DE3031334C2 - Microbiological process for the production of cholanic acid derivatives - Google Patents

Microbiological process for the production of cholanic acid derivatives

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DE3031334C2
DE3031334C2 DE3031334A DE3031334A DE3031334C2 DE 3031334 C2 DE3031334 C2 DE 3031334C2 DE 3031334 A DE3031334 A DE 3031334A DE 3031334 A DE3031334 A DE 3031334A DE 3031334 C2 DE3031334 C2 DE 3031334C2
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Description

Die Erfindung betrifft das im Patentanspruch angegebene mikrobiologische Verfahren zur Herstellung von Cholansäurederivaten der Formel:The invention relates to the microbiological method specified in the claim for the production of Cholanic acid derivatives of the formula:

JOJO 3535 -40-40

5555 6060 6565

COORCOOR

(D(D

OHOH

in der X für \" OH oder = O und R für Wasserstoff, ein Alkalimetall oder Erdalkalimetall steht, mit den bei diesem Verfahren verwendeten Mikroorganismen. Das Verfahren der Erfindung ermöglicht die Herstellung der Cholansäurederivate der Formel (I) in hoher Ausbeute in kurzer Zeit durch Kultivieren der angegebenen Mikroorganismen in einem Nährmedium, das Cholsäure oder ein Salz von Cholsäure als Substrat enthält.
Die Cholansäurederivate der Formel (I), in der X fürX" OH steht, nämlich la, 7a-Dihydroxy-12-keto-5^-cholan
in which X stands for OH or = O and R stands for hydrogen, an alkali metal or alkaline earth metal, with the microorganisms used in this process. The process of the invention enables the cholanic acid derivatives of the formula (I) to be prepared in high yield in a short time Culturing the specified microorganisms in a nutrient medium which contains cholic acid or a salt of cholic acid as a substrate.
The cholanic acid derivatives of the formula (I) in which X stands for X "OH, namely la, 7a-dihydroxy-12-keto-5 ^ -cholane

säure oder ihre Salze, sind geeignete Zwischenprodukte für die Herstellung der Chenodesoxycholsäure (CDCA) als Gallensteinlöser. Das Cholansäurederivat der Formel (I), in der X für =0 steht, d.h. 7a-Hydroxy-3,12-diketo-5/ö-cholansäure oder ihre Salze, sind geeignete Zwischenprodukte für die Herstellung von Deoxycholsäure, die ein geeignetes Ausgangsmaterial für die Herstellung von Progesteron und Adrenalkortikosteroidderivaten ist.acid or its salts are suitable intermediates for the production of chenodeoxycholic acid (CDCA) as a gallstone remover. The cholanic acid derivative of the formula (I) in which X = 0, i.e. 7a-hydroxy-3,12-diketo-5 / δ-cholanic acid or their salts, are suitable intermediates for the production of deoxycholic acid, which is a suitable starting material for the production of progesterone and adrenal corticosteroid derivatives is.

Es ist bekannt, daß Cholansäuredertvate der Formel (I) nach einem mikroblellen Verfahren unter Verwendung von Cholsäure oder eines Salzes von Cholsäure als Substrat hergestellt werden können. Beispielsweise beschreiben Hayakawa et al. ein Verfahren zur Herstellung von 3ar,7ar-Dlhydroxy-12-keto-5/J-Cholansäure durch Verwendung des Stammes Streptomyces gelatlcus 1164 [The Journal of Biochemistry (Japan), 44, Nr. 2 (1957) 109-113 und Proceedings of Japan Academy, 32 (1956) 519-522]. Hasegawa et al. beschreiben ein Verfahren zur Herstellung von 3or,7ar-Dlhydroxy-12-keto-5/?-cholansäure durch Verwendung des Stammes Asperglllus clnnamomeus HUT 2026 [Hiroshima Journal of Medical Science, Band 8, Nr. 3 (1959) 277-283]. Klkuchl und Mitarbeiter beschreiben ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung von 3a,7a-Dlhydroxy-12-keto-5/?-cholansäure durch Verwendung des Stammes Staphylococcus epldermldls H-I [Journal of Biochemistry, Band 72, Nr. 1 (1972) 165-172]. Ferner beschreiben Hayakawa und Mitarbeiter ein Verfahren zur Herstellung von 7cr-Hydroxy-3,12-dlketo-5/?-cholansäure unter Verwendung von Streptomyces gelatlcus, Stamm 1164 [Proceedings of Japan Academy, Band 32 (1956) 519-522].It is known that cholanic acid derivatives of the formula (I) by a microbial process under Using cholic acid or a salt of cholic acid as a substrate can be prepared. For example describe Hayakawa et al. a process for the preparation of 3ar, 7ar-Dlhydroxy-12-keto-5 / J-cholanic acid by using the strain Streptomyces gelatlcus 1164 [The Journal of Biochemistry (Japan), 44, No. 2 (1957) 109-113 and Proceedings of Japan Academy, 32 (1956) 519-522]. Hasegawa et al. describe a procedure for the production of 3or, 7ar-Dlhydroxy-12-keto-5 /? - cholanic acid by using the strain Asperglllus Namomeus HUT 2026 [Hiroshima Journal of Medical Science, Vol. 8, No. 3 (1959) 277-283]. Klkuchl and Employees also describe a process for the preparation of 3a, 7a-Dlhydroxy-12-keto-5 /? - cholanic acid by using the strain Staphylococcus epldermldls H-I [Journal of Biochemistry, Volume 72, No. 1 (1972) 165-172]. Hayakawa et al. Also describe a process for the preparation of 7cr-hydroxy-3,12-dlketo-5 /? - cholanic acid using Streptomyces gelatlcus, strain 1164 [Proceedings of Japan Academy, Volume 32 (1956) 519-522].

Bei diesen Verfahren Ist jedoch die Konzentration der Cholsäure als Substrat Im Nährmedium gering, beispielsweise nicht höher als 10 g/l. Nach Untersuchungen der Anmelderin ist es bei der Herstellung von Cholansäurederivaten nach den bekannten mikrobiologischen Verfahren notwendig, die Cholsäure In niedriger Konzentration zu verwenden, da die zu verwendenden Mikroorganismen schlecht oder kaum wachsen, wenn die Konzentration der Cholsäure im Nährmedium 20 g/l oder mehr beträgt. Ferner erfordern diese bekannten Verfahren eine zu lange Zelt für die Kultivierung. Es Ist daher erwünscht, ein Verfahren zur Herstellung von Cholansäurederivaten in hoher Ausbeute Innerhalb kurzer Zeit zu entwickeln. Es wurde nun gefunden, daß gewisse Mikroorganismen, die zu den Gattungen Arthrobacter, Brevibacterium und Cornynebacterlum gehören,With these methods, however, the concentration of cholic acid as a substrate in the nutrient medium is low, for example not higher than 10 g / l. According to the applicant's studies, it is used in the production of cholanic acid derivatives according to the known microbiological processes necessary, the cholic acid in low concentration to use because the microorganisms to be used grow poorly or hardly if the The concentration of cholic acid in the nutrient medium is 20 g / l or more. Furthermore, these require known methods too long a tent for cultivation. It is therefore desirable to have a method for producing Cholanic acid derivatives in high yield to develop within a short time. It has now been found that certain microorganisms belonging to the genera Arthrobacter, Brevibacterium and Cornynebacterlum,

in einem Medium, das Cholsäure oder ihr Salz als Substrat in einer Konzentration innerhalb eines weiten Bereichs enthält, zu wachsen und die Cholansäurederivate Jn hoher Ausbeute Innerhalb kurzer Zeit zu bilden vermögen.in a medium containing cholic acid or its salt as a substrate in a concentration within a wide Range contains to grow and to form the cholanic acid derivatives in high yield within a short time capital.

Die Mikroorganismen, die die Cholansäurederivate der Formel (I) in einem Nährmedium, das Cholsäure oder ihre Salze enthält, zu bilden vermögen, und von der Anmelderin gewonnen worden sind, wurden bei der American Type Culture Collection, U.S.A. (nachstehend als ATCC bezeichnet) hinterlegt. Es handelt sich um Arth_robacter, Stamm CA-35 (=ATCC 31651), Arthrobacter, Stamm CA-35-A589-29-32 (=ATCC 31652) Arthrobacter., Stamm CA-35-A589-47 (=ATCC 31653), Brevlbacterium, Stamm CA-6 (=ATCC 31661) und Corynebacterium, Stamm CA-53 (=ATCC 31662). Die Stämme Arthrobacter CA-35, Brevlbacterium CA-6 und Cerynebacterium CA-53 sind Wildstämme, und die anderen Stämme von Arthrobacter sind Mutanten des Stammes Arthrobacter CA-35, die durch Behandlung des Wildstamms mit N-Methyl-N'-nitro-N-nltrosoguanSdäa erhallen wurden.The microorganisms that the cholanic acid derivatives of the formula (I) in a nutrient medium containing cholic acid or containing their salts, capable of forming, and obtained by the applicant, have been obtained from the American Type Culture Collection, U.S.A. (hereinafter referred to as ATCC). It is Arth_robacter, Strain CA-35 (= ATCC 31651), Arthrobacter, strain CA-35-A589-29-32 (= ATCC 31652) Arthrobacter., Strain CA-35-A589-47 (= ATCC 31653), Brevlbacterium, strain CA-6 (= ATCC 31661) and Corynebacterium, Strain CA-53 (= ATCC 31662). The Arthrobacter CA-35, Brevlbacterium CA-6 and Cerynebacterium strains CA-53 are wild strains and the other strains of Arthrobacter are mutants of the Arthrobacter strain CA-35 obtained by treating the wild strain with N-methyl-N'-nitro-N-nltrosoguanSdäa.

Die morphologischen Eigenschaften, Kulturmerkmale und physiologischen Eigenschaften dieser Stämme sind in Tabelle 1 genannt. Zum Vergleich sind auch die Merkmale des Stamms Arthrobactersimplex IAM 1660, der mit dem Stamm Arthrobacter CA-35 verwandt ist, in Tabelle 1 genannt.The morphological characteristics, cultural characteristics and physiological properties of these strains are mentioned in table 1. For comparison, the characteristics of the Arthrobacterimplex IAM 1660 strain, the is related to the strain Arthrobacter CA-35, named in Table 1.

Tabelle 1Table 1

Merkmalecharacteristics

Arthrobacter simplex, Stamm IAM 1660Arthrobacter simplex, strain IAM 1660

Arthrobacter,
Stamm CA-35
Arthrobacter,
Strain CA-35

mikroskopische Beobachtungen Formmicroscopic observations form

Teilungdivision

Größe (μπι) Flagellata SporenSize (μπι) flagellata Spurs

Gramfarbung Säurefeste FärbungGram color Acid-fast color

Kulturmerkmale Bouillon-AgarplatteCulture characteristics bouillon agar plate

Gelatine-Stichkultur LackmusmilchGelatin stab culture litmus milk

BCP-MilchBCP milk

Physiologische Merkmale ') Nitratreduktion Denitrifi cation Methylrottest Voges-Proskauer-Test Indolebiidung H2S-B ildung Hydrolyse von Stärke Verwertung von Citrat Assimilierung anorganischer Stickstoffquellen Urease
Oxidase
Katalase
Sauerstoffbedarf Oxidations-/Fermentationstest Bildung von Säuren und Gasen aus Kohlenhydraten 2) 1. L-Arabinose
Physiological characteristics') Nitrate reduction Denitrification methyl red test Voges-Proskauer test Indole formation H 2 SB formation Hydrolysis of starch Utilization of citrate Assimilation of inorganic nitrogen sources Urease
Oxidase
Catalase
Oxygen demand Oxidation / fermentation test Formation of acids and gases from carbohydrates 2 ) 1. L-arabinose

Stäbchen (zuweilen gequollen oder gekrümmt)Chopsticks (sometimes swollen or curved)

0,4-0,5 X 1-3 nicht vorhanden nicht vorhanden positiv-veränderlich nein0.4-0.5 X 1-3 nonexistent nonexistent positive-changeable no

kreisrund, leicht erhaben, farblos, glatt, glänzend, durchsichtigcircular, slightly raised, colorless, smooth, shiny, transparent

schlagartige (saccate) Verflüssigung Lackmus reduziert, Milch geklärtSudden (saccate) liquefaction litmus reduced, milk clarified

Klärung, wird alkalischClarification, becomes alkaline

Stäbchen (zuweilen abgebrochen oder gekrümmt)Chopsticks (sometimes broken or bent)

abbrechen
0,8-0,9 X 1,7-2,2
nicht vorhanden
nicht vorhanden
positiv
nein
abort
0.8-0.9 X 1.7-2.2
unavailable
unavailable
positive
no

kreisrund, leicht erhaben, gelb bis cremefarben, glatt, glänzend, undurchsichtig keine Verflüssigung
Lackmus reduziert,
Milch unverändert
circular, slightly raised, yellow to cream-colored, smooth, shiny, opaque, no liquefaction
Litmus reduced,
Milk unchanged

alkalisch, nicht geronnen und nicht peptonisiertalkaline, not curdled and not peptonized

± bis -± to -

aerobaerobic SäurenAcids GaseGases AssimiAssimi aerobaerobic SäurenAcids GaseGases Assimi- 65Assimi- 65 -- lierunglation oxidativoxidative lierunglation Wachswax Wachswax tumtum tumtum

Fortsetzungcontinuation

Merkmalecharacteristics

Arthrobacter simplex, Stamm IAM 1660Arthrobacter simplex, strain IAM 1660

Arthrobacter, Stamm CA-35Arthrobacter, strain CA-35

Bildung von Säuren und Gasen aus Kohlenhydraten2)Formation of acids and gases from carbohydrates 2 )

* 2. D-Xylose* 2. D-xylose

3. D-Glucose3. D-glucose

4. D-Mannose4. D-mannose

5. D-Fructose5. D-fructose

6. D-Galactose6. D-galactose

7. Maltose7. Maltose

8. Saccharose8. sucrose

9. Lactose9. Lactose

10. Trehalose10. Trehalose

11. D-Sorbit11. D-sorbitol

12. D-Mannit12. D-mannitol

13. Inosit13. Inositol

14. Glycerin14. Glycerin

15. Stärke15. Strength

Wachstum growth

Säuren GaseAcids gases

Assimilierung Assimilation

Wachstum growth

Säuren GaseAcids gases

Assimilierung Assimilation

±to-± to-

Merkmalecharacteristics

Arthrobacter CA-35-A589-29-32Arthrobacter CA-35-A589-29-32

Arthrobacter, Stamm CA-35-A589^t7Arthrobacter, strain CA-35-A589 ^ t7

mikroskopische Beobachtungen Form
Teilung
Größe (μιη) Flagellata Sporen
Gramfarbung Säurefeste Färbung
microscopic observations form
division
Size (μιη) Flagellata spores
Gram color Acid-fast color

Kulturmerkmale Bouillon-AgarplatteCulture characteristics bouillon agar plate

Bouillon-Agarplatte, enthaltend Cholsäure (10 g/l)Bouillon agar plate containing cholic acid (10 g / l)

Gelatine-Stichkultur LackmusmilchGelatin stab culture litmus milk

BCP-MilchBCP milk

Physiologische Merkmale') Nitratreduktion Denitrifi cation Methylrottest Voges-Proskauer-Test Indolbildung H2S-Bildung Hydrolyse von Stärke CitratverwertungPhysiological characteristics') Nitrate reduction Denitrification methyl red test Voges-Proskauer test Indole formation H 2 S formation Hydrolysis of starch Citrate utilization

kurze Stäbchenshort chopsticks

0,8-1,0 X 1,3-2,00.8-1.0 X 1.3-2.0

polare Flagellatapolar flagellata

keineno

positivpositive

neinno

kreisrund, flach, gelb, glatt, glänzend, undurchsichtigcircular, flat, yellow, smooth, shiny, opaque

kreisrund, flach, gelb, glatt, glänzend, undurchsichtigcircular, flat, yellow, smooth, shiny, opaque

Verflüssigungliquefaction

Lackmus reduziert, Milch nicht geronnen und nicht peptonisiertLitmus reduced, milk not curdled and not peptonized

alkalisch, nicht geronnen und nicht peptonisiertalkaline, not curdled and not peptonized

kurze Stäbchenshort chopsticks

0,8-1,0 X 1,3-2,3 Flagellata keine0.8-1.0 X 1.3-2.3 Flagellata none

positivpositive

neinno

kreisrund, flach, gelb, glatt, glänzend, undurchsichtig kreisrund, flach, weiß bis blaß cremefarben, glatt, glänzend, undurchsichtig Verflüssigung Lackmus reduziert, Milch nicht geronnen und nicht peptonisiert alkalisch, nicht geronnen und nicht peptonisiertcircular, flat, yellow, smooth, shiny, opaque circular, flat, white to pale Cream-colored, smooth, shiny, opaque liquefaction litmus reduced, milk not curdled and not peptonized alkaline, not curdled and not peptonized

Fortsetzungcontinuation

Merkmalecharacteristics

Arlhrobiicter CA-35-A589-29-32 Arthrobacier,Arlhrobiicter CA-35-A589-29-32 Arthrobacier,

Assimilierung von anorganischen StickstoffquellenAssimilation of Inorganic Nitrogen Sources

Ammonium +Ammonium +

Nitrat +Nitrate +

UreaseUrease

Oxidase -Oxidase -

Katalase +Catalase +

Sauerstoffbedarf aerobAerobic oxygen demand

Oxidations'/Ferrnsntationstest oxidat; Oxidation / Fernsntationstest oxidate ;

Bildung von Säuren und Gasen aus Kohlenhydraten 2)Formation of acids and gases from carbohydrates 2 )

1. L-Arabinose1. L-arabinose

2. D-Xylose2. D-xylose

3. D-Glucose3. D-glucose

4. D-Mannose4. D-mannose

5. D-Fructose5. D-fructose

6. D-Galactose6. D-galactose

7. Maltose7. Maltose

8. Saccharose8. sucrose

9. Lactose9. Lactose

10. Trehalose10. Trehalose

11. D-Sorbit11. D-sorbitol

12. D-Mannit12. D-mannitol

13. Inosit13. Inositol

14. Glycerin14. Glycerin

15. Stärke15. Strength

SäurenAcids

Gase aerob
Säuren
Aerobic gases
Acids

10 S10 p -Λ589-47-Λ589-47 •5• 5 20 ι20 ι GaseGases 25 I25 I. -- 30 B
j
30 B
j
I I I II I I I II.
35 β35 β
ii
:: ii
[[
-- --

Merkmalecharacteristics

Brevibacterium Stamm CA-6 Corynebacterium,
Stamm CA-53
Brevibacterium strain CA-6 Corynebacterium,
Strain CA-53

mikroskopische Beobachtungen Form
Teilung
Größe (μπι) Flagellata
Sporen
Gramiarbung Säurefeste Färbung
microscopic observations form
division
Size (μπι) flagellata
Spurs
Acid-fast coloring

Kulturmerkmale Bouillon-AgarplatteCulture characteristics bouillon agar plate

Bouillon-Agarplatte, enthaltend Cholsäure (10 g/1) NähragarplatteBouillon agar plate containing cholic acid (10 g / 1) Nutrient agar plate

Gelatine-Stichkultur LackmusmilchGelatin stab culture litmus milk

BCP-MilchBCP milk

Stäbchenrod

1,0 X 2,5-4,0 polare Flagellata nicht vorhanden positiv nein Stäbchenform, Coryneform1.0 X 2.5-4.0 polar flagellata absent positive no stick shape, coryne shape

abbrechen (snapping)
1,3-2,4 x 1,0-1,2
nicht vorhanden
nicht vorhanden
positiv
nein
cancel (snapping)
1.3-2.4 x 1.0-1.2
unavailable
unavailable
positive
no

gewellt, leicht erhaben, farblos, glatt, glänzend, durchscheinendwavy, slightly raised, colorless, smooth, shiny, translucent

Verflüssigung peptonisiert, wird alkalischLiquefaction peptonizes, becomes alkaline

peptonisiert, wird alkalisch kreisrund, flach gelb, glatt, glänzend, undurchsichtigpeptonized, alkaline becomes circular, flat yellow, smooth, shiny, opaque

keine Verflüssigungno liquefaction

Lackmus mit braunem Sediment reduziertLitmus reduced with brown sediment

alkalischalkaline

4040

4545

5050

5555

6060

6565

Fortsetzungcontinuation

Merkmalecharacteristics

Brevibacterium Stamm CA-6Brevibacterium strain CA-6

Corynebacterium, Stamm CA-53Corynebacterium, strain CA-53

1010

2020th

2525th

3030th

3535

4040

4545

5050

5555

6060

6565

Säuren GaseAcids gases

Assimilierung Assimilation

aerob Säurenaerobic acids

GaseGases

Physiologische Merkmale ') Nitratreduktion Denitrifi cation Methylrottest Voges-Proskauer-Test Indolbildung H2S-B ildung Hydrolyse von Stärke Citratverwertung Assimilierung von anorganischen Stickstoffquellen Ammonium NitratPhysiological characteristics') Nitrate reduction Denitrifi cation methyl red test Voges-Proskauer test Indole formation H 2 SB formation Hydrolysis of starch Citrate utilization Assimilation of inorganic nitrogen sources Ammonium nitrate

Urease Oxidase Katalase Sauerstoffbedarf Oxidations-/FermentationstestUrease Oxidase Catalase Oxygen Demand Oxidation / Fermentation Test

Bildung von Säuren und Gasen aus Kohlenhydraten2)Formation of acids and gases from carbohydrates 2 )

1. L-Arabinose1. L-arabinose

2. D-Xylose2. D-xylose

3. D-Glucose3. D-glucose

4. D-Mannose4. D-mannose

5. D-Fructose5. D-fructose

6. D-Galactose6. D-galactose

7. Maltose7. Maltose

8. Saccharose8. sucrose

9. Lactose9. Lactose

10. Trehalose10. Trehalose

11. D-Sorbit11. D-sorbitol

12. D-Mannit12. D-mannitol

13. Inosit13. Inositol

14. Glycerin14. Glycerin

15. Stärke15. Strength

Bemerkungen:Remarks:

1. Die zur Kennzeichnung der physiologischen Merkmale verwendeten Zeichen haben die folgenden Bedeutungen:
+ : Der Stamm hat das entsprechende Merkmal oder bildet das entsprechende Produkt.
1. The symbols used to identify the physiological characteristics have the following meanings:
+: The trunk has the corresponding characteristic or forms the corresponding product.

±: Es ist schwierig, zu bestimmen, ob der Stamm das entsprechende Merkmal hat oder das entsprechende Produkt bildet oder nicht. -: Der Stamm hat nicht das entsprechende Merkmal oder bildet nicht das entsprechende Produkt.±: It is difficult to determine whether the strain has the corresponding characteristic or constitutes the corresponding product or not. -: The trunk does not have the corresponding characteristic or does not form the corresponding product.

2. Die hinsichtlich der Bildung von Säuren und Gasen aus Kohlenhydraten verwendeten Zeichen haben die folgenden Bedeutungen:2. The symbols used in relation to the formation of acids and gases from carbohydrates have the following meanings:

I) Wachstum, Säuren und Gase:I) Growth, acids and gases:

Der Stamm wurde in Hugh-und-Leifson-Medium gezüchtet mit dem Unterschied, daß jeweils die Kohlenhydrate 1-15 anstelle der KohlenstoPTquelle verwendet wurden und das Wachstum des Stamms und die Bildung von Säuren und Gasen beobachtet wurden.The strain was grown in Hugh and Leifson medium with the difference that the carbohydrates 1-15 instead of the Carbon sources were used and the growth of the stem and the formation of acids and gases were observed.

+ : Der Stamm wächst oder eine Säure oder ein Gas wird gebildet+: The trunk grows or an acid or a gas is formed

±. Es ist schwierig, zu bestimmen, ob der Stamm wächst oder eine Säure oder ein Gas gebildet wird oder nicht±. It is difficult to determine whether or not the stem is growing, or an acid or a gas is being formed

-: Der Stamm wächst nicht oder eine Säure oder ein Gas wird nicht gebildet-: The trunk does not grow, or an acid or a gas is not formed

II) Assimilierung:II) assimilation:

Das Nährmedium, das pro Liter 2 g NH4NO:,. 2 g KH3PO4. 5 g K:HPO4. 0.2 g MgSO4 · 7H2O, 0.1 g Hefeextrakt und 5 g eines der Kohlenhydrate 1-15 enthielt, wurde in ein Reagenzglas (Durchmesser 21 mm) gegeben, und der Stamm wurde darin unter Schütteln gezüchtet, wobei seine Assimilierung (Wachstum) beobachtet wurde.The nutrient medium, which contains 2 g of NH 4 NO:,. 2 g of KH 3 PO 4 . 5 g of K : HPO 4 . 0.2 g of MgSO 4 · 7H 2 O, 0.1 g of yeast extract and 5 g of any one of carbohydrates 1-15 was placed in a test tube (diameter 21 mm), and the strain was cultured therein with shaking, whereby its assimilation (growth) was observed became.

aerob oxidativaerobic oxidative

Wachstum growth

- : Der Stamm wächst nicht.-: The trunk does not grow.

± : Der Stamm wächst geringfügig.±: The trunk grows slightly.

+ : Der Stamm wächst.+: The trunk is growing.

++ : Der Stamm wächst gut.++: The trunk is growing well.

+++: Der Stamm wächst sehr gut.+++: The trunk is growing very well.

Auf der Grundlage dieser morphologischen Merkmale, Kulturmerkmale und physiologischen Merkmale wurde die Klassifizierung der Stämme gemäß Bergey's Mannual of Determinative Bacteriology, 7. und 8. Auflage, bestimmt.On the basis of these morphological characteristics, cultural characteristics and physiological characteristics the classification of the strains according to Bergey's Mannual of Determinative Bacteriology, 7th and 8th edition, definitely.

Es wurde festgestellt, daß Arthrobacter Stamm CA-35 hinsichtlich seiner mikroskopischen Beobachtungen, beispielsweise In der Form, der Gramfärbung und dergleichen sowie In seinen physiologischen Merkmalen eine Beziehung zu Arthrobacter simplex hat. Der Stamm Arthrobacter CA-35 unterscheidet sich jedoch von Arthrobacter Simplex Stamm IAM 1660 In seiner Pigmentbildung, Verwertung von Kohlenhydraten und im Wachstum In einem Cholsäure enthaltenoen Medium. Arthrobacter, Stamm CA-3S, vermag in einem Medium zu wachsen, das Natriumcholat als einzige Kohlenstoffquelle In hoher Konzentration, z. B. 20 bis 500 g/l, enthält, und bildet »ls hauptsächliche Stoffwechselprodukte Ta-HydroxyO.n-diketo-S/J-Cholansäure, 3or,7a-Dihydroxy-12-keto-5/3-choiansäure, 7cr,i2cr-Dihydroxy-3-keio-5/j-choiansäure und/oder die Natriumsaize dieser Säuren, während Arthrobacter simplex Stamm IAM 1660 in einem Medium, das Natriumcholat als einzige Kohlenstoff quelle In einer Konzentration von 10 g/l enthält, kaum zu wachsen vermag.It was found that Arthrobacter strain CA-35, in terms of its microscopic observations, for example in the form, the grief coloration and the like as well as in its physiological characteristics one Relationship with Arthrobacter simplex. However, the Arthrobacter CA-35 strain is different from Arthrobacter Simplex strain IAM 1660 in its pigment formation, utilization of carbohydrates and in growth Medium contained in a cholic acid. Arthrobacter, strain CA-3S, is able to grow in a medium, sodium cholate as the only carbon source. B. 20 to 500 g / l, and forms »As the main metabolic products Ta-Hydroxy-O.n-diketo-S / J-cholanic acid, 3or, 7a-dihydroxy-12-keto-5/3-choic acid, 7cr, i2cr-dihydroxy-3-keio-5 / j-choic acid and / or the sodium salts of these acids, while Arthrobacter simplex strain IAM 1660 in a medium containing sodium cholate as the only carbon source Contains a concentration of 10 g / l, is hardly able to grow.

Der Stamm CA-35 von Arthrobacter bildet gelbe bis cremefarbene Pigmente. Andererseits existieren als Mikroorganismen, die zur Gattung Arthrobacter gehören und Pigmente bilden, Arthrobacter oxydans, Arthrobacter aurescens und Arthrobacter ureafaclens. Der Stamm CA-35 von Arthrobacter unterscheidet sich jedoch auch von diesen Mikroorganismen, da Arthrobacter oxydans und Arthrobacter aurescens gewöhnlich gramnegativ sind und Stärke hydrolysleren und Arthrobacter ureafaclens gewöhnlich gramnegativ ist und Nitrate nicht r.duzlert. Es ist daher anzunehmen, daß der Stamm Arthrobacter CA-35 eine neue Spezies darstellt, die zur Gattung Arthrobacter gehört, da der Stamm sich von den Stämmen der Standardspezies, die zur Gattung Arthrobacter gehören, unterscheidet.Arthrobacter strain CA-35 produces yellow to off-white pigments. On the other hand, exist as Microorganisms belonging to the genus Arthrobacter and producing pigments, Arthrobacter oxydans, Arthrobacter aurescens and Arthrobacter ureafaclens. However, the Arthrobacter strain CA-35 is different also from these microorganisms, since Arthrobacter oxydans and Arthrobacter aurescens are usually gram-negative and starch hydrolysleren and Arthrobacter ureafaclens are usually gram negative and nitrates are not r.duzlert. It can therefore be assumed that the strain Arthrobacter CA-35 is a new species that is used for Belongs to genus Arthrobacter because the strain is different from the strains of the standard species belonging to the genus Arthrobacter belong, differs.

Obwohl einige der Mutanten des Stamms Arthrobacter CA-35 vom Ursprungsstamm hinsichtlich der Geiseln sehr verschieden sind, wurde festgestellt, daß diese Mutanten zu Arthrobacter gehören, da Im allgemeinen ein Mutant In die gleiche Spezies seines Ursprungsstamms eingestuft wird.Although some of the mutants of the Arthrobacter CA-35 strain from the parent strain in terms of hostages are very different, it was found that these mutants belong to Arthrobacter, as in general a Mutant is classified into the same species as its parent strain.

Im Hinblick auf seine mikroskopischen Beobachtungen wie Gramfärbung und dgl. und seine physiologischen Merkmale wurde festgestellt, daß der Stamm Brevlbacterlum CA-6 zur Gattung Brevlbacterium gehört. Der Stamm Brevlbacterium CA-6 unterscheidet sich jedoch etwas von anderen zur Gattung Brevlbacterium gehörenden Mikroorganismen, da die anderen Mikroorganismen zahlreiche, den Zelleib umgebende Geiseln aufweisen (Perltrlcha), während der Stamm Brevibacterlum CA-6 polare Geisein usw. aufweist.With regard to its microscopic observations such as Gram's stain and the like and its physiological Characteristics, it was found that the strain Brevlbacterlum CA-6 belongs to the genus Brevlbacterium. Of the However, strain Brevlbacterium CA-6 is somewhat different from others belonging to the genus Brevlbacterium Microorganisms, as the other microorganisms have numerous hostages surrounding the cell body (Perltrlcha), while the strain Brevibacterlum CA-6 exhibits polar geism, etc.

Ferner wurde gefunden, daß der Stamm Corynebacterlum CA-53 mit Corynebacterlum equi eng verwandt ist.It was also found that the strain Corynebacterlum CA-53 is closely related to Corynebacterlum equi.

Das Verfahren gemäß der Erfindung wird durchgeführt. Indem ein Mikroorganismus, der aus den Gattungen Arthrobacter, Brevlbacterlum und Corynebacterium, wie sie im Patentanspruch genannt wurden, ausgewählt ist und In einem Cholsäure oder ihr Salz als Substrat enthaltenden Medium zu wachsen vermag, in einem Kulturmedium gezüchtet wird, das Cholsäure oder ihr Salz als Substrat enthält.The method according to the invention is carried out. By being a microorganism belonging to the genera Arthrobacter, Brevlbacterlum and Corynebacterium as mentioned in the claim is selected and capable of growing in a medium containing cholic acid or its salt as a substrate, in a culture medium is grown that contains cholic acid or its salt as a substrate.

Für die Zwecke der Erfindung kann Cholsäure als solche als Substrat verwendet werden. Es ist jedoch auch möglich, Alkalisalze von Cholsäure, z. B. Natriumcholat und Kallumcholat. oder Erdalkallsalze von Cholsäure, z. B. Calziumcholat und Magneslumcholat, zu verwenden, wobei die Alkalisalze bevorzugt werden. Bei Verwendung eines Cholats wird es in Wasser In einer solchen Menge gelöst, daß eine wäßrige Lösung, die das Cholat In bestimmter Konzentration enthält, erhalten wird. Als Alternative kann eine bestimmte Menge einer Alkaliverbindung oder Erdalkallverbindung, die ein Salz mit Cholsäure bildet, vorher in Wasser gelöst und die Lösung mit Cholsäure versetzt werden, wobei eine wäßrige Lösung, die ein Cholat in bestimmter Konzentration enthält, erhalten wird. Die Konzentration der Cholsäure oder ihres Salzes kann In einem weiten Bereich von etwa 1 bis 500 g/l, gerechnet als Cholsäure, variiert werden. Im Hinblick auf die Ausbeute an gewünschten Cholansäurederivaten der Formel (I), die Bedingungen der Kultivierung und die Wirtschaftlichkeit, z. B. Verfahrensführung, Verarbeltbarkelt und dergleichen, wird empfohlen, die Cholsäure oder ihr Salz in einer Konzentration von etwa 5 bis 300 g/l, vorzugsweise etwa 10 bis 200 g/l, gerechnet als Cholsäure, zu verwenden.For the purposes of the invention, cholic acid can be used as such as a substrate. However, it is too possible to use alkali salts of cholic acid, e.g. B. sodium cholate and calcium cholate. or alkaline earth salts of cholic acid, z. B. calcium cholate and magnesium cholate to be used, the alkali salts being preferred. Using of a cholate it is dissolved in water in such an amount that an aqueous solution contains the cholate Contains in a certain concentration is obtained. As an alternative, a certain amount of an alkali compound can be used or alkaline earth compound which forms a salt with cholic acid, previously dissolved in water and the solution are mixed with cholic acid, an aqueous solution containing a cholate in a certain concentration, is obtained. The concentration of the cholic acid or its salt can be in a wide range from about 1 to 500 g / l, calculated as cholic acid, can be varied. With regard to the yield of the desired cholanic acid derivatives of formula (I), the conditions of cultivation and the economy, e.g. B. Procedure, Processable products and the like, it is recommended to use cholic acid or its salt in a concentration of about 5 to 300 g / l, preferably about 10 to 200 g / l, calculated as cholic acid, to be used.

Die Kultivierung kann nach bekannten Verfahren durchgeführt werden, im allgemeinen erfolgt die Züchtung In Schüttelkultur oder Submerskultur unter Verwendung eines flüssigen Mediums.The cultivation can be carried out by known methods; in general, the cultivation is carried out In shake culture or submerged culture using a liquid medium.

Für die Züchtung können mehr Medien verwendet werden, die die Nährstoffe enthalten, die von dem zu verwendenden Mikroorganismus verwertet werden. Das Medium kann Cholsäure oder ihr Salz als einzige Kohlenstoffquelie oder eine zusätzliche Kohlenstoffquelle, z. B. eine Pentose (z. B. Arablnose), eine Hexose (2. B. Glucose, Mannose, Fructose und Galactose), ein Disaccharld (z. B. Maltose), ein Stärkezersetzungsprodukt (z. B. Dextrin), einen Zuckeralkohol (z. B. Sorbit), einen mehrwertigen Alkohol (z. B. Glycerin), ein Gemisch dieser Kohlenstoffquellen oder dgl. und/oder andere Nährstoffe, z. B. ein Polypepton, ein Pepton, Flelschextrakt. Malzextrakt, Maisquellwasser, Hefeextrakt, Aminosäuren oder ein Gemisch dieser Nährstoffe enthalten. Im allgemeinen kann eine zusätzliche Kohlenstoffquelle und/oder ein anderer Nährstoff dem Nährmedlum in einer Konzentration von etwa 0,1 bis 10 g/l zugesetzt werden.More media containing the nutrients required by the one can be used for breeding using microorganism are recovered. The medium can be cholic acid or its salt as the only one Carbon source or an additional carbon source, e.g. B. a pentose (z. B. Arablnose), a hexose (2. B. glucose, mannose, fructose and galactose), a disaccharide (e.g. maltose), a starch decomposition product (e.g. dextrin), a sugar alcohol (e.g. sorbitol), a polyhydric alcohol (e.g. glycerin), a mixture these carbon sources or the like. And / or other nutrients, e.g. B. a polypeptone, a peptone, flake extract. Malt extract, corn steep liquor, yeast extract, amino acids or a mixture of these nutrients. In general, an additional source of carbon and / or another nutrient can be added to the nutrient medium a concentration of about 0.1 to 10 g / l can be added.

Als Stickstoffquellen eignen sich beispielsweise Ammonlumsuifat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumnitrat, Natriumnitrat, Kaliumnitrat und Gemische dieser Verbindungen. Im allgemeinen kann die Stickstoffquelle dem Nährmedium in einer Konzentration von etwa 0,5 bis 5 g/l zugesetzt werden. Ferner können Dikaliumhydrogenphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Magnesiumsulfat u. dgl. als anorganische Salze dem Nährmedlum gewöhnlich in einer Konzentration von etwa 0,1 bis 10 g/l zugesetzt werden. Die Kultivie-Examples of suitable nitrogen sources are ammonium sulphate, ammonium chloride, ammonium phosphate, Ammonium nitrate, sodium nitrate, potassium nitrate and mixtures of these compounds. In general, the Nitrogen source can be added to the nutrient medium in a concentration of about 0.5 to 5 g / l. Further For example, dipotassium hydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate, magnesium sulfate and the like can be used as inorganic salts are usually added to the nutrient medium at a concentration of about 0.1 to 10 g / l. The cultiva-

rung kann als Schüttelkultur oder Submerskultur 6 Stunden bis 5 Tage bei 25 bis 35° C durchgefühlt werden.tion can be carried out as a shake culture or submerged culture for 6 hours to 5 days at 25 to 35 ° C.

Beim Verfahren gemäß der Erfindung wird Cholsäure oder ihr Salz als Substrat in die Cholansäurederivate derIn the process according to the invention, cholic acid or its salt is used as substrate in the cholanic acid derivatives

Formel (I) und eine geringe Menge 7 a, na-Dihydroxy-S-keto-Sjö-cholansäure oder ihr Salz umgewandelt, wenn der Stamm Arthroba ier CA-35 verwendet wird. Es wurde gefunden, daß das Cholansäurederivat der Formel (I), in der X für'S" OH steht, nämlich 3a, 7a-Dihydroxy-12-keto-5/?-cholansäure oder ihr Salz, überwiegend gebildetFormula (I) and a small amount of 7 a, na-dihydroxy-S-keto-Sjö-cholanic acid or its salt converted if the strain Arthroba ier CA-35 is used. It has been found that the cholanic acid derivative of the formula (I), in which X stands for'S "OH, namely 3a, 7a-dihydroxy-12-keto-5 /? - cholanic acid or its salt, predominantly formed

wird, wenn die vorstehend genannten Mutanten von Arthrobacter CA-35 verwendet werden. Wenn 3a, 7a, Dihydroxy-n-keto-SyS-cholansäure oder ihr Salz gewünscht wird, ist es daher zweckmäßig, die Mutanten Arthrobacter CA-35-A-589-29-32 (=ATCC 31652) und Arthrobacter CA-35-A589-47 (=ATCC 31653) zu ver-when the aforementioned mutants of Arthrobacter CA-35 are used. If 3a, 7a, Dihydroxy-n-keto-SyS-cholanic acid or its salt is desired, it is therefore advisable to use the mutants Arthrobacter CA-35-A-589-29-32 (= ATCC 31652) and Arthrobacter CA-35-A589-47 (= ATCC 31653)

it wenden. Bei Verwendung des Stamms Brevibacterium CA-6 wird die Cholsäure oder ihr Salz in die Cholansäurederivate der Formel (I) und eine geringe Menge 7a-Hydroxy-3,12-diketo-44-cholensäure oder ihr Salz umgewandelt. Bei Verwendung des Stamms Corynebacterium CA-53 wird die Cholsäure oder ihr Salz in die Cholansäurederivate der Formel (I) und 7<z-Hydroxy-3,12-diketo-.d4-cholensäure oder ihre Salze umgewandelt. Nach Beendigung der Kultivierung werden die im Kulturmedium angehäuften Produkte vom Medium abgetrennt und gereinigt. Zuerst werden Materialien, die Im Medium unlöslich sind, z. B. Zellen des Mikroorganismus u. dgl., nach bekannten Verfahren wie Filtration, Zentrifugleren u. dgl. vom Kulturmedium abgetrennt. Dann wird das Filtrat oder der Übersianii durch Zusatz elnsr Säure, z. B. Salzsäure, angesäuert, wodurch die Produkte darin ausgefällt werden. Gleichzeitig wird auch die als Substrat verwendete Cholsäure oder Ihr Salz, die nicht umgewandelt worden sind, als Cholsäure ausgefällt. Nach der Abtrennung der gebildeten Fällung wird das Filtrat oder der Überstand mit einem Inerten organischen Lösungsmittel, z. B. Äthylaceta, weiter extrahiert, und das Lösungsmittel wird vom Extrakt abdestlUiert, wobei ein Rückstand erhalten wird. Hierdurch werden die verbleibenden Produkte und das Substrat fast vollständig zurückgewonnen Der erhaltene Rückstand wird mit der vorstehend genannten Fällung vereinigt.turn it. When using the strain Brevibacterium CA-6, the cholic acid or its salt is converted into the cholanic acid derivatives of the formula (I) and a small amount of 7a-hydroxy-3,12-diketo-4 4 -cholenic acid or its salt. When using the strain Corynebacterium CA-53, the cholic acid or its salt is converted into the cholanic acid derivatives of the formula (I) and 7 <z-hydroxy-3,12-diketo-.d 4 -cholenic acid or its salts. After the end of the cultivation, the products accumulated in the culture medium are separated from the medium and purified. First, materials that are insoluble in the medium, e.g. B. cells of the microorganism and the like, separated from the culture medium by known methods such as filtration, centrifugation and the like. The filtrate or the supersianii is then added by adding an acid, e.g. B. hydrochloric acid, acidified, whereby the products are precipitated in it. At the same time, the cholic acid or its salt used as substrate, which have not been converted, is also precipitated as cholic acid. After the precipitate formed has been separated off, the filtrate or the supernatant is washed with an inert organic solvent, e.g. B. Ethylaceta, extracted further, and the solvent is distilled off from the extract, whereby a residue is obtained. As a result, the remaining products and the substrate are almost completely recovered. The residue obtained is combined with the above-mentioned precipitation.

Das In dieser Welse erhaltene Gemisch der Produkte und der Cholsäure wird der Chromatographie unterworfen, um das gewünschte Produkt zu isolieren. Beispielswelse können Poduicte, die unter Verwendung des Stamms Arthrobacter CA-35 oder dessen genannten Mutanten erhalten werden sind, wie folgt isoliert werden: de Produkte und die Cholsäure werden In Ihre Methylester umgewandelt, und die erhaltenen Methylester werden der Chromatographie an Kieselgel unterworfen, wobei nacheinander mit Chloroform, Chloroform-Äthanol (Volumenverhältnis 99: 1) und dann mit Chloroform-Äthanol (Volumenverhältnis 97: 3) eluiert wird. DerThe mixture of products and cholic acid obtained in this catfish is subjected to chromatography, to isolate the desired product. Example catfish can generate modules using the Arthrobacter CA-35 strain or its named mutants can be isolated as follows: de Products and the cholic acid are converted into their methyl esters, and the methyl esters obtained are subjected to chromatography on silica gel, successively with chloroform, chloroform-ethanol (99: 1 volume ratio) and then eluted with chloroform-ethanol (97: 3 volume ratio). Of the

3u gewünschte 7a-Hydroxy-3,12-diketo-5/?-cholansäuremethylester wird mit Chloroform eluiert. Durch Elution zuerst mit Chloroform-Äthanol (Volumenverhältnis 99:1) werden zuerst eines der Nebenprodukte, 7ct,12ct-Dlhydroxy-S-keto-S/J-cholansäuremethylester. und dann der gewünschte 3a,7a-D!hydroxy-12-keto-5/?-cholansäuremethylester eluiert. Methyitholat wird mit Chloroform-Äthanol (Volumenverhältnis 97:3) eluiert. Diese Methylester können durch Hydrolyse nach einem üblichen Verfahren In die entsprechenden Säuren umgewandelt werden. Als Alternative können bei Verwendung des Stamms Brevibacterium CA-6 oder Corynebacterium CA-53 die Produkte beispielsweise wie folgt Isoliert werde,-.: i^as Gemisch der Produkte und die Cholsäure werden unmittelbar ciev Chromatographie an Kieselgel unterworfen, wobei nacheinander mit Chloroform-Äthanol (Volumenverhältnis 98 : 2) und dann mit Chloroform-Äthanol (Volumenverhäiinfs 97 : 3) eluiert wird. Die gewünschte 7ar-Hydroxy-3,12-dlketo-5/J-chol3nsäure wird mit Chloroform-Äthanol (Volumenverhältnis 98:2) eluiert. Durch Elution mit Chloroform-Äthanol (Volumenverhältnis 97 : 3) wird zuerst als Nebenprodukt Ia-Hydroxy-S.n-dtketo-^-cholensaure und dann die gewünschte 3a,7ar-Dihydroxy-12-keto-5/?-cholansäure eluiert.3u desired 7a-hydroxy-3,12-diketo-5 /? - cholanic acid methyl ester is eluted with chloroform. By eluting first with chloroform-ethanol (volume ratio 99: 1) one of the by-products, 7ct, 12ct-Dlhydroxy-S-keto-S / J-cholanoic acid methyl ester, are first produced. and then the desired 3a, 7a-D! hydroxy-12-keto-5 /? - cholanic acid methyl ester is eluted. Methylate is eluted with chloroform-ethanol (volume ratio 97: 3). These methyl esters can be converted into the corresponding acids by hydrolysis by a conventional method. As an alternative, when using the strain Brevibacterium CA-6 or Corynebacterium CA-53, the products can be isolated, for example, as follows: i ^ a mixture of the products and the cholic acid are immediately subjected to ciev chromatography on silica gel, one after the other with chloroform-ethanol (Volume ratio 98: 2) and then eluted with chloroform-ethanol (volume ratio 97: 3). The desired 7ar-hydroxy-3,12-dlketo-5 / I-cholic acid is eluted with chloroform-ethanol (volume ratio 98: 2). Elution with chloroform-ethanol (volume ratio 97: 3) as a byproduct is first Ia- hydroxy-Sn-dtketo - ^ - cholensaure and then the desired 3a, 7a-dihydroxy-12-keto-5 / - eluted cholanic?.

Die räch dem Verfahren gemäß der Erfindung erhaltene SaJct-Dihydroxy-n-keto-S/J-cholansäure oder Ihr Salz kann nach der Huang Mlnlon-Reduktionsmethode leicht reduziert werden, wobei Chenodesoxycholsäure (CDCA) als wertvoller Gallenstelnlöser erhalten wird.SaJct-dihydroxy-n-keto-S / I-cholanic acid or its obtained after the process according to the invention Salt can be easily reduced by the Huang Mlnlon reduction method, using chenodeoxycholic acid (CDCA) is obtained as a valuable biliary remover.

7.z-Hydroxy-3,12-dlketo-5/)-cholansäure oder Ihr Salz kann durch Dehydratisierung und anschließende Hydrierung nach einem bekannten Verfahren leicht In Desoxycholsäure, ein wertvolles Ausgangsmaterial für die Herstellung von Progesteron und Adrenalkortlkosteroldderivaten umgewandelt werden. Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele und Bezugsbelsplele welter ausführlich erläutert7.z-Hydroxy-3,12-dlketo-5 /) - cholanic acid or its salt can be obtained by dehydration and subsequent hydrogenation according to a known process easily In deoxycholic acid, a valuable starting material for the Production of progesterone and adrenal corticosterol derivatives are converted. The invention is further illustrated in detail by the following examples and references

Gewinnung von MutantenObtaining Mutants

Eine Schleifenmenge des Stamms Arthrobacter CA-35 (FERM-P 5145; ATCC 31651), de? Im Schrägröhrchen {Nährmedium A : 0,5% NaOH, 5,0% Cholsäure, 0,5% Pepton, 0,5% Hefeextrakt 0,5% NaCl und 1,5% Agar) gezüchtet worden war, wurde In ein In einem Reagenzglas (200 mm χ 21 mm Durchmesser) enthaltenes Nährmedium (10 ml, Medium B: 1% NaOH, 10% Cholsäure, 0,2% NH4NO,. C,2<*. KH2POa, 0,5% K2HPO4, 0,02% MgSO4 ■ 7H2O und 0,01% Hefeextrakt) geimpft und unter Schütteln 24 Stunden bc; 30° C bebrütet. Die erhaltene Kultur (0,3 ml) wurde zu einem In einem Reagenzglas (200 mm χ 21 mm Durchmesser) enthaltenen Nährmedium (10 ml, Nährmedium C: 0.05% NaOH, 0,5% Cholsäure. 0,5% Glucose. 0,2% NH4NO,, 0,2% KH2PO4, 0,5% K2HPO4, 0.02% MgSO4 7H2O und 0.01% Hefeextrakt) gegeben und unter Schütteln 15 bis 16 Stunden bei 30° C bebrütet. Die Zellen des Mikroorganismus In einer Log-Phase wurden mit einem Membranfilter (Porengröße 0,45 μηι) unter aseptischen Bedingungen Isoliert, mit 0,'molaren Phosphat.juffern (pH 7,0, 20ml) gewaschen und im eic chen Puffer (25 ml) suspendiert.A loop set of the Arthrobacter CA-35 strain (FERM-P 5145; ATCC 31651), de? In an inclined tube (nutrient medium A: 0.5% NaOH, 5.0% cholic acid, 0.5% peptone, 0.5% yeast extract, 0.5% NaCl and 1.5% agar) was grown in one in one Test tube (200 mm χ 21 mm diameter) containing nutrient medium (10 ml, medium B: 1% NaOH, 10% cholic acid, 0.2% NH 4 NO,. C, 2 <*. KH 2 POa, 0.5% K 2 HPO 4 , 0.02% MgSO 4 7H 2 O and 0.01% yeast extract) inoculated and with shaking for 24 hours bc; 30 ° C incubated. The culture obtained (0.3 ml) became a nutrient medium (10 ml, nutrient medium C: 0.05% NaOH, 0.5% cholic acid. 0.5% glucose. 0, contained in a test tube (200 mm χ 21 mm diameter)) 2% NH 4 NO, 0.2% KH 2 PO 4 , 0.5% K 2 HPO 4 , 0.02% MgSO 4 7H 2 O and 0.01% yeast extract) and incubated with shaking for 15 to 16 hours at 30 ° C . The cells of the microorganism in a log phase were isolated with a membrane filter (pore size 0.45 μm) under aseptic conditions, washed with 0, 'molar Phosphat.juffern (pH 7.0, 20ml) and in eic chen buffer (25 ml ) suspended.

Die Mutationsbehandlung wurde durchgeführt, Indem N-Methyl-N'-ntlro-N-nl;ro?f;giianld!n In einer Endkonzentration von 50 Mg/ml zu 4 ml der vorstehend genannten Zellsuspension In einem Peagenzglas (200 mm χ 21 mm Durchmesser) gegeben und das Gemisch 45 Minuten bei 300C unter Schütteln inkubiert wurde. Unter diesen Bedingungen betrug die Letalrate de1= Stamms Arth cb^tfir ΓΑ-35 etwa 80%.The mutation treatment was carried out by adding N-methyl-N'-ntlro-N-nl; ro? F; giianld! N in a final concentration of 50 mg / ml to 4 ml of the above cell suspension in a test tube (200 mm 21 mm Diameter) and the mixture was incubated for 45 minutes at 30 0 C with shaking. Under these conditions the mortality rate de 1 = strain Arth cb ^ tfir ΓΑ-35 was about 80%.

Die In dieser Welse behandelten Ztllen wurden mit einem Membranfilier (Porengröße 0,45 μπι) unter aseptischen Bedingungen Isoliert, mit 20 ml 0,!molarem Phosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen und In 25 ml des glel-The cells treated in this catfish were aseptic with a membrane filter (pore size 0.45 μm) Conditions isolated, washed with 20 ml 0.1 molar phosphate buffer (pH 7.0) and poured into 25 ml of the

chen Puffers suspendiert. Die erhaltene Zellsuspension wurde mit einer sterilisierten normalen Kochsalzlösung verdünnt und auf Agarpiatten (Medium D: 0,1% NAOH, 1,0* Choisäure, 0,2% NH4NO3, 0,2% KHjPO4, 0,5% K2HPO4, 0,02% MgSO4 · 7H2O, 0,01% Hefeextrakt und 1,5% Agar) so ausgebreitet, oaß 300 bis 500 Kolonien pro Platte gebildet würden. Die Platten wurden 4 Tage bel.30° C Inkubiert. Jede in dieser Weise gebildete, punktförmlge Kolonie wurde isoliert und auf einer Platte (Medium E: 0,5% Pepton, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% NaCL und 1,5%- Agar) 24 Stunden bel 30° C Inkubiert. Jede auf der Platte des Mediums E gebildete Kolonie wurde durch Replikatlerung auf eine Platte des Mediums D übertragen und 20 Stunden bei 30° C inkubiert.suspended in buffer. The cell suspension obtained was diluted with a sterilized normal saline solution and placed on agar plates (medium D: 0.1% NAOH, 1.0 * choic acid, 0.2% NH 4 NO 3 , 0.2% KHjPO 4 , 0.5% K 2 HPO 4 , 0.02% MgSO 4 · 7H 2 O, 0.01% yeast extract and 1.5% agar) spread out so that 300 to 500 colonies per plate would be formed. The plates were incubated at 30 ° C. for 4 days. Each formed in this manner, punktförmlge colony was isolated and transferred to a plate (Medium E: 0.5% peptone, 0.5% yeast extract, 0.5% NaCl and 1.5% - agar) for 24 hours b e l 30 ° C Incubated. Each colony formed on the medium E plate was replicated onto a medium D plate and incubated at 30 ° C. for 20 hours.

Jede Kolonie auf der genannten Platte des Mediums E, deren durch Replikatlerung übertragene Kolonie auf der Platte des Mediums D nicht wuchs, wurde auf einen Schrägnährmedium (Medium F: 0,1% NaOH, 1.0% Choisäure, 0,5% Pepton, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% NaCl und 1,5% Agar) 24 Stunden bei 30° C Inkubiert. Eine Schleifenmenge dieser Schrägkultur wurde In 10 ml eines Nährmediums (Medium G: 0,5% NaOH, 5,0% Choisäure, 0,5% Glucose, 0,2% NH4NO3, 0,2% KH2PO4, 0,5% K2HPO4, 0,02% MgSO4 · 7H2O und 0,01% Hefeextrakt) in einem Reagenzglas (200 mm χ 21 mm Durchmesser) geimpft und un"^r Schütteln 3 Tage bei 30° C inkublert.Each colony on the said plate of medium E, whose replicating colony on the plate of medium D did not grow, was grown on a slant culture medium (medium F: 0.1% NaOH, 1.0% choic acid, 0.5% peptone, 0, 5% yeast extract, 0.5% NaCl and 1.5% agar) Incubated for 24 hours at 30 ° C. A loop amount of this slant culture was added to 10 ml of a nutrient medium (medium G: 0.5% NaOH, 5.0% choic acid, 0.5% glucose, 0.2% NH 4 NO 3 , 0.2% KH 2 PO 4 , 0.5% K 2 HPO 4 , 0.02% MgSO 4 · 7H 2 O and 0.01% yeast extract) inoculated in a test tube (200 mm χ 21 mm diameter) and shaking for 3 days at 30 ° C incubated.

Bei der Untersuchung der in jedem Medium G angehäuften Produkte durch Dünnschlchtchromatography wurde ein Mikroorganismus, der 3a,7ar-Dlhydroxy-12-keto-5/i-cholansäure oder Ihr Salz selektiv bildet, gefunden 15 ^ und als Stamm Arthrobacter CA-35-M-965-3 bezeichnet.In examining the products accumulated in each medium G by thin layer chromatography a microorganism which selectively forms 3a, 7ar-Dlhydroxy-12-keto-5 / i-cholanic acid or its salt was found 15 ^ and designated as Arthrobacter strain CA-35-M-965-3.

Das vorstehend beschriebene Verfahren wird nachstehend als »Verfahren M« bezeichnet. Nach dem Verfahren M wurde eine Mutationsbehandlung unter Verwendung des Stamms Arthrobacter CA-35-M-965-3 als | Ursprungsstamm durchgeführt. Als Folge wurden drei Stämme, die 3a,7a-Dihydroxy-12-keto-5/?-cholansäure oder Ihr Salz selektiv bildeten gefunden und als Stämme Arthrobacter CA-35-A589. Arthrobacter Ca-35-A849 bzw. Arthrobacter CA-35-A-1071 bezeichnet.The method described above is hereinafter referred to as "Method M". After the procedure M was subjected to mutation treatment using Arthrobacter strain CA-35-M-965-3 as | Original strain carried out. As a result, three strains were found containing 3a, 7a-dihydroxy-12-keto-5 /? - cholanic acid or your salt selectively formed and found as strains Arthrobacter CA-35-A589. Arthrobacter Ca-35-A849 and Arthrobacter CA-35-A-1071, respectively.

Aus der Kolonie des Stamms Arthrobacter CA-35-A589 wurden zwei überlegene Stämme isoliert und als Stämme Arthrobacter CA-35-A589-29-32 bzw. Arthrobacter CA-35-A589-47 bezeichnet.Two superior strains were isolated from the colony of the Arthrobacter CA-35-A589 strain and identified as Arthrobacter CA-35-A589-29-32 and Arthrobacter CA-35-A589-47 strains, respectively.

Beispiel 1example 1

Der Stamm Arthrobacter CA-35 (=ATCC 31651) wurde In einem Nährmedium der nachstehend genannten Zusammensetzung wie folgt gezüchtet:Arthrobacter CA-35 strain (= ATCC 31651) was grown in a nutrient medium as mentioned below Composition bred as follows:

Choisäure 100 gChoic acid 100 g

Ammoniumnitrat 2,0 gAmmonium nitrate 2.0 g

Kallumdlhydrogenphosphat 2,0 gCalcium hydrogen phosphate 2.0 g

Dlkallumhydrogenphosphat 5,0 gCalcium hydrogen phosphate 5.0 g

Magneslumsulfatheptahydrat 0,2 gMagnesium sulfate heptahydrate 0.2 g

Hefeextrakt 0,1gYeast extract 0.1g

Natriumhydroxyd 10 g |Sodium hydroxide 10 g |

destilliertes Wasser zur Auffüllung auf 11distilled water to make up to 11

Durch Mischen dieser Bestandteile wurde ein Nährmedium (11) erhalten. Teile von je 100 ml dieses Nährmediums wurden auf 10 Sakaguchlkolben (Volumen 500 ml) verteilt und 15 Minuten Im Autoclaven bei 12O0C behandelt. Den Kolben wurden je 10 ml einer Impfkultur zugesetzt, die durch vorheriges Züchten des Stamms im gleichen Medium für 2 Tage bei 30° C unter Schütteln erhalten worden war. Jeder Kolben wurde auf einer Schüttelvorrichtung 2 Tage bei 30° C Inkublert.A nutrient medium (11) was obtained by mixing these ingredients. Parts of 100 ml each of this culture medium were distributed to 10 Sakaguchlkolben (volume 500 ml) and 15 minutes autoclaved at 12O 0 C. To the flasks were added 10 ml each of an inoculum obtained by previously culturing the strain in the same medium for 2 days at 30 ° C. with shaking. Each flask was incubated on a shaker for 2 days at 30 ° C.

Nach beendeter Kultivierung wurde das Kulturmedium vereinigt und zur Entfernung der Zellen des Mikroorganismus zentrifugiert. Der erhaltene Überstand wurde durch Zusatz von 600 ml wäßriger 1 N-Salzsäure angesäuert, wobei sich eine Fällung bildete. Die Fällung wurde abgetrennt und die zurückbleibende Lösung mit 1 1 Äthylacetat extrahiert. Das Äthylacetat wurde mit einem Rotationsverdampfer vom Extrakt abdestilliert und der Rückstand mit der vorstehend genannten Fällung vereinigt, wöbe! ein Gemisch von Cholansäurederlvaten und Choisäure (85 g) erhalten wurde.After the completion of the cultivation, the culture medium was combined and removed to remove the cells of the microorganism centrifuged. The supernatant obtained was acidified by adding 600 ml of aqueous 1N hydrochloric acid, whereby a precipitate formed. The precipitation was separated off and the remaining solution with 1 l Ethyl acetate extracted. The ethyl acetate was distilled off from the extract using a rotary evaporator and the Residue combined with the above-mentioned precipitation, wöbe! a mixture of cholanic acid derivatives and Choic acid (85 g) was obtained.

E;n geringer Teil des Gemisches wurde In Methanol in einer Konzentration von 1% gelöst. Die Lösung (10 μΐ) wurde in eine schnell arbeitende Flüsslgkeltschromatography-Apparatur eingespritzt, die mit einer μBondapak C-18-Kolonne versehen war (Typ HLC-GPC-244). Die Säule wurde mit Wasser-Methanol (Volumenverhältnis 30: 70. pH 2.5) mit einer Rate von 1 ml/Min, eluiert. Der Brechungsindex des Eluats wurde gemessen.A small part of the mixture was dissolved in methanol at a concentration of 1%. The solution (10 μΐ) was injected into a high-speed liquid gel chromatography apparatus that was equipped with a μBondapak C-18 column was provided (type HLC-GPC-244). The column was filled with water-methanol (volume ratio 30:70, pH 2.5) at a rate of 1 ml / min, eluted. The refractive index of the eluate was measured.

Das erhaltene Chromatogramm ist in Flg. 1 dargestellt. Die Peaks A, B, C und D In Flg. 1 entsprechen denen des Bezugsstandards von 7cr-Hydroxy-3,12-dlketo-5/J-cholansäure, SaJar-Dlhydroxy-U-keto-S/J-cholansäure, 7a,12a-Dlhydroxy-3-keto-5/3-cholansäure bzw. Choisäure.The chromatogram obtained is in Flg. 1 shown. The peaks A, B, C and D in Flg. 1 correspond those of the reference standard of 7cr-hydroxy-3,12-dlketo-5 / J-cholanic acid, SaJar-Dlhydroxy-U-keto-S / J-cholanic acid, 7a, 12a-dihydroxy-3-keto-5/3-cholanic acid and choic acid, respectively.

Wenn die Verbindungen in den Fraktionen, die den Peaks A, B und C entsprachen. Isoliert und Ihre chemischen Konstitutionen auf der Grundlage der Massenspektren, IR-Spektren und NMR-Spektren bestimmt wurden, zeigten diese Spektren, daß es sich bei diesen Verbindungen um 7ct-Hydoxy-3,12-dlketo-5/!-cholansäure, 3a.7a-Dlhydroxy-12-keto-5/3-choIansäure bzw. 7a,12ur-Dlhydroxy-3-keto-50-cholansäure handelte. Die Abbildungen Flg. 2, 3 und 4 zeigen die IR-Spektren (A, B und C) der Methylester der den Peaks A, B und C entsprechenden Verbindungen im Vergleich zu denen des Bezugsstandards (A', B' und C).If the compounds in the fractions corresponding to peaks A, B and C. Isolated and your chemical Constitutions determined on the basis of the mass spectra, IR spectra and NMR spectra these spectra showed that these compounds are 7ct-hydroxy-3,12-dlketo-5 /! - cholanic acid, 3a.7a-Dihydroxy-12-keto-5/3-cholanic acid or 7a, 12ur-Dihydroxy-3-keto-50-cholanic acid. the Figures Flg. 2, 3 and 4 show the IR spectra (A, B and C) of the methyl esters of the peaks A, B and C. corresponding compounds compared to those of the reference standard (A ', B' and C).

Die Schmelzpunkte der den Peaks A, B und C entsprechenden Verbindungen und Ihrer Methylester sind nachstehend In Tabelle 2 genannt.The melting points of the compounds corresponding to peaks A, B and C and their methyl esters are hereinafter referred to in Table 2.

3G 31 3343G 31 334

Tabelle 2Table 2

Verbindungen Schmelzpunkte der Methylester, (0C) Gefunden LiteraturCompounds Melting points of the methyl esters, ( 0 C) Found literature

Schmelzpunkte der freien Säuren (0C)Melting points of the free acids ( 0 C)

Gefunden LiteraturFound literature

Peak APeak A 150-152150-152 152-154152-154 - - Peak BPeak B 154-156154-156 156-157156-157 219-220219-220 221-222221-222 Peak CPeak C 168-169168-169 169-172169-172 185-186185-186 186-138186-138

Die Ausbeute der Produkte und die Menge der Cholsäure, die nicht umgesetzt worden war, wurden aus dem Flächenverhältnis des in Fig. 1 dargestellten Chromatogramms berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 genanntThe yield of the products and the amount of cholic acid that had not been reacted were determined from the Area ratio of the chromatogram shown in FIG. 1 is calculated. The results are in Table 3 called

Tabelle 3Table 3

Verbindungenlinks FlächenSurfaces Umsatzsales Ausbeute oderYield or verhältnisrelationship (%)(%) Menge (g)Amount (g) 7a-Hydroxy-3,12-diketo-7a-hydroxy-3,12-diketo- 28,5428.54 28,5428.54 24,324.3 5/ß-cholansäure5 / ß-cholanic acid (Peak A)(Peak A) 3α, 7a-Di-hydroxy-12-keto-3α, 7a-di-hydroxy-12-keto- 63,0663.06 63,0663.06 53,653.6 5/?-cholansäure5 /? - cholanic acid (Peak B)(Peak B) 7α-, 12a-Di-hydroxy-3-7α-, 12a-di-hydroxy-3- 1,541.54 1,541.54 1,301.30 keto-5/5-cholansäureketo-5/5-cholanic acid (Peak C)(Peak C) CholsäureCholic acid 6,866.86 6,866.86 5,805.80 (Peak D)(Peak D)

Beispiel 2Example 2

t Der In Beispiel 1 beschriebene Versuch wurde wiederholt, wobei jedoch außerdem 5,0 g/l Glucose dem Nähr-The experiment described in Example 1 was repeated, but with 5.0 g / l of glucose added to the nutritional

medium zugesetzt warden. Hierbei wurden 91,0 g eines Gemisches von Produkten und nicht umgewandelter Cholsäure erhalten. Das Gemisch (91,0 g) wurde In 270 ml Methanol gelöst und mit 9 ml konzentrierter Salzsäure versetzt. Die erhaltene Lösung wurde 20 Minuten am Rückfluß erhitzt, wobei die Produkte und die Cholsäure In Ihre Methylester umgewandelt wurden.medium must be added. This produced 91.0 g of a mixture of products and unconverted Obtain cholic acid. The mixture (91.0 g) was dissolved in 270 ml of methanol and concentrated with 9 ml Hydrochloric acid added. The resulting solution was refluxed for 20 minutes, with the products and the Cholic acid converted into your methyl ester.

In eine Kolonne (1200 mm χ 70 mm Durchmesser) wurden 1500 g Kieselgel C-200 gefüllt. Die vorstehend genannten Methylester wurden am Kieselgel absorbiert. Die Säule wurde mit Chloroform elulert, wobei 25,1 g 7a-Hydroxy-3,12-dlketo-5^-cholansäUremethylester erhalten wurden. Die Säule wurde dann mit Chloroform-Äthanol (Volumenverhältnis 99 :1) elulert, wobei zuerst 1,40 g 7a,12a-Dlhydroxy-3-keto-5/J-cholansäuremethylester und dann 56,4 g 3a;,75r-Dihydroxy-12-keto-5/3-cholansäuremethylester erhalten wurden.1500 g of silica gel C-200 were placed in a column (1200 mm × 70 mm diameter). The above named methyl esters were absorbed on silica gel. The column was elulerted with chloroform, yielding 25.1 g 7a-Hydroxy-3,12-dlketo-5 ^ -cholanoic acid remethyl ester were obtained. The column was then washed with chloroform-ethanol (Volume ratio 99: 1) elulert, whereby first 1.40 g of 7a, 12a-Dlhydroxy-3-keto-5 / I-cholanoic acid methyl ester and then 56.4 g of methyl 3a;, 75r-dihydroxy-12-keto-5/3-cholanoate were obtained.

Diese Methylester wurden hydrolysiert, wobei 24,8 g 7a-Hydroxy-3,12-dlketo-5/J-choiansäure, 1,38 g 7α,12α-Dlhydroxy-3-keto-5/?-cholansäure und 56,0 g 3a,7«-Dlhydroxy-12-keto-5/?-cholansäure erhalten wurden.These methyl esters were hydrolyzed, leaving 24.8 g of 7a-hydroxy-3,12-dlketo-5 / J-choic acid, 1.38 g of 7α, 12α-dihydroxy-3-keto-5 /? - cholanic acid and 56.0 g of 3a, 7 "-Dlhydroxy-12-keto-5 /? - cholanic acid were obtained.

Beispiel 3Example 3

Der In Beispiel 1 beschriebene Versuch wurde wiederholt, wobei jedoch die Konzentration der Cholsäure verändert und dem Nährmedium Natriumhydroxid In einer Menge von 10 Gew.-%, bezogen auf die verwendete Cholsäure, zugesetzt wurde. Die Ausbeute an Produkten und die Menge der nicht umgewandelten Cholsäure für jede Konzentration des Substrats (Cholsäure) sind In Tabelle 4 genannt.The experiment described in Example 1 was repeated, but with the concentration of cholic acid changed and the nutrient medium sodium hydroxide in an amount of 10 wt .-%, based on the used Cholic acid, was added. The yield of products and the amount of unconverted cholic acid for Each concentration of the substrate (cholic acid) is given in Table 4.

Tabelle 4Table 4

Verbindungenlinks

AusbeutenExploit

Substratkonzentration (g/l) 50 200Substrate concentration (g / l) 50 200

300300

3a, 7a-Dihydroxy-12-keto-5/?-cholansäure 27,1g 108,3 g 47,4 g3a, 7a-dihydroxy-12-keto-5 /? - cholanic acid 27.1g 108.3g 47.4g

7a-Hydroxy-3,12-diketo-5/?-cholansäure 12,3 g 49,0 g 21,4 g7a-hydroxy-3,12-diketo-5 /? - cholanic acid 12.3 g 49.0 g 21.4 g

7a, Ha-Dihydroxy-S-keto-SyS-cholansäure 0,7 g 2,65 g 1,20 g7a, Ha-dihydroxy-S-keto-SyS-cholanic acid 0.7 g 2.65 g 1.20 g

Cholsäure geringe 20,1 g 230 gCholic acid low 20.1 g 230 g

Mengelot

1010

Beispiel 4Example 4

Der in Beispiel 2 beschriebene Versuch wurde wiederholt, wobei jedoch jeder Kolben auf der Schüttelvorrichtung 24 Stunden bei 30° C Inkubiert wurde, wobei 98,0 g eines Gemisches von Produkten und nicht umgewandelter Cholsäure erhalten wurden. Das Gemisch wurde der Schnell-Flüsslgkeltschromatographle unter den In 5 Beispiel 1 genannten Bedingungen unterworfen, um seine Zusammensetzung zu ermitteln. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 genannt.The experiment described in Example 2 was repeated, but with each flask on the shaker Incubation was carried out for 24 hours at 30 ° C., whereby 98.0 g of a mixture of products and unconverted Cholic acid were obtained. The mixture was subjected to high-speed liquid gel chromatography under In 5 Example 1 subjected to the conditions mentioned in order to determine its composition. The results are mentioned in table 5.

Tabelle 5Table 5

Verbindungen Anteil ! Connections Share !

3a, 7a-Dihydroxy-12-keto- 67,73a, 7a-dihydroxy-12-keto-67.7

5/7-cholansäure
7a-Hydroxy-3,12-diketo- 15
5/7 cholanic acid
7a-hydroxy-3,12-diketo-15

5/?-cholansäure 8,35 /? - cholanic acid 8.3

la, 12a-Dihydroxy-3-keto- la, 12a-dihydroxy-3-keto-

5/?-cholansäure 4,05 /? - cholanic acid 4.0

Cholsäure 20,0 20Cholic acid 20.0 20

Beispiel 5Example 5

Der in Beispiel 2 beschriebene Versuch wurde wiederholt, wobei jedoch in jeden Kolben 20 ml einer Impfkultur gegeben wurden, die durch Züchten für 24 Stunden bei 3O0C erhalten worden war. Hierbei wurden 117,0 g 25 eines Gemisches von Produkten und nicht umgewandelter Cholsäure erhalten. Das Gemisch wurde der Schnellchromatographle unter den In Beispiel 1 genannten Bedingungen unterworfen, um seine Zusammensetzung zu ermitteln. Die Ergebnisse sind In Tabelle 6 genannt.The experiment described in Example 2 was repeated except that in each piston 20 of a seed culture were placed ml, which had been obtained by culturing for 24 hours at 3O 0 C. This gave 117.0 g of a mixture of products and unconverted cholic acid. The mixture was subjected to rapid chromatography under the conditions mentioned in Example 1 to determine its composition. The results are shown in Table 6.

Tabelle 6 J0 Table 6 J0

Verbindungenlinks Beispiel 6Example 6 Anteilproportion of 3a, 7a-Dihydroxy-12-keto-3a, 7a-dihydroxy-12-keto- 5/?-cholansäure5 /? - cholanic acid 63,363.3 7a-Hydroxy-3,12-diketo-7a-hydroxy-3,12-diketo- 5/?-cholansäure5 /? - cholanic acid 23,523.5 7a, 12a-Dihydroxy-3-keto-7a, 12a-dihydroxy-3-keto- 5/?-cholansäure5 /? - cholanic acid 2,02.0 CholsäureCholic acid 11,211.2

Der Stamm Arthrobacter CA-35-A589-29-32 45 The Arthrobacter strain CA-35-A589-29-32 45

(=ATCC 31652) wurde wie folgt gezüchtet:(= ATCC 31652) was bred as follows:

Zusammensetzung des Nährmediums:Composition of the nutrient medium:

Cholsäure 100 gCholic acid 100 g

AmmoniumnitratAmmonium nitrate 2,0 g2.0 g KaliumdihydrogenphosphatPotassium dihydrogen phosphate 2,0 g2.0 g DikaliumhydrogenphosphatDipotassium hydrogen phosphate 5,0 g5.0 g MagnesiumsulfatheptahydratMagnesium sulfate heptahydrate 0,2 g0.2 g HefeextraktYeast extract 0,1g0.1g NatriumhydroxitSodium hydroxite 10 g10 g GlukoseGlucose 5,0 g5.0 g Leitungswassertap water zur Abfüllung auf 1 1for bottling on 1 1

Die vorstehend genannten Bestandteile, mit Ausnahme der Glukose, wurden In Leitungswasser gemischt und damit auf 800 ml aufgefüllt und Im Autoclaven 15 Minuten bei 1200C behandelt. Die Glukose wurde In 200 ml Leitungswasser gelöst und im Autoclaven 30 Minuten bei 110° C behandelt. Nach dem Abkühlen wurden beide Lösungen zusammengegeben, wobei 1 1 Nährmedium erhalten wurden. Je 100 ml des Nährmediums wurden auf 10 Sakaguchlkolben (Volumen 500 ml) unter aseptischen Bedingungen aufgeteilt. In die Kolben wurden je 2 ml 65The above ingredients, except glucose were mixed in tap water and filled up to 800 ml and autoclaved for 15 minutes at 120 0 C. The glucose was dissolved in 200 ml of tap water and treated in an autoclave at 110 ° C. for 30 minutes. After cooling, the two solutions were combined, 1 l of nutrient medium being obtained. 100 ml each of the nutrient medium were divided into 10 Sakaguchl flasks (volume 500 ml) under aseptic conditions. 2 ml of 65

if der Impfkultur gegeben, die durch vorherige Kultivierung des Stamms Im gleichen Nährmedium unter Schütteln bei 300C für 14 Stunden erhalten worden war. Jeder Kolben wurde auf einer Schüttelvorrichtung 3 Tage bei 30° C inkubiert.■ the seed culture if added, which had been obtained by previous culturing of the strain in the same nutrient medium under shaking at 30 0 C for 14 hours. Each flask was incubated on a shaker for 3 days at 30 ° C.

Nach beendeter Kultivierung wurde das Kulturmedium zusammengegeben und zur Entfernung der Zellen des Mikroorganismus zentrifugiert. Der erhaltene Überstand wurde durch Zusatz von 600 ml wäßriger 1 N-Salzsäure angesäuert, wobei eine Fällung gebildet wurde. Die Fällung wurde abgetrennt und die als Rückstand verbleibende Lösung mit 1 1 Äthylacetat extrahiert. Das Äthylacetat wurde vom Extrakt Im Rotallonsverband abdestilliert und der Rückstand mit der vorstehend genannten Fällung zusammengegeben, wobei 99,3 g eines Gemisches von Cholansäurederlvaten und Cholsäure erhalten wurden.After the end of the cultivation, the culture medium was combined and used to remove the cells of the Centrifuged microorganism. The obtained supernatant was made by adding 600 ml of aqueous 1N hydrochloric acid acidified, forming a precipitate. The precipitate was separated off and the residue that remained Solution extracted with 1 l of ethyl acetate. The ethyl acetate was distilled off from the extract in a Rotallonsverband and the residue combined with the above-mentioned precipitation, giving 99.3 g of a mixture from cholanic acid derivatives and cholic acid.

Ein kleiner Teil des Gemisches wurde In Methanol In einer Konzentration von 2% gelöst. Die Lösung (10 μΐ) wurde In eine Schnell-Flüsslgkeltschromatography-Apparatur gegeben, die mit einer μBondapak C-18-Kolonne versehen war (Typ HLC-GPC-244).A small part of the mixture was dissolved in methanol at a concentration of 2% . The solution (10 μΐ) was placed in a high-speed liquid gel chromatography apparatus which was provided with a μBondapak C-18 column (type HLC-GPC-244).

Die Säule wurde mit Wasser-Methanol (Volumenverhältnis 30: 70, pH 4,0) mit einer Rate von 1 ml/Minute elulert und der Brechungsindex des Eluats gemessen. Das erhaltene Chromatogramm ist In Flg. 5 dargestellt. Die Peaks B und D In Fig. 5 entsprechen denen der Bezugstandards von 3a,7a-Dlhydroxy-12-keto-5/3-cholansäure bzw. Cholsäure.The column was filled with water-methanol (volume ratio 30:70, pH 4.0) at a rate of 1 ml / minute elulert and measured the refractive index of the eluate. The chromatogram obtained is in Flg. 5 shown. The peaks B and D in FIG. 5 correspond to those of the reference standards of 3a, 7a-Dlhydroxy-12-keto-5/3-cholanic acid and cholic acid, respectively.

Wenn die dem Peak B entsprechende Verbindung In der Fraktion Isoliert und Ihre chemische Konstitution auf der Grundlage des Massenspektrums, IR-Spektrums und MMR-Spektrums bestimmt wurde, ergaben diese Spektren, daß die Verbindung die 3«,7a-D!hydroxy-12-keio-5/i-cholansäure war.If the compound corresponding to peak B In the fraction Isolated and your chemical constitution determined on the basis of the mass spectrum, IR spectrum and MMR spectrum, gave them Spectra that the compound was 3 ", 7a-D! Hydroxy-12-keio-5 / i-cholanic acid.

Die Ausbeute an Produkten und die Menge der nicht umgewandelten Cholsäure wurden aus dem Flächenverhältnis des Chromatogramms In Fig. 5 berechnet. Die Ergebnisse sind In Tabelle 7 genannt.The yield of products and the amount of unconverted cholic acid were determined from the area ratio of the chromatogram in Fig. 5 calculated. The results are shown in Table 7.

Tabelle 7Table 7

Verbindungenlinks

Umsatz, % *) Ausbeute oder Menge (g)Conversion,% *) Yield or amount (g)

3<r, 7a-Dihydroxy-12- 98,85 98,163 <r, 7a-dihydroxy-12-98.85 98.16

keto-5/?-cholansäure
(Peak B)
keto-5 /? - cholanic acid
(Peak B)

andere aus Cholsäure 0,59 0,59others from cholic acid 0.59 0.59

gebildete Derivateformed derivatives

Cholsäure (Peak D) 0,56 0,55Cholic acid (peak D) 0.56 0.55

*) Der Umsatz wurde aus dem Flächenverhältnis berechnet.*) The conversion was calculated from the area ratio.

Beispiel 7Example 7

Der In Beispie! 6 beschriebene Versuch wurde wiederholt, wobei jedoch eine Zellsuspenslon, die durch Abtrennen der Zellen des Mikroorganismus aus der Impfkultur (10 ml) durch Zentrifugleren und Suspendieren der Zellen In 10 ml sterilisiertem Wasser erhalten worden war, anstelle von 2 ml der Impfkultur In jeden Kolben gegeben wurde. Hierbei wurden 99,5 g eines Gemisches von Produkten und nicht umgewandelter Cholsäure erhalten. Das Gemisch (99,5 g) wurde In 270 ml Methanol gelöst und mit 9 ml konzentrierter Salzsäure versetzt. Die erhaltene Lösung wurde 20 Minuten am Rückfluß erhitzt, um die Produkte und die Cholsäure in ihre Methylester umzuwandeln.The example! The experiment described in 6 was repeated except that a cell suspension obtained by separating the cells of the microorganism from the inoculation culture (10 ml) by centrifugation and suspending the cells in 10 ml of sterilized water was added to each flask instead of 2 ml of the inoculum became. This gave 99.5 g of a mixture of products and unconverted cholic acid. The mixture (99.5 g) was dissolved in 270 ml of methanol, and 9 ml of concentrated hydrochloric acid were added. The resulting solution was refluxed for 20 minutes to convert the products and the cholic acid to their methyl esters.

1500 g Kieselgel C-200 wurden in eine Kolonne (1200 mm χ 70 mm Durchmesser) gefüllt, worauf die genannten Methylester am Kieselgel adsorbiert wurden. Die Säule wurde mit Chloroform-Äthanol (Volumenverhältnis 99 : 1) eluiert, wobei 102 g SxJ^-Dihydroxy-^-keto-SyS-cholansäuremethylester erhalten wurden, der hydrolislert wurde, wobei 98,5 g 3ar,7ar-Dlhydroxy-12-keto-5/?-cholansäure erhalten wurden.1500 g of silica gel C-200 were placed in a column (1200 mm × 70 mm diameter), whereupon the above Methyl esters were adsorbed on silica gel. The column was washed with chloroform-ethanol (volume ratio 99: 1) eluted to give 102 g of SxJ ^ -dihydroxy- ^ - keto-SyS-cholanic acid methyl ester, which hydrolyses was, 98.5 g of 3ar, 7ar-Dlhydroxy-12-keto-5 /? - cholanic acid were obtained.

Beispiel 8Example 8

Der in Beispiel 6 beschriebene Versuch wurde wiederholt, wobei jedoch die Konzentration der Cholsäure verändert, Nairiuriihydröxii dem Nährrnediurn in einer Menge von 10 Gew.-%, bezogen auf verwendete Cholsäure, und wäßrige 1 N-Salzsäure In einer Menge von 60 ml/g des verwendeten Natrlumhydroxits zugesetzt wurden, wobei eine Fällung gebildet wurde. Der Umsatz oder die Ausbeute des Produkts und die Menge der zurückbleibenden Cholsäure sind für jede Konzentration des Substrats (Cholsäure) in Tabelle 8 genannt.The experiment described in Example 6 was repeated, but with the concentration of cholic acid changed, Nairiuriihydröxii the nutrient medium in an amount of 10 wt .-%, based on the cholic acid used, and 1N aqueous hydrochloric acid were added in an amount of 60 ml / g of the sodium hydroxite used whereby a precipitate was formed. The conversion or the yield of the product and the amount of Cholic acid remaining for each concentration of the substrate (cholic acid) is given in Table 8.

Tabelle 8Table 8

Verbindungenlinks 3a, 7a-Dihydroxy-
12-keto-S/J-cholan-
säure
3a, 7a-dihydroxy
12-keto-S / J-cholan-
acid
CholsäureCholic acid
Umsatz bzw.
Ausbeute
Sales or
yield
Substratkonzen
tration (g/l)
Substrate concentration
tration (g / l)
11 96,7% *)96.7% *) 0,4%0.4% 55 98,0% *)98.0% *) 0,7% *}0.7% *}

Fortsetzungcontinuation 3a, 7o-Dihydroxy-
12-keto-5/f-cholan-
säure
3a, 7o-dihydroxy
12-keto-5 / f-cholan-
acid
GholsäureGholic acid
Verbindungenlinks Umsatz bzw.
Ausbeute
Sales or
yield
Subslratkonzen-
tration (g/l)
Subscriber Concentration
tration (g / l)
9,3 g9.3 g 0,1g0.1g
1010 19,5 g19.5 g 0,2 g0.2 g 2020th 49,6 g49.6 g 0,1g0.1g 5050 98,2 g98.2 g 0,6 g0.6 g 100100 129,2 g129.2 g 70,0 g70.0 g 200200

·) Umsatz·) Sales

20 120 1

Beispiel 9 |Example 9 |

Der In Beispiel 6 beschriebene Versuch wurde wiederholt, wobei jedoch anstelle des Stammes Arthrobacter CA-35-A 589-29-32 der Stamm Arthrobacter CA-35-A589-47 (=ATCC 31653) verwendet wurde, die Konzentrationen der Cholsäure und des Natrlumhydroxlts Im Nährmedium auf 50 g/l bzw. 5 g/l geändert wurden und jeder Kolben 35 Stunden bei 300C lnkublert wurde, wobei 49,31g eines Gemisches von Produkten und nicht umgewandelter Cholsäure erhalten wurden. Das Gemisch wurde der gleichen Schnell-Flüssigkeltschromatography unter den In Beispiel 6 genannten Bedingungen unterworfen.The experiment described in Example 6 was repeated, but instead of the Arthrobacter CA-35-A 589-29-32 strain, the Arthrobacter CA-35-A589-47 strain (= ATCC 31653) was used, the concentrations of cholic acid and sodium hydroxide in the culture medium at 50 g / l and 5 g / l were changed and each flask was lnkublert for 35 hours at 30 0 C, wherein 49,31g of a mixture of products and unconverted cholic acid were obtained. The mixture was subjected to the same high-speed liquid chromatography under the conditions mentioned in Example 6.

Das erhaltene Chromatogramm ist in Fig. 6 dargestellt. Die Peaks A, B, C und D in Flg. 6 entsprechen dem des Bezugsstandards von 7a-Hydroxy-3,12-diketo-5/3-cholansäure, SaJct-Dlhydroxy-n-keto-S/J-cholansäure, 7a,12a:-Dlhydroxy-3-keto-5/!-cholansäure bzw. Cholsäure.The chromatogram obtained is shown in FIG. The peaks A, B, C and D in Flg. 6 correspond to the of the reference standard of 7a-hydroxy-3,12-diketo-5/3-cholanic acid, SaJct-Dlhydroxy-n-keto-S / I-cholanic acid, 7a, 12a: -Dlhydroxy-3-keto-5 /! -Cholanic acid and cholic acid, respectively.

Wenn die den Peaks A, B, C und D entsprechenden Fraktionen abgetrennt und der Dünnschichtchromatography unterworfen wurden, enthielt jede dem Peak B, C bzw. D entsprechende Fraktion eine Elnzelverbindung. Die dem Peak A entsprechende Fraktion war ein Gemisch von 7a-Hydroxy-3,12-diketo-5/J-cholansäure und einem anderen nicht identifizierten Material.When the fractions corresponding to peaks A, B, C and D separated and thin layer chromatography were subjected, each fraction corresponding to peaks B, C and D contained an individual compound. The fraction corresponding to peak A was a mixture of 7a-hydroxy-3,12-diketo-5 / I-cholanic acid and other unidentified material.

Die Ausbeute an Produkten und die Menge der zurückgebliebenen, nicht umgewandelten Cholsäure wurden aus dem Flächenverhältnis des in Flg. 6 dargestellten Chromatogramms berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 genannt.The yield of products and the amount of remaining unconverted cholic acid were determined from the area ratio of the in Flg. 6 shown chromatogram calculated. The results are in Table 9 named.

Tabelle 9Table 9

Verbindungen Umsatz % Ausbeute bzw.Compounds Sales% Yield or

Menge, gAmount, g

7cr-Hydroxy-3,12- 0,80 0,397cr-hydroxy-3.12-0.80 0.39

diketo-5/?-cholansäure und nicht
identifiziertes
Material
(Peak A)
diketo-5 /? - cholanic acid and not
identified
material
(Peak A)

3«, 7a-Dihydroxy- 98,01 48,333 ", 7a-dihydroxy-98.01 48.33

I2-keto-5/?-
cholansäure
(Peak B)
I2-keto-5 /? -
cholanic acid
(Peak B)

7a, Ha-Dihydroxy- 0,25 0,137a, Ha-dihydroxy-0.25 0.13

3-keto-5/S-cholansäure
(Peak C)
3-keto-5 / S-cholanic acid
(Peak C)

6060

andere Derivate 0,24 0,12other derivatives 0.24 0.12

Cholsäure
(Peak D) 0,70 0,35
Cholic acid
(Peak D) 0.70 0.35

Beispiel 10 «Example 10 «

Der in Beispiel 1 beschriebene Versuch wurde wiederholt, wobei jedoch anstelle des Stamms Arthrobacter CA-35 der Stamm Brevlbacterlum CA-6 verwendet wurde. Das hierbei erhaltene Gemisch von Produkten undThe experiment described in Example 1 was repeated, but instead of the Arthrobacter CA-35 of the strain Brevlbacterlum CA-6 was used. The resulting mixture of products and

unverändert gebliebener Cholsäure wurde der Schnell-Flüsslgchromatography wie In Beispiel 1 unterworfen. Das erhaltene Chromatogramm Ist In Fig. 14 dargestellt.Cholic acid which had remained unchanged was subjected to rapid liquid chromatography as in Example 1. That The chromatogram obtained is shown in FIG.

Die Verbindungen In den Fraktionen, die den Peaks E, A, B und D entsprachen, wurden isoliert und IhreThe compounds in the fractions corresponding to peaks E, A, B and D were isolated and theirs

chemischen Konstitutionen durch die Massenspektren, IR-Spektren und NMR-Spektren bestimmt. Diese Spek-chemical constitutions determined by the mass spectra, IR spectra and NMR spectra. This spec-

tren zeigten, daß es sich bei diesen Verbindungen um 7ar-Hydroxy-3,12-dlketo-44-cholensäure, 7a-Hydroxy-3,12-dlketo-5/J-cholansäure, SctJa-Dlhydroxy-U-keto-S/J-cholansaure bzw. Cholsäure handelte. Die Verbindungen In den Fraktionen, die den Peaks X und Y entsprachen, wurden nicht Identifiziert.Tren showed that these compounds are 7ar-hydroxy-3,12-dlketo-4 4 -cholenic acid, 7a-hydroxy-3,12-dlketo-5 / I-cholanic acid, SctJa-Dlhydroxy-U-keto-S / J-cholanoic acid or cholic acid. The compounds in the fractions corresponding to peaks X and Y were not identified.

In dem In Flg. 7 dargestellten Chromatogramm beträgt das Verhältnis der Peaks mit Ausnahme der Peaks X und Y (d. h. das Flächenverhältnis E : A : B : D 12,2 : 22,2 : 44,9 : 20,7.In the In Flg. The chromatogram shown in FIG. 7 is the ratio of the peaks with the exception of the X peaks and Y (i.e., the area ratio E: A: B: D 12.2: 22.2: 44.9: 20.7.

Beispiel 11Example 11

Der in Beispiel 1 beschriebene Versuch wurde wiederholt, wobei jedoch anstelle des Stamms Arthrobacter CA-35 der Stamm Corynebacterium CA-53 (=ATCC 31662) verwendet wurde, wobei 82 g eines Gemisches von Produkten und Cholsäure erhalten wurde. Dieses Gemisch wurde der Schnell-Flüsslgkeitschromatography unter den In Beispiel 1 genannten Bedingungen unterworfen, wobei jedoch Wasser-Methanol (Vo!umenverhältn!s 30 : 70, pH 4,0) anstelle von Wasser-Methanol (Volumenverhältnis 30 : 70, pH 2,5)als Elutlonsmittel verwendet wurde.The experiment described in Example 1 was repeated, but instead of the Arthrobacter CA-35 of the strain Corynebacterium CA-53 (= ATCC 31662) was used, wherein 82 g of a mixture of Products and cholic acid was obtained. This mixture was subjected to high-speed liquid chromatography Subjected to the conditions mentioned in Example 1, but using water-methanol (volume ratios 30:70, pH 4.0) was used instead of water-methanol (volume ratio 30:70, pH 2.5) as the eluting agent became.

Das erhaltene Chromatogramm Ist in Flg. 8 dargestellt. Die Peaks A, B, C und D in Flg. 15 entsprechen denen der Bezugsstandards von 7<z-Hydroxy-3,12-dlketo-5/!-cholansäure, SaJcr-Dlhydroxy-U-keto-S/J-cholansäure, 7a-Hydroxy-3,12-dlketo-J4-cholensäure bzw. Cholsäure.The chromatogram obtained is in Flg. 8 shown. The peaks A, B, C and D in Flg. 15 correspond to those of the reference standards of 7 <z-hydroxy-3,12-dlketo-5 /! - cholanic acid, SaJcr-Dlhydroxy-U-keto-S / J-cholanic acid, 7a-hydroxy-3,12-dlketo-J 4 -cholenic acid or cholic acid.

Wenn die Verbindungen in den Fraktionen, die den Peaks A, B und C entsprachen, Isoliert und Ihre chemischen Konstitutionen aus den Massenspektren, IR-Spektren und NMR-Spektren bestimmt wurden, zeigten diese Spektren, daß es sich bei diesen Verbindungen um 7a-Hydroxy-3,12-diketo-5^-Cholansäure, 3«,7ar-Dlhydroxy-12-keto-5^-cholansäure bzw. 7sr-Hydroxy-3,12-diketo-J''-cholensäure handelte.If the compounds in the fractions that corresponded to peaks A, B and C, Isolate and their chemical Constitutions determined from the mass spectra, IR spectra and NMR spectra showed this Spectra that these compounds are 7a-hydroxy-3,12-diketo-5 ^ -cholanic acid, 3 ", 7ar-dihydroxy-12-keto-5 ^ -cholanic acid and 7sr-hydroxy-3,12-diketo-J "-cholenic acid acted.

Bezugsbeispiel 1Reference example 1

In einen Dreihalsrundkolben wurden 10 g der In der beschriebenen Welse hergestellten 3a,7cr-Dihydroxy-12-keto-5/?-cholansäure gegeben. Der Säure wurden langsam 100 ml Äthylenglykol und eine Lösung von 10 g KaIlumhydroxyd in 20 ml Wasser zugesetzt. Ferner wurden 10 ml 85%lges Hydrazlnhydrat zugesetzt, worauf das erhaltene Gemisch 2 Stunden am Rückfluß erhitzt wurde. Die Temperatur wurde allmählich erhöht und das Erhitzen am Rückfluß 4 Stunden bei 185 bis 1900C fortgesetzt, um das Hydrazlnhydrad abzudestillleren. Nach dem Abkühlen wurde das Reaktionsgemisch mit überschüssigem Wasser verdünnt und auf pH 3 eingestellt, wobei sich eine Fällung bildete. Die Fällung wurde abfiltriert, mit Wasser gewaschen und an der Luft getrocknet, wobei 8,5 g 3ar,7a-Dihydroxy-5/i-cholansäure (CDCA) erhalten wurden.10 g of the 3a, 7cr-dihydroxy-12-keto-5 /? -Cholanic acid prepared in the catfish described were placed in a three-necked round-bottomed flask. 100 ml of ethylene glycol and a solution of 10 g of potassium hydroxide in 20 ml of water were slowly added to the acid. Further, 10 ml of 85% pure hydrazine hydrate was added and the resulting mixture was refluxed for 2 hours. The temperature was gradually increased and the refluxing continued for 4 hours at 185-190 0 C to the Hydrazlnhydrad abzudestillleren. After cooling, the reaction mixture was diluted with excess water and adjusted to pH 3, whereupon a precipitate formed. The precipitate was filtered off, washed with water and air-dried to give 8.5 g of 3ar, 7a-dihydroxy-5 / i-cholanic acid (CDCA).

Bezugsbeispiel 2Reference example 2

In einem Dreihalsrundkolben wurden 3 g der in der beschriebenen Welse hergestellten 7cr-Hydroxy-3,I2-dlketo-5/i-cholansäure In 70 ml Pyridln gelöst. Der Lösung wurde 1 mol Tosylchlorld zugesetzt. Das erhaltene Gemisch wurde 1 Stunde der Reaktion bei 0° C überlassen und dann 5 Stunden am Rückfluß erhitzt. Anschließend wurde wäßrige 3 N-Salzsäure zugesetzt und das Reaktionsgemisch mit 100 ml Äther extrahiert. Der Äther wurde vom Extrakt unter vermindertem Druck abdestilliert, wobei 2,5 g db- und/oder 47-3,12-Dlketo-cholensäure erhalten wurden. Das erhaltene Produkt (2 g) wurde In 10 ml wäßrigen 1 N-Natriumhydroxid gelöst. Der Lösung wurde 0,1 g Raney-Nickel zugesetzt. Nach Zugabe von 0,01 mol Wasserstoff wurde das Gemisch der Reaktion über Nacht überlassen, wobei 3cr,12«-Dlhydroxy-5ß-cholansäure (Desoxycholsäure) und 3a:,I2/!-Dlhydroxy-5/i-choIansäure erhalten wurden (Ausbeute 90%).3 g of the 7cr-hydroxy-3,12-dlketo-5 / i-cholanic acid prepared in the catfish described were dissolved in 70 ml of pyridine in a three-necked round bottom flask. 1 mol of tosylchlorld was added to the solution. The resulting mixture was allowed to react at 0 ° C. for 1 hour and then refluxed for 5 hours. Aqueous 3N hydrochloric acid was then added and the reaction mixture was extracted with 100 ml of ether. The ether was distilled off from the extract under reduced pressure, 2.5 g of d b and / or 4 7 -3,12-dlketo-cholenic acid being obtained. The obtained product (2 g) was dissolved in 10 ml of 1N aqueous sodium hydroxide. 0.1 g of Raney nickel was added to the solution. After the addition of 0.01 mol of hydrogen, the mixture was left to react overnight, 3cr, 12'-dihydroxy-5ß-cholanic acid (deoxycholic acid) and 3a:, I2 /! - dihydroxy-5 / i-cholanic acid being obtained (yield 90%).

Hierzu 8 Blatt ZeichnungenIn addition 8 sheets of drawings

Claims (1)

Patentanspruch:Claim: Verfahren zur Gewinnung von Cholansäurederivaten der Formel
O
Process for the preparation of cholanic acid derivatives of the formula
O
COORCOOR OHOH in der C für \~ OH oder = O und R für Wasserstoff, ein Alkalimetall oder Erdalkalimetall steht, durch Züchten eines Mikroorganismus in einem ChoLsäure oder eines ihrerSalzeenthaltevidenNährmedium und Isolieren des gebildeten Cholanjäurederivats, dadurch gekennzeichnet, daß man Arthrobacter ATCC 31651, Arthrobacter ATCC 31652, Arthrobacter ATCC 31653, Brevibacterium ATCC 31661 oder Corynebacterium ATCC 31662 in einem Nährmedium züchtet.in which C stands for OH or = O and R stands for hydrogen, an alkali metal or alkaline earth metal, by growing a microorganism in a hydrochloric acid or one of its salts-containing media and isolating of the Cholanjäurederivats formed, characterized in that Arthrobacter ATCC 31651, Arthrobacter ATCC 31652, Arthrobacter ATCC 31653, Brevibacterium ATCC 31661 or Corynebacterium ATCC 31662 grows in a nutrient medium.
DE3031334A 1979-08-21 1980-08-20 Microbiological process for the production of cholanic acid derivatives Expired DE3031334C2 (en)

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JP11230779A JPS5910198B2 (en) 1979-08-31 1979-08-31 Method for producing 7α-hydroxy-3,12-diketo-5β-cholanic acid
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JP8225680A JPS578796A (en) 1980-06-17 1980-06-17 Preparation of 3alpha,7alpha-dihydroxy-12-keto-5beta-cholanic acid and/or its salt
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