DE3879803T2

DE3879803T2 - Reinigung von faktor viii:c durch phospholipid-affinitaet.

Info

Publication number: DE3879803T2
Application number: DE8888111301T
Authority: DE
Inventors: James E Brown; Cynthia A Cowgill
Original assignee: Miles Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1987-07-16
Filing date: 1988-07-14
Publication date: 1993-07-08
Anticipated expiration: 2008-07-15
Also published as: DE3879803D1; ES2053631T3; GR3007541T3; EP0303064A2; EP0303064A3; EP0303064B1; ATE87632T1; US4795806A

Description

Bereich:

Diese Offenbarung betrifft die Reinigung von Faktor VIII:C, und zwar sowohl von aus Plasma abgeleitetem wie auch von gentechnologisch hergestelltem Faktor VIII:C und Fusionsprodukten davon. Insbesondere kann angekoppeltes Phosphatidylserin als vorherrschendes Phospholipid bei der Affinitätschromatographie zur Reinigung und Abtrennung von Faktor VIII verwendet werden, wodurch man einen hohen Reinheitsgrad an Faktor VIII:C erhält.

Hintergrund der Erfindung

Faktor VIII (antihämophiler Faktor), isoliert aus Plasma oder handelsüblichen Konzentraten, besteht aus vielfachen Polypeptiden mit einem Mr von ungefähr 80.000 bis 210.000. Darüber hinaus haben rekombinante DNA-Klone die Konstruktion von Plasmiden gestattet, welche die Expression von Faktor VIII-Protein in transfektierten Säugerzellen steuern. Rekombinante DNA-Klone haben weiterhin die Konstruktion von Plasmiden gestattet, welche die Expression von Fusionsprodukten von Faktor VIII-Protein in transfektierten Säugerzellen steuern. Faktor VIII:C bezieht sich im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung auf ein Faktor VIII-Protein, das in einer Weise wirken kann, daß es die Hämophilie genannte erbliche Bluterkrankheit korrigieren kann. Faktor VIII kann aus einem Plasma abgeleitet oder aus gentechnologischer Quelle sein, oder kann auch Fusionsprodukte davon bedeuten. Aus Plasma abgeleiteter Faktor VIII könnte menschlichen Ursprungs oder aus Schwein oder Rind und Konzentraten davon sein. Der Begriff Faktor VIII soll keine Beschränkung darstellen, sondern bezieht sich auf ein funktionelles Protein zur Behandlung von Bluterkrankheiten.
Eine Vielzahl von Methoden zur Abtrennung von Faktor VIII:C aus Plasma sind angewendet worden. Tuddenham et al., Journal of Laboratory Clinical Medicine, Band 93, Seite 40 (1979), berichteten von einer Ein- Schrittmethode zur Abtrennung des Faktors VIII:C von den meisten anderen Plasmaproteinen unter Verwendung von polyklonalen Antikörpern auf den von Willebrand- Faktor, die an Agaroseperlen angekoppelt waren. Austen, British Journal of Haem., Band 43, Seite 669 (1979), reinigte Faktor VIII unter Verwendung einer Aminohexyl-substituierten Agarose. Zimmerman et al., US-Patent Nr. 4 361 509 und US-Neuausgabepatent Nr. 32 011, beschreiben eine Methode zur Trennung der Molekülbestandteile des Faktors VIII/von Willebrand-Faktor (vWf)-Komplexes unter Verwendung eines Zwei- Schrittverfahrens, (1) Adsorbieren eines VIII:C/vWf- Komplexes auf Partikel, die mit einem monoklonalen vWf-spezifischen Antikörper verbunden sind, und (2) Adsorbieren des eluierten VIII:C an einer Aminohexylagarosesäule zur Konzentration und weiteren Reinigung des Faktors VIII:C. Die Reinigung von Faktor VIII:C aus gentechnologisch hergestellten DNA- Klonen wurde erreicht, indem zuerst der Faktor VIII:C auf DEAE-Sepharose adsorbiert wurde, der Faktor VIII eluiert wurde und das Material durch eine Faktor VIII monoklonale Antikörpersäule geschickt wurde, Gitschier et al., Nature, Band 312, 22. November 1984, Seiten 330-337. Rotblat et al., Biochemistry 1985, 24, 4294-4300 beschreiben ein Verfahren zur Reinigung des menschlichen Faktor VIII:C aus Kryopräzipitat unter Verwendung eines Polyelektrolytverfahrens als vorbereitenden Schritt vor der Immunoaffinitäts-Chromatographie mit von Willebrand-Faktor-Antikörpern, gefolgt von Adsorption an einen Faktor VIII:C-spezifischen monoklonalen Antikörper. Bis heute sind die erfolgreichsten Faktor VIII-Reinigungen aus Plasma und rekombinanten DNA- Klonen durch Verwendung von monoklonalen Antikörpern erreicht worden, die entweder auf Faktor VIII:C oder auf von Willebrand-Faktor spezifisch waren.
Obwohl monoklonale Antikörper erfolgreich verwendet wurden, um ein relativ reines Faktor VIII:C-Präparat zu erhalten, können monoklonale Antikörper im Endpräparat vorliegen, und zwar wegen Auswaschung aus der Trägermatrix. Dies wirft die Möglichkeit einer Antigenizität auf, wenn das Endpräparat in tierische Systeme eingebracht wird, da monoklonale Antikörper aus Mäusen keine normalen Metabolite sind und als Antigene bekannt sind. Ein zweiter Nachteil der Verwendung von monoklonalen Antikörpern ist das Erfordernis von Zellkulturmöglichkeiten zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern und die damit einhergehenden Kosten und die mit monoklonalen Antikörpern verbundenen Behandlungs-/Verfahrensweisen.
Die vorliegende Erfindung vermeidet die mit monoklonalen Antikörpern verbundenen Probleme, liefert aber immer noch ein hochgereinigtes Präparat, indem mindestens ein an eine Trägerstruktur gekoppeltes Phospholipid verwendet wird, wobei das Überwiegende Phospholipid Phosphatidylserin ist.
Die Bindung von Faktor VIII:C an Phospholipid-Vesikel wurde unter Anwendung eines IRMA-Assays, Sucrosegradienten-Ultrazentrifugation und Säulenchromatographie demonstriert. Lajmanovich et al., Biochimica und Biophysica Acta, 678 (1981), 132-136, untersuchten die Wechselwirkung zwischen gereinigtem menschlichen Faktor VIII und Phospholipid-Vesikeln. Eine äquimolare Mischung von PS und PC wurde mit der Sucrosegradienten-Ultrazentrifugation untersucht. Andere Experimente, die in der Referenz nicht gezeigt sind, betreffen die Verwendung von PS- oder PC- Vesikeln. Die Autoren zeigten, daß in Anwesenheit von PS/PC- oder PS/PE-Vesikeln die Faktor VIII-Aktivität vollständig von vWf abgetrennt wurde, wenn man Sucrose- Dichtegradienten-Ultrazentrifugation anwendete, wobei Faktor VIII:C mit den Phospholipiden oben erschien und vWf nach unten wanderte.
Yoshioka et al., Brit. J. Haem., 1983, 55, 27-36, untersuchten die Wechselwirkung zwischen Faktor VIII- Gerinnungsantigen (VIII:C Ag) und Phospholipid (PL) unter Verwendung von IRMA. Behandlung von Faktor VIII- Konzentrat mit gereinigten Phospholipiden zeigte die größte VIII:C Ag-Verringerung mit PS, weniger mit PE und sehr wenig mit PC.
Andersson und Brown zeigten durch Sucrose-Gradienten- Ultrazentrifugation, daß Faktor VIII:C/von Willebrand- Faktor an Phospholipid-Vesikel in Lösung bindet. (Biochem J. [1981] 200, 161-167). Die Phospholipid- Vesikel waren eine 50/50-Mischung von Phosphatidylserin und Phosphatidyiethanolamin (PE) oder eine 50/50- Mischung von Phosphatidylserin und Phosphatidylcholin (PC). Andersson et al., waren auch erfolgreich bei der Kopplung von Phospholipid-Vesikeln, die Phosphatidylserin und Phosphatidyiethanolamin enthielten, an Bromcyan-aktivierte Agarosegele, (Thrombosis Res. 23:481-489, 1981). Eine 50/50-Mischung von PS/PE wurde wiederum verwendet. Es wurde gezeigt, daß Faktor VIII/von Willebrand-Faktor an Phospholipid- Vesikel in Abwesenheit von Ca&spplus;&spplus; bindet, doch Versuche, irgend einen Faktor VIII mit 1M NaCl zu eluieren, waren erfolglos. Faktor VIII wurde mit 1M KSCN eluiert, was eine ziemlich geringe Wiedergewinngung von Faktor VIII-Aktivität aufgrund der Labilität von Faktor VIII in KSCN lieferte.
Ein erstes Ziel dieser Erfindung ist es, ein relativ reines Faktor VIII:C-Präparat aus von Plasma abgeleiteten oder gentechnologisch hergestellten Quellen und Fusionsprodukte davon zu erhalten, und zwar ohne die mit der Reinigung durch monoklonale Antikörper verbundenen Probleme.
Ein weiteres Ziel dieser Erfindung ist es, ein Reinigungsverfahren zur Verfügung zu stellen, das zur Reinigung von Faktor VIII:C und Fusionsprodukten davon in einem Schritt direkt aus Gewebekulturflüssigkeiten ausgeführt werden kann.
Noch ein weiteres Ziel dieser Erfindung ist es, eine Phospholipidsäule, die überwiegend Phosphatidylserin als Phospholipid enthält, in Verbindung mit monoklonalen Antikörpern zur weiteren Reinigung und Isolierung von Faktor VIII:C zu verwenden.

Zusammenfassung der Erfindung

Angekoppeltes Phospholipid (PL), das überwiegend Phosphatidylserin (PS) ist, liefert ein leistungsstarkes Affinitätsharz zur Reinigung von Faktor VIII:C der vollen Länge, aus von Plasma abgeleiteten und gentechnologisch hergestellten Quellen, sowie seiner Derivate und Fusionsprodukte. Angekoppeltes PL, welches überwiegend PS ist, kann zur Reinigung von Faktor VIII:C direkt aus Rohproduktquellen wie etwa aus Plasma oder Plasmakonzentraten und Gewebekulturflüssigkeiten verwendet werden, ebenso wie aus Zwischenquellen wie PEG-Koate , einem Polyethylenglycolverfahren zur Gewinnung von Faktor VIII, oder aus DEAE-Eluaten oder aus reineren Quellen wie durch monoklonale Antikörper gereinigtem Faktor VIII:C.
Ein Verfahren zur Herstellung von hochreinem Faktor VIII:C oder einem Faktor VIII:C-Fusionsprodukt mit prokoagulierender Aktivität umfaßt die Schritte von (a) Adsorbieren von Faktor VIII:C oder dessen Fusionsprodukten an eine Phospholipid-beschichtete Trägerstruktur, die überwiegend Phosphatidylser in ist, und (b) Eluieren des adsorbierten Faktor VIII:C oder dessen Fusionsprodukten mit einer Salzlösung, die von einer hinreichenden Konzentration zur Eluierung von Faktor VIII:C ist.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Die folgende Beschreibung gibt Details an, auf welche Weise Ausführungsformen der vorliegenden Verbindung hergestellt und verwendet werden können, um die Trennung, Reinigung und Konzentrierung von Faktor VIII:C zu einem Reinheits- und Konzentrationsgrad zu erreichen, der vergleichbar mit dem ist, der unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern, welche spezifisch auf Faktor VIII:C oder von Willebrand-Faktor sind, erzielt wird. Die folgende Beschreibung soll die Erfindung nicht beschränken, und Abweichungen würden von den Fachleuten als in den Bereich dieser Erfindung fallend angesehen werden.
Es werden Experimente beschrieben, die demonstrieren, daß eine Phospholipidsäule, die überwiegend aus an eine Trägerstruktur gekoppeltem PS besteht, ein leistungsstarkes Affinitätsharz zur Reinigung des Faktors VIII:C liefert. Andersson et al., siehe oben, zeigten, daß eine 50/50-Mischung von PS/PC oder PS/PE eine so starke Affinität zu Faktor VIII:C liefert, daß eine Eluierung mit einer Salzlösung, die nicht aktivitätszerstörend auf Faktor VIII:C wirkte, erfolglos war. Es liegt innerhalb des Bereichs der vorliegenden Erfindung, eine Phospholipid- Trägerstruktur herzustellen, die PS und PE oder PC enthält, worin die Menge von PE oder PC ausreichend ist, um die Affinität von PS zu steigern, ohne daß die Eluierung von Faktor VIII:C oder dessen Fusionsprodukten mit einer Salzlösung von mindestens ungefähr 1,5 M verhindert wird. Das Verhältnis beträgt weniger als 50 %, vorzugsweise beträgt die Menge 10 bis 20 %. Indem man das Verhältnis von PS und PE oder PC oder deren Mischungen ausbalanciert, dürfte es möglich sein, die Affinität von Faktor VIII:C für die Phospholipid-Trägerstruktur zu maximieren, den Faktor VIII:C auf der Phospholipid-Trägerstruktur zu adsorbieren und den adsorbierten Faktor VIII:C mit einer Salzlösung zu waschen, welche ausreicht, um unerwünschte Proteine zu entfernen, ohne den Faktor VIII:C zu eluieren. Unerwünschte Proteine schließen ein, doch sind nicht beschränkt auf, Proteine wie etwa Fibrinogen, Fibronektin oder vWf aus von Plasma abgeleitetem Faktor VIII:C oder Proteine, die in den Gewebekulturen vorliegen, die von allen Linien exprimiert werden wie etwa Baby-Hamsterniere (BHK)- oder chinesischer Hamstereierstock (CHO)-Proteine. Der adsorbierte, gewaschene Faktor VIII:C kann dann mit einer Salzkonzentration eluiert werden, die ausreicht, um Faktor VIII:C zu eluieren, während sie die Aktivität von Faktor VIII:C erhält. Die Salzlösung kann in beiden Schritten ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus NaCl, CaCl&sub2;, LiCl und KCl und deren Mischungen. Andere Salzlösungen können verwendet werden. Die Faktoren für die Auswahl einer Salzlösung sind die Fähigkeit, Faktor VIII:C zu eluieren, ohne im wesentlichen irgendein erwünschtes Charakteristikum von Faktor VIII:C nachteilig zu beeinflussen. Die Salzlösung kann in beiden Schritten dieselbe sein, z. B. NaCl, wenn man anerkennt, daß dann die Konzentration der Salzlösung zwischen den beiden Schritten verschieden wäre. Die Konzentration der Salzlösung im Waschschritt beträgt weniger als 1 M, vorzugsweise weniger als 0,8 M. Die Konzentration der Salzlösung im Eluierungsschritt beträgt mindestens 1 M, vorzugsweise mehr als 1,5 M. Die Konzentration der Salzlösung kann auch so angepaßt werden, daß sie mit der Salzkonzentration der zu behandelnden, Faktor VIII enthaltenden Flüssigkeit kompatibel ist, wie etwa der Gewebekulturflüssigkeit, DEAE-Eluat, Plasmafraktion oder -konzentrat usw.. PL-Trägerstrukturen, die mit im wesentlichen reinem PS gekoppelt sind, können ebenfalls mit der Salzlösung wie oben beschrieben gewaschen werden. Wenn man im wesentlichen reines PS verwendet, ist es ratsam, die Wirkung der Salzkonzentration, die im Waschschritt verwendet wird, auszuwerten, um zu bestimmen, ob Faktor VIII mit den unerwünschten Proteinen eluiert wird, indem man die Aktivität des Wascheluats bezüglich Faktor VIII:C untersucht. Es kann notwendig sein, die Konzentration der Salzlösung im Waschschritt zu erniedrigen.
PS wurde an Glyceryl-kontrolliertes Porenglas (CPG) gekoppelt, um ein Affinitätsharz zur Verfügung zu stellen. Die Verwendung von CPG soll keine Beschränkung sein, andere Materialien wie etwa voraktivierte Harze und Perlen könnten verwendet werden, um eine Trägerstruktur zur Ankopplung von PS zur Verfügung zu stellen.
Die Trägerstruktur für die Phospholipidsäule kann sowohl natürliche wie auch synthetische Polymermaterialien einschließen. Die Trägerstruktur sollte in der Lage sein, mit einem Phospholipid oder einer Mischung von diesen gekoppelt zu werden, ohne im wesentlichen irgendein gewünschtes Charakteristikum des zu reinigenden Faktors VIII, wie etwa Ausbeute, Reinheit und Aktivität, nachteilig zu beeinflussen.
In der breiten Praxis dieser Erfindung ist die physikalische Form oder Makrokonfiguration der Säule nicht kritisch. Die Säule wird zur Affinitätschromatographie verwendet, und die Oberfläche für Kontakt und Bindung sind wichtige Merkmale. Die Trägerstruktur kann in verschiedenen physikalischen Formen eingesetzt werden, einschließlich Perlen, Flocken, Scheiben, Fasern, Filme, Beschichtungen z. B. auf erweiterten Oberflächenträgern und -blättern, Röhren oder in einer beliebigen anderen trägerlosen Struktur.
Bei der Verwendung von Porenglasperlen als Trägerstruktur wurde bemerkt, daß die Bindungskapazität für eine 3 ml-Säule ungefähr 100 Aktivitätseinheiten pro ml Gel betrug. Für eine 23 ml-Säule betrug die Bindungskapazität ungefähr 127 u/ml. Wenn große Volumina von Faktor VIII:C enthaltenden Flüssigkeiten verarbeitet werden sollen, müßte das Gelvolumen entsprechend angepaßt werden. Weil diese Reinigungstechnik eine Affinitätschromatographie im Gegensatz zur konventionellen Chromatographie ist, würde dies nicht eine nicht-handhabbare große Säule erfordern, sondern könnte leicht in relativ dünnen, Pfannkuchen-artigen Säulen von großem Durchmesser durchgeführt werden. Zusätzlich würde die flache, Pfannkuchen-artige Säule schnellere Probenzuführung erlauben und könnte für längere Waschschritte angepaßt werden.
PS (Sigma) wurde an Glyceryl-kontrolliertes Porenglas (Sigma) nach der Methode von Roy et al., J. CHROM. 303 (1984) 225-228, gekoppelt. PS wurde in einer Konzentration von 5 mg/ml in 0,1 M Na(H)PO&sub4;, pH 7,0, 0,1 M NaCl suspendiert, mit Stickstoff entgast und mit Ultraschall behandelt, bis die Lösung klar wurde (ungefähr 3 Minuten). 18 g PS wurden mit 6 g CPG gemischt.
Gewebekulturflüssigkeit, enthaltend exprimierten Faktor VIII:C, oder Gewebekulturflüssigkeit, enthaltend exprimierten Faktor VIII:C, welche mit einer DEAE- Sepharosesäule kontaktiert worden war, woraus ein DEAE- Konzentrat resultierte, wurde auf die Phosphatidylserin-Glycerin-kontrolliertes Porenglas (PS-CPG> -Säule in einem Verhältnis von 100 U pro ml Gel aufgebracht. Wenn größere Volumina von Faktor VIII enthaltenden Flüssigkeiten gereinigt werden, können relativ dünne Säulen von großem Durchmesser hergestellt werden, um das Verfahren im großen Maßstab zu erleichtern. Die PS-CPG-Säule wurde in 0,05 M Tris, pH 7,3, 0,3 M NaCl, 0,01 M CaCl&sub2;, 0,02 % NaN&sub3; und 10 % Glycerin equilibriert und mit dem selben Puffer eluiert, der 2 M NaCl enthielt. Weitere PS-CPG- Säulendurchläufe schlossen auch einen Waschschritt mit 0,6 M NaCl ein. Das Faktor VIII:C enthaltende Eluat wurde durch einen Faktor VIII:C-Koagulationsassay, einen Baby-Hamsternieren (BHK)-Kontaminationsassay, einen Bradford-Proteinassay und SDS- Polyacrylamidgelelektrophorese analysiert.
Die Bestandteile der Pufferlösung können der Quelle der den Faktor VIII:C enthaltenden Flüssigkeit angepaßt werden. In vorliegendem Beispiel wurde 0,3 M NaCl zum Puffer zugegeben, um eine Anpassung der Salzkonzentration des DEAE-Eluats zu vermeiden; 0,02 % NaN&sub3; werden als Bakterizid zugegeben; und dies kann durch andere bekannte germizide Mittel ersetzt werden oder sogar fernbleiben.
Tabelle 1 erläutert die Wiedergewinnung von Faktor VIII:C aus DEAE-Eluaten. Rekombinanter FVIII:C in Gewebekulturflüssigkeit (TCF) oder in DEAE-Konzentrat wurde auf die PS-CPG im Verhältnis von 100 u/ml Gel aufgebracht. Die Gewebekulturflüssigkeit enthielt 1000 bis 4000 U/L des exprimierten Faktors VIII:C. Das Gel wurde nachfolgend mit 0,05 Imidazol pH 6,9, enthaltend 0,15 M Nacl, 0,01 M CaCl&sub2; und 0,02 M Glycinethylester gewaschen; Faktor VIII wurde mit demselben Puffer, der 0,1 M CaCl&sub2; enthielt, eluiert. Das aus DEAE-Sepharose erhaltene Material wurde dann durch eine PS-CPG-Säule geschickt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefaßt. Die Ergebnisse werden mit Gewebekulturflüssigkeitsmedien verglichen, die auf DEAE-Sepharose adsorbiert worden waren, wie oben ausgeführt. Das aus DEAE-Sepharose erhaltene Vergleichsmaterial wurde dann mit einer Säule in Kontakt gebracht, die einen monoklonalen Antikörper enthielt, der auf Faktor VIII:C spezifisch war. Die Säule wurde hergerichtet, indem 2 mg Faktor VIII- monoklonaler Antikörper C&sub7;F&sub7; an 1 ml Affi-Gel 10 (Bio-Rad) kovalent gebunden wurden. Für ein detailliertes Verfahren zur Herstellung der C&sub7;F&sub7;-Säule siehe das Verfahren von Gitschier et al., siehe oben. Tabelle 1 Vergleich einer Phospholipidsäule mit einer monoklonalen Antikörpersäule unter Verwendung von DEAE- Eluat als Ausgangsmaterial Probe Durchschnittliche Wiedergewinnung Durchschnitt ug BHX/4500 U von F.VIII:C Säule Säulengröße Durchschnittliche spezifische Aktivität u/A&sub2;&sub8;&sub0;
Die Entfernung von BHK-Kontamination für die Proben A&sub1; und B&sub2; ist vergleichbar. Die BHK-Kontamination für die größere Säule A&sub2; im Vergleich zu B&sub2; zeigte, daß zusätzliches Waschen und/oder vorsichtige Peak-Sammlung notwendig sind, um die BHK-Kontamination zu verringern.
Tabelle 2 erläutert die Wiedergewinnung von Faktor VIII:C direkt aus Gewebekulturflüssigkeiten, ohne die Adsorption von externen Proteinen unter Verwendung von DEAE-Sepharose. Der monoklonale Antikörper-C&sub7;F&sub7;- Säulenschritt ohne den DEAE-Sepharoseschritt war nicht erfolgreich darin, den Faktor VIII:C direkt aus der Gewebekulturflüssigkeit zu erkennen. Tabelle 2 Gewebekulturflüssigkeit in einem Volumen von 50 ml, enthaltend 50 Einheiten Faktor VIII:C mit 10 % Glycerin und in Gegenwart von Ca&spplus;&spplus;. Probe %-Wiedergewinnung Durchschnitt
In Abwesenheit von Ca&spplus;&spplus; war die Wiedergewinnung von Faktor VIII 0 %.
Das Kopplungsverfahren und die Säulenpuffer, wie zuvor beschrieben, wurden verwendet, um eine 23 ml-PL-Säule unter Verwendung von PS herzustellen. Es wurde gefunden, daß die Säule eine Bindekapazität von 127 Einheiten Faktor VIII:C pro ml Phospholipidgel hat. Die Puffer enthielten 0,01 % Tween 80, das einen stabilisierenden Effekt auf Faktor VIII:C ausübt. Die Säule wurde bei Raumtemperatur bei 6 ml/min. unter Verwendung von FPLC während einer Gesamtzeit von 1 h laufengelassen. Die Probe, die den rekombinanten Faktor VIII:C enthielt, wurde hergestellt, indem die den Faktor VIII:C enthaltende Gewebekulturflüssigkeit über eine DEAE-Sepharosesaule zweimal laufengelassen wurde, worauf als "zweites DEAE-Eluat" Bezug genommen wird. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 unten zusammengefaßt. Tabelle 3 23 ml PS-CPG-Säule bei Verwendung eines zweiten DEAE- Eluats (rFVIII) Probe rEVlll:C (Einheiten /ml) Volumen Gesamteinheiten % Wiedergewonnen * = Durchschnitt von EL&sub1; und EL&sub2; ** = Durchschnitt von EL pk und EL rest Legende: FT = Durchfluß; EL = Eluat; pk = Peak; rest = verbleibendes Eluat
Zusätliche Probenquellen wurden unter Verwendung einer 3 ml-Säule, an die wie zuvor beschrieben gekoppelt worden war, ausgewertet. Dieselbe Säule wurde verwendet, um 14 Proben auszuwerten, und die Säule wies eine ausgezeichnete Bindekapazität für alle 14 Durchläufe auf. Sowohl rekombinant erhaltener Faktor VIII:C und aus Plasma erhaltener Faktor VIII:C wurden ausgewertet. Die Quellen schlossen Gewebekulturen, die rekombinanten Faktor VIII enthielten; Polyethylenglycol-Plasmakonzentrat, das Faktor VIII enthielt; rekombinanten Faktor VIII enthaltendes DEAE- Eluat; DEAE-Eluat, das ein Fusionsprodukt des rekombinanten Faktors VIII enthielt; monoklonales Antikörpereluat, enthaltend rF.VIII (mit und ohne vWf) und monoklonales Antikörpereluat, das aus Plasma erhaltenen (pd) F.VIII (mit und ohne vWf) enthielt, ein. Eluierungsbedingungen wurden durch 2 M NaCl und 1 M CaCl&sub2; in Anwesenheit und Abwesenheit von 0, 01 % Tween 80 demonstriert. Diese Ergebnisse sind in Tabelle 4 unten zusammengefaßt: Tabelle 4 Vergleich von verschiedenen Quellen für Faktor VIII zweites DEAE-Eluat rF.VIII Volumen Gesamt U Wiedergewinnung Volumen Gesamt U Wiedergewinnung SM enthielt Albumin SM enthielt Albumin und vWf PEG Wiedergepd F.VIII U/ML Volumen Gesamt U winnuna zweites DEAE-Eluat rF.VIII zweites DEAE-Eluat rF.VIII Volumen Gesamt U Wiedergewinnung Eluiert mit 1 M CaCl&sub2; anstelle von 2 M NaCl Puffer enthielt 0,01 % Tween 80 SM = Ausgangsmaterial FT = Durchfluß EL = Eluat Eluierungspuffer enthielt Glycerin
Das Verfahren zur Reinigung des gentechnologisch hergestellten Faktors VIII:C ist verschieden von dem des aus Plasma abgeleiteten Faktor VIII:C wegen der Anwesenheit von großen Proteinmolekülen im Plasma wie etwa Fibronektin und Fibrinogen und der Tatsache, daß Faktor VIII:C einen Teil des Faktor VIII:C:vWf- Komplexes ist. Obwohl gezeigt worden ist, daß Faktor VIII durch PL in Anwesenheit von vWf gereinigt werden kann, können große Proteinmoleküle vor oder nach der Behandlung mit PL entfernt werden. Schritte zur Entfernung dieser unerwünschten Proteine sind bekannt. Diese Schritte sind bei der herkömmlichen Plasmabehandlung verwendet worden, um Faktor VIII:C von geringerer Reinheit zu erhalten, ebenso wie in Kombination mit monoklonalen Antikörpern, um hochgereinigten Faktor VIII:C zu erhalten. Plasma und Plasmakonzentrate können unter Verwendung von DEAE- Sepharose vorbehandelt werden, um unerwünschte Proteine zu entfernen. Der VIII:C:vWf-Komplex kann mit β- Mercaptoethanol (BME) oder CaCl&sub2; dissoziiert werden, z. B mit 250 mM, und mit einer DEAE-Sepharosesäule zur Entfernung des vWf kontaktiert werden. Das DEAE-Eluat kann dann auf der Phospholipidsäule, wie oben dargelegt, absorbiert werden.
Nachdem die obigen Offenbarungen gegeben sind, werden unzweifelhaft den Fachleuten Abweichungen davon in den Sinn kommen. Demgemäß ist beabsichtigt, daß die obigen Beispiele als lediglich erläuternd verstanden werden sollen und daß der Bereich der offenbarten Erfindungen nur durch die folgenden Ansprüche beschränkt sein soll.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von hochreinem Protein mit Faktor VIII:C-prokoagulierender Aktivität oder Fusionsprodukten davon, umfassend die Schritte:

(a) Adsorbieren von Faktor VIII:C oder dessen Fusionsprodukten auf einen festen Träger, an welchen Phospholipide gekoppelt worden sind, welche ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Phosphatidylserin (PS) und Phosphatidylserin in Mischung mit Phosphatidylcholin (PS/PC) oder Phosphatidylethanolamin (PS/PE), wobei das Phosphatidylethanolamin oder Phosphatidylcholin, falls vorliegend, in einer Menge zwischen 10 % und 20 % des Phospholipids vorliegen, und

(b) Eluieren des adsorbierten Faktors VIII:C oder dessen Fusionsprodukten mit einer nichtdenaturierenden Salzlösung, wobei diese Salzlösung von einer hinreichenden Konzentration zur Eluierung von Faktor VIII:C oder dessen Fusionsprodukten ist, während sie die Aktivität von Faktor VIII:C erhält.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Faktor VIII:C oder dessen Fusionsprodukte aus einer aus Plasma abgeleiteten Quelle erhalten werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Faktor VIII:C oder dessen Fusionsprodukte aus einer gentechnologisch hergestellten Quelle erhalten werden.

4. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die aus Plasma abgeleitete Quelle menschliches Plasma, Schweineplasma und Rinderplasma sowie Plasmakonzentrate und Plasmafraktionen davon einschließt.

5. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Konzentration der Salzlösung mindestens 1 M beträgt.

6. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Salzlösung aus der Gruppe bestehend aus NaCl, CaCl&sub2;, LiCl und KCl ausgewählt ist.

7. Verfahren nach Anspruch 1, das ferner den Schritt einer Wäsche des adsorbierten Faktors VIII:C oder dessen Fusionsprodukten aus Schritt (a) mit einer Salzlösung einschließt, wobei diese Salzlösung von einer hinreichenden Konzentration ist, um unerwünschte Verunreinigungen zu entfernen, ohne den Faktor VIII:C oder dessen Fusionsprodukte zu eluieren.