TECHNISCHER BEREICH
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Die vorliegende Erfindung betrifft menschliche monoklonale
Antikörper gegen Candida und Hybridome, welche diese produzieren,
sowie ein Verfahren zur Herstellung der monoklonalen
Antikörper. Diese monoklonalen Antikörper sind für die Diagnose und
Behandlung von Candida-Infektionskrankheiten nützlich.
ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
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Candida ist eine zu den Pilzen gehörende Gattung, welche die
Arten Candida albicans A, C. albicans B, C. tropicalis,
C. stellatoidea, C. guilliermondii, C. krusei, C. parapsilosis,
C. kefyr und C. glabrate umfaßt. Unter den im vorigen genannten
ist C. albicans als ein opportunistischer Krankheitserreger von
Bedeutung, welcher bei an Immunmangel leidenden Patienten
schwere Infektionen verursachen kann. Obwohl diese Pilze
allgemein verbreitete, im Verdauungstrakt und in Hohlräumen von 10
bis 50 % eines normalen Menschen vorkommende Mikroorganismen
sind, vermehren sich diese Mikroorganismen bei einer
verminderten Resistenz gegen Infektionen im Wirtsorganismus, nach der
Verabreichung von Antibiotika über einen längeren Zeitraum
hinweg oder nach einem chirurgischen Eingriff in abnormer Weise,
schädigen Gewebe und können ins Blut gelangen. Für solch
tiefsitzende Pilzinfektionen ist die Diagnose und Behandlung von
Candida von therapeutischer Wichtigkeit.
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Beispielsweise muß im Fall eines Patienten, der an einem
Immunmangel leidet und der ein hartnäckiges, herkömmlicher
Behandlung standhaltendes Fieber hat, eine tiefsitzende
Candida-Mykose vermutet werden. Zur Diagnose der Candida-Mykose ist es
wichtig, das Vorhandensein von Läsionen in der Netzhaut des
Auges durch eine Fundoskopie festzustellen. Alternativ wird
eine Probe von Blut, einem Abszeß, Urin, eine Gewebeprobe oder
dergleichen in verschiedenen Nährmedien kultiviert und die
Morphologie der kultivierten Mikroorganismen betrachtet oder ein
Zuckervergärungstest oder eine serologische Identifizierung
durchgeführt.
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Für eine schnelle und genaue serologische Diagnose von Candida,
wird bevorzugt ein monoklonaler Antikörper mit höherem
Antikörpertiter und höherer Spezifität als ein Serumantikörper
verwendet. Bislang sind von Mäusen stammende monoklonale Antikörper
gegen Candida beschrieben worden. D.L Brawner und J.E. Cutler
(Infect. Immun. 43, 966, 1984) stellten einen monoklonalen
Antikörper her, welcher C. albicans, C. tropicalis und C.
glabrata von der Gattung Candida agglutiniert oder verklumpt;
N.A. Strockbine et al (Infect. Immun. 43, 1012, 1984) stellten
einen monoklonalen Antikörper gegen Protein von C. albicans
her; und Y. Miyakawa et al (J. Clin. Microbiol. 23, 881, 1986)
stellten einen monoklonalen Antikörper gegen das Mannan-Antigen
von Candida her. Alle in Berichten beschriebenen monoklonalen
Antikörper stammen von Mäusen, nicht von Menschen. Menschliche
monoklonale Antikörper sind insofern von Vorteil, als ihr
F(ab')&sub2;-Fragment leichter zu erhalten ist als das eines
monoklonalen Maus-Antikörpers, was dazu führt, dar ein Diagnostikum
leicht herstellbar ist, Cysteinreste weitverbreitet erhältlich
sind und die non-spezifische Adsorption durch Fc-Anteile
verringert wird.
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Wenn systemische Candida-Mykose bei einem Immunmangel-Patienten
in komplizierter Form vorliegt, wird ein Antimyotikum
systemisch verabreicht. Gegenwärtig werden Amphotericin B und
Flucytosin
als Antimyotika verwendet, und Ketoconazol, Miconazol und
dergleichen befinden sich in der Entwicklung. 0bwohl
Amphotericin ein pharmazeutisches Präparat ist, das hauptsächlich zur
Behandlung von lebensbedrohlichen Candida-Mykosen gewählt wird,
verursacht es Nebenwirkungen wie beispielsweise Fieber,
Nierenleiden und Störungen des Knochenmarks. Flucytosin hat zwar eine
geringere Toxizität als Amphotericin, ist aber gegen Candida-
Mykose weniger wirksam. Ketoconazol und Miconazol verursachen
schwere Nebenwirkungen. In Anbetracht der oben beschriebenen
Lage des Stands der Technik sind pharmazeutische Präparate mit
stärkerer Wirksamkeit gegen Candida-Mykose, jedoch geringeren
Nebenwirkungen erwünscht.
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Wie aus der Tatsache, daß Candida ein gewöhnlicher
Mikroorganismus ist und eine Infektion damit durch einen Immunmangel
verursacht wird, klar erkennbar ist, funktioniert die
Immunkompetenz eines Menschen als ein wirksamer Schutzmechanismus. Das
Immunsystem wird grob in zellvermittelte Immunität und humorale
Immunität eingeteilt. N.N. Pearsall et al immunisierten ein
Tier mit Candida, entnahmen dem Tier Immunozyten und
Immunserum, verglichen die Schutzwirkung der Immunozyten und des
Immunserums mit einem an Candida-Mykose leidenden Tier und
berichteten, daß das Immunserum wirksamer war (J. Immunol. 120,
1176, 1978). Ein als ein Schutzfaktor in einem Immunserum
wesentliches Gebilde ist ein Immunoglobulin (abgekürzt Ig, auch
Antikörper genannt). Demgemäß sollte die Prophylaxe und
Behandlung von Candida-Mykose möglich sein, indem einem an
Immunmangel leidenden Patienten Antikörper gegen Candida verabreicht
werden. Zwar enthalten gegenwärtig im Handel erhältliche
Humanserumglobulin-Präparate Antikörper gegen Candida, doch ist
deren Anteil sehr niedrig, und aufgrund dieses geringen Gehalts
ist die Schutzwirkung gegen Candida natürlich sehr klein. Was
den Gesichtspunkt des Antikörpertiters betrifft, so ist ein
monoklonaler Antikörper ein aus einer einzigen molekularen
Spezies bestehender Antikörper und sein Titer ist höher als
derjenige von in einem Immunserum vorhandenen Antikörpern.
Desweiteren
kann eine große Menge von monoklonalem Antikörper durch
Vermehren von Zellen, welche monoklonale Antikörper
produzieren, hergestellt werden. Zwar sind monoklonale Antikörper gegen
Candida beschrieben worden, doch da diese monoklonalen
Antikörper von Maus-Lymphozyten erhaltenes Maus-Protein sind, wird
dies bei der Verabreichung an einen Menschen als ein Fremdstoff
erkannt und eine Immunreaktion gegen Maus-Protein findet statt,
was eine Hemmung der Immunaktivität des monoklonalen
Maus-Antikörpers zur Folge hat, und ferner bewirkt der Maus-Antikörper
aufgrund eines Antigen-Antikörper-Komplexes ungünstige
Nebenwirkungen. Daher besteht ein Bedarf für die Entwicklung von
monoklonalen, von Menschen stammenden Antikörpern gegen Candida,
welche für die Prophylaxe und Behandlung von
Candida-Infektionen von Nutzen sind.
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Im allgemeinen wird ein vom Menschen stammender monoklonaler
Antikörper von Hybridomen hergestellt, welche durch Zellfusion
zwischen Maus-Myelomzellen, menschlichen Myelomzellen oder
anderen etablierten Lymphozyten und menschlichen Lymphozyten
erhalten werden. Alternativ wird er von durch den EB-Virus
transformierten lymphoblastoiden Zellen produziert. Seit 1980 ist
zwar die Produktion von vielen monoklonalen menschlichen
Antikörpern versucht worden, doch birgt jedes Verfahren
charakteristische Probleme. Die Herstellung eines monoklonalen
Antikörpers mittels Hybridomen, welche durch Zellfusion zwischen Maus-
Myelomzellen und menschlichen Lymphozyten erhalten wurden, ist
instabil und die Effizienz einer Zellfusion zwischen
menschlichen Myelomzellen und menschlichen Lymphozyten ist sehr gering.
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Außerdem liefert die Herstellung eines monoklonalen Antikörpers
mittels Lymphoblastoiden, welche unter Verwendung eines
EB-Virus erhalten wurden, eine geringe Ausbeute und ist instabil.
Desweiteren ergeben sich Probleme hinsichtlich der Sicherheit,
da der EB-Virus Tumore erzeugen kann.
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Wie oben beschrieben gibt es grobe Hindernisse auf dem Weg zur
Etablierung einer Zelle, welche menschliche monoklonale
Antikörper
produziert. Außerdem gibt es hinsichtlich der Gewinnung
von gegen Candida immunisierten menschlichen Lymphozyten ein
Problem. Menschliche Lymphozyten können von peripherem Blut,
einer operativ entfernten Milz, Lymphknoten oder Mandeln oder
aus Mark erhalten werden. Peripheres Blut ist zwar leicht
erhältlich, doch im allgemeinen ist die Verfügbarkeit von anderem
Gewebe sehr eingeschränkt. Außerdem enthält peripheres Blut
normalerweise eine kleine Menge der B-Lymphozyten, und daher
eine sehr kleine Menge von B-Lymphozyten, die von einem Antigen
aktiviert wurden, und ein groper Teil solcher Zellen sammelt
sich im Lymphgewebe. Daher ist die Gewinnung von
Candida-spezifischen B-Zellen aus peripherem Blut schwierig. Selbst bei der
Verwendung von festem Lymphgewebe stehen keine großen Mengen
von ausreichend gegen Candida immunisierten Lymphozytendonoren
zur Verfügung. Demgemäß sind aufgrund der obengenannten
Hindernisse niemals menschliche monoklonale Antikörper gegen Candida
produziert worden.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
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Daher schafft die vorliegende Erfindung ein Hybridom mit der
Fähigkeit, einen menschlichen monoklonalen Antikörper gegen
Candida zu produzieren, dadurch gekennzeichnet, daß das
Hybridom durch das Verfahren erhältlich ist, welches die Schritte
umfaßt:
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Gewinnen von menschlichen B-Lymphozyten,
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Prüfen der Lymphozyten auf Anti-Candida-Aktivität,
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Auswählen der Lymphozyten mit hoher
Anti-Candida-Aktivität,
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Verschmelzen dieser Lymphozyten mit Myelomzellen zur
Bildung von Hybridomen,
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Prüfen der Hybridome auf hohe Antikörperproduktion und
Klonen dieser Hybridome, um Hybridome zu erhalten,
welche in der Lage sind, monoklonale
Anti-Candida-Antikörper zu bilden,
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und daß der daraus hergestellte menschliche, monoklonale
Antikörper eine Fähigkeit besitzt, Candida-Zellen zu agglutinieren
und mit dem Candida-Zellwand-Polysaccharid Mannan zu reagieren.
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Die vorliegende Erfindung schafft auch einen menschlichen
monoklonalen Antikörper gegen Candida, welcher von einem solchen
Hybridom produziert wird, wobei die menschlichen B-Lymphozyten
von menschlichen Mandeln, Milz, Adenoiden oder Lymphknoten
gewählt sind.
Kurze Erklärung der Zeichnungen
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Figur 1 ist ein Graph, der zeigt, wie eine Antigen-Antikörper-
Reaktion zwischen verschiedenen monoklonalen Antikörpern der
vorliegenden Erfindung und C. albicans A durch Mannan gehemmt
wird; und
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Figur 2 ist ein Graph, der zeigt, wie eine Antigen-Antikörper-
Reaktion zwischen verschiedenen monoklonalen Antikörpern der
vorliegenden Erfindung und C. albicans B durch Mannan gehemmt
wird.
Die beste Methode zur Ausführung der Erfindung
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Gemäß der vorliegenden Erfindung wird zuerst ein menschlicher
B-Lymphozyt mit der Fähigkeit zur Produktion eines Antikörpers
gegen Candida gewonnen und eine Zellinie, welche einen
menschlichen Anti-Candida-Antikörper produziert, wird etabliert.
Gemäß dem Verfahren wird ein menschlicher B-Lymphozyt mit der
Fähigkeit zur Produktion eines monoklonalen Antikörpers gegen
Candida, gegebenenfalls nach Stimulieren mit einem
B-Lymphozyten-Aktivierungsfaktor, mit einer Myelomzelle
(Zellfusionspartner) verschmolzen. Nach etwa 3 bis 5 Wochen nach der Fusion
werden Proben des Überstands von entwickelten Hybridomen
entnommen und auf die Gegenwart eines Antikörpers gegen Candida
untersucht. Hybridome, welche einen spezifischen Antikörper
produzieren, werden dann geklont und die Klone ausgewählt, die
eine hervorragende Fähigkeit zur Antikörperproduktion zeigen.
Bei der Verwendung einer Mandelzelle mit einer großen Fähigkeit
zur Produktion von Antikörpern gegen Candida werden zwar Klone,
die einen Candida-spezifischen Antikörper produzieren,
effizient entwickelt, doch da ein Großteil von ihnen eine instabile
Antikörperproduktion zeigt, müssen sie in genauer zeitlicher
Abstimmung unter Zugabe von Feederzellen geklont werden. Die
solchermaßen gewonnenen Zellen, welche einen menschlichen
monoklonalen Anti-Candida-Antikörper produzieren, werden kultiviert
und ein Überstand hiervon wird gesammelt, welcher dann einer
Säulenchromatographie oder dergleichen unterworfen wird, um den
menschlichen monoklonalen Antikörper in Reinform zu erhalten.
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Bei der vorliegenden Erfindung verwendete Lymphozyten sind in
der menschlichen Milz, Lymphknoten, Mandeln, Adenoiden, Mark,
peripherem Blut und dergleichen enthalten. Zwar werden
Lymphozyten aus allen Quellen für die vorliegende Erfindung
verwendet, doch vorzugsweise werden diese Lymphozyten von festem
Lymphgewebe wie den Mandeln, Adenoiden, der Milz oder den
Lymphknoten erhalten. Am meisten bevorzugt wird eine Quelle
verwendet, welche Lymphozyten mit der Fähigkeit liefert, eine
große Menge Antikörper gegen Candida zu produzieren, wenn sie
in vitro mit einem Lymphozytenaktivierungsfaktor und/oder einem
Candida-Antigen kultiviert werden.
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Beispielsweise werden viele menschliche Mandeln, welche an
Mandelentzündung leidenden Patienten entfernt werden, gesammelt
und Lymphozyten von den gesammelten Mandeln abgetrennt. Die
Immunantwort auf Candida variiert erheblich je nach Mandelspender
und dementsprechend werden die Lymphozytenquellen auf eine
große Fähigkeit, in vitro einen Antikörper gegen Candida zu
produzieren, geprüft. Auf diese Weise wird die
Lymphozytenquelle mit der größten Fähigkeit zur Produktion eines
Antikörpers gegen Candida erhalten.
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Wenn von den solchermaßen gewählten Lymphozytenquellen
gewonnene Lymphozyten zur Herstellung von Hybridomen verwendet
werden, vorzugsweise vor der Zellfusion, werden die Lymphozyten
mit einem Aktivierungsfaktor für B-Lymphozyten und/oder einem
Candida-Antigen stimuliert. Der B-Lymphozytenaktivierungsfaktor
kann jede Substanz sein, die das Wachstum von B-Lymphozyten
fördert, beispielsweise Kermesbeerenmitogen (PWM), B-Zellen-
Wachstumsfaktoren (BCGF), Protein A, Phytohaemagglutinin (PHA)
und Concanavalin A. Vorzugsweise werden 2 bis 200 ug/ml PWM
oder ein Hundertstel bis ein Drittel des Volumens BCGF
verwendet. Als Candida-Antigen werden Candida-Zellen als solche oder
ein aus Candida-Zellen extrahiertes Antigen wie etwa Mannan
verwendet. Die Zellen werden vorzugsweise in einer Menge von
1 x 10&sup5; bis 1 x 10&sup8; Zellen/ml verwendet, und Mannan wird
bevorzugt in einem Komplex mit methyliertem Rinderserumalbumin bis
zu einer Konzentration von 10 ng/ml bis 1 ng/ml zugegeben. Die
Methode und die Bedingungen der Stimulierung sind nicht
kritisch, so werden zum Beispiel ein Hundertstel bis ein Drittel
des Volumens BCGF und 1 x 10&sup5; bis 1 x 10&sup7; Lymphozyten gemischt
und kultiviert. Die Kultivierungstemperatur beträgt 35º C bis
40º C und die Kultivierungszeit 3 bis 10 Tage, vorzugsweise 4
bis 6 Tage. Zwar kann jedes Kulturmedium, welches vom Menschen,
vom Rind oder vom Pferd stammendes Serum enthält, verwendet
werden, doch werden Medien wie etwa RPMI 1640, welche fötales
Kalbsserum (FCS) enthalten, besonders bevorzugt.
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Die bei der vorliegenden Erfindung verwendeten Myelomzellen
sind menschliche Myelomzellen, menschliche B-Lymphoblasten,
menschliche B-Lymphomzellen, Maus-Myelomzellen,
Heteromyelomzellen, welche von Hybridomen von menschlichen Lymphozyten und
Maus-Myelomzellen erhalten wurden, oder dergleichen. Als Maus-
Myelomzellinien werden solche mit besonders hohem
Verschmelzungsvermögen bevorzugt, etwa P3 x 63Ag 8, P3-NS1/1-Ag4-1,
P3 x 63AgU1, SP2/OAg 14, P3 x 62Ag 8, 6, 5 und 3, MPC11-45, 6,
TG1.7, SP-1 und dergleichen, obwohl grundsätzlich jede
Myelomzellinie für die vorliegende Erfindung verwendet werden kann.
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Die Verschmelzung zwischen menschlichen Lymphozyten und
Myelomzellen wird wie folgt ausgeführt. Beispielsweise werden
antikörperproduzierende Zellen und Myelomzellen in einem Verhältnis
von 10:1 bis 1:10, vorzugsweise 1:1 bis 1:3, vermischt und der
Mischung ein geeignetes Zellfusionsmedium wie etwa RPMI 1640
zugegeben, welches ungefähr 35 % Polyethylenglykol (ungefähres
Molekülgewicht 1000 bis 6000) und ungefähr 7,5 %
Dimethylsulfoxid enthält, die Mischung wird bei einer Temperatur zwischen
Raumtemperatur und 37º C eine bis mehrere Minuten lang gerührt,
allmählich mit RPMI 1640, welches mit 10 % FCS versetzt wurde,
verdünnt und die Zellkonzentration mittels eines
HAT-Selektionsmediums (Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin) auf 1 bis
5 x 10&sup5; Zellen/ml eingestellt. Dann werden beispielsweise
0,2 ml der Mischung pro Vertiefung auf einer Platte mit 96
Vertiefungen verteilt und in CO&sub2;-enthaltender Luft bei 35º C bis
38º C 2 bis 3 Wochen lang kultiviert. In dem HAT-Medium
überleben nur Hybridome, während Myelomzellen, welche gegen
8-Azaguanin resistent sind, und mit Myelomen fusionierte Myelomzellen
nicht überleben können (nichtverschmolzene
antikörperproduzierende Zellen sterben nach ein paar Tagen ab).
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Nach dem Kultivieren wird der Antikörpertiter der Nährlösungen
überprüft, um Hybridome, welche einen gewünschten Antikörper
produzieren, auszuwählen und zu isolieren (Klonen). Diese
Prüfung des Antikörpertiters in einer Nährlösung kann durch ein
Radioimmunoassay (RIA), ein Enzymimmunoassay (ELISA), oder ein
Zellagglutinationsverfahren durchgeführt werden. Die durch
Klonen ausgewählten Hybridome, welche den menschlichen
monoklonalen Anti-Candida-Antikörper der vorliegenden Erfindung
produzieren, können eingefroren und gelagert werden. Eine solche
Hybridomzellinie und/oder eine hiervon erhaltene Zellinie wird
in großem Umfang gezüchtet, um einen gewünschten menschlichen
monoklonalen Antikörper aus dem Kulturüberstand zu gewinnen.
Als Alternative können Hybridome auch in ein Tier eingepflanzt
werden, um einen Tumor zu bilden, und ein monoklonaler
Antikörper kann aus Aszites oder Serum des Tieres gewonnen werden.
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Menschliche monoklonale Anti-Candida-Antikörper, welche wie
oben beschrieben gewonnen werden, haben die folgenden
Eigenschaften. Die erfindungsgemäßen menschlichen monoklonalen
Anti-Candida-Antikörper gehören zu den Klassen IgG, IgM oder
IgA.
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Die gemäß der vorliegenden Erfindung erhaltenen menschlichen
monoklonalen Antikörper reagieren im allgemeinen mit vielen in
Versuchen erhaltenen Stämmen und klinisch isolierten Candida-
Stämmen. Als Candida-Stämme können C. albicans A, C.
albicans B, C. tropicalis, C. stellatoidea, C. guilliermondii,
C. krusei, C. parapsilosis, C. kefyr und C. glabrate genannt
werden. Gemäß der vorliegenden Erfindung erhaltene menschliche
monoklonale Antikörper haben eine unterschiedliche
Reaktionsfreudigkeit, und daher reagieren einige mit einem breiten
Spektrum der obengenannten Stämme, während andere nur mit wenigen
der Stämme reagieren.
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Die gemäß der vorliegenden Erfindung erhaltenen menschlichen
monoklonalen Antikörper haben eine Aktivität zur Verklumpung
von Candida-Zellen.
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Im allgemeinen ist ein monoklonaler Antikörper mit der
Agglutinierungsaktivität sowohl für diagnostische als auch für
therapeutische Zwecke vorteilhaft, da eine Diagnose leicht mittels
Zellagglutination durchführbar ist und im allgemeinen ein
monoklonaler Antikörper mit einer Agglutinationsaktivität fest an
Zellen bindet, was eine starke Schutzwirkung zur Folge hat.
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Eine Candida-Zelle umfaßt viele antigene Substanzen; im
einzelnen sind Mannan, Proteine und Glucane in der Zelloberfläche
vorhanden. Insbesondere in der Zellwand vorliegendes Mannan ist
für diagnostische und therapeutische Zwecke wichtig. Die gemäß
der vorliegenden Erfindung erhaltenen menschlichen monoklonalen
Antikörper reagieren mit Mannan.
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Für diagnostische und therapeutische Zwecke haben die
erfindungsgemäßen menschlichen monoklonalen Antikörper eine
Aktivität zum Verklumpen von Candida-Zellen, reagieren mit in der
Zellwand vorhandenem Mannan und gehören vorzugsweise zur Klasse
IgG.
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Die vorliegenden menschlichen monoklonalen Antikörper werden
für die Diagnose, Prophylaxe und/oder Behandlung von Candida-
Mykose verwendet.
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Als nächstes wird die vorliegende Erfindung anhand von
Beispielen näher erläutert.
Beispiel 1
(1) Kultivieren von Candida
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Ein Zellrasen von C. albicans A (J 1012) oder C. albicans B
(J 1445) wurde einer Schrägkultur entnommen, 100 ml einer
Nährlösung (0,5 % Hefeextrakt, 1 % Polypepton und 2,0%
Glucose) wurden damit geimpft und über Nacht bei 30º C unter
Schütteln aerobisch kultiviert. Der Nährlösung wurden 35 %
Formalin zugegeben, um eine Endkonzentration von Formaldehyd
von 1 % zu ergeben, und eine Reaktion wurde bei Raumtemperatur
eine Stunde lang durchgeführt. Die Zellsuspension wurde sodann
10 Minuten lang bei 2000 x g zentrifugiert, um die
Candida-Zellen auszufällen, welche dann wieder in 10 ml einer
phosphatgepufferten Kochsalzlösung (PBS) suspendiert und nachfolgend
zentrifugiert wurden, um die Zellen zu waschen. Nach einmaliger
Wiederholung dieser Prozedur wurden die Zellen in 10 ml PBS
suspendiert und für die Lagerung eingefroren. Andere Candida-
Stämme wurden demselben Verfahren wie oben beschrieben
unterworfen, um antigene Materialien herzustellen.
(2) Enzymimmunoassay (ELISA)
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Die obengenannte Stammzellensuspension wurde aufgetaut, zu 2
bis 3 ml der Zellsuspension wurden 500 ml reines Wasser
zugegeben und die verdünnte Zellsuspension wurde in Mengen von
0,03 ml/Vertiefung auf eine ELISA-Platte (Falcon (eingetragenes
Warenzeichen) 3912 Microtest III flexible assay plate,
96 wells) gegeben. Nach 5stündigem Erwärmen der Platte bei
65º C zum Verdampfen der Flüssigkeit wurden 0,05 ml von
0,1 %igem Glutaraldehyd in jede Vertiefung gegeben und 10
Minuten lang reagieren gelassen und nachfolgend der Überstand
entfernt. Als nächstes wurden 0,15 ml mit 0,1 % NaN&sub3; und 1 %
Rinderserumalbumin (BSA) ergänzte PBS in jede Vertiefung gegeben,
und nachdem die Platte bei 37º C eine Stunde stehengelassen
worden war, wurde sie bei 4º C aufbewahrt, um als eine
Assayplatte für ein Anti-Candida-Antikörper-Assay verwendet zu
werden. Dann wurden 60 ul eines Hybridom-Kulturüberstands dieser
Platte zugegeben, welche dann bei Raumtemperatur eine Stunde
stehengelassen wurde. Nach dreimaligem Waschen mit PBS, welche
0,05 * Tween (eingetragenes Warenzeichen) enthielt, wurden der
Platte 60 ul von mit alkalischer Phosphatase gekoppeltem
Ziegen-Antikörper gegen menschliches IgG oder IgM (2000fach
verdünnt) zugegeben und bei Raumtemperatur eine Stunde lang
reagieren gelassen. Nach weiterem dreimaligem Waschen wurden
100 ul einer durch Lösen von p-Nitrophenylphosphat in 1 M
Diethanolamin + 1 mM MgCl&sub2; (pH 9,8) in einem Verhältnis von
0,6 mg/ml hergestellten Lösung der Platte zugegeben und nach 30
bis 60 Minuten die Absorption bei 405 nm gemessen.
(3) Lymphozyten der menschlichen Mandeln
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Durch Operationen entfernte menschliche Mandeln wurden mit
Pinzetten und Scheren in eiskaltem RPMI 1640 zerrissen, um Zellen
zu erhalten. Die Zellen wurden zweimal gewaschen, indem die
Zellen in eiskaltem RPMI 1640 dispergiert und dann mittels
Zentrifugieren
ausgefällt wurden, und schließlich in RPMI 1640,
welches 20 % FCS, 10 % Dimethylsulfoxid und 80 ug/ml Gentamycin
enthielt, auf eine Konzentration von ungefähr 5 x 10&sup7; Zellen/ml
dispergiert. Jeweils 1 ml der Dispersion wurde in Fläschchen
gefüllt und in flüssigem Stickstoff aufbewahrt. Zur Verwendung
wurde die gefrorene Zellsuspension aufgetaut und auf Ficoll-
Paque (eingetragenes Warenzeichen von Pharmacia) gegeben und
nachfolgend bei 2000 U/min 30 Minuten lang zentrifugiert,
wodurch Monozyten in einer oberen Schicht des Ficoll-Paque
gesammelt wurden, und die Monozyten wurden als Lymphozyten verwendet.
(4) Vergleich der Anti-Candida-Antikörperproduktion in vitro
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Aus Mandeln, welche 12 Patienten entnommen worden waren, wurden
Lymphozyten hergestellt und in einer Nährlösung A (RPMI 1640,
10 % FCS, 20 mM HEPES, 2 mM Glutamin, 1 mM Pyruvat, 0,02 mg/ml
Serin und 80 ug/ml Gentamycin) bis zu einer Konzentration von
2 x 10&sup6; Zellen/ml dispergiert und nach Zugeben von 20 ug/ml PWM
6 Tage lang kultiviert. Der Kulturüberstand wurde gewonnen und
gemäß dem in Abschnitt (2) beschriebenen ELISA-Assay auf Anti-
Candida-IgG und Anti-Candida-IgM untersucht. Tabelle 1 zeigt
die Mengen von Anti-Candida-IgG- bzw. IgM-Antikörpern, welche
in vitro von jedem Mandel-Lymphozyt produziert wurden. Die
Zahlenwerte stellen die Absorption bei 405 nm dar. Aufgrund dieses
Ergebnisses wurde festgestellt, daß die Mandeln, die
IgG-Antikörper in großen Mengen produzierten, die Mandeln B, F und K
waren.
Tabelle 1
Mandel
IgG Antikörper
(5) Zellfusion
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Von den Mandeln B und K gewonnene Lymphozyten wurden in einem
Nährmedium A auf eine Dichte von 2 x 10&sup6; Zellen/ml dispergiert,
10 ug/ml PWM wurden der Dispersion zugegeben und diese in
5 % CO&sub2; bei 37º C kultiviert. Die Lymphozyten und
Maus-Myelomzellen wurden wie folgt einer Zellfusion unterworfen. Vor der
Zellfusion wurden Maus-Myelomzellen P3 x 63 Ag8U1 in einem
Nährmedium (Nährmedium A, jedoch ohne HEPES) kultiviert.
1 x 10&sup7; Myelomzellen und 5 x 10&sup6; mit PWM stimulierte
Lymphozyten wurden vermischt, mit einem serumfreien RPMI 1640
gewaschen und schließlich bei 1500 U/min 5 Minuten lang
zentrifugiert, um den Überstand zu entfernen. Das verbliebene
Zellpellet wurde durch Beklopfen des das Zellpellet enthaltenden
Reagenzglases gründlich zerkleinert. Dem Reagenzglas wurde 1 ml
einer Polyethylenglycollösung (5,75 ml RPMI 1640, 3,5 ml
Polyethylenglycol 1000 und 0,75 ml Dimethylsulfoxid) (abgekürzt zu
PEG-Lösung) zugegeben und die Zellen vorsichtig suspendiert.
Nach einer Minute wurde der Zellsuspension 1,0 ml RPMI 1640
zugegeben, und nachfolgend wurden nach einer weiteren Minute
2,0 ml RPMI, nach zwei weiteren Minuten 4,0 ml HAT-Medium
(RPMI 1640, 10 % fötales Kalbsserum, 80 ug/ml Gentamycin,
95 uM Hypoxanthin, 0,4 uM Aminopterin und 1,6 uM Thymidin), und
nach weiteren zwei Minuten 8,0 ml HAT-Medium in dieser
Reihenfolge zugegeben. Schließlich wurde ein HAT-Medium zugegeben, um
125 ml Zellsuspension zu ergeben. Die Suspension wurde auf
5 Kulturplatten (96 Vertiefungen) verteilt und bei 37º C in
5 % CO&sub2;-enthaltender Luft kultiviert. In einwöchigen Abständen
wurde eine Hälfte des Nährmediums durch frisches HAT-Medium
(dasselbe Medium wie das durch Auschließen von A erhaltene
HAT-Medium) ersetzt, um Hybridome zu erhalten.
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Die Hybridome wurden mittels ELISA auf Produktion von
Anti-Candida-IgG geprüft und ein Teil des ELISA-Ergebnisses ist in
Tabelle 2 aufgeführt. Daraus wird ersichtlich, daß Hybridome
(Klone), welche einen Anti-Candida-IgG-Antikörper produzierten,
sehr wirksam entwickelt waren.
Tabelle 2
Zellfusionsplatte (*)
ELISA-Wert (relativer Wert der Absorption bei 405 nm)
Anzahl der Klone
Platte Nr. 1 (Mandel B)
(*) Jede
Platte hatte 96 Vertiefungen
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Das Klonen wurde mittels "limited dilution" durchgeführt. Das
heißt, von Vertiefungen, welche Anti-Candida-Antikörper
aufwiesen, wurden Zellen gewonnen, gezählt und in die Vertiefungen
einer Platte in einem Verhältnis von einer Zelle pro Vertiefung
oder 10 Zellen pro Vertiefung unter Verwendung einer
Nährlösung B (RPMI 1640, 10 % FCS, 2 mM Glutamin, 1 mM Pyruvat,
0,02 mg/ml Serin und 80 ug/ml Gentamycin) verteilt. Nach zwei
Wochen waren die Zellen ausreichend gewachsen und daher wurden
die Überstände durch Assay geprüft, um mittels ELISA das
Vorhandensein von monoklonalen Anti-Candida-Antikörpern zu
bestimmen und Hybridome mit der Fähigkeit, einen monoklonalen Anti-
Candida-Antikörper zu produzieren, auszuwählen.
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Auf diese Weise wurden die Hybridome PLT2-16, PML2F7 und AAE3H4
etabliert, und diese Hybridome produzieren nun weiterhin auf
stabile Weise menschliche monoklonale Antikörper.
(7) Spezifität von menschlichen monoklonalen Anti-Candida-
Antikörpern
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Mittels ELISA wurde gefunden, dar die menschlichen monoklonalen
Antikörper PLT2-26 und PML2F7 IgM-Antikörper sind und AAE3H4
ein IgG-Antikörper ist, und daher wurde ihre Fähigkeit, auf
unterschiedliche Arten von Candida-Stämmen zu reagieren, mittels
ELISA untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt.
Tabelle 3
Menschlicher
monoklonaler
Antikörper
Candida-Stämme (*1) (*2)
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(*1) Die Werte stellen das ELISA-Ergebnis dar
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(*2) Stämme von Candida wie folgt
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1. C. albicans A (J 1012)
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2. C. albicans B (J 1445)
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3. C. tropicalis (J 1017)
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4. C. guilliermondii (J 1023)
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5. C. parapsilosis (J 1015)
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6. C. krusei (J 1005)
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7. C. kefyr (J 1004)
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8. C. glabrata (J 4002)
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9. Aspergillus fumigatus
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10. Keine Zugabe von Zellen
(8) Von menschlichem MCA erkanntes Candida-Antigen
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Mannan von C. albicans wurde wie folgt in Reinform gewonnen.
Zellen wurden zur Wasserextraktion im Autoklaven behandelt und
dem Extrakt 75 % Ethanol zugegeben, um Ausfällungen zu
erhalten. Die Ausfällungen wurden wieder in Wasser gelöst und der
Lösung wurde Fehlingsche Lösung zugegeben, wodurch Ausfällungen
erhalten wurden, welche sodann in einer verdünnten Lösung von
Chlorwasserstoffsäure gelöst wurden und wiederum mittels
75 % Ethanol ausgefällt wurden. Die Ausfällungen wurden in
3,7 N Essigsäure gelöst und der Lösung wurde Aktivkohle
zugegeben, um alle Verunreinigungen außer Mannan zu adsorbieren und
zu eliminieren. Auf diese Weise wurde gereinigtes Mannan von
C. albicans erhalten.
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Dieses Mannan wurde zum Prüfen der Hemmung einer
Antigen-Antikörper-Reaktion verwendet. Zuerst wurde eine wäßrige Lösung von
0,1 mg/ml Mannan schrittweise zweifach verdünnt und der
verdünnten Lösung (50 ul) eine Menge von menschlichem monoklonalem
Antikörper (59 ul) zugegeben und das Ganze eine Stunde lang bei
Raumtemperatur reagieren gelassen. Dann wurden 70 ul der
Mischung in eine Vertiefung einer ELISA-Platte gegeben, wie in
Abschnitt (2) beschrieben, um eine Reaktion eines menschlichen
monoklonalen Antikörpers gegen C. albicans A und B mittels
ELISA zu messen. Die Ergebnisse sind in den Figuren 1 und 2
gezeigt. Die Ergebnisse zeigen, daß bei allen drei monoklonalen
Antikörpern, d.h. AAE3H4, PLT2-16 und PML2F7, die
Antigen-Antikörper-Reaktion ab einer bestimmten Mannan-Konzentration
gehemmt wurde.
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(9) Aktivität von menschlichem monoklonalem
Anti-Candida-Antikörper zur Agglutination von Candida-Zellen
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Lebende Candida-Zellen und mit Formalin behandelte Zellen, wie
in Abschnitt (1) beschrieben, wurden unabhängig voneinander in
PBS suspendiert und 10 ul der Suspension gründlich mit 10 ul
von menschlichem monoklonalem Antikörper (ungefähr 10 ug/ml)
auf einem Objektträger vermischt, und die Agglutination wurde
sowohl durch das Mikroskop als auch mit dem bloßen Auge
betrachtet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt.
Tabelle 4
Menschlicher MCA
C. albicans A
+ : agglutiniert
- : nicht agglutiniert
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Anhand diesen Ergebnisses wurde festgestellt, daß diese drei
menschlichen MCA eine Fähigkeit zum Verklumpen von
Candida-Zellen besitzen.
(10) Reinigung des menschlichen monoklonalen Antikörpers
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AAE3H4-Hybridomzellen wurden in Medium B dispergiert und
kultiviert, wobei eine Zellkonzentration zwischen 1 x 10&sup5; Zellen/ml
und 10 x 10&sup5; Zellen/ml beibehalten wurde. Dann wurden 480 ml
eines resultierenden Kulturüberstands in eine Säule für eine
Protein A-Sepharose (eingetragenes Warenzeichen) (Größe 1,2 cm
x 2,1 cm) gegeben, und nach Waschen der Säule mit PBS und
Wasser wurde ein menschlicher monoklonaler Antikörper mittels
einer verdünnten Lösung von Chlorwasserstoffsäure (pH 2,5)
eluiert. Das Eluat wurde sofort durch Zugeben von einem Zehntel
des Volumens von 10fach konzentrierter PBS neutralisiert. Auf
diese Weise wurden ungefähr 4,6 mg Protein erhalten. Mittels
Elektrophorese wurde bestätigt, daß dieses Protein ein
gereinigter Antikörper war (Molekulargewicht ungefähr 160000), und
mittels ELISA wurde bestätigt, daß es ein Antikörper gegen
C. albicans war.
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Das obengenannte Hybridom AAE3H4 wurde als AAE3H4(CA)
bezeichnet und am 27. September 1988 bei der Fermentation Research
Institute Agency of Industry and Technology, 1-3 Higashi
1-chome Tsukuba-shi Ibaraki-ken Japan als internationale
Hinterlegung FERM BP-2074 gemäß dem Budapester Vertrag hinterlegt.
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Auskunft über gemäß Rule 13-2 Depository Authority hinterlegte
Mikroorganismen: Ministry of Trade and Industry, Fermentation
Research Institute Agency of Industry and Technology.
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Adresse: 1-3 Higashi 1-chome Tsukuba-shi Ibaraki-ken, Japan.