DE3745135C2 - Verwendung von hydrophilen Triazolothieno-diazepinen zur Behandlung von Arteriosklerose - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung von hydrophilen Triazolothieno-diazepinen zur Behandlung von Arteriosklerose, die durch den Abbau der Endothelzellenbarriere hervorgerufen wird.

Das Endothel bildet eine zellige Auskleidung, die das Gewebe schützt. Beim Durchbrechen der Endothelzellenbarriere treten eine Reihe von Erkrankungen auf. So kann eiweißreiche Flüssigkeit aus dem Gewebe austreten, was zur Ödembildung führen kann. Auch kann die Herabsetzung der Endothelzellbarriere in Rahmen von bakteriellen Erkrankungen (Endotoxinschock), viralen sowie autoimmunen Entzündungen und Allergien sowie Pseudoallergien auftreten. Eine unbeschädigte Endothelzellbarriere in verpflanzten Organen stellt die Grundvoraussetzung für das Gelingen von Organverpflanzungen dar. Weiterhin kann durch Herabsetzung der Endothelzellbarriere die Blut-Hirnschranke beeinträchtigt werden. Da das Endothel vor einer Absiedlung von erkrankten Gewebezellen schützt, wirkt es einer Metastasierung entgegen. Auch führen Läsionen des Endothels zu einem gesteigerten Stoffeinstrom, der Reaktionen hervorruft, die zur Arteriosklerose führen können.

Eine PAF-Acether-Bildung in aktivierten Zellen ruft Störungen in den großen und kleinen Gefäßen hervor. Diese können zur Verengung von Koronargefäßen, zu intestinalen Ulcera, zu Haut- und Lungenerkrankungen führen.

PAF-Acether (platelet-activating-factor) ist seiner chemischen Struktur nach 1-0- Alkyl-2-acetyl-sn-glyceryl-3-phosphorylcholin (J. Exp. Med. 1972, 136: 1356-1377; J. Biol. Chem. 1979, 254: 9355-9358). Es ist bekannt, daß PAF-Acether starke inflammatorische und hypotensive Eigenschaften besitzt und die koronare Vasokonstriktion sowie die akute Ödembildung in der Haut induziert. Es sind PAF- Acether-Rezeptoren an Blutplättchen, polymorphonuklearen Neutrophilen und Membranpräparationen menschlichen Lungengewebes beschrieben worden (J. Immunol. 1982, 129: 1637-1641; Thromb. Res. 1986, 41: 699-706).

In DE 35 02 392 A1 werden neue Thieno-triazolo-1,4-diazepino-2-carbonsäureamide, Verfahren zu ihrer Herstellung und pharmazeutische Zusammensetzungen offenbart; siehe Seite 7 bis 12. Diese Verbindungen sollen PAF-Acether antagonistische Wirkung haben; siehe Seite 12, 6. Absatz. Auf Seite 13, Absatz 2 und 3, werden Entzündungsprozesse des Tracheobronchialbaumes (akute und chronische Bronchitis, Asthma bronchiale) oder der Niere (Glomerulonephritis), anaphylaktische Zustände, Allergien und Entzündungen im Bereich der Schleimhäute und der Haut (z. B. Psoriasis) sowie durch Sepsis, Endotoxine oder Verbrennungen bedingte Schockzustände als Indikationen der PAF-Antagonisten genannt. Als Indikationen werden Entzündungen und Allergien von Bronchien, Trachealbaum, der Haut und der Schleimhaut genannt.

Aufgabe der Erfindung ist es, Substanzen für die Behandlung von Arteriosklerose bereitzustellen, die durch den Abbau der Endothelzellenbarriere hervorgerufen oder begleitet wird.

Dies wird erfindungsgemäß durch hydrophile Triazolothieno-diazepine erreicht, die die PAF-Acether-Bindungsstellen an Zellen inhibieren.

Diese Substanzen eignen sich insbesondere zur Behandlung von Entzündungen, Allergien, Ödemen, bakteriellen Erkrankungen, spastischen Koronarverengungen, Arteriosklerose, Abstoßungsreaktionen bei Organverpflanzungen sowie des Endotoxinschocks. Sie sind ferner zur Herabsetzung der Metastasierung geeignet. Triazolothieno-diazepine, wie WEB 2086 sind in Br. J. Pharmac. (1987), 90: Seite 139-146 beschrieben. Von den hydrophilen Triazolothieno-diazepin-Verbindungen sind insbesondere WEB 2086 und 2098 geeignet.

Erfindungsgemäß werden insbesondere WEB 2086 und WEB 2098 verwendet, um eine Durchbrechung der Endothelzellenbarriere durch PAF-Acether sowie durch PAF- Acether stimmulierte Zellen zu verhindern.

Wie nunmehr festgestellt wurde, weisen die Endothelzellen Bindungsstellen oder Rezeptoren für PAF-Acether auf. Durch Wechselwirkung mit diesen Rezeptoren kommt es zur intrazellulären Calciumvorschiebung und zur Bildung von Mediatoren, wie Histamin, Prostaglandinen, usw., einschließlich PAF-Acether selbst, die die Endothelzellen angreifen bzw. zerstören.

Möglich ist auch, daß an die Rezeptoren von Endothelzellen gebundener PAF-Acether zur Adhärenz von aktivierten Zellen, wie Thrombozyten, Neutrophilen, Eosinophilen, Monozyten, Tumorzellen und dergleichen führt, die PAF-Acether auf der Oberfläche ihrer Plasmamembranen tragen und ihrerseits die Bildung von Mediatoren hervorrufen.

Thrombozyten, Neutrophile sowie möglicherweise Eosinophile und Tumorzellen weisen ihrerseits Rezeptoren für PAF-Acether auf. Ein weiterer Mechanismus, der zur Durchbrechung der Endothelzellenbarriere führen kann, dürfte darin bestehen, daß bei Bindung von PAF-Acether an die Rezeptoren dieser Zellen die erwähnten Mediatoren ausgeschüttet werden, die dann die Endothelzellen angreifen.

Um dem zu begegnen, werden erfindungsgemäß hydrophile Triazolothieno-diazepine verwendet, die einerseits die PAF-Acetherbindung an den Endothelzellen direkt inhibieren, andererseits aber auch die Bindung von PAF-Acether an anderen Zellen, wie Thrombozyten, Neutrophilen und Eosinophilen blockieren und damit einen indirekten Angriff dieser Mediatoren auf die Endothelzellen verhindern.

D. h. erfindungsgemäß werden hydrophile Triazolothieno-diazepine verwendet, die PAF-Acether-Bindungsstellen an Endothelzellen inhibieren, wegen der Mediatorbildung bei einer PAF-Acether-Bindung an andere Zellen und der Beeinträchtigung der Endothelzellen durch diese Mediatoren können jedoch auch solche Verbindungen zur Anwendung kommen, die die PAF-Acether-Bindungsstellen an diesen Zellen inhibieren.

Die PAF-Acether-Bindungsstellen inhibierenden Substanzen können durch Injektion oder oral verabreicht werden.

Die nachstehend beschriebenen Versuche dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.

1. Herstellung der Endothelzellen

Menschliche Endothelzellen wurden von der Nabelschnurvene isoliert (J. Clin Invest. 1973, 52: 2745-2756). D. h. die Vene wurde mit einer Kanüle versehen und mit 0,1%igen Collagenaselösungen gefüllt (Typ I, Sigma, St. Louis, MO, USA). Nach einer 10 Minuten langen Inkubation bei 37°C wurden die gelösten Zellen herausgespült und durch Zentrifugation gesammelt. Die Zellen wurden in einem Hams F-12-Medium mit 10% hitzeinaktiviertem fötalen Kalbserum (FCS Hyclone, Logan, Utah, USA), 1% Ultroser SF (IBF, Villeneuve 1a Garenne, Frankreich) und 90 µg/ml Heparin ergänzt mit 50 U/ml Penicillin und 50 µg/ml Streptomycin, resuspendiert (Science 1983, 222: 623-625). Die Zellen wurden in einer 25 cm² Kulturflasche inkubiert (Primaria, Falcon, Labware, Oxnard, Californien, USA), und zwar eine Stunde. Die nichthaftenden Zellen wurden dann abgezogen und die haftenden Zellen wurden weiter in frischem Kulturmedium kultiviert, wobei ein Mediumwechsel alle 2 Tage vorgenommen wurde. Wenn die Kulturen-Konfluenz (3 bis 5 Tage) erreicht haben, wurden die Zellen geerntet, indem sie kurz Trypsin-EDTA (Gibco, Paisly, Schottland) ausgesetzt wurden und in eine 35 mm Kulturschale (Primaria, Falcon) mit einem 1 : 3 bis 1 : 5 Splitverhältnis gegeben wurden. Die Zellen wurden dann weiter in einem Hams F-12-Medium mit 15% FCS, 1% Ultroser FS und 90 µg/ml Heparin wachsen gelassen, wobei ein Mediumwechsel alle zwei bis drei Tage vorgenommen wurde. Die Zellen erreichten eine Konfluenz nach 4 bis 6 Tagen, wobei die Zahl der Zellen 5,2 ± 0,15 × 10⁵ je Schale betrug. Die Zellen des ersten Durchgangs wurden während der gesamten Untersuchung verwendet. Die Kulturen wurden als Endothelzellen aufgrund morphologischer Kriterien und durch indirekte Immunfluoreszenz unter Verwendung eines spezifischen Antiserums für humanes Faktor VIII-Antigen (Nordic Immunol. Tilburg, Niederlande), welches ein übliches Markierungsmittel für endotheliale Zellen ist, bestimmt. Die Endothelzellkulturen enthielten keine Monocyten/Makrophagenhaltigen Zellen aufgrund morphologischer Kriterien und durch indirekte Immunfluoreszenz unter Verwendung monoklonaler Antikörper für alpha₂-Makroglobulin.

2. PAF-Acether-Bindung an Endothelzellen

Von den konfluenten, also zusammengewachsenen menschlichen Endothelzellen wurde zweimal sorgfältig das Kulturmedium mit Tyrodes Puffer abgewaschen, welcher 0,25% entfettetes Rinderserumalbumin (BSA) enthielt. Zu den konfluenten endothelialen Zellen wurden bei 20°C 900 µl Tyrodes Puffer (pH 7,4), 0,25% BSA (Grad v. Sigma), 1,3 mM Ca²⁺, 100 µl ³H-PAF-Acether (0,065 nM Endkonzentration) (1-0-³H-Octadecyl-2-acetyl-sn-glyceryl-3-phosphorylcholin 80 Cl/mmol, Amersham, Bucks, Großbritannien) mit und ohne 500 nM (Endkonzentration) unmarkiertem PAF-Acether (1-0-Octadecyl-2-acetyl-sn-glyceryl- 1-phosphorylcholin) (Bachem, Bubendorf, Schweiz) in unterschiedlichen Zeitabständen (3, 5, 15, 30 Min.) gegeben.

Bei einem zweiten Experiment wurden unterschiedliche Konzentrationen von 3H- PAF-Acether (0,0325-0,65 nM Endkonzentrationen) in Abwesenheit oder Gegenwart von unmarkiertem PAF-Acether oder dessen Enantiomeren (3-0-Hexadecyl-2-acetyl­ glyceryl-1-phosphocholin) (500 nM) 30 Minuten inkubiert, wie vorstehend beschrieben.

In weiteren Versuchen wurde der PAF-Acether-Antagonist WEB 2086 (1, 10, 100, 1000 nM, Endkonzentration) oder Vehikel (isotonische NaCl-Lösung) zusammen mit 0,65 nM ³H-PAF-Acether zu konfluenten Endothelzellen gegeben.

Nach 30 Minuten wurde die freie Aktivität zweimal von den konfluenten Endothelzellen mit Tyrodes Puffer (pH 6,4) welcher BSA enthielt, bei 20°C gewaschen, und dann einmal mit kalter isotonischer NaCl-Lösung. Die Zellen wurden durch Zugabe von kalter isotonischer EDTA-NaCl-Lösung (5 mM) getrennt, wonach bei 4°C 30 Minuten inkubiert wurde. Die gelösten Zellen wurden von dem Medium durch Vakuumfiltration mit einem Millipore-Vakuumsystem (Molsheim, BRD) abgetrennt. Der Inkubationspuffer wurde ebenfalls filtriert, um einen Verlust an Zellen während des Waschvorgangs nach dem Bindungsversuch zu vermeiden. Die Filter wurden zweimal mit 10 ml kaltem Tyrodes Puffer gewaschen und die Radioaktivität die an die Filter gebunden war, wurde unter Standardbedingungen in PSC (Amersham) bestimmt. Die filtergebundene Radioaktivität in Abwesenheit von Endothelzellen wurde abgezogen von der Radioaktivität in Gegenwart von Endothelzellen. Die gebundene Radioaktivität wurde in fmol ³H-PAF-Acether, gebunden an 5,20 ± 0,15 × 10⁵ endotheliale Zellen, berechnet.

Nach einer Inkubation von 30 Minuten mit steigenden Konzentrationen von PAF- Acether-Antagonisten wurden die Zellen durch kalte EDTA NaCl-Lösung freigesetzt und dann durch Vakuumfiltration abgetrennt. Die ³H-PAF-Acether-Bindung wurde in fmol, gebunden an 5,2 ± 0,15 × 10⁵ Endothelzellen berechnet.

Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 1 wiedergegeben.

Tabelle 1 WEB 2086

1 nM	0,66 ± 0,2 fmol
10 nM	1,5 ± 1,1 fmol
100 nM	2 ± 1,1 fmol
1000 nM	3 ± 0,7 fmol

D. h. die PAF-Acetherbindung an 5,2 × 10⁵ Endothelzellen vermindert sich bei einem Zusatz von 1 nM WEB 2086 um 0,66 ± 0,2 und bei 1000 nM um 3 ± 0,7 fmol.

4. ³H-PAF-Acether-Abbau

Konfluente humane Endothelzellen wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen von ³H-PAF-Acether (0,065; 0,13; 0,653 nM Endkonzentrationen) unter den Bedingungen des Bindungsversuchs bei 20°C 30 Minuten inkubiert. Die Endothelzellen wurden sorgfältig dreimal gewaschen und durch dreimaliges Gefrieren und Auftauen gelöst. Die suspendierten lysierten Endothelzellen (1 ml) wurden in Chloroform/Methanol (1 : 2 V/V) extrahiert und es wurde Chloroform/Wasser (1 : 1 V/V) zugegeben. Die Chloroformphase wurde isoliert und die Wasserphase wurde mit Chloroform dreimal gewaschen, um eine Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) durchzuführen (C. R. Acad. Sci. Paris, 1979, 289: 1037-1040).

In der nachstehenden Fig. 1 ist die ³H-PAF-Acether-Bindungs-Kinetik gezeigt, d. h. der Effekt von unmarkiertem PAF-Acether (500 nM) auf die ³H-PAF-Acetherbindung (0,065 nM) an kultivierte humane Endothelzellen. Die Endothelzellen (5,2 ± 0,15 × 10⁵) wurden in unterschiedlichen Zeiträumen mit ³H-PAF-Acether in Abwesenheit (⚫) oder in Gegenwart (O) von unmarkiertem PAF-Acether inkubiert und dann durch Inkubation in EDTA-NaCl-Lösung (5 mM) bei 4°C vor einer Vakuumfiltration freigesetzt. Die spezifische Bindung (∎) wurde als Differenz des gesamten gebundenen (⚫) ³H-PAF-Acether in Abwesenheit gegenüber unspezifisch gebundenen in Gegenwart von unmarkiertem PAF-Acether (O) ausgerechnet. Die ³H-PAF- Acether-Bindung wurde in % der gesamten Radioaktivität berechnet. Die Werte sind Mittelwerte (± 1 SD) von drei Versuchen.

Die kultivierten humanen Endothelzellen, an die ³H-PAF-Acether (0,065 nM) in einer zeitabhängigen Weise gebunden ist, erreichten nach einer Inkubationszeit von 5 Min. ein Plateau, wie Fig. 1 zu entnehmen. Nach einer Inkubation von 30 Min. setzte nicht markierter PAF-Acether (500 nM) die ³H-PAF-Acether-Verbindung um 33,0 ± 6,6% herab.

In Fig. 2 ist die ³H-PAF-Acether-Bindung an adherente humane Endothelzellen wiedergegeben. Nach einer Inkubation von 30 Minuten mit zunehmenden Konzentrationen von ³H-PAF-Acether (0-0,653 nM) in Abwesenheit (⚫) oder Gegenwart (O) von unmarkiertem PAF-Acether (500 nM) wurden Endothelzellen mit EDTA-NaCl (5 mM) Lösung bei 4°C vor dem Abtrennen durch Vakuumfiltration freigesetzt. Die Differenz des gesamten gebundenen ³H-PAF-Acether in Abwesenheit gegenüber Gegenwart von nicht markiertem PAF-Acether (spezifische Bindung ∎) wurde in fmol, gebunden an 5,2 ± 0,15 × 10⁵ Endothelialzellen, ausgerechnet.

Nach 30 Minuten erreichten humane Endothelzellen, an die ³H-PAF-Acether gebunden war (Gesamtbindung) in einer konzentrationsabhängigen Weise noch kein Plateau. In Gegenwart von überschüssigem unmarkiertem PAF-Acether (500 nM) wurde ³H-PAF-Acether (unspezifische Bindung) in einer konzentrationsabhängigen nicht absättigbaren Weise ebenfalls gebunden. Die Differenz zwischen der gesamten (⚫) und der unspezifischen Bindung (O), welche als spezifische Bindung (∎) definiert wird, erreichte ein Plateau von 1,72 ± 0,9 fmol, gebunden an 5,2 ± 0,15 × 10⁵ Endothelzellen bei Konzentrationen höher als 0,16 nM ³H-PAF-Acether, wie aus Fig. 2 hervorgeht. Die Scatchard-Datenanalyse zeigte einen Kd-Wert von 0,043 nM.

Die Stereospezifität der endothelialen Bindungsstellen für PAF-Acether wurde nachgewiesen, da das Enatiomere von PAF-Acether die Bindung von ³H-PAF- Acether nicht beeinflußte.

In vergleichenden Bindungsstudien wurden Endothelzellen und Thrombozyten untersucht. (Thrombosis Res., 1986, 41: 699-706). In Scatchardanalysen wurden dabei für Endothelzellen ein K_D von 0,043 nM und für Thrombozyten von 0,54 nM errechnet. Die unterschiedliche Affinität der Bindungsstellen führt zu Bezeichnungen der "very high affinity pafacether receptors" (VHA-pafacether-receptors) und "high affinity receptors" (HA-pafacether-receptors).

5. Diskussion der vorstehenden Ergebnisse

Der PAF-Acether-Antagonist WEB 2086 inhibiert die ³H-PAF-Acether-Bindung (0,65 nM) an Endothelzellen in einer konzentrationsabhängigen Weise (Tabelle 1).

Nach einer Inkubation von 30 Min. der konfluenten Endothelzellen mit zunehmenden Konzentrationen von ³H-PAF-Acether (0,065 bis 0,65) wurde ein Abbau von ³H- PAF-Acether ausgeschlossen, da intakter ³H-PAF-Acether (93,4 ± 0,67%) mittels Hochdruckflüssigkeitschromatographie gewonnen wurde und lediglich 1,4 ± 0,99% ³H-PAF-Acether zu ³H-Lyso-PAF-Acether abgebaut wurde.

Diese Ergebnisse zeigen, daß spezifische Bindungsstellen für PAF-Acether in menschlichen Endothelzellen in Kulturen bestehen. Die spezifische Bindung (Differenz zwischen gesamter und unspezifischer Bindung) wurde mit ³H-PAF- Acether zwischen 0,16 und 0,65 nM gesättigt, was eine konstante Menge von Bindungsstellen an Endothelzellen andeutet, die in der Lage sind, ³H-PAF-Acether in reversibler Weise zu binden, wobei ein ³H-PAF-Acether-Abbau ausgeschlossen wird.

Die konzentrationsabhängige Inhibierung der ³H-PAF-Acether-Bindung durch WEB 2086 unterstreicht die Gegenwart von spezifischen Bindungsstellen an Endothelzellen. Die PAF-Acether-Bindung an Endothelzellen scheint im übrigen anders zu sein als an Blutplättchen, da der Kd-Wert eine viel höhere Affinität wiedergibt und WEB 2086 die ³H-PAF-Acether-Bindung inhibiert.

Die Gegenwart von PAF-Acether-Rezeptoren in Endothelzellen deutet auf deren Funktion hin. Blutplättchen und Neutrophile sind eindeutige Beispiele von Zellen, welche PAF-Acether-Rezeptoren besitzen und beide bilden und setzen diesen Mediator als Messenger zwischen Zellen der gleichen Spezies frei, wodurch ein Aktivierungssignal sich fortpflanzt und verstärkt. Dies dürfte auch zwischen benachbarten Endothelzellen der Fall sein. Darüber hinaus wird angenommen, daß PAF-Acether eines der Signale zwischen stimulierten Endothelzellen einerseits und Blutplättchen und Neutrophilen andererseits darstellt. Demzufolge können die Membranrezeptoren für PAF-Acether der molekulare Träger für die Gegenwart des Mediators an der Außenseite (und Innenseite) der Membran sein.

In der Tat initiieren Mediatoren, wie Histamin, Bradykin, ATP, Leukotriene C₄ und D₄ und Interleukin 1 die PAF-Acether-Synthese von kultivierten humanen Endothelzellen. Synthetisierten PAF-Acether bleibt stark mit den Zellen verbunden und konnte nicht freigesetzt werden, was auf eine PAF-Acether-Bindung an zelluläre Membranen hindeutet, welche die Haftung der Neutrophilen stimulieren kann (Proc. Natl. Acad. Sci. 1986, USA, 83: 2204-2208; J. Clin. Invest. (1986); 77: 2027- 2033). Weiterhin mag eine PAF-Acether-ähnliche Substanz, die erstmals in Lipoproteinen gefunden wurde, die Adherenz von Monozyten, Thrombozyten und weiteren Blutzellen erhöhen und somit zur Entstehung der Arteriosklerose beitragen.

Die vorstehenden Ergebnisse zeigen also spezifische ³H-PAF-Acether-Bindungsstellen (VHA-Bindungsstellen) an humanen Endothelzellen, welche nicht mit den spezifischen ³H-PAF-Acether-Bindungsstellen an Blutplättchen (HA-Bindungsstellen) übereinstimmen.

Wie vorstehend erwähnt, werden erfindungsgemäß neben Substanzen, die die Bindung von PAF-Acether an Rezeptoren der Endothelzellen inhibieren, auch solche Substanzen eingesetzt, welche PAF-Acether-Rezeptoren an anderen Zellen, insbesondere Blutplättchen (Thrombozyten) inhibieren, da die Bindung von PAF- Acether an diese Zellen zur Bildung von Mediatoren führt, die die Endothelzellen angreifen. Weiterhin können sich die Zellen mittels ihrer eigenen Bindungsstellen an endothelial gebundenen PAF-Acether anlagern. Demgemäß wurden auch Versuche zur PAF-Acether-Bindung an Thrombozyten durchgeführt. Diese hier nicht näher beschriebenen Versuche ergaben, daß von den hydrophilen Triazolothieno-diazepin- Verbindungen insbesondere WEB 2086 und 2098 zu einer signifikanten Inhibierung der PAF-Acether-Rezeptoren an Thrombozyten führen, während WEB 2105 und WEB 2118 eine erheblich geringere Inhibierung zeigten.

Claims (3)

1. Verwendung von hydrophilen Triazolothieno-diazepinen zur Behandlung von Arteriosklerose, die durch den Abbau der Endothelzellenbarriere hervorgerufen wird.

2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die hydrophilen Triazolothieno-diazepine WEB 2086 oder WEB 2098 sind.

3. Verwendung der hydrophilen Triazolothieno-diazepine nach Anspruch 1 oder 2 in Form von Präparaten zur Injektion oder oralen Verabreichung.