DE3137668A1 - Verfahren zum testen auf vitamin b(pfeil abwaerts)1(pfeil abwaerts)(pfeil abwaerts)2(pfeil abwaerts) und testsatz zu seiner durchfuehrung - Google Patents

Verfahren zum testen auf vitamin b(pfeil abwaerts)1(pfeil abwaerts)(pfeil abwaerts)2(pfeil abwaerts) und testsatz zu seiner durchfuehrung

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DE3137668A1 DE19813137668 DE3137668A DE3137668A1 DE 3137668 A1 DE3137668 A1 DE 3137668A1 DE 19813137668 DE19813137668 DE 19813137668 DE 3137668 A DE3137668 A DE 3137668A DE 3137668 A1 DE3137668 A1 DE 3137668A1
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Description

DR. A. VAN DER WERTH DR. FRANZ LEDERER R. F. MEYER-ROXLAU DIPL.-ING. (1934-1974) DIPL-CHEM. DIPL--1NG.
8000 MÖNCHEN 80 LUCILE-GRAHN-STRASSE 22
TELEFON: (089) 472947 TELEX: 624624 LEDER D TELEGR..-LEDERERPATENT
22. Sept. 1981 4925
AMERSHAM INTERNATIONAL LIMITED
White Lion Road
Amersham, Buckinghamshire, HP7 9LL, England
Verfahren zum Testen auf Vitamin B12 und Testsatz zu seiner
Durchführung
Serum-B-2r an Trägerprotein gebunden, muß freigesetzt werden, bevor darauf getestet werden kann. Bei herkömmlichen Methoden wird das Serum 15 bis 30 min in Gegenwart von Cyanid erwärmt. Bei in großen klinischen Chemielaboratorien durchgeführten Tests ist jedes Erhitzen unerwünscht, da es den Arbeitsfluß unterbricht. Ein Erwärmungsvorgang, der aufgrund der Gegenwart von Cyanid (insbesondere bei saurer Lösung) die Verwendung eines Abzugs erfordert, ist höchst unerwünscht.
Ein Aufsatz in Clinical Chemistry, Band 26, Nr. 2, 1980, Seiten 323 - 326, schlägt einen Test vor, bei dem endogenes Serums' aus seinen Proteinkomplexen bei Raumtemperatur mit NaOH bei pH 13,6 freigesetzt wird. Das Arbeitsprotokoll weist aber auf die Verwendung sehr großer Cyanid-Konzentrationen (2000 μg/ml Serum) bei der Denaturierung hin. Auch wird Auster-Krötenfisch-Serum als spezifisches Reagens für Vitamin B12 anstelle des üblicheren Schweine-Intrinsikfaktors verwendet. Soweit bekannt, ist dieser Test nicht gewerblich verwertet worden. Es besteht ein klar erkannter und lange verspürter
Jt-S
Bedarf an einem Test auf Vitamin B12 unter Verwendung des Intrinsikfaktors, wobei bindende Serumproteine denaturiert werden, ohne Wärme oder hohe Cyanidkonzentrationen anzuwenden.
Bekannt ist, daß Dithiopolyole, wie Dithiothreitol (DTT), die Freisetzung von Vitamin B12 aus bindenden Serumproteinen fördern können. Ein Aufsatz im American Journal of Clinical Pathology, August 1980, Band 74, Nr. 2, Seiten 209 bis 213, vergleicht drei handelsübliche Vitarain B1„-Testsätze, bei denen die Denaturierung von Serumproteinen durch Kochen erfolgt. Ein bei einem der Testsätze auftretendes Problem nicht-spezifischer Bindung wurde durch Einbeziehen von DTT und Cöbinamid zusammen mit den anderen Testbestandteilen behandelt.
Die Erfindung schafft ein Verfahren zum Testen auf Vitamin B12 in Serum mit folgenden Schritten:
a) Mischen einer Probe des zu testenden Serums mit Alkali, Cyanid und einem Dithiopolyol mit 4 bis 6 Kohlenstoffatomen,
,^-V b) Inkubieren des Gemischs bei einer Temperatur nicht
über 50 0C ausreichend lange, um das Vitamin B.. von den bindenden Serumproteinen abzutrennen und die Proteine im wesentlichen zu denaturieren,
c) entweder vor, während oder nach der Stufe b) Bildung einer Standardmenge an radioaktiv markiertem Vitamin B12 und einem Vitamin B1„-Analogon, das sich fest an die bindenden Serumproteine der Probe bindet, nicht aber an den Intrinsikfaktor, ·
d) Senken des pH-, erts des inkubierten Gemischs aus der Stufe b), Zugabe einer Standardmenge an Intrinsikfaktor, die
nicht ausreicht, um das gesamte Vitamin B12 in der Probe und das radioaktiv markierte Vitamin B^? zu binden, und
e) Inkubieren des Gemischs, um einen Teil des Vitamins B12 in der Probe und einen Teil des radioaktiv markierten Vitamins B12 an äen Intrinsikfaktor gebunden werden zu lassen, Abtrennen des gebundenen Anteils vom nicht so gebundenen Anteil, Messen des Radioaktivitätswerts wenigstens eines Anteils und Verwerten der Messung zur Bestimmung der Konzentration an Vitamin B1? in der Probe.
Ein Merkmal der Erfindung ist das Einbeziehen eines Dithiopolyols mit 4 bis,6 Kohlenstoffatomen in Stufe a) zur Förderung der Abtrennung des Vitamins B12 von den bindenden Serumproteinen. Bevorzugte Dithiopolyole sind 1,4-Dithiotetritole, einschließlich die beiden Isomeren Dithiothreitol und Dithioerythritol. Diese werden vorzugsweise in Anteilen von 2 bis 20, insbesondere 4 bis 10 mg/ml Serumprobe verwendet.
Ein weiteres Merkmal der Erfindung ist die Verwendung von Cyanid in Stufe a). Cyanid wandelt die verschiedenen vorhandenen Cobalamine in Cyanocobalamine um. Vermutlich fördert das Dithiopolyol die Freisetzung von Cyanocobalaminen aus bindenden. Serumproteinen. Dithiopolyole sind besonders wirksam in Gegenwart von Cyanid, was vermuten läßt, daß sie besser in der Lage sind, Cyanocobalamine als andere Cobalamine aus bindenden Serumproteinen freizusetzen. Die erfindungsgemäß bevorzugte Cyanidkonzentration ist 10 bis 1000, insbesondere 20 bis 200 μg/ml Serumprobe.
Cyanid und Dithiopolyole fördern die Abtrennung von Vitamin B12 von bindenden Serumproteinen, denaturieren aber selbst nicht die Proteine. Daher besteht, wenn der pH-Wert in Stufe b) herabgesetzt wird, die Gefahr, daß die bindenden
Serumproteine in gewissem Ausmaß mit dem Vitamin B1- rekombinieren. Gemäß einem weiteren Merkmal der Erfindung wird diese Gefahr dadurch vermieden, daß in das Gemisch bei Stufe d) ein Vitamin B1„-Analogon einbezogen wird, das jegliche verbliebenen nicht-denaturierten bindenden Serumproteine der Probe bindet, nicht aber den zugesetzten Intrinsikfaktor. Die verwendete Menge des Vitamin B12-Analogons sollte wenigstens ausreichen, alle Bindungsstellen der nicht-denaturierten bindenden Serumproteine der Probe zu besetzen, und sie ist das vorzugsweise 10- bis 1000-fache der zum Besetzen aller Bindungsstellen erforderlichen Menge. Ein geeignetes Vitamin B1?-Analogon ist Cobinamid, das fest an bindende Serumproteine gebunden wird, aber überhaupt kaum an den Intrinsikfaktor. Andere Vitamin B1„-Analoga können verwendet werden.
In Stufe b) erfolgt die Trennung und teilweise Denaturierung von den bindenden Serumproteinen bei einer Temperatur nicht über 50 eC und vorzugsweise bei Raumtemperatur. Der pH-Wert der Probe sollte wenigstens 12,0, vorzugsweise 12,5 bis 13,7, insbesondere 12,9 bis 13,5, sein. Das Alkali, das bequemerweise Natriumhydroxid ist, wird in einer Menge verwendet, die den gewünschten pH-Wert zu erreichen erlaubt. Die für die Umsetzung erforderliche Zeit ist im allgemeinen 5 bis 60 min, typischerweise etwa 15 min, und kann durch Versuch und Irrtum leicht bestimmt werden.
In Stufe b) wird das Gemisch der behandelten Probe und des Intrinsikfaktors unter pH- und Temperaturbedingungen inkubiert, bei denen der Intrinsikfaktor Vitam B12 stark bindet. Diese Bedingungen können pH 9,3 bei Raumtemperatur sein.
Der Vitamin B12~Tracer kann herkömmlicherweise mit Kobalt-57 markiert sein. Der Tracer kann der Serumprobe entweder vor, während oder nae. Stufe b) zugesetzt werden. Es kann bequem sein, ein einziges Reagens zur Verfügung zu stellen,
das markiertes Vitamin B12 und Cyanid enthält, zur Zugabe zur Probe in Stufe a).
Das Vitamin B12-Analogon, z.B. Cobinamid, kann vor, während oder nach der Stufe b)· zugesetzt werden. Vorzugsweise wird es nach der Stufe b) zugesetzt. Es kann bequem sein, ein einziges Reagens, das Cobinamid und Intrinsikfaktor enthält, in Stufe d) vorzusehen.
Die Stabilität des Dithiopolyols ist stets problematisch gewesen. Bei einem handelsüblichen Vitamin B.. .,-Testsatz wird DTT als wässrige Lösung zugeführt, die bei 4 eC bis zu 30 Tage nach Öffnen des Gefäßes gelagert werden kann. Vor der Verwendung wird die DTT-Lösung mit dem radioaktiven Tracer gemischt, um eine arbeitende Tracerlösung zu ergeben, die nur einen Tag stabil ist. Bei einem weiteren handelsüblichen Testsatz wird DTT als gefriergetrocknetes Pulver zur Verfügung gestellt, das als solches bei 2 bis 8 0C gelagert werden kann. Nach dem Rekonstituieren muß es bei -20 0C gelagert werden. Vor dem Gebrauch wird es mit dem markierten Vitamin B1^ zu einer arbeitenden Tracerlösung gemischt.
Ein weiteres Merkmal der Erfindung liegt darin, daß das Dithiopolyol im Gemisch mit dem zum Denaturieren der Serumproteine verwendeten Alkali vorgesehen werden kann. Dies ist unerwartet, da es seit langem bekannt ist, daß Mercaptane durch Luft leicht zum Disulfid oxidiert werden, insbesondere in alkalischer Lösung. Der erfindungsgemäße Test, der ohne ein Dithiopolyol nicht arbeitet, arbeitet mit Lösungen von DTT in NaOH, die über 14 Wochen bei 2 bis 4 0C oder bis zu 2 Wochen bei 37 0G aufbewahrt worden sind, völlig zufriedenstellend.
•Die Erfindung liefert somit ferner einen Testsatz zur Durchführung eines Tests auf Vitamin B1 „ in Serum mit Quellen für
Alkali/ einem Dithiopolyol mit 4 bis 6 Kohlenstoffatomen, Cyanid, radioaktiv markiertem Vitamin Β.«, IntrinsikEaktor und einem Vitamin B12~Analogon, das in Serum fest an bindende Serumproteine gebunden wird, nicht aber an den Intrinsikfaktor, wobei die Quellen für Alkali und Dithiopolyol im Gemisch vorliegen.
Es ist ziemlich üblich, einen Doppeltest auf Vitamin B12 und Folat durchzuführen, und zwar unter Zugabe von mit Kobalt-57 markiertem Vitamin B12 und mit Jod-125 oder Jod-131 markiertem Folat und spezifischen bindenden Proteinen für beide Materialien zur selben Serumprobe. Das erfindungsgemäße Verfahren zum Testen auf Vitamin B12 kann vorteilhafterweise zusammen mit einem Folat-Test durchgeführt werden. Folat liegt normalerweise in Serum zusammen mit Folat bindenden Proteinen vor. Stufe b) des erfindungsgemäßen Verfahrens, bei tiefer Temperatur durchgeführt, um bindende Serumproteine zu entfernen, hat keinen schädlichen Einfluß auf den Folattest.
Die Quelle für den Intrinsikfaktor ist unwichtig. Gewöhnlich wird Intrinsikfaktor vom Menschen oder Schwein verwendet.
Beispiel 1
Reagentien und Arbeitsvorschrift für einen erfindungsgemäßen Test.
Reagentien
a) Standards enthalten Vitamin B12 in geeichten Mengen, auf Puffer-Basis, menschliches Serumalbumin enthaltend.
b) Tracer ist Co-Cyanocobalamin in einem konservierten 10 mM Phosphatpuff r, 0,1 Gew.-%/Vol.-% Kaliumcyanid enthaltend.
c) Denaturierungsreagens ist eine 1,2m Natriumhydroxidlösung mit 1,0 % Dithiothreitol.
d) Bindendes Reagens ist gereinigter Intrinsikfaktor vom Schwein in einem konservierten 0,2 m Boratpuffer, menschliches Serumalbumin und 20 |ig/l· Cobinamid enthaltend.
e) Kohletabletten sind ein Gemisch aus mit Protein überzogener Aktivkohle mit mikrokristalliner Cellulose in einem Gewichtsverhältnis von 1:3.
Testarbeitsweise
1. Die Teströhrchen werden markiert und in Gestellen aufgestellt nach dem in Tabelle I wiedergegebenen Protokoll.
2. 200 μΙ-Teilmengen der Standards und unbekannte Sera werden in die geeigneten Röhrchen mit einer frischen Pipettenspitze für jede neue Lösung pipettiert.
3. 100 μΙ-Mengen Tracer werden in alle Röhrchen pipettiort.
4. 100 μΙ-Teilmengen Denaturierungsreagens werden in alle Röhrchen pipettiert.
5. Gründliches Wirbelmischen aller Röhrchen, damit keine Tropfen unvermischten Reagens übrig bleiben. Bedecken der Röhrchen mit einem Gewebe und Inkubieren in gedämpftem Licht für 15 min bei Raumtemperatur.
6. 10Ö0 μΐ des bindenden Reagens werden in alle Röhrchen pipettiert/ mit Ausnahme der "Totais" und Blindprobenröhrchen. 1000 μΐ destilliertes Wasser werden in die "Totais" und Blindprobenröhrchen pipettiert.
7. Alle Röhrchen werden gründlich wirbelgemiscbt und
45 min bei Raumtemperatur in gedämpftem Licht inkubjert.
8. Gegen Ende der Inkubationsperiode wird mit einer
Pinzette eine Aktivkohletablette in jedes Röhrchen, mit
Ausnahme der "totals",gegeben.
9. Die Tabletten können für wenigstens 5 bis 10 s zerfallen. 1 bis 2 s wird durchwirbelt, entfernt und sofort
wieder weitere 6 bis 10 s durchwirbelt»
10. Alle Röhrchen werden bei Raumtemperatur 15 min inkubiert.
11. Alle Röhrchen (ausgenommen die "totals")werden wenigstens 10 min bei 1500 g zentrifugiert. Das freie Vitamin B12 wird von der Aktivkohle adsorbiert; das gebundene Vitamin B12 bleibt in der überstehenden Flüssigkeit.
12. Nach dem Zentrifugieren werden die überstehenden
Flüssigkeiten in einen klaren Satz markierter Röhrchen dekantiert, die Röhrchenränder leicht aneinander geklopft, um die überstehende Flüssigkeit vollständig zu überführen.
13. Alle Röhrchen werden in einem geeignet programmierten ^-Zähler 60 s oder auf wenigstens 10 000 Zählimpulse in den Röhrchen 5 bis 6 gezählt.
Ergebnisse
1. Auf log/lin.-Papier werden zwei Standardkurven erstellt, indem die Zählimpulse pro Zeiteinheit auf der linearen Achse gegen die Konzentration an Vitamin B12 oder
Folat auf der log-Acvi~e aufgetragen werden. Es werden die
besten Standardkurven ^urch das Mittel doppelter Punkte unter Ausschluß stark abweichender Punkte erstellt.
2. Unter Verwendung des Mittels der Zählimpulse für die unbekannten Proben werden deren Vitamin B1^- oder FoIat-Konzentrationen aus der jeweiligen Standardkurve abgelesen.
Der obige Test wurde mit einem führenden kommerziellen Testsatz (der ein Kochen der Probe zwecks Denaturierung erfordert) und mit einem herkömmlichen mikrobiologischen Test (der als eine genaue Bestimmung liefernd anerkannt ist, aber zu langsam und zu schwer zu handhaben ist) verglichen. In beiden Fällen wurde eine lineare Beziehung mit einem hohen Korrelationskoeffizienten über 0,94 gefunden. Dies zeigt, daß der erfindungsgemäße Test genaue Ergebnisse erzielt, ohne unter den Nachteilen bestehender Tests zu leiden, nämlich der Notwendigkeit, die Probe in Alkali mit Cyanid zum Denaturieren der Serumproteine zu kochen.
Die Abkürzung "totals" steht für die Gesamtradioaktivität des radioaktiven Tracers, die in Lösung vorliegt, wenn keine Aktivkohle zur (teilweisen) Ausfällung den Röhrchen • zugesetzt wurde.
Tabelle I
Testprotokoll
Anmerkung: Alle Volumina "Totais"
1 - 2		 in μΐ 0
5-6		 50
7-8		 1000 150
9-10		 STANDARDS 1000
13-14		 2000
15-16		 UNBEKANNT 1 1000 1000 1000 2
etc.
Röhrchen — Blind
probe
3-4		 200 200 — 200 400
11-12		 200 200 — — — — _
Standards 200 _ _ 200 mm _ 200 200
Rontrollen oder
unbekannte Proben		 100 _ 100 100 100 _ 100 100 100 100
Zweifach-Tracer — 100 100 100 100 100 100 100 100 100
Denature ^rungs-
reagens		 100 Wirbelmischen. 15 min 100 Inkubation bei Raumtemperatur
- 1000 1000 1000 1000
Lösung binden
den Proteins		 1000 - — — — -
Wasser 1000
Wirbelmischen. 45 min Inkubation bei Raumtenperatur
Zugabe einer Aktivkohle-Tablette zu allen Röhrchen (ausgenommen den "Totais"), 1-2 s Wirbelmischen, Entfernen und Wirbelmischen für weitere. 6 bis 10 s.
15 min Inkubation aller Röhrchen bei Raumtemperatur.
Zentrifugieren aller Röhrchen 10 min bei 1500 g. Dekantieren der überstehenden Flüssigkeiten in einen sauberen Satz markierter Röhrchen und Auszählen.
CO CO
CJ) CT) 00
- jar-"
Beispiel 2
Die folgenden Reagentien und Arbeitsweisen wurden zur Bestimmung der Serum-Blindproben (nicht-spezifische Bindung von Vitamin B13)/ erhalten unter verschiedenen Bedingungen in der/alkalischen Denaturierungsstufe des Vitamin B15-TeStS, angtiwandt. Aus den späteren Daten wird klar, daß einzigartig definierte Bedingungen für die wirksame Denaturierung von Vitamin B-. „ bindenden Proteinen in menschlichem Serum mit Natriumhydroxid nötig sind.
Reagentien
1a. i ,.5 η Natronlauge.
1b. Destilliertes Wasser. ·
Tracer-Lösung
2a. 1,5 \iCi ( Co) Vitamin B1 „-Tracer in Kaliumphosphatpuffer mit menschlichem Serumalbumin und Konservierungsstoff.
2b. Wie 2a, aber auch KCN (0,5 mg/ml) enthaltend.
2c. Wie 2a, aber auch Dithiothreitol (1 Gew./Vol.-?.) enthaltend.
2d. Wie 2a, aber auch KCN (0,5 mg/ml) und Dithiothreitol (1 Gew./Vol.-%)-Testlösung enthaltend.
3a. Natriumborat-Puff er, pH 7,2, mit menschlichem Serumalbumin und .Natriumchlorid.
3b. Wie 3a, aber auch Dithiothreitol (0,1 Gew./Vol.-%) enthaltend.
3c. Wie 3a, aber auch KCN (50 ug/ml) enthaltend.
3d. Wie 3a, aber auch Dithiothreitol (0,1 Gew./Vol.-%) . und KCN (50 μg/ml) enthaltend.
3e. Wie 3a, aber auch Cobinamid (20 ng/ml) enthaltend.
4. Mit Protein überzogene Kohle-Suspension in 0,9 (Gew./Vol.) % Natriumchloridlösung mit Konservierungsstoff (75 mg Aktivkohle/ml).
Arbeitsweise zur Bestimmung Serum-unspezifischer Bindung
1 Testbedingungen
2 3 4 5 6		 2a 2b 2c 2d 7 Röhrchen mit
Gesamtradio
aktivität
1a 1a 1a Ta
2a 2d — — — —. 2d 2a
1b 1a 1a 1a
3a —
Zugabe von 200 μΐ Serum * Zugabe von 100 μΐ Reagens Zugabe von 100 μΐ Reagens Zugabe von 100Ομ1 Reagens
Wirbelmischen und Inkubieren für 15 min bei Raumtemperatur (ausgenommen die Röhrchen unter Testbedingung 2, die 15 min bei 100 0C inkubiert werden) .
Zugabe von 1000μ1 von 200 μΐ Reagens 3a - 3d 3b 3c 3a 3e 3a
Wirbelmischen und Inkubieren für 45 min bei Raumtemperatur
Zugabe Reagens 4 4 4 4 4 4 4 -
Wirbelmischen und 5 min stehenlassen. Zentrifugieren aller Röhrchen ausgenommen die "Totais" 10 min bei 1500 g, Dekantieren überstehender Flüssigkeiten in einen klaren Satz markierter Röhrchen. Alle überstehenden Flüssigkeiten und der Gesamtgehalt der "Total"-Röhrchen werden in einem ^-Zähler gezählt.
* Zwölf menschliche Serumproben wurden unter jeder Bedingung getestet.
·- jar--
Ergebnisse
Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle aufgeführt. Die Werte sind die mittleren Zählwerte, erhalten an 12 einzelnen Serumproben, ausgedrückt als Prozentsatz der Gesamtzählimpulse.
Mittlere (n = 12) Serum-Blindwerte,erhalten unter verschiedenem Bedingungen beim Vitarn B., -,-Test
Testbedingungen ' Serum-Blindwert
(% nicht-spezif.Bindung)
1. Test ohne Denaturierung endogener 87,1 (+7,5) bindender Proteine
2. Test mit Wärmedenaturierung (sieden- 7,2 (+ 0,9) des Wasserbad
Alkalische Denaturierung:
3. DTT und KCN in der Testlösung (pH 9,3) 23,7 (+ 3,2)
4. KCN in Tracer-Lösung (pH 13). DTT in 28,9 (+ 3,0) der Testlösung (pH 9,3)
5. DTT in Tracer-Lösung (pH 13). KCN in
der Testlösung (pH 9,3) 15,6 (+3,4)
6. OTT und KCN in Tracer-Lösung (pH 13) 8,9 (+ 0,8)
7. DTT und KCN in Tracer-Lösung (pH 13) 4,3 (+ 0,4) 20 ng/ml Cobinamid in der Testlösung
(pH 9,3).
Diskussion
Die Bedingung 1, bei der es keine Denaturierung gab, zeigt, daß die Masse des Vitamins B1- im Serum in gebundener. Form vorliegt. Bei der Bedingung 2 erfolgte die Denaturierung durch Kochen mit Cyanid, eine unbequeme Stufe, die aber die nicht-spezifische Bindung auf einen annehmbaren Wert senkte.
Raumtemperatur-Denaturierung, mit oder ohne Cyanid (Bedingnng 4 und 3) beließ 20 bis 30 % des Vitamins B12 gebunden an
nicht-spezifische Serum-Proteine. Raumtemperatur-Denaturierung in Gegenwart von Dithiothreitol (Bedingung 5) lieferte bessere Ergebnisse, und diese wurden weiter erheblich verbessert, wenn Cyanid auch vor dem Denaturieren zugesetzt wurde (Bedingung 6). Das Ergebnis der Bedingung 6 wurde noch weiter verbessert, wenn Cobinamid in der Testlösung zugegen war (Bedingung 7).
,»*■» Die Ergebnisse der Bedingung 2, 6 und 7 waren unter dem Gesichtspunkt der Genauigkeit alle annehmbar, aber die Bedingung 6 und 7 hatten gegenüber der Bedingung 2 den großen
Vorteil, daß Ergebnisse unter Anwendung lediglich von Raumtemperaturen erzielt wurden.

Claims (10)

  1. Patentansprüche
    1 ./Verfahren zum Testen auf Vitamin B12 in Serum, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:
    a) Mischen einer Probe des zu testenden Serums mit
    Alkali, Cyanid und einem Dithiopolyol mit 4 bis 6 Kohlenstoffatomen,
    b) Inkubieren des Gemischs bei einer Temperatur nicht
    über 50 0C ausreichend lange, um das Vitamin B12 von den bindenden Serumproteinen abzutrennen und die Proteine im we-
    " ■■ sentlichen zu denaturieren,
    c) entweder vor, während oder nach der Stufe b) Bildung einer Standardmenge an radioaktiv markiertem Vitamin B12 und einem Vitamin B12~Analogon, das sich fest an die bindenden
    Serumproteine der Probe bindet, nicht aber an den Intrinsikfaktor,
    d) Senken des pH-Werts des inkubierten Gemischs aus der Stufe b), Zugabe einer Standardmenge an Intrinsikfaktor, die nicht ausreicht, um des gesamte Vitamin B12 in der Probe und
    das radioaktiv markierte Vitamin B12 zu binden, und
    e) Inkubieren des Gemischs, um einen Teil des Vitamins B12 in der Probe und einen Teil des radioaktiv markierten Vitamins B1- an den Intrinsikfaktor gebunden werden zu lassen, Abtrennen des gebundenen Anteils vom nicht so gebundenen Anteil, Messen des Radioaktivitätswerts wenigstens eines Anteils und Verwerten der Messung zur Bestimmung der Konzentration an Vitamin B12 in der Probe.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe a) das Alkali und das Dithiopolyol als vorgebildetes Gemisch der Serumprobe zugesetzt werden.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch.gekennzeichnet, daß als Dithiopolyol· Dithiothreitol oder Dithioerythritol verwendet wird.
  4. 4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Vitamin B^-Analogon Cobinamid ist.
  5. 5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß Cyanid in Stufe a) in einer Menge· entsprechend 20 bis 200 μg Kaliumcyanid/ml Serum verwendet wird.
  6. 6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Dithiopolyol in Stufe a) in einer Menge von 4 bis 10 mg/ml Serum verwendet wird.
  7. 7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Vitamin B1„-Analogon in der 10- bis TOOO-fachen Menge der zum Besetzen aller Bindungsstellen der bindenden Serumproteine, die durch die Inkuba-
    tionsstufe b) nicht denaturiert worden sind, erforderlichen Menge verwendet wird.
  8. 8. Testsatz zur Durchführung eines Tests auf Vitamin B12 in Serum mit Quellen für Alkali, ein Dithiopolyol mit 4 bis 6 Kohlenstoffatomen, Cyanid, radioaktiv markiertes Vitamin B1-, Intrinsikfaktor und ein Vitamin B1 ,,-Analogon, das sich in Serum stark an bindende Serumproteine bindet, aber nicht an den Intrinsikfaktor, wobei die Quellen für Alkali und Dithiopolyol im Gemisch vorgelegt sind.
  9. 9. Testsatz nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Quellen für radioaktiv markiertes Vitamin B12 und Cyanid im Gemisch vorgelegt sind.
  10. 10. Testsatz nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Vitamin B12-Analogon Cobinamid ist.
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US (1) US4426455A (de)
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111624074A (zh) * 2020-07-07 2020-09-04 江苏拜明生物技术有限公司 一种用于血清中维生素b12含量检测的释放剂、制备及应用

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4806493A (en) * 1984-03-19 1989-02-21 Icn Micromedic Systems, Inc. Stabilizers for use in serum folate assays
US4680273A (en) * 1985-07-29 1987-07-14 Victor Herbert Assay for vitamin B12 deficiency
US6942977B1 (en) 1991-04-09 2005-09-13 Bio-Rad Laboratories, Inc. Immunoassays for determining vitamin b12, and reagents and kits therefor
CA2104967A1 (en) * 1992-01-06 1993-07-07 Francee S. Boches Binding protein capture assay
GB0004042D0 (en) * 2000-02-21 2000-04-12 Axis Shield Asa Assay
US7163918B2 (en) * 2000-08-22 2007-01-16 New River Pharmaceuticals Inc. Iodothyronine compositions
CN107219373B (zh) * 2016-03-22 2020-07-07 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 维生素b12检测试剂盒和方法及其样本前处理方法
WO2018175186A1 (en) * 2017-03-20 2018-09-27 Trustees Of Boston University Methods relating to the measurement of vitamin d and vitamin d metabolites
CN109709253A (zh) * 2019-01-31 2019-05-03 杭州度安医学检验实验室有限公司 液相色谱串联质谱测定维生素b12的方法及试剂盒
CN113495158A (zh) * 2020-03-20 2021-10-12 郑州达诺生物技术有限公司 一种样本前处理剂、一种维生素b12定量检测试剂盒及使用方法
CN114011111B (zh) * 2022-01-05 2022-04-01 广州科方生物技术股份有限公司 用于结合蛋白中萃取维生素的萃取液及其制备方法和应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4146602A (en) * 1977-01-27 1979-03-27 Becton, Dickinson & Company Simultaneous radioassay of folate and vitamin B12
GB2011070A (en) 1977-12-14 1979-07-04 Technicon Instr Assay of vitamin B12

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4028465A (en) 1975-11-10 1977-06-07 Bio-Rad Laboratories Assay method for serum folate
US4279859A (en) 1977-07-21 1981-07-21 Becton Dickinson & Company Simultaneous radioassay of folate and vitamin B12
US4332786A (en) 1980-05-15 1982-06-01 Baxter Travenol Laboratories, Inc. Method and composition for vitamin B-12 Assay

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4146602A (en) * 1977-01-27 1979-03-27 Becton, Dickinson & Company Simultaneous radioassay of folate and vitamin B12
GB2011070A (en) 1977-12-14 1979-07-04 Technicon Instr Assay of vitamin B12

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GB 20 11 070 A *
WO 79/00880 A1 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111624074A (zh) * 2020-07-07 2020-09-04 江苏拜明生物技术有限公司 一种用于血清中维生素b12含量检测的释放剂、制备及应用
CN111624074B (zh) * 2020-07-07 2024-01-30 江苏拜明生物技术有限公司 一种用于血清中维生素b12含量检测的释放剂、制备及应用

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DE3137668C2 (de) 1985-03-07
US4426455A (en) 1984-01-17

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