DE2952119A1

DE2952119A1 - Stabilised aq. solns. of protein, esp. insulin - contg. surfactant, pref. polyether, to prevent denaturation

Info

Publication number: DE2952119A1
Application number: DE19792952119
Authority: DE
Inventors: Dipl.-Chem. Dr. Horst 6233 Kelkheim Thurow
Original assignee: Hoechst AG
Current assignee: Hoechst AG
Priority date: 1979-12-22
Filing date: 1979-12-22
Publication date: 1981-07-09

Abstract

Aq. protein solns. contain a surfactant (I) with a linear structure consisting of alternate weakly hydrophobic and weakly hydrophilic regions. Pref. (I) is a homopolymer, copolymer or block copolymer of formula (Ia) R2Y-(X)n-R3 (Ia) ((X)n is a chain of n members of formula -CHR1CHR1O- or -CHR1O- in any order; n is 2-80, pref. 8-45; Y is O or NH; R1 is H, Me or Et, but must be Me or Et in at least half the gps. X; R2 and R3 are H or organic gps.). The solns., esp. insulin solns., are stabilised against denaturation of the protein, which can affect its immunological and biological properties. (I) prevents the adsorption of the protein on surfaces and hence prevents sec. reactions such as aggregation. The solns. may be used for therapeutic purposes (e.g. as insulin solns. with depot action), or for treating hydrophobic surfaces to prevent their adsorbing and denaturing effect on proteins, e.g. during the prepn. and purificn. of proteins, esp. by chromatography or ultrafiltration.

Description

Gegen Denaturierung beständige, wäßrige Protein-LösungenAqueous protein solutions resistant to denaturation

Die Erfindung betrifft eine wäßrige Proteinlösung, die gegen Denaturierung der Proteine an Grenzflächen beständig ist, sowie Verfahren zur Herstellung einer solchen Lösung und zur Behandlung von Oberflächen, die auf Proteinlösungen denaturierend wirken.The invention relates to an aqueous protein solution against denaturation the proteins are persistent at interfaces, as well as processes for making a such solution and for the treatment of surfaces denaturing on protein solutions works.

Es ist bekannt, daß gelöste Proteine an hydrophoben Grenzflächen (dazu gehört auch die Grenzfläche wäßrige Lösung/ Luft) adsorbiert werden (C.W.N. Cumper und A.E. Alexander, Trans.Faraday Soc. 46, 235 (1950)). Proteine sind amphiphile Substanzen, d.h. sie haben sowohl hydrophile als auch hydrophobe Bereiche. Die hydrophoben Bereiche bilden den Kontakt zur hydrophoben Crenzfläche.It is known that dissolved proteins at hydrophobic interfaces (see also includes the interface aqueous solution / air) to be adsorbed (C.W.N. Cumper and A.E. Alexander, Trans. Faraday Soc. 46, 235 (1950)). Proteins are amphiphilic Substances, i.e. they have both hydrophilic and hydrophobic areas. The hydrophobic Areas form the contact with the hydrophobic crimping surface.

Als Folge der Adsorption der Proteine an Grenzflächen werden verschiedene Sekundärreaktionen beobachtet, die man allgemein unter dem Begriff "Denaturierung" zusammenfaßt. Es kommt zu einer Formänderung der adsorbierten Proteinmoleküle (Änderung der Tertiär- und/oder Sekundärstruktur).As a result of the adsorption of the proteins at interfaces become different Secondary reactions observed, which are commonly referred to as "denaturation" summarizes. There is a change in shape of the adsorbed protein molecules (change the tertiary and / or secondary structure).

Daneben kann es zur Aggregation von adsorbierten Proteinmolekülen zu löslichen oder unlöslichen polymeren Formen kommen. So ist von vielen Proteinen eine Oberflächen-Aggregation bekannt, die sich z.B. als Trübung der Lösung oder als biologische Inaktivierung der Proteine beim Rühren oder Schütteln der wäßrigen Lösungen bemerkbar macht (A.F.Henson, I.R. Mitchell, P.R. Mussellwhite, J. Colloid Interface Sci.In addition, it can lead to the aggregation of adsorbed protein molecules come to soluble or insoluble polymeric forms. So is of many proteins a surface aggregation known, e.g. as turbidity of the solution or as biological inactivation of the proteins when stirring or shaking the aqueous Making solutions noticeable (A.F. Henson, I.R. Mitchell, P.R. Mussellwhite, J. Colloid Interface Sci.

32, 162 (1970)). Diese Oberflächenadsorption und -aggregation ist besonders nachteilig in Apparaten zum Transport von Proteinlösungen z.B. in automatischen Dosiergeräten für Arzneimittel. In einigen Fällen kommt es auch zu chemischen Reaktionen der adsorbierten Proteine mit gelösten Substanzen (F. MacRitchie, J. Macromol.Sci., Chem., 4, 1169 (1970).32, 162 (1970)). This surface adsorption and aggregation is particularly disadvantageous in apparatus for transporting protein solutions, e.g. in automatic Dosing devices for drugs. In some cases, chemical reactions also occur of the adsorbed proteins with dissolved substances (F. MacRitchie, J. Macromol.Sci., Chem., 4, 1169 (1970).

Eine spezielle Form der hydrophoben Grenzflächen bildet sich beim Gefrieren von wäßrigen Lösungen, z.B. bei der Gefriertrocknung von Proteinen. An diesen Grenzflächen kommt es ebenfalls zu den beschriebenen Denaturierungen von Proteinen (U.B. Hansson, Acta Chem.Scand., 22, 483 (1968).A special form of the hydrophobic interfaces is formed during Freezing of aqueous solutions, e.g. in the freeze-drying of proteins. At the described denaturation of these interfaces also occurs Proteins (U.B. Hansson, Acta Chem. Scand., 22, 483 (1968).

Der Denaturierungsprozeß kann einem Protein immunogene Eigenschaften (d.h. die Fähigkeit, immunologische Abwehrreaktionen in einem Organismus zu induzieren,) verleihen oder bereits vorhandene immunogene Eigenschaften verstärken.The denaturation process can give a protein immunogenic properties (i.e. the ability to induce immunological defense reactions in an organism) confer or enhance already existing immunogenic properties.

Außerdem können biologische Eigenschaften, wie enzymatische, serologische oder hormonelle Aktivitäten, verändert oder zerstört werden.It can also have biological properties, such as enzymatic, serological or hormonal activities, changed or destroyed.

Es ist ferner bekannt, daß man die Adsorption von Proteinen an die Grenzfläche, die sich zwischen einer wäßrigen Lösung und einer flüssigen hydrophoben Phase ausbildet, dadurch verhindern kann, daß man diesem System monomere oberflächenaktive Substanzen, wie Alkylalkohole zusetzt (R. Cecil und C.F. Louis, Biochem.J. 117, 147 (1970)).It is also known that the adsorption of proteins to the Interface between an aqueous solution and a liquid hydrophobic Phase forms, thereby preventing this system from being monomeric surface-active Substances such as adding alkyl alcohols (R. Cecil and C.F. Louis, Biochem. J. 117, 147 (1970)).

Diese Substanzen werden ihrerseits reversibel an die hydrophoben Grenzflächen adsorbiert und verdrängen so die Proteine. Nachteilig bei diesem Verfahren ist, daß die Anwendungskonzentration der oberflächenaktiven Substanzen nahe deren Sättigungsgrenze in wäßriger Lösung liegen muß, denn nur so wird eine optimale Beladung der Grenzfläche gewährleistet. In vielen Fällen ist die Größe der Grenzfläche nicht konstant, sondern variabel (z.B. die Grenzfläche Lösung/Luft beim Rühren oder Schütteln von Proteinlösungen), so daß die wäßrige Lösung Moleküle dieser oberflächenaktiven Substanzen abwechselnd nachliefern und aufnehmen muß, d.h. einen Puffervorrat enthalten muß. Bei einer notwendigen Anwendungskonzentration nahe der Sättigungsgrenze ist dies jedoch nur begrenzt möglich.These substances in turn become reversible at the hydrophobic interfaces adsorbs and displaces the proteins. The disadvantage of this process is that the application concentration of the surface-active substances is close to their saturation limit must lie in aqueous solution, because this is the only way to ensure optimal loading of the interface guaranteed. In many cases the size of the interface is not constant, but rather variable (e.g. the solution / air interface when stirring or shaking protein solutions), so that the aqueous solution alternates molecules of these surface-active substances must subsequently deliver and receive, i.e. contain a buffer stock. at one However, this is only necessary application concentration close to the saturation limit limited possible.

Ein weiterer Nachteil dieses Verfahrens ist ferner, daß die erwähnten monomeren oberflächenaktiven Substanzen nicht nur an den hydrophoben Grenzflächen adsorbiert werden, sondern auch an den hydrophoben Bereichen der gelösten Proteine. Dort bewirken sie eine Denaturierung der gelösten Proteine, die in vielen Fällen irreversibel'ist und die man gerade verhindern will.Another disadvantage of this method is that the mentioned monomeric surface-active substances not only at the hydrophobic interfaces adsorbed, but also on the hydrophobic areas of the dissolved proteins. There they cause a denaturation of the dissolved proteins, which in many cases irreversible and which one is trying to prevent.

Die Stärke der Bindung der monomeren oberflächenaktiven Substanzen sowohl an die hydrophoben Grenzflächen als auch an die hydrophoben Bereiche der gelösten Proteine ist von der Hydrophobizität der Substanzen, d.h. z.B. von der Länge der Alkylketten abhängig. Je länger die Alkylkette, um so größer die Bindungsstärke. Der Widerspruch zwischen einer möglichst vollständigen Beladung der Grenzflächen mit den oberflächenaktiven Substanzen (erreichbar durch hohe Hydrophobizität der Substanzen oder hoher Anwendungskonzentration) und möglichst geringer Bindung an die hydrophoben Bereiche der gelösten Proteine schien nicht lösbar zu sein.The strength of the binding of the monomeric surfactants both to the hydrophobic interfaces and to the hydrophobic areas of the dissolved proteins depends on the hydrophobicity of the substances, i.e. e.g. on the Length of the alkyl chains dependent. The longer the alkyl chain, the greater the bond strength. The contradiction between loading the interfaces as completely as possible with the surface-active substances (achievable through the high hydrophobicity of the Substances or high application concentration) and the lowest possible binding to the hydrophobic areas of the solubilized proteins appeared to be insoluble.

Es wurde nun gefunden, daß polymere Substanzen mit alternierend angeordneten hydrophoben und hydrophilen Bereichen die Grenzflächen derart verändern, daß die Adsorption von Proteinen an diese Grenzflächen und dadurch auch die erwähnten Sekundärreaktionen wie z.B. die Grenzflächenaggregation wirksam verhindert werden. Gegenstand der Erfindung ist demgemäß eine wäßrige Proteinlösung, gekennzeichnet durch einen Gehalt an einer oberflächenaktiven Substanz mit kettenförmiger Grundstruktur, deren Glieder schwach hydrophobe und schwach hydrophile Bereiche in alternierender Anordnung enthalten.It has now been found that polymeric substances with alternately arranged hydrophobic and hydrophilic areas change the interfaces in such a way that the Adsorption of proteins at these interfaces and thereby also the mentioned secondary reactions how, for example, interfacial aggregation can be effectively prevented. Subject of the invention is accordingly an aqueous protein solution, characterized by a content of one Surface-active substance with a chain-like basic structure, the links of which are weak Contain hydrophobic and weakly hydrophilic areas in an alternating arrangement.

Bevorzugt als oberflächenaktive Substanzen im Sinne der Erfindung sind Homo-, Misch- oder Blockpolymerisate der Formel I R2Y R, 1 in der Xn eine Kette von n Gliedern der Formeln II oder III in beliebiger Reihenfolge und n 2 - 80, vorzugsweise 8 -45 ist, Y -0- oder -NH- ist, R1 H, -CH3 oder H ist, wobei die Reste R1 gleich oder -C25 1 verschieden sein können, jedoch mindestens in der Hälfte der Kettenglieder X -CH3 oder -C 2H5 vorkommt, und in der R2 und R3 unabhängig voneinander H oder ein organischer Rest sind.Preferred surface-active substances for the purposes of the invention are homopolymers, copolymers or block polymers of the formula I R2Y R, 1 in which Xn is a chain of n members of the formulas II or III in any order and n is 2-80, preferably 8 -45, Y is -0- or -NH-, R1 is H, -CH3 or H, where the radicals R1 can be the same or -C25 1 different, but at least in half of the chain links X —CH3 or —C 2H5 occurs, and in which R2 and R3 are independently H or an organic radical.

Besonders bevorzugt sind Verbindungen der Formel I, in denen R3 Alkyl mit 1 - 20 C-Atomen, Carboxyalkyl mit 2 - 20 C-Atomen oder Alkylphenyl mit 1 - 10 Alkyl-C-Atomen bedeutet. R2 bedeutet in den bevorzugten Verbindungen ebenfalls Alkyl mit 1 - 20 C-Atomen, im Falle Y = -0- aber auch Carboxalkyl mit 2 - 20 C-Atomen oder Alkylphenyl mit 1 - 10 Alkyl-C-Atomen.Compounds of the formula I in which R3 is alkyl are particularly preferred with 1 - 20 carbon atoms, carboxyalkyl with 2 - 20 carbon atoms or alkylphenyl with 1 - 10 Means alkyl carbon atoms. In the preferred compounds, R2 also denotes alkyl with 1 - 20 carbon atoms, in the case of Y = -0- but also carboxalkyl with 2 - 20 carbon atoms or alkylphenyl with 1 to 10 alkyl carbon atoms.

Beispiele für die Reste R2 und R3 sind Methoxy, Athoxy, Propoxy, Butoxy,oder die Reste, die sich von Laurylalkohol oder Myristylalkohol ableiten; Carboxalkylgruppen, die sich von der Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure, Palmitinsäure oder Stearinsäure ableiten, Nonylphenoxy, Oleylamino oder Stearylamino.Examples of the radicals R2 and R3 are methoxy, ethoxy, propoxy, butoxy, or the residues derived from lauryl alcohol or myristyl alcohol; Carboxalkyl groups, which differ from acetic acid, propionic acid, butyric acid, palmitic acid or stearic acid derive nonylphenoxy, oleylamino or stearylamino.

R2 oder R3 kann sich auch von einem mehrwertigen Alkohol wie Glycerin oder Pentaerytrit oder einer mehrwertigen Carbonsäure wie Citronsäure oder einem mehrwertigen Amin wie Xthylendiamin ableiten. Mehr funktionelle Glieder R2 oder R3 können mit zwei oder mehreren Polyalkoxyketten der oben gezeigten Art verbunden sein, wobei verzweigte Produkte entstehen.R2 or R3 can also be different from a polyhydric alcohol like glycerin or pentaerythritol or a polyvalent one Carboxylic acid such as citric acid or a polyvalent amine such as xthylenediamine. More functional links R2 or R3 can be combined with two or more polyalkoxy chains of the type shown above be connected, resulting in branched products.

Die Herstellung der erfindungsgemäß zu verwendenden oberflächenaktiven Substanzen werden in an sich bekannter Weise durch kontrollierte Addition von Alkylenoxiden an Alkylendiglykole (oder an mehrwertige Alkohole oder Amine z.B. Pentaerythrit oder Athylendiamin, zur Darstellung von verzweigten Produkten) hergestellt. Die endständige Hydroxylfunktionen können gegebenenfalls anschließend verestert oder veräthert werden. Eine allgemeine Vorschrift ~zUr=Herstellung eines geeigneten Blockpolymerisats ist in Beispiel 1a beschrieben. The production of the surface-active substances to be used according to the invention Substances are produced in a manner known per se by the controlled addition of alkylene oxides to alkylene diglycols (or to polyhydric alcohols or amines e.g. pentaerythritol or ethylenediamine, for the preparation of branched products). the Terminal hydroxyl functions can optionally then be esterified or to be etherified. A general rule for the preparation of a suitable block polymer is described in Example 1a.

Die erfindungsgemäßen oberflächenaktiven Substanzen zeichnen sich dadurch aus, daß sie schon in Konzentrationnen von 2-200 ppm in wäßrigen Medien wirksam sind. Man kann sich vorstellen, daß diese Substanzen an der Grenzfläche so geformt sind, daß ihre hydrophoben Reste in die hydrophobe Phase ragen und die alternierend angeordneten hydrophilen Reste in die wäßrige Phase. Da die Hydronhobizität der einzelnen hydrophoben Reste relativ schwach ist, dürfte auch die Bindung dieser einzelnen hydrophoben Reste an fremde hydrophobe Strukturen, z.B. an die hydrophoben Bereiche gelöster Proteine, so schwach sein, daß sie bei den erfindungsgemäßen Anwendungskonzentrationen vernachlässigt werden können. Erst die Summe aller Bindungen der einzelnen hydrophoben Reste an eine größere hydrophobe Fläche (Grenzfläche, gegen die die hydrophoben Bereiche der gelösten Proteine sehr klein sind) bewirkt, daß diese Substanzen auch bei geringer Anwendungskonzentration die Grenzflächen optimal bedecken.The surface-active substances according to the invention are distinguished characterized in that they are already present in concentrations of 2-200 ppm in aqueous media are effective. One can imagine that these substances are at the interface are shaped so that their hydrophobic residues protrude into the hydrophobic phase and the alternately arranged hydrophilic residues in the aqueous phase. As the hydronhobicity of the individual hydrophobic residues is relatively weak, the binding of these should also be individual hydrophobic residues to foreign hydrophobic structures, e.g. to the hydrophobic ones Areas of dissolved proteins, be so weak that they are at the use concentrations according to the invention can be neglected. First the sum of all bonds of the individual hydrophobic ones Residues on a larger hydrophobic surface (interface against which the hydrophobic Areas of dissolved proteins are very small) causes these substances too if the application concentration is low, optimally cover the interfaces.

Die Molekülform, die die erfindungsgemäßen oberflächenaktiven Substanzen in wäßriger Lösung zeigen, dürfte sich von der Form, die sie an der Oberfläche annehmen unterscheiden.The molecular form that the surface-active substances according to the invention show in aqueous solution is likely to differ from the shape they take on the surface differentiate.

In wäßriger Lösung ist die polymere Kette so geformt, daß die einzelnen hydrophoben Bereiche sich gegenseitig absättigen und die hydrophilen Bereiche nach außen in die wäßrige Umgebung ragen. Dies bewirkt eine ausreichend hohe Löslichkeit in wäßrigen Medien, so daß ein genügend großer Vorratspuffer vorhanden ist, der auch bei ständiger Xnderung der Größe der Grenzflächen eine optimale Beladung der Grenzflächen mit den erwähnten Substanzen ermöglicht.In aqueous solution, the polymer chain is shaped so that the individual hydrophobic areas saturate each other and the hydrophilic areas after protrude outside into the watery environment. This causes a sufficiently high solubility in aqueous media, so that a sufficiently large storage buffer is available, the an optimal loading of the Allows interfaces with the substances mentioned.

Die erwähnten polymeren oberflächenaktiven Substanzen kann man entweder einer Protein lösung zumischen oder man kann die Oberflächen, die mit Proteinlösungen in Berührung kommen sollen, mit diesen oberflächenaktiven Substanzen vorbehandeln.The polymeric surface-active substances mentioned can be either add a protein solution or you can use the surfaces covered with protein solutions should come into contact, pretreat with these surface-active substances.

Der Zusatz der erwähnten polymeren oberflächenaktiven Substanzen zu Proteinlösungen ist nicht auf Lösungen für therapeutische Zwecke begrenzt. Man kann diese Substanzen auch Proteinlösungen während des Herstellungs- und Reinigungsprozesses von Proteinen zusetzen zur Vermeidung von Adsorption und Denaturierung an Grenzflächen, insbesondere bei der Gelchromatographie und Ultrafiltration von Proteinlösungen.The addition of the mentioned polymeric surface-active substances to Protein solutions is not limited to solutions for therapeutic purposes. One can these substances also include protein solutions during the manufacturing and purification process add proteins to avoid adsorption and denaturation at interfaces, especially in gel chromatography and ultrafiltration of protein solutions.

Beispiel 1 (a) In einem 10 l-Glaskolben mit Rührer, Heizbad, Rückflußkühler und einer Einrichtung zur Dosie-ung von Alkylenoxiden unter Stickstoff werden 152,1 g Propylenglykol und 125 g 40 %ige Kalilauge vorgelegt. Durch Vakuumdestillation wird entwässert. Anschließend werden bei 1200C langsam unter Rühren nacheinander 4141 g Propylenoxid und 476 g Äthylenoxid zugegeben. Nach beendeter Reaktion wird durch Zugabe von Milchsäure das Kaliumhydroxid neutralisiert. Durch Vakuumdestillation werden die leichtflüchtigen Anteile abgetrennt und das Produkt entwässert. Das mittlere Molekulargewicht des Produktes beträgt 2000 Dalton bei einem Gehalt an Polyoxyäthylen von 10 Gew.-% im Molekül.Example 1 (a) In a 10 l glass flask with stirrer, heating bath, reflux condenser and a device for metering alkylene oxides under nitrogen are 152.1 g propylene glycol and 125 g 40% potassium hydroxide solution. By vacuum distillation is drained. Then at 1200C slowly with stirring one after the other 4141 g of propylene oxide and 476 g of ethylene oxide were added. When the reaction is complete, the potassium hydroxide is neutralized by adding lactic acid. By vacuum distillation will the volatile components separated and the product drains. The average molecular weight of the product is 2000 Daltons a polyoxyethylene content of 10% by weight in the molecule.

(b) 2 Proben mit jeweils 10 ml einer 0,1 %igen Lösung von Rinderserum-Albumin bzw. Human-Albumin in 0,01 M Phosphatpuffer, pH 7, und 2 gleiche Proben mit Zusatz eines Stabilisators von 10 ppm (bezogen auf das Gewicht der Lösung) eines Blockpolymerisats bestehend aus einer linearen Kette von Polypropylenglykol mit einem mittleren Molekulargewicht von 1750 Dalton, der beidseitig jeweils 5 % Polyäthylenglykol anpolymerisiert waren, wurden bei 370C geschüttelt. Die beiden ersten Proben zeigten nach 7 Tagen bzw. 30 Tagen eine starke Trübung, hervorgerufen durch denaturiertes Protein . Die beiden Proben, die den Stabilisator enthielten, waren nach mehreren Monaten noch klar.(b) 2 samples each containing 10 ml of a 0.1% solution of bovine serum albumin or human albumin in 0.01 M phosphate buffer, pH 7, and 2 identical samples with additive a stabilizer of 10 ppm (based on the weight of the solution) of a block polymer consisting of a linear chain of polypropylene glycol with an average molecular weight of 1750 Dalton, of which 5% polyethylene glycol was polymerized on both sides, were shaken at 370C. The first two samples showed after 7 days and Severe turbidity caused by denatured protein for 30 days. The two Samples containing the stabilizer were still clear after several months.

Beispiel 2 10 Proben mit jeweils 10 ml einer 0,01 %igen Lösung des Enzyms ß-Galaktosidase aus E.coli in 0,01 M Phosphatpuffer, 6 pH 7, mit 3 x 106 1uU/ml wurden stufenweise mit 10-100 mg Silikonöl AK 350 versetzt. Die Suspensionen wurden 48 Stunden bei 5 °C geschüttelt. Dabei bildete sich eine Emulsion, die sich durch Ultrazentrifugation (40 000 g, 30 Minuten, 4 OC) in 2 Phasen trennen ließ. In der wäßrigen Phase wurde die Enzymaktivität bestimmt. Es zeigte sich, daß die Silikonölemulsion bis zu 70 % des Enzyms adsorbiert hatte.Example 2 10 samples each with 10 ml of a 0.01% solution of the Enzyme ß-galactosidase from E. coli in 0.01 M phosphate buffer, 6 pH 7, with 3 x 106 10-100 mg AK 350 silicone oil were gradually added to 1 uU / ml. The suspensions were shaken at 5 ° C for 48 hours. An emulsion was formed, which separated into 2 phases by ultracentrifugation (40,000 g, 30 minutes, 4 OC). The enzyme activity was determined in the aqueous phase. It turned out that the Silicone oil emulsion had adsorbed up to 70% of the enzyme.

Die Wiederholung des Versuchs in Gegenwart von 100 ppm (bezogen auf das Gewicht der Lösung) folgender Verbindung CH3-(CH2)12-CH2-O-(-CH2 -CH 2O )4- ergab, daß in Gegenwart dieser oberflächenaktiven Verbindung keine Enzymaktivität an das Silikonöl adsorbiert wurde. Beispiel 3 10 ml einer wäßrigen Suspension von Polystyrol-Kugeln (DowLatex(R)> mit einem mittleren Durchmesser von 0,481 iim wurden in zwei gleiche Teile geteilt. Während der erste Teil unbehandelt blieb, wurde der zweite Teil mit 50 mg eines Blockpolymerisats bestehend aus einer linearen Kette von Polypropylenglykol mit einem mittleren Molekulargewicht von 2250 Dalton, der beidseitig jeweils 5 % Polyäthylenglykol anpolymerisiert waren, bei Raumtemperatur 2 Tage geschüttelt. Anschließend wurde der Uberschuß durch Dialyse gegen eine wäßrige Lösung, die 20 ppm dieser polymeren oberflächenaktiven Substanz enthielt, entfernt.The repetition of the experiment in the presence of 100 ppm (based on the weight of the solution) of the following compound CH3- (CH2) 12-CH2-O - (- CH2 -CH 2O) 4- found that no enzyme activity was adsorbed to the silicone oil in the presence of this surface active compound. Example 3 10 ml of an aqueous suspension of polystyrene balls (DowLatex (R)> with a mean diameter of 0.481 μm were divided into two equal parts. While the first part remained untreated, the second part with 50 mg of a block polymer consisting of a linear chain of polypropylene glycol with an average molecular weight of 2250 Dalton, with 5% polyethylene glycol polymerized on each side, shaken at room temperature for 2 days.

Von den in der nachstehenden Tabelle angegebenen Proteinen wurden je 2 x 3 ml einer Lösung der genannten Konzentration in Phosphatpuffer pH 7 hergestellt. Jede dieser Lösungen wurde bei 5 OC mit jeweils 500 wl der unbehandelten und der wie oben beschrieben vorbehandelten Polystyrol-Suspension geschüttelt. Anschließend wurde jede Probe durch ein 0,2 m Filter klarfiltriert. Die Tabelle gibt die Proteinkonzentrationen in den Filtraten an: Proteinkonzentration in den Lösungen Protein A B C Human-y-Globulin 1,2 mg/ml 1,2 mg/ml 0,2 mg/ml Ei-Albumin 0,5 mg/ml 0,50 mg/ml 0,22 mg/ml Lysozym 1,0 mg/ml 0,95 mg/ml 0,25 mg/ml Secretin 1,0 mg/ml 1,0 mg/ml 0,3 mg/ml Glucagon 1,0 mg/ml 0,9 mg/ml 0,3 mg/ml Insulin 1,0 mg/ml 1,0 mg/ml 0,2 mg/ml A = 3 ml der eingesetzten Proteinlösunge + 450 /ul Puffer B = nach Kontakt mit vorbehandelten Polystyrolflächen C = nach Kontakt mit unbehandelten Polystyrolf].ächen Dieser Versuch wurde bei 37 0C wiederholt. Dabei wurden zusätzlich die Filtrate durch Gelchromatographie in einer Säule untersucht. Es zeigte sich, daß diejenigen Proteinlösungen, die mit den unbehandelten Polystyrolkugeln in Kontakt waren, hochmolekulare Aggregate enthielten. In den Proteinlösungen, die mit den vorbehandelten Polystyrolkugeln in Kontakt waren, wurden solche Aggregate nicht gefunden.Of the proteins given in the table below were 2 x 3 ml each of a solution of the stated concentration in phosphate buffer pH 7 prepared. Each of these solutions was at 5 OC with 500 wl each of the untreated and the Shaken as described above pretreated polystyrene suspension. Afterward each sample was filtered clear through a 0.2 m filter. The table gives the protein concentrations in the filtrates: Protein concentration in the solutions Protein A B C Human-y-globulin 1.2 mg / ml 1.2 mg / ml 0.2 mg / ml egg albumin 0.5 mg / ml 0.50 mg / ml 0.22 mg / ml lysozyme 1.0 mg / ml 0.95 mg / ml 0.25 mg / ml Secretin 1.0 mg / ml 1.0 mg / ml 0.3 mg / ml glucagon 1.0 mg / ml 0.9 mg / ml 0.3 mg / ml insulin 1.0 mg / ml 1.0 mg / ml 0.2 mg / ml A = 3 ml of the protein solution used + 450 / μl buffer B = after contact with pretreated Polystyrene surfaces C = after contact with untreated polystyrene surfaces This The experiment was repeated at 37.degree. The filtrates were additionally analyzed by gel chromatography examined in a column. It was found that those protein solutions with the untreated polystyrene spheres were in contact, contained high molecular weight aggregates. In the protein solutions that were in contact with the pretreated polystyrene balls, no such aggregates were found.

Beispiel 4 5 Proben mit jeweils 10 ml einer 0,1 %igen Lösung von Glucagon in 0,05 M Tris/HCl-Puffer pH 8,0 und 5 gleiche Proben mit einem Zusatz von 50 ppm (bezogen auf das Gewicht der Lösung) folgender Verbindung: CH3- (cH2) 14-CH2-O- (CH2-rH2-O) 4 wurden bei Raumtemperatur geschüttelt. Die ersten 5 Proben zeigten nach 4 Tagen eine Trübung, verursacht durch ausgefallenes denaturiertes Protein. Diejenigen Proben, denen die oberflächenaktive Substanz zugesetzt worden war, blieben mehrere Wochen klar.Example 4 5 samples each with 10 ml of a 0.1% strength solution of glucagon in 0.05 M Tris / HCl buffer pH 8.0 and 5 identical samples with an addition of 50 ppm (based on the weight of the solution) as follows Compound: CH3- (cH2) 14-CH2-O- (CH2-rH2-O) 4 were shaken at room temperature. The first 5 samples showed a turbidity after 4 days, caused by precipitated denatured protein. Those samples to which the surfactant had been added remained clear for several weeks.

Beispiel 5 Ampullen mit 1 - 5 ml je einer 0,1 %igen Lösung der Peptidhormone Secretin, Calcitonin, Glucagon, Gastrin, Adrenocorticotropes Hormon (ACTH), Bradykinin, Cholecystokinin (CCK), Gastrin Inhigierendes Polypeptid (GIP), Vasoaktives Intestinales Polypeptid (VIP) und Luteinisierungs-Releasing-Hormon (LHR) in 0,05 M Tris/HCl-Puffer pH 7,5 und gleiche Proben mit einem Zusatz von 10 ppm (bezogen auf das Gewicht der Lösung) eine Blockpolymerisats bestehend aus einer linearen Kette von Polypropylenglykol mit einem mittleren Molekulargewicht von 2000 Dalton, der beidseitig jeweils 5 % Polyäthylenglykol anpolymerisiert waren, wurden bei 370C geschüttelt. Die Proben ohne Stabilisator zeigten nach einigen Tagen eine starke Trübung, hervorgerufen durch denaturiertes Protein. Die stabili- sierten Proben waren auch nach mehreren Monaten noch klar. Example 5 ampoules with 1-5 ml each of a 0.1% solution of the peptide hormones Secretin, calcitonin, glucagon, gastrin, adrenocorticotropic hormone (ACTH), bradykinin, Cholecystokinin (CCK), Gastrin Inhibiting Polypeptide (GIP), Vasoactive Intestinal Polypeptide (VIP) and luteinizing releasing hormone (LHR) in 0.05 M Tris / HCl buffer pH 7.5 and the same samples with an addition of 10 ppm (based on the weight of the Solution) a block polymer consisting of a linear chain of polypropylene glycol with an average molecular weight of 2000 Dalton, which is 5% on both sides Polyethylene glycol were partially polymerized, were shaken at 370C. Samples without a stabilizer showed severe turbidity after a few days by denatured protein. The stable sated samples were still clear even after several months.

Beispiel 6 Ampullen mit jeweils 10 ml einer 0,1 %igen Lösung von Ei-Albumin bzw. Myoglobin vom Wal in 0,01 M Phosphatpuffer, pH 7, und gleiche Proben mit einem Zusatz von 50 ppm (bezogen auf das Gewicht der Lösung) folgender Verbindung: wurden bei 37 0C geschüttelt. Die Proben ohne Stabilisator zeigten nach einigen Tagen eine starke Trübung, verursacht durch ausgefallenes denaturiertes Protein. Diejenigen Proben, denen die oberflächenaktive Substanz zugesetzt worden war, blieben mehrere Monate klarExample 6 Ampoules each with 10 ml of a 0.1% solution of egg albumin or whale myoglobin in 0.01 M phosphate buffer, pH 7, and the same samples with an addition of 50 ppm (based on the weight of the solution) following connection: were shaken at 37 ° C. The samples without stabilizer showed severe turbidity after a few days, caused by denatured protein which had precipitated out. Those samples to which the surfactant had been added remained clear for several months

Claims

Patent claims: (1) Aqueous protein solution characterized by a Content of a surface-active substance with a chain-shaped basic structure, whose Links weakly hydrophobic and weakly hydrophilic areas in an alternating arrangement contain.

(2) Aqueous protein solution according to claim 1, characterized in that the surface-active substance is a homopolymer, copolymer or block polymer of the formula I, R2 Y-Xn-R3 1 in which Xn is a chain of n members of the formulas II or III in any order and n is 2-80, preferably 8-45, Y is -0- or -NH-, R1 is H, -CH3 or -C2H5, where the radicals R1 can be identical or different, but at least half of them of the chain links X -CH3 or -C2H5 occurs, and in which R2 and R3 are, independently of one another, H or an organic radical.

(3) Aqueous protein solution according to claim 2, characterized in that that R2 and R3 are each alkyl with 1-20 carbon atoms, carboxalkyl with 2-20 carbon atoms or alkylphenyl with 1 - 10 alkyl carbon atoms, R20, however, if Y is -NH-, only alkyl with Can be 1 - 20 carbon atoms.

(4) Aqueous protein solution according to claim 2, characterized in that that R2 and / or R3 are polyvalent and with two or more polyalkoxy chains ~ Xn are connected to branched products.

(5) Method of preparing a stable protein solution thereby characterized in that an aqueous protein solution is a surface-active substance according to claims 1-4 added.

(6) Method of treating a clay hydrophobic surfaces for elimination their adsorbing and denaturing effect on proteins characterized by that one the surface with an aqueous solution of a surface-active substance Treated according to responses 1-4.

(7) Use of solutions according to claims 1-4 in cleaning of proteins by chromatography or ultrafiltration.