder von Zelltod verringert werden. Eine solche Zerstörung der normalen Zellfunktion ist ein ernsthaftes Problem bei Radiopharmaceutika, wie z.B. Indium-Oxin oder Indium-Tropolon, die zur Zeit verwendet werden. Als Ergebnis der Trägertoxizität und Indium- Toxizität auf die Wirtszelle werden solche Verfahren als sub-optimal für die Markierung von Lymphocyten betrachtet.
In anderen Applikationen können monoklonale Antikörper, Lectine, Agonisten oder Antagonisten von Geweberezeptoren, Glycosaminglycane, Sialinsäuren oder andere solche Moleküle an der äußeren Oberfläche der Zelle plaziert werden, um das Wanderungsmuster der Zelle zu verändern. Während einige Biomoleküle, wie z.B. Glycosaminoglycane und Sialinsäuren, spezifische Wanderungsrouten beeinträchtigen können, können andere, wie z.B. monoklonale Antikörper, Agonisten oder Antagonisten von Geweberezeptoren, oder Leotine die Retentionszeit einer Zelle an einer bestimmten Stelle beeinträchtigen.
Ein weiterer bemerkenswerter Vorteil ist der, daß die Bindung der erfindungsgemäßen Verbindungen an Trägerzellen in den Lipiden erfolgt. Dies ist deshalb von Bedeutung, weil die Bindung in Lipiden die Möglichkeit verringert, mit den wichtigen funktionellen Bereichen einer Zellmembran, die den diskreten Proteinanteilen und nicht in den ausgedehnteren Lipidregionen liegen, in Wechselwirkung zu treten. Solche Verfahren des Standes der Technik, die Bio-Affektions-Substanzen an Zellen liefern, die die Bindung an Proteine und Zellrezeptoren mitsichbringen, ergeben oft, wie vorstehend angegebenen, eine Verringerung der funktionellen Kapazität.
Aus der Bindung in den Lipidregionen der Zellen ergeben sich bestimmte weitere Vorteile. Da die Lipidregionen den Großteil der Oberfläche der Zelle umfassen, ist es möglich, eine größere Zahl von Lipid-bindenden Verbindungen in die Plasmamembran einzuführen. Weil die erfindungsgemäßen Verbindungen in die Membranlipide eingebaut werden, sind sie darüberhinaus im allgemeinen in normalen physiologischen Salzen unlöslich. Wenn deshalb die Verbindungen einmal an die Membran gebunden sind, sind sie dort wirksam eingeschlossen und können nicht leicht diisozieren. Die Verbindungen treten deshalb aus den Zellen nicht aus, und wenn eine markierte Zelle auf eine andere Zelle oder Membran trifft, wird die Verbindung nicht von Zelle zu Zelle übertragen.
Die Bindung in den Membranlipiden ist auch deshalb vorteilhaft, weil die gebundenen Verbindungen im allgemeinen nicht-immunogen sind. Das Immunsystem ergibt keine so leichte Antwort gegenüber Veränderungen in den Lipidregionen der Zellmembran als gegenüber Veränderungen in Proteinanteilen. Mit einer ausreichend kleinen Bio-Affektions-Einheit wird deshalb nicht erwartet, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen eine humorale oder zelluläre Immunantwort gegen sie hervorrufen.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Unter Bezugnahme auf die Zeichnungen bedeuten:
Figur 1 eine graphische Darstellung von Messungen der Fluoreszenzintensitäts-Verteilung für Yac-1-Zellen, die mit DiO-C14-(3) markiert sind, wobei Figur 1A die Intensitätsdifferenz von angefärbten gegenüber nicht gefärbten Zellen zeigt; und die Figur 1B den Abfall der Fluoreszenzintensität als Funktion der Zeit darstellt.
Figur 2 ist eine graphische Darstellung der Zellenzahl und Messungen der inversen Fluoreszenzintensität als Funktion der Zeit unter Verwendung von DiO-Cl4- (3)-markierten und nicht-markierten Yac-1-Zellen.
Figur 3 ist eine graphische Darstellung, die die Beziehung im Hinblick auf die Cytotoxizität von mit DiO-Cl4-(3) gefärbten und nicht- gefärbten Yac-1-Zielzellen zeigt.
Figur 4 ist eine graphische Darstellung, die die Beziehung im Hinblick auf die Cytotoxizität von Effektor/Zielzellen-Anfärbung unter Verwendung von DiO-Cl4-(3)-angefärbten Yac-1-Zielzellen und ungefärbten Poly I:C behandelten NK-Preps gegenüber nicht angefärbten Yac-1- Zielzellen und angefärbten Poly I:C-behandelten NK-Preps zeigt.
Figur 5 veranschaulicht die Zellbindungsstabilität einer erfindungsgemäßen Verbindung im Vergleich mit zwei verschiedenen Fluoreszenzverbindungen mit nicht akzeptierbaren Freisetzungsgraden aus der Plasmamembran markierter Zellen.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Der Ausdruck "lebensfähige Bioteilchen, die eine physiologische Funktion ausüben können" wird hier verwendet, um auf irgendeine lebensfähige Zelle oder einen Membran-enthaltenden Virus hinzuweisen. Der Ausdruck "Zelle", wie er hier verwendet wird, schließt jedoch prokaryotische Zellen, wie z.B. Bakterien, sowie mit einem Kern versehenen eukaryotischen Zellen ein, wie z.B. weiße Blutkörperchen, verschiedene Tumorzellen, und Säugerzellen in Kultur, z.B. Chinese Hamster Ovary-Zellen, Hefe, und nicht mit einem Kern versehene Zellen, wie z.B. rote Blutkörperchen, rote Blutkörperchen-Geisterzellen und Plättchen. Die nachfolgend angegebene detaillierte Beschreibung der Erfindung bezieht sich insbesondere auf Zellen. Es ist jedoch verständlich, daß das, was im Hinblick auf Zellen angegeben wird, im allgemeinen auch auf Membran-enthaltende Viren anwendbar ist.
Die Ausdrücke Bio-Affektions-Substanz und Bio-Affektions-Einheit werden hier untereinander vertauschbar verwendet, um auf eine große Vielfalt verschiedener Substanzen Bezug zu nehmen, die bei der diagnostischer Behandlung von Menschen und Tieren brauchbar sind. Die diagnostischen Applikationen der Verbindungen umfassen z.B. die Bestimmung oder den Nachweis einer physiologischen Bedingung oder eines Zustandes durch einen in vivo oder in vitro-Test. Derivate solcher Substanzen mit langen Kohlenwasserstoffschwänzen können, wie dies nachfolgend detaillierter beschrieben wird, in jeder dieser allgemeinen Applikations kategorien vorteilhaft verwendet werden.
Im Falle diagnostischer Applikationen dienen die erfindungsgemäßen Verbindungen wirksam als Reporter-Moleküle, die außerhalb des Körpers bestimmbar sind, oder die Entfernung aus einer Körperflüssigkeit oder eine Biopsie zur Analyse in vitro erfordern, wobei das erstere Verfahren, das eine nicht-chirurgische Einschätzung eines physiologischen Zustandes erlaubt, bevorzugt ist.
In jedem Fall zeigen die erfindungsgemäßen Verbindungen keine nennenswerte cytotoxische Wirkung auf die Trägerzelle, und ergeben auch keine nennenswerte schädliche Wirkung auf die gewünschte Zellfunktion.
Die diagnostischen Mittel, die die erfindungsgemäßen Verbindungen umfassen, können ausgewählt sein aus verschiedenen Klassen von Substanzen, die durch verschiedene analytische Verfahren, die einem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt sind, bestimmbar sind. Eine solche zur diagnostischen Applikation geeignete Klasse von Substanzen umfaßt solche, in denen die Bio-Affektions-Einheit eine Fluoreszenzverbindung ist. Eine Zusammensetzung, die eine solche Verbindung in einem Lösungsmittel des hier beschriebenen Typs umfaßt, kann leicht an Trägerzellen appliziert werden, wodurch die Verbindung an die Plasmamembran der Zellen gebunden wird. Die Zellen werden dann fluoreszierend gemacht, und sind so ex vivo bestimmbar, wodurch eine Indikation über die in vivo-Aktivität der Zelle geliefert wird. Solche Fluoreszenzverbindungen sind vorzugsweise Cyaninfarbstoffe und ihre Derivate, einschließlich von z.B. Oxacarbocyanin, Indocarbocyanin, Thiocarbocyanin, oder Acridinfarbstoffe und Derivate davon. Andere brauchbare Fluoreszenzverbindungen umfassen z.B. Styrylpyridin, Anthrachinon, Cumarin, Xanthen, Phenoxazin, Phenothiazin, oder Diphenylhexatrienfarbstoffe und Derivate davon. Die Fluoreszenzeinheiten besitzen vorzugsweise eine positive Ladung, die den Einbau und die Retention in der Plasmamembran unterstützt.
Andere brauchbare Diagnostika sind chelatisierende Metallkomplexverbindungen, die direkt oder indirekt bestimmbar sind. Der Chelat-Metallkomplex kann ein Isotop umfassen, das ausgewählt ist aus der Reihe der Übergangsmetalle, dessen Atomnummer 21 bis 49 beträgt, wie z.B. Indium-111 oder Technetium-99m. Solche Komplexe können an die Zellplasmamembran gebunden werden, wodurch diese radioaktiv wird, um unter Verwendung einer γ-Strahlenkamera nach Injektion der markierten Zellen in den Körper eine Abbildung zu ermöglichen. Die Chelatverbindungen können auch mit Ionen von Metallen komplexiert sein, die indirekt bestimmbar sind, z.B. durch bestimmte Wirkungen, die diese an der Stelle des Interesses hervorrufen. Komplexe paramagnetischer Elemente sind z.B. dazu fähig, die Relaxationszeiten naher Kerne zu beeinflussen, was durch eine magnetische Resonanzabbildung (MRI) bestimmbar ist. Chelat-Metallkomplexe, die ein Metallion umfassen, das ausgewählt ist aus den Übergangsmetallen, dessen Atomnummer 21 bis 29 beträgt, den Lanthaniden, dessen Atomnummer 59-66 beträgt, und den Actiniden, dessen Atomnummer 91 ist, können für solche Zwecke geeignet sein.
Verbindungen, die radioaktive Isotope umfassen, können, wenn erwünscht, in erfindungsgemäßen diagnostischen Applikationen ebenfalls verwendet werden. Ein Radioisotop, wie z.B. ¹²&sup5;I, ¹³¹I, ¹&sup4;C, ³H, ³²P, ³&sup5;S, &sup7;&sup5;Se können die reichlich vorhandenen aber nicht radioaktiven Formen des natürlich auftretenden Atoms, das in der Bio-Affektions-Einheit oder dem Kohlenwasserstoff-Schwanzanteil der Verbindung vorhanden ist, substituieren. Eine geeignete Formulierung einer solchen Verbindung, die auf Trägerzellen (oder Viren) appliziert wird, wodurch die Verbindung an die Plasmamembran der Zellen (oder die Membran des Virus) gebunden wird, macht die Zellen (oder Viren) radioaktiv und erlaubt eine Abbildung unter Verwendung einer konventionellen radiographischen Bestimmungsvorrichtung, wie z.B. einer γ-Strahlenkamera oder von Standard-β-Zählverfahren. Isotopen mit einem Nicht-Null-Spinzustand können ebenfalls in die erfindungsgemäßen Verbindungen eingeführt werden, wodurch ihre Gegenwart unter Verwendung von MRI-Verfahren bestimmbar wird.
Die Bio-Affektions-Einheit kann auch in Form eines Liganden vorliegen, der dazu fähig ist, an Rezeptoren von Zellen innerhalb von Zielorganen zu binden. Verbindungen, die solche Liganden enthalten, ermöglichen, wenn sie an Zellen gebunden sind, daß die Wanderung von Zellen auf spezifische Organstellen gerichtet ist.
Die Bio-Affektions-Einheiten werden in Form von Derivaten verwendet, die eine Bindung an die Plasmamembran von Trägerzellen ermöglichen. Diese Derivate sind Verbindungen der Formel R-B-R&sub1;, worin B eine Bio-Affektions-Einheit darstellt, und R und R&sub1; verschiedene Substituenten darstellen, die unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe Wasserstoff, Alkyl, Alkenyl, Alkynyl, Alkaryl oder Aralkyl, deren Kohlenwasserstoffketten geradkettig oder verzweigt sind, wobei die Substituenten unsubstituiert oder durch eine oder mehrere nicht-polare funktionelle Gruppen substituiert sind, und einer der Reste R und R&sub1; mindestens 12 geradkettige Kohlenstoffatome besitzt, und die Summe der geradkettigen Kohlenstoffatome in R und R&sub1; insgesamt mindestens 23 beträgt. Die R und/oder R&sub1;-Gruppen werden so ausgewählt, daß der Plasmamembran-Retentionskoeffizient der Verbindung (wie nachfolgend beschrieben) in Salzlösung, die 10 % Serum enthält, während 24 Stunden mindestens 90 beträgt, und das der die Löslichkeit der Verbindung bestimmende Faktor der Verbindung während eines Zeitraums von zwei Stunden in dem ausgewählten Bindungsmedium keine größere Veränderung als 20 % zeigt. Der hier verwendete Ausdruck "nicht polare funktionelle Gruppe" bezieht sich auf Substituenten, wie z.B. O-Alkyl, S-Alkyl, Halogen, N(Alkyl)&sub2;, Se-Alkyl, NO, CN, CO-Alkyl, C=N-Alkyl, -SiMe&sub3;, O-SiMe&sub3; und dergleichen.
Eine bevorzugte Klasse von Fluoreszenzverbindungen innerhalb des erfindungsgemäßen Rahmens sind Cyaninderivate der Formel
worin R und R&sub1; verschieden sind und Substituenten darstellen, die unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe Wasserstoff, Alkyl, Alkenyl, Alkynyl, Alkaryl oder Aralkyl, deren Kohlenwasserstoffketten 1 bis 30 Kohlenstoffatome besitzen, und die geradkettig oder verzweigt sind, wobei die Substituenten unsubstituiert oder durch eine oder mehrere nicht-polare funktionelle Gruppen substituiert sind, und einer der Reste R oder R&sub1; mindestens 12 geradkettige Kohlenstoffatome besitzt, und die Summe der geradkettigen Kohlenstoffatomen in R und R&sub1; mindestens 23 beträgt.
X und X&sub1; gleich oder verschieden sein können und O, S, C(CH&sub3;)&sub2; oder Se bedeuten;
Y ein Brückenglied darstellt, das ausgewählt ist aus -CH--, -CH=CH-CH=, -CH=CH-CH=CH-CH=, oder -CH=CH-CH=CH-CH=CH-CH=;
Z einen Substituenten darstellt, der ausgewählt ist aus der Gruppe H, Alkyl, OH, NH&sub2;, COOH, CONH&sub2;, SO&sub3;H, SO&sub2;NH&sub2;, CONH-Alkyl, CON-(Alkyl)&sub2;, NH- Acyl, -O-Alkyl, NH-Alkyl, oder N(Alkyl)&sub2;, SH, S-Alkyl, NO&sub2; oder Halogen und die Alkylgruppen der Z-Substituenten 1 bis 3 Kohlenstoffatomen besitzen;
und A ein biologisch kompatibles Anion darstellt.
Bei der praktischen Durchführung dieser Erfindung lassen sich besonders gute Resultate erzielen unter Verwendung von Cyaninderivaten der Formel
worin R und R&sub1; verschieden sind und Alkylsubstituenten mit 1 bis 30 Kohlenstoffatomen darstellen, die geradkettig oder verzweigt sind, und unsubstituiert oder durch Halogen substituiert sind, wobei einer der Reste R oder R&sub1; mindestens 12 geradkettige Kohlenstoffatome besitzt und die Summe der geradkettigen Atome in R und R&sub1; mindestens 23 beträgt; Z einen Substituenten bedeutet, der ausgewählt ist aus der Gruppe H, oder Niederalkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen; und A ein biologisch kompatibles Anion bedeutet.
Eine weitere bevorzugte Klasse von Fluoreszenzverbindungen innerhalb des erfindungsgemäßen Rahmens sind Acridinderivte der Formel
worin R einen Substituenten bedeutet ausgewählt aus der Gruppe Alkyl, Alkenyl, Alkynyl, Alkaryl oder Aralkyl, deren Kohlenwasserstoffkette geradkettig oder verzweigt ist, wobei der Substituent unsubstituiert oder durch eine oder mehrere nicht-polare funktionelle Gruppen substituiert ist, und mindestens 23 geradkettige Kohlenstoffatome besitzt;
Z einen Substituenten bedeutet ausgewählt aus der Gruppe H, Alkyl, OH, NH&sub2;, COOH, CONH&sub2;, SO&sub3;H, SO&sub2;NH&sub2;, CONH-Alkyl, CON (Alkyl)&sub2;, NH-Acyl, -O-Alkyl, NH-Alkyl oder N(Alkyl)&sub2;, SH, S-Alkyl, NO&sub2;, Halogen, wobei die Alkylgruppen dieser Z-Substituenten 1 bis 3 Kohlenstoffatome besitzen; und
A ein biologisch kompatibles Anion darstellt.
Eine weitere bevorzugte Klasse von Verbindungen innerhalb des Rahmens der Erfindung sind Chelatbildner der Formel
worin n eine Zahl von 1 bis 20 ist; m eine Zahl von 0 bis 2 ist; und p entweder 0 oder 1 ist,
worin R&sub1;, R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; unabhängig voneinander Substituenten darstellen, ausgewählt aus der Gruppe:
C&sub1;-C&sub3;&sub0;-Alkyl, C&sub1;-C&sub3;&sub0;-Alkenyl, C&sub1;-C&sub3;&sub0;-Alkynyl, und unsubstituiertes oder substituiertes Aryl oder Aralkyl, wobei die letztgenannten Substituenten ausgewählt sind aus Hydroxyl, Halogen, Thiol, C&sub1;-C&sub3;&sub0;-Alkyl, C&sub1;-C&sub3;&sub0;-Alkenyl, C&sub1;-C&sub3;&sub0;-Alkynyl oder Aryl oder Aralkyl; O-(C&sub1;-C&sub3;&sub0;-Alkyl, Alkenyl oder Alkynyl); S-(C&sub1;-C&sub3;&sub0;-Alkyl, Alkenyl oder Alkynyl); NH(C&sub1;-C&sub3;&sub0;-Alkyl, Alkenyl oder Alkynyl); N&spplus;R&sub1;&sub1; C&sub1;-C&sub3;&sub0;-Alkyl, Alkenyl oder Alkynyl)&sub2;; N(C&sub1;-C&sub3;&sub0;-Alkyl, Alkenyl oder Alkynyl)&sub2;;
W CH&sub2; oder C=O bedeutet;
X CH oder N bedeutet;
R&sub5; und R5' unabhängig voneinander H, CH&sub2;CO&sub2;H oder Y-R&sub8; bedeuten;
Y das Brückenglied O, C=O, S, (CH&sub2;)x oder Se bedeutet, x eine Zahl von 0 bis 5 ist;
R&sub6; und R&sub7; unabhängig voneinander H oder C&sub1;-C&sub2;-Alkyl bedeutet;
R&sub8; einen Substituenten bedeutet, ausgewählt aus der Gruppe -NH(C&sub1;-C&sub3;&sub0;-Alkyl, Alkenyl, oder Alkynyl), N(C&sub1;-C&sub3;&sub0;-Alkyl, Alkenyl oder Alkynyl)&sub2;, N&spplus;R&sub1;&sub1; (C&sub1;-C&sub3;&sub0;-Alkyl, Alkenyl oder Alkynyl)&sub2;, C&sub1;-C&sub3;&sub0;-Alkyl, C&sub1;-C&sub3;&sub0;- Alkenyl, C&sub1;-C&sub3;&sub0;-Alkynyl, unsubstituiertes oder substituiertes Aryl oder Aralkyl, wobei die zuletzt genannten Substituenten ausgewählt sind aus der Gruppe H, Alkyl bis C&sub3;&sub0;, Alkenyl bis C&sub3;&sub0;, Alkynyl bis C&sub3;&sub0;, Alkaryl, Aralkyl, -O-Alkyl bis C&sub3;&sub0;, -O-Alkenyl bis C&sub3;&sub0;, O-Alkynyl bis C&sub3;&sub0;, -O- Aralkyl, -NR&sub9;-Alkyl bis C&sub3;&sub0;, -NR&sub9;-Alkynyl bis C&sub3;&sub0;, -NR&sub9;-Alkenyl bis C&sub3;&sub0;, -NR&sub9;-Aralkyl, S-Alkyl bis C&sub3;&sub0;, -S-Alkenyl bis C&sub3;&sub0;, S-Alkynyl bis C&sub3;&sub0;, -S- Aralkyl, N&spplus;R&sub9;R&sub1;&sub1;-Alkyl bis C&sub3;&sub0;, N&spplus;R&sub9;R&sub1;&sub1;-Alkenyl bis C&sub3;&sub0;, N&spplus;R&sub9;R&sub1;&sub1;-Alkynyl bis C&sub3;&sub0;, -NHCOR&sub9;,
worin y eine Zahl von 0 bis 5 ist;
R&sub9; einen Substituenten bedeutet ausgewählt aus der Gruppe H, C&sub1;-C&sub3;&sub0;-Alkyl, C&sub1;-C&sub3;&sub0;-Alkenyl, C&sub1;-C&sub3;&sub0;-Alkynyl oder Aralkyl, R&sub1;&sub0; einen Substituenten bedeutet ausgewählt aus der Gruppe C&sub1;-C&sub3;&sub0;-Alkyl, C&sub1;-C&sub3;&sub0;-Alkenyl, C&sub1;-C&sub3;&sub0;- Alkynyl, Alkaryl oder Aralkyl;
R&sub1;&sub1; einen Substituenten bedeutet ausgewählt aus der Gruppe H oder C&sub1; bis C&sub3;-Alkyl; und
worin mindestens einer der Substituenten R&sub1;, R&sub2;, R&sub3;, R&sub4;, R&sub8;, R&sub9; oder R&sub1;&sub0; mindestens 23 Kohlenstoffatome besitzt, oder die Summe der geradkettigen Kohlenstoffatome in einem der zwei Substituenten mindestens 23 Kohlenstoffatome beträgt.
Inbesondere bevorzugt sind Chelatbildner der folgenden Formel:
worin R&sub1; COCH&sub2;SH, CH(CH&sub3;)C(CH&sub3;)=NOH oder CH&sub2;C(Me)&sub2;SH bedeutet; X ein Carbonyl oder Methylen bedeutet; und
R&sub2; einen Substituenten bedeutet, ausgewählt aus der Gruppe NHR&sub3;, NR&sub3;R&sub4; oder &spplus;NR&sub3;R&sub4;R&sub5;;
R&sub3; und R&sub4; Substituenten darstellen, die unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe C&sub1;-C&sub3;&sub0;-Alkyl, C&sub1;-C&sub3;&sub0;-Alkenyl, C&sub1;-C&sub3;&sub0;-Alkynyl, Aralkyl oder Alkaryl;
R&sub5; H oder C&sub1;-C&sub2;-Alkyl bedeutet; und mindestens einer der Substituenten R&sub3; oder R&sub4; mindestens 23 geradkettige Kohlenstoffatome besitzt, oder die Summe der geradkettigen Kohlenstoffatome in R&sub3; und R&sub4; mindestens 23 Kohlenstoffatome ergibt
Ebenfalls brauchbar ist ein Chelatmittel der Formel:
worin n 0 oder 2 ist; m 1 oder 2 ist; X CH oder N bedeutet; einer der Reste R&sub1; oder R&sub2; CH&sub2;CO&sub2;H ist, und der andere der Reste R&sub1; oder R&sub2; einen Substituenten bedeutet, ausgewählt aus der Gruppe Alkyl, Alkenyl, Alkynyl, Aralkyl oder Alkaryl, oder CH&sub2;-C&sub6;H&sub4;-NHCO- (Alkyl, Alkenyl, Alkynyl, Aralkyl, Alkaryl), deren Kohlenwasserstoffkette geradkettig oder verzweigt ist und mindestens 23 geradkettige Kohlenstoffatome besitzt. Chelatbildner dieser Formel sind vorzugsweise mit Indium komplexiert. Bei der praktischen Durchführung der Erfindung können natürlich, wenn erwünscht, verschiedene andere lipophile chelatisierende Derivate verwendet werden.
Zur Herstellung der Derivate der Bio-Affektions-Substanzen der vorstehend beschriebenen Formel R-B-R&sub1; kann eine Anzahl verschiedener Synthesewege verwendet werden. Diese umfassen:
(a) eine Alkylierungsreaktion zwischen "B" oder dem Vorläufer von "B" und der Kohlenwasserstoffketteneinheit R und/oder R' unter nukleophilem Ersatz einer guten Austrittsgruppe, und wenn erforderlich, nachfolgende Überführung von "Vorläufer in B". Z.B. können eine O-Alkylierung durch Verfahren durchgeführt werden, die denen von F. Fages et al., Bull, Soc. Chim. Fr. 959 (1985) oder von Felgner et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 84 (1987) 7413 beschriebenen analog sind; eine N-Alkylierung durch Verfahren, wie sie von A. Yamagishi, J. Phys. Chem. 85 (1981) 281; J. Sondermann, Liebigs Ann. Chem. 749 (1971) 183-197; oder S.M. Karesh, Ph.D. Disertation, University of Maryland, 1975, beschrieben sind; eine S-Alkylierung durch Verfahren, die von R.A. Pascal, Jr. und D.L. Ziering, J. Lipid Res 27 (1986) 221 oder L.H. DeRiemer et al., J. Labelled Compounds and Radiopharm 18 (1981) 1517 beschrieben werden.
(b) eine Acylierungsreaktion zwischen "B" oder "Vorläufer von B" und der Kohlenwasserstoffketteneinheit R und/oder R', und, wenn erforderlich, nachfolgende Überführung von "Vorläufer in B". Z.B. kann eine O- Acylierung unter Bildung einer Esterbindung durchgeführt werden durch Verfahren, die von C.L. Penney et al., J. Org. Chem. 50 (1985) 1457 oder A.W. Nicholas et al., Lipids 18 (1983) 434 beschrieben sind; eine N- Acylierung unter Bildung einer Amidbindung durch Verfahren, wie sie von T.G. Wensel und C.F. Meares in "Radioimmunoimaging and Radioimmunotherapy"; S. Burchiel, B.A. Rhodes, Herausgeber; Elservier, New York, 1983, Seite 1985 oder S. Hirano und W. Ohashi, Carbo. Res. 59 (1977) 285-288 beschrieben werden.
(c) durch eine Additionsreaktions zwischen "B" oder dem "Vorläufer für B" und der Kohlenwasserstoffketteneinheit R und R', an der eine Amino- oder Hydroxyl-Funktion und eine Isocyanat- oder Isothiocyanat- Funktion beteiligt sind, und, wenn erforderlich, nachfolgende Überführung von "Vorläufer in B". Für Additionsreaktionen an Isocyanat siehe Satchell und Satchell, Chem. Soc. Rev. 4 (1975) 231-250, und für Additionsreaktionen an Isothiocyanate siehe Walter und Bode, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 6 (1967) 281-293.
(d) durch eine Kondensationsreaktion zwischen "B" oder "Vorläufer von B" und der Kohlenwasserstoffketteneinheit R und/oder R', an der eine Aminofunktion und eine Aldehydfunktion unter Erhalt eines Derivates einer Schiff'schen Base beteiligt sind, und, wenn erforderlich, nachfolgende Überführung von "Vorläufer in B". Siehe z.B. die Europäische Patentveröffentlichung Nr. 0088695 A2 und die dort zitierten Referenzen.
Andere geeignete Reaktionsschemata, einschließlich von Variationen und Modifikationen der gerade erwähnten, sind für einen Fachmann auf diesem Gebiet ersichtlich.
Reaktionschemata, die zur Herstellung spezificher Klassen von zur praktischen Durchführung der Erfindung brauchbaren Verbindungen geeignet sind, sind die folgenden:

1. Fluoreszenzverbindungen mit lipophilen Schwänzen

Oxacarbocyaninderivate können wie im nachfolgenden Schema 1 gezeigt hergestellt werden. 2-Methylbenzoxazol (im Handel erhältlich) wird mit einem Alkyliodid (R'1) wie von J. Sims et al., Biochemistry 13 (1974) 3315-3330 beschrieben alkyliert und ergibt (1), das dann mit N,N'- Diphenylformamid (im Handel erhältlich) nach einem Verfahren, das analog dem im US-Patent 2647054 ist, unter Erhalt von (2) umgesetzt wird. Die Verbindungen (3) und (4) werden nach dem Verfahren von J. Sondermann, Liebigs Ann. Chem. 749 (1971) 183-197, hergestellt. Alkohol (ROH) wird mit 4-Chlorbenzolsulfonylchlorid (im Handel erhältlich) unter Erhalt von (3) behandelt, das dann mt 2-Methylbenzoxazol unter Erhalt von (4) umgesetzt wird. Die Zwischenprodukte (2) und (4) können zusammen durch Erhitzen am Rückfluß in Ethanol, das Triethylamin (zwei Äquivalente) enthält, unter Erhalt von Oxacarbocyanin (5) gekuppelt werden (eine Modifizerung des im US-Patent Nr. 2647054 beschriebenen Verfahrens).
Acridinderivate werden im Schema 2 dargestellt nach einem Verfahren, das analog ist zu dem von A. Yamagishi et al., J. Phys. Chem. 85 (1981) 281 beschriebenen Verfahren. 4-Chlorbenzolsulfonat (6) wird nach dem Verfahren von J. Sondermann, Liebigs Ann. Chem. 749 (1971) 183- 197 (siehe vorstehend) hergestellt, mit Acridinorange (7) (im Handel erhältlich) erhitzt und dann mit Kaliumjodid unter Erhalt von Acridiniumjodid (8) behandelt.
Geeignete Rhodamin B-Derivate können wie von P.M. Keller et al., J. Cell. Sci. 28 (1977) 167-177 beschrieben hergestellt werden. Dieses Verfahren wird im Schema 3 veranschaulicht, das eine Veresterung von Rhodamin B (9) (im Handel erhältlich) mit einem liphophilen Alkohol (ROH) über sein Säurechlond umfaßt.

2. Metallchelatbildner mit liphophilen Schwänzen.

Das Schema 4 veranschaulicht zwei Verfahren (a) und (b) zur Herstellung von Chelatbildnern vom Aninopolycarbonsäure-Typ, z.B. Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), mit lipophilen Schwänzen (R), die zur Komplexierung mit einem weiten Bereich von Metallkationen fähig sind.
Die Verbindung (12) kann hergestellt werden durch ein Verfahren, das dem von W.C. Eckelman et al., J. Pharm. Sci. 64 (1975) 704 beschriebenen analog ist. Dieses Verfahren umfaßt die Alkylierung von Diethylentriamin (10) (im Handel erhältlich) mit Alkylbromid (RBr), und nachfolgende Behandlung mit HBr unter Erhalt von (11). Das Zwischenprodukt (11) wird dann mit Natriumchloracetat unter Erhalt von (12) umgesetzt.
Ein anderes Verfahren umfaßt die Synthese der Verbindung (13) aus p-Nitrophenylalanin (im Handel erhältlich), wie von L.H. Deriemer et al., J. of Labelled Compounds and Radiopharm. 18 (1981) 1517-1534, beschrieben, und Kuppeln von (13) mit einem Säurechlond (RCOCl), wie von T.G. Wensel und C.F. Meares in "Radioimmunoimaging and Radioimmunotherapy", S. Burchiel, B.A. Rhodes, Herausgeber: Elsevier, New York, 1983, Seite 185, beschrieben, wodurch das Produkt (14) erhalten wird.
Die Synthese von drei zur Komplexierung mit Technetium geeigneten Chelatbildnern ist im Schema 5 veranschaulicht. Diese können vom Zwischenprodukt (15) abgeleitet werden, das aus Ethyl 2,3- diaminopropionat (siehe E.F. Godefoi, Chem. Abstr. 51 (1956) 463) von S.M.N. Efange et al., J. Nuc. Med. 28 (1987) 1012-1019, hergestellt wurde. Die Umsetzung von (15) mit einem lipophilen Amin RR'NH ergibt (16), das nach Säurehydrolyse dann (17) ergibt. Die Verbindung (17) kann in den Chelatbildner (18) überführt werden durch ein Verfahren, das dem von S.M.N. Efange et al. (J. Nuc. Med 28 (1987) 1012-1019) beschriebenen Verfahren analog ist, und das die Behandlung von (17) mit 2,2-Dithio- bis(2-methylpropanal) umfaßt (siehe H.F. Kung et al., J.Nuc. Med. 25 (1984) 326-332), und nachfolgende gleichzeitige Reduktion des Disulfids, des Diimins und des Amids mit Lithiumaluminiumhydrid.
Alternativ kann (17) in einen Chelatbildner (19) überführt werden durch ein Verfahren, das mit dem von R.O. Neiurinckx et al., J. Nuc. Med. 28 (1987) 191-202 beschriebenen analog ist, das die Behandlung von (17) mit 2,3-Butandionmonoxim (im Handel erhältlich) und nachfolgende Reduktion des Diimins mit Natriumborhydrid umfaßt.
Als andere Alternative kann (17) in den Chelatbildner (20) beschriebenen analog ist, und das die Umsetzung von (17) mit Chloracetylchlorid und nachfolgende Umsetzung mit Natriumthiobenzoat umfaßt, wonach die Spaltung der Benzoylgruppen mit Alkali bewirkt wird.

3. Proteinsubstanzen mit liphophilen Schwänzen

Zur Anbindung von lipophilen Schwänzen an Proteinsubstanzen werden nachfolgend vier mögliche Wege beschrieben.

(i) Via Cyanurchlorid (Trichlortriazin)

Dieses Verfahren wird im Schema 6 veranschaulicht und ist mit den Verfahren analog, die von C.W. Mahorey und A. Azzi, Biochem. J. 243 (1987) 569-574 und D. Blakeslee und M.G. Baines, J. Immuno. Meth. 13 (1976) 305-320, beschrieben werden. Der lipophile Schwanz (R) wird an die Cyanursäure (im Handel erhältlich) angefügt via nukleophilem Ersatz eines Chlors der Cyanursäure (21) durch ein Alkylamin unter Erhalt von Dichlortriazinylaminoalkyl (22), das dann an ein Protein unter Erhalt von (23) über einen weiteren nukleophilen Ersatz von Chlor durch eine Aminogruppe am Protein an das Protein gekuppelt wird.

(ii) Via aktivierte Ester

Dieses Verfahren wird im Schema 7 veranschaulicht und ist analog zu dem von A. Huang et al., Biochemica et Biophysica Acta 716 (1982) 140- 150, beschriebenen Verfahren. Es wird der aktivierte Ester (24) einer Säure mit einem lipophilen Schwanz, R, gebildet und einer nukleophilen Austauschreaktion am Estercarbonyl mit der Aminogruppe eines Proteins unterworfen. Der aktivierte Ester kann N-Hydroxysuccinimid, Trichlorphenol oder p-Nitrophenol sein, und wird normalerweise durch Kuppeln der Säure und von Alkohol mit Dicyclohexylcarbodiimid gebildet.

(iii) Via Addition an Isothiocyanat

Dieses Verfahren wird im Schema 8 veranschaulicht und ist analog zu den von Esteban et al., J. Nuc. Med. 28 (1987) 861 und C.F. Meares et al., Anal. Biochem. 142 (1984) 68-78 beschriebenen Verfahren. Der lipophile Schwanz, R, wird durch die Additionsreaktion eines Aminorestes am Protein an eine Isothiocyanat-Funktionalität an der lipophilen Einheit unter Bildung einer Thioharnstoff-Bindung angefügt.

(iv) Via Bildung von Schiff'scher Base

Im Fall von Glycoproteinen kann die Kohlenhydrat-Seitenkette selektiv durch chemische oder enzymatische Mittel oxidiert werden und die resultierende Aldehyd-Funktionalität mit einem liphophilen Amin unter Bildung eines Derivates einer Schiff'schen Base umgesetzt werden. Das Derivat der Schiff'schen Base kann dann, wenn erforderlich, mit Natriumborhydrid oder Natriumcyanoborhydrid unter Bildung eines stabileren Adduktes reduziert werden. Dieses Verfahren ist analog zu dem in der Europäischen Patentveröffentlichung 0088695 A2 beschriebenen Verfahren.

4. Kohlenhydrate mit liphophilen Schwänzen

N-Acetyl-D-neuraminsäurederivate mit lipophilen Schwänzen können hergestellt werden nach einem wie im Schema 9 dargestellten Verfahren, das analog ist zu dem von H. Ogura et al., Carbo. Res. 158 (1986) 37-51 beschriebenen Verfahren. Die von H. Ogura et al., aus N-Acetyl-D- neuraminsäure (25) (aus essbarem Vögelnest) durch Umsetzung mit saurem Methanol und dann mit Acetylchlorid hergestellte Verbindung (26) kann eine Koenigs-Knorr-Reaktion mit einem lipophilen Alkohol, ROH, eingehen unter Erhalt von (27) als Mischung der α- und β-Anomeren, die bei der Behandlung mit Natriumhydroxid zur Spaltung des Methylesters und der O- Acetate die lipophilen Derivate (28) ergeben.
Geeignete Heparinderivate können hergestellt werden unter Verwendung eines Verfahrens, das zu dem vom S. Hirano und W. Ohashi, Carbo. Res. 59 (1977) 285-288, analog ist, und die Umsetzung von N- desulfatisiertem Heparin mit einem lipophilen Anhydrid unter Erhalt eines N-Acylderivates umfaßt. SCHEMA 1 SCHEMA 2 SCHEMA 3 SCHEMA 4 SCHEMA 5 SCHEMA 6 SCHEMA 7 SCHEMA 8 SCHEMA 9 Koenigs-Knorr
Wie bereits erwähnt ist die Natur der an den erfindungsgemäßen Verbindungen vorhandenen Kohlenwasserstoffschwänze für den Erfolg der Bindung der Bio-Affektions-Einheit an die Plasmamembran der Zelle wichtig. In Verbindungen mit einzelnen Kohlenwasserstoffschwänzen, z.B. Acridinderivaten, sollte die geradkettige Zahl der Kohlenstoffatome 23 oder größer sein. In Verbindungen mit 2 oder mehr Kohlenwasserstoffschwänzen muß einer der Schwänze eine geradkettige Länge von mindestens 12 Kohlenstoffatomen besitzen, und die Summe der geradkettigen Kohlenstoffatome in den Kohlenwasserstoffschwänzen mindestens 23 betragen. Der Membranretentionskoeffizient sollte mindestens 90 sein. Mit anderen Worten müssen mindestens 90 % der zu testenden Verbindung während eines Zeitraums von 24 Stunden zurückgehalten werden. Das Verfahren zur Bestimmung des Membranretentionskoeffizienten wird nachfolgend beispielhaft veranschaulicht.
Wie bereits erwähnt müssen die erfindungsgemäßen Verbindungen dazu fähig sein, an die Trägerzellen ohne nennenswerte Toxizität gegenüber den Trägerzellen zu binden. Um das Ausmaß der Cytotoxizität zu bestimmen, werden die Zellen einer erfindungsgemäßen Verbindung bei verschiedenen Konzentrationen, einschließlich der Konzentration 0, ausgesetzt. Die Zellen werden dann der Einwirkung von Trypanblau oder Propidiumjodid ausgesetzt (F. Celada und B. Rotman, Proc. Natl. Acad. Sci. 57 (1967) 630). Diese Farbstoffe werden normalerweise durch eine lebende Zelle ausgeschlossen und durchdringen nur die Membran einer toten Zelle. Nach der geeigneten Inkubationszeit werden die Zellen mit einem Mikroskop oder einem Durchflußcytometer untersucht und der Prozentsatz an angefärbten Zellen (Prozent toter Zellen) bestimmt. Eine Verbindung ist dann für die hier beschriebenen Applikationen nur annehmbar, wenn die Cytotoxizität bei den zur Zellbindung verwendeten Konzentrationen der Verbindung geringer als 10 % ist. Alle nachfolgend beispielhaft beschriebenen Verbindungen erfüllen dieses Kriterium.
Die Bindung der erfindungsgemäßen Verbindungen an Trägerzellen sollte auch keine nennenswerte nachteilige Wirkung auf die gewünschten Zeilfunktionen haben. Da die praktische Durchführung der Erfindung Zellen als Trägervehikel verwendet, ist es wichtig, daß die Bindung der erfindungsgemäßen Verbindungen an Zellen die Zellfunktionen, die für ihre Fähigkeit als Träger zu wirken wichtig sind, nicht verändert. Für die markierte Zelle kann es z.B. wichtig sein, sich zu teilen, um in einer bestimmten Applikation zu wirken. Auf der anderen Seite können die verwendeten Verbindungen einige Funktionen, die keine Wirkung auf das Teilungspotential oder ein anderes Verhaltenserfordernis der Zelle für die beabsichtigte Applikation haben, ändern. Solche Verbindungen können deshalb als ohne nennenswerte schädliche Wirkung auf die Zellfunktion für den Zweck ihrer erfindungsgemäßen Verwendung angesehen werden. Nachfolgend werden Verfahren zur Bestimmung der von erfindungsgemäßen Verbindungen hervorgerufenen Wirkung auf Zeilfunktionen, die für die praktische Durchführung dieser Erfindung von potentieller Bedeutung sein können, beispielhaft erläutert.
Bei der Auswahl eines Zellbindungsmediums müssen, damit erfindungsgemäße Verbindungen reproduzierbar an die Plasmamembran von Zellen ohne Verringerung der Zellebensfähigkeit oder ohne eine andere schädliche Wirkung auf die gewünschte Zellfunktion hervorzurufen, zwei Kriterien erfüllt werden. Das Zellbindungsmedium muß (i) bei einer iso- osmotischen Konzentration vorliegen, um keine Schrumpfung oder ein Quellen und eine mögliche Beschädigung der Zellen zu verursachen und (ii) es den erfindungsgemäßen Verbindungen erlauben, in einer solchen Weise solubilisiert zu werden, daß sie in geeigneten Konzentrationen erhältlich sind, um in die Plasmamembran der Zellen eingebaut zu werden.
Wie vorstehend angegeben besitzen die erfindungsgemäßen Verbindungen eine lipophile Natur, die es ihnen erlaubt, in der Plasmamembran der Zelle eingebettet zu werden und dort auf stabile Weise zu verbleiben. Die spezifischen Eigenschaften, die es den erfindungsgemäßen Verbindungen erlauben, für eine Zellmarkierung verwendet zu werden, nämlich die Tendenz, sich vorzugsweise in der nicht- polaren Umgebung der Membran anzuordnen und nicht über das umgebende ionische Medium zu Nachbarzellen überzutreten, schafft das Problem der Applikation solcher Verbindungen für Zellen in einer Weise, die eine reproduzierbare Bindung erlaubt. Versuche zum Zeitverlauf der Löslichkeit haben gezeigt, daß die Verbindungen, die dazu dienen, die Plasmamembran stabil zu markieren, wenn sie in ionischen Lösungen (z.B. Phosphat- gepufferte Salzlösung, Kulturmedium usw.) solubilisiert werden, dazu tendieren, Micellen oder Aggregate auszubilden, die ausgefällt werden können. Die Konzentration solcher Verbindungen in einer für die Bindung an die Plasmamembran geeigneten Form wird so verringert und zeitabhängig, wodurch sich ein verringerter Einbau der Verbindung in die Plasmamembran ergibt. Darüberhinaus tritt eine solche Verbindung in einer nicht konsistenten Weise auf.
Die iso-osmotische Charakterisierung des Bindungsmediums kann unter Verwendung einer im Handel erhältlichen Instrumentierung (uOsmette, Precision Instruments, Sudbury, Mass) durchgeführt werden. Diese Instrumentierung mißt genau die Gefrierpunktsdepression einer bestimmten Lösung, die Informationen über die Konzentration oder den osmotischen Druck der Lösung gibt. Eine iso-osmotische Lösung unterstützt eine bestimmte Zelle, ohne irgendeine Wirkung auf ihr Volumen auszuüben. Die Osmolaritäten von Lösungen, die Säugerzellen unterstützen, liegen normalerweise im Bereich von zwischen 260 und 340 Milliosmols. Durch diese Messungen kann die Konzentration einer bestimmten Lösung, die verwendet werden kann, um die erfindungsgemäßen Verbindungen zu applizieren, so eingestellt werden, daß eine iso-osmostische Lösung erhalten wird. Das Bindungsmedium sollte auch für das Bioteilchen, an das die Verbindung gebunden werden soll, isotonisch sein.
Das zweite Kriterium der Auswahl eines geeigneten Mediums zur Bindung der Verbindungen erfordert die experimentelle Ermittlung der tatsächlichen Stabilität dieser Verbindungen in einem bestimmten Medium und kann durch eine Löslichkeitsbestimmung der Verbindung (CSD) charakterisiert werden. Bei der Durchführung einer solchen Bestimmung wird mit der Verbindung eine ethanolische Vorratslösung einer Konzentration von 2 x 10&supmin;³ M hergestellt. Aus der ethanolischen Vorratslösung werden 10 ml einer Arbeitslösung hergestellt, damit eine Endkonzentration von 1 bis 4 x 10&supmin;&sup5; M erhalten wird. Ein Milliliter dieser Lösung wird dann in jedes von sechs 1,5 ml Mikrozentrifugen- Röhrchen zu gleichen Teilen aufgeteilt. Ein Röhrchen wird bei 10000 x g mit Zeiten von 0, 15, 30, 45, 60 und 120 Minuten mikrozentrifugiert. Ein 100 µl-Anteil wird aus dem Überstand entfernt und für jede Zentrifugierzeit-Probe mit 3,0 ml Ethanol verdünnt. Die Konzentrationen der Fluoreszenzverbindung in den Überständen der Zentrifugenzeiten von mehr als 2 Stunden können bestimmt werden, indem man die von einem Spektrofluorometer erhaltenen Fluoreszenzeinheiten unter Verwendung der Peakanregung und der Emissionswellenlängen für die zu untersuchende Verbindung beobachtet.
Für radioisotope Verbindungen ist das gleiche experimentelle Verfahren anwendbar, und die Ergebnisse können unter Verwendung von oder γ-Zählern bestimmt werden. In allen Fällen wird die Menge der erfindungsgemäßen Verbindung im Überstand der iso-osmotischen Lösung bei jeder Zentrifugenzeit mit einer Probe einer solchen Verbindung unter Verwendung von Ethanol als Lösungsmittel verglichen, das, obwohl es für die Markierung von Zellen nicht geeignet ist, dazu dient, um die maximale Löslichkeit der Verbindung (total) zu gestatten. Die Löslichkeit der Verbindung in Prozent wird in jeder Zusammensetzungsformulierung bestimmt und während des Verlaufs von zwei Stunden verfolgt. Irgendeine Zusammensetzungsformulierung, die eine Abweichung von mehr als 20 % während des zweistündigen Zeitraums zeigt, wird nicht zu einer reproduzierbaren Bindung der zu untersuchenden Verbindung an die Plasmamembran führen.
In die Bestimmung der Konzentration der zur Bindung an die Plasmamembran der Zellen verwendeten erfindungsgemäßen Verbindung gehen verschiedene Faktoren ein. Die von der Verbindung hervorzurufende beabsichtigte Wirkung, der zu markierende Zelltyp und das Verfahren zur Bestimmung sind die primären Faktoren. Um z.B. das Zellwachstum oder die Teilung unter Verwendung von Fluoreszenzverbindungen zu verfolgen, ist die höchste mögliche Konzentration erwünscht, die kein Quenschen dieser Verbindungen verursacht und die einen großen dynamischen Bereich zwischen markierten und nicht-markierten Zellarten erlaubt. Es gibt jedoch eine obere Grenze für den übermäßigen Einbau der Verbindung in die Plasmamembran. Unter Verwendung von Gewebekulturzellen erlauben es Konzentrationsbereiche von 1 x 10&supmin;&sup6; M bis 1 x 10&supmin;&sup5; M, mindestens 6 Zellteilungen der Population zu verfolgen, während von Konzentrationen von mehr als 4 x 10&supmin;&sup5; M festgestellt wurde, daß sie eine cytotoxische Wirkung auf bestimmte zu markierende Zelltypen erzeugt.
Bei den Radioisotopen-Verbindungen sind unterschiedliche Gesichtspunkte zu beachten. Hier ist die Bestimmung der Konzentration der Verbindungen für die Applikation an eine Plasmamembran primär abhängig von der Empfindlichkeit des Bestimmungsverfahrens und damit der Energie des verwendeten Radioisotops. Die Zeit, die für markierte Zellen erforderlich ist, um ihre Zielstelle zu erreichen, wird ebenfalls wichtig und in der idealen Situation existiert ein Gleichgewicht zwischen allen diesen Faktoren. Für diagnostische Zwecke ist es das Ziel, genug der radio-bindenden Verbindung einzubauen, um eine Bestimmung des Ortes der markierten Zellen zu erlauben, nachdem sie den Ort des Interesses erreicht haben, während gleichzeitig die Menge der auf den Patienten wirkenden Strahlung minimalisiert wird. Die Halbwertszeit und die durch das verwendete Radioisotop emittierte Energie, sowie die Zahl der markierten Zellen, die notwendig sind, um die Stelle des Interesses abzubilden und diagnostisch zu lokalisieren, tragen alle gleichermaßen zur optimalen oder minimalen Konzentration für die Zellbindung bei.
Es werden nun unter Bezugnahme auf bestimmte diagnostische und therapeutische Applikationen repräsentative Verfahren zur Verwendung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen beschrieben.

Zellmarkierung mit Fluorochrom

Erfindungsgemäße Fluoreszenzverbindungen werden in Abwesenheit von Serum und anderen Lipid-enthaltenden Materialien an Trägerzellen appliziert. Die Zellen werden vom Körper entfernt oder aus der Kultur entnommen und frei von Serum gewaschen. Sie werden in einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung suspendiert, die das iso-osmotisch regulierende Mittel aber nicht in ionischer Lösung und eine geeignete Konzentration der Fluoreszenzverbindung (10&supmin;&sup5; bis 10&supmin;&sup7; M) enthält. Die Bindung der Verbindung an die Zellen ist im allgemeinen innerhalb von 10 Minuten vervollständigt und die Bindungsreaktion wird durch Zugabe eines autologen oder heterologen Serums beendet. Die Zellen werden dann in Serum-enthaltendem Medium (5-10 % v/v) gewaschen und, abhängig von der Applikation, in eine Kultur gegeben oder dem Tier injiziert.
Das Verfahren zur Zellbindung von Verbindungen der hier beschriebenen Art wird detaillierter in der vorstehend genannten US- Patentanmeldung Serial Nr. 925192 beschrieben.
Ein anderes Verfahren umfaßt das Suspendieren der Fluoreszenzverbindung in Salzlösung, um eine Micellenbildung zu erlauben. Die Zellen werden dann in die resultierende Suspension gegeben und die phagocytischen Zellen (z.B. Monocyten, Makrophagen und Neutrophile) werden bevorzugt markiert. Auf diese Weise ist es möglich, die Anfärbung selektiv an phagocytischen Zellen vorzunehmen.
Die Bindung eines Fluorochroms an transplantierte Knochenmarkzellen auf die gerade beschriebene Weise erlaubt die Bestimmung, ob die Zellen an eine spezifische Stelle der Hämatopoese wandern und, nach Bestimmung einer solchen Stelle, ob dort eine Zellteilung auftritt. Eine Fraktion der Donorzellen wird einer Dichtegradienten-Sedimentation unterworfen und die mononuklearen Zellen werden isoliert, gewaschen und mit der nicht- ionischen Applikationsform der Fluoreszenzverbindung markiert. Die gewaschenen Fluoreszenz- markierten Zellen werden dem Empfänger intravenös injiziert. In periodischen Intervallen (2-4 Stunden) wird durch Venipunktur Blut entnommen und der Prozentsatz an markierten Zellen z.B. unter Verwendung der Durchflußcytometrie, bestimmt. Die Geschwindigkeit des Verschwindens der Zellen aus dem Kreislauf ist ein Maß der Geschwindigkeit, mit der die Zellen zu den Zentren der hämatopoetischen Aktivität zurückkehren. Zusätzlich wird in wöchentlichen Intervallen abgesaugtes Knochenmark entnommen und dann einer Dichtegradienten-Sedimentation unterworfen. Die nach diesem Verfahren erhaltene mononukleare Population wird dann einem "Cocktail" monoklonaler Antikörper ausgesetzt, die an Myeloidzellen binden, und mit einer Fluoreszenzfarbe, die von der Tracking-Verbindung verschieden ist, markiert. Unter Verwendung von monoklonaler Fluoreszenz und Durchflußcytometrie ist es dann möglich, die Fluoreszenzintensität des Tracking-Farbstoffes an den Zellen, die myeloiden Ursprungs sind, zu bestimmen.
Wenn die Intensität des Tracking-Farbstoffes an den Myeloidzellen mit der Zeit abnimmt, dann kann die Wachstumsgeschwindigkeit für diese Zellen bestimmt werden. Dieses Verfahren wird ausführlicher in der vorstehend genannten US-Patentanmeldung Serial Nr. 925445 beschrieben, dessen gesamte Beschreibung hiermit unter Bezugnahme darauf Bestandteil der vorliegenden Beschreibung ist, so wie wenn sie vollständig wiedergegeben würde. Die Tatsache, daß die Zellen wachsen ist außerdem von klinischer Bedeutung, um zu zeigen, daß das transplantierte Mark repopularisiert. Ähnliche Verfahren werden, wenn erwünscht, zur Untersuchung anderer Zellfamilien verwendet.
Eine andere Applikation der Fluoreszenz-markierten Zellen ist die Testung auf Chemosensitivität. Nachdem ein primärer Tumor ausgeschnitten ist, werden die Zellen dispergiert und mit einer erfindungsgemäßen Fluoreszenzverbindung markiert. Die Zellen werden dann in Vertiefungen gegeben und die Fluoreszenzintensität der Zellen bestimmt, z.B. mittels quantitiver Cytometrie. Wenn sich die Zellen teilen, verringert sich die Fluoreszenzintensität und dieser Verlust der Fluoreszenz kann mit einem Cytometer bei verschiedenen Intervallen nach Einbringen der Zellen in die Kultur bestimmt werden. Die Geschwindigkeit der Fiuoreszenzabnahme in Gegenwart oder Abwesenheit verschiedener Konzentrationen eines chemotherapeutischen Wirkstoffes ist ein Maß für die von dem Wirkstoff verursachte Cytostase. Zusätzlich kann gleichzeitig ein Farbstoff- Ausschlußtest verwendet werden, um den Grad der Cytotoxizität zu bestimmen. Wenn der Tracking-Farbstoff grün fluoresziert, dann könnte der rote Farbstoff Propidiumjodid für Cytotoxizitätsmessungen verwendet werden. Außerdem ist es möglich, monoklonale Antikörper, die spezifisch Tumorzellen binden, in Kombination mit den gerade beschriebenen Farbstoffen zu verwenden, um die Cytostase und Cytotoxizität an Tumorzellen und normalen Zellen unabhängig voneinander zu verfolgen.
Fluoreszenz-markierte Zellen könne auch verwendet werden, um das Schicksal von übertragenen roten Blutkörperchen zu verfolgen, um zu bestimmen, ob der Patient eine post-chirurgische Blutung besitzt, oder ob eine Autoimmun-Hämolyse vorliegt. Um dieses Ziel zu erreichen, wird ein Teil der zu übertragenden roten Blutkörperchen mit der Fluoreszenzform des Tracking-Farbstoffes markiert. Die Fluoreszenzzellen werden mit den übrigen der nicht fluoreszierenden Zellen übertragen und sofort post- chirurgisch eine Blutprobe entnommen, z.B. durch Venipunktur. Die Prozentzahl an Fluoreszenzzellen kann bestimmt werden unter Verwendung der Durchflußcytometrie oder der Fluorometrie. In periodischen Intervallen werden zusätzliche Blutproben entnommen und die Prozentzahl an markierten Zellen bestimmt. Wenn der Patient eine post-chirurgische Blutung zeigt, verändert sich das Verhältnis von fluoreszierenden zu nicht-fluoreszierenden Zellen nicht, auch wenn die Hematokritsedimentation abfällt. Wenn der Patient eine Autoimmun-Hämolyse zeigt, nimmt das Verhältnis von fluoreszierenden zu nicht- fluoreszierenden Zellen ab, weil der Antikörper nur gegen die übertragenen Zellen gerichtet ist.

Radioabbildung

Die erfindungsgemäßen Verbindungen, die die Fähigkeit besitzen, an die Lipidphase der Membran zu binden und Indium-111 oder Technetium-99m, oder andere radio-abbildende Atome zu chelatisieren, werden zuerst an das radioaktive Ion gebunden, um einen stabilen Komplex auszubilden. Der Komplex wird vom freien Radioisotop abgetrennt, dann in ein iso-osmolares Lösungsmittel, das nicht ionisch ist, übertragen. Die Zellen werden zusammen mit dem Chelator-Radioisotop-Komplex in dieses Lösungsmittel gegeben und der Komplex dann an die Zellmembran gebunden. Die Bindungsreaktion wird mit einem autologen oder heterologen Serum beendet. Die Zellen (oder Viren) werden von ungebundenem Chelator-Radioisotop- Komplex freigewaschen und die Zellen (oder Viren) sind fertig, um in das Tier injiziert zu werden, und der endgültige Ort kann unter Verwendung einer γ-Kamera bestimmt werden.
Solche Verbindungen können verwendet werden, um die Stelle der verdeckten Infektion über die Bindung an eine Neutrophil, den primären phagocytischen Leukocyt des Blutes, zu lokalisieren. Beim Versuch die Stelle einer verdeckten Infektion in einem symptomatischen Individuum zu lokalisieren, werden Leukocyten vom Blut des Individuums isoliert. Diese Zellen werden dann, im allgemeinen wie vorstehend beschrieben, mit Indium oder Technetium markiert und intravenös injiziert. Innerhalb der nächsten 48 Stunden wandern die radioaktiv-markierten Neutrophile an die Stelle der Infektion, wo die γ-Emission unter Verwendung einer γ-Kamera bestimmt werden kann.
In einer anderen Applikation dieser Technologie kann ein Plättchen an die Stelle eines frischen Plaques an den Arterienwänden oder an einem Thrombus verfolgt werden. Beim Versuch, die Stelle einer Plaquebildung in einem symptomatischen oder asymptomatischen Individiuum zu lokalisieren, werden aus dem Blut des Individiuums unter Verwendung von Standard- Gradientenverfahren Plättchen isoliert. Diese Zellen werden dann, wie beschrieben, mit Indium oder Technetium markiert, und intravenös injiziert. Ein geeignetes Verfahren zur Bindung einer Verbindung des hier beschriebenen Typs an Plättchen wird in der vorstehend genannten US- Patentanmeldung Serial Nr. 925192 beschrieben. Innerhalb der nächsten 48 Stunden wandern die radioaktiven markierten Plättchen an die Stelle der Plaquebildung an Arterienwänden, wo die γ-Emission unter Verwendung einer γ-Kamera bestimmt werden kann.
In einer anderen Applikation der hier beschriebenen radio- Abbildungstechnik kann ein einen Tumor infiltrierender Lymphocyt aus einer primären Lesion isoliert werden, in Il-2 entwickelt werden, mit einer Tracking-radioisotopen Form einer erfindungsgemäßen Verbindung markiert werden und die gewaschenen Zellen intravenös injiziert werden. In dieser Applikation wird die Annahme gemacht, daß sich ein einen Tumor- infiltrierender Lymphocyt an der Tumorstelle befindet, weil die Gegenwart von Tumorzellen bestimmt werden kann, die dann an diese Stelle wandern. Außerdem ist die Häufigkeit von Tumortracking-Lymphocyten im Blutkreislauf sehr gering, und unter Verwendung der in dem primären Tumor gefundenen Lymphocyten wird von dem körpereigenen Mechanismus, diese Tracking-Zellen zu konzentrieren, Gebrauch gemacht. Diese Zellen werden in Gegenwart eines für Lympocyten spezifischen Wachstumsfaktors (Il-2) und in Gegenwart von Tumorzellen gezüchtet. Das in vitro-Wachstum der Lymphocyten vergrößert ihre Zahl so, daß ein Teil dieser Zellen radioaktiv markiert und injiziert wird, während der Rest in Dimethylsulfoxid (DMSO) und Serum gegeben wird und zur Konservierung bei der Temperatur von flüssigem Stickstoff eingefroren wird. Diese eingefrorenen Zellen können aufgetaut, radioaktiv markiert und periodisch injiziert werden, und danach unter Verwendung von γ-Abbildungstechniken sichtbar gemacht werden, um die Stelle der metastatischen Lesionen zu lokalisieren.

Radioisotop-Markierung

Obwohl es möglich ist, Chelatbildner zu verwenden, um radioaktive Metallionen zu binden, ist es auch möglich, fluoreszierende oder nicht- fluoreszierende Verbindungen der Formel R-B-R&sub1; herzustellen, worin die radioisotopen Atome Bestandteil des Moleküls sind. Z.B. können radioaktives Jod, Kohlenstoff, Stickstoff, Schwefel, Phosphor oder Selen in erfindungsgemäßen Verbindungen eingebaut werden. Verbindungen, die γ- Strahlen einer ausreichenden Energie emittieren, können unter Verwendung der γ-Scintographie bestimmt werden. Für diese Radionuklide können alle vorstehend unter dem Stichwort Radio-Abbildung beschriebenen Applikationen gleichermaßen durchgeführt werden. Wenn das Isotop nicht penetrierende β-Strahlen geringer Energie aussendet, dann kann die Verbindung für Forschungszwecke unter Verwendung von Standard-β- Zählverfahren verwendet werden.

Abbildung durch magnetische Resonanz

Die erfindungsgemäßen Verbindungen, die die Fähigkeit besitzen, die Lipidphase der Membran zu binden, und Gadolinium oder andere MRI- Kontrast-erhöhende Mittel zu chelatisieren, werden zuerst an die ionischen Formen des ausgewählten Metalles unter Bildung eines Komplexes gebunden. Der Komplex wird von den freien MRI-Kontrastmitteln abgetrennt und dann in ein iso-osmolares Lösungsmittel, das nicht ionisch ist, übertragen. Die zu bestimmenden Zellen werden in das Lösungsmittel, das den Chelator-Ionen-Komplex enthält, eingebracht, der an die Plasmamembran der Zellen gebunden wird. Die Bindungsreaktion wird mit autologem oder heterologem Serum beendet und die gewaschenen Zellen können für eine Abbildung aufgrund magnetischer Resonanz verwendet werden. Verbindungen des eben beschriebenen Typs ermöglichen die Bestimmung der Stelle einer verdeckten Infektion. Zur Lokalisierung der Stelle einer verdeckten Infektion in einem symptomatischen Individuum werden Leukocyten aus dem Blut des Individuums isoliert. Diese Zellen werden dann mit einem Chelator-Gadolinium-Komplex, wie beschrieben, markiert und intravenös injiziert. Innerhalb der nächsten 48 Stunden wandern die mit dem Kontrastmittel markierten Neutrophilen an die Stelle der Infektion, wo sie durch magnetische Resonanzabbildung bestimmt werden können.
In einer anderen erfindungsgemäßen MRI-Applikation kann ein Plättchen an die Stelle eines frischen Plaques an Arterienwänden oder einem Thrombus verfolgt werden. Zur Lokalisierung der Stelle einer Plaquebildung in einem symptomatischen oder eine asymptomatischen Individuum werden Plättchen aus dem Blut des Individuums unter Verwendung von Standard-Gradientenverfahren isoliert. Diese Zellen werden dann mit einem Chelator-Gadolinium-Komplex, wie beschrieben, markiert und intravenös injiziert. Innerhalb der nächsten 48 Stunden wandern die mit dem Kontrastmittel markierten Plättchen an die Stelle der Plaquebildung an den Arterienwänden, wo sie durch magnetische Resonanzabbildung bestimmt werden können.
In einer anderen erfindungsgemäßen MRI-Applikation kann ein einen Tumor-infiltrierender Lymphocyt aus einer primären Lesion isoliert, in Il-2 entwickelt und mit einem gegenüber magnetischer Resonanz empfindlichen Isotop markiert und intravenös injiziert werden. In dieser Applikation wird die Annahme gemacht, daß die Tumor-infiltrierenden Lymphocyten an der Stelle des primären Tumors sind, weil die Gegenwart von Tumorzellen bestimmt werden kann, und diese dazu fähig sind, an die Stelle einer Metastase zu wandern. Außerdem ist die Häufigkeit von Tumor- Tracking-Lymphocyten im Blutkreislauf sehr gering und unter Verwendung der in dem primären Tumor gefundenen Lymphocyten wird von dem körpereigenen Mechanismus, diese Tracking-Zellen zu konzentrieren, Gebrauch gemacht. Die Zellen wachsen in Gegenwart eines Lymphocyten- spezifischen Wachstumsfaktors (Il-2) und in Gegenwart von Tumorzellen. Das in vitro-Wachstum der Lymphocyten vergrößert ihre Zahl, weshalb ein Teil dieser Zellen isotopisch markiert und injiziert werden, während der Rest in DMSO und Serum gegeben wird, und zur Konservierung bei der Temperatur von flüssigem Stickstoff eingefroren wird. Diese eingefrorenen Zellen können aufgetaut, isotopisch markiert und in mehreren Intervallen nach der anfänglichen Wachstumsperiode injiziert werden. Die markierten Tumor-infiltrierenden Lymphocyten werden dann injiziert, wodurch sie an die Stelle von metastatischen Tumoren wandern und durch magnetische Resonanzabbildung bestimmt werden können.

Zellbestimmung (Zell-Targeting) durch Binden spezifischer Proteine an Zellmembranen

In einer anderen Ausführungsform umfassen die erfindungsgemäßen Verbindungen Proteinsubstanzen, einschließlich von Proteinen, Glycoproteinen, Lipoproteinen oder Peptiden als Bio-Affektions-Einheit. Diese Verbindungen werden so formuliert, daß sie den iso-osmotischen Regulator enthalten, der mit ihrer Lösung und Zellebensfähigkeit kompatibel ist. Die Zellen werden in das Zell-bindende Medium gegeben, wobei die Kohlenwasserstoffketten der Verbindungen in der Plasmamembran eingebettet werden, und das Protein auf der Oberfläche eines spezifischen Zelltyps plaziert wird.
Das gerade beschriebene Verfahren kann verwendet werden, um einen monoklonalen Antikörper für menschliches Fibrin an die Oberfläche einer Tracking-Zelle, z.B. eines roten Blutkörperchens, zu binden. Das Antikörper-gebundene rote Blutkörperchen wird dann, wie vorstehend beschrieben, unter Verwendung von radioabbildenden Verbindungen oder von durch magnetische Resonanz abbildenden Verbindungen Isotopen- markiert. Diese doppel markierte (anti-Fibrin + Isotop) Zelle kann einem Patienten injiziert werden, wobei die Zelle an die Stelle eines Fibringerinnsels wandert und unter Verwendung von Standard-γ-Scintographie oder Kernabbildung sichtbar gemacht werden kann.
In einer anderen erfindungsgemäßen Applikation kann ein monoklonaler Antikörper gegen menschliche Zelloberflächentumorantigene an die Oberfläche einer Tracking-Zelle, z.B. einem Monocyt oder Lymphocyt, gebunden werden. Die resultierende Zelle wird dann, wie vorstehend beschrieben, unter Verwendung der radio-abbildenden Verbindungen oder der durch magnetische Resonanz abbildenden Verbindungen Isotopen-markiert. Diese doppel markierte (anti-Tumorzelle + Isotop) Zelle wird einem Patienten injiziert, wodurch die Zelle die Stelle eines Tumors aufspürt und unter Verwendung von Standard-γ-Scintographie oder MRI abgebildet werden kann.
In einer anderen Applikation dieser Technologie wird (R-tPA-R1) an die Oberfläche einer Tracking-Zelle (z.B. eines roten Blutkörperchens) appliziert. Die gleiche Zelle wird dann wie vorstehend beschrieben unter Verwendung der radio-abbildenden Verbindungen oder der durch magnetische Resonanz abbildenden Verbindungen Isotopen-markiert. Diese doppel markierte (tPA + Isotop) Zelle wird einem Patienten injiziert, wodurch die Zelle die Stelle eines Fibringerinnsels aufspürt und unter Verwendung von Standard-γ-Scintographie oder Kernabbildung abgebildet werden kann.

Beispiel 1

Bestimmung der auf die Zellfunktion durch Bindung von Verbindungen an die Plasmamembran hervorgerufenen Wirkungen

a. Wirkung auf die Wachstumsgeschwindigkeit von Zellen

Um die Wirkung von erfindungsgemäßen Verbindungen auf die Zellwachstumsgeschwindigkeit zu messen, müssen die Zellen zuerst verschiedenen Konzentrationen einer ausgewählten Verbindung ausgesetzt werden.
Dazu werden logarithmisch wachsende Yac-1-Zellen einmal in PBS gewaschen und in einer Lösung des Fluorochroms 3,3'- Ditetradecylooxacarbocyanin (DiO-Cl4 (3)) (10&supmin;&sup5; M) bei einer Konzentration von 10&sup6;-10&sup7; Zellen/ml während 5 Minuten bei Raumtemperatur resuspendiert. Die Bindungsreaktion wurde durch Zugabe eines gleichen Volumens von fötalem Kälberserum (FCS) beendet und die Zellen bei 400 x g 5 Minuten lang pelletisiert, gewaschen (3x) und in komplettem Medium resuspendiert. Unter Verwendung eines Coulter EPICS 753 Durchflußcytometers wurden Messungen der Fluoreszenzintensität durchgeführt. Zur Anregung des Farbstoffes wurden 200 mW eines Lichts von 488 mm verwendet und die grüne Fluoreszenz von Propidiumjodid-negativen Zellenwurde unter Verwendung eines 525 nm Durchgangsbereich-Interferenzfilter gemessen.
In Figur 1 ist die Fluoreszenzintensität von mit DiOC&sub1;&sub4;(4) angefärbten Yac-1 Zellen, die in Figur 1 wiedergegeben ist, im Vergleich zu den nicht angefärbten Kontrollen extrem hell. Ännliche Ergebnisse wurden mit anderen erfindungsgemäßen Fluoreszenzverbindungen erhalten. In Figur 1A wird ein großer dynamischer Bereich zwischen Fluoreszenz- positiven und Fluoreszenz-negativen Zellen dargestellt. Der Bereich der Färbereaktion ist so groß, daß die Fluoreszenzintensität auf einer halblogarithmischen Skala aufgetragen werden muß.
Um die Wachstumsgeschwindigkeit von Zellen zu verfolgen, wurden DiO-C&sub1;&sub4;-(3)-gebundene Zellen in einem Inkubator in komplettem Kulturmedium (DMEM High Glucose + 20 % FBS) gegeben und täglich unter Verwendung von Durchflußcytometrie-Verfahren analysiert. Das Instrument wurde täglich justiert und unter Verwendung von fluoreszierenden Mikroperlen-Standards die Intensitätseinstellungen reproduziert. Aus jedem Fluoreszenzprofil wurde die mittlere Fluoreszenzintensität und die Standardabweichung bestimmt. Als Ergebnis dieser Bestimmungen wird ein Abfall in der Fluoreszenzintensität beobachtet (Figur 1B).
In Figur 2 werden die Wachstumsgeschwindigkeiten für gefärbte und nicht-gefärbte Yac-1-Zellen verglichen. Separate Kolben von mit DiO-C&sub1;&sub4;- (3)-markierten und nicht-markierten Kontrollkulturen (Yac-1) wurden zur Zeit 0 auf 2 x 10&sup5; Zellen/ml eingestellt. Die Zellzählungen wurden unter Verwendung eines Coulter ZBI Zellzählgerätes (Coulter Electronics, Inc. Hialeah, Fl) erhalten. Die Messungen der Fluoreszenzintensität wurden wie vorstehend unter Bezugnahme auf Figur 1 beschrieben bestimmt. Die mittleren Log-Fluoreszenzintensitäten wurden für jeden Zeitpunkt bestimmt und die inverse Fluoreszenz berechnet und aufgetragen. Zu jedem Zeitpunkt wurden die an Vierfach-Proben bestimmten Standardabweichungen berechnet und aufgetragen, und weil die Wachstumsgenetik exponentiell ist, ist eine halblogarithmische Grafik der Fluoreszenzintensität während der Log-Phase des Wachstums, wie in Figur 2 dargestellt, linear. Aus der Figur 2 ist es ersichtlich, daß die Wachstumsgeschwindigkeit für gefärbte und ungefärbte Zellen die gleiche ist. Außerdem wurde jeden Tag die mittlere Fluoreszenzintensität für die angefärbte Kultur bestimmt. Der inverse Wert der Fluoreszenzintensität ist in Figur 2 neben den Zellwachstumsdaten aufgetragen, und es ist klar, daß in einer logarithmisch wachsenden Kultur der Abfall in der Fluoreszenzintensität direkt proportional der Zellwachstumsgeschwindigkeit ist.

b. Wirkung auf die Bindungsaffinität für Zielzellen

Eine andere Zellfunktion, die bei bestimmten erfindungsgemäßen Applikationen von Bedeutung ist, ist die Fähigkeit eines Lymphocyten (NK- Zelle) eine Ziel-Tumorzelle zu erkennen, an sie zu binden und sie zu töten. In einer Anzahl erfindungsgemäßer Ausführungsformen ist es wünschenswert, eine Effektor-NK-Zelle zur Stelle eines Tumors zu verfolgen. Um zu bestimmen, ob eine erfindungsgemäße Verbindung irgendeine schädliche Wirkung auf diese Funktion besitzt, werden Effektorzellen oder Zielzellen mit der Verbindung gebunden.
Die Standarduntersuchung auf eine durch Zellen hervorgerufene Cytotoxizität (K.T. Brunner, J. Mauel, J.C. Cerottini, B. Chapuis, Immunol. 14 (1968) 181) ist es, die Zielzellen mit &sup5;¹Cr zu markieren und die Zellen von ungebundenem &sup5;¹Cr freizuwaschen. Die Effektorzellen werden in verschiedenen Verhältnissen in Kontakt mit den Zielzellen gebracht, und wenn die Zielzellen durch die Effektorzellen getötet werden, wird das &sup5;¹Cr aus der Zelle in das Medium freigesetzt und der Grad der cytotoxischen Abtötung steht in Beziehung zur Menge von in das Medium freigesetztem &sup5;¹Cr, die mit einem γ-Zähler bestimmt wird. Um die Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen auf eine durch Zellen verursachte Cytotoxizität zu bestimmen, wird die &sup5;¹Cr-Freisetzung für unmarkierte Zellen, markierte Effektorzellen und markierte Zielzellen gemessen. Die Ergebnisse solcher Messungen unter Verwendung von mit DIOC&sub1;&sub4;(3)- markierten und nicht-markierten Yac-1-Zielzellen sind in den Figuren 3 und 4 dargestellt. Die Werte für die Effektor-Zielzellen-Verhältnisse von 50:1, 25:1, 12:1 und 6:1 für Poly/I:C und Salz-behandelte Effektoren zu ungefärbten Yac-1-Zielzellen sind auf den X-Achsen dargestellt. Die Werte für %-Abtötung für die gleichen Verhältnisse von Poly I:C und Salz- behandelten Effektoren zu gefärbten Yac-1-Zielzellen sind auf den Y- Achsen angegeben. Durch die strichlierten Linien werden 95 %- Konfidenzintervalle dargestellt. Aus Figur 3 ist es ersichtlich, daß die Chromfreisetzung (% Cytotoxizität) die gleiche ist für mit DiO-C&sub1;&sub4;(3) angefärbte Zielzellen oder nicht-angefärbte Zielzellen. Die für DiO-C&sub1;&sub4;- (3) markierte Yac-1-Zielzellen und nicht-markierte Poly I:C behandelte NK-Präparate berechneten Werte für %-Abtötung durch Cr(51)-Freisetzung sind auf der X-Achse dargestellt. Die auf den Y-Achsen angegebene %- Abtötung durch Chromfreisetzung stellt unter Verwendung von nicht- gefärbten Yac-1-Zielzellen und mit DiO-C&sub1;&sub4;-(3)-gefärbten Poly I:C- behandelten NK-Präparaten erhaltenen Werten dar. Für beide Probenserien wurden Proben zu den Zeiten 1, 2, 3 und 4 Stunden genommen. Die verwendeten E/T-Verhältnisse waren 50, 25, 12, 6, 3 und 1,5 zu 1. Die Figur 4 zeigt, daß die Chromfreisetzung (%-Cytotoxizität) die gleiche ist, unabhängig davon, ob die Zielzellen oder die Effektorzellen angefärbt sind. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Funktion der durch Zellen hervorgerufenen Cytotoxizität nach Markierung der Effektor- oder Zielzellen mit dem Fluorochrom unverändert ist.
Die vorstehend beschriebene Untersuchung auf durch Zellen hervorgerufene Cytotoxizität zeigt, daß die Zelimarkierung die Fähigkeit der Effektorzelle, die Zielzelle aufzufinden, an ihr zu binden oder sie zu töten nicht beeinträchtigt. Es ist möglich, daß eine andere nicht- getestete Funktion beeinträchtigt werden kann, da aber die interessierenden Funktionen unbeeinträchtigt waren, kann angenommen werden, daß keine nennenswerten schädlichen Wirkungen auf die Funktion der durch Zellen hervorgerufenen Cytotoxizität vorhanden waren.

Beispiel 2

Bestimmung des Membranretentionskoeffizienten

Der Membranretentionskoeffizient (MRC) liefert Informationen im Hinblick darauf, wie gut eine bestimmte Verbindung in der Plasmamembran einer Trägerzelle zurückgehalten wird, und wird wie nachstehend beschrieben bestimmt.
Die Erzeugung von roten Blutkörperchen-Geisterzellen zur Verwendung als Modellmembran wird durchgeführt, indem man Gesamtblut bei 300 x g 15 Minuten lang zentrifugiert, das Plasma entfernt und die Zellpellets in 0,83 % (Gewicht/Volumen) Ammoniumchlorid resuspendiert. Die Geisterzellen werden aus dem Ammoniumchlorid durch Zentrifugieren bei 10000 x g während 10 Minuten pelletisiert Dieses Ammoniumchlorid-Waschverfahren wird mindestens fünfmal wiederholt, um sicherzustellen, daß eine vollständige Freisetzung des Hämoglobins von den Zellen erfolgte. Die Geisterzellen werden mit der in Frage stehenden Verbindung mit einer Konzentration markiert, die die Bestimmung der markierten Geisterzellen durch instrumentelle Analyse oder Fluoreszenz-mikroskopische Verfahren ermöglicht, und bei einer Konzentration, die verwendet werden würde, um Zellen für eine spezifische Applikation, wie vorstehend beschrieben, zu markieren. Für diese Bestimmungen werden Vorratslösungen der in Frage stehenden Verbindungen in Ethanol mit einer molaren Konzentration von 2 x 10&supmin;³ hergestellt, und Arbeitsverdünnungen der Verbindungen in iso- osmotischer Sucrose (52 g/500 ml destilliertes Wasser) hergestellt. Nach Inkubierung der Geisterzellen bei einer ungefähren Konzentration von 1 x 10&sup9; Geisterzellen/ml in den Arbeitsverdünnungen der Verbindungen während 10 Minuten werden die Proben bei 10000 x g zentrifugiert, um die Geisterzellen zu pelletisieren und die färbende Lösung wird von den Proben abgesaugt. Die markierten Geisterzellen werden in 1 ml Phosphat- gepufferter Salzlösung, die 10 % fötales Rinderserum enthält (PBS-FBS) resuspendiert. Zur Bestimmung der Menge der gesamten vorhandenen Verbindung werden 3 x 20 µl-Anteile aus jeder Probe entfernt. Die Proben werden wie vorstehend beschrieben zentrifugiert und zur quantitativen Bestimmung der Menge der vorhandenen Verbindung dreimal 20 µl-Anteile aus dem Überstand entnommen.
Nach der Probenahme wird der Überstand abgesaugt und das rote Blutkörperchen-Geisterzellenpellet wird in 1,0 ml des PBS-FBS resuspendiert, und nochmals wie vorstehend beschrieben Proben entnommen. Dieses Verfahren wird mindestens sechsmal wiederholt, um die Bestimmung von rasch freigesetzten Verbindungen zu ermöglichen, und nach Zeiträumen von gleich oder größer 24 Stunden, um die Bestimmung von langsamer freigesetzten Verbindungen zu ermöglichen. Für die Bestimmung der Menge der in jeder Probe vorhandenen Verbindung werden die 20 µl-Anteile durch Schütteln in 3,0 ml n-Butanol extrahiert. Die Proben werden bei 3000 x g zentrifugiert, um Membrantrümmer zu entfernen, und die Butanolfraktionen werden auf die Konzentration der Verbindung untersucht. Fluoreszierende Verbindungen werden auf diese Weise unter Verwendung der Peakanregung untersucht und die emittierten Wellenlänge für die bestimmten Verbindungen untersucht, um die Fluoreszenzeinheiten für jede Probe zu bestimmen. Radiomarkierte Verbindungen erfordern keine Butanolextraktion und können direkt unter Verwendung von β- oder γ-Zählvorrichtungen geprüft werden.
Die vorstehend beschriebene Bestimmung der in jeder Probe vorhandenen Menge der Verbindung erlaubt es, das MRC für jede Waschung oder fixierten Zeitpunkt zu berechnen. Der Wert wird nach der folgenden Formel erhalten:
((CT - Cs) / CT) *100
worin CT die Menge der vorhandenen Verbindung (in nach dem zur Prüfung der Verbindung verwendeten Verfahren bestimmten Einheiten) in der gesamten Probe darstellt und Cs die Menge der für den bestimmten Zeitpunkt im Überstand vorhandenen Menge der Verbindung darstellt. Der Vergleich der MRC-Werte definiert das Kriterium zur Identifizierung der erfindungsgemäßen Verbindungen, wobei dieses Kriterium ist:
(1) die für jede Waschstufe bestimmten MRC-Werte sollten einen Wert von mindestens ca. 90 besitzen, und (2) die Differenz in Prozent zwischen den MRC-Werten während eines Zeitraums von mindestens 24 Stunden sollte kleiner als ca. 10 % sein. Die in der nachfolgenden Tabelle I angegebenen Daten sind die Ergebnisse aus einem Experiment, und dienen als Beispiel für die MRC-Bestimmung. Tabelle I Membranretentionskoeffizienten (MRC) für Zell-bindende Verbindungen
Für die in der Tabelle I genannten Verbindungen sind die Strukturen in Tabelle II angegeben. Tabelle II Tabelle II (Fortsetzung)
Ein anderes Verfahren, das zur Bestimmung der Zellbindungsfähigkeit der erfindungsgemäßen Fluoreszenzverbindungen verwendet werden kann, ist die interzelluläre Verbindungstransferanalyse (ICTA). Zur Durchführung dieser Analyse werden Gewebskulturzellen, in diesem Beispiel Yac-1- Zellen, einer Konzentration von ca. 1 x 10&sup7;/ml mit 4 x 10&supmin;&sup6; M der ausgewählten Verbindung in einer iso-osmotischen Sucroselösung 10 Minuten lang markiert. Die Anfärbung wird mit einer gleichen Menge an FBS beendet und die Zellen dreimal gewaschen und in komplettem Gewebskulturmedium resuspendiert. Eine gleiche Anzahl markierter und nicht-markierter Yac-1- Zellen wurden in Kulturflaschen bei einer Dichte von 4 x 10&sup5; Zellen/ml in 20 ml Flüssigkeit gegeben. Die Zellen wurden vier Tage bei 37 ºC in einer 5 % CO&sub2;-Atmosphäre kultiviert. Ein Teil jeder zu testenden Kultur wird täglich zur durchflußcytometrischen Analyse entnommen. Der Markierungsgrad in % und die Fluoreszenzintensität wurden bestimmt. Die anregenden und zur Bestimmung verwendeten Wellenlängen zur Analyse werden auf der Basis der individuellen Eigenschaften der zu testenden Verbindung ausgewählt.
Für jede der drei Testverbindungen wurde ein Fluoreszenzhistogramm erzeugt und Beispiele für solche Histogramme sind in Figur 5 dargestellt. Anfänglich enthält jedes Histogramm zwei Populationen: die linkeste Population stellt die nicht-markierten Zellen dar, die der Kultur zugegeben wurden und die Population auf der rechten Seite stellt die mit der Verbindung markierten Zellen der Kultur dar. Wenn die markierten und nicht-markierten Zellen in die Kultur in einem Verhältnis von 1:1 gegeben werden, sollte der Prozentsatz an durch jeden der Peaks dargestellten Zellen ca. 50 % betragen. Es ist wichtig, drei Merkmale der Histogramme im Laufe der Zeit zu verfolgen:
(1) die mittlere Intensität der positiven oder markierten Population, (2) die mittlere Autofluoreszenzintensität der nicht-markierten Population, und (3) den Prozentsatz an positiven oder markierten Zellen in der Kultur. Diese drei Parameter dienen zur Bestimmung, ob die Verbindung in der Membran stabil zurückgehalten wird, wodurch sie nicht an anderen Zellen übertragen wird und zur Bestimmung dient, ob die Verbindungen eine cytostatische und/oder cytotoxische Wirkung auf die Zellen, an die sie gebunden sind, hervorrufen. Wenn eine Übertragung oder ein Austreten der Verbindung auftritt, wird ein Ansteigen der mittleren Intensität der nicht-markierten Population beobachtet. In Figur 5A ist es bemerkenswert, daß am Tag 1 die Fluoreszenzintensität der nicht markierten Zellen (linker Peak) gegenüber Tag 0 signifikant erhöht ist, was anzeigt, daß (PKH-3) aus den markierten Zellen austritt (rechter Peak, Tag 0) und in unmarkierten Zellen eingebaut wird. In der obigen Tabelle I ist eine %- Veränderung in MRC von 61 % für die gleiche Verbindung ebenfalls ein Zeichen für einen Austritt aus der Zelle.
Auf der anderen Seite wird, wenn die Austrittsgeschwindigkeit wesentlich ist, eine Verschmelzung der nicht-markierten und markierten Populationen auftreten (Figur 5B). Wenn eine cytostatische und/oder cytotoxische Wirkung aufgetreten ist, wird der Prozentsatz an markierter Population gegenüber dem zur Zeit 0 bestimmten Wert abnehmen. Die Figur 5B zeigt, daß die Fluoreszenzintensität nicht-markierter Zellen (linker Peak) gegenüber dem Tag 0 beträchtlich erhöht ist, was anzeigt, daß 3n- Propyl-3'-n-tetradecyloxacarbocyaninjodid (PKH/CMPD-1) aus den markierten Zellen austritt. Ein weiterer Beweis dafür ist ein einzelner Peak am Tag 2. Auf ähnliche Weise ist in der obigen Tabelle I die %-Veränderung im MRC von 76 % für die gleiche Verbindung ebenfalls ein Anzeichen für einen Austritt aus der Zelle.
Die erfindungsgemäß verwendbaren Fluoreszenzverbindungen haben die folgenden Charakteristika:
(1) der Prozentsatz an Zellen in der markierten Population unterscheidet sich während der Zeit nicht signifikant von dem zur Zeit 0 erhaltenen Wert, (2) die mittlere Intensität der nicht-markierten Population steigt während der Zeit nicht signifikant an, und (3) die mittlere Intensität der markierten Population fällt in einer Weise ab, die den Wachstumscharakteristika der Zellen entspricht. 3-n-Propyl-3'-n- docosanyloxacarbocyaninjodid genügt diesen Kriterien, wie dies durch das Histogramm der Figur 5C gezeigt wird. Insbesondere bemerkenswert in Figur C ist die totale Trennung von gefärbten und ungefärbten Zellpeaks während der 5 Tage des Experimentes. Außerdem trat keine wesentliche Veränderung in der Prozentzahl gefärbter Zellen auf. Aus der obigen Tabelle I wird für diese Verbindung eine %-Veränderung im MRC von 1,46 % angegeben, was die sehr stabile Bindung an die Plasmamembran anzeigt. Zusätzlich nimmt die Fluoreszenzintensität markierter Zellen täglich ab, wenn sich die Zellen teilen.
Die in der obigen Tabelle I angegebene MRC-Werte zeigen die hervorragende Korrelation mit den hier beschriebenen aus der intrazellulären Verbindungstransferanalyse erhaltenen Ergebnissen.

Beispiel 3

Herstellung der Verbindungen

a. 3-n-Propyl-3'-n-eicosanyloxacarbocyaninjodid

3-n-Propyl-2-methylbenzoxazoliumjodid wurde gemäß dem von J. Sims et al., Biochemistry 13 (16) (1974) 3315-30 beschriebenen Verfahren hergestellt.
Eine gerührte Mischung von 3-n-Propyl-2-methyl-benzoxazoliumjodid (9,09 g, 30 mmol) und N,N'-Diphenylformamidin (5,88 g, 30 mmol) in Essigsäureanhydrid (60 ml) wurde unter Rückfluß 30 Minuten lang erhitzt. Die Lösung wurde dann auf Raumtemperatur abkühlen gelassen, mit Ether (300 ml) verdünnt und abgekühlt. Das kristalline feste 2-(β- Acetanilido)vinyl-1-benzoxazolium-n-propyljodid wurde durch Filtration gesammelt und aus Ethanol/Ether umkristallisiert, und ergab einen braunen kristallinen Feststoff (4,77 g, 35 %), Schmelzpunkt 209-210 ºC. Gefunden C, 53,58 %; H, 4,81 %. N,6,26 %. berechnet für C&sub2;&sub0;H&sub2;&sub1;O&sub2;N&sub2;J C, 53,58 %; H, 4,72 %; N, 6,25 %. max; 3100-3000, 3000-2800, 1721, 1616, 1589, 1217, 763 und 700 cm&supmin;¹. ¹Hnmr, δ, 9,75 (d, J=14Hz, 1H); 7,84-7,45 (m, 9H); 5,44 (d, J=14Hz, 1H); 4,49 (t, J=7Hz, 2H); 2,12 (s, 3H); 0,868 (t, J=7,4Hz, 3H).
Zu einer gerührten Lösung von Eicosanol (5,0 g, 16,70 mmol) und Triethylamin (4 ml) in Methylenchiond (80 ml) wurde tropfenweise eine Lösung von 4-Chlorbenzolsulfonylchlorid (3,90 g, 18,50 mmol) in Methylenchlorid (20 ml) zugegeben und diese Lösung 24 Stunden lang gerührt. Die Reaktionsmischung wurde dann mit mehr Methylenchlorid (100 ml) verdünnt und mit Wasser (2 x 75 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde über MgSO&sub4; getrocknet, filtriert und aufkonzentriert und ergab ein Rohrprodukt, das aus Methanol umkristallisiert wurde unter Erhalt von n-Eicosanyl-4-chlorbenzolsulfonat (5,10 g, 65 %); Schmelzpunkt 69-70 ºC. max; 3000-2800, 1367, 1184, 1176, 963 cm&supmin;¹. m/z, 472 (M&spplus;). Gefunden C, 66,16 %; H 9,75 %; S, 6,74 %; Cl, 7,40 % berechnet für C&sub2;&sub6;H&sub4;&sub5;O&sub3;SCl, 66,00 %; H, 9,59 %; S, 6,78 %; Cl, 7,49 %. ¹Hnmr, 0,855 (t, J=6,6Hz, 3H); 1,10-1,65 (m); 4,030 (t, J=6,4Hz, 2H); 7,48-7,53 (m, 2H); 7,80-7,84 (m, 2H).
Eine gerührte Lösung von 2-Methylbenzoxazol (1,35 g, 10,10 mmol) und n-Eicosanyl-4-chlorbenzolsulfonat (4,00 g, 8,50 mmol) wurde bei 130 bis 135 ºC 24 Stunden lang erhitzt. Nach dem Abkühlen wurde der gebildete Feststoff mit Ether verrieben und zweimal mit Ether gewaschen. Das Produkt 3-n-Eicosanyl-2-methylbenzoxazolium-4-chlorbenzolsulfonat (4,20 g, 82 %; Schmelzpunkt 128-132 ºC) wurde an der Luft getrocknet und ohne weitere Reinigung in der nächsten Stufe verwendet. max; 3000-2800, 1593, 1582, 1219, 1207, 1086, 1030, 1007, 824, 754 cm&supmin;¹. ¹Hnmr δ, 0,87 (m, 3H); 1,10-1,95 (m); 3,20 (s, 3H); 4,62 (t, J=7,5Hz, 2H); 7,12-7,72 (m, 8H). ¹³Cnmr d, 168,1, 147,8, 144,5, 135,1, 129,6, 128,8, 127,9, 127,3, 114,1, 112,9, 47,9, 31,8, 29,6, 29,4, 29,3, 29,0, 28,1, 26,6, 22,6, 13,9. Gefunden m/z (M&spplus;) 414.3764, berechnet für C&sub2;&sub8;H&sub4;&sub8;NO 414.3736.
Eine Lösung von 2-(β-Acetanilido)vinyl-1-benzoxazolium-n- propyljodid (0,448 g, 1,00 mmol) und 3-n-Eicosanyl-2-methylbenzoxazolium- 4-chlorbenzolsulfonat (0,605 g, 1,00 mmol) in Ethanol (15 ml) wurde erhitzt, um die Salze zu lösen und dann Triethylamin (0,40 ml) zugegeben und die Mischung am Rückfluß eine Stunde lang erhitzt. Die Lösung wurde dann abgekühlt und 15 ml gesättigte KI-Lösung zugegeben. Die Lösung wurde dann mit Wasser verdünnt (150 ml) und mit Methylenchlorid (150 ml) extrahiert. Die Methylenchloridschicht wurde mit Wasser gewaschen, über MgSO&sub4; getrocknet, filtriert und aufkonzentriert, und ergab einen dunkelroten Gummi, der aus Ethylacetat umkristallisiert wurde, wodurch ziegelrote Kristalle des gewünschten Produktes erhalten wurden (0,42 g, 58 %) Schmelzpunkt 170-180 ºC. max: 3100-2800, 1564, 1506, 1211, 739 cm&supmin;¹. ¹Hnmr δ, 0,842 (t, J=7Hz, 3H); 1,062-1,454 (m), 1,859-1,999 (m); 4,226 (t, J=7,4Hzm, 4H); 6,78 (d, J=13,2Hz, 1H); 6,80 (d, J=13,2Hz, 1H); 7,237- 7,460 (m, 8H); 8,45 (t, J=13,2Hz, 1H). Gefunden C, 66,22 %; H, 8,21 %; N, 3,79 %; C berechnet für C&sub4;&sub0;H&sub5;&sub9;O&sub2;N&sub2;I, 66,10 %; H, 8,18 %; N, 3,85 %.

b. 3-n-Pentyl-3'-n-octadecyloxacarbocyaninjodid

Eine gerührte Lösung von 2-Methylbenzoxazol (10 g, 75 mmol) und n- Pentyljodid (14,85 g, 75 mmol) wurde am Rückfluß 18 Stunden lang erhitzt. Nach dem Abkühlen wurde der gelbbraune Feststoff in Ether aufgeschlämmt, abfiltriert und mit Ether gewaschen. Der resultierende Feststoff wurde luftgetrocknet und ergab 3-n-Pentyl-2-methylbenzoxazoliumjodid (20,3 g, 82 %).
Eine gerührte Mischung von 3-n-Pentyl-2-methylbenzoxazoliumjodid (6,62 g, 20 mmol) und N,N'-Diphenylformamidin (3,92 g, 20 mmol) in Essigsäureanhydrid (40 ml) wurde unter Rückfluß 30 Minuten lang erhitzt. Die Lösung wurde dann auf Raumtemperatur abkühlen gelassen, mit Ether verdünnt (200 ml) und über Nacht abgekühlt. Der gebildete kristalline Feststoff, 2-(Acetanilido)vinyl-1-benzoxazolium-n-pentyljodid, wurde abfiltriert, einige Male mit Ether gewaschen und an der Luft getrocknet (5,88 g, 62 %).
3-n-Octadecyl-2-methylbenzoxazolium-4-chlorbenzolsulfonat wurde gemäß dem von J. Sandermann, Liebigs Ann. Chem. 749 (1971) 183, 197, beschriebenen Verfahren hergestellt.
Das 3-n-Pentyl-3'-n-octadecyloxacarbocyaninjodid wurde nach dem im wesentlichen gleichen Verfahren, wie es im Beispiel 4a verwendet wurde, hergestellt, wobei die folgenden Mengen an Reagentien verwendet wurden: 2-(β-Acetanilido)vinyl-1-benzoxazolium-n-pentyljodid (0,476 g, 1 mmol), 3-n-Octadecyl-2-methylbenzoxazolium-4-chlorbenzolsulfonat (0,578 g, 1 mmol), Triethylamin (0,40 ml) und Ethanol (15 ml). Das dunkelrote Rohprodukt wurde aus Ethylacetat umkristallisiert und ergab (0,45 g, 62 %), Schmelzpunkt 170-173 ºC. max: 3100-2800; 1565, 1507, 1209, 739 cm&supmin;¹. ¹Hnmr δ, 0,86-0,94 (m, 6H); 1,24-2,00 (m); 4,28 (t, J=7,1Hz, 4H); 6,83 (d, J=13,4Hz, 2H); 7,26-7,48 (m, 8H); 8,49 (dd, J=13 und 13,2Hz, 1H). Gefunden C, 66,39 %; H, 8,13 %, N, 3,79 %; C berechnet für C&sub4;&sub0;H&sub5;&sub9;N&sub2;O&sub2;I, 66,10 %; H, 8,18 %; N, 3,85 %.

c. 3-n-Octyl-3'-n-octadecyloxacarbocyaninjodid

Eine gerührte Lösung von 2-Methylbenzoxazol (10,0 g, 75 mmol) und n-Octyljodid (18,0 g, 75 mmol) wurde am Rückfluß 18 Stunden lang erhitzt. Nach Abkühlen wurde der gelbbraune fettbraune Feststoff in Ether aufgeschlämmt, filtriert und mit Ether gewaschen. Der resultierende Feststoff wurde an der Luft getrocknet und ergab (20,5 g, 73 %) 3-n- Octyl-2-methylbenzoxazoliumjodid.
Eine gerührte Mischung von 3-n-Octyl-2-methylbenzoxazoliumjodid (7,46 g, 0,02 mol) und N,N'-Diphenylformamidin (3,92 g, 0,02 mol) in Essigsäureanhydrid (40 ml) wurde unter Rückfluß 30 Minuten lang erhitzt. Die Lösung wurde dann abgekühlt und 48 Stunden lang unter einem hohen Vakuum aufbewahrt. Das Rohprodukt wurde dann in Methylenchlorid gelöst, mit Wasser (2 x 50 ml) gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und aufkonzentriert und ergab 2-(β-Acetanilido)vinyl-1- benzoxazolium-n-octyljodid als Rohprodukt, das ohne weitere Reinigung für die nächste Umsetzung verwendet wurde.
Eine Lösung des so erhaltenen 2-(β-Acetanilido)vinyl-1- benzoxazolium-n-octyljodid (1,11 g) und von 3-n-Octadecyl-2- methylbenzoxazolium-4-chlorbenzolsulphonat, hergestellt wie im Beispiel 4b (0,86 g, 1,50 mmol) in Ethanol (20 ml) wurde erhitzt, um die Salze zu lösen und dann Triethylamin (0,60 ml) zugegeben und die Mischung am Rückfluß 1 Stunde lang erhitzt. Die Lösung wurde abgekühlt und 15 ml gesättigter KI-Lösung zugegeben. Die Lösung wurde dann mit Wasser (150 ml) verdünnt und mit Methylenchlorid (150 ml) extrahiert. Die Methylenchloridschicht wurde mit Wasser gewaschen, über MGSO&sub4; getrocknet, filtriert und aufkonzentriert, und der dunkelrote Gummi einer Flash- Chromatographie an Silicagel und Elution mit 5 % Methanol in CH&sub2;Cl&sub2; unterworfen. Das gewünschte Produkt wurde aus EtOAc umkristallisiert und ergab (0,58 g, 50 %), Schmelzpunkt 166-167 ºC. max; 1567, 1509, 1205, 739 cm&supmin;¹. ¹Hnmr δ, 0,838-0,881 (m,6H) ; 1,901-1,956 (m, 4H) ; 4,277 (t, J=6,5Hz, 4H); 6,785 (d, J=13,1 Hz, 2H), 7,271-7,480 (m, 8H); 8,50 (t, J=13Hz, 1H) m/z, 641 (M&spplus;). Gefunden C 67,37 %, H 8,51 %, N 3,63 %; C 67,17 % berechnet für C&sub4;&sub3;H&sub6;&sub5;N&sub2;O&sub2;I; C 67,17; H 8,52 %; N 3,64 %.

d. 3-n-Propyl-3'-n-docosanyloxacarbocyaninjodid

Zu einer gerührten Lösung von Docosanol (6,0 g, 18,00 mmol) und Triethylamin (4 ml) in Methylenchlorid (80 ml) wurde tropfenweise eine Lösung von 4-Chlorbenzolsulfonylchlorid (4,26 g, 20,00 mmol) in Methylenchlorid (100 ml) zugegeben und diese Lösung wurde 24 Stunden lang gerührt. Die Reaktionsmischung wurde dann mit mehr Methylenchlorid (100 ml) verdünnt und mit Wasser (2 x 75 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde über MgSO&sub4; getrocknet, filtriert und aufkonzentriert und ergab ein Rohprodukt, das aus Methanol umkristallisiert wurde unter Erhalt von n-Docosanyl-4-chlorbenzolsulfonat (5,8 g, 65 %); Schmelzpunkt 74-75 ºC. max; 3000-2800, 1367, 1185, 1177, 963 cm&supmin;¹. ¹Hnmr δ, 0,879 (m, 2H); 1,185-1,574 (m); 4,054 (t, J=6,6Hz, 2H); 7,53 (d, J=8,8Hz, 2H); 7,845 (d, J=8,8Hz, 2H). m/z, 499 (M-H)&spplus;. Gefunden C, 67,13 %; H, 10,13 %; S, 6,36 %; Cl, 7,26 %; C; berechnet für C&sub2;&sub8;H&sub4;&sub9;O&sub3;SCl, 67,10 %; H, 9,85; S, 6,40 %; Cl, 7,07 %.
Eine gerührte Lösung von 2-Methylbenzoxazol (0,665 g, 5 mmol) und n-Docosanyl-4-chlorbenzolsulfonat (2,5 g, 5 mmol) wurde bei 130-135 ºC 24 Stunden lang erhitzt. Nach dem Abkühlen wurde der gebildete Feststoff mit Ether verrieben und zweimal mit Ether gewaschen. Das Produkt, 3-n- Docosanyl-2-methylbenzoxazolium-4-chlorbenzolsulfonat (1,80 g, 56 %); Schmelzpunkt 115-118 ºC, wurde an der Luft getrocknet und direkt in der nächsten Umsetzung verwendet. max; 3100-3000, 1595, 1582, 1220, 1198, 1086, 1032, 1008, 829, 756 cm&supmin;¹. ¹Hnmr δ, 0,88 (m, 3H); 1,10-1,95 (m); 3,26 (s, 3H); 4,73 (t, J=7,4Hz, 2H); 7,17-7,76 (m, 8H). 13Cnmr d, 168,2, 147,8, 144,6, 135,0, 129,6, 128,7, 127,95, 127,9, 127,3, 114,1, 112,96, 47,9, 31,8, 29,6, 29,4, 29,3, 29,0, 28,1, 26,6, 22,6, 14,1, 14,0. Gefunden m/z (M+) 442.4056, berechnet für C&sub3;&sub0;H&sub5;&sub2;NO 442.4049.
Das 3-n-Propyl-3'-n-docosanyloxacarbocyaninjodid wurde nach im wesentlichen dem gleichen Verfahren, wie es im Beispiel 4a verwendet wurde, hergestellt, wobei die folgenden Mengen an Reagentien verwendet wurden: 2-(β-Acetanilido)vinyl-1-benzoxazolium-n-propyljodid (0,45 g, 1 mmol), 3-n-Docosanyl-2-methyl-benzoxazolium-4-chlorbenzolsulfonat (0,633 g, 1 mmol), Triethylamin (0,40 ml) und Ethanol (15 ml). Das dunkelrote Rohprodukt wurde aus heißem Ethylacetat umkristallisiert und ergab ziegelrote Kristalle des Produktes (0,45 g, 60 %); Schmelzpunkt 182-184 ºC. max: 3100-2800, 1565, 1507, 1209, 739 cm&supmin;¹. ¹Hnmr δ, 0,879 (t, J=6,3Hz, 3H); 1,105-2,049 (m); 4,262 (t, J=7,1Hz, 4H); 6,85 (d, J=13Hz, 1H); 6,86 (d, J=13,1Hz, 1H); 7,258-7,485 (m, 8H); 8,488 (dd, J=13,0 und 13,2 Hz, 1H). Gefunden C, 67,29 %; H, 8,47 %; N, 3,74 %; C berechnet für C&sub4;&sub2;H&sub6;&sub3;N&sub2;O&sub2;I, C 66,83 %; H, 8,41 %; N, 3,71 %.

e. 3,6-Bis(dimethylamino)-10-n-hexacosanylacridiniumjodid

Eine Lösung von Hexacosanol (250 mg, 0,654 mmol), Triethylamin (125 ml, 0,900 mmol) und 4-Chlorbenzolsulfonylchlorid (150 mg, 0,711 mmol) in Methylenchlorid (30 ml) wurde bei Raumtemperatur 120 Stunden lang gerührt. Die Reaktionsmischung wurde dann mit Methylenchlorid (20 ml) verdünnt und mit Wasser (2 x 50 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet, abfiltriert und aufkonzentriert, und ergab ein Rohprodukt. Flash- Säulenchromatographie an Silicagel (10:1 Hexan: Ethylacetat) und nachfolgende Umkristallisation aus Methanol ergab n-Hexacosanyl-4- chlorbenzolsulfonat (80 mg, 22 %).
max; 3000-2800; 1367; 1185; 1177; 963; 831; 822 cm&supmin;¹. ¹Hnmr δ, 7,853 (d, J=8,7Hz, 2H); 7,533 (d, J=8,6Hz, 2H); 4,06 (t, J=6,5Hz, 2H); 0,887 (t, J=6,3Hz, 3H).
Eine Lösung von Acridinorange (freie Base, 75 % Farbstoffgehalt) (71 mg, 0,200 mmol) und n-Hexacosanyl-4-chlorbenzolsulfonat (110 mg, 0,200 mmol) in Xylol (5 ml) wurde am Rückfluß (Ölbadtemperatur 150 º) 24 Stunden lang erhitzt. Die Mischung wurde auf Raumtemperatur abkühlen gelassen und das Xylol unter Hochvakuum über Nacht entfernt. Der feste Rückstand wurde in Ethanol (10 ml) aufgenommen und gesättigte Kaliumjodidlösung (10 ml) und dann Wasser (10 ml) zugegeben. Die resultierende Lösung wurde mit Methylenchlorid extrahiert und der Extrakt über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und aufkonzentriert, und ergab ein Rohprodukt. Flash-Säulenchromatographie (10 % Methanol in Methylenchlorid) des Rohmatenais ergab das Produkt als roten kristallinen Feststoff (45 mg, 30 %). max; 3000-2800; 1640; 1601; 1503; 1360; 1166 cm&supmin;¹. ¹Hnmr δ, 8,71 (s, 1H); 7,96 (d, J=9,3Hz, 2H); 7,14 (dd, J=2,0Hz und 9,0Hz, 2H); 6,695 (s, 2H); 4,84 (t, J=7,9Hz, 2H); 3,36 (s, 12H); 0,884 (t, J=7,0Hz, 3H).
Obwohl die verschiedenen Aspekte der vorliegenden Erfindung beschrieben und vorstehend durch bestimmte bevorzugte Ausführungsformen beispielhaft beschrieben wurden, ist es für einen Fachmann auf diesem Gebiet klar, daß viele andere Ausführungsformen möglich sind. Die vorliegende Erfindung kann z.B. vorteilhafterweise zur Untersuchung von Viren verwendet werden. Zur Zeit ist es extrem schwierig, Viren innerhalb eines Modellsystems zu bestimmen, um die Lokalisierung in vivo festzustellen, wenn eine Virusreplikation oder ein Pooling eintritt. Unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen ist es möglich, Reportermoleküle in die Lipide von Membranviren unter Verwendung der nachfolgend skizzierten Fluoreszenz- und Radioabbilde-Verfahren einzubauen. Es ist z.B. nicht bekannt, wo der Virus HIV-I (AIDS) in einem lebenden Tier repliziert oder als solcher verbleibt. Solche Viren könnten mit den Indium- oder Jod (γ-emittierenden) Formen der erfindungsgemäßen Verbindungen markiert und von ungebundenen radioaktiven Verbindungen freigewaschen werden. Der markierte Virus kann dann injiziert werden und das Tier unter Verwendung einer γ-Kamera abgebildet werden. Wenn die Viren auch mit einer fluoreszierenden Form der erfindungsgemäßen Verbindungen markiert werden, kann das γ-Abbilden verwendet werden, um festzustellen, welches Organ das Reservoir für den Virus ist, und das Organ könnte entfernt, in einzelne Zellsuspensionen aufgeschlossen und die die Viren enthaltenden Zellen auf Fluoreszenzbasis unter Verwendung der Durchflußcytometrie oder quantitativen Mikroskopie identifiziert werden. Die vorliegende Erfindung ist deshalb nicht auf die spezifisch beschriebenen und beispielhaft dargestellten Ausführungsformen beschränkt, sondern sie kann variiert und modifiziert werden, ohne den Rahmen der anliegenden Ansprüche zu verlassen.

Claims

1. Zusammensetzung zum Binden eines Diagnostikums an die Oberflächenmembran eines lebens- und, zur Ausübung einer physiologischen Funktion fähigen Bioteilchens, dadurch gekennzeichnet, daß diese Zusammensetzung folgendes umfaßt: eine Verbindung der Formel R-B-R&sub1;, in welcher B dieses Diagnostikum darstellt und R und R&sub1; unterschiedlich sind und Substituenten darstellen, die unabhängig voneinander aus der Gruppe Wasserstoff, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Alkaryl oder Aralkyl mit jeweils geradkettigen oder verzweigten Kohlenwasserstoffketten ausgewählt sind, wobei diese Substituenten gegebenenfalls durch eine oder mehrere nichtpolare funktionelle Gruppen substituiert sind, wobei einer der Substituenten R und R&sub1; mindestens 12 geradkettige Kohlenstoffatome hat und wobei die Summe der geradkettigen Kohlenstoffatome in R und R&sub1; zumindest 23 beträgt, sowie ein verträgliches Bindungsmedium, in dem diese Verbindung gelöst ist, wobei dieses Medium mit dem Bioteilchen, an das die Verbindung gebunden werden soll, iso-osmotisch ist.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Medium über iso-osmotische Eigenschaften zwischen 260 mOs und 340 mOs verfügt und mit dem Bioteilchen, an das die Verbindung gebunden werden soll, isotonisch ist.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Medium aus der Gruppe bestehend aus einem Zucker, einem Zuckeralkohol, einer Aminosäure, einem Puffer nach Good oder einer Kombination daraus ausgewählt ist.

4. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Diagnostikum ein Radioisotop umfaßt.

5. Zusammensetzung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Radioisotop-Bestandteil des Diagnostikums aus der Gruppe radioaktiver Wasserstoff, radioaktiver Kohlenstoff, radioaktiver Stickstoff, radioaktiver Phosphor, radioaktives Fluor, radioaktives Chlor, radioaktives Jod, radioaktiver Schwefel und radioaktives Selen ausgewählt ist.

6. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Substituent R oder R&sub1; ein Radioisotop umfaßt.

7. Zusammensetzung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Radioisotop aus der Gruppe radioaktiver Wasserstoff, radioaktiver Kohlenstoff, radioaktiver Stickstoff, radioaktiver Phosphor, radioaktives Fluor, radioaktives Chlor, radioaktives Jod, radioaktiver Schwefel und radioaktives Selen ausgewählt ist.

8. Zusammensetzung nach Anspruch 11 dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung die Formel

aufweist, in welcher R und R&sub1; verschieden sind und Substituenten darstellen&sub1; die unabhängig voneinander aus der Gruppe Wasserstoff, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Alkaryl oder Aralkyl ausgewählt sind, wobei deren Kohlenwasserstoffketten 1 bis 30 Kohlenstoffatome aufweisen und geradkettig oder verzweigt sind, wobei die Substituenten gegebenenfalls durch eine oder mehrere nichtpolare funktionelle Gruppen substituiert sind, wobei einer der Substituenten R oder R&sub1; mindestens 12 geradkettige Kohlenstoffatome aufweist, und wobei die Summe der geradkettigen Kohlenstoffatome in R und R&sub1; mindestens 23 beträgt;

X und X&sub1; gleich oder verschieden sein können und O, S, C(CH&sub3;)&sub2; oder Se darstellen;

Y ein aus der Gruppe -CH=, -CH=CH-CH=, -CH=CH-CH=CH-CH= oder -CH=CH-CH=CH-CH=CH-CH= ausgewähltes Brückenglied darstellt;

Z einen aus der Gruppe H, Alkyl, OH, NH&sub2;, COOH, CONH&sub2;, SO&sub3;H, SO&sub2;NH&sub2;, CONH-Alkyl, CON-(Alkyl)&sub2;, NH-Acyl, -O- Alkyl, NH-Alkyl oder N(Alkyl)&sub2;, SH, S-Alkyl, NO&sub2; oder Halogen ausgewählten Substituenten darstellt, wobei die Alkylgruppen diese Z-Substituenten mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen umfassen;

und A ein biologisch kompatibles Anion darstellt.

9. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung die Formel

aufweist, in welcher R einen aus der Gruppe Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Alkaryl oder Aralkyl mit einer jeweils geradkettigen oder verzweigten Kohlenwasserstoffkette ausgewählten Substituenten darstellt, wobei dieser Substituent gegebenenfalls durch eine oder mehrere nichtpolare funktionelle Gruppen substituiert ist und mindestens 23 geradkettige Kohlenstoffatome aufweist;

Z einen aus der Gruppe H, Alkyl, OH, NH&sub2;, COOH, CONH&sub2;, SO&sub3;H, SO&sub2;NH&sub2;, CONH-Alkyl, CON-(Alkyl)&sub2;, NH-Acyl, -O- Alkyl, NH-Alkyl oder N(Alkyl)&sub2;, SH, S-Alkyl, NO&sub2; oder Halogen ausgewählten Substituenten darstellt, wobei die Alkylgruppen diese Z-Substituenten 1 bis 3 Kohlenstoffatome umfassen; und

A ein biologisch kompatibles Anion darstellt.