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Hintergrund der Erfindung
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Gebiet der Erfindung
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Die
Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Isolierung von Erythropoetin
(EPO) unter Verwendung einer spezifischen Kombination aus chromatographischen
Schritten. Dieses Verfahren ermöglicht
die Herstellung von Erythropoetin mit hoher Reinheit und mit einem
gewünschten
Profil an EPO Glycoisoformen.
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EPO
ist ein Glycoprotein, das eine Hauptrolle bei der Proliferation
und Differenzierung von erythroiden Vorläuferzellen für Erythrocyten
spielt. EPO, das durch rekombinante DNA Technologie erhalten wird
(rekombinantes EPO), wird für
die klinische Anwendung verwendet.
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EPO
kommt als Gemisch aus Glycoisoformen vor, die sich in der Anzahl
an geladenen Kohlenhydratresten des Proteins unterscheiden. Die
Gruppe aus unterschiedlichen Gemischen der EPO Glycoisoformen umfasst
EPO-alpha, EPO-beta und EPO-omega.
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Beschreibung des Stands der Technik
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EPO
kann aus unterschiedlichen Quellen isoliert werden, die auch genetisch
veränderte
Säugerzellen umfassen.
Verfahren zur Isolierung/Reinigung, die aus der Wissenscharts- und
Patentliteratur bekannt sind, umfassen mehrere chromatographische
Schritte. Die am meisten verwendeten sind Anionenaustauschchromatographie
und Umkehrphasen HPLC (RP-HPLC). Andere chromatographische Verfahren
werden ebenfalls verwendet: Hydroxyapatit-, hydrophobe, Kationenautausch-,
Affinitäts-
(das heißt
Immunaffinitäts-)
und Größenausschluss-(Gelfilrations-)Chromatographien.
Einige Zwischenschritte sind auch herkömmlich: Aussalzung, Konzentration,
Diafiltration, Ultrafiltration, Dialyse, Fällung mit Ethanol und andere.
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Verfahren
zur Isolierung von EPO sind in mehreren europäischen Patenten und Patentanmeldungen und
auch in der Wissenschaftsliteratur beschrieben.
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Verfahren
zur Isolierung von EPO, die die Verwendung von RP-HPLC umfassen,
sind beschrieben in
EP
0 205 564 A ,
EP
0 148 605 A ,
EP
0 830 376 A ,
EP
0 267 678 A ,
EP
0 228 452 A ,
EP
1 127 063 A ,
EP
0 209 539 A und Lai et al. (1986) J. Biol. Chem., 261(7):
3116–3121,
Broudy et al. (1988) Arch. Biochem. Biophys. 265(2): 329–336, Zou
et al., (1998) Se Pu, Inuue et al. (1994) Biol. Pharm Bull 17(2):
180–184,
Qian et al., (1986) Blood, 68(1): 258–262, Krystal et al. (1986)
Blood 67(1): 71–79
und Lange et al (1984) Blood Cells, 10(2–3): 305–314. RP-HPLC erfordert in
den meisten Fällen
die Verwendung von organischen unpolaren Lösemitteln. Die organischen
unpolaren Lösemittel
sind toxisch, verschmutzen die Umwelt und sind schwierig von den
gewünschten
Proteinen zur trennen.
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Verfahren
zur Isolierung von EPO, die Immunaffinitätschromatographie mit gebundenen
monoklonalen Antikörpern
umfassen, sind beschrieben in: Sasaki et al. (1987) Methods Enzymol,
Yanagawa et al. (1984) J. Biol. Chem, 259(5): 2707–2710 und
Ghanem et al. (1994) Prep. Biochem. 24(2): 127–142. Monoklonale Antikörper sind
Säugerproteine,
ihre Stabilität
für die
Reinigung im großen
Maßstab
ist fraglich und Cleaning-in-place und desinfizierende Reinigungen
sind schwer auszuführen.
Es besteht auch ein Infektionsrisiko mit Viren.
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In
EP 0 358 463 A ist
eine Kombination aus Ionenaustauschchromatographie und Chromatographie mit
gebundenem Lektin zur Isolierung von EPO beschrieben. Dieses Verfahren
ergibt nur eine geringe Ausbeute.
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Die
Verwendung einer Lektinmatrix in einer Kombination mit Aussalzung
und Gelfiltration ist in
EP 1010
758 A beschrieben. Es wird erneut eine geringe Ausbeute
erhalten.
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Die
Verwendung einer Dihydroxyboronilmatrix zur Reinigung von EPO ist
in
EP 0 820 468 A beschrieben.
Es führt
zu einer geringen Reinheit, die nicht in der Humanmedizin verwendbar
ist.
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Die
EP 1 127 063 A beschreibt
die Isolierung von EPO durch Fällung
mit Ammoniumsulfat, hydrophober Chromatographie, Anionen- und Kationenaustauschchromatographien,
Gelfiltration oder unterschiedlichen Kombinationen der beschriebenen
Chromatographien. Dieses Verfahren liefert EPO, das in einem großen Maßstab mit
einer hohen Reinheit hergestellt werden kann, das zur Verwendung
in der Humanmedizin geeignet ist. Die Verwendung von Ammoniumsulfat
kann Probleme mit der Maßstabsvergrößerung verursachen,
es ist zusätzliche
Ausrüstung
erforderlich und es besteht ein Bedarf, die Phasen zu wechseln.
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Die
EP 0 984 062 A beschreibt
die Isolierung von EPO mittels: Chromatographie mit dem Matrixgebundenen
Farbstoff, hydrophober Chromatographie, Hydroxyapatitchromatographie
und Anionenaustauschchromatographie. Weder die Isolierung eines
gewünschten
Profils an Isoformen noch die Möglichkeit
der Veränderung
der EPO Glycoisoformen mit einer Kombination des chromatographischen
Schritts ist beschrieben.
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In
der
EP 0 640 619 A ist
die Isolierung von spezifischen EPO Glycoisoformen unter Verwendung
der Anionenaustauschchomatographie beschrieben. Es gibt jedoch keine
Beschreibung über
ein Verfahren zur Herstellung eines Gemisches aus unterschiedlichen
EPO Glycoisoformen. Ferner ermöglicht
das Verfahren nicht die Isolierung von EPO mit hoher Reinheit.
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Die
EP 0 428 267 A beschreibt
ein Verfahren zur Isolierung von spezifischen EPO Glycoisoformen, das
einen präparativen
isoelektrischen Fokusierungsschritt und ein Verfahren zur Isolierung
von Gemischen der EPO Glycoisoformen mit 12 oder mehr Sialinsäuren pro
Molekül,
das einen Anionenaustauschchromatographieschritt umfasst, der nach
RP-HPLC Reinigungsschritten ausgeführt wird. Ferner erlaubt das
Verfahren keine erwünschte
Kontrolle des gewünschten
Isoformengemisches, speziell jene mit weniger als 12 Sialinsäuren. Weder
die Isolierung des gewünschten
Profils der Isoformen noch die Möglichkeit
der Veränderung
der EPO Glycoisofomen mit einer Kombination aus chromatographischen
Schritten ist beschrieben.
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Es
ist ein Verfahren zur Isolierung der genauen Anzahl der EPO Glycoisoformen
eines EPO Analogons in
EP
1 037 921 A beschrieben. Das Verfahren verwendet RP-HPLC.
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Die
Trennung der spezifischen EPO Glycoisoformen durch die Verwendung
der isoelektrischen Kapillarfokussierung ist in Cifuentes et al.
(1999) J. Chromatogr. A. 15(2): 453–463 beschrieben. Jedoch wird
in diesem Verfahren Harnstoff verwendet, der klinische Anwendungen
hemmt. Die Verwendung der Kapillarisoelektrofokussierung ist nicht
für eine
Herstellung in großem
Maßstab
in der Industrie geeignet.
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Die
Abtrennung von EPO Glycoisoformen durch ein Verfahren, das unterschiedliche
chromatographische Verfahren verwendet, ist auch in Gokana et al.
(1997) J. Chromat. A. 791: 109–118
beschrieben. Das Verfahren umfasst die Verwendung der Immunaffinitätschromatographie
mit gebundenen monoklonalen Antikörpern. Dies erhöht das Risiko
für eine
mögliche
virale Infektion, die für
klinische An wendungen schädlich
ist, wobei die Stabilität
für eine
Herstellung in großem
Maßstab
fraglich ist und das Cleaning-in-Place und die desinfizierenden
Reinigungen schwierig auszuführen
sind. Ferner umfasst es die Verwendung von RT-HPLC, für die gewöhnlich toxische,
organische Lösemittel
erforderlich sind. Es ist daher schwierig, dieses System für eine industrielle
Anwendung zu verwenden.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Es
ist ein Ziel der Erfindung, das Verfahren zur Herstellung von EPO
zu verbessern. Die vorliegende Erfindung liefert ein Verfahren zur
Herstellung von EPO nach Anspruch 1 und den folgenden Ansprüchen.
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Der
Ausdruck "EPO Glycoisoform" bezieht sich auf
die EPO Herstellung mit einem einzigen pI und weist dieselbe Aminosäuresequenz
auf. Unterschiedliche EPO Glycoisoformen unterscheiden sich vorwiegend
durch den Gehalt an geladenen Kohlenhydratresten (Sialinsäuren) pro
EPO Molekül.
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Der
Gehalt an Sialinsäuren
trägt zur
Azidität
einer EPO Glycoisoform bei und definiert daher die Position jeder
Bande im Gel der isoelektrischen Fokussierung (IEF).
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Die
Nummerierung der Bandenpositionen im IEF Gel ist willkürlich. Höhere Nummern
zeigen eine erhöhgte
Azidität
an, das heißt
einen höheren
gehalt an Sialinsäuren.
Demnach enthält
EPO alpha (Epoietin alfa-Eprex®) EPO Glycoisoformen von
3 bis 8, BRP Standard (ein Referenzstandard der Europäischen Pharmakopöe-Erythropoetin
BRP Batch 1) enthält
die EPO Glycoisoformen 1 bis 8, EPO beta (Epoletin beta-Neorecormon®)
enthält
die EPO Glycoisoformen 1 bis 8. Der BRP Standard dürfte eine
50:50 Mischung der zwei EPO Präparationen
sein, die derzeit auf dem europäischen
Markt erhältlich
sind (Epoietin alfa und Epoietin beta).
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Gemäß Lai et
al. (1986) J. Biol. Chem. und
EP 0 428 267 A ist EPO alpha als Gemisch an
EPO Glycoisoformen beschrieben, die 9 bis 14 Sialinsäuregruppen
pro EPO Molekül
enthalten und diese EPO Glycoisoformen können dementsprechend den willkürlichen
Nummern 3 bis 8 zugeordnet werden (für die Präsentationen der EPO Glycoisoformen
dieser Erfindung verwendet).
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Das
essentielle Element der Erfindung ist die Bildung von EPO mit hoher
Reinheit und mit einem erwünschten
Profil der EPO Glycoisoformen unter Verwendung einer Kombination
an spezifischen chromatographischen Schritten auf eine Weise, dass
das Ausgangsprofil der EPO Glycoisoformen verändert oder modifiziert ist.
Die chromatographischen Schritte, die im erfindungsgemäßen Verfahren
angewendet werden, umfassen zumindest (a) Farbstoffaffinitätschromatographie
und (b) hydrophobe Chromatographie und (c) Anionenaustauschchromatographie.
In einer bevorzugten Ausführungsform
umfasst das Verfahren ferner (d) Gelfiltrationschromatographie.
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Im
Verfahren zur Herstellung von EPO gemäß der Erfindung wird das Profil
der EPO Glycoisoformen durch jeden der oben erwähnten chromatographischen Schritte
verändert
oder modifiziert. Die Performance aller chromatographischer Schritte
(a) bis (c) vorzugsweise mit (d) erlaubt es, ein reineres, vorbestimmteres EPO
Glycoisoformenprofil zu erhalten. Es ist daher möglich, das Profil der EPO Glycoisoformen
während
des Reinigungsprozesses zu kontrollieren und daher eine exakte und
gewünschte
Mischung der EPO Glycoisoformen (EPO alpha, EPO beta und andere)
mit hoher Reinheit zu erhalten.
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Das
gewünschte
Profil der EPO Glycoisoformen wird geeigneterweise durch das Einstellen
der bestimmten Prozessfaktoren, Auswahl geeigneter Matrizes für die oben
erwähnten
Chromatographieschritte, Anwendung von geeigneten Bedingungen in
den Wasch-/Elutionsschritten der jeweiligen chromatographischen Verfahren
und/oder Sammeln von geeigneten Fraktionen, die aus den Chromatographiesäulen eluiert
werden.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
kann vorteilhafterweise mit einem Verfahren zur Analyse des Profils der
EPO Glycoisoformen kombiniert werden, indem die EPO enthaltenden
Proben, die an ausgewählten
Zwischenschritten während
eines Mehrschrittverfahrens zur Herstellung von EPO in Form eines
Glycoisoformengemisches und wahlweise auch zu Beginn und/oder am
Ende des gesamten Prozesses erhalten werden, einer IEF mit einer
geeigneten Gelmatrix, wie Polyacrylamid unterzogen werden und dann
eine Immundetektion auf einer festen Phase ausgeführt wird.
Das heißt
die Analyse wird als Zwischenprozessschritt im Verlauf des Isolierungs-
und Reinigungsprozesses vorzugsweise mindestens zweimal ausgeführt. Die
Immundetektion kann auf der Basis der Western Blottechnik auf einer
geeigneten Membran ausgeführt
werden, wie einer Nitrozellulosemembran. Durch dieses Verfahren
wird eine in-Prozesskontrolle
der Proben währen
des Reinigungsverfahrens ermöglicht.
Das Verfahren ist daher zur Forschung, Verfahrensoptimierung und
zur industriellen Anwendung der Verfahren zur Herstellung von EPO
mit einem spezifischen und gewünschten
Profil an EPO Glycoisoformen brauchbar. Wenn es mit dem Verfahren
zur Herstellung eines EPO mit einem gewünschten EPO Glycoisoformenprofil
der Erfindung, wie dies oben definiert ist, kombiniert wird, erlaubt
die in-Prozessanalyse eine Inline-Kontrolle an ausgewählten Chromatographieschritten,
optional vor und nach jedem Schritt. Es ermöglicht eine Kontrolle über die
Wirksamkeit der gewünschten
Profiländerung
der EPO Glycoisoformen und die Bedingungen, die bei den Reinigungsschritten
in Bezug auf das gewünschte
EPO Glycoisoformenprofil angepasst werden können. Es ermöglicht daher
eine gezielte Entwicklung und Produktion von EPO. Eine Profilgesteuerte
Produktion von EPO kann daher ausgeführt werden. Es kann daher eine
hohe und gleichförmige Produktspezifität und eine
hohe Produktqualität
aufrechterhalten werden.
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Die
vorliegende Erfindung ermöglicht
eine Herstellung im großen
Maßstab
(große
Mengen) von biologisch wirksamem EPO mit hoher Reinheit und einem
gewünschten
Profil der EPO Glycoisoformen. Es ist daher zur industriellen Herstellung
von EPO geeignet.
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Mit
der vorliegenden Erfindung können
mehrere Vorteile zur gleichen Zeit erhalten werden. Das Verfahren
der Erfindung liefert ein gewünschtes
Profil der EPO Glycoisoformen. Die EPO Reinheit ist hoch durch das
Erreichen einer Reinheit, die zumindest 99% der gesamten Proteine überschreitet
und vorteilhafterweise 99,9% der gesamten Proteine überschreitet,
wie dies durch HPLC und Gelelektrophorese bestimmt wird. Das Verfahren
ist zur Herstellung von EPO im großen Maßstab geeignet. Da es nicht
erforderlich ist, den RP-HPLC Reinigungsschritt auszuführen, können toxische
unpolare organische Lösemittel
vermieden werden. Ferner werden weder Proteine noch andere Substanzen
tierischen Ursprungs verwendet. Daher wird das Kontaminationsrisiko
durch Viren und dergleichen und somit das Infektionsrisiko von Patienten
vermieden und die klinische Sicherheit wird verbessert. Das erhaltene
EPO ist zur Verwendung in der Humanmedizin geeignet.
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Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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Die 1 zeigt
die Trennung der EPO Glycoisoformen in den Proben von Überständen am
6., 10. und 11. Tag der Kultivierung der CHO Zellen, die EPO exprimieren.
Die Trennung wird mittels IEF und Immundetektion auf einer Membran
gemäß Beispiel
1 ausgeführt.
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Die 2 zeigt
die Profile der relativen Anteile der EPO Glycoisoformen in den
Proben, die von CHO Zellsuspensionskulturen abgeleitet sind, die
in 1 gezeigt sind.
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Die 3 zeigt
die Profile der relativen Anteile der EPO Glycoisoformen nach der
Elution aus einer Farbstoffaffinitätschromatographiesäule in Abhängigkeit
der pH Bedingungen, die für
den Elutionspuffer in Beispiel 2a verwendet werden.
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Die 4 zeigt
das Elektrophoretogramm der EPO Glycoisoformen nach IEF und Immundetektion
von EPO auf einer Membran, wie dies in Beispiel 2b erhalten wurde.
Spur
1: Probe nach Elution aus einer Farbstoffaffinitätschromatographiesäule (1.
Schritt des Reinigungsverfahrens) (Beispiel 2a, Puffer B, pH 7,0)
Spur
2: Zellkulturüberstand
(vor dem 1. Schritt des Reinigungsverfahrens)
Spur 3: Probe
nach der Elution aus einer hydrophoben Chromatographiesäule.
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Die 5 zeigt
die Profile der relativen Anteile von verschiedenen EPO Glycoisoformenfraktionen nach
der Ausführung
der hydrophoben Chromatographie mit einer Gradientenelution aus
der Säule,
wie dies in Beispiel 2c erhalten wurde.
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Die 6 zeigt
das Elektrophoretogramm der EPO Glycoisoformen nach der Ausführung einer
Anionenaustauschchromatographie DEAE Säule, wie dies in Beispiel 2d
erhalten wurde und durch IEF und Immundetektion von EPO auf einer
Membran analysiert wurde.
Spur 1: Eluat von der DEAE Säule
Spur
2: EPO BRP Standard
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Die 7 zeigt
Profile der relativen Anteile an unterschiedlichen EPO Glycoisoformenfraktionen
nach der Ausführung
einer Anionenaustauschchromatographie mit einer Gradientenelution
aus der DEAE Säule, wie
dies in Beispiel 2e erhalten wurde.
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Die 8 zeigt
die Profile der relativen Anteile von unterschiedlichen EPO Glycoisoformenfraktionen nach
der Ausführung
einer weiteren Anionenaustauschchromatographie mit einer Gradientenelution
von der Source 15Q Säule,
wie dies in Beispiel 2f erhalten wurde.
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Die 9 zeigt
die Profile der relativen Anteile von unterschiedlichen EPO Glycoisoformenfraktionen nach
der Ausführung
einer Gelchromatographie, gefolgt von IEF Analyse (Beispiel 2g).
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Die 10 zeigt
die Profile der relativen Anteile der EPO Glycoisoformen, die in
den vereinigten Fraktionen nach der Gradientenelution aus DEAE und
Source 15 Q Säulen
vorhanden sind, im Vergleich mit EPO Standards (Beispiel 2h).
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Die 11 zeigt
die Profile der relativen Anteile der EPO Glycoisoformen nach 3
aufeinanderfolgenden Chromatographieschritte, die Farbstoffaffinitäts-, hydrophobe
und Anionenaustauschchromatographieschritte umfassen, wie dies mit
IEF analysiert wird. Zum Vergleich werden EPO alpha und nicht gereinigtes EPO
aus dem Zellkulturüberstand
eines Bioreaktors durch IEF analysiert. In diesem besonderen Fall
wird die Isoform 8 aufgrund einer geringen Menge des auf das Gel
aufgetragenen Materials nicht detektiert.
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Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
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Die
Erfindung betrifft unterschiedliche Wege der Anwendung spezifischer
chromatographischer Methoden. Gemäß des Grundkonzepts der Erfindung
umfasst das Verfahren zur Herstellung von Erythropoetin (EPO) in
Form eines Glycoisoformengemisches das Unterziehen einer EPO enthaltenden
Zusammensetzung der chromatographischen Schritte aus (a) Farbstoffaffinitätschromatographie
und (b) hydrophober Chromatographie und (c) Anionenaustauschchromatographie,
worin das EPO Glycoisoformenprofil nach den chromatographischen
Schritten relativ zu der EPO enthaltenden Ausgangszusammensetzung
verändert
ist. Der Ausdruck EPO Glycoisoformenprofil gemäß der Erfindung meint ein Gemisch
aus definierten EPO Glycoisoformen, die in verschiedenen Anteilen
im Gesamtgemisch enthalten sind. Es wurde festgestellt, dass es
durch diese Schritte (a) und (b) möglich ist, das Profil durch
die Verringerung und vorzugsweise Eliminierung des Anteils an EPO
Glycoisoformen mit einer geringen Anzahl von beispielsweise bis
zu 3, vorzugsweise bis zu 4 und vor allem bis zu 5 (einschließlich 5)
Sialinsäuregruppen
pro EPO Molekül
zu verringern und vorzugsweise zu eliminieren. Die Verringerung
oder vorzugsweise Eliminierung des Anteils dieser EPO Glycoisoformen
mit geringer Anzahl ist für
das erhaltene EPO Produkt in Bezug auf Stabilität und biologischer Aktivität hilfreich.
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Die
EPO enthaltende Ausgangszusammensetzung, die den chromatographischen
Schritten und so der Veränderungen
des Profils unterzogen wird, ist geeigneterweise eine Zusammensetzung,
die aus dem Überstand
einer Zellkultur oder eines Wachstumsmediums erhalten wird, in das
rekombinantes humanes EPO (rHuEPO) exprimiert wird. rHuEPO wird
aus genetisch transfizierten Säugerwirtszellen
exprimiert, beispielsweise Quarzellen des Chinesischen Hamsters
(CHO) oder Babyhamsternierenzellen (BHK). Die Zellen können in
Rollflaschen, Rollkolben oder Bioreaktoren kultiviert werden. Das
Zellwachstum und die Kultivierung können durch ein Batchverfahren
oder durch kontinuierliches Verfahren ausgeführt werden. Wenn ein kontinuierliches
Verfahren ausgeführt
wird, kann es als Perfusionskultur in einem Bioreaktor und einem
kontinuierlichen Ernten für
einen angemessenen Zeitraum ausgeführt werden. Um die Zellen und
möglicherweise
andere kontaminierende Materialien aus dem Kulturmedium zu entfernen,
kann der Überstand
einem Fällungsschritt unterzogen
werden, beispielsweise mittels Ammoniumsulfat. Vorzugsweise wird
der Überstand
einer Filtration unterzogen. Die EPO enthaltende Lösung oder
das Filtrat werden dann auf die Farbstoffaffinitätssäule aufgetragen.
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Die
Farbstoffaffinitätschromatographie
in Schritt (a) wird mit einem geeigneten Matrixgebundenen Farbstoff,
vorzugsweise mittels eines Triazinfarbstoffs ausgeführt. Der
besonders bevorzugte Matrix-gebundene Farbstoff ist Cibachron 3G
und ein geeignetes Säulenmaterial
ist Blue Sepharose 6 Fast Flow. Ein Faktor, durch den das EPO Glycoisoformenprofil
beeinflusst werden kann, ist der pH des Elutionspuffers. Der pH
des Elutionspuffers wird vorzugsweise auf einen Bereich von 5,0
bis 9,0, bevorzugter 6,0 bis 8,0 eingestellt. Es können unterschiedliche
Elutionen verwendet werden, vorzugsweise lineare (Gradienten-) oder
Stufenelution, am bevorzugtesten Stufenelution. Es können unterschiedliche
Salze für
die Elution verwendet werden, vorzugsweise NaCl und KCl, am bevorzugtesten
NaCl.
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Die
hydrophobe Chromatographie in Schritt (b) wird mit einer hydrophoben
Matrix ausgeführt.
Ein geeignetes Matrixmaterial ist Sepharose, das durch hydrophobe
Gruppen modifiziert wird, wie Alkylgruppen, wie dies beispielhaft
dargestellt wird durch Butyl- oder Arylgruppen, wie dies beispielhaft
durch Phenyl dargestellt wird. Eine gute Verringerung oder Eliminierung
des Anteils an EPO Glycoisoformen mit einer geringeren Anzahl an
Sialinsäuregruppen
pro EPO Molekül
kann durch die Verwendung von Sourcematrix (Polystyroldivinylbenzol)
Materialien erhalten werden, die hydrophobe Gruppen aufweisen, wie
Isopropyl, Phenyl oder Ether, Toyopearlmatrizes mit hydrophoben
Gruppen, wie Phenyl, Butyl und Ether, vorzugsweise Butyl-modifizierte Träger, wie
Butyl Sepharose 4 Fast Flow. Es können unterschiedliche Elutionstypen
verwendet werden, vorzugsweise lineare (Gradienten-) oder Stufenelution,
am bevorzugtesten Stufenelution.
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Die
gewünschte
Veränderung
des Glycoisoformenprofils wird weiter durch die Ausführung eines Schritts
(c) der Anionenaustauschchromatographie verbessert. Durch diese
Maßnahme
wird das Profil signifikant verändert,
um ein reineres und kontrollierteres EPO Glycoisoformengemisch bereitzustellen,
wie dies gewünscht
wird. Ein bevorzugtes Anionenaustauschchromatographiematerial ist
DEAE Sepharose, wie DEAE Sepharose Fast Flow oder Source 30Q (quarternäre, geladener
Aminoethylligand) oder Source 15Q (quarternärer geladener Ammoniumligand),
vorzugsweise Source 15Q.
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Wenn
das erfindungsgemäße Verfahren
ferner den chromatographischen Schritt (d) einer Gelchromatographie
umfasst, kann ein weiterer Selektionsprozess in Bezug auf das gewünschte EPO
Glycoisoformengemisch realisiert werden. Die EPO Glycoisoformen
unterscheiden sich in Bezug auf die Fraktion, die von der Gelchromatographiesäule vereinigt
wird. Ein bevorzugtes Gelchromatographiesäulenmaterial ist Superdex 200
oder Sephacryl S-200.
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Im
obigen Verfahren zur Herstellung von EPO, wie dies oben beschrieben
ist, bestehen die chromatographischen Schritte vorzugsweise aus
den folgenden Schritten in der angegebenen Reihenfolge: (a), (b),
(c) oder (a), (c), (b), jeweils optional mit (d).
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Die
angegebenen Reihenfolgen der chromatographischen Schritte sind in
Bezug auf sowohl eine effektive Reinigung als auch eine gewünschte EPO
Glycoisoformenanpassung wirksam. Als Zwischenschritte werden Pufferaustausch
und speziell Filtration, Ultrafiltration und/oder Diafiltration
ausgeführt.
Es besteht aber kein Bedarf für
eine Veränderung
des Puffers zwischen den Schritten (a) und (b). Insbesondere werden
Ultrafiltrations- und Diafiltrationsschritte zwischen den Schritten
(b) und (c) ausgeführt
und ein weiterer Ultrafiltrationsschritt wird zwischen den Schritten
(c) und (d) ausgeführt.
Andere herkömmliche
Reinigungsverfahren können
zusätzlich
angewendet werden, können
aber auch weggelassen werden. Insbesondere können chromatographische Schritte,
wie HPLC und Hydroxyapatit vermieden wer den, die ferner die Verwendung
organischer Lösemittel
erfordern. Die ausschließliche
Anwendung der Schritte (a) bis (d), optional supplementiert durch Pufferaustausch-
oder Filtrationstechniken, ermöglicht
bereits die Isolierung von hochqualitativem EPO in hoher Ausbeute,
hoher Reinheit und einem gewünschten
Profil an EPO Glycoisofomen. Das Produkt kann so direkt zur klinischen
Anwendung in der Humanmedizin verwendet werden.
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Im
erfindungsgemäßen Herstellverfahren
richtet sich die Veränderung
des EPO Glycoisoformenprofils auf die Herstellung eines Gemisches
aus EPO Glycoisoformen mit einer definierten Anzahl an Sialinsäuregruppen
pro EPO Molekül.
Das gewünschte
EPO Glycoisoformengemisch wird geeigneterweise hergestellt und genau
kontrolliert durch (i) Selektion der geeigneten Matrices, (ii) durch
Einstellung der chromatographischen Bedingungen und/oder (iii) durch
Sammlung der gewünschten
Fraktionen, die aus der Säule
in den obigen chromatographischen Schritten (a) bis (c), optional
mit (d) eluiert werden.
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Um
ein gleichförmiges
und gut definiertes EPO Glycoisoformengemisch herzustellen, das
eine hohe biologische Aktivität
und Stabilität
aufweist, werden die chromatographischen Schritte vorzugsweise auf
eine Weise eingestellt, dass ein spezifischer Gehalt an Sialinsäuregruppen
pro EPO Molekül
erhalten wird, der einem Bereich von 6 bis 14 entspricht. Erforderlichenfalls
kann das hergestellte EPO Glycoisoformengemisch dann EPO alpha (Anzahl
der Sialinsäuregruppen
8 bis 13) oder EPO beta (6–13)
oder EPO entsprechen, das eine Anzahl an Sialinsäuregruppen von 7 bis 13 aufweist.
Darüberhinaus
kann der Anteil einer spezifischen EPO Isoform oder aller Isoformen
in einem Gemisch ebenfalls variiert werden.
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Die
Bedingungen der jeweiligen oben beschriebenen chromatographischen
Schritte können
unter Verwendung einer geeigneten Chromatographiematrix, Einstellung
der chromatographischen Bedingungen und/oder Auswahl der eluierten
Fraktionen eingestellt werden. Geeignete chromatographische Bedingungen in
Bezug auf pH Bereich, Salzkonzentration oder Gradient und Temperatur
sind in den folgenden Tabellen gezeigt. Allgemeine Bereiche:
Chromatographie | pH
Bereich | Salzkonzentrationsbereich/Gradient | Temperaturbereich °C |
Farbstoffaffinität | 5–9 | 0–2,5 M | 2–20 |
Hydrophobe | 6–8 | 2,5–0 M | 4–25 |
Anionenaustausch | 6–8 | 0–0,30 M | 4–25 |
Gelchromatographie | 6–8 | 0,15–1 M | 2–20 |
Bevorzugte Bereiche:
Chromatographie | pH
Bereich | Salzkonzentrationsbereich/Gradient | Temperaturbereich °C |
Farbstoffaffinität | 6,5–7,5 | 0–2,5 M | 2–6 |
Hydrophobe | 6,5–7,5 | 2,5–0 M | 18–23 |
Anionenaustausch | 6,5–7,5 | 0–0,30 M | 18–23 |
Gelchromatographie | 7,2–7,5 | 0,15–0,5 M | 2–6 |
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Das
erhaltene EPO Produkt mit dem gewünschten Glycoisoformengemisch
ist zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung geeignet,
die eine therapeutisch wirksame Menge an EPO umfasst. Das gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren
erhaltene EPO wird mit einem herkömmlichen pharmazeutisch annehmbaren
Träger
gemischt. Eine bevorzugte pharmazeutische Zusammensetzung umfasst
EPO, Puffer, Polysorbate, unterschiedliche Aminosäuren, optional
Zucker und Salze.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
wird vorzugsweise mit einem Verfahren zur Bestimmung des Erythropoetin
(EPO) Glycoisoformenprofils in einer EPO enthaltenden Zusammensetzung
kombiniert, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
- – Bereitstellung
einer EPO enthaltenden Zusammensetzung aus dem Kulturüberstand
und/oder ein Zwischenschritt oder am Ende eines EPO Isolierungs-
und Reinigungsverfahrens, das mehrere chromatographische Schritte
umfasst und/oder aus einer pharmazeutischen Zusammensetzung
- – Unterziehung
der EPO enthaltenden Zusammensetzung einer isoelektrischen Fokussierung
(IEF) in einer Gelmatrix
- – Transfer
von Proteinen aus dem Gel auf eine Membran
- – Immundetektion
von EPO auf der Membran
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Eine
geeignete Gelmatrix, die für
IEF verwendet wird, ist Polyacrylamid. Der Transfer aus dem Gel
auf eine Membran, die vorzugsweise eine Nitrocellulosemembran ist,
kann durch einen einfachen Diffusionstransfer oder Elektroblot ausgeführt werden.
Die Immundetektion wird geeigneterweise durch die Verwendung von EPO
spezifischen Antikörpern
und geeignet markierten sekundären
Antikörpern
ausgeführt.
Die Verwendung von IEF kombiniert mit der Immundetektion, die für EPO auf
der Membran spezifisch ist, ermöglicht
eine verlässliche
Analyse des Profils der EPO Glycoisoformen in den Proben der Säugerzellkulturen
und in den Proben nach jedem Chromatographieschritt der vorliegenden
Erfindung, wie dies oben beschrieben ist. Dieses Verfahren ermöglicht die
Kontrolle der Proben während
des Reinigungsprozesses, welche eine in-Prozess Kontrolle ist. Sie
kann daher für
Forschung, Optimierungsverfahren und industrielle Anwendung der
Verfahren zur Herstellung von EPO mit einem spezifischen Profil
der EPO Glycoisoformen verwendet werden. Das Profil der EPO Glycoisoformen
kann in den konzentrierten Proben des gereinigten EPO, in komplexen
Proteingemischen (Zellkulturen) und in Lösungen mit einer geringen Konzentration
an EPO und nach einem bestimmten Chromatographieschritt und in allen
Proben und Lösungen
bestimmt werden, die andere Proteine umfassen. Die Analyse ist für EPO und
einige EPO Analoga spezifisch und empfindlich. Das bestimmte EPO
Glycoisoformenprofil ermöglicht
einen direkten Vergleich der EPO Glycoisoformzusammensetzungen und
quantitativen Anteile in unterschiedlichen Proben, die entweder
aus einer Zellkultur oder aus verschiedenen Eluaten der chromatographischen
Schritte stammen. Das Verfahren zur Bestimmung des EPO Glycoisoformenprofils
wird vorzugsweise in einer in-Prozesskontrolle während des Verfahrens der Herstellung
von Erythropoetin (EPO) der Erfindung angewendet, wie dies oben
beschrieben ist.
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Die
folgenden Beispiele sind zum Zweck der Erläuterung von verschiedenen Ausführungsformen
der Erfindung angegeben und sollen die vorliegende Erfindung in
keiner Weise beschränken.
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Beispiel 1
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IEF in Polyacrylamidgel und Immundetektion
auf Nitrocellulosemembran
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Dieses
Verfahren wird für
die Analyse des Profils der EPO Glycoisoformen verwendet. Es kann
das Profil der EPO Glycoisoformen in unterschiedlichen Proben bestimmt
werden (in komplexen Proteingemischen, in den Proben mit geringen
Konzentrationen an EPO). Das Analyseergebnis ermöglicht den direkten Vergleich
der EPO Qualität
in unterschiedlichen Proben. Das vorliegende Beispiel 1 zeigt die
IEF Analyse und die Immundetektion von EPO aus Zellkulturen und
die anschließenden
Beispiele 2 und 3 zeigen die Ergebnisse von Eluaten nach einem bestimmten
Chromatographieschritt der Isolierung und/oder Reinigung von EPO.
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Für eine zur
IEF Analyse präparierende
Probe wird diese einer Diafiltration unter Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran
unterzogen (MGCO (Molekulargewichtsausschlussgrenze) 10 000 Da).
Der Diafiltrationsschritt eliminiert Moleküle, die kleiner als 10 kDa
sind und führt
zu einem Entsalzen und Konzentrieren der Probe. Die Endkonzentration
der Probe beträgt
0,5 bis 1,5 μg
EPO, wobei 15–20 μl der Probe
auf das Gel aufgetragen werden.
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Herstellung des IEF Polyacrylamidgels
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Die
Gesamtkonzentration an Acrylamid beträgt 5%, das Maß an Quervernetzung
beträgt
3%, die Dicke beträgt
0,5 mm und die Endkonzentrationen an Harnstoff und Gesamtampholiten
betragen jeweils 5 M und 2%. Die Rolle der Ampholiten ist es, einen
pH Gradienten von pH 3 bis 6 im Gel zu erhalten (beispielsweise 70%
des Gesamtampholiten ergibt pH 3–5, 30% der Gesamtampholiten
ergibt pH 3–10).
Die Elektrodenlösungen
werden an die Wahl der Ampholite angepasst, beispielsweise besteht
der Elektrolyt an der Anode aus 0,1 M Glutaminsäure und 0,5 M Phosphorsäure und
der Elektrolyt an der Kathode besteht aus 0,1 M β-Alaninlösung.
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Wie
in 1 gezeigt werden die EPO Glycoisoformen in den
Proben der Überstände der
Zellkulturen mittels IEF getrennt. In den Spuren 1 bis 3 werden
Proben der EPO bildenden Zellkultursuspension (CHO Zellen) am 6.
Tag (Spur 1), am 10. Tag (Spur 2) und am 11. Tag (Spur 3) vom Beginn
der Kultivierung an entnommen und auf das Gel aufgetragen. In Spur
4 wird EPO BRP Batch 1 auf das Gel aufgetragen.
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Vorfokussierung
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25
Minuten bei konstanter Leistung P = 12 W (für die Gelgröße von 25 × 11 cm). Die Proben (15–20 μl) werden
nahe an der Kathode aufgetragen.
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Fokussierung
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75
Minuten bei konstanter Leistung P = 15 W (für die Gelgröße 25 × 11 cm). Während der Elektrophorese wird
das Gel bei 15°C
gehalten. Die Bedingungen für
die Elektrophorese können
verändert
werden, indem man die unterschiedlichen Eigenschaften der Ampholiten
aus unterschiedlichen Quellen in Betracht zieht.
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Diffusionstransfer
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Der
Diffusionstransfer der Proteine aus dem Gel auf die Membran wird
folgendermaßen
ausgeführt: Die
Membran wird auf das Gel gelegt und es werden mehrere Lagen an Filterpapier
auf die Membran gelegt. Die Gelmembran und das Filterpapier haben
dieselbe Größe. Die
Membran und das Filterpapier werden in Transferpuffer vorbenetzt.
Transferpuffer:
48 mM Tris-HCl, 39 mM Glycin, 0,037% SDS, 20 Volumenprozent Methanol,
pH 8,3. Die Transferzeit beträgt
90 Minuten bei 40°C
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Immundetektin auf Nitrocellulosemembran
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Nach
dem Transfer wird die Nitrocellulose mittels einer 5% Lösung an
Magermilchpulverblockierungslösung
blockiert. Dann wird die Membran mit monoklonalem Maus-anti-hEPO
Antikörper
(IgG) als primäre
Antikörper
inkubiert. Die Membran wird mit 10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH
7,4 gewaschen. Dann wird die Membran mit polyklonalen Kaninchenantikörpern (IgG)
inkubiert, die mit Meerrettichperoxidase als sekundäre Antikörper konjugiert
sind. Für
die Färbereaktion
wird ein Substrat für
die Peroxidase verwendet, beispielsweise 4-Chlor-1-naphthol.
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Es
werden spezifische EPO Glycoisoformen durch den Vergleich mit EPO
BRP identifiziert. Die Intensität
der Banden wird mittels Densitometrie bestimmt. Es wird dann das
Profil der spezifischen EPO Glycoisoformen berechnet.
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Das
erhaltene Elektrophoretogramm ist in 1 gezeigt.
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Getrennte
Banden, die auf dem Elektrophoretogramm beobachtet werden, werden
mit willkürlichen Zahlen
von 3 bis 9 markiert. Sie werden gemäß der ansteigenden Azidität der Isoform
von der negativen Kathode zur positiven Anode markiert (höhere Nummern
zeigen Isoformen mit mehr Sialinsäuren und daher einem geringeren
pI an). In der 1 und in den anschließenden Figuren
ist die Korrelation zwischen den willkürlichen Nummern im Elektrophoretogramm
und den Nummern der Sialinsäuregruppen
pro EPO Molekül
wie folgt: Isoformen 9, 8, 7, 6 werden jeweils 14, 13, 12, 11 ...
Sialinsäuregruppen
pro Molekül
zugeordnet.
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Die 2 zeigt
die Profile der relativen Anteile der EPO Glycoisoformen in den
Proben, die von Suspensionskulturen der CHO Zellen abgeleitet sind,
die in 1 gezeigt sind. Die Intensität der Banden auf der Membran
(1) wird durch Densitometrie gemessen. Die Intensität jeder
Bande ist ein relativer Teil (relative Intensität,%) der Summe der Intensitäten aller
detektierten Banden aus jeder Probe (Spur) angegeben.
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Die 1 und 2 zeigen,
dass die IEF Analyse in Kombination mit der Immundetektion gemäß der Erfindung
eine gute und spezifische Kontrolle über die EPO Glycoisoformbildung
aus der rohen Zellkultur erlaubt, in der viele andere Proteine vorkommen.
Durch diese Analyse kann ein geeigneter Zeitpunkt für die Ernte
gefunden werden, die eine gute Basis zur weiteren Isolierung und
Reinigung in Bezug auf das angestrebte Glycoisoformenprofil bereitstellt.
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Die 4 und 6 zeigen
weitere Elektrophoretogramme für
die EPO Glycoisoformenanalyse während
des Verfahrens zur Herstellung des EPO Glycoisoformengemisches gemäß der Erfindung
(siehe jeweils Beispiele 2b und 2d).
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Beispiel 2
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Veränderung
der EPO Glycoisoformenprofile durch unterschiedliche chromatographische
Schritte
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Beispiel 2a: Chromatographie auf Matrix-gebundenem
Farbstoff Cibachron Blue 3G
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Die
EPO bildende CHO Zellkultursuspension wird in einem Bioreaktor hergestellt,
zuerst durch ein 10 μm
Vorfilter und dann durch ein 0,2 μm
Membransterilfilter unter Antrennung der Zellen filtriert.
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Das
Filtrat wird auf die erste Chromatographiesäule unter Verwendung eines
Matrixgebundenen Farbstoffs Cibachron Blue 3G aufgetragen. Die Chromatographie
wird unter den folgenden Bedingungen ausgeführt:
Säule: | Matrix
Blue Sepharose 6 Fast Flow, Amersham Pharmacia Biotech |
| Partikelgröße 45 bis
165 μm |
| SV
(Säulenvolumen)
= 7,85 ml, H (Säulenhöhe) = 10 cm, |
| D
(Säulendurchmesser)
= 1 cm |
Temp | Raumtemperatur |
Flussrate | 1,5
ml/min, 115 cm/Stunde |
Puffer
A | 10
mM Na-Phosphat, pH = 7,0 |
Puffer
B | 10
mM Na-Phosphat, 2,5 M NaCl, pH = 7,0 |
Probe | 150
ml, 6 mg |
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Die
Probe wird mit 5 SV (Säulenvolumina)
Puffer A äquilibriert.
Nach dem Auftragen der Probe wird die Säule zuerst mit 3 SV an Puffer
A und dann mit 5 SV eines Gemisches aus Puffer A und B (90:10) gewaschen.
Das meiste EPO eluiert mit Puffer B (5 SV). Dieselbe Trennung wird
mittels der Puffer A und B bei pH 6,4 und 8,0 ausgeführt.
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Vereinigte
Fraktionen nach der Elution mit Puffer B werden mittels IEF in Polyacrylamidgel, Überführung der
Proteine auf die Nitrocellulosemembran und Ausführung der Immundetektion analysiert,
wie dies in Beispiel 1 beschrieben ist. Die Intensität der Banden
auf der Membran wird densitometrisch gemessen. Die Intensität jeder
Bande ist als relativer Teil (relative Intensität,%) der Summe der Intensitäten aller
detektierten Banden für
jede Probe (Spur) angegeben. Die getrennten Banden, die auf dem
Elektrophoretogramm sichtbar sind, werden mit willkürlichen
Nummern von –3
bis 9 markiert (mit der Korrelation zwischen den angegebenen Nummern
und des Gehalts an Sialinsäuren
pro EPO Molekül,
wie dies in Beispiel 1 definiert ist). Die Analyse zeigt, dass unterschiedliche
Profile an EPO Glycoisoformen unter Verwendung eines unterschiedlichen
pHs der Wasch- und Elutionspuffer erhalten werden können, wie
dies in 3 gezeigt ist.
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Beispiel 2b: Hydrophobe Chromatographie
(1)
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Das
Eluat aus der Blue Sepharose 6 Fast Flow Säule (Puffer B bei pH 7) mit
einem gewünschten
Glycoisoformenprofil wird auf eine Butyl Sepharose 4 Fast Flow (Amersham
Pharmacia Biotech) Säule
aufgetragen. Die hydrophobe Chromatographie wird unter den folgenden
Bedingungen ausgeführt:
Säule: | Matrix
Butyl Sepharose 4 Fast Flow, Amersham Pharmacia Biotech, |
| mittlere
Partikelgröße 90 μm |
| SV
= 1 ml, H = 2,5 cm, D = 0,7 cm |
Temp. | Raumtemperatur |
Flussrate | 1
ml/min, 150 cm/Stunde |
Puffer
A | 10
mM Na-Phosphat, 2,5 M NaCl, pH = 7,0 |
Puffer
B | 10
mM Na-Phosphat, 1,0 M NaCl, 30% (V/V) Isopropanol, pH = 7,0 |
Puffer
C | 10
mM Na-Phosphat, 30% (V/V) Isopropanol, pH = 7,0 |
Probe | 1,5
ml, 0,9 mg |
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Die
Säule wird
mit Puffer A äquilibriert.
Nach dem Auftragen der Probe wird die Säule mit 3 SV Puffer A und dann
mit 8 SV Puffer B gewaschen. Das meiste EPO wird mit Puffer C eluiert.
Das Profil der EPO Glycoisoformen, das durch das Waschen der Säule mit
Puffer C erhalten wird, wird mit IEF in Polyacrylamidgel und Immundetektion
von EPO auf Nitrocellulosemembran analysiert, wie dies in 4 gezeigt
ist.
Spur 1: Probe nach Elution von der Blue Sepharose Fast
Flow Chromatographiesäule
(1. Schritt des Reinigungsverfahrens) (Beispiel 2a, Puffer B, pH
7)
Spur 2: Zellkulturüberstand
(vor dem 1. Schritt des Reinigungsverfahrens)
Spur 3: Probe
nach der Elution von der Butyl Sepharose 4 Fast Flow Säule (vereinigte
Fraktionen nach Elution mit Puffer C).
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IEF
und Immundetektionsanalyse werden wie in Beispiel 1 ausgeführt und
evaluiert.
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Wie
es aus 4 deutlich wird, werden solche chromatographischen
Bedingungen etabliert, so dass die meisten EPO Glycoisoformen mit
einem geringeren Gehalt an Sialinsäuren eliminiert werden.
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Die
vereinigten Fraktionen werden mittels des Ultrafiltrationssystems
MINITAN (Millipore) konzentriert. Die Diafiltration wird mittels
10 mM Na-Phosphatpuffer pH 7,0 als Puffer ausgeführt.
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Das
Eluat aus der Blue Sepharose 6 Fast Flow Säule (Puffer B bei pH 7) mit
einem erwünschten
Glycoisoformenprofil wird auf eine Butyl Sepharose 4 Fast Flow Säule (Amersham
Pharmacia Biotech) aufgetragen. Die hydrophobe Chromatographie wird
unter folgenden Bedingungen ausgeführt:
Säule: | Matrix
ButylSepharose Fast Flow, Amersham Pharmacia Biotech, |
| mittlere
Partikelgröße 90 μm |
| SV
= 1 ml, H = 2,5 cm, D = 0,7 cm |
Temp. | Raumtemperatur |
Flussrate: | 1
ml/min, 150 cm/h |
Puffer
A | 10
mM Na-Phosphatpuffer, 2,5 M NaCl, pH = 7,0 |
Puffer
C | 10
mM Na-Phosphatpuffer, 30% (V/V) Isopropanol, pH = 7,0 |
Probe | EPO
BRP Standard gelöst
in Puffer A, 0,5 ml, 0,25 mg |
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Die
Säule wird
mit Puffer A äquilibriert.
Nach dem Beladen der Säule
wird die Säule
mit 3 SV Puffer A und dann mit 5 SV eines Gemisches der Puffer A
und C (50:50) gewaschen. EPO wird von der Säule mit einem linearen Gradienten
an Puffer C in Puffer A (linearer Gradient von 50 bis 100% von Puffer
C in 45 Minuten (= 45 SV)) eluiert. Es können 3 überlappende Peaks auf dem Chromatogramm
gesehen werden. EPO wird in den Fraktionen 15 bis 23 eluiert. Die
Fraktionen 15, 19 und 21 werden dann mittels IEF und Immundetektion
analysiert, wie dies in Beispiel 1 beschrieben ist. Die in 5 gezeigten
Ergebnisse zeigen, dass das Profil der EPO Glycoisoformen sich von
Fraktion zu Fraktion unterscheidet.
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Die
EPO Glycoisoformen mit geringerem pI (höherer Gehalt an Sialinsäuren) werden
in früheren
Fraktionen eluiert, als die mit höherem pI. Dieses Merkmal zeigt
an, dass es dieses Verfahren ermöglicht,
die Fraktionen mit dem gewünschten
Profil an EPO Glycoisoformen zu sammeln.
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Beispiel 2d: Anionenaustauschchromatographie
(1)
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Das
Eluat aus der Butyl Sepharose 4 Fast Flow Säule, wie dies in Beispiel 2c
beschrieben ist, mit einem gewünschten
Glycoisoformenprofil wird auf eine DEAE Sepharose Fast Flow Säule (Amersham
Pharmacia Biotech) aufgetragen. Die Anionenaustauschchromatographie
wird unter folgenden Bedingungen ausgeführt:
Probe | 0,2
mg |
Säule | Matrix
DEAE Sepharose Fast Flow, Amersham Pharmacia Biotech |
| mittlere
Partikelgröße 90 μm |
| SV
= 1 ml, H = 2,5 cm, D = 0,7 cm |
Flussrate | 1
ml/min, 158 cm/Stunde |
Puffer
A | 10
mM Na-Phosphat pH = 7,0 |
Puffer
B | 10
mM Na-Phosphat pH = 7,0, 0,03 M NaCl |
Puffer
C | 10
mM Na-Phosphat pH = 7,0, 0,1 M NaCl |
Puffer
D | 10
mM Na-Phosphat pH = 7,0, 0,3 M NaCl |
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Die
Säule wird
mit Puffer A äquilibriert.
Nach dem Auftragen der Probe wird die Säule mit 3 SV Puffer A gewaschen
und dann mit 5 SV Puffer B. Das meiste EPO wird mit Puffer C (8
SV) eluiert. Die verbleibenden Proteine werden mit Puffer D eluiert.
Die Säule
wird mit 2 M NaCl regeneriert.
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Das
Profil der durch das Waschen der Säule mit Puffer C erhaltenen
EPO Glycoisoformen wird mit IEF und Immundetektion von EPO auf einer
Nitrocellulosemembran analysiert, wie dies in Beispiel 1 beschrieben ist.
Die Ergebnisse sind in 6 gezeigt.
Spur 1: Eluat
von DEAE Sepharose Fast Flow (vereinigte Fraktionen nach der Elution
mit Puffer C)
Spur 2: EPO BRP Batch 1.
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Die
beschriebenen Bedingungen ermöglichen
es, ein Profil zu erhalten, das im wesentlichen zu dem Profil des
EPO BRP Standards ähnlich
ist.
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Beispiel 2e: Anionenaustauschchromatographie
(2)
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Das
Eluat von der Butyl Sepharose Fast Flow Säule, wie dies in Beispiel 2c
beschrieben ist, mit einem gewünschten
Glycoisoformenprofil wird auf eine DEAE Sepharose Fast Flow Säule (Amersham
Pharmacia Biotech) aufgetragen. Die Anionenaustauschchromatographie
wird unter folgenden Bedingungen ausgeführt:
Säule: | Matrix
DEAE Sepharose Fast Flow, Amersham Pharmacia Biotech, |
| mittlere
Partikelgröße 90 μm |
| SV
= 1 ml, H = 2,5 cm, D = 0,7 cm |
Temp | Raumtemperatur |
Flussrate | 1
ml/min, 150 cm/Stunde |
Puffer
A | 10
mM Na-Phosphat pH = 7,0, |
Puffer
B | 10
mM Na-Phosphat pH = 7,0, 1 M NaCl |
Probe | EPO
BRP Standard gelöst
in Puffer A, 0,5 ml, 0,25 mg |
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Die
Säule wird
mit Puffer A äquilibriert.
Nach dem Auftragen der Probe wird die Säule mit 3 SV Puffer A gewaschen
und dann mit 5 SV eines Gemisches aus Puffer A und B (94:6). Das
EPO wird aus der Säule eluiert,
wobei der Anteil an Puffer B in Puffer A (linearer Gradient von
6 bis 11,5% an Puffer B in 60 Minuten (= 60 SV)) erhöht wird.
Man sieht 3 überlappende
Peaks auf dem Chromatogramm. Es wird EPO in den Fraktionen 8 bis
24 eluiert.
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Die
Fraktionen 11, 14, vereinigte Fraktionen 21 und 22 (21 + 22) und
24 werden mittels IEF analysiert. Die Proteine werden auf eine Nitrocellulosemembran überführt und
das EPO wird immundetektiert und die Intensität der Banden wird densitometrisch
gemessen, wie dies in Beispiel 1 beschrieben ist.
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Die
IEF Analyse zeigt, dass das Profil der EPO Glycoisoformen sich von
Fraktion zu Fraktion unterscheidet (7). Die
EPO Glycoisoformen mit höherem
pI (mit weniger Sialinsäuren)
werden schneller von der Säule
eluiert. Daher kann das Verfahren zur Herstellung des gewünschten
Profils an EPO Glycoisoformen verwendet werden.
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Beispiel 2f: Anionenaustauschchromatographie
(3)
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Das
Eluat von der Butyl Sepharose Fast Flow Säule, wie es in Beispiel 2c
beschrieben ist, mit einem erwünschten
Glycoisoformenprofil, wird auf eine SOURCE 15Q Säule (Amersham Pharmacia Biotech)
aufgetragen. Die Anionenaustauschchromatographie wird unter folgenden
Bedingungen ausgeführt:
Säule: | Matrix
SOURCE 15Q, Amersham Pharmacia Biotech, |
| Partikelgröße 15 μm |
| SV
= 1 ml, H = 3 cm, D = 0,64 cm |
Temp | Raumtemperatur |
Flussrate | 1
ml/min, 180 cm/Stunde |
Puffer
A | 10
mM Na-Phosphat pH = 7,0 |
Puffer
B | 10
mM Na-Phosphat pH = 7,0, 1 M NaCl |
Probe | EPO
BRP Standard gelöst
in Puffer A, 0,5 ml, 0,25 mg |
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Die
Säule wird
mit Puffer A äquilibriert.
Nach dem Auftragen der Probe wird die Säule mit 3 SV Puffer A gewaschen
und dann mit 5 SV eines Gemisches aus Puffer A und B (94:6). Das
EPO wird von der Säule eluiert,
wobei der Anteil an Puffer B in Puffer A (linearer Gradient von
6 bis 11,5% an Puffer B in 60 Minuten (= 60 SV) kontinuierlich erhöht wird.
Man sieht 3 überlappende
Profile auf dem Chromatogramm. Es wird EPO in den Fraktionen 8 bis
31 eluiert. Eine IEF Analyse zeigt, dass das Profil der EPO Glycoisoformen
sich von Fraktion zu Fraktion unterscheidet (8). Die
Fraktionen 13, 19 und 26 werden mit IEF analysiert, die Proteine werden
dann auf die Nitrocellulosemembran überführt und EPO wird wie in Beispiel
1 beschrieben immundetektiert.
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Die
EPO Glycoisoformen mit höherem
pI (geringer Gehalt an Sialinsäuren)
werden schneller von der Säule
eluiert. Daher kann das Verfahren zur Isolierung des gewünschten
Profils der EPO Glycoisoformen verwendet werden.
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Beispiel 2g: Gelfiltration
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Das
Eluat von der DEAE Sepharose Fast Flow Säule (Amersham Pharmacia Biotech)
wird, wie dies in Beispiel 2d beschrieben ist, auf eine Superdex
200 Säule
(Amersham Pharmacia Biotech) aufgetragen. Es wird eine Gelfiltration
unter den folgenden Bedingungen ausgeführt:
Probe | 0,09
mg, 0,5 ml |
Säule | Matrix
Superdex 200, Amersham Pharmacia Biotech |
| mittlere
Partikelgröße 13 μm |
| SV
= 24 ml, H = 30 cm, D = 1 cm |
Flussrate | 0,2
ml/min, 15,2 cm/Stunde |
Puffer
A | 10
mM Na-Phosphat, 0,15 M NaCl pH = 7,2 |
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Das
EPO wird von der Säule
in den Fraktionen 59 bis 68 eluiert.
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Die 9 zeigt
die Profile der EPO Glycoisoformen nach der Elution von der Superdex
200 Säule.
Die Fraktionen 61, 63, 65 und 67 werden mit IEF analysiert, die
Proteine werden dann auf Nitrocellulosemembran überführt, das EPO wird immundetektiert
und die Intensität
der Banden wird densitometrisch gemessen, wie dies in Beispiel 1
beschrieben wurde.
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Die
IEF Analyse zeigt, dass EPO Glycoisoformen sich zwischen bestimmten
Fraktionen unterscheiden. Die EPO Glycoisoformen mit einem geringeren
pI (mit einem hohen Gehalt an Sialinsäuren) werden schneller von
der Säule
eluiert. Daher ermöglicht
dieses Verfahren die Isolierung eines erwünschten Profils der EPO Glycoisoform
durch die Auswahl der geeigneten Fraktion nach Elution von der Säule.
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Beispiel 2h: Herstellung eines gewünschten
EPO Glycoisoformengemisches
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Die 10 zeigt
die Profile der EPO Glycoisoformen nach der Gradientenelution von
den Säulen DEAE
Sepharose Fast Flow von Beispiel 2e und Source 15Q von Beispiel
2f. Der EPO BRP Batch 1 wird auf die Säulen aufgetragen. Die vereinigten
Fraktionen 13 bis 31 aus Source Q und die vereinigten Fraktionen
von 14 bis 28 der DEAE Sepharose Fast Flow werden mittels IEF analysiert.
Zum Vergleich werden EPO BRP und EPO alpha (Eprex) ebenfalls analysiert.
Die Proteine werden dann auf die Nitrocellulosemembran überführt, das
EPO wird immundetektiert und die Intensität der Banden wird densitometrisch
gemessen, wie dies in Beispiel 1 beschrieben ist. Es wird eine gute Übereinstimmung
mit dem gewünschten
EPO alpha Isoformenprofil mit beiden Anionenaustauschchromatographiesäulen erhalten.
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Beispiel 3
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Verfahren
zur Erhaltung eines gewünschten
Profils an EPO Glycoisoformen: Profil von EPO alpha Es wird eine
EPO bildende CHO Zellkultursuspension in einem Bioreaktor hergestellt,
zuerst durch einen 10 μm Vorfilter
und dann durch eine Membran eines sterilisierenden 0,2 μm Filters,
um die Zellen abzutrennen. Das Filtrat wird auf die erste Chromatographiesäule mit
einem Matrixgebundenen Farbstoff Cibachron Blue 3G aufgetragen.
Die Chromatographie wird unter folgenden Bedingungen ausgeführt:
Säule | Matrix
Blue Sepharose 6 Fast Flow, Amersham Pharmacia Biotech |
| Partikelgröße: 45–165 μm |
| Säulenvolumen
(SV) = 30 ml, Säulenlänge (H)
= 15 cm |
| Säulendurchmesser
(D) = 1,6 cm |
Temp | Raumtemperatur |
Flussrate | 5
ml/min, 150 cm/Stunde |
Puffer
A | 10
mM Na-Phosphat, pH = 7,0 |
Puffer
B | 10
mM Na-Phosphat, 2,5 M NaCl, pH = 7,0 |
Probe | 400
ml, 36 mg Protein |
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Die
Säule wird
mit 5 SV Puffer A äquilibriert.
Nach dem Auftragen der Probe wird die Säule mit 5 SV Puffer A gewaschen
und dann mit 4 SV eines Gemisches aus Puffer A und Puffer B (92:8).
Das Eluat, worin EPO durch Waschen der Säule mit Puffer B eluiert wird
(6 SV), wird für
weitere chromatographische Schritte verwendet.
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Das
Eluat aus dem ersten Chromatographieschritt wird auf die Säule des
zweiten Chromatographieschritts aufgetragen (hydrophobe Chromatographie).
Die hydrophobe Chromatographie wird unter folgenden Bedingungen
ausgeführt:
Säule | Matrix
Butyl Sepharose Fast Flow, Amersham Pharmacia Biotech |
| mittlere
Partikelgröße 90 μm |
| SV
= 1 ml, H = 2,5 cm, D = 0,7 cm |
Temp | Raumtemperatur |
Flussrate | 1
ml/min, 150 cm/Stunde |
Puffer
A | 10
mM Na-Phosphat, 2,5 M NaCl, pH = 7,0 |
Puffer
B | 10
mM Na-Phosphat, 30% (V/V) Isopropanol, pH = 7,0 |
Probe | 90
ml, 1,5 mg |
-
Die
Säule wird
mit 5 SV Puffer A äquilibriert.
Nach dem Auftragen der Probe wird die Säule mit 5 SV Puffer A und dann
mit 12 SV eines Gemisches der Puffer A und B (1:1) gewaschen. Das
Eluat, worin EPO mit Puffer B (15 SV) eluiert wird, wird für anschließende Chromatographie
Schritte verwendet.
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Das
Eluat vom zweiten chromatographischen Schritt wird konzentriert
und der Puffer B wird durch 10 mM Na-Phosphatpuffer, pH 7,0 unter
Verwendung des Ultrafiltrationssystems Centricon YM-10 (Millipore)
ersetzt. Das Konzentrat wird auf die Säule des dritten Chromatographieschritts
(Anionenaustauschchromatographie) aufgetragen. Die Chromatographie
wird unter den folgenden Bedingungen tauschchromatographie) aufgetragen.
Die Chromatographie wird unter den folgenden Bedingungen ausgeführt:
Säule: | Matrix
Source 15Q, Amersham Pharmacia Biotech |
| Partikelgröße 15 μm |
| SV
= 1 ml, H = 3 cm, D = 0,64 cm |
Temp. | Raumtemperatur |
Flussrate | 1
ml/min, 180 cm/Stunde |
Puffer
A | 10
mM Na-Phosphat, pH = 7,0 |
Puffer
B | 10
mM Na-Phosphat, pH = 7,0, 1 M NaCl |
Probe | 2
ml, 0,4 mg |
-
Die
Säule wird
mit 5 SV an Puffer A äquilibriert.
Nach dem Auftragen der Probe wird die Säule mit 5 SV an Puffer A gewaschen.
EPO wird mit einem linearen Gradienten an Puffer B in Puffer A eluiert
(linearer Gradient von 0 bis 13% an Puffer B in 60 min (= 60 SV).
Das EPO wird in den Fraktionen 20 bis 56 eluiert, während das
gewünschte
Glycoisoformenprofil in den Fraktionen 37 bis 51 gefunden wird.
Das schließliche Profil
der Glycoisoformen des isolierten EPO nach 3 aufeinanderfolgenden
Chromatographieschritten mittels Blue Sepharose 6 Fast Flow, Butyl
Sepharose 4 Fast Flow und Source 15Q ist in der 11 gezeigt.
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Die
vereinigten Fraktionen 37 bis 51 von der Source 15Q werden mit IEF
analysiert, wie dies in Beispiel 1 beschrieben ist. Zum Vergleich
werden 2 andere Proben aufgetragen: EPO alpha (Eprex) und ungereinigter Überstand
aus der Zellkultur des Bioreaktors. Wie es aus 11 ersichtlich
ist, erhält
man eine ausgezeichnete Übereinstimmung
zwischen dem EPO Glycoisoformenprofil und EPO alpha, wie dies gewünscht wird,
nur unter Verwendung der 3 charakterisierten Chromatographieschritte.
Zur selben Zeit beträgt
die Reinheit des erhaltenen EPO Produkts über 99%, wie dies durch HPLC
und Gelelektrophorese bestimmt wird.