DE68915518T2

DE68915518T2 - Chemische verbindung.

Info

Publication number: DE68915518T2
Application number: DE68915518T
Authority: DE
Inventors: Peter Geistlich; Heinz Lussi
Original assignee: Ed Geistlich Soehne AG fuer Chemische Industrie
Current assignee: Ed Geistlich Soehne AG fuer Chemische Industrie
Priority date: 1988-06-02
Filing date: 1989-06-02
Publication date: 1994-09-08
Anticipated expiration: 2009-06-03
Also published as: US5167961A; US5417975A; GB8813033D0; DE68915518D1; EP0372066B1; JP2679855B2; WO1989011880A1; ATE106017T1; EP0372066A1; CA1339302C; JPH02504627A

Description

Die Erfindung betrifft Knochenmineral-Produkte mit einer großen spezifischen Oberfläche.
Knochen von geschlachteten Tieren sind ein billiges Rohmaterial, das in großen Mengen erhältlich ist. Sie enthalten zu 50 bis 60% sehr feine Kristallite einer Form von Hydroxylapatit, die an Collagengewebe gebunden sind, und signifikante Mengen an proteinartigen und anderen Substanzen sowie assoziierte Fett- und Muskelgewebe enthält. Dieser Hydroxylapatit würde, wenn man ihn in reinem Zustand ohne Änderung seiner wesentlichen Kristallstruktur isolieren könnte, ein hochbiokompatibles Remodellierungs-Knochenimplantat- Material darstellen.
Natürliches Knochenmineral umf aßt Hydroxylapatit-ähnliche Kristallite mit einem bestimmten Kristallinitätsgrad, einer bestimmten Konstitution und einer bestimmten Größe (irreguläre, plättchenähnliche Morphologie, Dicke 5-10 nm, Länge 10-50 nm) und eine bestimmte Oberflächenchemie, die aus dem Calcium- Phosphatverhältnis resultiert (37,5-38,0% Calcium und 15,5- 19,0% Phosphor). Die anorganische Phase der Knochen enthält Porositäten, die ultrastrukturelle Interstitien (10-100 nm) zwischen den Kristalliten, die natürlich vorkommen und durch Entfernen der organischen Phase produziert werden, und mikroskopische Zwischenräume (1-20 Mikron), die Osteozyten- Lakunen, Canaliculi, vaskuläre Kanäle, Volkmann-Kanäle und die Kanäle des Havers-Systems (100-500 nm) umfassen. Die spezifische Oberfläche, die ein Maß für die Porosität darstellt, liegt im Bereich 50 bis 100 m²/g, wie durch Quecksilber-Porosimetrie bestimmt wurde. Die Kristallinität des Knochenminerals kann durch Röntgen-Diffraktion, und die porosität, die Morphologie und die Größe der Kristallite kann durch Elektronenmikroskopie charakterisiert werden. Es wurde gefunden, daß die Zusammensetzung und die Struktur von natürlichem Knochenmineral nicht durch in vitro-gebildete Calciumphosphat-Produkte oder durch natürlich vorkommende, vorher präparierte Hydroxylapatite nachvollzogen werden kann.
Bisher sind zwei Verfahren zur Reinigung von natürlichem Knochenmineral vorgeschlagen worden, nämlich die Kalzination und die Lösungsmittel-Extraktion.
Die Temperaturen, die während der Kalzination zur Verbrennung der organischen Bestandteile der Knochen benötigt werden, sind ziemlich hoch. Dies führt zu extensiver Rekristallisation des mineralischen Teils unter Bildung von wesentlich groberen Kristallen. Das so gebildete Material zeigt eine kleine spezifische Oberfläche und ist einem chemisch präzipitierten Hydroxylapatit nicht überlegen.
Es muß betont werden, daß Knochenmineral, das einer Behandlung unterzogen worden ist, die in einer signif ikanten Zunahme der Kristallgröße resultiert, weniger leicht nach einer Implantation remodelliert wird, da Osteoklasten und Osteoblasten an solch großen Kristallen die Zweifachfunktion der Mineral-Resorption und der Erzeugung von neuem Knochen nicht leicht durchführen können. Solche implantierten Inserts können auf unbestimmte Zeit unverändert bleiben, was schließlich zu unerwünschten Effekten führt. Auf der anderen Seite tendieren viele synthetische Tricalciumphosphat-Produkte dazu, zu schnell resorbiert zu werden, um Osteoblasten zu ermöglichen, neuen Knochen zu regenerieren.
Bei dem früheren Extraktionsverfahren werden die Proteine aus entfettetem Knochen mit einem geeigneten Lösungsmittel extrahiert. Das resultierende Knochenmineral wird sodann gewaschen, um das Lösungsmittel zu entfernen.
Stegemann und Jung (Hoppe Seyler's Z. physiol. Chem. 320 (196) 272) verwendeten Formamid zur Proteinextraktion. Dieses Verfahren erwies sich als unpraktisch, da das Lösungsmittel unter den Bedingungen einer Heißextraktion instabil war.
Man fand, daß eine Extraktion mit heißem Wasser anstelle des Waschens mit Wasser nach der Extraktion ein unerwünschtes Kristallwachstum förderte, obwohl es manchmal empfohlen wurde (Skinner, Kempur und Pak: Cal. Tiss. Res. 10 (1972) 257).
Das allgemein bevorzugte Verfahren gemäß dem Stand der Technik umfaßt die Extraktion von entfettetem Knochen mit siedendem Ethylendiamin, gefolgt von Waschen mit Wasser. Dies Verfahren ist von Williams und Irvine Jnr. (Science 119 (1954) 771) eingeführt und später von Losse und Hurley (Nature 177 (1956) 1032; Military Medicine (1957) 101) und Kershaw (The Pharmaceutical Journal 190 (1963) 537) verwendet worden. Ein Patent für dieses Verfahren ist der Armour & Co. (US 2968593 (1961) erteilt worden.
Die WO-A-86/07265 (Ed Geistlich Söhne A.G.) beschreibt eine pharmazeutische Präparation, die aus mit Lösungsmittel extrahiertem natürlichen Knochenmaterial gebildet wurde, das mit heißem Wasser vor einer Kombination mit physiologisch aktiven Substanzen, z.B. Antibiotika oder Taurolidin, gewaschen wurde.
Es ist allgemein beansprucht worden, daß eine Extraktion mit Ethylendiamin (wie in der oben erwähnten WO-A-86/07265) reines Knochenmineral ergibt. Bei einer Wiederholung dieses Verfahrens haben wir jedoch immer gefunden, daß die Produkte zwischen 0,1% und 1% organische Rückstände enthalten, die häufig zu einer unerwünschten Immunantwort auf die Implantation führen.
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren bereitgestellt zur Herstellung eines hochreinen Knochenminerals, wobei die organische Substanz in einem entfetteten Knochen durch Erhitzen mit Ammoniak oder einem primären Amin abgebaut und solubilisiert wird, dadurch gekennzeichnet, daß die solubilisierten Abbauprodukte durch Waschen mit fließendem Wasser bei Temperaturen unterhalb von 60ºC extrahiert werden, das Erhitzen mit einem primären Amin und die Waschschritte gegebenenfalls wiederholt werden, wobei im wesentlichen die gesamte organische Substanz, die mit diesen Schritten entfernt werden kann, entfernt wird, das so behandelte Knochenmineral in Luft bei Temperaturen zwischen 250ºC und 600ºC erhitzt wird, wobei das Knochenmineral einen Gehalt an organischen Verunreinigungen unterhalb von 150 ppm besitzt.
Bei einigen früheren Verfahren wurde versucht, das Knochenprotein mit heißem Ethylendiamin zu extrahieren, ohne es mit Wasser zu waschen. Dieses Verfahren ist nicht sehr effektiv. Gemäß der vorliegenden Erfindung werden die entfetteten Knochen mit heißen Aminen (oder wäßrigem Ammoniak) behandelt, um die ursprünglich unlöslichen Proteine abzubauen und zu solubilisieren, und findet die Extraktion der solubilisierten Abbauprodukte während des Waschens mit Wasser statt.
Man fand, daß dieses Waschverfahren am wichtigsten ist, da es nicht nur die Extraktion von freien, löslichen organischen Substanzen, sondern auch die Desorption von absorbierten Abbauprodukten bewirkt. Wegen der großen spezifischen Oberfläche des Knochenminerals ist eine Adsorption ein sehr wichtiger Effekt, der eine Reinigung verhindert. Folglich hat das Waschen mit Wasser sehr extensiv zu erfolgen.
Das abschließende Erhitzen auf einige Hundert Grad Celcius bewirkt eine weitere Desorption. Gleichzeitig werden verbleibende organische Kontaminationen wenigstens teilweise durch Oxidation zerstört.
Da Knochenmineral in einem extrem feinen kristallinen Zustand vorkommt, ist es nicht sehr stabil und einer Rekristallisation ausgesetzt. Alle Verfahrensbedingungen müssen so ausgewählt sein, daß ein übermäßiges Kristallwachstum vermieden wird.
Jeder Vertebraten-Knochen kann als Ausgangsmaterial für das vorliegende Verfahren verwendet werden. Rinderfemur ist ein bevorzugtes Rohmaterial. Die Knochen müssen frei von anderen Geweben, wie Knochenmark, Knorpel oder Knochenhaut, sein.
Kortikaler sowie spongiöser Knochen können bei dem Verfahren verwendet werden, was makroskopisch unterschiedliche Typen des Endproduktes ergibt. Die Knochen müssen gemahlen oder in Stücke geschnitten sein. Die Form und die Größe der Teilchen werden im allgemeinen durch die Anforderungen an das Endprodukt bestimmt. Da alle Behandlungen größtenteils diffusionskontrolliert sind, erleichert eine feine Zerkleinerung des Materials das Verfahren.
Die Knochen müssen im wesentlichen völlständig entfettet sein, da rückständige Fette und ihre Reaktionsprodukte mit Aminen während der nachfolgenden Behandlungen nicht leicht entfernt werden können. Eine Entfettung wird vorzugsweise durch Lösungsmittelextraktion durchgeführt, und geeignete Verfahren gehören zum Stand der Technik.
Im allgemeinen kann eine Entfettung durch Refluxierung des Knochenmaterials in einem Lösungsmittel, das geeigneterweise im Bereich von 80 bis 120ºC, z.B. bei etwa 100ºC, siedet, bewirkt werden. Zu geeigneten Lösungsmitteln zählen Kohlenwasserstoffe wie Toluol und Methylcyclohexan.
Primäre aliphatische oder alicyclische Amine sind im allgemeinen wasserlöslich und werden als Reagenzien zum Proteinabbau bevorzugt. Diese Amine können mehr als eine Aminogruppe pro Molekül besitzen und/oder können andere funktionelle Gruppen, z.B. Hydroxylgruppen, enthalten. Sie besitzen vorzugsweise 2 bis 6 Kohlenstoffatome. Zu Beispielen zählen Cyclohexylamin, Ethanolamin und Ethylendiamin. Ammoniak selbst stellt auch ein geeignetes Reagenz dar. Die Zugabe von bis zu 50% Wasser ist häufig vorteilhaft.
Die Abbaureaktion kann durchgeführt werden, indem man den entfetteten Knochen in einen Kolben oder in ein Cefäß gibt, genügend Reaktionsflüssigkeit zugibt, um ihn zu bedecken, und ihn auf eine Temperatur zwischen 80ºC und 200ºC, vorzugsweise zwischen 100ºC und 150ºC, erhitzt. Wenn Ammoniak oder ein niedrig-siedendes Amin, wie Ethylamin, verwendet wird, muß die Reaktion unter Druck, vorzugsweise in einem Autoklaven, durchgeführt werden. Ein komplizierteres Gerät kann ebenfalls verwendet werden, solange sich der Knochen in Kontakt mit dem heißen Reagens befindet.
Die Dauer der Hitzebehandlung hängt von der Teilchengröße des Knochens, der Reaktivität des Amins und der Reaktionstemperatur ab und kann zwischen 2 und 200 Stunden betragen. Bei Knochenstücken mit etwa 1 cm Durchmesser ergibt, bei Verwendung von wäßrigem Ethylendiamin als Reagens und einer Reaktionstemperatur von 118ºC, eine Reaktionsdauer von 50 Stunden sehr zufriedenstellende Ergebnisse.
Nach der Abbaureaktion wird das Reagens, das jetzt schon einen Teil der Abbauprodukte enthält, abgelassen. Der behandelte Knochen wird in ein Spülbad transferiert. Nach Entfernen des größten Teils des restlichen Reagenzes wird die Geschwindigkeit des kontinuierlichen Wasserdurchflußes zwischen 1 und 50 cm pro Stunde eingestellt, wobei 10 cm/Stunde eine bevorzugte Geschwindigkeit darstellt. Ein schnellerer Wasserdurchf luß kann verwendet werden, wird jedoch das Verfahren nicht beschleunigen. Um eine Rekristallisation zu vermeiden, sollte die Wassertemperatur 60ºC nicht übersteigen. Die Wassertemperatur sollte jedoch nicht übermäßig niedrig sein, wenn eine effiziente Extraktion erreicht werden soll, und liegt vorzugsweise oberhalb von 10ºC. Eine Temperatur von ungefähr 20ºC ist bevorzugt. Die Anwesenheit von Aminen in dem Waschwasser kann leicht durch eine pH-Messung ermittelt werden. Sogar nach einer vollständigen Entfernung des Amin-Reagenzes findet eine Desorption von Abbauprodukten weiterhin statt. Das Waschverfahren wird deshalb 5 bis 25 Tage fortgesetzt, wobei die Zeitdauer größtenteils von der Teilchengröße des Knochens abhängt.
Um eine besonders hohe Reinheit zu erreichen, müssen die Amin-Behandlung und das Waschen wiederholt werden. Wenn relativ große Stücke von Kortikal-Knochen verarbeitet werden, kann eine Wiederholung der Behandlung notwendig sein.
Der abschließende und essentielle Schritt bei der Behandlung des Knochenminerals umfaßt ein mehrstündiges, trockenes Erhitzen auf Temperaturen zwischen 250ºC und 600ºC, vorzugsweise auf nicht mehr als 550ºC und besonders bevorzugt auf zwischen 5350ºC und 500ºC. Die höheren Temperaturen sind wirksamer bei der Entfernung von Kontaminationen, aber führen dazu, daß sich das Risiko einer Rekristallisation mit einer sich daraus ergebenden Steigerung der Kristallgröße erhöht. Ein Erhitzen in einer Sauerstoff-angereicherten Atmosphäre fördert die vorteilhafte Oxidation der organischen Rückstände.
Das erfindungsgemäß hergestellte Knochenmineral ist ein weißes, kreidiges, sprödes Material, das die Makrostruktur des ursprünglichen Knochens zeigt. Bei einer Untersuchung unter einem Elektronenmikroskop kann man kristalline Plättchen, die nicht dicker als 100 Å sind und einen Durchmesser von 200 bis 400 Å besitzen, erkennen. Durch Röntgendiffraktographie wird das Vorhandensein einer Hydroxylapatit-Gitterstruktur bestätigt. Die Breite der Interferenzen stimmt mit der oben gefundenden Kristallgröße überein. Durch Quecksilber-Porosimetrie wurde eine spezifische Oberfläche von 60m² pro g gemessen.
Der Proteingehalt liegt unterhalb der Detektionsgrenze der Lowry-Methode (135 ppm) und der gesamte Gehalt an organischen Verunreinigungen liegt sicher unterhalb von 150 ppm. Im Gegensatz dazu zeigt eine Wiederholung der in der oben erwähnten Literatur beschriebenen Verfahren, daß die Produkte im allgemeinen einen wesentlichen Gehalt an organischen Verunreinigungen, normalerweise mehr als 1000 ppm und häufig signifikant mehr, besitzen.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Knochenmineral zur Verwendung in der Medizin bereitgestellt, das im wesentlichen die Kristallstruktur und die Mineral- Mikrostruktur eines natürlichen Knochens besitzt und ein physiologisch kontrolliertes, durch Zellen vermitteltes Remodellieren bei einer Implantation erlaubt, wobei der Gehalt an organischen Verunreinigungen weniger als 150 ppm beträgt. Das durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellte Knochenmineral weist in der Tat bei einer elektronenmikroskopischen Untersuchung bei einer 100000-fachen Vergrößerung keine organischen Verunreinigungen auf.
Im Gegensatz zu früher vorgeschlagenen natürlichen oder synthetischen Knochenmineral-Materialien wird das erfindungsgemäße Produkt leicht remodelliert durch die Wirkung von Osteoklasten, was eine Resorption des Knochenminerals bewirkt, und durch die Wirkung von Osteoblasten, wodurch neuer Knochen hergestellt wird, der schließlich das Implantat ersetzt.
Das erfindungsgemäße Knochenmineral kann somit als Remodellierungs-Implantat oder als prosthetischer Knochenersatz verwendet werden, z.B. bei orthopädischen Eingriffen einschließlich Hüftkorrekturen, Ersatz von Knochenverlust, z.B. bei der Traumatologie, bei der Remodellierung bei Gesichtsoperationen der Maxilla oder bei der Füllung von periodontalen Defekten und Zahnextraktionshöhlen. In diesem Zusammenhang kann das Knochenmineral eine oder mehrere physiologisch aktive Substanzen adsorbiert oder absorbiert haben.
Physiologisch aktive Substanzen, die an das Knochenmineral adsorbiert werden können, sind vorzugsweise wenigstens teilweise wasserlöslich und umfassen antibakterielle Substanzen wie Antibiotika, z.B. Penicilline, Cephalosporine, Aminoglycoside usw., Sulphonamide und besonders Kondensationsprodukte des Formaldehyds mit Taurinamid oder Nsubstituierten Taurinamiden. Die letztgenannten Verbindungen können dargestellt werden durch die Formel
worin R¹ für Wasserstoff oder eine C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylgruppe und R² für Wasserstoff oder eine Gruppe der Formel
worin R¹ die oben erwähnten Bedeutungen besitzt, steht.
Die Verbindung der Formel (I), bei der sowohl R¹ als auch R² für Wasserstoff stehen, ist Taurultam, während die Verbindung, bei der R¹ für Wasserstoff und R² für die Formel (II) stehen, Taurolidin ist. Diese Verbindungen wirken als Methylol- Transferagenzien und sind nicht nur bei einer Zerstörung sowohl von Gram-negativen als auch von Gram-positiven Bakterien sondern auch bei der Inaktivierung sowohl von Endotoxinen als auch von Exotoxinen, die von den Bakterien gebildet werden, wirksam.
Zu weiteren nützlichen, physiologisch aktiven Substanzen zählen Proteine und Polypeptide, die in der Lage sind, die Knochen- Regeneration zu unterstützen, insbesondere nicht-collagene Proteine, die von der Knochenmatrix und Knochenzellen stammen. Zu diesen zählen mitogene Faktoren wie der Skelett- Wachstumsfaktor und morphogene und angiogene Faktoren sowie die Transformationswachstumsfaktoren α und β Typ 1 und/oder 2. Typ 2 ist besonders wichtig.
Während es in den meisten Fällen wichtig ist, signifikante Modifikationen der Größe der Knochenmineral-Kristallite zu vermeiden, um zu garantieren, daß die Knochenteile nach der Implantation schnell in natürlichen Knochen überführt werden, hat man gefunden, daß es bestimmte Umgebungen gibt, insbesondere die hochvaskularisierte Maxilla-Region, wo eine leichte Modifikation der Struktur des Knochenminerals von Vorteil sein kann, um eine übermäßig schnelle Resorption zu verzögern. In diesem Zusammenhang hat man gefunden, daß es vorteilhaft sein kann, die Temperatur des abschließenden Erhitzungsschrittes auf oberhalb von 600ºC zu erhöhen, nämlich auf eine Temperatur zwischen 600 und 700ºC. Innerhalb dieses Temperaturbereiches ergibt sich eine maßvolle Erhöhung der Größe der Kristallplättchen und eine Erhöhung der Porengröße. Auf diese Weise ist es möglich, dem Chirurgen eine Reihe von prosthetischen Produkten aus Knochenmineral zu liefern, die unterschiedliche physikalische und physiologische Eigenschaften besitzen, indem man die Temperatur des abschließenden Erhitzungsschrittes variiert.
Die folgenden Beispiele werden nur zur Illustration aufgeführt:

Beispiel 1

(a) Herstellung von entfettetem Knochen

Femuren von frischgeschlachteten Rindern werden in Scheiben von 1 cm Dicke zersägt. Diese Scheiben werden gesäubert, indem man sie wiederholt in Wasser kocht und man anhängendes weiches Gewebe abschneidet. Das Material wird über Nacht bei 100ºC in einem Ofen mit zirkulierender Luft getrocknet. Kortikale und spongiöse Knochen werden separat behandelt. Kortikalknochenringe werden in Stücke von 1 cm Breite zerschnitten. Spongiöse Knochenscheiben werden in Platten von 15 mm² zersägt.
Der getrocknete Knochen wird in einen Soxhlet-Extraktor gebracht, der zur Hitzeextraktion modifiziert ist, und 72 Stunden mit siedendem Toluol extrahiert. Der entfettete Knochen kann nach dem Trocknen bei 80ºC in einem geschlossenen Behälter gelagert werden.

(b) Herstellung von granulärem Knochenmineral

1700 g entfetteter Kortikalknochen, 1000 ml 99% Ethylendiamin und 150 ml entionisiertes Wasser werden unter Rückfluß in einem Erlenmeyer-Kolben, der in ein Ölbad getaucht ist, über einen Zeitraum von 50 Stunden erhitzt. Bei 115ºC beginnt es zu sieden. Die Temperatur des siedenden Gemisches steigt gegen Ende der Behandlung auf 119ºC.
Nach Abkühlen wird das rötlich-braune Amin-Reagens dekantiert, und die Knochen werden dreimal mit kaltem, entionisiertem Wasser gespült.
Die Knochensubstanz wird in einen Glaszylinder transferiert, der nahe dem Boden mit einer Glasfritte versehen ist. Ein kontinuierlicher Wasserfluß wird durch die poröse Glasscheibe und die Knochensubstanz-Schicht geschickt.
Das rohe Knochenmineral wird bei 100ºC in einem Ofen mit zirkulierender Luft getrocknet und in einem Walzwerk zu einer partikelgröße kleiner als 2 mm vermahlen.
Die oben beschriebene Amin-Behandlung wird unter Verwendung der vorbehandelten Substanz in genau der gleichen Weise wiederholt, wobei aber das nachfolgende Waschen auf 15 Tage ausgedehnt wird. Das resultierende Knochenmineral wird bei 160ºC getrocknet und sodann in einem Porzellantiegel 20 Stunden auf 350ºC erhitzt.
Man erhält 1102 g weißes, granuläres, reines Knochenmineral. Die Substanz kann durch Sieben in Fraktionen mit einer einheitlicheren Partikelgröße aufgetrennt werden.

Beispiel 2 - Herstellung von spongiösem Knochenmineral

Es werden hauptsächlich die gleichen, in Beispiel 1(b) beschriebenen Verfahren verwendet. 600 g entfettete spongiöse Knochenplatten aus Beispiel 1(a), 1500 ml 99% Ethylendiamin und 75 ml entionisiertes Wasser werden unter Rückfluß 50 Stunden erhitzt. Der behandelte Knochen wird 6 Tage mit Wasser gewaschen.
Der naße Knochen wird einer zweiten, entsprechenden Behandlung mit 1500 ml Ethylendiamin unterzogen, wobei eine Zugabe von Wasser vermieden wird. Das nachfolgende Waschen wird auf 17 Tage verlängert.
Das abschließende Trocknen und die Hitzebehandlung bei 350ºC wird genauso wie in Beispiel 1(b) beschrieben durchgeführt.
Es wurden 366 g reines, weißes, extrem brüchiges, spongiöses Knochenmineral hergestellt.

Beispiel 3 - Herstellung von kortikalen Knochenmineralstücken

1700 g entfettete kortikale Knochenstücke werden wie in Beispiel 1(b) beschrieben mit einem Ethylendiamin/Wasser- Gemisch behandelt und 6 Tage gewaschen. Das naße, rohe Knochenmineral wird einer zweiten, entsprechenden Behandlung unter Verwendung von 1000 ml Ethylendiamin und 50 ml Wasser unterzogen, gefolgt von 10-tägigem Waschen mit Wasser.
Um die höchste Reinheit zu erzielen, werden die naßen Knochenmineralstücke 5 Tage in 1 Liter reinem Ethylendiamin gekocht und sodann in einem langsamen Strom (1 Liter/Stunde) von kaltem, entionisiertem Wasser 22 Tage extrahiert.
Das Produkt wird abschließend über Nacht bei 160ºC getrocknet und sodann 25 Stunden auf 400ºC erhitzt.
Man erhält 1085 g schwach rötliche, brüchige Knochenmineralstücke. Etwaige organische Verunreinigungen konnten nicht festgestellt werden, da deren Konzentration unterhalb der analytischen Nachweisgrenze liegt.

Beispiel 4

Granuläres Knochenmineral mit einer Partikelgröße zwischen 1 und 2 mm wurde unter Verwendung der in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren hergestellt. Die Substanz wurde durch Elektronenmikroskopie, Röntgen-Diffraktographie und Quecksilber-Porosimetrie charakterisiert. Jedes dieses Verfahren mißt eine andere Eigenschaft der Substanz. Unter Verwendung der Elektronenmikroskopie fand man, daß die Substanz aus kristallinen Plättchen mit einer Größe von etwa 200 bis 400 Å-Einheiten (20 bis 40 nm) besteht. Deren Dicke scheint höchstens 100 Å-Einheiten (10 nm) zu betragen, da die Kristalle noch von den Elektronen durchdrungen werden. Die Verteilung der Kristallgröße scheint ziemlich eng zu sein, aber wegen der unzureichenden Disagglomeriation war eine quantitativere Auswertung nicht durchführbar. Figur 1 zeigt einen Elektronenmikrograph des erfindungsgemäßen Knochenminerals bei einer 100000-fachen Vergrößerung.
Durch Röntgen-Diffraktographie fand man, daß das Mineral eine reine Hydroxylapatit-Kristallstruktur besaß. Es wurden keine Interferenzen mit anderen Gitterstrukturen beobachtet. Unter Verwendung der Laue-Scherrer-Relation konnte die durchschnittliche Kristallgröße in der 002-Richtung als 315 Å-Einheiten (31,5 nm) mit Vertrauensgrenzen von 276 und 362 Å-Einheiten (27,6 und 36,2 nm) geschätzt werden.
Eine Quecksilber-Porosimetrie bis zu einem Druck von 1000 atm ergab die folgenden Werte:
Porenvolumen: 0,249 cm3/g
Innere Oberfläche: 41,700 m2/g
Häufigster Porendurchmesser: 18 nm
Als die Messung bei 1000 atm unterbrochen wurde, stieg das Porenvolumen weiterhin mit dem Druck. Das bedeutet, daß die Substanz Poren mit einem Durchmesser unterhalb von 150 Å- Einheiten (15 nm) enthält, die nicht früher penetriert wurden. Das oben gezeigte Porenvolumen und die innere Oberfläche sollten daher als untere Grenzen betrachtet werden.

Beispiel 5 - Hochtemperatur-Behandlung

Proben der beschriebenen Substanz wurden 18 Stunden auf Temperaturen zwischen 600ºC und 800ºC in einem elektrischen Ofen erhitzt und sodann auf die gleiche Weise wie das ursprüngliche Produkt analysiert. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 1 zusammengefaßt.
Durch Erhöhung der Erhitzungstemperatur wachsen die Kristalle und die Poren mehr, während die innere Oberfläche schrumpft.
Nach Erhitzen auf 600ºC verschwanden die kleinen Poren mit Durchmessern von weniger als 15 nm zugunsten von größeren Poren.
Nach Erhitzen auf 650ºC wurde eine sehr breite Kristallgrößenverteilung und zwei vorherrschende Porengrößen mit Durchmessern von 34 nm und 130 nm beobachtet.
Eine Erhöhung der Temperatur von 700ºC auf 800ºC verringert das Porenvolumen abrupt von 0,216 cm³/g auf 0,042 cm³/g, wahrscheinlich wegen Beginn des Sinterns.
Ein Erhitzen innerhalb des verwendeten obigen Temperaturbereiches bewirkt ein Kristallwachstum, aber keine Änderung der Kristallgitterstruktur. Dies konnte unabhängig durch Thermodiffraktographie bestätigt werden: Bei etwa 650ºC wurden die vorher breiten Interferenzen schnell scharf, ohne ihre Richtungen zu ändern. TABELLE 1 Modifizierung der Kristallgröße und Porosität durch Hitzebehandlung Probe Elektronenmikroskopie Röntgen-Diffraktographie Quecksilber-Porosimetrie 18 Std. erhitzt auf Ungefähre Kristallgröße (nm) Kristallgröße 002 (nm) Vertrauensgrenze Porenvolumen (cm3/g) Innere Oberfläche (m2/g) Häufigster Porendurchmesser (nm) kein Erhitzen ungefähr 200

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines hochreinen Knochenminerals, wobei die organische Substanz in einem entfetteten Knochen durch Erhitzen mit Ammoniak oder einem primären Amin abgebaut und solubilisiert wird, dadurch gekennzeichnet, daß die solubilisierten Abbauprodukte durch Waschen mit fließendem Wasser bei Temperaturen unterhalb von 60ºC extrahiert werden, das Erhitzen mit einem primären Amin und die Waschschritte gegebenenfalls wiederholt werden, wobei im wesentlichen die gesamte organische Sustanz, die mit diesen Schritten entfernt werden kann, entfernt wird, das so behandelte Knochenmineral in Luft bei Temperaturen zwischen 250ºC und 600ºC erhitzt wird, wobei das Knochenmineral einen Gehalt an organischen Verunreinigungen unterhalb von 150 ppm besitzt.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das primäre Amin ein aliphatisches oder alicyclisches Amin ist, das eine oder mehrere primäre Aminogruppen besitzt.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der Knochen init dem primären Amin oder Ammoniak bei einer Temperatur im Bereich von 100º bis 150ºC erhitzt wird.

4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das fließende Wasser mit 1 bis 50 cm pro Stunde fließt.

5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das abschließende Erhitzen im Bereich von 350º bis 500ºC stattfindet.

6. Modifikation des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei, um ein Produkt mit einer modifizierten Knochenmineralstruktur herzustellen, der abschließende Erhitzungsschritt bei 600º bis 700ºC durchgeführt wird.

7. Knochenmineral zur Verwendung in der Medizin, das im wesentlichen die Kristallstruktur und die Mineral-Mikrostruktur eines natürlichen Knochens besitzt, und ein physiologisch kontrolliertes, durch Zellen vermitteltes Remodellieren bei einer Implantation erlaubt, wobei der Gehalt an organischen Verunreinigungen weniger als 150 ppm beträgt.

8. Knochenmineral gemäß Anspruch 7, auf dem ein oder mehrere Antibiotika, Sulfonamide oder Kondensationsprodukte von Formaldehyd und Taurinamid absorbiert sind.

9. Knochenmineral gemäß Anspruch 7 oder 8, das einen oder mehrere mitogene, morphogene, angiogene Faktoren und/oder transformierende Wachstumsfaktoren trägt.

10. Knochenmineral gemäß Anspruch 7 zur Verwendung als Remodellierungs-Implantat oder prosthetischer Knochenersatz.