DE2500076C3 - Verfahren zur Gewinnung von intravenös-verträglichen Gammaglobulinen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von iv-verträglichen Gammaglobulinen aus einem Gammaglobulin-Rohniederschlag von Blut, der mittels üblicher Fällmethoden wie durch Cryo-Äthanol-Fraktionierung gewonnen wurde, durch Unlöslichmachen des antikomplcmentären Gammaglobulin-Anteils in einer wäßrigen Lösung des Rohniederschlages durch Bindung desselben an ein wasserlösliches Polymer und anschließendes Ausfällen der unlöslichen Bestandteile.

Zu den im Plasma des Blutes gelösten Stoffen gehören u. a. die Gammzslobulr ·;, die für die Behandlung und Prophylaxe von Infektionen eingesetzt werden. Zur Isolierung der Garmaglobuline müssen möglichst alle anderen im Plasma vorhandenen Substanzen entfernt werden, damit es möglichst rein zur Verfügung steht.

Zur Fällung und Isolierung von Gammaglobulinen aus Blut bedient man sich insbesondere eines unter dem Namen »COHN-Methode« bekannten Verfahrens (C ο h η et al, J. Amer. Chem. Soc Vol. 68, pp. 459 ... 475; Vol. 72, pp. 465 ... 474). Dieses Verfahren geht a^ von einem aus verschiedenen Blutproben gemischten Plasma. Es ist im Prinzip eine fraktionierte Fällung unter verschiedenen Konditionen. Bei der ersten Stufe wird bei -3°C und einem pH-Wert von 7,2 bei einer Äthanolzugabe von 8% zunächst als erstes Sediment vornehmlich Fibrinogen abgeschieden. Die überstehende Flüssigkeit wird in einer zweiten Stufe mit etwa IWo Äthanol bei pH 5,6 gefällt. Der Niederschlag eniii t vorwiegend Gammaglobulin. Zur Reinigung dieses, als COHN-Fraktion II-III bezeichneten Niederschlages wird dieser wieder aufgelöst und zunächst bei pH 5 und 8% Äthanol erneut gefällt Der verbleibende Überstand wird dann mit 25% Äthanol bei pH 7,2 erneut gefällt. Der dabei entstehende Rohniederschlag besteht aus mindestens 90% Gammaglobulinen. Der Niederschlag wird in einer geeigneten Pufferlösung aufgenommen und steht nach Slerilfiltration für die Anwendung am Menschen bereit.

Es hat sich gezeigt, daß Jn zahlreichen Fäüen Gammaglobulin-Präparate, die auf die vorbeschriebene oder andere Weise gewonnen wurden, antikomplementär wirksam sind, so daß bei intravenöser Verabreichung durch körpereigene Reaktionen Komplikationen entstehen*

Es ist daher bereits versucht worden, die Intravenös^ verträglichkeit von Gammaglobulinen durch weitere Reinigung des Rohniederschlages zu erhöhen. Es sind verschiedene Verfahren bekannt, die antikomplementäre Wirksamkeit (ACA) wirksam auszuschließen, sei es durch physikalische, sei es durch chemische Methoden. Als Beispiele seien aus der Literatur genannt:

1. Behandlung mit geeigneten Enzymen, z. B. Plasmin;

2. Hydrolyse bei hoher Wasserstoffionenkonzentration (z. B. bei pH 4,0);

ίο 3. Modifizierung mit p-Propiolacton.

Weitere Verfahren finden sich abgehandelt in der Beschreibungseinleitung zur GB-PS 13 72 953. In dieser Patentschrift wird im Gegensatz zu dem bisher angeführten Stand der Technik ein Verfahren zur

is Gewinnung von iv-verträglichen Gammaglobulinen beschrieben, bei dem aus dem Gammaglobulin-Rohniederschlag die ACA entfernt wird, indem es durch ein wasserlösliches Salz bzw. ein wasserlösliches lineares, fadenförmiges, ungeladenes Polymer zu eine.n unlöslichen Komplex gebunden und ausgefällt wird. Als Polymer wird insbesondere Polyäthylenglykol mit einem Molekulargewicht von 5000 in einer Menge von 44 · · ■ 7 g/100 ml Lösung verwendet, die mindestens 3 g Gammaglobulin/100 ml Lösung enthalten muß.

Anstelle des PEG werden als Fällungsmittel auch wasserlösliche lineare ungeladene Fadenpolymere in äquivalenten Mengen vorgeschlagen, wobei Dextran, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, Nonylphenyläthoxilat und Polyalcylenglykol genannt, jedoch keine Beispiele angegeben werden.

Es zeigt sich jedoch, daß trotz der fraktionierten Fällung mit PEG immer noch ACA im gereinigten Gammaglobulin vorhanden ist Es wird daher vorgeschlagen, einen weiteren Aussalzschritt zur ACA-Entfernung anzuschließen. Die Notwendigkeit des weiteren Aussalzschrittes ergibt sich aus der mangelnden Selektivität des PEG, wobei bei der ACA-Fällung auch natives Gammaglobulin mitfällt bzw. bei der anschließenden Fällung des nativen Gammaglobulins noch

ίο mitgefälltes ACA-Material vorhav,sten ist. Aus diesem Grunde ist der Anteil nativer Moleküle im gewonnenen Produkt nicht 100%.

Demgegenüber stellt sich die Aufgabe, aus dem Gammaglobulin-Rohniederschlag mit hoher Ausbeute Gammaglobuline zu gewinnen, deren Anteil an nativen Gammaglobulin-Molekülen praktisch 100% ist, so daß die antikomplementäre Wirksamkeit völlig unterdrückt ist und das Globulin zur intravenösen Anwendung bedenkenlos geeipnet ist Auch soll die Lagerfähigkeit des neuen Produktes wesentlich gegenüber solchen Produkten erhöht sein, die einen geringeren Anteil an nativen Gammaglobulinen enthalten.

Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren gemäß Erfindung, bei dem der Gammaglobulin-Rohniederschlag in einer wäßrigen Lösung aufgenommen wird, in der ah wasserlösliches Polymer Hydroxyäthylstärke mit einem Molekulargewicht von 1000 — 900 000 in einer Konzentration von 1—30 Gew.-% in der Lösung vorliegt, die einen pH-Bereich von 3,5—8.0 aufweist. Aus dieser Lösung wird der antikomplementäre Anteil ausgefällt.

Die Hydroxyäthylstärke dient zur Trennung von denaturierter) Molekülen von solchen, die gewonnen werden. Sie bewirkt einen Schutz der nichtaggregierteh

Gammaglobulin-Moleküle vor Ausfällung, Durch Zuga* be der Hydroxyäthylstärke ist die nachfolgende, an sich bekannte Fällung des nativen Gammaglobulin in der genauen Selektierung Wesentlich verbessert.

Die Lösung des Gammaglobulin-Rohniederschlages in der gepufferten Hydroxyäthylstärke-Lösung enthält demnach ausfällbare und nicht ausfällbare Bestandteile. Sie wird in einem nachfolgenden fraktionierten Fällungsverfahren, beispielsweise mit Polyäthylenglykol, von den ausfällbaren (antikomplementären) Bestandteilen befreit Hierzu wird vorzugsweise der Hydroxyäthylstärke-Lösung mit dem rohen Niederschlag in einem ersten Schritt 10% Polyäthylenglykol zugegeben. Dabei werden die antikomplementären Bestandteile zusammen mit HES ausgefällt und anschließend zentrifugiert. Der verbleibende Überstand wird bsi pH 7,0—7,2 mit 20% Polyäthylenglykol versetzt und erneut zentrifugiert Der jetzt gewonnene Niederschlag enthält praktisch völlig reines Gammagiobulin. Es wird zweckmäßigerweise in einer physiologischen Kochsalzlösung gelös-i und auf eine Konzentration von 5% Eiweiß gebracht Nach Sterilfiltration steht die Lösung zur therapeutischen, insbesondere intravenösen, Anwendung zur Verfügung.

Vorzugsweise wird der Gammaglobulin-Rohniederschlae in einer gepufferten Hydroxyäthylstärke-Lösung aufgenommen, die einen pH-Wert von 6,5—6,9 .'ufweiot

Die einzelnen Verfahrensschritte werden anhand eines Beispiels erläutert

1. Herstellung des Gammaglobulin-Rohniederschlages

Es wird ausgegangen von einem gesammelten Humanblut-Piasma. Dieses wird zur Auslösung einer Fällungsreaktion mit 8 Gew.-% Äthanol bei einem pH-Wert von 7,2 bei —3°C versetzt Aus dem Plasma wird die sog. Fraktion I nach COHN ausgeschieden. Die aufstehende Flüssigkeit wird anschließend bei -5° C und einem pH-Wert von 5,8 mit 19% Äthanol versetzt. Es scheidet sich die sog. Fraktion H-III aus, die aus Gamma-Globulinen besteht. Der Niederschlag wird wieder aufgelöst und bei pH 5 und 8% Äthanol erneut gefällt Der verbleibende Überstand wird dann mit 25% Äthanol bei pH 7,2 erneut gefällt Der hierbei entstehende ".ohniederschlag (= Fraktion II) besteht aus mindestens 90% Gammaglobulin.

2. Herabsetzung der antikomplementät en
Wirksamkeit

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Um den Gammaglobulin-Rohniederschlag weiter zu reinigen, wird dieser in einer gepufferten, wäßrigen Lösung mit einem pH-Wert von 6,7 in einer Konzentration von 6% erneut gelöst. In dieser wäßrigen Lösung sind weiterhin etwa 10 Gew.-% Hydroxyäthylstärke gelüM. Die Hydroxyäthylstärke führt selbst nicht zu einer Fällungsreaktion, sondern ermöglicht die Trennung tier erwünschten und nicht erwünschten Gammaglobulin-Anteile.

Die eigentliche Fällung erfolgt in an sich bekannter Weise. Der Lösung des Rohniederschlages werden 10 Gew.-% Polyäthylenglykol zugeführt. Es scheiden sich die antikomplementären Bestandteile des Gammaglobulins durch Bildung unlöslicher Komplexe aus. Das Gemisch wird zentrifugiert Der verbleibende Überstand, der das reine Gammaglobulin enthält, wird nochmals bei pH 7,2 mit 20 Gew»-% Polyäthylenglykol Versetzt Es scheidet sich ein Niederschlag des reinen Gammaglobulins ab. Dieser wird zentrifugiert und erneut in einer physiologischen Kochsalzlösung aufgenommen und auf eine Konzentration von 5,2% Eiweiß gebracht und anschließend sterilfiltriert Hiernach steh* er zur therapeutischen Anwendung bereit Das Präparat enthält hochreines Gammaglobulin, das zur intravenösen Anwendung geeignet ist

Das vorstehende Beispiel kann dadurch variiert werden, daß der pH-Bereich der gepufferten HES-Lösung zwischen 3,5 und 8,0, vorzugsweise zwischen 6,5 und 63 liegt

Der Gehalt an Hydroxyäthylstärke beträgt vorzugsweise 8—10 Gew.-%, wobei sich ein Optimum der Wirksamkeit dann ergibt wenn der Anteil des Gammaglobulins-Rohniederschlages in der Lösung 6 Gew.-% bei einem Gehalt von etwa 10% Hydroxyäthylstärke beträgt

Die Zeichnung zeigt verschiedene Immun-Elektrophorese-Diagramme (IEP) verschiedener Gammaglobuline bzw. Normalseren, die nach bekannten bzw. dem neuen Verfahren hergestellt sind. Die obere Hälfte des Diagramms zeigt dabei jeweils IEl- Diagramme von Normal-Blutseren (Ausgangsmaterial;, während die unteren Hälften Diagramme folgender Substanzen zeigen:

a) Standard-Gammaglobulin;

b) pro.oolytisch modifiziertes Gammaglobulin;

c) Betapropiolaction modifiziertes Gammaglobulin;

d) Gammaglobulir, nach dem neuen Verfahren hergestellt

Bei den Proben gemäß Diagramm a) dis c) handelt es sich jeweils um ein im Handel befindliches modifiziertes Präparat Ein Präparat, das gemäß GB-PS 13 72 953 gewonnen wird, ist in Deutschland im Handel nicht erhältlich. Diese Proben zeigen außer der Gammaglobulin-Linie (längliche, sichelförmige Linie im rechten Bereich des Diagramms) noch weitere Eiweißbestandteile des menschlichen Blutes. Die Gammaglobulin-Linien sind bei den Proben a) und b) infolge der chemischen Modifizierung unscharf dargestellt. Die Probe c) zeigt eine gegenüber der Gammaglobulin- Linie des Vergleichsserums veränderte Position.

Demgegenüber zeigt sich deutlich, daß die Probe d) praktisch ausschließlich aus reinem Gammaglobulin besteht da die sichelförmige Linie des Spektrums deutlich im Normalserum enthalten ist.

Aus den Diagrammen ist abzulesen, daß das nach dem neuen Verfahren gewonnene Gammaglobulin praktisch zu 100% rein ist und dem Gammaglobulin des ursprünglichen Blutserums vollständig entspricht. Letzteres bedeutet, daß die Moleküle nicht modifiziert oder chemisch verändert sind. Aus diesen Eigenschaften resultieren auch die in Versuchen überprüften weiteren vorteilhaften Eigenschaften des Gammagiobulins gemäß dem neuen Verfahren, nämlich seine absolut sichere Intravenösverträglichkeit und seine stark verringerte antikomplementäre Wirksamkeit gegenüber den körpereigenen Abwehrstoffen, die bei in-vitro und Klinik-Tests nachgewiesen werden konnten. Als weiterer Vorteil fi.°' sich erwiesen, daß bei Lagerungsversuchen eine besonders große Stabilität der erfindungsgemäß hergestellten Gämmäglöbuline festgestellt werden konnte.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur Gewinnung von iv-verträglichen Gammaglobulinen aus einem Gammaglobulin-Rohniederschlag von Blut, der mittels üblicher Fällmethoden, wie durch Cryo-Äthanol-Fraktionierung gewonnen wurde, durch Unlöslichmachen des antikomplementären Gamrnaglobulin-Anteils in einer wäßrigen Lösung des Rohniederschlages durch Bindung desselben an ein wasserlösliches Polymer und anschließendes Ausfällen der unlöslichen Bestandteile, dadurch gekennzeichnet, daß als wasserlösliches Polymer Hydroxyäthylstärke verwendet wird, welche in einem Molekulargewicht von 1000—900 000 und in einer Konzentration von 1—30 Gew.-°/o in der Lösung vorliegt, die einen pH-Bereich von 3,5—8,0 aufweist