DE60014575T2

DE60014575T2 - Stabilisierende Peptide, und Polypeptide und Antikörper die diese beinhalten

Info

Publication number: DE60014575T2
Application number: DE60014575T
Authority: DE
Inventors: Eugenio Benvenuto; Rosella Franconi; Angiola Desiderio; Paraskevi Tavladoraki
Original assignee: Agenzia Nazionale per le Nuove Tecnologie lEnergia e lo Sviluppo Economico Sostenibile ENEA
Current assignee: Agenzia Nazionale per le Nuove Tecnologie lEnergia e lo Sviluppo Economico Sostenibile ENEA
Priority date: 1999-12-30
Filing date: 2000-12-21
Publication date: 2005-10-13
Anticipated expiration: 2020-12-22
Also published as: CA2395041A1; JP2003518941A; IL150067A0; EP1120464B1; WO2001049713A2; US20030157090A1; ATE278778T1; ITRM990803A1; EP1120464A2; ITRM990803A0; DE60014575D1; IT1307309B1; AU2397701A; WO2001049713A3; EP1120464A3

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Moleküle, die in der Lage sind, eine spezifische Wechselwirkung mit Zielmolekülen einzugehen.
Stand der Technik
Moleküle, die zu einer spezifischen Wechselwirkung mit Zielmolekülen in der Lage sind, sind im Stand der Technik bekannt.
Insbesondere sind Antikörper lösliche und stabile Moleküle, von denen bekannt ist, dass sie die Fähigkeit einer Wechselwirkung mit Zielmolekülen aufweisen, die zur gleichen Zeit spezifisch und wirksam ist.
Solche Moleküle werden dementsprechend zur Modulierung der Akkumulierung und/oder Expression von Zielmolekülen in einer Vielzahl von Anwendungen in der Biologie, Medizin und Landwirtschaft verwendet.
Es ist im Allgemeinen in diesen Anwendungen wünschenswert, einen Antikörper mit einer hohen Stabilität zu haben.
Insbesondere gibt es Anwendungen, bei denen es notwendig ist, einen Antikörper zu haben, der besonders stabil ist, bei dem die Wechselwirkung in einer extrem reduzierenden Umgebung durchgeführt werden soll oder kann, wie dem Cytoplasma, zum Beispiel Anwendungen, die durchgeführt werden, um innerhalb einem intrazellulären Kompartiment:

– Wechselwirkungen zwischen Makromolekülen zu blockieren oder stabilisieren (z. B. Protein-Protein- oder Protein-DNA-artige);
– enzymatische Funktionen zu modulieren, die die aktive Stelle betreffen, das Substrat zurückzuhalten oder ein Enzym in seiner aktiven oder inaktiven Struktur blockieren;
– Proteine in ihr normales zelluläres Kompartiment zu entfernen, z. B. Transkriptionsfaktoren im Cytoplasma zurückzuhalten oder Membranrezeptoren in dem endoplasmatischen Reticulum zurückzuhalten;
– mit Pathogen-abgeleiteten Molekülen zu wechselwirken, um den relevanten infektiösen Prozess zu stören;
– cytoplasmatische Moleküle in vivo für diagnostische oder therapeutische Zwecke zu binden (z. B. Oncogenprodukte).

Unter den Antikörpern, von denen auf dem Gebiet bekannt ist, dass sie diese Merkmale aufweisen, ist scFv(F8), ein im scFv („einzelkettiges Ketten-variables Fragment") Format entwickelter Antikörper, einer der repräsentativsten (Tavladoraki et al. 1993).
scFv(F8) zeigt tatsächlich eine signifikante molekulare Stabilität, wie durch Messungen der freien Energie (ΔG) in Denaturierungs- und Renaturierungsexperimenten in vitro nachgewiesen wurde (Tavladoraki et al. 1999).
Dieses Molekül wird auch durch das Folgende charakterisiert:

– hohe Effizienz bei der Faltung (Tavladoraki et al. 1999);
– lange Halbwertszeit innerhalb des Cytoplasma (Tavladoraki et al. 1999);
– Funktionalität in dem Cytoplasma in Bezug auf die Fähigkeit zur Erkennung von Antigenen und Wechselwirkung mit der Replikation des AMCV Virus (Tavladoraki et al. 1993);
– große Expressionsmengen als lösliches Protein in Bakterien- und Pflanzencytoplasma (Tavladoraki et al. 1999);
– die Fähigkeit zur Wechselwirkung mit seinem Antigen in dem Cytoplasma eukaryontischer Zellen in vivo, wie durch Experimente gezeigt wurde, die in dem Hefe „zwei-Hybrid"-System durchgeführt wurden (Visintin et al. 1999).

Untersuchungen des Redoxzustandes des Proteins haben zudem gezeigt, dass keine Disulfidbindung in dem Protein innerhalb des Cytoplasmas ausgebildet wird (Tavladoraki et al. 1999).
ScFv(F8) ist ein sehr interessantes Molekül für biotechnologische Anwendungen, insbesondere für die oben aufgezeigten.
scFv(F8) als solches hat jedoch ein relativ eingeschränktes Anwendungsgebiet, da es nur in der Lage ist, mit AMCV Virus zu wechselwirken.
Im Gegensatz dazu wären „scFv(F9)- ähnliche" Antikörper (vom funktionellen Gesichtspunkt her), die in der Lage sind, mit Zielmolekülen zu wechselwirken, die nicht AMCV sind, von großem Interesse. Sie würden eine Anzahl von Anwendungen mit spezifischen Zielmolekülen in dem Plasma ermöglichen, oder bei gegebener Stabilität in anderen verschiedenen Umgebungen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Aufgabe der Erfindung sind Peptide, die in der Lage sind, Stabilität und Löslichkeit in einem Antikörper zu vermitteln, einschließlich der Antikörper.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird diese Aufgabe durch ein Peptid gelöst, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es eine Sequenz aufweist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den Sequenzen besteht, die in der beigefügten Sequenzauflistung von SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 8 gezeigt werden, und das in einer variable Region eines scFv-Antikörpers mit umfasst ist und den besagten Antikörper in cytoplasmatischem Medium löslich und stabil macht.
Um besagten Antikörper stabil und löslich zu gestalten, sollen die Peptide mit den Sequenzen SEQ ID NO: 1 (H-FR1), SEQ ID NO: 2 (H-FR2), SEQ ID NO: 3 (H-FR3) und SEQ ID NO: 4 (H-FR4), die hierin auch als H-FR-Peptide bezeichnet werden, in der variablen Region der schweren Kette von besagtem Antikörper (VH-Region) mit umfasst sein, kovalent an Peptide mit den Sequenzen gebunden, die in der beigefügten Sequenzauflistung von SEQ ID NO: 88 (H-CDR1), SEQ ID NO: 89 (H-CDR2) und SEQ ID NO: 90 (H-CDR3) gezeigt werden, die hierin auch als H-CDR-Peptide bezeichnet werden, in der Reihenfolge:
SEQ ID NO: 1 (H-FR1) – SEQ ID NO: 88 – (H-CDR1) – SEQ ID NO: 2 (H-FR2) – SEQ ID NO: 89 (H-CDR2) – SEQ ID NO: 3 (H-FR3) – SEQ ID NO: 90 (H-CDR3) – SEQ ID NO: 4 (H-FR4).
Gemäß der Anordnung, die in 4 gezeigt wird.
Die Peptide mit den Sequenzen SEQ ID NO: 5, (L-FR1), SEQ ID NO: 6, (L-FR2), SEQ ID NO: 7, (L-FR3) und SEQ ID NO: 8 (L-FR4), die im Allgemeinen als L-FR-Peptide bezeichnet werden, sollen stattdessen in der variablen Region der leichten Kette von besagtem Antikörper (VL-Region) mit umfasst sein, kovalent gebunden an Peptide mit den Sequenzen, die in der beigefügten Sequenzauflistung von SEQ ID NO: 91 (L-CDR1), SEQ ID NO: 92 (L-CDR2) und SEQ ID NO: 93 (L-CDR3) gezeigt werden, die hierin auch als L-CDR-Peptide bezeichnet werden, in der Reihenfolge:
SEQ ID NO: 5 (L-FR1) – SEQ ID NO: 91 – (L-CDR1) – SEQ ID NO: 6 (L-FR2) – SEQ ID NO: 92 (L-CDR2) – SEQ ID NO: 7 (L-FR3) – SEQ ID NO: 93 (L-CDR3) – SEQ ID NO: 8 (L-FR4).
Die H-FR- und L-FR-Peptide werden hiern im Allgemeinen auch FR(Gerüstregion)-Peptide genannt.
Ein Vorteil der FR-Peptide der Erfindung ist die Tatsache, dass sie überraschenderweise die Fähigkeit gezeigt haben, Löslichkeit und Stabilität auf jeglichen Antikörper zu übertragen, einschließlich derer in den oben genannten Reihenfolgen. Besagte stabilisierende Fähigkeit kann zu mindestens in dem Antikörper des scFv-Typs besagten Antikörper sogar in einem reduzierenden Medium, wie dem Cytoplasma, stabil und löslich machen.
Die durch einen scFv-Antikörper mit dieser Anordnung gemäß dem in Tavladoraki et al.1999 beschriebenen Verfahren vermittelte thermodynamische Stabilität liegt tatsächlich in der gleichen Größenordnung wie bei dem scFv(F8) mit Werten an freier Energie (ΔG) zur Denaturierungs- und Renaturierungsreaktion in vitro in der gleichen Größenordnung wie bei den für scFv(F8) festgestellten (Tavladoraki et al. 1999).
Insbesondere bei pH 7,2 sind die ΔG-Werte größer als oder gleich 7 kcal/Mol und insbesondere Werte im Bereich zwischen 7,8 und 10,5 kcal/Mol.
Eine analoge Stabilität kann für Fv- und Dab-Antikörper, die die FR-Peptide der Erfindung umfassen, erzielt werden.
In jedem Fall werden alle Antikörper, die die oben genannten Peptide umfassen, als eine Wirkung des relevanten Mitumfasstseins in der variablen Region der schweren Kette oder leichten Kette stabilisiert. Insbesondere wird dieses bei Konstrukten gezeigt, die als ein Grundgerüst die konstanten Regionen des Immunglobulin-artigen IgG oder IgA verwenden oder auch bei Antikörpern wie Fab, bei denen die Stabilität dieses Konstrukts in jedem Fall verbessert ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform der H-Fr-Peptide der Erfindung ist Xaa in Position 24 von H-FR1 (SEQ ID NO: 1) Ala; Xaa in Position 12 von H-FR2 (SEQ ID NO: 2) ist Leu; Xaa in Position 2 von H-FR3 (SEQ ID NO: 3) ist Pro; Xaa in Position 3 von H-FR3 (SEQ ID NO: 3) ist Asp; Xaa in Position 13 von H-FR3 (SEQ ID NO: 3) ist Arg; Xaa in Position 18 von H-FR3 (SEQ ID NO: 3) ist Asn; Xaa in Position 20 von H-FR3 (SEQ ID NO: 3) ist Leu; Xaa in Position 12 von H-FR7 (SEQ ID NO: 7) ist Arg; Xaa in Position 15 von H-FR7 (SEQ ID NO: 7) ist Phe.
Gemäß der Erfindung können alle diese Peptide durch die Mittel einer Reihe von konventionellen Techniken, die auf dem Gebiet bekannt sind, hergestellt werden, wie z. B. rekombinante DNA, aber auch Konstruktionen von synthetischen Polypeptiden.
Das relevante Verfahren zur Herstellung von Peptiden, die einen Antikörper stabilisieren, einschließlich derselben in einer variablen Region, umfassend die folgenden Schritte:

– die Herstellung eines Polypeptides aus einem monoklonalen Antikörper,
– die mutagene Veränderung besagten Polypeptids durch Techniken wie der hierarchischen Mutagenese, Fehler-bedingter PCR, DNA-Mischen oder Ribosomen-Display,

Alternativ dazu können besagte Peptide durch chemische Synthese hergestellt werden, wie z. B. durch Translatieren eines Polynukleotids, das diese kodiert.
Die H-CDR- und L-CDR-Peptide der Erfindung werden hierin auch als CDR-(Komplementaritäts-bestimmende Regionen)-Peptide bezeichnet. CDR-Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung korrespondieren mit den Teilen der Regionen VH und VL des Antikörpers, die die Bindungsspezifität des Antikörpers bestimmen. Insbesondere H-CDR-Peptide korrespondieren mit den Teilen von VH, und L-CDR-Peptide korrespondieren mit den Teilen von VL, die die Bindungsspezifität des Antikörpers bestimmen.
Die strukturellen Eigenschaften des CDR-Peptids sind derart, dass wenn es in den Polypeptiden VH und VL mit umfasst ist, kovalent an die FR's der Peptide gemäß der oben genannten Anordnung gebunden sind, dass diese Spezifität an einen Antikörper vermitteln, der sie umfasst, ohne seine Stabilität und Löslichkeit zu verändern.
Dem entsprechend hängen deren Sequenzen von dem Antigen ab, das der Antikörper, in dem sie umfasst sind, spezifisch bindet.
Um Peptide herzustellen, die als VH- oder VL-Region eines Antikörpers geeignet sind, kann ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids verwendet werden, das als eine variable Region eines Antikörpers geeignet ist, sowie spezifisch für ein vorbestimmtes Antigen ist, das die folgenden Schritte umfasst:

– die Herstellung eines Antikörpers, der als eine variable Region der schweren Kette das Polypeptid aufweist, das die Sequenz hat, die in der Sequenzauflistung als SEQ ID NO: 101 genannt wird, und als eine variable Region der leichten Kette, das Polypeptid mit der Sequenz, die in der beigefügten Sequenzauflistung als SEQ ID NO: 102 genannt wird;
– das in Kontakt bringen von besagtem Antikörper mit besagtem Antigen und
– das Auswählen des Antikörpers, der besagtes Antigen bindet,
– das Isolieren des Polypeptids der variablen Region der schweren Kette und/oder des Polypeptids der variablen Region der leichten Kette des Antikörpers, der besagtes Antigen bindet.

Dieses Verfahren, welches ein Gegenstand der Erfindung ist, umfasst in einer bevorzugten Ausführungsform zudem den Schritt:

– der Sequenzierung der variablen Regionen von besagtem Antikörper, der besagtes Antigen bindet.

Das zuvor bestimmte Antigen des Verfahrens der Erfindung kann jegliches Antigen von Interesse sein, insbesondere virale, und speziell die Antigene, die mit HIV, HCV und HPV assoziiert sind, wie Tat-, Rev-, E7- oder NS3-Protein, die als bevorzugt angesehen werden. Andere Antigene wie Rinderserumalbumin, Lysozym, AMCV-Virus, „gefleckter welker Tomatenvirus" oder „Gurkenmosaikvirus" werden in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung verwendet.
Gegenstand der Erfindung sind zusätzlich die Polypeptide, die durch das oben genannte Verfahren herstellbar sind, die zur Herstellung der variablen Region der schweren Kette (VH) oder der leichten Kette (VL) eines gegebenen Antikörpers geeignet sind.
Bezüglich der Polypeptide der Erfindung werden Polypeptide, die zur Herstellung der VH-Region eines Antikörpers geeignet sind, hierin auch als VH-Polypeptide bezeichnet, Polypeptide, die zur Herstellung der VL-Region eines Antikörpers geeignet sind, werden hierin auch als VL-Polypeptide bezeichnet.
Insbesondere sind diesbezüglich die folgenden VH- und VL-Polypeptide Gegenstand der vorliegenden Erfindung:

– VH-F8 (SEQ ID NO: 31) und VL-F8 (SEQ ID NO: 32), die jeweils die VH- und VL-Regionen von spezifischen AMCV-Antikörpern darstellen, und insbesondere von scFv(F8);
– VH-LYS/P5 (SEQ ID NO: 33) und VL-LYS/P5 (SEQ ID NO: 34), die jeweils die VH- und VL-Regionen von Antikörpern konstituieren, die spezifisch für das Lysozym sind;
– VH-LYS/11E (SEQ ID NO: 35) und VL-LYS/11E (SEQ ID NO: 36), die die VH- und VL-Regionen jeweils von spezifischert Antikörpem für das Lysozym konstituieren;
– VH-BSA/9F (SEQ ID NO: 37) und VL-BSA/9F (SEQ ID NO: 38), die jeweils die VHund VL-Regionen von Antikörpern konstituieren, die spezifisch für Rinderserumalbumin sind;
– VH-TSWV (BR01)/6H (SEQ ID NO: 39) und VL-TSWV (BR01)/6H (SEQ ID NO: 40), die jeweils die VH- und VL-Regionen von Antikörpem konstituieren, die spezifisch für den "gefleckten welken Tomatenvirus" sind;
– VH-TSWV (P105)/1C (SEQ ID NO: 41) und VL-TSWV (P105)/1C (SEQ ID NO: 42), die jeweils die VH- und VL-Regionen von Antikörpem konstituieren, die spezifisch für den „gefleckten welken Tomatenvirus" sind;
– VH-CMV/4G (SEQ ID NO: 43) und VL-CMV/4G (SEQ ID NO: 44), die jeweils die VHund VL-Regionen von Antikörpem konstituieren, die spezifisch für den „Gurkenmosaikvirus" sind;
– VH-CMV/4B (SEQ ID NO: 45) und VL-CMV/4B (SEQ ID NO: 46), die jeweils die VHund VL-Regionen von Antikörpem konstituieren, die spezifisch für den „Gurkenmosaikvirus" sind; und
– VH-CMV/2G (SEQ ID NO: 47) und VL-CMV/2G (SEQ ID NO: 48), die jeweils die VHund VL-Regionen von Antikörpem konstituieren, die spezifisch für den „Gurkenmosaikvirus" sind.

Auf der Basis der Polypeptide der Erfindung können spezifische CDR-Peptide hergestellt werden, die Bindungsspezifität den Antikörpern vermitteln, die diese umfassen.
Besagte CDR-Peptide können durch ein Verfahren zur Herstellung eines Peptids hergestellt werden, das einem Antikörper Bindungsspezifität für ein vorbestimmtes Antigen vermittelt, das die folgenden Schritte umfasst:

– die Herstellung eines Antikörpers, der als eine variable Region der schweren Kette das Polypeptid aufweist, das die Sequenz hat, die in der Sequenzauflistung als SEQ ID NO: 101 gezeigt wird, und als eine variable Region der leichten Kette das Polypeptid mit der Sequenz, die in der Sequenzauflistung als SEQ ID NO: 102 genannt wird;
– das in Kontakt bringen von besagtem Antikörper mit besagtem Antigen und
– das Auswählen des Antikörpers, der besagtes Antigen bindet,
– das Isolieren des Polypeptids der variablen Region der schweren Kette und/oder des Polypeptids der variablen Region der leichten Kette des Antikörpers, der besagtes Antigen bindet;
– das Isolieren des Teils von besagtem Antikörper, der die Bindungsspezifität des besagten Antikörpers vermittelt.

In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das oben genannte Verfahren zusätzlich den folgenden Schritt:

– des Sequenzierens der variablen Regionen von besagtem Antikörper, der besagte Antigen bindet.

Das Antigen kann jegliches Antigen sein und ist vorzugsweise eines der oben beschriebenen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch all diejenigen Peptide, die durch das oben beschriebene Verfahren herstellbar sind.
Insbesondere die Peptid-CDRs, die die folgende Bindungsspezifität für:

– ACMV (Artischocken – Flecken – Kräuselvirus) in dem Antikörper scFv (F8) mit jeweils den Sequenzen SEQ ID NO: 9 (H-CDR1-F8), SEQ ID NO: 10 (H-CDR2-F8), SEQ ID NO: 11 (H-CDR3-F8), SEQ ID NO: 12 (L-CDR1-F8), SEQ ID NO: 13 (L-CDR2-F8) und SEQ ID NO: 14 (L-CDR3-F8);
– Lysozym (insbesondere Lysozym aus Hühnereialbumin) mit den Sequenzen SEQ ID N: 97 (H-CDR1-LYS/P5), SEQ ID NO: 98 (H-CDR2-LYS/P5), SEQ ID NO:15 (H-CDR3-LYS/P5), SEQ ID NO: 99 (L-CDR1-LYS/P5), SEQ ID NO: 100 (L-CDR2-LYS/P5) und SEQ ID NO: 16 (L-CDR3-LYS/P5) ergeben,

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch all die Peptid- H-CDR3 und L-CDR3, wie sie oben definiert werden, die Bindungsspezifität an die Antikörper, die diese in den VH- und VL-Polypeptiden umfassen, für Antigene, die sich von ACMV unterscheiden, vermitteln, wobei das ursprüngliche H-CDR3-F8 und L-CDR3-F8 zusammen mit anderen Peptiden H-CDR1, H-CDR2 und L-CDR2 von F8 und mit den Peptiden L-CDR1-MUT (SEQ ID NO: 76) substituiert wird, die anstatt des Peptids L-CDR1-F8 mit umfasst sind, gemäß der Anordnung, die in 7 gezeigt wird.
Unter diesen sind ein besonderer Gegenstand der Erfindung die Peptide H-CDR3 und L-CDR3, die die folgende Spezifität ergeben:

– Lysozym (H-CDR3-LYS/11 E, SEQ ID NO: 17 und L-CDR3-LYS/11 E, SEQ ID NO: 18),
– Rindersen.imalbumin (H-CDR3-BSA/9F, SEQ ID NO: 19 und L-CDR3-BSA/9F, SEQ ID NO: 20),
– „geflecktes welkes Tomatenvirus"- Nukleoprotein (H-CDR3-TSWV (BR01)/6H, SEQ ID NO: 21 und L-CDR3-TSWV (BR01)/6H, SEQ ID NO:22; H-CDR3-TSVW (P105/1C, SEQ ID NO: 23 und L-CDR3-TSWV (P105)/1C, SEQ ID NO: 24), und
– „Gurkenmosaikvirus" (H-CDR3-CMV/4G, SEQ ID NO: 25 und L-CDR3-CMV/4G, SEQ ID NO: 26; jedoch auch H-CDR3-CMV/4B, SEQ ID NO: 27 und L-CDR3-CMV/4B, SEQ ID NO:28; und letztendlich H-CDR3-CMV/2G, SEQ ID NO:29 und L-CDR3-CMV/2G, SEQ ID NO:30).

Der Begriff „H-CDR3" in 7 zeigt die Position der Peptide H-CDR3-LYS/11E, H-CDR3-BSA/9F, H-CDR3-TSWV (BR01)/6H, H-CDR3-TSWV (P105)/1C, H-CDR3-CMV/4G, H-CDR3-CMV/4B in der VH-Region. Der Begriff „L-CDR3" zeigt die Position der Peptide L-CDR3-LYS/11 E, L-CDR3-BSA/9F, L-CDR3-TSVW (BR01)/6H, L-CDR3-TSWV (P105)/1 C, L-CDR3-CMV/4G und L-CDR3-CMV/4B in der VH-Region.
Das L-CDR1-MUT-Peptid (SEQ ID NO: 94) stellt auch einen Gegenstand der vorliegenden Erfindung dar.
All die oben genannten CDR-Peptide können zum Nachweis von Molekülen von Interesse in einer Probe gemäß den auf dem Gebiet bekannten Techniken verwendet werden; besagte Verwendung wird als von dem Gegenstand der Erfindung mit umfasst angesehen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung wird auch durch all diejenigen Antikörper gegeben, die mindestens eines der oben erwähnten VH- und VL-Polypeptide der vorliegenden Erfindung umfassen.
Diesbezüglich sind nicht nur hergestellte Antikörper des scFv-Typs, sondern auch hergestellte Antikörper des Fab-, Fv, dAb-Typs sowie alle Immunglobuline, insbesondere diejenigen des IgG- und IgA-Typs, Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Insbesondere sind Gegenstand der vorliegenden Erfindung der hergestellte Antikörper scFv (F8) (SEQ ID NO: 49) und die scFv-Antikörper: scFv (P5) (SEQ ID NO: 50), scFv (LYS11E), scFv (BSA9F), scFv (BR01-6H), scFv (P105-1C), scFv (CMV-4G, scFv (CMV4B) und scFv (CMV-2G).
Solche scFv-Antikörper sind durch das Verbinden der jeweiligen VH- und VL-Polypeptide mit einem Linker herstellbar, der kovalent an das carboxyterminale Ende des VH-Polypeptids durch sein aminoterminales Ende und an das aminoterminale Ende des VL-Polypeptids durch sein carboxyterminales Ende gebunden ist (siehe das Diagramm in 2).
Dieser Linker kann einer von denjenigen Linkern sein, von denen auf dem Gebiet bekannt ist, dass sie für die Verbindung von VH- und VL-Polypeptiden geeignet sind. Insbesondere kann der Linker derjenige mit der Sequenz sein, die als SEQ ID NO: 51 in der Auflistung der Sequenzen in der Anlage gezeigt wird.
Alle Varianten der oben erwähnten Peptide und Polypeptide oder der Antikörper, die diese enthalten, müssen auch

– ein Mutein der oben genannten FR- und CDR-Peptide, VH- und VL-Polypeptide und Antikörper, die diese umfassen,
– ein Molekül, das mindestens eines der oben genannten FR- und CDR-Peptide, VHund VL-Polypeptide und Antikörper, die diese umfassen, oder zu mindestens eines der relevanten Muteine, umfasst
– ein Fragment oder ein Teil der oben genannten FR- und CDR-Peptide, VH- und VL-Polypeptide und Antikörper, die diese umfassen, oder mindestens eines der relevanten Muteine,
– ein Fragment oder ein Teil der Moleküle, das mindestens eines der oben genannten FR- und CDR-Peptide, VH- und VL-Polypeptide und Antikörper, die diese umfassen, oder mindestens eines der relevanten Muteine umfasst,

Jedes Molekül, das direkt oder indirekt aus einem der Peptide, Polypeptide oder Antikörper der vorliegenden Erfindung abgeleitet ist und insbesondere diejenigen mit den Sequenzen, die in der beigefügten Sequenzauflistung genannt werden, muss als im Wesentlichen aus einem der besagten Peptide, Polypeptide und Antikörper bestehend angesehen werden, wenn:

– Varianten der oben genannten Peptide/Polypeptide in Antikörpern enthalten sind, die zu mindestens in dem Cytoplasma einer Zelle funktionell und stabil sind;
– Varianten der oben genannten Antikörper selbst ein Antikörper sind, der zu mindestens in einem cytoplasmatischen Kompartiment funktionell und stabil ist.

Für die Zwecke der vorliegenden Anmeldung ist ein Mutein der oben genannten Peptide / Polypeptide / Antikörper ein zu dem ursprünglichen Peptid / Polypeptid / Antikörper ähnliches, so dass es als eine Ableitung des zweiten von dem ersten angesehen werden kann.
Ein Fragment von mindestens einem der oben genannten Peptide / Polypeptide / Antikörper oder einem seiner Muteine oder eines größeren Moleküls, das dieses umfasst, wird für die Zwecke der Erfindung durch ein Molekül wiedergegeben, bei dem eine oder mehrere Aminosäuren des ursprünglichen Peptids oder Muteins trunkiert wurden.
In Bezug auf das größere Molekül, das mindestens eines dieser Peptide / Polypeptide / Antikörper und/oder Muteine umfasst, kann der Anteil des Moleküls, der sich von diesen Peptiden und/oder Muteinen unterscheidet, teilweise oder vollständig mit der Sequenz von scFv (F8) übereinstimmen.
Alle diese Moleküle können durch Mittel einer Reihe konventioneller Techniken, die auf dem Gebiet bekannt sind, hergestellt werden, wie z. B. durch rekombinante DNA, aber auch durch Konstruktionen von synthetischen Polypeptiden.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung wird durch Polynukleotide wiedergegeben (sowohl Polydeoxyribonukleotide wie auch Polyribonukleotide), die für die Peptide / Polypeptide der vorliegenden Erfindung oder deren Varianten kodieren. Insbesondere sind die Polynukleotide mit den folgenden genannten Sequenzen:
SEQ ID NO: 52 (H-FR3-F8), SEQ ID NO: 54 (H-FR2-F8), SEQ ID NO: 56 (H-FR3-F8), SEQ ID NO: 58 (H-FR4-F8), SEQ ID NO: 60 (L-FR1-F8), SEQ ID NO: 62 (L-FR2-F8), SEQ ID NO: 64 (L-FR3-F8), SEQ ID NO: 66 (L-FR4-F8), SEQ ID NO: 68 (H-CDR1-F8), SEQ ID NO: 70 (H-CDR2-F8), SEQ ID NO: 72 (H-CDR3-F8), SEQ ID NO: 74 (L-CDR1-F8), SEQ ID NO: 76 (L-CDR2-8) und SEQ ID NO: 78 (L-CDR3-F8), SEQ ID NO: 80 (VH-F8) und SEQ ID NO: 82 (VL-F8), SEQ ID NO: 95 (L-CDR1-MUT) in dem Gegenstand der vorliegenden Erfindung mit umfasst.
Von der vorliegenden Erfindung mit umfasst sind auch Polynukleotide, die für die hergestellten Antikörper kodieren, die unter Verwendung der Peptide / Polypeptide der vorliegenden Erfindung erhalten werden, und insbesondere diejenigen mit den Sequenzen SEQ ID NO: 84 (scFv (F8) und SEQ ID NO:8 6 (scFv (P5)).
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung wird durch Peptide / Polypeptide, hergestellte Antikörper, insbesondere für die Therapie von allen pathologischen Zuständen wiedergegeben, die mit der Akkumulierung von mindestens einem Molekül in einer intra- oder extrazellulären Umgebung assoziiert sind. Hier wird insbesondere auf infektiöse, Tumor-, metabolische und immunbedingte (insbesondere autoimmunbedingte) Pathologien hingewiesen. In Bezug auf die infektiösen Pathologien wird insbesondere auf solche aufmerksam gemacht, die mit Viren assoziiert sind, entweder in Tieren (siehe z. B. Pathologien, die mit HIV, insbesondere HIV-1, HPV, Herpesvirus oder HCV-Virus im Menschen assoziiert sind) oder in Pflanzen (siehe z. B. die Pathologien, die mit CMV oder TSWV-Viren in Tomaten assoziiert sind).
Zudem auch die pharmazeutischen Zusammensetzungen, die eine therapeutisch wirksame Menge von mindestens einem der oben genannten Peptide, Polypeptide, Antikörper und/oder Varianten davon und/oder eine therapeutisch wirksame Menge von mindestens einem der oben genannten Polynukleotide und ein pharmazeutisch geeignetes Trägermittel umfassen.
Das pharmazeutisch verträgliche Trägermittel oder Hilfsmittel kann jegliches Trägermittel oder Hilfsmittel sein, von dem auf dem Gebiet bekannt ist, dass es zur Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen geeignet ist, oder ein Material, das die oben genannten Moleküle enthält. Insbesondere kann gemäß der Erfindung solch ein Trägermittel ein flüssiges oder festes Trägermittel sein, die verwendet werden, oder von dem ein Fachmann auf dem Gebiet weiß, dass es für Protein und Antikörper geeignet ist.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren für die Behandlung von Pathologien, die mit der Akkumulierung eines Moleküls innerhalb oder außerhalb einer menschlichen, tierischen Zelle assoziiert sind, das den folgenden Schritt umfasst:

– die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines oben genannten Antikörpers oder einer Variante davon an ein Subjekt, das dessen bedarf.

Insbesondere kann besagte Verabreichung parenteral zur Behandlung von Krebs und Pathologien, die damit assoziiert sind, oder durch den oralen Weg als passive Immuntherapie gemäß den dem Fachmann auf dem Gebiet bekannten Verabreichungstechniken verabreicht werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur Behandlung von Pathologien, die mit der Akkumulierung eines Moleküls innerhalb oder außerhalb einer menschlichen, tierischen oder pflanzlichen Zelle assoziiert sind, das den folgenden Schritt umfasst:

– die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge der oben genannten Polynukleotide oder einer Variante davon, die für die Antikörper der vorliegenden Erfindung kodieren, an ein Subjekt, das deren bedarf.

Besagte Verabreichung soll durch das Einfügen besagter Polynukleotide in Vektoren durchgeführt werden, die zur Transfektion geeignet sind. Gemäß der vorliegenden Erfindung können jegliche Vektoren verwendet werden, insbesondere die viralen, die derzeit von einem Fachmann auf dem Gebiet zur Behandlung eines Subjekts, das dessen bedarf, für diesen Zweck adaptiert werden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der oben genannten Antikörper und/oder Polynukleotide oder Varianten davon zur Behandlung von Pathologien, die mit der Akkumulierung eines Moleküls innerhalb oder außerhalb der menschlichen, tierischen oder pflanzlichen Zelle assoziiert sind.
Die Verwendung von diesen oben genannten Peptiden /Polypeptiden / Antikörpern oder einer Variante davon zur Diagnose dieser Pathologien ist auch von dem Gegenstand der vorliegenden Erfindung mit umfasst.
Insbesondere können solche Moleküle, die an Gene fusioniert sind, die für ein Protein, das eine enzymatische Aktivität (d. h. alkalische Phosphatase) aufweist, oder Reporterproteine, wie grünes fluoreszierendes Protein, kodieren, in diagnostischen Anwendungen verwendet werden. Andere Reportergene oder Proteine, die auf dem Gebiet bekannt sind, können genauso gut in der diagnostischen Anwendung verwendet werden.
Unter den diagnostischen Anwendungen, bei denen die Antikörper der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, ist das Bild-gebende Verfahren besonders bevorzugt.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein diagnostischer Kit, der die oben genannten Moleküle als Reagenzien umfasst, und insbesondere ein diagnostischer Kit für infektiöse Pathologien, der dahingehend charakterisiert ist, dass er mindestens eine Zusammensetzung umfasst, die mindestens eines der oben genannten Polynukleotide, Peptide, Polypeptide, Antikörper und/oder eine Variante davon umfasst.
Mit umfasst in dem Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Verwendung der oben genannten Antikörper zur Identifizierung neuer Moleküle und/oder deren relevanter Funktion.
Eine solche Identifizierung kann z. B. gemäß Techniken durchgeführt werden, die auf dem Gebiet bekannt sind, die als Genomstudien und Proteomstudien bezeichnet werden.
Insbesondere ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung die Verwendung der oben genannten Peptide / Polypeptide / Antikörper oder einer Variante davon zur Herstellung von Molekülen, die in der Therapie von infektiöser Pathologie verwendet werden sollen und der relevante Kit unmfasst mindestens eines dieser Peptide / Polypeptide / Antikörper oder eine Variante davon als ein Reagenz.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch eine Zusammensetzung, die für experimentelle Anwendungen geeignet ist, die mindestens eines der oben genannten Moleküle und einen damit chemisch kompatiblen Träger umfasst.
Dieser chemisch kompatible Träger kann jeglicher Träger sein, der auf dem Gebiet dahingehend bekannt ist, dass er für pharmazeutische Zusammensetzungen geeignet ist, oder ein Material, das die oben genannten Moleküle enthält.
Insbesondere kann gemäß der Erfindung ein solcher Träger ein flüssiger oder fester Träger sein, der verwendet wird, von dem ein Fachmann auf dem Gebiet jedoch weiß, dass er für Protein und Antikörper geeignet ist.
Die Erfindung wird besser mit Hilfe der Figuren im Anhang beschrieben werden.
Beschreibung der Figuren
1 zeigt die Anordnung der Peptide der vorliegenden Erfindung in den VH- und VL-Polypeptiden eines Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung.
2 zeigt die Verbindung der VH- und VL-Polypeptide der vorliegenden Erfindung in Antikörpern des scFv-Typs.
3 zeigt das zusammenfassende Diagramm der Modifikationen der Sequenz von scFv(F8), die die tatsächlichen Eigenschaften der Stabilität des Antikörpers nicht verändern. Die Regionen (FR und CDR) sind gemäß AbM (Oxford Molecular Ltd) individualisiert und die Nummerierung entspricht Kabat (Kabat et al. 1991).
Die in grau gefärbten Quadraten gezeigten Reste sind die Reste, die unverändert verbleiben müssen, die Reste, die in schwarz gefärbten Quadraten gezeigt werden, sind die Reste, die mit jeglicher Aminosäure substituiert werden können, die Reste, die in weißen Quadraten gezeigt werden, sind wie folgt modifizierbar:

– der Rest VH 24 ist mit Resten von äquivalenter chemischer Natur substituierbar;
– der Rest VH 47 ist mit Resten von äquivalenter chemischer Natur substituierbar;
– der Rest VH 52 ist mit Resten von äquivalenter chemischer Natur oder unterschiedlicher chemischer Natur substituierbar oder kann durch Deletion eliminiert werden;
– der Rest VH 60 ist mit Resten von äquivalenter chemischer Natur oder unterschiedlicher chemischer Natur substituierbar;
– der Rest VH 61 ist mit Resten äquivalenter chemischer Natur oder unterschiedlicher chemischer Natur substituierbar;
– der Rest VH 71 ist mit Resten äquivalenter chemischer Natur substituierbar;
– der Rest VH 76 ist mit Resten äquivalenter chemischer Natur substituierbar;
– der Rest VH 78 ist mit Resten äquivalenter chemischer Natur substituierbar;
– die Reste VH 100 – 1000 sind mit Resten äquivalenter chemischer Natur oder unterschiedlicher Natur substituierbar oder können durch Deletion eliminiert werden;
– die Reste VL 27C – 29 sind mit Resten äquivalenter chemischer Natur oder unterschiedlicher chemischer Natur substituierbar oder können durch Deletion eliminiert werden;
– der Rest VL 68 ist mit Resten äquivalenter chemischer Natur oder unterschiedlicher chemischer Natur substituierbar;
– der Rest VL 71 ist mit Resten äquivalenter chemischer Natur oder unterschiedlicher chemischer Natur substituierbar.

4 zeigt ein zusammenfassendes Diagramm der Strategie der Mutagenese, die mittels rationaler Substitutionen der VH- und VL-Polypeptide des Antikörpers scFv(F8) verwendet wurde. Die tatsächlichen Aminosäurereste der Sequenz von scFv(F8) werden in normalen Buchstaben gezeigt, die Aminosäuren der Sequenz von scFv (D1.3) (Bhat et al. 1990) werden in unterstrichenen Buchstaben gezeigt. Die Sequenzen werden für alle Produkte der intermediären Mutagenese (P1, P2, P3 und P4) gezeigt und für das letzte Produkt der Mutagenese (P5), so dass die Änderungen (Substitutionen und Deletionen), die mit der ursprünglichen Sequenz von scFv(F8) durchgeführt worden sind, durch Unterstreichung markiert sind.
5 zeigt die Modifikation, die auf dem CDR1 des VL gemäß dem Ansatz zufälliger Mutationen für die Herstellung von Mutanten von scFv(F8) bewirkt wurde.
6 zeigt die Oligonukleotide, die als Primer für die Herstellung der „Monoscaffold"-Bibliothek, wie sie in den Beispielen beschrieben wird, verwendet wurde.
Der Begriff „N" bedeutet jegliches Nukleotid, der Begriff „M" zeigt das dATP- oder dCTP-Nukleotid an.
7 zeigt die Struktur der Peptide der vorliegenden Erfindung in den VH- und VL-Polypeptiden der Antikörper, in denen die Bindungsspezifität insbesondere durch die H-CDR3- und L-CDR3-Peptide vorgegeben wird.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Wie oben erwähnt, sind die Peptide der vorliegenden Erfindung in der Lage, die Antikörper, die diese umfassen, sogar in einer reduzierenden Umgebung stabil zu gestalten.
Regionen, die die Komplementarität (CDR) mit dem Antigen bestimmen sowie Gerüstregionen (FR) des scFv(F8)-Antikörpers wurden durch Sequenzieren gemäß den auf dem Gebiet bekannten Kriterien identifiziert.
ScFv(F8) wurde als ein Gerüst verwendet, auf das neue Spezifitäten entweder durch „loop grafting" („rationaler Ansatz") oder durch Mutation und Selektion durch Repertoiregenerierung („molekulare Evolution") hergestellt wurden. Antikörper, die durch positionsgerichtete Mutagenese hergestellt wurden, wurden analysiert, um die Beibehaltung der Stabilität und Löslichkeit in cytoplasmatischer Umgebung zu verifizieren sowie die Annahme einer Bindungsspezifität, die sich von AMCV unterscheidet.
In dem „rationalen Ansatz" wurden Reste von sowohl CDR- wie auch FR-Regionen mit Resten von scFv (D1.3) substituiert, die Lysozym erkennen, wohingegen bei der „molekularen Evolution" Reste der CDR3-Regionen zufällig substituiert wurden und die Bindungseigenschaften des resultierenden scFv überprüft wurden. Diese Experimente zeigten, dass das scFv(F8) Gerüst die Substitution definierter Reste in sowohl den CDR- wie auch FR-Regionen toleriert, die neu in Bezug auf die Beibehaltung der Stabilität des Antikörper scFv(F8) (siehe insbesondere 3) definiert werden können.
„Rationaler Substitutions"- Ansatz
Die Erfinder substituierten scFv(F8)-Aminosäuren mit Aminosäuren der CDRs und FRs von scFv(D1.3), die Lysozym erkennen. Diese Substitutionen wurden in einer rationalen Weise durchgeführt, wobei jeder Rest auf der Basis einer theoretischen Konstruktion, die mittels molekularer Modellierung entwickelt wurde, modifiziert wurde.
Gemäß diesem Ansatz wurden ausgiebige Aminosäurenmodifikationen durchgeführt, einschließlich aller CDRs von VH und VL. Diese Regionen wurden (mittels der auf dem Gebiet als „Pfropfen" bekannten Technik) mit den korrespondierenden Regionen eines anderen Antikörpers von „normalem Typ" substituiert (der nicht die jeweilige Stabilität oder cytoplasmatische Funktionalität aufzeigt), der ein anderes Zielmolekül bindet, das Lysozym, Rinderserumalbumin, das Nukleoprotein des „gefleckten welken Tomatenvirus", „Gurkenmosaikvirus" oder jegliches andere Zielmolekül von Interesse sein kann.
Das in 4 gezeigte Diagramm fasst die Strategie der Mutagenese zusammen, die für ein scFv(F8) Antikörperpfropfen verwendet wurde.
Die Analyse der mutagenisierten Produkte in dem spezifischen Fall, der in der Figur gezeigt wird, der sich auf die direkte Mutagenese eines Antikörpers bezieht, der Lysozym bindet, zeigte den Erfolg der Pfropfenstrategie. Tatsächlich waren die resultierenden chimären Antikörper (P2, P3, P4 und P5 genannt) in der Lage, spezifisch Lysozym zu erkennen, wie durch die molekulare Entwicklung vorausgesagt worden war. Zur gleichen Zeit wurde die Kapazität des scFv(F8)-Gerüst zur Unterstützung ausgiebiger Mutationen nachgewiesen, insbesondere auf der Ebene der CDRs ohne die Beeinträchtigung molekularer Stabilität. Tatsächlich zeigten sich die neuen bindenden Moleküle, die durch diesen Ansatz erhalten wurden, als löslich und funktionell in der reduzierenden Umgebung des Zellzytoplasmas genau so wie der erkennende scFv(F8).
Als ein Ergebnis war außer einigen FR-Resten, die modifiziert wurden, um die korrekte Faltung der Regionen zu erlauben, die in der neuen Antigenerkennung involviert sind, die Gerüststruktur von scFv(F8) nicht wesentlich verändert, Es wurde die Struktur identifiziert, die in der Lage ist, als „zentraler Nukleus" zu funktionieren, auf der es möglich ist, mittels Proteinentwicklung Sequenzen zu pfropfen, die in der Lage sind, eine Bindungsfähigkeit für neue Antigene zu vermitteln. Dieser zentrale Nukleus besteht aus den FR-Peptiden, die in der Zusammenfassung der Erfindung beschrieben wurden.
Die Eigenschaft dieser mutierten Moleküle wurde durch die Erfinder mittels Techniken der Analyse der Expression in sowohl Periplasma wie auch Cytoplasma von Escherichia coli verifiziert, was in den Beispielen besser erklärt und ausgeführt wird. Insbesondere hat die Analyse der Expression in dem bakteriellen Cytoplasma es möglich gemacht, die Fähigkeit der gepfropften Antikörper zu beurteilen, das neue Antigen zu erkennen. Die Expression in dem bakteriellen Cytoplasma hat es stattdessen ermöglicht, die Proteinlöslichkeit und Funktionalität in reduzierender Umgebung zu analysieren.
In dem Fall von Antikörpem, die auf Lysozymspezifität mutagenisiert wurden, zeigte der ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)- Test, der mit periplasmatischen Extrakten durchgeführt wurde, die auf Gesamtproteingehalt normalisiert wurden, dass alle Produkte der Mutagenese mit Ausnahme von P1 (Mutante mit der geringsten Anzahl von Substitutionen) in der Lage waren, Lysozym zu erkennen. Die P3-Mutante, die die CDRs von scFv (D1.3) und einige Substitutionen in den Gerüsten aufweist, zeigte die höchste Bindungsaktivität. Die für P3 beobachtete Lysozymerkennung war etwas geringer als die durch scFv (D1.3) gezeigte (ungefähr 15 % weniger). Diese Daten wurden mit der Westem Blot-Analyse verbunden, die vergleichbare Expressionsmengen der verschiedenen Produkte der Mutagenese und zwischen Mutageneseprodukten und dem ursprünglichen scFv(F8) und scFv (D1.3) zeigte. Dieses zeigt, dass die Unterschiede des Signals, das in dem ELSA beobachtet wurde, ausschließlich auf die unterschiedliche Spezifität für das Antigen zurückzuführen sind, anstatt auf unterschiedliche Expressionsmengen.
Bezüglich der Expression in bakteriellem Cytoplasma ergab ein ELISA, der mit Extrakten durchgeführt wurde, die auf Gesamtproteinen normalisiert wurden, eine höhere Aktivität für die P5-Mutante, die durch die höchste Anzahl an Aminosäuresubstitutionen gekennzeichnet ist. Eine schwache Bindungsaktivität, in jedem Fall eine höhere als die für scFv(D1.3) gemessene, wurde auch für P3 und P4 festgestellt.
Sogar in diesem Fall zeigten Westem Blot-Analysen eine gleichwertige Expression der scFv-Mutanten, die in dem Cytoplasma exprimiert wurden, was wiederum bestätigt, dass die Unterschiede des ELISA-Signals auf die unterschiedliche Fähigkeit zur Erkennung des Lysozyms zurückzuführen sind.
„Molekularer Evolutions"-Ansatz
Auf der Basis der in dem rationalen Substitutionsansatz erhaltenen Indikationen wurde eine Bibliothek neuer Moleküle, die aus scFv(F8) abgeleitet wurden, hergestellt.
Der Ausgangspunkt für die Herstellung der Bibliothek war scFv(MUT-VL1), ein Derivat des scFv(F8)-Antikörpers, das in den CDRs modifiziert worden war. Die CDR1 der VL-Domäne wurde gekürzt und teilweise gemäß einem Modell-unterstützten Konstruktionsdesign verändert. Zudem wurden 9 Aminosäuren aus dem ungewöhnlich langen CDR3 der VH-Domäne des ursprünglichen scFv (s. 5) entfernt.
Es wurde eine strukturelle Variabilität durch gezielte zufällige PCR-Mutagenese in 4 Aminosäurepositionen in der CDR3 von sowohl den VH- wie auch den VL-Domänen eingeführt. Es wurden degenerierte Oligonukleotide, die Reste zwischen und einschließlich 95 und 98 von VH und 91 und 94 von VL zufällig variieren, verwendet. Nach der Mutagenese wurde ein Repertoire mit einer geschätzten Diversität von 5 × 10⁷ unterschiedlichen Phagenklonen erhalten.
Der Pool an Molekülen, der so erhalten wurde, wurde auf einen Phagen in einer Bibliothek zur Selektion auf Antigene hin übertragen, die sich von AMCV unterscheiden, das ursprünglich von scFv(F8) erkannt wurde. Diese „Bibliothek", die unter Verwendung eines einzelnen Ausgangsantikörpers („Monoscaffold Bibliothek") als Basisstruktur konstruiert wurde, stellte Antikörper mit unterschiedlicher Spezifität zur Verfügung, die zur gleichen Zeit die besonderen Eigenschaften der Stabilität des scFv(F8)-Moleküls beibehalten (cytoplasmatische Löslichkeit, Denaturierung und Renaturierung in vitro). Diese Schlussfolgerungen wurden durch Guanidiniumchlorid-Denaturierungs /Renaturierungs-Studien mit isolierten scFv-Molekülen erhalten. Die Expression der gleichen ScFv-Fragmente in dem Escherichia coli Cytoplasma als lösliche und funktionelle Moleküle bestätigte die Stabilität dieser Proteine auch in einem in vivo-System.
Zudem wurde für einige von diesen (scFv(CMV)4B und scFv(CMV)4G) gezeigt, dass sie als lösliche und funktionelle Moleküle auch in Pflanzencytosol exprimiert werden. Das Vorhandensein von scFv(CMV)4B- oder scFv(CMV)4G-Antikörpem in der löslichen Fraktion von Kartoffelvirus X (PVX)- infizierten Tabakpflanzen zeigt, dass diese Moleküle, anders als die meisten Antikörper, in Pflanzencytoplasma gefaltet und stabil sind. Identische Ergebnisse wurden in transgenen Tomatenpflanzen erhalten, die die Fähigkeit einer korrekten Faltung in einer reduzierenden Umgebung bestätigen. Diese Antikörper stören den CMV-Zusammenbau und/oder die Replikation und stellen eine konstruierte Resistenz gegen den Virus zur Verfügung („Pflanzenkörper-vermittelte Resistenz").
Aus der Bibliothek isolierte und charakterisierte CDR3-Sequenzen der VH- und VL-Domänen der Antikörper (siehe Tabelle I infra) zeigten, dass die Substitution der Reste in den oben genannten Positionen vollständig zufällig ist. Zudem zeigte die Aminosäurezusammensetzung und Verteilung in den mutierten CDR3, dass Ladung und Hinderung von Aminosäuren die Faltung und Löslichkeit dieser scFv-Fragmente nicht wesentlich betrifft.
Die aus der Herstellung und aus der Analyse der „Monoscaffold"-Bibliothek erhaltenen Daten zeigten die Möglichkeit der Verwendung des Gerüstes von scFv(F8) zur Herstellung einer Sammlung von polyvalenten Antikörpern mit der gleichen intrinsischen Stabilität wie der ursprüngliche Antikörper scFv(F8). Diese Bibliothek ist für alle Anwendungen vorgesehen, bei denen die Expression von Antikörpern in dem Cytoplasma notwendig ist, oder bei denen besondere Eigenschaften der molekularen Stabilität essentiell sind.
Als ein Ergebnis dieser Experimente wurden die stabilen Antikörpermoleküle mit einer neuen Bindungsspezifität und insbesondere diejenigen, die in der Zusammenfassung der Erfindung beschrieben werden, erhalten.
Schlussfolgerung
Die Ergebnisse all dieser experimentellen Ansätze werden in dem in der folgenden Tabelle I gezeigten Diagramm zusammengefasst.
In dieser Tabelle werden die Ergebnisse und die Information, die als Ergebnis der Herstellung von Mutanten durch den Ansatz zufälliger Substitutionen erhalten wurden, berichtet. Die nicht polaren Reste werden mit doppelt unterstrichenen Buchstaben gezeigt. Die Reste mit polarer R-Gruppe ohne Ladung werden in normalen Buchstaben gezeigt; die sauren Reste (negative Ladung) werden mit gestrichelter Unterstreichung gezeigt und die basischen Reste (positive Ladung) werden mit einfachem Unterstreichen gezeigt.
Tabelle I
Auf der Basis der oben gezeigten Ergebnisse wurden die Peptide, Polypeptide, Antikörper, die in der Zusammenfassung der Erfindung genannt werden, nach dem auch hierin genannten Verfahren erhalten
Die dadurch erhaltenen besonderen Antikörper haben eine verbesserte Stabilität aufgezeigt und die Antikörper des Typ FAB, Fv, dAb, IgG oder IgA haben insbesondere bedingt durch die Gegenwart der Peptide der Erfindung in den VH- und VL-Regionen eine verbesserte Stabilität aufgezeigt.
Bis zu diesem Punkt wurde eine allgemeine Beschreibung der vorliegenden Erfindung gegeben. Mit Hilfe der folgenden Beispiele wird nun eine detaillierte Beschreibung zur Verfügung gestellt, um Umfang, Eigenschaften, Vorteile und Durchführungsverfahren zu erklären.
Beispiele
Beispiel 1: Bestimmung der Sequenz von scFv(F8)
Der einzelkettige Antikörper scFv(F8) leitet sich aus einem mAb (Sezernierung durch eine Hybridomzelle) der Klasse IgG2b ab, der gegen das Hüllprotein des Pflanzenvirus AMCV gerichtet ist (Artischocken Flecken Kräuselvirus). Um diesen Antikörper zu erhalten, wurden Balb/c-Mäuse mit dem aufgereinigten Virus immunisiert. Die Techniken zur Isolierung der Lymphozyten und Herstellung der Hybridomzelle waren Standardtechniken, die in der Literatur bekannt sind (Harlow und Lane 1988). Die Hybridomzellline, die diesen Antikörper exprimiert, wurde durch ELISA auf der Basis ihrer hohen Affinität für das Antigen ausgewählt. Zur Isolierung der Gene der schweren (H) und leichten (L)-Kette dieses Antikörpers wurde die vollständige cDNA gemäß einem veröffentlichten Protokoll ausgewählt (Tavladoraki et al. 1993). Die variablen Regionen (VH und VL) wurden mittels PCR (Polymerasekettenreaktion) unter Verwendung universeller Primer für die variablen Regionen amplifiziert und anschließend in unterschiedliche Arten von Vektoren kloniert (Tavladoraki et al. 1993). Diese Sequenz wurde gemäß dem Sanger-Verfahren (Sambrook et al. 1989) nach dem Protokoll des Sequanase Kits (USB) bestimmt.
Beispiel 2: Bestimmung der positionsspezifischen Mutaaenese in dem rationalen Ansatz
Die Mutagenese wurde mit dem Plasmid pMUT-VL1, das das Gen enthält, das für einen Antikörper kodiert, der aus scFv(F8) abgeleitet wurde, durchgeführt, bei dem nur das CDR1 der VL teilweise in der Aminosäurezusammensetzung verändert wurde und um vier Aminosäuren verringert wurde.
Es wurde das Stratagene („Quick Change Site-directed Mutagenesis Kit")-System zur Mutagenese nach den vom Hersteller zur Verfügung gestellten Instruktionen verwendet. Dieses System basiert auf der enzymatischen Verlängerung von zwei komplementären Primern, die mutierte Sequenzen enthalten, unter Verwendung von pMUT-VL1 als Template. Das Plasmid wurde denaturiert, was die Bindung der zwei Oligonukleotide an die gegenüberliegende DNA-Stränge ermöglicht, um die Verlängerungsreaktion der pFU-DNA-Polymerase vorzubereiten. Das Ergebnis ist ein Plasmid mit einer Doppelhelix, die die Oligonukleotide eingebaut wurde, was die gewünschte Mutation bewirkt.
Die bakterielle Stammlösung von E. Coli XL1-Blue, die für die Aufreinigung des plasmidischen Vektors verwendet wurde, hat Methyl-Transferaseaktivität, daher resultiert das aus Bakterien extrahierte DNA-Plasmid methyliert. Im Gegensatz dazu enthalten mutierte Plasmide, die durch Verlängerung der Pfu-DNA-Polymerase erhalten werden, keine Methylierungen. Dieses ermöglichte die Auswahl von mutierten Plasmiden durch Verdau der Reaktionsprodukte mit dem Endonukleaseenzym Dpnl, das häufige spezifische Sequenzen methylierter DNA in dem Elternplasmid erkennt. Die Produkte der Reaktion wurden in E. Coli XL1-Blue transfiziert, bei dem die „Nick"-Stellen, die während der Synthese des mutierten Plasmids in vitro hergestellt werden, durch zelluläre Reparatursysteme phosphoryliert werden.
Die Mutagenesereaktion wurde in 25 μl durchgeführt, enthaltend: 2,5 μl Reaktionspuffer 10 x, 2,5 mM dNTP, 10 ng DNA-Template, 62,5 ng von jedem Primer, 1,25 U Pfu DNA-Polymerase (Stratagene).
Die verwendeten Bedingungen waren die folgenden: Denaturierung bei 95 °C für 30 "; 18 Zyklen: Denaturierung bei 95 °C für 30 ", Bindung bei 55 °C für 1 ' und enzymatische Verlängerung bei 68 °C für 7 '; 5 ' bei 68 °C zur Vervollständigung der Verlängerung. Die Reaktion wurde unter Verwendung einer Perkin Elmer / Cetus-Vorrichtung durchgeführt.
Die Produkte der Reaktion wurden für eine Stunde bei 37 °C mit 5 U des Restriktionsenzyms Dpnl (Stratagene) inkubiert und durch Elektrophorese auf Agarosegel analysiert.
Die Produkte der Mutagenese wurden in den pGEM-7Zf(+)- Vektor (Promega) kloniert und in E. Coli XL1-Blue gemäß den konventionellen Verfahren der Molekularbiologie transfiziert. Die Mutagenese wurde durch Sequenzierung verifiziert.
Die durch mutierte Sequenzen exprimierten Proteine wurden nach dem Klonieren in den Expressionsvektor pDN332 (Neri et al. 1996) und Induktion der Expression in Bakterien gemäß der in den folgenden Beispielen beschriebenen Technik analysiert.
Die Funktionalität der Antikörper und die Löslichkeit in cytoplasmatischer, reduzierender Umgebung wurde mittels eines Western Blots und ELISA, wie unten beschrieben wird, analysiert.
Beispiel 3: Extraktion des Proteins das in E Coli Periplasma exprimiert wird
Einzelne Kolonien von E. Coli HB2151, die scFv-Antikörper exprimieren, wurden in 50 ml SB-Kulturmedium, enthaltend 100 μg/ml Ampicillin und 2 % Glukose inokuliert und für 16 Stunden bei 37 °C wachsen gelassen. Diese Vorkultur wurde auf einen Liter mit frischem SB-Medium verdünnt und bei 37 °C für zwei zusätzliche Stunden geschüttelt (bis A₆₀₀ nm = 0,7 – 0.8). Die Zellen wurden bei Raumtemperatur bei 3000 g für 15 ' zentrifugiert.
Die Induktion des IacZ-Promotors wurde durch Resuspendierung des bakteriellen Präzipitats in 1 Liter SB-Medium erreicht, das 100 μg/ml Ampicillin und 1 mM IPTG enthält und Schütteln bei 30 °C für 3 Stunden. Die Kultur wurde dann bei 3000 g für 15' bei 4 °C zentrifugiert, um die Zellen zu fällen.
Lösliche Proteine wurden aus bakteriellem Periplasma durch osmotischen „Schock" extrahiert. Die pelletierten Zellen wurden in 15 ml TES-Pufferlösung (0,5 M Saccharose, 0,2 M Tris-HCl, 0,5 mM EDTA, pH 8,0), die Proteasehemmer enthält („Complete Mini", Boehringer) resuspendiert.
Dann wurden 22,5 ml der 1 : 5 verdünntes TES und Proteasehemmer hinzugefügt. Die bakterielle Suspension wurde einer langsamen Rotation für 15 ' bei Raumtemperatur ausgesetzt. Der Extrakt wurde dann bei 15.000 g bei 4 °C für 20 'zentrifugiert, um periplasmatische Proteine, die in dem Überstand vorhanden sind, zu gewinnen.
Beispiel 4: Expression von Proteinen in E Coli Cytoplasma
a. Herstellung intrazellulärer Extrakte
Um die Expression von scFv-Fragmenten in dem bakteriellen Cytoplasma zu erhalten, wurden signalsequenzlose Konstrukte hergestellt. Die Sequenz, die scFv(F8) kodiert, die kein PeIB-Sezernierungssignal enthält (Tavladoraki et al., 1993), wurde in HindIII – NotI-Stellen des pDN332 Phagemids einkloniert, was den pDN-F8 intra genannten Phagemid ergibt. Konstrukte von scFv-Genen, die zur intrazellulären Expression vorgesehen sind, wurden durch Substitution eines PstI – NotI – 744 Bp – Fragments von pDN-F8 intra, korrespondierend zu dem scFv(F8)-Gen mit den analogen Pstl – NotI – Restriktionsfragmenten, die durch Verdau von mutierten scFv-Genen erhalten wurden, hergestellt. Plasmide, die die signalsequenzlose Version der scFv-Gene enthalten, wurden verwendet, um E. coli HB2151 zu transformieren.
b. Expression von rekombinantem Protein in E. Coli
50 ml 2 x TY-AG wurden in einer Über-Nacht-Kultur bei A_{600 nm} = 0,05 inokuliert. Die Zellen wurden bei 37 °C bis A_{600 nm} = 0,6 wachsen gelassen, dann wurden sie pelletiert und in 50 ml SB-Mesium resuspendiert, das 100 μg/ml Ampicillin und 0,4 mM IPTG enthält. Nach 3 h Induktion bei 30 °C wurden Bakterien in 2,5 ml Extraktionspuffer (20 mM Tris-HCl, 2 mM EDTA, 10 mM Jodacetamid, pH 8) gesammelt, bei –20 °C gefroren / aufgetaut und dann für 3 Min. bei 150 Watt Leistung (Soniprep 150, Sonyo) auf Eis Ultraschall-behandelt. Die lösliche Fraktion wurde durch Zentrifugation für 30 Min. bei 18.000 g gesammelt.
Das Pellet, das Inklusionskörper enthält, wurde in Elektrophoresepuffer (20 % Glycerin, 2 % SDS, 0,06 M Tris-HCl, pH 6,8, 0,02 % Bromphenol blau, 5 % β-Mercaptoethanol) resuspendiert, für 5' gekocht und der erhaltene Überstand wurde nach einer kurzen Zentrifugation auf ein Polyacrylamidgel geladen.
Beispiel 5: Analyse von rekombinanten Antikörpern
a. Bestimmung der Proteinkonzentration
Die Konzentration des Gesamtproteins, das in den Extrakten vorhanden war, wurde unter Verwendung des BioRad-Reagenzes und Rinderserumalbumin als Standard bestimmt.
Die Konzentration des scFv nach Aufreinigung wurde auf der Basis der Absorption bei 280 nm berechnet. Nach elektrophoresischer Trennung wurden Proteinbanden mit Silbernitrat oder Coomassie Blau- Färbeverfahren sichtbar gemacht.
b. Elektrophorese auf denaturierendem Polyacrylamid Gel (SDS – PAGE)
Die Analyse der Antikörperfragmente, die nach der Aufreinigung erhalten wurden, wurde mittels SDS – PAGE, gemäß dem auf dem Gebiet bekannten Protokoll, durchgeführt. Das Trenngel wurde unter Verwendung von Polyacrylamid (Acrylamid-Bisacrylamid 29 : 1) mit 12 % Endkonzentration in der Gegenwart von 2 % SDS hergestellt. Beladungspuffer (Endkonzentrationen: 10 % Glycerin, 0,06 M Tris-HCl, pH 6,8, 0,025 % Bromphenol Blau, 2 % SDS und 5 % β-Mercaptoethanol) wurde auf die Proben vor dem Sieden für 5' hinzugefügt. Die Elektrophorese wurde unter Verwendung der MiniProtean (BioRad)- Vorrichtung bei 100 Volt durchgeführt.
c. Western Blot-Analyse
Nach Trennung auf SDS – PAGE wurden die Proteine dann von dem Gel auf eine Nitrozellulosemembran (Hybon-C Super, Amersham) bei 100 Volt für eine Stunde bei 4 °C elektrotransferiert.
Die Nitrozellulosemembran wurde dann in PBS-Puffer (0,2 M NaH₂PO₄, 0,2 M Na₂HPO₄, 0,15 M NaCl), enthaltend 0,1 % Tween-20 (PBST) und 4 % entrahmte Milch bei 4 °C für 16 Stunden blockiert.
Nach drei Waschungen mit PBST, jeweils für 30", 5', 5' und einer Waschung von 5' in PBS, wurde die Membran in PBS, 2 % entrahmte Milch (PBSM), enthaltend 2,5 μg/ml monoklonale Antikörper anti-Flag M2 (Sigma) für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Membran wurde gewaschen und der Immunnachweis wurde durch Inkubation für 1 Stunde bei Raumtemperatur in PBSM realisiert, das biotinylierten Anti-Maus IgG Antikörper (Amersham) enthält, gefolgt durch Inkubation in PBSM mit Streptavidin-Meerrettichperoxidasekonjugat (Amersham). Die Signalentwicklung wurde durch verstärkte Chemilumineszenz (ECL Plus, Amersham) erhalten.
d. ELISA-Test
Immunplatten (Maxisorp, Nunc) wurden mit Antigenen (100 μg/ml Lysozym (Sigma) und 3 μg/ml AMCV) in 100 μl Carbonatpuffer (50 mM NaHCO₃, pH 9,6) bei 4 °C für 16 Stunden inkubiert.
Nach drei Waschungen mit PBST und einer Waschung mit PBS wurden die Platten mit PBSM für 2 Stunden bei 37 °C blockiert. Jedes Well wurde dann gewaschen und mit 80 μl Extrakt aus induzierten bakteriellen Kulturen und 20 μl PBSM, enthaltend 2,5 μg/ml Anti-FlagM2 (Sigma) gefüllt. Die Platten wurden für 16 Stunden bei 4 °C inkubiert und gewaschen. 100 μl PBSM wurde dann zu jedem Well hinzugefügt, das einen Ziegeanti-Maus Antikörper enthält, der an Peroxydase konjugiert ist (KPL). Die Platten wurden bei 37 °C für eine Stunde inkubiert und gewaschen. Zur Signalentwicklung wurden 100 μl einer 1 : 1 Lösung Peroxydasesubstrat, ABTS [2'2'-Azinbi(3-ethylbenzthiazolin)sulphonsäure] : H₂O₂ (KPL) verwendet. Die Signale wurden bei 405 nm Absorption mittels eines ELISA-Lesegerätes (Labsystem Multiscan Plus) gemessen.
Beispiel 6: Herstellung und Klonierung der „Monoscaffold"-Bibliothek
Als ein Template für die Herstellung der Phagenbibliothek wurde das in Beispiel 2 beschriebene Plasmid pMUT-VL1 verwendet. Die Bibliothek wurde durch das Einführen einer Variabilität in der CDR3 des VH und VL durch die zufällige Modifikation der Sequenz hergestellt, die für die 4 Aminosäurereste in den in Tabelle 1 angezeigten Positionen kodiert. Für diesen Zweck wurden teilweise degenerierte Oligonukleotide synthetisiert, die entwickelt wurden, um die Einführung von Transkriptionsstopcodons zu vermeiden und die Länge des CDR3 des VH von 13 auf 4 Aminosäuren zu verringern. Die Mutagenese wurde mittels einer PCR durchgeführt, wobei die kodierenden Sequenzen für die VH- und VL-Domänen unabhängig voneinander jeweils unter Verwendung der Primer VHa und VHf und VLa und VLf (6) amplifiziert wurden. Die PCR-Reaktion wurde wie folgt vorbereitet: 300 ng pMUT-VL1, 0,4 mM Senseprimer (VHa oder VLa), 0,8 μM degenerierter Antisenseprimer (VHf oder VLf), 250 μM von jedem dNTP in 50 μl Inkubationspuffer 1 × Appligene (Oncor); 2,5 U Taq DNA Appligene Polymerase (Oncor), wurden bei 94 °C (Heißstart) hinzugefügt. Die Amplifikationsreaktion wurde gemäß dem folgenden Programm durchgeführt: 94 °C für 3 Minuten; 25 Zyklen: 94 °C für 1 Minute, 60 °C für 1 Minute, 72 °C für 1 Minute; 72 °C für 2 Minuten. Die Amplifikationsprodukte wurden aus Agarosegel unter Verwendung des QIAquick-Gel-Extraktionskits (QIAgen) unter Eluieren in 30 ml 3 mM Tris/HCl, pH 8,0 aufgereinigt. Der Zusammenbau der scFv-Antikörper wurde mittels PCR unter den gleichen, wie den oben beschriebenen Bedingungen durchgeführt, unter Verwendung von 10 μg der aufgereinigten VH- und VL-Fragmente, 0,8 μM Senseprimer (VHa) und 0,8 μM Antisenseprimer (VLg) in einem Endvolumen von 500 μl, das in 10 Reaktionen von 50 μl unterteilt wurde. Die zusammengesetzten scFvs wurden unter Verwendung des QIAquick PCR-Aufreinigungskits (QIAgen) aufgereinigt. Nach NcoI-NotI-Verdau wurde das gesamte Produkt des Zusammenbaus in Vektor pDN332 kloniert.
Ligationsprodukte wurden durch Elektroporation in den E. Coli TG1-Stamm unter Verwendung der folgenden Bedingungen transfiziert: 200 Ohm, 25 mF, 2,5 kVolt. Die Transformanten wurden auf 2 × YT + 2 % Glucose + Ampicillin 100 g/ml ausgewählt. Die Phagen wurden gemäß dem durch Nissim et al. (1994) beschriebenen Verfahren hergestellt.
Beispiel 7: Selektion der Mutanten aus der Monoscaffold"-Bibliothek und Analyse von deren Eigenschaften
a. Selektion der Bibliothek
Eine Antigenimmobilisierung wurde auf Immunröhrchen (Maxisorp, NUNC) in PBS (8 mM NarHPO₄ · 12 H₂O + 1 mM NaH₂PO₄ · H₂O + 0,15 M NaCl) oder in Carbonatpuffer 50 mM (CB) unter Inkubation für 16 Stunden bei Raumtemperatur oder bei 4 °C bei einer Konzentration durchgeführt, die zwischen 10 und 100 μg/ml, abhängig von dem Antigen, variiert.
10¹²-10¹³ Phagen in 4 ml PBS + 2 % Milch (PBS-M) wurden für jeden Selektionszyklus bei Inkubation für 2 Stunden verwendet, wobei die ersten 30 Minuten leicht gerührt wurde. Nach 10 – 15 Waschungen mit PBS + 0,1 % Tween20 und 10–15 Waschungen mit PBS wurde die Elution mit 1 ml 100 mM Triethylamin durchgeführt, das sofort mit 0,5 ml 1 M Tris/HCl, pH 8,0 neutralisiert wurde. Die Phagensuspension wurde dann verwendet, um 10 ml exponentiell wachsenden E. Coli TG1-Stamm (37 °C für 30 Minuten) zu infizieren. Nach Zentrifugation wurden die Bakterien resuspendiert und auf Platten ausplattiert, die Agarmedium enthalten: 2 × YT + 100 μg/ml Ampicillin + 1 % Glukose (2 × YT – AG).
Die Charakterisierung der einzelnen Klone auf Bindungsfähigkeit, die aus den letzten Selektionsdurchgängen abgeleitet wurden, wurde in einigen Fällen mit Klonen durchgeführt, die in der Form eines Phagen exprimiert wurden, und mit anderen, die als lösliche scFv exprimiert wurden.
In dem Fall der Phagenklone wurden 96 einzelne Kolonien, die aus dem letzten Selektionszyklus erhalten wurden, in 150 ml 2 × YT – AG inokuliert und bei 30 °C unter Rühren für 16 Stunden wachsen gelassen. Dann wurde eine Probe von 10 ml von jeder Vorkultur verwendet, um 150 ml 2 × YT – AG zu inokulieren, bis expontielles Wachstum erreicht wurde. Die Herstellung von Phagen wurde durch Infizieren mit ungefähr 10¹¹ t.u. (transformierende Einheiten) des ,Helfer'-Phagen VCSM13 (Stratagene) und Inkubieren bei 37 °C für 30 Minuten erhalten. Die infizierten Bakterien wurden zentrifugiert, in 150 ml 2 × YT + 100 μg/ml Ampicillin + 25 μg/ml Kanamicin resuspendiert und für 16 Stunden bei 30 °C inkubiert. Die Kulturüberstände wurden durch ELISA analysiert, wobei die Antigene unter den gleichen Bedingungen, die für die Immunröhrchen verwendet wurden, immobilisiert wurden. Nach Inkubieren für 2 Std. bei 37 °C wurde ein Peroxidase-konjugierter monoklonaler Antikörper anti-M13 (Pharmacia) 1 :5000 in PBS-M für 1 Stunde bei 37 °C verwendet. Die colorimetrische Reaktion wurde unter Verwendung des „ABTS Peroxidasesubstratsystems" (KPL) entwickelt. Positive Klone, die aus dieser ersten Selektion erhalten wurden, wurden weiter analysiert, um die Funktionalität als lösliche scFvs zu verifizieren. Für diesen Zweck wurden Plasmide aus positiven Klonen mittels des QIAprep Spin Miniprep (QIAGEN) Systems extrahiert, sequenziert und in den E. Coli NB2151-Stamm transfiziert. Kompetente Bakterien wurden durch Resuspendierung bei 0 °C in TSS hergestellt (für 100 ml : 1 g Bacto-Tripton, 0,5 g Hefeextrakt, 0,5 g NaCl, 10 g PEG 3350, 5 ml DMSO, 50 mM MgCl₂, pH 6,5). DNA-Plasmid (1 – 5 ng) wurde zu 1 ml kompetenter Zellen hinzugefügt und auf Eis für 45 Minuten inkubiert. Nach einem kurzen Schock bei 42 °C für 2 Minuten wurde 1 ml LB hinzugefügt, dann wurden die Zellen für 1 Stunde bei 37 °C gerührt und auf LB + 100 μg/l Ampicillin plattiert. Die Analyse der Expression der einzelnen Kolonien aus der Transformation wurden durch ELISA gemäß dem unten beschriebenen Verfahren durchgeführt.
Zur Auswahl als lösliche scFvs wurden 10–100 μl Phagen, die aus dem letzten Auswahlschritt mit Antigenen eluiert wurden, verwendet, um Zellen des E. Coli NB2151-Stammes in exponentielles Wachstum zu infizieren. 96 einzelne Kolonien wurden mit 150 μl 2 × YT – AG für 16 Stunden unter Rühren inokuliert. 10 μl von jeder Vorkultur wurden in 150 μl 2 × YT + 100 μg/ml Ampicillin + 0,1 % Glukose verdünnt und bei 37 °C für eine Stunde wachsen gelassen. Die Proteinexpression wurde durch die Zugabe von 1 mM IPTG und 16 Stunden Inkubation induziert. Einzelkulturüberstände (enthaltend 2,5 μg/ml eines anti-FLAG M2 monoklonalen Antikörper, Sigma, in PBS-M) wurden zwei Std. bei 37 °C inkubiert und durch ELISA analysiert. Ein 1 : 10.000 in PBS-M verdünnter Kaninchen-anti-Maus-Antikörper (KPL), der an die Peroxydase konjugiert war, wurde dann für 1 Stunde bei 37 °C hinzugefügt.
b. Analyse der Kreuzreaktivität
Positive Klone, die aus der ELISA-Untersuchung abgeleitet wurden, wurden weiterhin auf deren Bindungsspezifität für Antigene analysiert, die nicht der Auswahl entsprach.
50 ml E. Coli HB2151-Stamm in exponentiellem Wachstum in SB-A (35 g/l Tripton + 20 g/l Hefeextrakt + 5 g/l Natriumchlorid + 100 μg/ml Ampicillin, pH 7,5) wurden bei 30 °C für 3 Stunden durch die Zugabe von 1 mM IPTG induziert. Nach Zentrifugation wurden die Zellen in 500 μl TES (0,2 M Tris-HCl, pH 8 + 0,5 mM EDTA + 0,5 M Saccharose) resuspendiert, das Protease-Hemmer (Complete^®, EDTA-frei, Boehringer) enthält. Dann wurden 750 μl 1 : 5 verdünntes TES hinzugefügt und die Probe wurde unter orbitaler Agitation für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Proteinextrakte, die als Überstand nach Zentrifugation für 20 Minuten bei 18.000 g bei 4 °C erhalten wurden, wurden in einem ELISA-Test mit unterschiedlichen Antigenen verwendet. In jedes ELISA-Well wurden 80 μl periplasmatischer Extrakt geladen, anschließend 20 μl PBS + 10 % Milch. Der Nachweis wurde wie bereits beschrieben durch Verwendung des Antikörpers anti-FLAG M2 durchgeführt.
c. Sequenzierung
Plasmide aus ausgewählten positiven Klonen wurden an beiden DNA-Strängen durch Verwendung einer 373 DNA-Sequenziervorrichtung (Applied Biosystems) sequenziert.
d. Aufreinigung des scFv
Um große Mengen an scFv herzustellen, wurde eine Einzelkolonie von E. Coli HB2151 in 100 μg/ml SB inokuliert, der 100 μg/ml Ampicillin und 2 % Glukose (SB-AG) enthält. Nach 16 Stunden Inkubation bei 30 °C wurde die Kultur mit 900 ml SB-AG verdünnt und für eine weitere Stunde rühren gelassen (bis zu einer O.D.₆₀₀ = 0,9). Nach Zentrifugation wurden die Pellets in SB-A + 1 mM IPTG resuspendiert und für 3 Stunden bei 30 °C induziert. Nach Zentrifugation wurden die Bakterien in 10 ml TES + Proteasehemmer resuspendiert, anschließend wurden 1 : 5 verdünnte 15 ml TES + Proteasehemmer hinzugefügt und die Probe wurde für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Zentrifugation (20 Minuten bei 18.000 g bei 4 °C) wurde der Überstand zurück gewonnen (Fraktion 1A) und das Pellet wurde in 15 ml MgSO₄ + Proteasehemmer für eine weitere Proteinextraktion resuspendiert. Nach 10 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur wurde ein zweiter Zentrifugationsschritt durchgeführt und der Überstand wurde als Fraktion 2A getrennt gesammelt. Die Fraktionen 1A und 2A wurden unabhängig voneinander durch Ultrafiltration auf einer Diaflo YM10-Membran (Amicon) aufkonzentriert und durch Affinitätschromatographie auf Protein-L Sepharose (Actigen) oder auf Ni-NTA (QIAgen) gemäß den von den Herstellern vorgeschlagenen Protokollen aufgereinigt. Eine Quantifizierung wurde durch Ablesen der Absorption bei 280 nm durchgeführt und die Proteinreinheit wurde auf SDS-PAGE, gefolgt von AgNO₃-Färbung, verifiziert.
e. Analyse der thermodynamischen Stabilität
i) Entfaltungs- und Faltungsstudien mit scFv-Mutanten.
Gleichgewichtsentfaltungsexperimente wurden bei 20 °C durch Inkubation von jeder scFv-Mutante (35 μg/ml) bei sich erhöhenden Guanidiniumchlorid (GdmCl)-Konzentrationen (0 – 4 M) in PBS durchgeführt. Nach 3 h wurden intrinsische Fluoreszenzemissionsspektren bei 20 °C aufgenommen. Zur Überprüfung der Umkehrbarkeit der Entfaltung wurden Mutanten (0,70 mg/ml) bei 20 °C in 4 M GdmCl in PBS für 3 Std. entfaltet. Die erneute Faltung wurde durch 20-fache Verdünnung bei 20 °C in Lösungen des gleichen Puffers, der für die Entfaltung verwendet wurde, der sich verringernde GdmCl-Konzentrationen enthält, gestartet. Nach 3 h wurden intrinsische Fluoreszenzemissionsspektren bei 20 °C aufgenommen. Gleichgewichtsentfaltungsexperimente unter reduzierenden Bedingungen wurden durch Inkubation von 35 μg/ml scFv(HEL-11E) in 20 mM Tris-HCl, pH 9,0, 0,15 M NaCl, 2 mM DTT und 0,1 mM EDTA bei sich erhöhenden GdmCl-Konzentrationen (0 – 4 M) für 3 h bei 20 °C vor der Aufnahme der Fluoreszenzemissionsspektren durchgeführt. Für Entfaltungsexpermiente wurde die Mutante (0,70 mg/ml) 3 hin 4 M GdmCl, 18 mM DTT und 1,0 mM EDTA bei pH 9,0 entfaltet, die Lösung wurde dann 25-fach in abfallenden GdmCl-Konzentrationen verdünnt und Fluoreszenzemissionsspektren wurden 3 h danach aufgenommen. Die Funktionalität aller Mutanten, die unter reduzierenden Bedingungen rückgefaltet wurden, wurde durch ELISA (s. oben) untersucht.
ii) Datenanalyse
Die Änderungen in den intrinsischen Fluoreszenzemissionsspektren bei sich erhöhenden GdmCl-Konzentrationen wurden bei der intensitätsdurchschnittlichen Emissionswellenlänge ^–λ (Roger et al., 1993) quantifiziert, die gemäß der folgenden Gleichung berechnet wird: –λ = Σ (Ii λ / Σ (Ii) Gl. 1 worin λi und Ii die Emissionswellenlänge und deren korrespondierende Fluoreszenzintensität bei besagter Wellenlänge ist. Basislinien- und Übergangsregionsdaten für scFv(F8) GdmCl-Denaturierung wurden an ein Zwei-Zustands- (Santoro et al., 1988) lineares Extrapolationsmodell (LEM) gemäß der folgenden Gleichung angepasst: ΔGentfalten = ΔGH 2 O + mg [GdmCl] = RTInK entfalt. Gl. 2worin ΔG_entfalt. die freie Energieänderung zur Entfaltung für eine gegebene denaturierende Konzentration ist, ΔG^H ₂ ^O ist die freie Energieänderung zur Entfaltung in der Abwesenheit des Denaturierungsmittels und m ist die Steigung, die die Änderung in ΔG_entfalten pro Konzentrationseinheit des Denaturierungsmittels wiedergibt, R ist die Gaskonstante, T ist die Temperatur und K_entfaltenist die Gleichgewichtskonstante zur Entfaltung. Das Modell drückt das Signal als eine Funktion der Konzentration des Denaturierungsmittels aus:
Worin Y_i das beobachtete Signal ist, Y_N und Y_D sind die Basislinienschnittpunkte, die jeweils mit den nativen und denaturierten Proteinen korrespondieren, m_N und m_D sind die korrespondierenden Basisliniensteigungen, [X]_i ist die Konzentration des Denaturierungsmittels nach der i-ten Zugabe, ΔG^H ₂ ^O ist die extrapolierte freie Energie der Entfaltung in der Abwesenheit von Denaturierungsmittel, m_g ist die Steigung einer ΔG_Entfalten gegen [X] Graphik, R ist die Gaskonstante, T ist die Temperatur. Die [GdmCl]_0,5 ist die denaturierende Konzentration am Mittelpunkt des Übergangs und wird gemäß GI. 2 wie folgt berechnet: [GdmCl]0,5 = ΔGH 2 O / mg Gl. 4
f. Affinitätsmessungen
Affinitäts-aufgereinigte scFvG4- und scFvB4-Antikörper gegen den Gurkenmosaikvirus (CMV) wurden auf 100 mg/ml unter Annahme einer OD_{280 nm} von 1,0 aufkonzentriert, von der angenommen wird, dass sie mit einer scFv-Konzentration von 0,7 mg/ml korrespondiert. Die Bindungseigenschaften wurden unter Verwendung von Oberflächenplasmonresonanz (SPR) bewertet. Eine Echtzeitwechselwirkungsanalyse wurde in dem BIAcoreX Biosensorsystem (Pharmacia Biosensor AB) durchgeführt.
Ungefähr 5.400 Resonanzeinheiten (RU) von aufgereinigtem CMV (200 ng/μl in 7 mM Acetatpuffer, pH 4,0) wurden an einen CM5-Sensorchip unter Verwendung des Aminkopplungskits (Biacore AB) verbunden, um das Antigen zu immobilisieren. Die kinetische Analyse wurde unter kontinuierlichem Fluss von 20 μl/Min. durchgeführt. Nach jeder Bindungsmessung wurde die Oberfläche mit 10 mM HCl regeneriert. Die Geschwindigkeitskonstanten wurden auf der Basis eines Einzelpositionsmodells unter Verwendung der BIAevaluation 2.1 Software (Biacore AB) gemessen. Die Assoziationsgeschwindigkeitskonstanten (k_on) wurden aus einer Grafik aus In(dR/dt) / t gegen die Konzentration über einen Bereich von sechs Konzentrationen (120, 150, 250, 300, 400 und 450 nM) für beide scFvs bestimmt. Die Dissoziationsgeschwindigkeitskonstante (k_off) wurde aus der Dissoziationsphase in dem Sensorgramm unter Verwendung der folgenden Gleichung bestimmt: In Rt0 / Rt = koff (t – t0)worin Rt₀ die Reaktion 30 s nach Beendigung der Antikörperinjektion ist. Eine lineare Graphik von In Rt / Rt₀ gegen (t – t₀) ergibt k_off direkt als Messung der Steigung. Die Gesamtaffinitätskonstanten (k_D) wurden aus den Assoziations- und Dissoziationsgeschwindigkeitskonstanten als k_D = k_off / k_on berechnet. Affinitätswerte waren 60 nM für scFvG4 und 10 nM für scFvB4.
Beispiel 8: Expression von Proteinen in dem Pflanzencvtoplasma
a. Klonierung in PVX-abgeleitetem Vektor und Expression in N. benthamiana- Pflanzen
Wir brachten die scFvs-Konstrukte durch einen Kartoffelvirus X (PVX)-abgeleiteten Vektor (Chapman et al., 1992) in Pflanzen ein, um die höchsten Expressionsmengen zu erhalten. Sequenzen, die die scFvs kodieren, wurden unter Verwendung von Oligonukleotiden amplifiziert, die entwickelt wurden, um die Erkennungsstellen Clal, Sphl und Xbal stromaufwärts (PVX CSC back = TTC ATC GAT TTG CAT GCT CTA GAC ATG CAG GTG CAG CTG CAG) und die Erkennungsstelle Sall stromabwärts (PVX flap = TCC GTC GAC CTA CTT GTC GTC GTC GTC TCC GTA GTC) der scFv-Gene einzufügen. Die scFv-Gene wurden dann als Clal – Sall – Fragmente in den Polylinker des Vektors pPVX201 (Baulcombe et al., 1995) eingefügt, einem Derivat des pGC3-Vektors (Chapman et al., 1992), der einzelne Klonierungsstellen enthält, die stromabwärts des PVX-Hüllprotein doppelsubgenomischen Promotors und einem CaMV (Blumenkohl Mosaik Virus) 35S-Promotors liegen. Somit wurden PVXscFv(G4)- und PVXscFv(B4)-Konstrukte erhalten. Diese Plasmide könnten direkt als Inokulum verwendet werden. DNA von jedem Konstrukt (40 μg) wurde verwendet, um mechanisch zwei Blätter pro Pflanze von N. benthamiana-Pflanzen im 3- bis 4-Blattstadium zu inokulieren. Es wurden vier getrennte Experimente durchgeführt, bei denen mindestens 10 Pflanzen mit jedem Konstrukt infiziert wurden.
Symptome erschienen an den oberen Blättern üblicherweise 7 – 9 Tage nach Inokulierung. Symptomatische Blätter wurden in flüssigem Stickstoff eingefroren und anschließend in PBS-Puffer homogenisiert, der einen Cocktail aus Proteasehemmem enthielt (Complete®, EDTA-frei, Boehringer). Nach Zentrifugation bei 20.000 × g für 30 Min. bei 4 °C wurden die Überstände verwendet, um die gesamte lösliche Protein (TSP)- Konzentration unter Verwendung des Bio-Rad Proteinassays und BSA als Standard zu bestimmen. Western Blots wurden unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers anti-FLAG M2 (Sigma) durchgeführt. Immunblots bestätigten das Vorhandensein eines 30 K-Moleküls, das mit scFvB4 oder scFvG4 in der löslichen Fraktion korrespondiert.
b. Tomatentransformation
Die scFvB4- und scFvG4-Gene wurden anschließend aus den PVXscFv(G4)- und PVXscFv(B4)- Konstrukten als Xbal I- Sal I-Fragmente in einen pBI-abgeleiteten Vektor unter der Kontrolle des CaMV 35S-Promotors subkloniert. Die Plasmide wurden dann in den Agrobacferium tumefaciens- Stamm EHA105 durch Elektroporation transferiert und für Blattdisktransformation auf dem Miniatur Lycopersicon esculentum cultivar, Micro-Tom (microtomato) (Meissner et al., 1997) verwendet. Transgene Microtomatenpflanzen wurden, im Wesentlichen wie beschrieben, (van Roekel et al., 1993) regeneriert.
Die Transformation der Pflanzen umfasste drei unabhängige Experimente für beide Konstrukte und primäre Transformanten wurden auf funktionelle Expression hin ausgewählt. Signale, die zu den scFvB4- und scFvG4-Antikörpem korrespondieren, wurden sowohl durch ELISA wie auch durch Immunblotten nachgewiesen. Insbesondere wurde der ELISA-Test gemäß dem folgenden Verfahren durchgeführt: 5 μg/ml des aufgereinigten CMV-Antigens in PBS wurden O/N bei 4 °C auf eine Mikrotiterplatte beschichtet. Nach dem Blockieren mit 5 % Milch in PBS wurden lösliche Pflanzenextrakte (wie oben beschrieben erhalten) O/N bei 4 °C hinzugefügt. Die funktionelle Bindung wurde durch Verwendung des monoclonalen Antikörpers anti-FLAG M2 (2,5 μg/ml) und eines Kaninchen- anti- Maus- Peroxidase-konjugierten Antikörpers (KPL) bewertet. Zur Signalentwicklung wurde ABTS Peroxidase-substrat (KPL) verwendet. Verschiedene transgene Pflanzen, die den rekombinanten Antikörper exprimieren, wurden hergestellt und mit dem Virus herausgefordert.
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Sequenzauflistung

Claims

Ein Polypeptidpaar, bestehend aus: – einem Polypeptid, das Gerüstpeptide der schweren Kette (H-FR) und Peptide der komplementaritätsbestimmenden Regionen der schweren Kette (H-CDR) umfasst, wobei H-FR1, H-CDR1, H-FR2, H-CDR2, H-FR3, H-CDR3, H-FR4 kovalent miteinander in der genannten Reihenfolge verbunden sind, und – einem Polypeptid, das Gerüstpeptide der leichten Kette (L-FR) und Peptide der komplementaritätsbestimmenden Regionen der leichten Kette (L-CDR) umfasst, wobei L-FR1, L-CDR1, L-FR2, L-CDR2, L-FR3, L-CDR3, L-FR4 kovalent miteinander in der genannten Reihenfolge verbunden sind, worin H-FR-1 SEQ ID NO: 1 ist, H-FR-2 ist SEQ ID NO: 2, H-FR3 ist SEQ ID NO: 3, H-FR 4 ist SEQ ID NO: 4, L-FR-1 ist SEQ ID NO: 5, L-FR-2 ist SEQ ID NO: 6, L-FR-3 ist SEQ ID NO: 7 und L-FR-4 ist SEQ ID NO: 8, wobei die genannten Polypeptide in der Lage sind, einen Antikörper im Zytoplasma löslich und stabil zu machen, wenn das erste in der variablen Region der schweren Kette und das letztere in der variablen Region der leichten Kette von besagtem Antikörper mitumfasst sind.
Das Polypeptidpaar gemäß Anspruch 1, worin das Xaa in Position 24 von SEQ ID NO: 1 Ala ist; das Xaa in Position 12 von SEQ ID NO: 2 Leu ist; das Xaa in Position 2 von SEQ ID NO. 3 Pro ist; das Xaa in Position 3 von SEQ ID NO: 3 Asp ist; das Xaa in Position 13 von SEQ ID NO: 3 Arg ist; das Xaa in Position 18 von SEQ ID NO: 3 Asn ist; das Xaa in Position 20 von SEQ ID NO: 3 Leu ist; das Xaa in Position 12 von SEQ ID NO: 7 Arg ist; und das Xaa in Position 15 von SEQ ID NO: 7 Phe ist.
Das Polypeptidpaar der Ansprüche 1 oder 2, worin das Polypeptid, das H-FR1, H-CDR1, H-FR2, H-CDR2, H-FR3, H-CDR3, H-FR4 umfasst, die kovalent miteinander in der genannten Reihenfolge verbunden sind, mit SEQ ID NO: 101 korrespondiert und das Polypeptid, das L-FR1, L-CDR1, L-FR2, L-CDR2, L-FR3, L-CDR3, L-FR4 umfasst, die kovalent miteinander in der genannten Reihenfolge verbunden sind, mit SEQ ID NO: 102 konespondiert.
Das Polypeptid gemäß Anspruch 3, worin besagtes Polypeptid eine Sequenz umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den Sequenzen besteht, die in der Sequenzauflistung von SEQ ID NO: 31 bis SEQ ID NO: 48 gezeigt werden.
Ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, das als eine variable Region eines Antikörpers geeignet ist, der stabil und löslich im Zytoplasma ist und spezifisch für ein vorbestimmtes Antigen ist, das den folgenden Schritt umfasst: – die Herstellung eines Antikörpers, der als eine variable Region der schweren Kette das Polypeptid aufweist, das Gerüstpeptide der schweren Kette (H-FR) und Peptide der komplementaritätsbestimmenden Regionen der schweren Kette (H-CDR) gemäß den Ansprüchen 1 – 3 umfasst, und als eine variable Region der leichten Kette das Polypeptid, das die Gerüstpeptide der leichten Kette (L-FR) und die Peptide der komplementaritätsbestimmenden Regionen der leichten Kette (L-CDR) gemäß den Ansprüchen 1 – 3 umfasst; – das in Kontakt bringen von besagtem Antikörper mit besagtem Antigen und, – das Auswählen des Antikörpers, der besagtes Antigen bindet, – das Isolieren des Polypeptids der variablen Region der schweren Kette und/oder des Polypeptids der variablen Region der leichten Kette des Antikörpers, der besagtes Antigen bindet.
Das Verfahren gemäß Anspruch 5, das zusätzlich den folgenden Schritt umfasst: – das Sequenzieren der variablen Regionen von besagtem Antikörper, der besagtes Antigen bindet.
Das Verfahren gemäß Anspruch 5 oder 6, worin besagtes Antigen das Tat-, Rev-, E7- oder NS3-Protein ist.
Ein Verfahren zur Herstellung von Peptiden, die einem Antikörper entweder Bindungsspezifität gegenüber einem vorbestimmten Antigen oder Löslichkeit und Stabilität im Zytoplasma vermitteln, das den folgenden Schritt umfasst: – die Herstellung eines Antikörpers, der als eine variable Region der schweren Kette das Polypeptid aufweist, das Gerüstpeptide der schweren Kette (H-FR) und Peptide der komplementaritätsbestimmenden Regionen der schweren Kette (H-CDR) gemäß den Ansprüchen 1 – 3 umfasst, und als eine variable Region der leichten Kette das Polypeptid, das die Gerüstpeptide der leichten Kette (L-FR) und die Peptide der komplementaritätsbestimmenden Regionen der leichten Kette (L-CDR) gemäß den Ansprüchen 1 – 3 umfasst; – das in Kontakt bringen von besagtem Antikörper mit besagtem Antigen und – das Auswählen des Antikörpers, der besagtes Antigen bindet, – das Isolieren des Polypeptids der variablen Region der schweren Kette und/oder des Polypeptids der variablen Region der leichten Kette des Antikörpers, der besagtes Antigen bindet, – das Isolieren entweder des Teils von besagtem Antikörpers, der die Bindungsspezifität des besagtem Antikörper vermittelt oder des Teils, der die Stabilität und Löslichkeit im Zytoplasma von besagtem Antikörper vermittelt.
Ein Peptid, das Bindungsspezifität für ein vorbestimmten Antigen vermittelt, das durch das Verfahren gemäß Anspruch 8 herstellbar ist.
Das Peptid gemäß Anspruch 9, das durch die Tatsache gekennzeichnet ist, dass es eine Sequenz umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den Sequenzen besteht, die in der beigefügten Sequenzauflistung von SEQ ID NO: 9 – SEQ ID NO: 30 und als SEQ ID NO: 94 gezeigt werden.
Ein Antikörper, der eine schwere Kette umfasst, wobei die variable Region von besagter schweren Kette Gerüstpeptide der schweren Kette (H-FR) und Peptide der komplementaritätsbestimmenden Regionen der schweren Kette (H-CDR) umfasst, wobei H-FR1, H-CD1, H-FR2, H-CDR2, H-FR3, H-CDR3, H-FR4 kovalent miteinander in der genannten Reihenfolge verbunden sind, und eine leichte Kette umfasst, wobei die variable Region von besagter leichten Kette Gerüstpeptide der leichten Kette (L-FR) und Peptide der komplementaritätsbestimmenden Regionen der leichten Kette (L-CDR) umfasst, wobei L-FR1, L-CDR1, L-FR2, L-CDR2, L-FR3, L-CDR3, L-FR4 kovalent miteinander in der genannten Reihenfolge verbunden sind, worin H-FR-1 SEQ ID NO: 1 ist, H-FR-2 ist SEQ ID NO: 2, H-FR-3 ist SEQ ID NO: 3, H-FR-4 ist SEQ ID NO: 4, L-FR-1 ist SEQ ID NO: 5, L-FR-2 ist SEQ ID NO: 6, L-FR-3 ist SEQ ID NO: 7 und L-FR-4 ist SEQ ID NO: 8.
Ein Antikörper gemäß Anspruch 11, der durch die Tatsache gekennzeichnet ist, dass er als variable Region der schweren Kette ein Polypeptid umfasst, das die Sequenz umfasst, die in der beigefügten Sequenzauflistung als SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45 oder SEQ ID NO: 47 aufgelistet ist, und respektive als variable Region der leichten Kette ein Polypeptid, das die Sequenzen umfasst, die in der beigefügten Sequenzauflistung als SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46 oder SEQ ID NO: 48 aufgelistet sind.
Ein Antikörper gemäß Anspruch 11, worin besagter Antikörper ein scFv, FAB, Fv, dAb, IgG oder IgA ist.
Ein Antikörper gemäß Anspruch 12, worin besagter Antikörper ein scFv, FAB, IgG oder IgA ist.
Ein Antikörper gemäß Anspruch 13 oder 14, worin besagter Antikörper ein scFV ist und die Polypeptide, die als variable Region der schweren Kette und der leichten Kette mit umfasst sind, durch einen Linker verbunden sind.
Ein Antikörper gemäß Anspruch 15, worin besagter Linker die Sequenz umfasst, die in der beigefügten Sequenzauflistung in SEQ ID NO: 51 aufgezeigt wird.
Ein Verfahren zur Gewinnung eines Antikörpers gemäß einem der Ansprüche 11–16 mit einer Bindungsspezifität für ein vorbestimmtes Antigen, das die folgenden Schritte umfasst: – die Herstellung eines Antikörpers, der als eine variable Region der schweren Kette das Polypeptid aufweist, das Gerüstpeptide der schweren Kette (H-FR) und Peptide der komplementaritätsbestimmenden Regionen der schweren Kette (H-CDR) gemäß den Ansprüchen 1 – 3 umfasst, und als eine variable Region der leichten Kette das Polypeptid, das die Gerüstpeptide der leichten Kette (L-FR) und die Peptide der komplementaritätsbestimmenden Regionen der leichten Kette (L-CDR) gemäß den Ansprüchen 1 – 3 umfasst; – das in Kontakt bringen von besagtem Antikörper mit besagtem Antigen und – das Auswählen des Antikörpers, der besagtes Antigen bindet.
Ein Polypeptid, das durch die Tatsache gekennzeichnet ist, dass es für ein Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 – 4 kodiert.
Ein Polypeptid, das durch die Tatsache gekennzeichnet ist, dass es für ein Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 9 und 10 kodiert.
Ein Polynukleotid gemäß Anspruch 18, das eine Sequenz umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den Sequenzen besteht, die in der beigefügten Sequenzauflistung als SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93 und SEQ ID NO: 95 gezeigt werden.
Ein Polypeptid, das durch die Tatsache gekennzeichnet ist, dass es für einen Antikörper gemäß einem der Ansprüche 11–16 kodiert.
Ein Polynukleotid gemäß Anspruch 21, das eine Sequenz umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den Sequenzen besteht, die in der beigefügten Sequenzauflistung als SEQ ID NO: 84 bis SEQ ID NO: 86 gezeigt werden.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die durch die Tatsache gekennzeichnet ist, dass sie als ein aktives Mittel eine therapeutisch wirksame Menge eines Antikörpers gemäß einem der Ansprüche 11–16 zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Trägermittel oder Hilfsstoff umfasst.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die durch die Tatsache gekennzeichnet ist, dass sie als ein aktives Mittel eine therapeutisch wirksame Menge der Polynukleotide gemäß einem der Ansprüche 18 – 22 zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Trägermittel oder Hilfsstoff umfasst.
Der Antikörper gemäß einem der Ansprüche 11–16 zur Verwendung als ein Medikament.
Verwendung des Antikörpers gemäß einem der Ansprüche 11–16 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Pathologien, die mit der Anhäufung eines Moleküls innerhalb oder außerhalb einer menschlichen oder tierischen Zelle assoziiert sind.
Ein Polynukleotid gemäß einem der Ansprüche 18 – 22 zur Verwendung als ein Medikament.
Verwendung des Polynukleotids gemäß einem der Ansprüche 18 – 22 zur Herstellung eines Medikaments zur Gentherapie von Pathologien, die mit der Anhäufung eines Moleküls innerhalb oder außerhalb einer menschlichen oder tierischen Zelle assoziiert sind.
Verwendung der Antikörper gemäß einem der Ansprüche 11–16 und/oder der Polynukleotide gemäß einem der Ansprüche 18 – 22 zur in-vitro-Diagnose von Pathologien, die mit der Anhäufung eines Moleküls innerhalb oder außerhalb einer menschlichen, tierischen oder pflanzlichen Zelle assoziiert sind.
Ein diagnostisches Kit, das als ein Reagenz einen Antikörper gemäß einem der Ansprüche 11–16 und/oder die Polynukleotide gemäß einem der Ansprüche 18 – 22 umfasst.
Ein diagnostisches Kit, das als ein Reagenz ein Peptid gemäß Anspruch 9 oder 10 umfasst.
Verwendung eines Antikörpers gemäß einem der Ansprüche 11–16 und/oder eines Polynukleotid gemäß Anspruch 18 – 22 zur Behandlung von Pathologien, die mit der Anhäufung eines Moleküls innerhalb oder außerhalb einer pflanzlichen Zelle assoziiert sind.