DE2546379A1 - Immobilisierte biologisch aktive substanz und deren verwendung - Google Patents

Immobilisierte biologisch aktive substanz und deren verwendung

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Description

Ingvar Gösta Holger Sjöholm, Nils Roger Lindmark, Bo Magnus Ekman,
Uppsala / Schweden
Immobilisierte biologisch aktive Substanz und deren Verwendung
Die Erfindung betrifft eine immobilisierte aktive Substanz und deren Verwendung. Insbesondere betrifft die Erfindung eine immobilisierte biologisch aktive Substanz, bestehend aus mikroporösen sphärischen Teilchen in Gelform und in Form eines dreidxmensionalen Netzwerks, wobei die Teilchen die biologisch aktive Substanzen den Maschen des Netzwerks eingeschlossen enthalten,und die Verwendung der Substanz als ein Reagens für die quantitative Bestimmung einer
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Komponente in einem biospezifischen System und zum Markieren oder Trennen von Zellen, Zellfragmenten, Viren oder Gewebestrukturen mit spezifischen Rezeptoren und Substanzen, die spezifische Oberflächenstrukturen besitzen.
Biochim. Biophys.,Band 166 (1968), Seiten 29 bis 39, beschreibt die Herstellung von immobilisierten Polynucleotiden durch Dispersionspolymerisation einer wäßrigen Lösung von Acrylamid und Ν,Ν'-Methylenbisacrylamid, wobei die Lösung auch ein Polynucleotid enthält. Die Polymerisation resultiert in der Bildung von mikroporösen sphärischen Teilchen in Gelform mit einem Durchmesser von 50 bis 25Ο um und einer Strukturform eines dreidimensionalen Netzwerks, das die Polynucleotide in seinen Maschen eingeschlossen hat. Eine Fraktion im Bereich von 150 bis 200 um wird für Säulenchromatographie verwendet, wobei die Eluierung mit Lösungen stattfindet, die ein Enzym mit einer solchen Molekulargröße enthalten, daß es fähig ist, in die Poren der Teilchen einzudringen.
Es wurde nun gefunden, daß es möglich ist, biologisch aktive Substanzen mit Hilfe von mikroporösen sphärischen Teilchen in Gelform derart zu immobilisieren, daß diese Substanzen in der Lage sind, ihre biologische Aktivität auch gegenüber Substanzen zu gebrauchen, die nicht bis zu einem sehr hohen Grad in das Netzwerk eindringen können, wodurch eine sehr breite Verwendung der immobilisierten biologisch aktiven Substanzen sichergestellt wird. Diese Vorteile werden erfindungsgemäß dadurch erreicht, daß man den Teilchen eine Größe unter 10 um und einen mittleren Durchmesser von 0,5 bis M um, vorzugsweise 1 um, vermittelt.
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Im Gegensatz zu den bisher bekannten immobilisierten Substanzen sind die erfindungsgemäßen Teilchen klein genug, um sicherzustellen, daß ein großer Teil der Moleküle der biologisch aktiven Substanz nicht vollständig im Netzwerk der Teilchen eingeschlossen ist, sondern teilweise aus letzteren herausragt. Es muß als besonders überraschend angesehen werden, daß es möglich war, eine wirksame Immobilisierung der biologisch aktiven Substanz zu erzielen, ohne daß sich letztere innerhalb der Teilchen befindet.
Die erfindungsgemäße immobilisierte, biologisch aktive Substanz, bestehend aus mikroporösen sphärischen Teilchen in Gelform und in Form eines dreidimensionalen polymeren Netzwerks, wobei die Teilchen die biologisch aktive Substanz in den Maschen des Netzwerks eingeschlossen enthalten, ist dadurch gekennzeichnet, daß die Teilchen eine Größe unter 10 um und einen mittleren Durchmesser von 0,5 bis 4 Jim, vorzugsweise 1 um, besitzen, wodurch die biologisch aktive Substanz in die Lage versetzt wird, ihre biologische
über
Aktivität gegen/Substanzen zu gebrauchen, die nicht in der Lage sind, in daseietzwerk der Teilchen einzudringen.
Die Teilchen bestehen hauptsächlich aus einem Copolymer einer niedermolekularen Acrylverbindung oder von 1-Vinyl-2-pyrrolidinon mit einer niedermolekularen Divinylverbindung, wobei letztere als Vernetzungsmittel fungiert. Mit dem Ausdruck "niedermolekular" ist gemeint, daß die Verbindung zweckmäßigerweise nicht mehr als 10 C-Atome enthält. Vorzugsweise enthält die Acryl . verbindung
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nicht mehr als 4 C-Atome, während die Divinylverbindung vorzugsweise N,N'-MethyIenbisacrylamid ist.
Geeignete niedermolekulare Diviny!verbindungen sind im Prinzip alle bekannten niedermolekularen Verbindungen, die 2 äthylenisch ungesättigte Endgruppen haben. Beispiele für solche niedermolekularen Divinylverbindungen sind Ν,Ν1-Methylenbisacrylamid, Diäthylenglykoldivinylather, Äthylenglykoldimethacrylat und Divinylsulfon.
Zu den bevorzugten Teilchen gehört ein Copolymer einer Acryl verbindung der Formel
R1
CH2 = C - COR2 ,
worin R1 ein Wasserstoffatom oder einen Methylrest und
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R einen Hydroxylrest oder -NHR, bedeuten, worin R ein Wasserstoffatom oder eine gerad- oder verzweigtkettige. Alkylgruppe mit 1 bis 6 C-Atomen bedeutet, wobei die Gruppe nichtsubstituiert oder durch eine Hydroxyl- oder Oxogruppe substituiert ist, mit einem N,N'-Methylenbisacrylamid. Besonders bevorzugt sind Copolymere von Acrylsäure und/oder Acrylamid mit Ν,Ν'-Methylenbisacrylamid.
Beispiele für erfindungsgemäß verwendbare niedermolekulare Acry!verbindungen sind Acrylamid, Methacrylamid, N-Hydroxy· ethylacrylamid, 2-Hydroxyäthylmethacrylat, Acrylnitril, Acrylsäure, Ν,Ν-Dimethylaminoäthylmethacrylat und Glycidylmethacrylat.
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Die biologisch aktive Substanz besteht aus Makromolekülen, wie Proteinen, Polysacchariden, Polyaminosäuren, Nucleinsäuren, getrennt oder miteinander vermischt. Die biologisch aktive Substanz kann entweder nichtmodifiziert oder mit radioaktiv markierten Substanzen, Farbstoffen oder Molekülen niederen Molekulargewichts, konjugiert sein. Die aktive Substanz kann auch selbst mit einem Strahlungserzeugenden Atom oder einer Atomgruppe, einem Enzym oder einer farberzeugenden Gruppe markiert sein. Eine indirekte Markierung kann außerdem dadurch erzielt werden, daß man die markierende Substanz in die Teilchen zusammen mit der biologisch aktiven Substanz einarbeitet.
Moleküle niederen Molekulargewichts lassen sich dadurch immobilisieren, daß sie durch chemische Reaktion oder Adsorption an immobilisierte Makromoleküle in den Teilchen gebunden sind.
Im Prinzip lassen sich die Teilchen nach bekannten Verfahren der Dispersionspolymerisation herstellen. Im einzelnen kann die Herstellung folgendermaßen stattfinden:
Eine wäßrige Lösung des zu polymerisierenden Monomers wird mit einer Lösung der zu immobilisierenden biologisch aktiven Substanz (ein Makromolekül oder eine Verbindung niederen Molekulargewichts, die an ein Makromolekül gebunden ist) vermischt. Eine/organische Phase, beispielsweise bestehend aus einem Gemisch von Toluol und Chloroform im Verhältnis von 3:1» wird in ein Reaktionsgefäß zusammen mit einem
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geeigneten Emulgator gegeben. Die Luft über der organischen Phase wird durch Stickstoffgas vertrieben. Ein Katalysator wird der Monomerlösung, die zur Verminderung der Reaktionsgeschwindigkeit gekühlt wird, zugesetzt, wobei diese Lösung schnell in die organische Phase gegossen wird, die intensiv durch einen wirksamen Homogenisator behandelt wird. Auf diese Weise können Teilchen mit Größen unter 1 um hergestellt werden. Im Polymerisationsverfahren sollte die Temperatur +400C nicht übersteigen, was bedeutet, daß biologische Moleküle biologisch aktiv bleiben.
Die Porosität der Teilchen kann durch Veränderung der Konzentration des Ausgangsmonomers in der Lösung und durch Veränderung der Konzentration der vernetzenden Divinylverbindung im Monomergemisch verändert werden. Die Oberflächenladung kann durch geeignete Auswahl der Konzentration und der Art der Monomere von ungeladen bis positiv oder negativ geladen verändert werden. Durch Einführung von geladenen Gruppen im Gelpolymer in die Polymerisation können die erhaltenen geladenen Teilchen sich gegenseitig abstoßend gemacht werden, um Aggregation der letzteren zu verhindern, was im Hinblick auf die Verwendung der immobilisierten biologisch aktiven Substanz wichtig ist. Der Monomerlösung können fluoreszierende Derivate vom Monovinylmonomer zugesetzt werden, wobei das Monomer in das Gelskelet in der Polymerisation eingearbeitet wird und die Teilchen fluoreszierend macht. Organische Moleküle können durch chemische Reaktionen an die immobilisierten biologisch aktiven Substanzen in den Teilchen auch nach der Polymerisation gebunden werden.
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Die immobilisierten biologisch aktiven Substanzen können lyophilisiert oder mit Äthanol getrocknet und dann für Jahre bei Raumtemperatur gelagert werden.
Die Erfindung befaßt sich außerdem mit der Verwendung einer erfindungsgemäßen immobilisierten biologisch aktiven Substanz als Reagens zur quantitativen Bestimmung einer Komponente injeinem biospezifischen System, wobei das System die biologisch aktive Substanz als Komponente enthält, mit Hilfe von Agglutinierungs-, immunometrischen, immunologischen oder Zellrezeptor-Bestimmungsmethoden.
Die Erfindung befaßt sich außerdem mit Agglutinierungs-, immunometrischen, immunologischen und Zellrezeptor-Bestimmungsmethoden für die quantitative Bestimmung einer Komponente in einem biospezifischen System unter Verwendung eines Reagens aus einer zu dem biospezifischen System gehörenden biologisch aktiven Substanz, die an mikroporöse, sphärische Teilchen mit der Strukturform eines dreidimensionalen Netzwerks gebunden sind. Die Erfindung ist durch die Verwendung von Teilchen mit Größen unter 10 um und einem mittleren Durchmesser von 0,5 bis H um, vorzugsweise 1 um,
gekennzeichnet, wobei die Teilchen die biologisch aktive Substanz in immobilisierter Form und in den Maschen des dreidimensionalen Netzwerks enthalten. Bei vorstehender Methode kann die immobilisierte biologisch aktive Substanz durch ein zur Aussendung einer Strahlung befähigtes Atom oder eine Gruppe, ein Enzym oder eine farberzeugende Gruppe markiert sein.
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Das Prinzip der Agglutinierungsreaktionen besteht darin, daß die zu bestimmende Substanz durch ihre spezifische Wechselwirkung mit an den Teilchen sitzenden Molekülen nachgewiesen wird, wobei diese Wechselwirkung zur Folge hat, daß benachbarte Teilchen zusammen an ein Netzwerk gebunden werden, was visuell beobachtet werden kann. Bei der Agglutinierungsmethode wird eine ReiheηVerdünnung der Probe und eine bekannte Konzentration der zu bestimmenden Substanz in speziellen Kunststoffwegwerfbehältern hergestellt.
Indem man die Teilchen durch Copolymerisation von geladenen Vinylverbindungen mit Ladung versieht, werden Teilchen erhalten, die nicht sofort Aggregate bilden. Eine standardi- ' sierte Menge der erfindungsgemäßen Teilchen wird allen Verdünnungen und Behältern, die nur Pufferlösung als Blindprobe enthalten, zugesetzt. Wenn die Probe die zu bestimmende Komponente enthält, hat die direkte Agglutinierung zur Folge, daß sich die Teilchen über die Moleküle der Komponente miteinander verbinden, wobei sich ein gleichmäßiger Teppich über der Oberfläche des Bodens des Kunststoffbehälters bildet. Wenn jedoch die Probe negativ ist, setzen sich die Teilchen am Boden des Behälters so ab, daß sich eine kleine scharfbegrenzte Zone bildet.
Indirekte sogenannte Inhibierungstechniken beruhen auf einer Konkurrenz zwischen den gleichen in den Teilchen immobilisierten Molekülen und den Molekülen in der Probe gegenüber einer begrenzten Menge an zugesetzten gegenüber den tatsächlichen Molekülen biospezifischen Makromolekülen.
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Die Quantitätsbestimmung findet bei diesen Methoden semiquantitativ dadurch statt, daß man/äer Agglutinierung den Verdünnungsgrad der Blindprobe mit demdenigen der Probe vergleicht. Wenn die Teilchen ungeladen gemacht werden, wird die Agglutinierungsreaktion auf einer glatten Oberfläche sichtbar.
Immunometrische, immunologische und Zellrezeptor-Bestimmungsmethoden beruhen auf einer spezifischen Wechselwirkung zwischen den biospezifischen Molekülen und deren Liganden. Wenn man die biospezifischen Moleküle und die zu bestimmende Substanz mit einer geeigneten Markierung versieht, kann der Grad der spezifischen Wechselwirkung häufig nach der Abtrennstufe quantitativ bestimmt werden. Die Methode kann für die Bestimmung von einer der Komponenten in einem Wechselwirkungssystem angewandt werden.
In Konkurrenz-Protein-Bindetechnücen wird die erfindungsgemäße immobilisierte biologisch aktive Substanz folgendermaßen verwendet: Einer verdünnten oder unverdünnten Probe wird zuerst vorzugsweise eine Markierung zugesetzt, wobei die Markierung die radioaktive oder mit Enzym markierte Form der quantitativ zu bestimmenden Substanz ist. Danach werden Mikroteilchen mit immobilisierten biospezifischen Proteinen in einer etwas niedrigeren Menge als die markierte Substanz zugesetzt, und man läßt eine Inkubation stattfinden, bis ein Gleichgewicht erreicht ist. Die Mikroteilchen lassen sich aus der Lösung durch kräftiges Zentrifugieren leicht abtrennen. Die Teilchen werden mit einer Pufferlösung gewaschen und nochmals zentrifugiert. Eine enzymatische oder radioaktive Messung der Probe gibt eine
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Antwort auf die Frage, wie groß ein Teil der markierten Substanz, die an die immobilisierte Komponente in den Teilchen gebunden wurde, ist. Eine andere Möglichkeit besteht darin, die markierte Substanz in der überstehenden Flüssigkeit nach dem ersten Zentrifugieren quantitativ zu bestimmen. Die Menge an Substanz kann von einer Standardkurve quantitativ bestimmt werden, die dadurch erhalten wird, daß man erst bekannte Mengen der zu bestimmenden Substanz zu einer konstanten Menge der Gelteilchen und der markierten Substanz zugibt.
Bei immunometrischen Techniken werden Antikörper oder Rezeptormoleküle markiert und im Überschuß zugesetzt, wonach die Inkubation solange stattfindet, bis ein Gleichgewicht erreicht worden ist. Danach werden erfindungsgemäße Mikroteilchen mit einer immobilisierten zu bestimmenden Substanz zugesetzt, damit markierte Antikörper oder Zellrezeptoren, die nicht reagiert haben, abgetrennt werden können. Nach Zentrifugieren in einer üblichen Tischzentrifuge kann ein feststehender Teil der darüber liegenden Phase ermittelt und die Substanz nach Erstellung einer Standardkurve mit Hilfe von bekannten Mengen der Substanz quantitativ bestimmt werden. Die quantitative Bestimmung kann außerdem an den gewaschenen Teilchen vorgenommen werden.
Bei den Konkurrenz-Bindetechniken zur quantitativen Bestimmung weist die Verwendung einer erfindungsgemäßen immobilisierten biologisch aktiven Substanz gegenüber bisher bekannten Reagentien folgende Vorteile auf:
Chemisch inerte Teilchen mit einer hohen mechanischen Festigkeit und einer wohldefinierten Größe unter 10 um
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lassen sich billig und leicht mit dem immobilisierten biospezifischen Molekül oder Liganden selbst in Polymerisationsreaktionen herstellen.
Nach dem Lyophilisieren oder Trocknen mit Äthanol lassen sich die Teilchen mit den immobilisierten Molekülen mehrere Jahre bei Raumtemperatur biologisch intakt aufbewahren.
Durch Veränderung der Oberflächenladung ist es möglieh, die Agglutinierungsreaktion dadurch zu vereinfachen, daß man letztere in zur Mitte schräg abfallenden Vertiefungen in den wegwerfbaren Kunststoffplatten stattfinden läßt.
Biospezifische Proteine oder Liganden lassen sich im Polymerisationsverfahren ohne die großen Verluste immobilisieren, die bei der mechanischen Zerkleinerung von Polymerblocks erzielt werden.
Durch Immobilisierung geeigneterPolymere in der Polymerisation sind diese Methoden für Substanzen mit niedrigem Molekulargewicht geeignet, in^dem letztere durch einfache bekannte Konjugationsmethoden an Makromoleküle gebunden werden.
Die Fähigkeit von Polyacrylamid an Glasoberflächen zu haften, kann für die Ausschaltung des Zentrifugierens verwendet werden.
Die Teilchen sind vollständig sphärisch und von gleichmäßiger Größe, was bedeutet, daß sie praktisch zu verwenden und leicht zu dosieren sind, im Gegensatz zu Teilchen, die nach Zerkleinerung von großen Polymerblocks erzielt wurden.
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Kovalente Bindung der biospezifischen Moleküle wurde
für die Immobilisierung nicht benutzt, weil eine derartige Bindung den Verlust von biologischer Aktivität zur Folge hat.
Die Erfindung befaßt sich außerdem mit der Verwendung der immobilisierten biologisch aktiven erfindungsgemäßen
Substanz zum Markieren von Zellen, Zellfragmenten, Viren und Gewebestrukturen mit spezifischen Rezeptoren oder
Substanzen, die spezifische Oberflächenstrukturen haben, wobei einer der Rezeptoren spezifisch auf die biologisch aktive Substanz gerichtet ist, oder eine der Oberflächenstrukturen spezifisch mit dieser biologisch aktiven Substanz reagiert, wobei diese Substanz mit einem zur Aussendung
einer Strahlung befähigten Atom oder einer Gruppe, einem Enzym oder einer farbbildenden Gruppe markiert ist.
Die Erfindung befaßt sich außerdem mit einer Methode zum Markieren von Zellen, Zellfragmenten, Viren oder Gewebestrukturen mit spezifischen Rezeptoren oder Substanzen, die spezifische Oberflächenstrukturen haben, durch biospezifische Wechselwirkung mit einem Reagens, das aus einer
biologisch aktiven Substanz besteht, die an einen festen Träger gebunden ist, wobei einer der Rezeptoren spezifisch gegen diese Substanz gerichtet ist oder eine der Oberflächenstrukturen spezifisch mit dieser biologisch aktiven Substanz reagiert, woßei die biologisch aktive Substanz mit einem zur Aussendung einer Strahlung befähigten Atom oder einer Gruppe, einem Enzym oder einer farberzeugenden Gruppe
markiert ist. Die Methode ist dadurch gekennzeichnet, daß man als festen Träger mikroporöse sphärische Teilchen in
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der Strukturrorm eines dreidimensionalen Netzwerks verwendet, wobei diese Teilchen Größen unter 10 um und mittlere Durchmesser von 0,5 bis 4 um, vorzugsweise 1 um, besitzen und wobei diese Teilchen die biologisch aktiven Substanzen in immobilisierter Form in den Maschen des dreidimensionalen Netzwerks eingeschlossen haben.
Die Markierung kann für verschiedene Arten von Studien verwendet werden, beispielsweise eine Studie von Oberflächenstrukturen mit Zellen. Eine Vielzahl von verschiedenen Markierungen für die immobilisierte biologisch aktive Substanz kann je nach Typ der durchzuführenden Studien und verfügbareifEinrichtung verwendet werden. Durch Markierung der Teilchen mit radioaktiven Isotopen kann der Nachweis und die quantitative Bestimmung in Flüssigkeits- oder Gammascintxllatxonszählern durchgeführt werden. Die Markierung der Teilchen kann außerdem mit fluoreszierenden Substanzen vom Fluorescxn'oder Rhodamin-Typ durchgeführt und in einem Fluoreszensmikroskop beobachtet werden. Für elektronenmikroskopische Studien können Proteine mit einer hohen Elektronendichte vom Ferritin-Typ in den Teilchen bei deren Herstellung immobilisiert werden und können dadurch in einem Elektronenmikroskop nachgewiesen werden. In diesem Falle würden Teilchen mit einer sehr kleinen Teilchengröße verwendet werden. Bei Gewebestudien können Enzyme, wie MeerretfcLch-peroxidase, in den Teilchen immobilisiert werden und über spezifische enzymatische, in einem Mikroskop sichtbare Farbreaktionen nachgewiesen werden. Die Polymerkörnchen mit dem immobilisierten Liganden und der Markierung werden zugesetzt und in einer Zellsuspension inkubiert.
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Die überschüssigen Teilchen werden entfernt ,und ein geeignetes Substrat, wie Benzidin, wird zugesetzt, wobei die Oxidation des letzteren dann nachgewiesen wird. Diese Methode ermöglicht es, die Menge an Zellen in einer Population mit einer gewissen Oberflächenstruktur zu bestimmen.
Die Erfindung befaßt sich außerdem mit der Verwendung einer erfindungsgemäßen immobilisierten biologisch aktiven Substanz zum Abtrennen von Zellen, Zellfragmenten, Viren oder Gewebestrukturen mit spezifischen Rezeptoren oder Substanzen mit spezifischen Oberflächenstrukturen aus einem Substanzgemisch, das solche Zellen, Zellfragmente, Viren, Gewebestrukturen oder Substanzen enthält, indem man die biologisch aktive Substanz spezifisch mit den Zellen etc. reagieren läßt, unter Bildung einer konjugierten Substanz, die dann von den übrigen Komponenten des Substanzgemisches durch Methoden abgetrennt wird, die auf unterschiedlicher Dichte und der Adsorption der Teilchen an Glaswänden basieren.
Polglich befaßt sich die Erfindung auch mit einer Methode zum Abtrennen von Zellen, Zellfragmenten, Viren oder Gewebestrukturen mit spezifischen Rezeptoren oder Substanzen mit spezifischen Oberflächenstrukturen von einem Substanzgemisch, enthaltend solche Zellen, Zellfragmente, Viren, Gewebestrukturen oder Substanzen durch spezifische Reaktion mit einem Reagens, das aus einer biologisch aktiven Substanz, die an einen festen Träger gebunden ist, besteht, auf die eine der Rezeptoren spezifisch gerichtet ist oder mit der einer der Oberflächenstrukturen spezifisch unter Bildung;
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einer konjugierten Substanz reagiert, die von den übrigen Komponenten in dem Substanzgemisch durch Methoden abgetrennt wird, die auf verschiedenen Dichten und der Adsorption eines Trägers an Glaswänden beruht. Die Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß man als festen Träger mikroporöse sphärische Teilchen in Gelform mit einer Strukturform eines dreidimensionalen Netzwerks verwendet, wobei diese Teilchen eine Größe unter 10 um und einen mittleren Durchmesser von 0,5 bis 4 um, vorzugsweise 1 um, aufweisen und die biologisch aktive Substanz in immobilisierter Form in den Maschen des dreidimensionalen Netzwerks eingeschlossen enthalten.
Für die vorstehende Verwendung und die Methoden kann die biologisch aktive Substanz mit einem zur Aussendung einer Strahlung befähigten Atom oder einer Gruppe, einem Enzym oder einer farberzeugenden Gruppe markiert sein.
Zur Abtrennung von biologischen Zellen mit einer gewissen Oberflächenstruktur in einer Zellpopulation können Mikroteilchen mit einer geeigneten Dichte und in denen das Molekül (Ligand),das spezifisch mit dieser Art von Zellen reagiert, in immobilisierter Form vorliegt, verwendet werden.Der Zellsuspension werden Mikroteilchen zugesetzt, die ihren Liganden in den Teilchen immobilisiert haben,und man läßt die Inkubation solange stattfinden, bis ein Gleichgewicht im System erreicht worden ist. Die Probe wird in einen geeigneten Dichtegradienten in ein Kunststoffzentrifugenrohr oberhalb des Gradienten gegeben. Aufgrund der Wechselwirkung der Zellen mit einer spezifischen Oberflächenstruktur mit den tiganden-Mikroteilchen bekommen diese Zellkomplexe eine
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Dichte, die sich von der der freien Zellen unterscheidet. Die Abtrennung erfolgt,indem die Proberohre in einer gekühlten Zentrifuge bei einer geeigneten Anzahl an Umdrehungen zentrifugiert wird bis die Abtrennung erzielt ist. Es werden im Rohr zwei verschiedene Schichten erhalten, wobei die schwerere Fraktion dem Boden am nächsten ist.
Die Dichte der Mikroteilchen kann dadurch variiert werden, daß man die Konzentration des niedermolekularen Acrylmonomeren zwischen 5 und 50 % verändert. Dadurch ist es möglich verschiedene Arten von Zellen mit verschiedenen Oberflächenstrukturen durch Auswahl vnn Mikropartikeln mit einer geeigneten Dichte und durch Auswahl des Dichtegradienten abzutrennen. Die Trennung, zwischen den verschiedenen Zelltypen kann visuell beobachtet werden, indem man die verschiedenen Teilchen mit färbenden Substanzen markiert. Auf diese Weise können Bedingungen, wie Zentrifugierzeit und Dichtegradient, bestimmt werden. Durch Immobilisieren der Ligandenteilchen über immobilisiertes Dextran oder Collagen können die Zellen von den Teilchen auf Zeit und Arbeit sparende Weise durch enzymatische Behandlung mit beispielsweise Dextranase oder Collagenase, abgetrennt werden.
Eine weitere Möglichkeit der Verwendung von Ligandenteilchen zur Abtrennung von Zellen besteht darin, die Fähigkeit des Polyacrylamid^ an Glasoberflächen adsorbiert zu werden, auszunutzen. Polyacrylamid-Ligandenteilchen werden gleichmäßig über die Glasoberfläche in einem Kulturgefäß verteilt.
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Die Zellsuspension wird dann dem Gefäß zugesetzt, wodurch Zellen mit einer spezifischen Oberflächenstruktur sich mit de» Ligandenteilchen verknüpfen. Nach Wegspülen der überschüssigen verbleibenden Zellen nach dem erforderlichen Inkubationsverfahren ist es möglich, eine sehr homogene Zellsuspension zu erhalten. Nach Zugabe von Nährmedium kann die Suspension gezüchtet und das Verfahren wiederholt werden, wenn die so erhaltenen Zellen heterogen sind.
Erfindungsgemäß immobilisierte biologisch aktive Substanzen können für die biospezifische Isolierung gewisser Verbindungen eines Gemischs gemäß den gleichen Methoden verwendet werden, die bereits für biospezifische/an verschiedene Matrices kovalent gebundene Adsorbentien verwendet werden. Es können chromatographische und absatzweise Verfahren angewandt werden.
Die Vorteile liegen für den Fachmann auf dem Gebiet der zellbiologischen Forschung auf der Hand.
Die Mikroteilchen, deren biologisch aktive Substanz immobilisiert worden ist, üben keine unspezifische oder giftige Wirkung auf biologische Zellen aus.
Durch Veränderung der Dichte und der Farbe der Teilchen können mindestens zwei verschiedene Arten von Zellen durch Zentrifugieren abgetrennt werden, und wenn die Teilchen gefärbt sind, können die geeigneten Abtrennbedingungen leicht experimentell bestimmt werden.
Der Ligand kann an den Teilchen immobilisiert werden und von letztererf proteolytisch oder durch eine andere enzymatische Digestion des immobilisierten Polymers,an das der Ligand kovalent gebunden ist, mit Hilfe von Enzymen, die die Oberflächenstruktur der Zellen nicht beeinträchtigen, abgetrennt werden. In vielen Fällen, insbesondere wenn spezifische Moleküle in reiner Form aus einem Gemisch derselben hergestellt werden sollen, kann die Wechselwirkung mit den Teilchen leicht durch Veränderung der Eigenschaften des Mediums, wie Temperatur, pH, Salzkonzentration usw., unterbrochen werden. In diesen Fällen können die Mikroteilchen nach dem Waschen wieder verwendet werden.
Die an der Glasaberfläche des Kulturgefäßes adsorbierten Ligandenteilehen können abgetrennt und im gleichen Gefäß kultiviert werden, ohne die Zellen zu bewegen und die Gefahr einer Verunreinigung einzugehen.
Im Zusammenhang mit dem Studium der Oberflächenstruktur einer Zelle können Mikroteilchen mit immobilisiertem Liganden für das Studium verschiedener Zellrezeptoren verwendet werden. Viele verschiedene organische Moleküle können in den Teilchen immobilisiert werden.
Zwei verschiedene Arten von Zellstrukturen, die in der gleichen Zelle oder Zellpopulafeion vorliegen, können durch gleichzeitigen Nachweis von zwei verschiedenen Markierungen, wie Fluorescein und Rhodamin, studiert werden.
Das Verfahren zur Herstellung der Teilchen stellt sicher, daß die in den Teilchen eingeschlossenen Makromoleküle durch
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chemische Modifikation im Zusammenhang mit dem Immobilisierungsverfahren nicht verändert werden.
Nachstehende Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.
Beispiel 1
200 ml eines Gemische aus Toluol und Chloroform (150:50) wurden in einem Becher mit 0,3 g eines Emulgators vermischt, der aus einem Poly(oxyäthylen)-poly(oxypropylen)-poly(oxyäthylen)-polymer (Pluronics P 68) bestand. 30 ml einer Lösung, durch die Stickstoffgas durchgeblasen und die auf +40C abgekühlt wurde und die 6 % Acrylamid, 2 % Ν,Ν'-Methylenbis(acrylamid) und 300 ul N.NjN'jN'-Tetramethyläthylendiamin enthielt, wurde sorgfältig vermischt. Danach wurden 150 mg Albumin zugesetzt und die Lösung schnell mit 1 ml einer 10#igen Ammoniumperoxodisulfatlösung in Wasser vermischt und in den Becher gegossen. Das Gemisch wurde sofort mit Hilfe einer wirksamen Emulgiervorrichtung nach Silversons (Waterside, Chesham, Bucks., U.K.) homogenisiert. Das Gemisch wurde mit einer starken Lampe beleuchtet, wodurch die Polymerisation zu Polyacrylamid erfolgte. Nach Zentrifugieren und Waschen wurden Mikroteilchen mit einem mittleren Durchmesser von 1 um (gemäß den Messungen in einem Zelloskop) mit dem immobilisierten Albumin erhalten.
Beispiel 2
Mikroteilchen mit immobilisiertem Albumin wurden auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1 hergestellt, jedoch mit einer
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niedrigeren Konzentration von Acrylamid (3 %) und Bisacrylamid (1 %). Die Größenverteilung der erhaltenen Teilchen war die gleiche wie in Beispiel 1. Versuche zeigten, daß die Fähigkeit des Albumins,verschiedene Medikamente, wie Salicylsäure und Warfarin zu binden, sich nicht verändert hatte.
Beispiel 3
Mikroteilchen mit immobilisiertem Albumin wurden auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1 hergestellt, jedoch mit wesentlich höherer Konzentration an Albumin in der Monomerlösung (200 mg/ml). Die Polymerisation erfolgte wie im Beispiel 1. Der Gehalt an Albumin in den fertigen Teilchen war hoch und entsprach etwa 25 Gew.-J5 der Teilchen.
Beispiel 4
Mikjpoteilchen wurden auf ähnliche Weise wie im Beispiel 1 hergestellt, jedoch mit 7 % Acrylamid und 3 % Bisacrylamid in der Monomerlösung,und das Albumin wurde durch Concanavalin A ( 2 mg/ml) ausgetauscht. Die erhaltenen Teilchen hatten Größen zwischen etwa 1 und 5 Jim. und waren in der Lage, sich fest an rote Blutkörperchen in physiologischen Salzlösungen zu binden. Fluoresceinisothiocyanat konnte ebenfalls an die erhaltenen Teilchen sehr leicht gebunden werden.
Beispiel 5
Es wurden Teilchen nach Beispiel 4 hergestellt mit geringen Mengen an Humanserum Albumin, das mit Fluoresceinisothiocyanat zusammen mit Concanavalin A modifiziert worden war.
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Die erhaltenen Teilchen konnten leicht in einem Mikroskop in fluoreszierendem Licht beobachtet werden.
Beispiel 6
Ähnlich wie im Beispiel 1 wurden Teilchen mit Protein A von Staphylococcus aureus hergestellt. Die Konzentration in der wäßrigen Lösung betrug H mg/ml. Die erhaltenen Teilchen erwiesen sich als fähig, in einer Sepharosesäule, an die normales Immunoglobulin menschlicher Herkunft (hauptsächlich IgGl) durch kovalente Bindungen gebunden war, festgehalten zu werden.
Beispiel 7
Dextran mit einem Durchschnittsmolekulargewicht von etwa 40 000 wurde mit Cyanogenbromid behandelt. Glycin wurde an das Dextran gebunden, indem es durch eine Säule aus Biogel P-6 lief. Das so modifizierte Dextran wurde in Mikroteilchen auf ähnliche Weise wie im Beispiel 1 immobilisiert. Verschiedene Verbindungen, die freie Aminogruppen aufwiesen, konnten durch kovalente Bindungen (beispielsweise Insulin) an die von Glycin stammenden Carboxylgruppen mit Hilfe üblicher Synthesemethoden gebunden werden. Insulin-Mikroteilchen wurden dann zum Studium des Insulinrezeptors verschiedener Zellen verwendet.
Beispiel 8
Nach dem gleichen Prinzip wie im Beispiel 7 wurde auch radioaJefciv markiertes Insulin (J -Insulin) in Mikroteilchen
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gebunden. Die Bindung an die Zellen konnte noch leichter quantitativ durch die radioaktive Strahlung bestimmt werden.
Beispiel 9
Bromsulfophthalein erzeugt eine starke blauviolette Färbung in alkalischem pH, die durch Bromsubstitution an verschiedene Arten von Polysacchariden, wie vernetzte Agarose, gebunden werden kann. Auf ähnliche Weise wie im Beispiel 1 wurden Mikroteilchen, die Bromsulfophthalein enthielten, hergestellt. Die Teilchen erwiesen sich als fähig, Albumin und ligandin-artige Proteine von Schweineleber aus deren Lösungen zu absorbieren. Auf ähnliche Weise konnte Bromsulfophthalein an Polyäthylenglykol gebunden werden, das dann in Mikroteilchen eingeschlossen wurde.
Beispiel 10
Auf ähnliche Weise wie im Beispiel 1 konnte Poly-1-lysin in Mikroteilchen anstelle von Albumin eingeschlossen werden.
Beispiel 11
Mikroteilchen wurden ähnlich wie in Beispiel 1 hergestellt, jedoch mit dem Unterschied, daß Acrylsäure anstelle von Acrylamid verwendet wurde. Die auf diese Weise erhaltenen Teilchen hatten Größen bis zu etwa 5 um. Sie enthielten Carboxylgruppen, die sie bei neutralen pH-Werten negativ geladen machten, wobei diese Ladung sie von anderen negativ geladenen Körpern abstieß. Dieses Beispiel beweist, daß das Verhältnis von
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Acrylamid zu Acrylsäure zwischen 1:0 bis 0:1 schwanken kann.
Beispiel 12
T-Lymphocyten wurden spezifisch in einem Gemisch von B- und T-Lymphocyten dadurch markiert, daß man das Gemisch mit Mikroteilchen (mit einem mittleren Durchmesser von 0,5
30 Minuten lang in einem Puffer bei O0C inkubierte, wobei die Teilchen Helixpomatiaagglutin - ein Leeitin, das in der Lage ist, T-Lymphocyten spezifisch zu binden - und riuorescein-markiertes Albumin enthielte/j.Das Zellgemisch wurde dann von überschüssigen Teilchen freigewaschen, indem man eine Suspension im Puffer herstellte und diese Suspension zentrifugierte. Zellen des Zellgemischs, die Teilchen an ihrer Oberfläche gebunden hatten, konnten in einem Fluoreszenz-Mikroskop nachgewiesen und der T-Lymphocyten-Gehalt berechnet werden.
Beispiel 13
Der Versuch wurde auf ähnliche Weise wie im Beispiel
■lpe
durchgeführt. Anstelle von J 3-modifiziertem Albumin enthielten die Teilchen nun Albumin, das mit Fluorescein markiert worden war. Der Komplex aus Teilchen und Zellen wurde durch Autoradiographie nachgewiesen.
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Beispiel 14
Der Versuch wurde auf ähnliche Weise wie im Beispiel 13 durchgeführt. Anstelle von mit Fluorescein markiertem Albumin enthielten die Teilchen nun Perritin. Der Teilchenkomplex wurde unter Verwendung eines Elektronenmikroskops nachgewiesen.
Beispiel 15
T-Lymphocyten wurden aus einem Zellgemisch, das aus B- und T-Lymphocyten bestand, abgetrennt, indem man das Gemisch mit Mikroteilchen, die Helixpomatiaagglutin enthielten, 30 Minuten lang gemäß Beispiel 12 inkubierte. Das Zellgemisch wurde dann als eine Schicht auf den oberen Teil eines Saccharoseoder Metrizoatgradienten getan,und nach 45minütigem Zentrifugieren bei 30 000 UpM fand man die Zellen, die nicht mit den Teilchen reagiert hatten, in der niedrigsten Zone des Gradienten. Am oberen Teil des Gradienten fand man Teilchen, die nicht mit den Zellen reagiert hatten. In dem Feld zwischen den beiden Zonen wurden Zellen gefunden, die mit Teilchen in unterschiedlichem Grad reagiert hatten.
Beispiel 16
Der Versuch wurde auf ähnliche Weise wie im Beispiel 15 durchgeführt, außer daß die Teilchen eine höhere Dichte als die Zellen aufwiesen, da jodmodifiziertes Polytyrosin in die Teilchen hineinpolymerisiert worden war. Die Reihenfolge der Zonen war genau umgekehrt wie im Beispiel 15.
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Beispiel 17
Der Versuch wurde auf ähnliche Weise wie in Beispiel 15 durchgeführt, außer daß Helixpomatiaagglutin durch kovalente Bindungen an Collagen gebunden war, das in die Teilchen hineinpolymerisiert worden war. Nachdem die T-Lymphocyten durch Wechselwirkung mit den Teilchen abgetrennt worden waren, wurden die Zellen wieder von den Teilchen durch enzymatische Digestion mit Collagenase befreit.
Beispiel 18
Radioimmunologische Bestimmung von Morphin
Ein handelsüblich erhältliches Kaninchen-antimorphinserum wurde in Polyacrylamidteilchen (T-C = 7,5 bis 5), deren mittlerer Durchmesser 1 bis 2 um betrug, hineinpolymerisiert. Vor ihrer Verwendung wurden die Teilchen sorgfältig mit 0,25M NaCl, 0,1 % (V/V) Tween 20 und O,l % (W/V) Gelatine in einem 0,05M Phosphatpuffer von pH 7,5 gewaschen. 1 ml des Antiserums reichte für 20 ml der gefüllten Teilchen aus. Die Mikroteilchen wurden zweimal stufenweise verdünnt und 0,5 ml jeder der Verdünnungen wurde in ein Ellemann-Rohr getan. 35 000 dpm tritium-markiertes Morphin wurde dann jeder Verdünnung zugesetzt. Die Verdünnung derjenigen Teilchen, die 50 % des zugesetzten Morphins banden, wurden für die weitere Analyse verwendet. Eine Standardprobe wurde durch Zugabe bekannter Mengen des nichtmarkierten Morphins zu 35 000 dpm Morphin (Volumen: 0,5 ml) hergestellt. Nach Zugabe von 0,5 ml der Teilchensuspension ließ man die Suspension k Stunden lang ohne Rühren bei Raumtemperatur stehen.
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Die Rohre wurden dann in einer üblichen Tischzentrifuge 5 Minuten lang bei 4 700 UpM zentrifugiert, 0,5 ml der überstehenden Flüssigkeit wurde abpipettiert,und nach Zugabe einer Scintillationsflüssigkeit zu dieser Menge wurde das Gemisch in einem Scintillationszähler ausgezählt. Eine Standardkurve wurde durch Logit-log-Auftragen erstellt, wodurch es möglich wurde, Mengen von Morphin von nur 5 bis 10 ug zu bestimmen.
Morphinmengen in Serumproben wurden herunter bis zu 5 bis 10 ng/ml des Serums bestimmt.
Beispiel 19
Der Versuch wurde auf ähnliche Weise wie in Beispiel 18 durchgeführt, außer daß Kaninchen-antidigoxin-antikörper in die Teilchen zur Bestimmung von Digoxin im Serum hinein-
125 polymerisiert wurden. Das Digoxin wurde mit J ^-Isotope markiert und Mengen bis herab zu 0,5 ng Dioxin wurden bestimmt.
Beispiel 20
Der Versuch wurde auf gleiche Weise wie in Beispiel 18 durchgeführt, außer daß Meerschweinchen-antiinsulin-Serum in die Teilchen hineinpolymerisiert wurde zur Bestimmung von Polypeptidhormoninsulin im Serum. Das Insulin wurde mit J -* markiert,und die Insulinmengen bis herunter zu 6,5 uU/ml des Serums wurden durch diese Methode gemessen. Diese Analyse verbrauchte jedoch eine etwas größere Menge an Antiserum als übliche Techniken, die auf der Verwendung einer Peststoffphase beruhen.
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Beispiel 21
Teilchen, die ein Protein von Bacterium S. aureus enthielten, wobei dieses Protein in der Lage ist, Immunglobulin 6 zu binden, wurden einem Überschuß an Kaninchen-antibovin-serumalbumin (BSA) zugesetzt, überschüssige Antikörper wurden in einem 0,05M Phosphatpuffer mit einem pH = 7,4 mit 0,15M NaCl und 0,1 % (V/V) Tween 20 weggewaschen. Die Teilchen wurden in diesem Puffer auf eine Konzentration von 5 % (V/V) verdünnt. 50 ul BSA-Lösungen, die stark auf 5 ng/ml verdünnt worden waren, wurden auf eine Silikonglasoberfläche getan. Man setzte 50 ul der Teilchensuspension jedem Tropfen zu und ließ es reagieren. Nach etwa 30 Minuten wurde eine deutliche Aggregation der Teilchen in den BSA-Lösungen beobachtet, während man eine solche Aggregation in der Blindprobe, die nur Phosphatpuffer enthielt, nicht beobachten konnte. Es wurden BSA-Mengen bis herunter zu 10 bis 15 ng/ml nachgewiesen.
Beispiel 22
Der Versuch wurde auf ähnliche Weise wie im Beispiel 21 durchgeführt, außer daß dinitropheny!-modifiziertes Bovinimmunglobulin G (7 Mol DNP/Mol Protein) in die sphärischen Teilchen hineinpolymerisiert worden war. Gegen die Dinitropheny !gruppe gerichtetes Antiserum wurde in starker Verdünnung. (10 000 bis 500 OOOfach) zugesetzt. Nach Zugabe dieses Antiserums zur Teilchensuspension (5 %, V/V) erfolgte eine
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- 2ο -
Agglutinierung gemäß Beispiel 21. Diese Agglutinierung wurde inhibiert, wenn Antiserum in der Lösung in Mengen bis herunter zu 2 ng/ml vorhanden war.
Beispiel 23
verwendet
Für den Versuch dieses Beispiels wurden Mikroteilchen, die aus Polyacrylamid bestanden und Humanserum entsprechend 15 % des Trockengewichts der Teilchen enthielten. 25 mg der Teilchen wurden jeweils in einer Reihe von Testrohren, die 1 ml O9OO5M Na-Phosphatpuffer, O,IM NaCl pH 7,4 und Salicylsäure in einem Molverhältnis zwischen Salicylsäure und dem Albumin von 0,1 bis 2,0 enthielten, suspendiert. Nach lOminütiger Inkubation wurden die Testrohre zentrifugiert und der Gehalt an Salicylsäure in der überstehenden Flüssigkeit bestimmt. Für jede zugesetzte Menge an Salicylsäure erhielt man Messungen für die Menge an Salicylsäure,die nicht an das Albumin in den Teilchen gebunden war. Die Werte wurden auf einem sogenannten Scatchardgraph aufgetragen, von dem ein Wert für die Associationskonstante ( = 0,3 χ ΙΟ3 Μ ) der Salicylsäure zu dem Albumin abgelesen werden konnte.
Beispiel 24
Der Verauch dieses Beispiels wurde auf ähnliche Weise wie im Beispiel 23 durchgeführt, außer das anstelle Salicylsäure Warfarin verwendet wurde. Die Associationskonstante betrug 0,2 χ 106 M"1.
Beispiel 25
Der Versuch dieses Beispiels wurde auf ähnliche Weise wie im Beispiel 23 durchgeführt, außer daß anstelle von Salicylsäure Tyroxin und anstelle von Humanserum Albumin Globulin
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verwendet wurde, das befähigt war, aus Humanblutplasma erhaltenes Tyroxin (TB G) zu binden.
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Claims (13)

Patentansprüche:
1. Immobilisierte biologisch aktive Substanz, enthaltend mikroporöse sphärische Teilchen in Gelform und in Form eines dreidimensionalen polymeren Netzwerks, wobei die Teilchen die biologisch aktive Substanz in den Maschen des Netzwerks eingeschlossen enthalten, dadurch gekennzeichnet, daß die Teilchen eine Größe von unter 10 iun und einen mittleren Durchmesser von 0,5 bis k um, vorzugsweise 1 um, aufweisen, wodurch die biologisch aktive Substanz ihre biologische Wirksamkeit gegenüber solchen Substanzen zu entfalten vermag, die das Netzwerk der Teilchen nicht zu durchdringen vermögen.
2. Immobilisierte biologisch aktive Substanz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Teilchen aus einem Copolymer von einer niedermolekularen Acrylverbindung oder l-Vinyl-2-pyrrolidinon mit einer niedermolekularen Divinylverbindung bestehen.
3. Immobilisierte biologisch aktive Substanz nach Anspruch oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Teilchen aus einem Copolymer aus einem Acrylamid der Formel
R1
CH2 = C - COR2
1
worin R ein Wasserstoffatom oder einen Methylrest und R OH oder -NHR bedeuten, worin R ein Wasserstoff atom oder
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eine gerad- oder verzweigtkettige Alkylgruppe mit 1 bis 6 C-Atomen bedeutet?, wobei die Alkylgruppe nicht substituiert oder mit einer Hydroxyl- oder einer Oxogruppe substituiert ist, mit Ν,Ν'-Methylen-bis-aerylamid bestehen.
4. Verwendung einer immobilisierten biologisch aktiven Substanz nach einem der Ansprüche 1 bis 3 als Reagens zur quantitativen Bestimmung einer Komponente in einem biospezifischen System, worin die biologisch aktive Substanz als eine seiner Komponenten enthalten ist, mit Hilfe von Agglutinierungs-, immunometrischen, immunologischen oder Zellrezeptor-Bestimmungsmethoden.
5. Verwendung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die immobilisierte biologisch aktive Substanz mit zur Aussendung einer Strahlung befähigten Atomen oder Gruppen, einem Enzym oder einer farberzeugenden Gruppe markiert ist.
6. Verwendung einer immobilisierten biologisch aktiven Substanz nach einem der Ansprüche 1 bis 3, zum Markieren von Zellen, Zellfragmenten, Viren oder Gewebestrukturen mit spezifischen Rezeptoren oder von Substanzen mit spezifischen Oberflächenstrukturen, wobei einer der Rezeptoren spezifisch gegen die biologisch aktive Substanz und die mit einem zur Aussendung einer Strahlung befähigten Atom oder einer Gruppe, einem Enzym oder einer farberzeugenden Gruppe markierte biologisch aktive Substanz gerichtet ist, bzw. eine der Oberflächenstrukturen spezifisch mit diesen Substanzen reagiert.
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7. Verwendung einer immobilisierten biologisch aktiven Substanz nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zum Abtrennen von Zellen, Zellfragmenten, Viren oder Gewebestrukturen mit spezifischen Rezeptoren oder von Substanzen mit spezifischen Oberflächenstrukturen von einem Substanzgemisch, das solche Zellen, Zellfragmente, Viren, GewebeStrukturen oder Substanzen enthält, durch spezifische Wechselwirkung der biologisch aktiven Substanzen mit den Zellen etc. unter Bildung eines Konjugats, das von den anderen Komponenten des Substanzgemische mit Hilfe von Methoden abgetrennt wird, die auf Unterschieden in der Dichte oder in der Adsorption der Teilchen an Glaswänden beruhen.
8. Verwendung nach Anspruch 7» dadurch gekennzeichnet, daß die biologisch aktive Substanz mit einem zur Aussendung einer Strahlung befähigten Atom oder einer Gruppe, mit einem Enzym oder mit einer farberzeugenden Gruppe markiert ist.
9. Agglutinierungs-, immunometrische, immunologische und Zellrezeptor-Bestimmungsmethoden für die quantitative Bestimmung einer Komponente in einem biospezifischen System, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Reagens, das eine in dem biospezifischen System enthaltene biologisch aktive Substanz gemäß einem der Ansprüche bis 3 enthält, verwendet.
10. Bestimmungsmethode nach Anspruch 9» dadurch gekennzeichnet, daß man eine biologisch aktive Substanz verwendet, die mit einem zur Aussendung einer Strahlung befähigten Atom oder einer Gruppe, mit einem Enzym oder einer farberzeugenden Gruppe markiert ist.
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11. Verfahren zum Markieren von Zellen, Zellfragmenten, Viren oder Gewebestrukturen mit spezifischen Rezeptoren oder von Substanzen mit spezifischen Oberflächenstrukturen durch biospezifische Wechselwirkung mit einem Reagens, das eine an einen festen Träger gebundene biologisch aktive Substanz enthält, gegen die einer der Rezeptoren spezifisch gerichtet ist bzw. mit der eine der Oberflächenstrukturen spezifisch reagiert und die mit einem zur Aussendung einer Strahlung befähigten Atom oder einer Gruppe, mit einem Enzym oder einer farbbildenden Gruppe markiert ist, dadurch gekennzeichnet, daß man als eine an einem festen Träger gebundene biologisch aktive Substanz eine Substanz nach einem der Ansprüche 1 bis verwendet.
12. Verfahren zum Abtrennen von Zellen, Zellfragmenten, Viren oder Gewebestrukturen mit spezifischen Rezeptoren oder Substanzen mit spezifischen Oberflächenstrukturen aus einem Substanzgemisch, das solche Zellen, Zellfragmente, Viren, Gewebestrukturen oder Substanzen enthält, durch spezifische Wechselwirkung mit einem Reagens, das eine an einen festen Träger gebundene biologisch aktive Substanz enthält, gegen die einer der Rezeptoren spezifisch gerichtet ist bzw. mit der eine der Oberflächenstrukturen spezifisch unter Bildung eines Konjugats reagiert, das von den anderen Komponenten des Substanzgemischs nach Methoden abgetrennt wird, die auf Unterschieden in der Dichte oder der Adsorption des Trägers an Glaswänden beruht, dadurch gekennzeichnet, daß man als eine an einen festen Träger gebundene biologisch aktive Substanz
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eine Substanz nach einem der Ansprüche 1 bis 3 verwendet.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man eine biologisch aktive Substanz verwendet» die mit einem zur Aussendung einer Strahlung befähigten Atom oder einer Gruppe, mit einem Enzym oder mit einer farberzeugenden Gruppe markiert ist.
Für: Ingvar Gösta Holger Sjöholm, Nils Roger Lindmark, Bo Magnus Ekman, Uppsala/Schweden
Dr.'H.J.Wolff Rechtsanwalt
60981 7/1143
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