DE3880194T2

DE3880194T2 - Zyklisches antikoagulierendes peptid.

Info

Publication number: DE3880194T2
Application number: DE8888108047T
Authority: DE
Inventors: John L Krstenansky; Simon J T Mao
Original assignee: Merrell Dow Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Aventis Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1987-05-21
Filing date: 1988-05-19
Publication date: 1993-08-26
Anticipated expiration: 2008-05-20
Also published as: DK278588D0; HU198512B; JP2598302B2; AU1634388A; IL86439A0; EP0291981A2; CA1328540C; IL86439A; FI89064C; CN88103009A; ES2054732T3; DK278588A; KR880013977A; DE3880194D1; NO882239D0; PT87537A; FI882359A; ATE88190T1; NZ224677A; ZA883444B

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue cyclische Peptide, welche nützliche gerinnungshemmende Stoffe sind.
Gerinnungshemmer sind nützliche therapeutische Stoffe in der pharmakologischen Behandlung von, zum Beispiel, akuter tiefer Venenthrombose, Lungenembolie, akuter arterieller Verschlußkrankheit der Gliedmaßen, Herzinfarkt und disseminiertem intravaskulärem Koagulations-Syndrom. Von der prophylaktischen Verabreichung von Gerinnngshemmern glaubt man, daß es das erneute Auftreten von Gefäßverschlüssen bei Patienten mit rheumatischen Erkrankungen oder arteriosklerotischen Herzleiden verhindert und das es gewisse thromboembolische Komplikationen bei Operationen verhindert. Die Verabreichung von Gerinnungshemmern ist auch angezeigt bei der Behandlung von Koronararterienerkrankung und Gefäßleiden des Gehirns. Arterielle Thrombose, besonders in Arterien, die den Herzmuskel und das Gehirn versorgen, ist eine Haupttodesursache.
Hirudin ist ein 65-Reste-Polypeptid, welches aus Speicheldrüsen von Blutegeln isoliert wird. Es ist ein gerinnungshemmender Stoff, welcher ein Thrombinspezifischer Hemmstoff ist. Obwohl Hirudin ziemlich wirksam ist, scheint der klinische Gebrauch von Hirudin aus Blutegeiextrakten, auf Grund seiner begrenzten Verfügbarkeit, seiner aufwendigen Herstellung und der allergischen Reaktionen, die gewöhnlich der Verabreichung von Proteinen diese Größe folgen, unwahrscheinlich.
Die Anmelder haben eine spezifische Region des Hirudins entdeckt, die zumindest zum Teil für seine gerinnungshemmende Aktivität verantwortlich ist. Diese Region ist chemisch synthetisiert worden und bestimmte cyclische Analoga davon scheinen an die Erkennungsstelle des Thrombins zu binden, aber nicht an die enzymatische Spaltstelle, die räumlich davon getrennt ist. Die Bindung des synthetischen Proteins verhindert kompetitiv die Bindung von Fibrinogen an der Erkennungsstelle des Thrombins, eine Voraussetzung für die Produktion von Fibrin und Gerinselbildung. Die Peptide dieser Erfindung besitzen signifikante gerinnungshemmende Aktivität und ihre ungewöhnliche Fähigkeit, nur an die Erkennungsstelle und nicht an die Spaltstelle des Thrombins zu binden, könnte einen wissenschaftlich interessanten und therapeutisch signifikanten Zusatz für die gerinnungshemmende Therapie ermöglichen.
Die vorliegende Erfindung betrifft Derivate des Hirudins mit der Strukturformel 1:
in der X einen aminoterminalen Rest, ausgewählt aus Wasserstoff, einem oder zwei Alkylresten mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, einem oder zwei Acylresten mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen, Carbobenzyloxy- oder tert.-Butyloxycarbonylgruppen bedeutet;
A&sub1; eine Bindung ist, oder ein Peptid mit 1 bis 5 Resten irgendeiner Aminosäure darstellt;
A&sub2; eine der Gruppen Phe, SubPhe (mono- oder disubstituiertes Phenylalanin), β-(2- und 3-Thienyl)-alanin; β-(2- und 3-Furanyl)- alanin, β-(2-, 3- und 4-Pyridyl)-alanin, β-(Benzothien - 2- und 3-yl)- alanin, β-(1- und 2-Naphthyl)-alanin, Tyr oder Trp bedeutet;
A&sub3; Glu oder Asp ist;
A&sub4; irgendeine Aminosäure ist;
A&sub5; Ile, Val, Leu, Nie oder Thr bedeutet;
A&sub7; irgendeine Aminosäure ist;
A&sub8; irgendeine Aminosäure ist;
A&sub1;&sub0; eine lipophile Aminosäure, ausgewählt aus Tyr, Tyr(SO&sub3;H), Trp, Phe, Leu, Nle, Ile, Val, His und Pro bedeutet oder ein mindestens eine dieser lipophilen Aminosäuren enthaltendes Dipeptid ist;
A&sub1;&sub1; eine Bindung ist oder ein Peptidfragment mit 1 bis 5 Resten irgendwelcher Aminosäuren darstellt;
Y einen carboxyterinalen Rest, ausgewählt aus OH,(C&sub1;-C&sub6;)-Alkoxy-, Amino-, Mono- oder Di-(C&sub1;-C&sub4;)alkylsubstituierten Amino- oder Benzylaminogruppen bedeutet:
R, R', R&sub1; und R&sub1;' jeweils ausgewählt sind aus Wasserstoffatomen oder (C&sub1;-C&sub4;)-Alkylresten;
B ausgewählt ist aus -S-, oder -S-S- oder -S-Alk&sub3;-S- und
Alk&sub1;, Alk&sub2; und Alk&sub3; jeweils ausgewählt sind aus (C&sub1;-C&sub8;)-Methylen- oder Ethylengruppen:
und wobei D" und "L" anzeigen, daß die Stereochemie am angegebenen Kohlenstoffatom diejenige ist, die dem D-Cystein bzw. L-Cystein entspricht: die Erfindung betrifft ferner die Dimeren dieser Peptidderivate und ihre Gemische sowie die Verwendung dieser Peptidderivate. Dimeren und Gemische davon als gerinnungshemmende Mittel.
Die folgenden geläufigen Abkürzungen von Aminosäuren werden in dieser Patentschrift gebraucht:
Gly - Glycin
Ala - Alanin
Val-Valin
Leu - Leucin
Ile - Isoleucin
Pro - Prolin
Phe - Phenylalanin
Trp - Tryptophan
Met - Methionin
Ser-Serin
Thr - Threonin
Cys - Cystein
Tyr - Tyrosin
Asn - Asparagin
Gln - Glutamin
Asp - Asparaginsäure
Glu - Glutaminsäure
Lys - Lysin
Arg - Arginin
His - Histidin
Nle - Norleucin
Hyp - Hydroxyprolin
3,4-DehydroPro - 3,4-Dehydroprolin
Tyr(SO&sub3;H) - Tyrosinsulfat
Pgl - Phenylglycin
NMePgl - N-Methylphenylglycin
Sar - Sarkosin (N-Methylglycin)
pSubPhe - para-substituiertes Phenylalanin
SubPhe - substituierte Phenylalanine
DAla - D-Alanin
Ac - Acetyl-Rest
Suc - Succinyl-Rest
pClPhe - para-Chlonphenylalanin
pNO&sub2;Phe - para-Nitrophenylalanin
Pen - Penicillamin (β,β-Dimethylcystein)
DCys - D-Cystein
Ein Alkylrest und der Alkylteil eines Alkoxyrestes kann ein geradkettiger, verzweigter oder cyclischer Alkylrest, zum Beispiel eine Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Isopropyl-, Butyl-, Isobutyl-, tert.-Butyl-, Pentyl-, Isopentyl-, sek.-Pentyl-, Cyclopentyi-, Hexyl-, Isohexyl-, Cyclohexyl- oder Cyclopentylmethylgruppe sein. Ein Acylrest mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen kann ein geradkettiger, verzweigter, cyclischer, gesättigter oder ungesättigter Acylrest sein, welcher 1 oder 2 Carbonyleinheiten pro Rest enthält. zum Beispiel eine Acetyl-, Benzoyl- oder Succinylgruppe. Der Ausdruck "eine (C&sub1;-C&sub8;)-Methylen- oder Ethylengruppe" verweist auf eine bivalente Gruppe, welche sich von einem acyclischen oder cyclischen, gesättigten oder ungesättigten Alkylrest mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen durch bildliches Entfernen von zwei Wasserstoffatomen von einem der Kohlenstoffatome oder von zwei benachbarten Kohlenstoffatomen des Alkylrests herleitet. Beispiele des (C&sub1;-C&sub8;)-Methylen- oder Ethylenrests in dieser Erfindung sind Methylen- oder Methyliden- (-CH&sub2;-), Ethyliden- (CH&sub3;CH< ), 1-Methylethyliden- (CH&sub3;C(CH&sub3;)< ), 1-Methylpropyliden- oder sek.-Butyliden- (CH&sub3;CH&sub2;C(CH&sub3;)< ), 2,2-Dimethylpropyliden- oder Neopentyliden- (CH&sub3;C(CH&sub3;)&sub2;CH< ), Ethylen- oder Dimethylen- (-CH&sub2;-CH&sub2; ), Methylethylen- (-CH&sub2;CH(CH&sub3;)-), Ethylethyien- (-CH&sub2;CH(C&sub2;H&sub5;)-), Ethenylen- oder Vinylen- (-CH=CH-), 1,1-Ethenyliden- (CH&sub2;=C< ), 1,1-Cyclohexyliden- (C&sub6;H&sub1;&sub0;< )- und 1,2-Cyclopentyliden (C&sub5;H&sub8;< )gruppen. Eine Halogengruppe bedeutet eine Fluor-, Chlor-, Brom- oder Iodgruppe.
Der Ausdruck "irgendeine Aminosäuren, wie er hier verwendet wird, beinhaltet die natürlich vorkommenden Aminosäuren wie auch andere "nichtproteinische" α-Aminosäuren, die allgemein auf dem Fachgebiet der Peptidchemie verwendet werden, wenn man synthetische Analoga von natürlich vorkommenden Peptiden herstellt. Die natürlich vorkommenden Aminosäuren sind Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Serin, Methionin, Threonin, Phenylalanin, Thyrosin, Tryptophan, Cystein, Prolin, Histidin, Asparaginsäure, Asparagin, Glutaminsäure, Glutamin, Arginin, Ornithin und Lysin. Beispiele für "nichtproteinische" α-Aminosäuren sind Norleucin, Norvalin, Alloisoleucin, Homoarginin, Thiaprolin, Dehydroprolin, Mydroxyprolin (Hyp), Homoserin, Cyclohexylglycin (Chg), α-Amino-n-buttersäure (Aba), Cyclohexylalanin (Cha), Aminophenylbuttersäure (Pba), in der ortho-, meta- oder para-Position des Phenylrests mit (C&sub1;-C&sub4;)-Alkyl-, (C&sub1;-C&sub4;)-Alkoxy-, Halogen- oder Nitrogruppen oder mit einer Methylendioxygruppe mono- oder disubstituierte Phenylalanine, β-(2- und 3-Thienyl)alanin. β-(2- und 3-Furanyl)alanin, β-(2-, 3- und 4-Pyridyl)alanin, β-(Benzothienyl-2- und 3-yl)alanin, β-(1- und 2-Naphthyl)alanin, O-alkylierte Derivate von Serin, Threonin oder Tyrosin, S-alkyliertes Cystein der O- Sulfatester von Tyrosin, 3,3-Diiodtyrosin und die D-Isomere der natürlich vorkommenden Aminosäuren.
Der Ausdruck "lipophile Aminosäure" beinhaltet Tyr, Tyr(SO&sub3;H), Phe, Leu, Nie, Ile, Val, His und Pro.
Die natürlich vorkommenden Aminosäuren mit Ausnahme von Glycin enthalten ein chirales Kohlenstoffatom. Soweit nicht anderweitig speziell angegeben, handelt es sich bei den hier angegebenen Aminosäuren um die L- Konfiguration. Zum Beispiel kann jede der Aminosäuren der A&sub1; oder A&sub1;&sub0; Gruppe die D- oder L-Konfiguration besitzen. Wie üblich, ist die Struktur der hier beschriebenen Peptide so, daß das aminoterminale Ende auf der linken Seite der Kette und das carboxyterminale Ende auf der rechten Seite der Kette ist.
Der Ausdruck "Dimere" bezeichnet jene Peptide, die aus der direkten Verknüpfung von zwei separaten linearen Peptiden während des Cyclisierungsschritts entweder in Kopf zu Kopf oder Kopf zu Schwanz-Weise entstehen. Im Verlauf der Durchführung der gewünschten internen Cyclisierung über die "B"-Gruppe, verbinden sich einige der linearen Peptide des Ausgangsmaterials mit einem anderen linearen Peptid des Ausgangsmaterials statt mit sich selbst. Das entstehende Produkt ist ein "Dimer" in dem Sinne, daß es aus zwei linearen Ausgangspeptiden aufgebaut ist, aber es ist kein Dimer in dem Sinne, daß die Molekülformel des Dimers genau das Doppelte der Molekülformel des Monomeren ist. Ein Dimer der erfindungsgemäßen Peptidderivate hat folgende Strukturformel: Kopf zu Schwanz-Dimer Kopf zu Kopf-Dimer
wobei die Substituenten wie vorstehend für Struktur 1 definiert sind. Die hier verwendete Bezeichnung"Peptidderivate" schließt die Dimeren und Gemische ein, soweit es sich aus dem Zusammenhang nicht anders ergibt. Während die Gemische von Monomer und Dimer, die aus dem Cyclisierungsschritt resultieren, leicht durch dem Fachmann bekannte Maßnahmen getrennt werden können, ist es möglich die Gemische in den gerinnungshemmenden Mitteln dieser Erfindung ohne Trennung zu verwenden.
Die Polypeptide der Formel 1 können mit beliebigen nichttoxischen, organischen oder anorganischen Säuren pharmazeutisch verträgliche Salze bilden. Beispiele für anorganische Säuren, welche geeignete Salze liefern, sind Chlorwasserstoff-, Bromwasserstoff-, Schwefel- und Phosphorsäure und saure Metallsalze, wie Natriummonohydrogenorthophospat und Kaliumhydrogensulfat. Beispiele für organische Säuren, welche geeignete Salzliefern, sind die Mono-, Di- und Tricarbonsäuren. Beispiele für solche Säuren sind Essig-, Glycol-, Milch-, Pyruvin-, Malon-, Bernstein-, Glutar-, Fumar-, Äpfel-, Wein-, Zitronen-, Ascorbin-, Malein-, Hydroxymalein-, Benzoe-, Hydroxybenzoe-, Phenylessig-, Zimt-, Salicyl-, 2-Phenoxybenzoesäure und Sulfonsäuren, wie Methansulfonsäure und 2- Hydroxyethansulfonsäure. Salze der carboxyterminalen Aminosäureeinheit schließen nichttoxische Carbonsäuresalze ein, welche mit beliebigen geeigneten anorganischen oder organischen Basen gebildet werden. Beispiele für diese Salze sind solche von Alkalimetallen, wie Natrium oder Kalium; von Erdalkalimetallen, wie Kalzium und Magnesium; von Leichtmetallen der Gruppe IIIA, einschließlich Aluminium; und von organischen primären, sekundären und tertiären Aminen, wie zum Beispiel Trialkylaminen, einschließlich Triethylamin, Procain, Dibenzylamin, 1- Ethenamin, N,N'-Dibenzylethylendiamin, Dihydro-abietylamin, N-(Nieder)- Alkylpiperidin und von anderen geeigneten Aminen.
Wie bei jeder allgemeinen Klasse von chemischen Verbindungen werden bestimmte Vertreter bevorzugt. Die Anmelder bevorzugen solche Peptidderivate der Formel 1, worin
X ein Wasserstoffatom, eine Acetyl- oder Succinylgruppe ist.
Ebenfalls bevorzugt sind solche Verbindungen der Formel 1, worin oder eine Bindung ist.
A&sub2; vorzugsweise Phe, β-(2- oder 3-Thienyl)alanin, Tyr, Trp oder pClPhe ist;
A&sub3; Glu;
A&sub4; Glu, Asp, Pro oder Ala
A&sub5; Ile:
A&sub7; Glu, Asp oder Ala:
A&sub8; Glu oder Asp;
A&sub1;&sub0; Leu;
A&sub1;&sub1; Pro, Gln, Asp oder Asp-Glu;
Alk&sub1; und Alk&sub2; jeweils eine Methylengruppe;
Y OH oder NH&sub2; und
B -S-S- ist.
Besonders bevorzugt sind solche Peptidderivate der Formel 1, worin entweder X eine Acetylgruppe und A&sub1; Gly-Asp oder Asp ist oder X eine Succinylgruppe und A&sub1; eine Bindung ist und worin
A&sub2; Phe, β-(2-Thienyl)alanin oder Tyr ist;
A&sub3; Glu;
A&sub4; Glu oder Pro;
A&sub5; Ile;
A&sub7; Glu;
A&sub8; Glu oder Asp;
A&sub9; Tyr, Ala-Tyr oder Glu-Leu;
A&sub1;&sub0; -Leu-Gln- oder -Asp-Glu-;
A&sub1;&sub1; Pro, Gln, Asp oder Asp-Glu;
R, R', R" jeweils ein Wasserstoffatom;
Alk&sub1; und Alk&sub2; jeweils eine Methylengruppe;
B -S-S- und
Y OH ist.
Die Peptide dieser Erfindung können durch eine Reihe von Verfahren, welche dem Fachmann ohne weiteres bekannt sind, hergestellt werden. Solche Verfahren schließen die sequenzielle Festphasen und Block-Synthese, das Klonen von Genen und die Kombination dieser Techniken ein. Die sequenzielle Festphasentechnik kann mit Hilfe der etablierten automatisierten Methoden, wie durch den Gebrauch eines automatischen Peptid-"Synthesizer", durchgeführt werden. In diesem Verfahren wird eine am α-Aminoende geschützte Aminosäure an eine Trägerharz gebunden. Das verwendete Trägerharz kann jedes geeignete Harz sein, das herkömmlich auf dem Fachgebiet für die Festphasen-Herstellung von Polypeptiden verwandt wird, vorzugsweise Polystyrol, welches mit 0,5 bis etwa 3% Divinylbenzol vernetzt ist, und welches entweder chlormethyliert oder hydroxymethyliert worden ist, um Stellen für die Esterbildung mit der anfänglich eingebrachten α-amingeschützten Aminosäure zu schaffen.
Ein Beispiel für ein Hydroxymethyl-Harz wird von Bodanszky et al., Chem. Ind. (London) 38, 1597-98 (1966) beschrieben. Ein chlormethyliertes Harz ist im Handel erhältlich von Bio Rad Laboratories, Richmond, California. und die Herstellung eines solchen Harzes wird durch Stewart et al., "Solid phase Peptide Synthesis" (Freeman & Co., San Francisco 1969), Kapitel 1, Seite 1-6 beschrieben. Die geschützte Aminosäure kann an das Harz durch das Verfahren von Gisi, Helv. Chem. Acta. 56,1476 (1973) gebunden werden. Viele harzgebundene, geschützte Aminosäuren sind im Handel erhältlich. Beispielsweise kann für die Herstellung eines erfindungsgemäßen Polypeptids, worin das carboxyterminale Ende eine Thr- Gruppe ist ein durch eine tert.-Butyloxycarbonylgruppe (Boc) geschütztes Thr, welches an ein benzylienes, hydroxymethyliertes Phenylacetamidomethyl-Harz (PAM) gebunden ist, verwendet werden. Dieses Harz ist im Handel erhältlich.
Nach der Bindung einer am α-Aminoende geschützten Aminosäure an ein Trägerharz, wird die Schutzgruppe durch ein geeignetes Verfahren, wie durch Verwendung von Trifluoressigsäure in Methylenchlorid, Trifluoressigsäure alleine oder HCl in Dioxan, entfernt. Das Entfernen der Schutzgruppe wird bei Temperaturen zwischen 0ºC und Raumtemperatur ausgeführt. Andere, übliche Spaltungsreagentien und Bedingungen für die Entfernung von spezifischen α-Aminoschutzgruppen können verwendet werden. Nach der Entfernung der α- Aminoschutzgruppe werden die anderen aminogeschützten Aminosäuren schrittweise in der gewünschten Reihenfolge angebunden. Alternativ dazu können Mehrfach-Aminosäuregruppen durch das Lösungsmittelverfahren verknüpft werden, ehe man sie mit der an das Trägerharz gebundenen Aminosäuresequenz verknüpft.
Die α-Aminoschutzgruppe, die bei jeder in die Polypeptidkette eingeführten Aminosäure verwandt wird, kann jede im Fachgebiet bekannte sein. Unter den in Frage kommenden Klassen von α-Aminoschutzgruppen sind (1) Schutzgruppen vom Acyl-Typ, wie: Formyl-, Trifluoracetyl-, Phthalyl-, Toluolsulfonyl- (Tosyl-), Berizolsulfonyl-, Nitrophenylsulfenyl-, Tritylsulfenyl-, o-Nitrophenoxyacetyl- und α- Chlorbutyrylgruppen: (2) Schutzgruppen vom Typ aromatischer Urethane, wie Benzyloxycarbonyl und substituierte Benzyloxycarbonylreste, wie p-Chlorbenzyloxycarbonyl-, p-Nitrobenzyloxycarbonyl-, p-Brombenzyloxycarbonyl-, p-Methoxybenzyloxycarbonyl-, 1-(p-Biphenylyl)-1-methylethoxycarbonyl-, α,α-Di-methyl-3,5-dimethoxybenzyloxycarbonyl- und Benzhydryloxycarbonylgruppen: (3) Schutzgruppen vom Typ aliphatischer Urethane. wie tert.- Butyloxycarbonyl- (Boc), Diisopropylmethoxycarbonyl-, Isopropyloxycarbonyl-, Ethoxycarbonyl- und Allyloxycarbonylgruppen: (4) Schutzgruppen vom Cycloalkyl-Urethane-Typ , wie Cyclopentyloxycarbonyl-, Adamantyloxycarbonyl- und Cyclohexyloxycarbonylgruppen: (5) Schutzgruppen vom Typ der Thiourethane, wie Phenylthiocarbonylgruppen: (6) Schutzgruppen vom Alkylrest-Typ, wie Triphenylmethyl- (Trityl-) und Benzylgruppen; und (7) Trialkylsilanreste wie Trimethylsilan. Die bevorzugte α-Aminoschutzgruppe ist die tert.- Butyloxycarbonylgruppe.
Die Auswahl eines geeigneten Verknüpfungsreagenz ist dem Fachmann geläufig. Ein besonders geeignetes Verknüpfungsreagenz, wenn die anzufügende Aminosäure Gln Asn oder Arg ist, ist N,N'-Diisopropylcarbodiimid und 1-Hydroxybenzotriazol. Die Verwendung dieser Reagentien verhindert die Bildung von Nitrilen und Lactamen. Andere Verknüpfungsreagenzien sind (1) Carbodiimide (z. B. N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid und N-Ethyl-N'-(γ-dimethylaminopropylcarbodiimid); (2) Cyanamide (z.B. N,N-Dibenzylcyanamid); (3) Ketenimine; (4) Isoxazoniumsalze (z. B. N-Ethyl-5-phenylisoxazonium-3'-sulfonat); (5) monocyclischen Stickstoff enthaltende, heterocyclische Amide von aromatischem Charakter, welche ein bis vier Stickstoffatome im Ring enthalten, wie Imidazolide, Pyrazolide und 1,2,4-Triazolide. Beispiele für besonders geeignete heterocyclische Amide sind N,N'-Carbonyldiimidazol und N,N-Carbonyl-di-1,2,4-triazol: (6) alkoxylierte Acetylene (z.B. Ethoxyacetylen); (7) Reagentien, die mit der Carboxyl- Einheit der Aminosäure gemischte Anhydride bilden (z.B. Ethylchlorformiat und Isobutylchlorformiat) oder die symmetrischen Anhydride der zu koppelnden Aminosäuren (z. B. Boc-Ala-O-Ala-Boc) und (8) Stickstoff enthaltende, heterocyclische Verbindungen, die eine Hydroxylgruppe an einem Ring- Stickstoffatom tragen (z.B. N-Hydroxyphthalimid, N-Hydroxysuccinimid und 1- Hydroxybenzotriazol). Andere Aktivierungsreagenzien und ihre Verwendung in der Peptid-Verknüpfung werden von Kapoor, J. Pharm. Sci.. 59, Seite 1-27 (1970) beschrieben. Die Anmelder bevorzugen die Verwendung von symmetrischen Anhydriden als Verknüpfungsreagenz für alle Aminosäuren außer Arg, Asn und Gln.
Jede geschützte Aminosäure oder Aminosäuresequenz wird in den Festphasenreaktor in ungefähr 4-fachem Überschuß eingebracht und die Kopplung wird in einem Medium aus Dimethylformamid : Methylenchlorid (1:1) oder in Dimethylformamid alleine oder vorzugsweise Methylenchlorid alleine ausgefuhrt. In Fallen, in denen unvollstandige Kopplung auftritt, wird das Verknüpfungsverfahren wiederholt, bevor man die α-Aminoschutzgruppe entfernt und vor der Kopplung der nächsten Aminosäure im Festphasenreaktor. Der Erfolg der Verknüpfungsreaktion bei jedem Schritt der Synthese wird durch die Ninhydrin-Reaktion nach E.Kaiser et al.. Analyt. Biochem. 34, 595 (1970) überwacht.
Nachdem die gewünschte Aminosäuresequenz erhalten worden ist, wird das Peptid vom Harz entfernt. Das kann durch Hydrolyse, wie durch die Behandlung des harzgebundenen Polypeptids mit einer Lösung von Dimethylsulfid. p-Kresol und Thiokresol in verdünnter wässriger Fluorwasserstoffsäure geschehen.
Wie auf dem Fachgebiet der Festphasen-Peptidsynthese bekannt ist, tragen viele der Aminosäuren funktionelle Gruppen, die einen Schutz während des Ketten-Autbaus benötigen. Die Verwendung und die Auswahl einer geeigneten Schutzgruppe liegt innerhalb der Fähigkeit des Fachmanns und hängt von der zu schützenden Aminosäure und der Anwesenheit anderer geschützter Aminosäurereste am Peptid ab. Die Auswahl einer solchen Seitenketten- Schutzgruppe ist kritisch. weil diese nicht während der Abspaltung der Schutzgruppe des α-Amino-Restes abgespalten werden darf. Zum Beispiel sind brauchbare Seitenketten-Schutzgruppen für Lysin Benzyloxycarbonyl- und substituierte Benzyloxycarbonylreste, wobei die Substituenten aus Halogen- (z.B., Chlor, Brom, Fluor) und Nitro- (z.B., 2-Chlorbenzyloxycarbonyl-, p-Nitrobenzyloxycarbonyl-,3,4-Dichlorbenzyloxycarbonylgruppe), Tosyl-, t-Amyloxycarbonyl-, t-Butyloxycarbonyl und Diisopropylmethoxycarbonylgruppen ausgewählt werden können. Die alkoholische Hydroxylgruppe von Threonin und Serin kann mit einer Acetyl-, Benzoyl-, tert.-Butyl-, Trityl-, Benzyl-, 2,6-Dichlorbenzyl- oder Benzyloxycarbonylgruppe geschützt werden. Die bevorzugte Schutzgruppe ist die Benzylgruppe.
Diese Gruppen können durch auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren entfernt werden. Typischerweise wird die Entfernung der Schutzgruppen nach der kompletten Peptidketten-Synthese durchgeführt, aber die Schutzgruppen können auch zu jeder anderen geeigneten Zeit abgespalten werden.
Im allgemeinen werden die cyclischen Peptide ausgehend von einem geeigneten linearen Derivat entweder vor oder nach dem Abspalten des linearen Peptids vom festen Träger hergestellt. Die Verbindungen der Formel 1, worin B eine -S-S- Gruppe ist, werden aus dem entsprechenden freien Sulfhydryl-haltigen, linearen Peptid durch bekannte oxidative Verknüpfungstechniken, wie durch Oxidation des linearen Peptids mit Kaliumhexacyanoferrat hergestellt, beschrieben zum Beispiel von Stewart et al., in "Solid Phase Peptide Synthesis" (Freeman & Co., San Francisco 1969), Kapitel 1, Seite 95 . Die Verbindungen von Formel 1 worin B eine -S-Alk&sub3;-S- Gruppe und Alk&sub3; eine (C&sub1;-C&sub8;)Ethylen-Gruppe ist, können aus den freien Sulfhydryl-haltigen linearen Peptiden durch Umsetzung mit einem 1,2-Dibrom-Derivat eines geeigneten acyclischen oder cyclischen, gesättigten oder ungesättigten Alkyl-Rest analog zu der in H. I. Mosberg und J. R. Omnaas, J. Amer. Chem. Soc. 107, 2986-2987 (1985) beschriebenen Methode hergestellt werden. Die Verbindungen der Formel 1 worin B eine -S-Alk&sub3;-S- Gruppe und Alk&sub3; eine (C&sub1;-C&sub8;)Methylen-Gruppe ist, werden aus den freien Sulfhydryl-haltigen linearen Peptiden durch Umsetzung mit einem geeigneten acyclischen oder cyclischen, gesättigten oder ungesättigten Alkylketon oder - aldehyd analog zu der in J. Amer. Chem. Soc. 76, 1945 (1954) beschriebenen Methode hergestellt. Die Herstellung solcher Verbindungen der Formel 1 worin B eine -S- Gruppe ist, kann in der Weise bewirkt werden, wie sie bei K. Jost, Collect. Czech. Chem. Commun. 36, 218 (1971) und in der US-PS Nr. 4 161 521 dargelegt wird.
Die gerinnungshemmende Dosis eines erfindungsgemäßen Peptidderivats beträgt 0,2 mg/kg bis 250 mg/kg Körpergewicht pro Tag je nach Patient, Ausmaß der Thrombose, die behandelt werden soll, und dem ausgewählten Peptid-Derivat. Die geeignete Dosis für einen bestimmten Patienten kann ohne weiteres bestimmt werden. Vorzugsweise werden typischerweise 1 bis 4 Dosen täglich mit jeweils 5 mg bis 100 mg aktiver Verbindung verabreicht.
Die gerinnungshemmende Therapie ist indiziert für die Behandlung und die Vorsorge einer Reihe von Gerinnungsituationen, besonders koronarer und cerebrovaskulärer Gefäßerkrankung. Fachleute auf diesem Gebiet kennen ohne weiteres die Umstände, die eine gerinnungshemmende Therapie erfordert. Der hier gebrauchte Ausdruck "Patient" bezieht sich auf Säuger, wie Primaten einschließlich des Menschen, Schafe, Pferde, Rinder, Schweine, Hunde, Katzen, Ratten und Mäuse.
Obwohl einige der Peptid-Derivate die Passage durch den Darm nach oraler Verabreichung überleben, bevorzugen die Anmelder die nicht-orale Verabreichung, zum Beispiel subkutan, intravenös, intramuskulär oder intraperitoneal; Verabreichung durch eine Depot-Spritze; Abgabe durch implantate; oder durch Aufbringen auf Schleimhäute, wie der Nase, des Rachens und der Bronchien, beispielsweise durch einen Aerosol-Behälter, der ein Peptid-Derivat dieser Erfindung in einer Spray- oder in Trockenpuderform enthält.
Für eine parenterale Verabreichung können die Verbindungen als injizierbare Dosen einer Lösung oder Suspension der Verbindung in einem physiologisch verträglichen Verdünnungsmittel mit einem pharmazeutischen Träger verordnet werden, welcher eine sterile Flüssigkeit, wie Wasser und Öle mit oder ohne Zugabe eines Netzmittels und anderer pharmazeutisch verträglicher Hilfsstoffe sein kann. Beispiele für Öle, welche in diesen Zubereitungen verwendet werden können, sind fossile, tierische, pflanzliche oder synthetische Öle beispielsweise Erdnußöl, Soyabohnenöl und Mineralöl. Im allgemeinen sind Wasser, Kochsalzlösung wässrige Dextrose und verwandte Zuckerlösungen, Ethanol und Glykole, wie Propyienglykol oder Polyethylenglykol, als flüssige Träger, besonders für Injektionslösungen, bevorzugt.
Die Verbindungen können in der Form von Depotinjektionen oder als Implantate verabreicht werden, die so formuliert sein können, daß sie eine verzögerte Abgabe des Wirkstoffs erlauben. Der Wirkstoff kann in Kügelchen oder kleine Zylinder gepreßt werden und subkutan oder intramuskulär als Depotinjektion oder Implantat eingepflanzt werden. Implantate können aus inerten Materialien, wie biologisch abbaubaren Polymeren oder synthetischen Silikonen, beispielsweise Silastik, Silikongummi, welcher von der Dow-Corning Corporation hergestellt wird, bestehen.
Die Erfindung wird durch die folgenden, nicht einschränkenden Beispiele veranschaulicht.

BEISPIEL 1

Darstellung von
Das Peptid wurde nach dem Festphasenverfahren unter Verwendung von 0,1 mmol eines 0,66 mmol/g Boc-Gln-PAM Harzes hergestellt. Doppelt symmetrische Anhydrid-Kopplungen wurden mit 2,0 mmol Na-Boc-Aminosäure (Peptides international), außer im Fall von Boc-Gln, welches durch das DCC/HOBT- Verfahren gekoppelt wurde, ausgeführt. Als Seitenkettenschutz wurde verwendet: Asp (Chx), Cys (pMeBzl), Glu(Bzl). Nach dem Abschluß der Synthese wurde der Na-Boc Schutz mit 50% Trifluoressigsäure in Methylenchlorid entfernt. Das Harz wurde drei Mal mit Methylenchlorid gewaschen, durch drei Spülungen mit 10% Diisopropylethylamin in Methylenchlorid neutralisiert, drei Mal mit Methylenchlorid gewaschen, mit N-Acetylimidazol in Methylenchlorid acetyliert, drei Mal mit Methylenchlorid gewaschen und im Vakuum getrocknet. Das Peptid wurde von den Schutzgruppen befreit und vom Harz mit Wasser abgespalten und der pH mit Ammoniumhydroxyd auf 8,.5 eingestellt. Kaliumcyanoferrat (0,.01 N) wurde zur Lösung gegeben, bis die gelbe Farbe bestehen blieb. Die Lösung wurde 30 min gerührt und dann der pH mit Essigsäure auf 4 bis 5 eingestellt. Das Gemisch wurde dann mit Bio-Rad AG3-X4A Ionenaustauscher-Harz für 2 Stunden gerührt. Das Gemisch wurde filtriert und das Filtrat lyophilisiert.
Das Peptid wurde durch Entsälzung auf einer 92 * 2,6 cm Sephadex G-15 Säule in 5% wässriger Essigsäure gereinigt und lyophilisiert. Eine präparative HPLC wurde an einer C¹&sup8;Vydac 218TP1010 (250 * 10 mm) Säule mit Acetonitril in 0,1 % wässriger Trifluoressigsäure bei 5 ml/min durchgeführt. Die Hauptfraktion wurde gesammelt und lyophilisiert, was das gewünschte Produkt ergab. Die Homogenität wurde durch HPLC und TLC bestimmt. HPLC Vydac 218TP54 (250 * 4,6 mm) C¹&sup8; Säule, 2 ml/min. t&sub0; = 1,8 min: die Eluierungszeit mit einem linearen Gradienten von 25-50% Acetonitril in 0,1 % Trifluoressigsäure bei 1 %/min beträgt 5,5 min. FAB-MS: (M + H) = 1411,7 ± 1 mu (ber. 1410). Die Aminosäuren- Analyse: (6N HCl-Hydrolyse; 24std bei 106ºC) siehe Tabelle 1, 57 Gew.-% Peptid- Gehalt. Tabelle 1 Aminosüaren-Analse (Hydrolyse mit 6N HCl; 24 Std bei 106ºC) Beispiel Nr. * Teile, welche zu allo-Ile während der Hydrolyse umgewandelt werden, sind nicht bestimmt.

Claims

1. Peptidderivat der allgemeinen Formel 1:

in der

X einen Rest an der endständigen Aminogruppe darstellt, ausgewählt aus einem Wasserstoffatom, einem oder zwei Alkylresten mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, einem oder zwei Acylresten mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen, der Carbobenzyloxy- oder tert-Butyloxycarbonylgruppe;

A&sub1; eine Bindung oder ein Peptid mit 1 bis 5 Aminosäureresten ist;

A&sub2; ist Phe, substituiertes Phenylalanin (SubPhe), β-(2- und 3-Thienyl)alanin, β-(2- und 3-Furanyl)alanin, β- (2-, 3- und 4-Pyridyl)alanin, β-(Benzothien-2- und 3-yl)alanin, β-(1- und 2-Naphthyl)alanin, Tyr oder Trp ist;

A&sub3; Glu oder Asp ist;

A&sub4; irgendeine Aminosäure ist;

A&sub5; Ile, Val, Leu, Nle oder Thr ist;

A&sub7; irgendeine Aminosäure ist;

A&sub8; Glu oder Asp ist;

A&sub1;&sub0; eine lipophile Aminosäure, ausgewählt aus Tyr, Tyr(SO&sub3;H), Trp, Phe, Leu, Nle, Ile, Val, His und Pro, oder ein Dipeptid, das mindestens eine dieser lipophilen Aminosäuren enthält, ist;

A&sub1;&sub1; eine Bindung oder ein Peptidfragment mit 1 bis 5 Resten irgendwelcher Aminosäuren ist;

Y einen Rest an der endständigen Carboxygruppe darstellt, ausgewählt aus -OH, einem (C&sub1;-C&sub6;)Alkoxy-, Amino-, Mono- oder Di-(C&sub1;-C&sub4;)alkylsubstituierten Amino- oder Benzylaminorest;

R, R', R&sub1; und R&sub1;' jeweils ausgewählt sind aus einem Wasserstoffatom oder einem (C&sub1;-C&sub4;)Alkylrest;

B ausgewählt ist aus den Gruppen -S-, -S-S- oder -S-Alk&sub3;-S-;

Alk&sub1;, Alk&sub2; und Alk&sub3; jeweils ausgewählt sind aus einer (C&sub1;-C&sub8;) Methylen- oder Ethylengruppe;

und in der "D" und "L" anzeigen, daß die Stereochemie des betreffenden Kohlenstoffatoms diejenige ist, die der von D-Cystein bzw. L-Cystein entspricht; und die pharmazeutisch verträglichen Salze davon.

2. Peptidderivat gemäß Anspruch 1, in dem A&sub2; Phe, β-(2- oder 3-Thienyl)alanin oder Tyr ist.

3. Peptidderivat gemäß den Ansprüchen 1 oder 2, in dem A&sub3; Glu ist.

4. Peptidderivat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, in dem A&sub4; Glu ist.

5. Peptidderivat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, in dem A&sub5; Ile ist.

6. Peptidderivat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, in dem A&sub7; Glu oder Ala ist.

7. Peptidderivat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, in dem A&sub8; Glu oder Asp ist.

8. Peptidderivat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, in dem A&sub1;&sub0; Leu ist.

9. Peptidderivat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, in dem A&sub1;&sub1; Pro, Gln, Asp oder Asp-Gln ist.

10. Peptidderivat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, in dem X ein Wasserstoffatom, eine Acetyl- oder Bernsteinsäuregruppe ist.

11. Peptidderivat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, in dem Y eine der Gruppen OH oder NH&sub2; ist.

12. Peptidderivat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, in dem die Reste R, R', R1', R&sub1;' jeweils ein Wasserstoffatom sind.

13. Peptidderivat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, in dem B eine Gruppe -S-S- ist.

14. Peptidderivat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, in dem Alk&sub1; und Alk&sub2; jeweils eine Methylengruppe der Formel -(CH&sub2;)- sind.

15. Dimer eines Peptidderivats gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14 oder ein Gemisch aus dem Dimeren und besagtem Peptid.

16. Verfahren zur Herstellung eines Peptidderivats gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14 oder eines Dimeren davon oder eines Gemischs des Dimeren und des besagten Polypeptids, das die Erzeugung des freien Sulfhydryl enthaltenden linearen Peptids durch eine Festphasen-Sequenz- oder Blocksynthese, Genclonierung, oder eine Kombination davon und anschließend die oxidative Kupplung des linearen Peptids umfaßt.

17. Festphasen-Sequenz- oder Blocksynthese-Verfahren zur Herstellung eines Peptidderivats gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14 oder eines Dimeren davon oder eines Gemisches des Dimeren und des besagten Polypeptids, das das Anbinden einer in geeigneter Weise geschützten Amino-Säure der Formel A&sub1;, die die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung hat, an einen aktivierten Harzträger, nachfolgend das Anbinden der anderen α-Amino-geschützten Aminosäuren der Formeln A&sub2; bis A&sub1;&sub1;, die die in den vorangegangenen Ansprüchen angegebene Bedeutung haben, an die endständige Aminogruppe der wachsenden Peptidkette, die unterdessen durch Entfernen ihrer Aminoschutzgruppe freigesetzt wurde, und schließlich die oxidative Kupplung des linearen Peptids umfaßt.

18. Peptidderivat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, ein Dimeres davon oder ein Gemisch dieser Verbindungen zur Verwendung als Arzneistoff.

19. Peptidderivat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, ein Dimeres davon oder ein Gemisch dieser Verbindungen zur Verwendung als Antikoagulierungsmittel.

20. Arzneimittel, enthaltend eine koagulationshemmend wirksame Menge eines Peptidderivats gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, eines Dimeren davon oder eines Gemisches dieser Verbindungen und gegebenenfalls einen pharmazeutisch verträglichen Träger und/oder ein Verdünnungsmittel.