DE2438350C3

DE2438350C3 - Peptide mit starker LH-RH/FSH-RH-Wirkung, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese enthaltende pharmazeutische Zubereitungen

Info

Publication number: DE2438350C3
Application number: DE2438350A
Authority: DE
Inventors: Rolf Dr. Geiger; Wolfgang Dr. 6239 Langenhain Koenig; Juergen Dr. Sandow
Original assignee: Hoechst AG
Current assignee: Hoechst AG
Priority date: 1974-08-09
Filing date: 1974-08-09
Publication date: 1979-06-13
Also published as: DE2438350A1; NL182051C; JPS5148659A; AT364093B; AU8374475A; ATA618975A; IL47880A0; LU73166A1; BE832310A; FR2281132A1; DK361875A; DE2438350B2; SE7508926L; SE424184B; IL47880A; DK148905B; NL182051B; CA1069888A; IE41510L; FR2281132B1

Description

wobei man andere funktionell Gruppen durch abhydrierbare oder im alkalischen oder schwach sauren Medium abspaltbare Schutzgruppen gegebenenfalls intermediär blockiert

3. Pharmazeutische Zubereitungen zur peroralen, intranasalen, intramuskulären, subcutanen oder intravenösen Verabreichung, enthaltend Verbindungen gemäß Anspruch 1.

4. Pharmazeutische Zubereitungen zur peroralen Verabreichung, enthaltend Verbindungen gemäß Anspruch 1.

Das l.uteotrope Hormon (LH) und follikelstimulierende Hormon (FSH) ausschüttende Releasinghormon LH-RH/FSH-RH der Struktur

Pyroglu-His-Irp-Ser-Tyr-Gly- Leu-Arg- Pro-GIy-N H₂

2 .1 4 5

10

(Bio;hem. Biophys. Res. Commun, 43. 1334-39 [1971]) wurde bereits in vielen Positionen modifiziert. Dabei fand man, daß durch Ersatz von GIy in der Position 6 durch D-Alanin (Biochemistry, 12,4616—20[1973]) oder durch Ersatz von GIy-NH2 in der Position 10 durch Äthylamino, Propylamino oder Isopropylamino (J. Med. Chenu 16, 1144—47 [1973]) die Aktivität gesteigert wird. Werden die beiden Modifikationen kombiniert, so erhält man Analoga mit noch stärkerer Wirkung (Biochem, Biophys. Res. Commun., 57, 335-40 [1974]). Der erfolgreiche Austausch von GIy durch D-Aminosäuren wurde erstmals am Insulin gezeigt (Scientia SinicaXVI,71-78[1973]).

Der Ersatz von Glycin in der Position 6 durch stärker lipophile D-Aminosäuren, wie z. B. D-Valon, D-Leucin oder D-Prolin führte zu Analogen mit geringerer LH-RH-Wirkung (Abstracts of The Endocrine Society 55th Annual Meeting, 1973, Seite A 145). Es war deshalb sehr überraschend, daß der Austausch von Glycin durch stark lipophile unnatürliche D-Aminosäuren, die eine tert.-Butylgruppe enthalten, noch stärker wirksame Analoga als die bereits bekannten in 6-Slellung ausgetauschten Analoga ergab.

Gegenstand der Erfindung sind Peptide der allgemeinen Formel

Pyroglu-His-Trp-Ser-Tyr-X-Leu-Arg-Pro-NH-R

3 4 5 6 7

10

worin X D-Ser(Bu'), D-Cys(Bu'), D-Asp(OBu'), D-GIu(OBu¹), D-Orn(Boc) oder D-Lys(Boc) und R Carbamoylmethyl, Äthyl- oder Cyclopropyl bedeuten.
r> Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung dieser Peptide, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man

a) durch in der Peptidchemie übliche Fragmentkondensation nach dem Kondensationsschema

"' ι -3 + 4-9(10)oder I -2 + 3-9(10)oder

b) durch stufenweisen Aufbau herstellt,

wobei man andere funktioneile Gruppen durch abhydrierbare oder im alkalischen oder schwach saurem

ι-· Medium abspaltbare Schutzgruppen ggf. intermediär blockiert.

Von großer Bedeutung sind die erfindungsgemäßen Verbindungen, bei den für X D-Ser(Bu'), D-CyS(Bu¹), D-GIu(OBu¹) oder D-Asp(OBu·) steht. Diese Verbindun-

i(i gen sind oral wirksam; oral wirksam*. Peptide dieser Kettenlänge waren bisher nicht bekannt. Das ist besonders überraschend, da die tert.-Butyläther und terl.-Butylester in saurem Medium instabil sind.

Als Verbindungen mit dem erfindungsgemäßen

i> Austausch in Position 6 kommen z. B. folgende LH-RH-Analoga in Betracht:

I 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Pyroglu-His-Trp-Scr-Tyr-X-Lcu-Arg-PrO-GIy-NH₂

— NH-CjH₅

CH₂

-NH-CH

CH₁

Von den vorstehend genannten Verbindungen sind diejenigen von besonderer Bedeutung, in denen X D-Ser(Bu'), D-GIu(OBu') und D-Asp(OBu') bedeutet

Bei der Synthese der erfindungsgemäöen Verbindungen dürfen nur Methoden verwendet werden, unter denen die sauer leicht abspaltbaren terL-Butylreste in Position 6 nicht abgespalten werden.

Bei der Fragmentkupplung nach a) verwendet man vorzugsweise die ohne Racemisierung verlaufende Azjdkupplung oder die DCC/l-HydroxybenzotriazoI- bzw. DCCAS-Hydroxy^-oxoOA-dihydro-l^-benzotriazin-Methode. Man kann auch aktivierte Ester von Fragmenten einsetzen.

Für die stufenweise Kondensation von Aminosäuren nach b) eignen sich besonders gut aktivierte Ester von Benzyloxycarbonylaminosäuren, wie z. B. N-Hydroxysuccinimidester oder 2.4.5-TrichlorphenyIester und 4-Nitrophenylester. Die Aminoiyse der beiden letzteren Aktivester läßt sich sehr gut durch N-Hydroxyverbindungen, die in etwa Aie Acidität der Essigsäure besitzen, wie z. B. 1 -Hydroxybenzotriazol katalysieren.

Als intermediäre Aminoschutzgruppen bieten sich abhydrierbare Gruppen wie z. B. der Benzyloxycarbonylrest ( = Z-Rest) oder schwach sauer abspaltbare Gruppen wie z. B. der 2-(p-Diphenyl)-isopropyloxycar- r> bonyl- oder 2-(3.5-Dimethoxypheny!)-isopropyIoxycarbonylrest an. Bei Derivaten, die Cys(Bu ) enthalten, wird der Z-Rest unter Zusatz von Triäthylamin oder N-Äthylmorpholin abhydriert.

Die Guanidofunktion des Arginins kann ungeschützt so bleiben oder durch eine Nitrogruppe blockiert werden, welche bei der nächstfolgenden Hydrierung abgespalten wird. Sie kann aber auch durch Aier abspaltbare Schutzgruppen, wie dem Carbcbenzoxyrest oder dem Tosylrest blockiert werden, wobei du Schutzgruppe r> jedoch spätestens auf der Tetrapeptidstufe abgespalten werden müssen. Im Falle der Nitro- oder Tosylgruppe ist dies gut mit flüssigem HF/Anisol zu bewerkstelligen. Das Gleiche gilt für einen intermediären Schutz der Amidgruppe durch den sauer abspaltbaren 4.4'-Dimeth- 4» oxybenzhydrylrest, der auch spätestens auf der Tetrapeptidstufe entweder mit Trifluoressigsäure/Anisol oder zusammen mit einer Guanidoschutzgruppe und/oder einer sauer abspaltbaren Aminogruppe mit HF/Anisol abgespalten wird.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen zeigen gegenüber den 6-GIy-, aber auch gegenüber den 6-D-Ala-Analogen im Ovulationstest und im Ascorbinsäuredepletionstest eine stärkere und längere Wirkung. Die überraschende orale Wirkung (Dosis 0,01 —0,2 mg/kg) der Verbindungen (X = D-Ser(But), D-Cys(Bu'), D-GIu(OBu¹), D-Asp(OBu')) eröffnen diesen Arzneinitteln einen weiteren Anwendungsbereich als den bis jetzt nur parenteral oder nasal applizierbaren LH-RH. Sie Stellen neuartige Arzneimittel dar, die bei Hypothalamus- und Hypophysen-Insuffizienz die Ausschüttung des luteinisierenden und <ies folükelstimulierenden Hormons aus dem Hypophysenvorderlappen bewirken und werden deshalb zur Behandlung von weiblicher und männlicher Sterilität verwendet, soweit diese hypothalamisch-hypophysären Ursprungs ist.

Gegenstand der Erfindung sind daher auch die pharmazeutischen Zubereitungen gemäß den Ansprüchen 3 und 4.

Eine weitere Anwendung der erfindungsgemäßen Substanzen ist die Festlegung des Ovulationszeitpunktes bei der Frau. Kurz vor dem erwarteten Ovulationszeitpunkt kann durch Applikation der neuen Arzneimittel eine Ovulation sicher ausgelöst werden. Das ist von Bedeutung für die Familienplanung sowohl nach der Methode Knaus-Ogino als auch für die künstliche Insemination.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind gelöst in physiologischer Kochsalzlösung intravenös, intramuskulär oder subcutan applizierbar, können intranasal in Form von Nasentropfen oder Nasenspray und auch oral angewendet werden.

Die bei verschiedenen Anwendungsarten bevorzugt angewandten Dosierungen sind:

intravenös 20— 1 000 ng/kg

subcutan 20- 2 000 ng/kg

intramuskulär 20— lOOOOrig/kg
intranasal 100— 50 000 ng/kg

peroral 10 000-200 000 ng/kg

Verfahrensvariante

a)

4

/

BzI

5

>

i

7

-OTcp

8

9

10

Reaktionsschema 1

Ser

BzI

Tyr

Leu

Arg

Pro

NH-R

1 2

/

Z-

H-

Pyroglu His

3

Z-

-OTcp

Trp

H-

L"

H-

OH

-N,

R = C₂H₅ (Beispiel I ürid 2)
R = Cyclopropyl (Beispiel 4)

RcaktioriHSchemH 2
Pyrogiu His Trp

Ser

Tyr

	Z-	NO₂
	-OTcp H-	NO,












Z-

-NH-MbJi

-NH-Mbh

NH₃

NH₂ -NH₂ -NH₂ -NH₂ -NH₂

Abkürzungen:	Benzyl
BzI	terL-Butyioxycarbonyi
Boc	tert-Butyl
Bu'	Dicyclohexylcarbodiimid
DCC	j Pyroglutaminsäure
Pyrogh	1 -Hydroxybenzotriazol
HOBt	4.4'-Dimethoxybenzhydry!
Mbh	terL-Butylester
OBu¹	p-Nitrobenzylester
ONb	N-Hydroxysuccinimidester
ONSu	2.4.5-Trichlorphenylester
OTcp	S-Hydroxy^-oxo-S^-dihydro-
0OBt	12 J-benzotriazinester
	Benzyloxycarbonyl
Z	Beispiel 1
	(analog Reaktionsschema 1)

2(1

25

if)

Pyroglu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(Bu')-

Leu-Arg-Pro-NH-C₂H₅ 4n

a)Z-Arg(Z₂)-Pro-NH-C₂H₅

Zu einer Lösung von 8,9 g (5OmMoI) H-Pro-NH-C₂H₅ · HCI, 28,9 g (50 mMol) Z-Arg(Z₂)-OH und 6,75 g (5OmMoI) HOBt in 150 ml Methylenchlorid gibt man 4-, bei 0⁰C 6,5 ml N-Äthylmorpholin und 11 g DCC, läßt 1 Stunde bei O⁰C rühren und läßt über Nacht bei Raumtemperatur stehen. Der Niederschlag wird abgesaugt und das Filtrat eingeengt. Der Rückstand wird zwischen Essigester und Wasser verteilt. Die Essigesterphase wird nacheindnder mit gesättigter NaHCO₃-Losung, 2 η H₂SO₄, gesättigter NaHCO₃-Lösung und mit Wasser ausgeschüttelt, über Na₂SO₄ getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wird in Isopropanol gelöst. Mit Petroläther wird daraus ein Öl gefällt, das über v, Nacht kristallisiert. Ausbeute 27,8 g (80%), Schmp. 82-85°C[(X]¹O¹= -30,0° (c= I.Methanol).

b) H-Arg-Pro-NH-CjH, · 2 HCI

39,7 g (56,7 mMol) Z-Arg(Z₂)-Pro-NH-C₂H₅ werden in 200 ml Methanol gelöst. Dazu gibt man eine Spatelspitze Pd/BaSO4-Katalysator und hydriert indem man unter Rühren Wasserstoff durch die Lösung leitet. Der pH der LösiUng wird mit Hilfe eines Autotitrators durch Zugabe von 1 η methanolischer Salzsäure auf 4,5 gehalten. Dsr Katalysator wird nach beendigter Hydrierung abgesaugt und das Filtrat eingeengt. Der Rückstand wird niU Äther verrieben und abgesaugt. Ausb. 17,9 g amorphe Substanz (85%), [α]? = -26,0° (c= 1. Methanol).

c)Z-Ser-Tyr(Bz^l)OH

Zu einer Suspension von 5.52 g (20 mMol) H-Tyr(Bzl)-OH in 60 ml Dimethylacetamid gibt man 7,68 g Z-Ser-OOBt und rührt sechs Stunden bei Rr-.imtemperatur. Von Ungelöstem wird abgesaugt und das auf 0^cC abgekühlte F'iltrat mit 300 ml Wasser versetzt. Der Niederschlag wird abgesaugt, mit Dimethylacetamid/Wasser-Mischung (i _: io) und Wasser gewaschen und mit 1 η H₂SO₄ verrührt. Nun wird wieder abgesaugt und mit Wasser gewaschen und getrocknet. Aus Essigester/Petroläther wird umkristallisiert. Ausbeute 735 g (75%), Schmp. 166^CC. [λ]
= + 20,9° (c = 1, Methanol).

d) Z-D-Ser(Bu')-l.eu-Arg-Pro-NH-C₂H₅

Zu einer Lösung von 11,2 g (3OmMoI) H-Arg-Pro-NH-C₂H₅ · 2 HCl in 50 ml Dimethylformamid gibt man bei 0° 7,8 ml N-Äthylmorpholin und 8,25 g Z Leu-ONSu. Man läßt über Nacht bei Raumtemperatur stehen, engt ein und verreibt den Rückstand je einmal mit Essigester und Äther. Man dekantiert die Lösungsmittel ab und trocknet das öl im Hochvakuum. Der Rückstand (20.0 g) wird in Methanol gelöst und analog Beispiel Ib katalytisch hydriert. Der Rückstand wird mit Äther verrieben und am Hochvakuum getrocknet. Es entstehen 16.1 g amorphes H-Leu-Arg-Pro-NHC₂H₅ ■ 2 HCl. das durch Salze verunreinigt ist (14.5 g = 100% bezogen auf H-Arg-Pro-NH-^H-, · 2 HCl). 2.45 g dieser Substanz werden zusammen mit 675 mg HOBt. U ml N-Äthylmorpholin und 2.4 g Z-D-Ser(Bu')-OTcp in 20 ml Dimethylformamid gelöst. Man läßt über Nacht bei Raumtemperatur stehen, engt anderntags ein. "CTeibt den Rückstand 2mal mit gesättigter NaHCOj-Lösung. löst in Methylenchlorid, trocknet über Na₂SO₄. engt ein und verreibt den Rückstand mit Äther. Ausbeute 2.3g (71% bezogen auf HArg-Pro-NH-C₂H₅ ■ 2HCI),Schmp.85-116°C.

p) H-Ser-Tyr-D-Ser(Bu')-Leu-Arg-Pro-NH-C₂H₅ · 2 HCl

2,3 g (3,33 mMol) Z-D-Ser(Bu')-Leu-Arg-Pro-NH-C₂H₅ werden in Methanol gelöst und analog Beispiel Ib katalytisch hydriert. Der Rückstand wird mit Äther verrieben und am Hochvakuum getrocknet. Ausb. 1,93 g amorphes Material (93%).

Obige 1,95 g (3,1 mMol) H-D-SeI-(Bu')-Leu-Arg-Pro NH-C₂H₅-2HCI werden zusammen mit 1,53 g

(3,1 mMol) Z-Ser-Tyr(Bzl)-OH,420 rng HOBl und 0,8 ml N-Äthylmorpholin in 7 ml Dimethylformamid suspendiert. Bei O⁰C gibt man 680 mg DCC zu und läßt 1 Stunde bei 0⁰C rühren und über Nacht bei Raumtemperatur stehen. Der Niederschlag wird anderntags abgesaugt und das Filtral eingeengt. Der Rückstand wird zweimal mit gesättigter NaHCOj-Lösung verrieben, in Methylenchlorid gelöst und die Lösung über Na₂SO₄ getrocknet und eingeengl. Der Rückstand wird mit Äther verrieben und abgesaugt. Es resultieren 2,65 g ( = 2.57 mMol) Z-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(Bu')-Leu-Arg-Pro-NH-C₂Hs) einer amorphen Substanz, die analog Beispiel Ib katalytisch hydriert wird. Der Rückstand wird mit Äther verrieben und am Hochvakuum getrocknet.

Ausbeute 2,2 g amorphes H-Ser-Tyr-D-Ser(Bu')-Leu-Arg-Pro-NH-C₂H₅ ■ 2 HCI ( = 2,5 mMol = 75% bezogen auf Z-D-Ser(Bu')-Leu-Arg-Pro-N H-C₂H₅).

Für eine analytische Probe werden 1,3 g auf unten beschriebener Verteilungschromatographie-Säule gereinigt.

Aufbau der Säule: 400 ml Eisessig, 800 ml n-Butanol und 4 Liter Wasser werden geschüttelt. 300 ml der oberen Phase werden mit 240 g eines; hydroxypropylierten vernetzten Dextrangels verrührt. Dabei wird das gesamte Lösungsmittel aufgesaugt. Diese so vorbehandelte Säulenfüllung wird in einer entsprechenden Menge der unteren Phase suspendiert. Man läßt 3 Stunden quellen und füllt die Säule (1 m χ 4 cm). Mit der unteren Phase wird eluiert.

Ausbeute an chromatographisch reiner Substanz: 562 mg

[«]»= -43,9° (c=l.in Methanol).

f)Pyroglu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(Bu')-Leu-Arg-Pro-NH-C₂H₅-diacetat

2.U einer Lösung von 500 mg Pyroglu-His-Trp-NH-NH₂ in 6 ml Dimethylformamid gibt man bei -30⁰C 0,66 ml einer 6,05 η HCI/Dioxan-Lösung und 1,2 ml einer lOproz. tert.-Butylnitrit-Lösung in absolutem Dioxan. Man läßt 20 Minuten bei -10⁰C rühren und gibt bei -40⁰C 877,8 mg rohes H-Ser-Tyr-D-Ser(Bu')-Leu-Arg-Pro-NH-C₂H₅ · 2 HCI und 0.78 ml N-Äthylmorpholin zu. Man läßt über Nacht im Kühlraum bei 4°C stehen, engt ein und verreibt den Rückstand mit Äther. Die Substanz wird in Wasser gelöst und über einen stark basischen Polystyrol-Anionenaustauscher (Acetat-Form) chromatographiert Das Eluat wird eingeengt und über eine Carboxymethylcellulosesäule (90 χ 1.5 cm). die mit 0,002 m NH₄-acetat-Lösung äquilibriert ist, gereinigt. Die Substanz wird gelöst in 0,002 m >>IH4-acetat-LÖ!;ung aufgegeben. Eluieri wird mit einer 0,002 m NH₄-acetat-Lösung, der ein Gradient einer 0,1 m NH₄-acetat-Lösung angelegt wird (Mischvolumen 250 ml).

Die Fraktionen, die das gewünschte Peptid enthielten, wurden zweimal gefriergetrocknet Ausb. 401 mg chromatographisch reine Substanz. Der Gehalt an Peptidbase ist laut UV-Spektrum 76% (Ausb. 25%). [α];' = —40,4" (c= i, in Dimethylacetamid).

Beispiel 2
(analog Reaktionsschema 1)

Pyroglu-His-Trp-Ser-Tyr-D-GIu(OBu')-Leu-Arg-Pro-NH-C₂H₅

a)Z-D-Giu(OBuⁱ)-Leu-Arg-Pro-NH-C₂H5

2,45 g durch Salze verunreinigtes H-Leu-Arg-Pro-NH-C₂H₅ · 2 HCI werden analog Beispiel Id mit 2,6 g Z-D-Glu(OBu')-OTcp, 675 mg HOBt und 1,3 ml N-Äthylmorpholin in 20 ml Dimethylformamid umgesetzt Ausbeute 2,75 g (81% bezogen auf H-Arg-Pro-NH-C₂H₅ · 2 HCl),Schmp.83-100⁰C.

b) H-Ser-Tyr-D-Glu(OBu')-Leu-

Arg-Pro-NH-C₂H₅ · 2 HCI

1,85 g (2,53 mMol) Z-D-GlutOBuO-Leu-Arg-Pro-NH-C₂H₅ werden analog Beispiel Ib in Methanol katalytisch

ίο hydriert. Der Rückstand wird mit Äther verrieben und abgesaugt Ausbeute 1,7 g(99,5%).

Obige 1,7 g (2,5 mMol) H-D-Glu(OBu')-Leu-Arg-Pro-NH-C₂H₅ · 2 HCI werden analog Beispiel Ie mit 1,23 g Z-Ser-Tyr(Bzl)-OH, 340 mg HOBl. 0,65 ml N-Äthylmor-

phoÜn und 550 mg DCC in 5 ml Dimethylformamid umgesetzt. Ausbeute 2,8 g leicht verunreinigtes Z-Ser-Tyr(BzI)-p-Glu(OBu')-Leu-Arg-Pro-NH-C₂H₅, das analog Beispiel Ib in Methanol katalylisch hydriert wird. Die Rohsubstanz wird analog Beispiel 2e verteilungschromatographisch gereinigt Ausbeute 1,108 g chromatographisch einheitliches Produkt (47% bezogen auf Z-D-Glu(OBu')-Leu-Arg-Pro-NH-C₂H₅). [α]? =

-42,3° (c= 1, in Methanol).

c) Pyroglu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Glu(OBu')-Leu-Arg-Pro-NH-C₂H₅-diacetat

Analog Beispiel If werden 500 mg Pyroglu-His Trp-NH-NH₂ mtf 920 mg (1 mMol) H-Ser-Tyr-D-Glu(oBu')-Leu-Arg-Pro-NH-C₂H₅ ■ 2 HCl umgesetzt und chroma-JO tographisch gereinigt. Ausbeute 491,5 mg chromatographisch reines Material. Der Gehalt an PepnHbase ist laut UV-Spektrum 79% (Ausbeute 30%).
[«]" 31,3° (c= !,Dimethylacetamid).

Beispiel 3
(analog Reaktionsschema 2)

Pyroglu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys(Boc)-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂

₄₍₎ a)Z-Pro-Gly-NH-Mbh

Zu einer Lösung von 30,5 g (0,1 Mol) Z-PrO-GIy-NH₂ und 24 g (0,1 Mol) 4.4'-Dimethoxybenzhydrol in 200 ml Eisessig gibt man 0,5 ml konz. H₂SO₄ und läßt einen Tag bei Raumtemperatur stehen. Anschließend wird mit

> 850 ml Wasser ein öl ausgefällt, das im Laufe von 24 Stunden kristallisiert Die Substanz wird abfiltriert und in Essigester gelöst. Die Essigesterlösung wird zweimal mit gesättigter NaHCOj-Lösung ausgeschüttelt, mit Na₂SO₄ getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wird aus Essigester/Petroläther kristallisiert Ausbeute 463 e, (87%), Schmp. 108⁰C, [α] = -9.7° (c= 1, in Dimethylacetamid).

b) H-Pro-Gly-NH-Mbh - HCl

45 g (84,7 mMol) Z-Pro-Giy-NH-Mbh werden analog Beispiel Ib in Methanol katalytisch hydriert Der Rückstand wird mit Äther verrieben. Ausbeute 33,7 g (91.5%), Schmp. 233°G Eine Probe wurde zur Analyse aus Methanol/Äther umgefällt: Schmp. 236°,

bo f«]f = -24,7° (c= 1,in Dimethylacetamid).

c)Z-Leu-Arg(NO₂)-OH

Zu einer Lösung von 24,8 g (0,1 Mol) Z-Leu-OH, 26,9 g (0.1 MoI) H-Arg(NO₂)-OMe - HCl und 13,5 g HOBt in ^00 ml Dimethylformamid gibt man bei 0°C 13 ml N-Äthylmorpholin und 22 g DCC. Man rührt 1 Stunde bei 0⁰C und läßt über Nacht bei Raumtemperatur stehen. Oer ausgefallene Niederschlag wird abse

saugt, das Filtrat eingeengt und der Rückstand in Essigestef aufgenommen. Die Essigesterphase wird mit gesättigter NaHCOj-Lösung, 2 η H₂SO^, gesättigter NaHCO₃-LoSURg und Wasser ausgeschüttelt, über Na₂SO4 getrocknet und eingeengt. Mit Diisopropylälher ^r> wird die Substanz verrieben. Zur weiteren Reinigung wird die Substanz in Essigester gelöst und über basi^hes AI2O3 Chromatographien. Ausbeute 23,05 g amorphe Substanz.

19,2 g (40 mMol) oben gewonnener Substanz werden in 80 ml Dioxan gelöst. Dazu gibt man 16 ml Wasser und eine Spatelspitze Thymolphthalein. Unter Rühren läßt man in 1 η Natronlauge bis zur bleibenden Blaufärbung langsam zutropfen (Verbrauch 37,7 ml). Nun wird neutralisiert, eingeengt und der Rückstand zwischen \; Essigester und 2 η HCl verteilt. Die Essigeslerphase wird mit Wasser gewaschen, mit Na₂SCM getrocknet und eingeengt. Mit Diisopropyläther wird verrieben und abgesaugt. Ausbeute 15,75mg. Schmp. 147-155°C, [cc]» = - 3,6° (c = I, Dimethylacetamid).

d)Z-Leu-Arg(NO₂)-Pro-Gly-NH-Mbh

f)H-D-Lys(Boc)-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂ · 2 HCl

21)

Zu einer Lösung von 4,66 g (1OmMoI) Z-Leu-Arg(NO₂)-OH, 4,34 g H-Pro-GIy-NH-Mbh · HCI und i,35g HOBt in 30 ml Dimethylformamid gibt man bei 2^r> O⁰C 1,3 ml N-Äthylmorpholin und 2,2 g DCC. Man läßt 1 Stunde bei 0°C und über Nacht bei Raumtemperatur rühren, saugt den Niederschlag ab und fällt aus dem Filtrat mit Wasser eine Substanz, die in Essigester gelöst wird. Die Essigesterlösung wird mit gesättigter «1 NaHCO3-Lösung, KHSO4-Lösung und Wasser ausgeschüttelt, über Na₂SOi getrocknet und eingeengt.

Ausbeute 6 g, Schmp.89-93°C,[α]? 21,7° (c= I. in

Dimethylacetamid).

e) H-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂ ■ 2 HF "

6 g Z-Leu-Arg(NO₂)-Pro-Gly-NH-Mbh und 12 ml Anisol werden mit 120 ml HF versetzt. Man rührt 1 Stunde bei 0^DC. zieht in Vakuum das HF ab und verteilt den Rückstand zwischen Wasser und Äther. Die ätherische Phase wird einmal mit Wasser ausgeschüttelt. Die vereinigten Wasserphasen werden mit Äther gewaschen und gefriergetrocknet Ausbeute 3,35 g einer amorphen Substanz. [cc]% = - 42,1 ° (c = 1, in H₂O)

4¹)

Zu einer Lösung von 2,4 g (5 mMol) H-Leu-Arg-Pro-GIy-NH₂ · 2 HF und 675 mg HOBt in 5 ml Dimethylformamid gibt man bei 0°C 13 ml N-Äthylmorpholin und 2,8 g Z-D-Lys(Boc)-OTcp. Man läßt 3 Stunden bei Raumtemperatur stehen, engt ein und verreibt den Rückstand zweimal mit gesättigter NaHCO₃-Lösung, löst in Methylenchlorid, trocknet über Na₂SO₄ und engt ein. Der Rückstand wird mit Äther verrieben und am Hochvakuum getrocknet Ausbeute 3,1 g (77%) amor- « phes Material. Diese Substanz wird analog Beispiel Ib in Methanol katalytisch hydriert. Der Rückstand wird mit Äther verrieben und am Hochvakuum getrocknet Ausbeute 2,67 g (74% bezogen auf Z-D-Lys(Boc)-OTcp) amorphes Material. Dünnschichtchromatographisch ω nicht einheitlich (verunreinigt durch 2 Nebenprodukte).

g) H-Trp-Ser-Tvr-D-LysfBocJ-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂ - 2 HCl

Zu einer Lösung von 2^3 g (3,7 mMol) Z-Trp-Ser-Tyr-NH-NHs in 25 ml Dimethylformamid gibt man bei -30⁰C 2,44 ml einer 6,05 η HCl/Dioxan-Lösung und 4,45 ml einer lOprozentigen tert-Butylnitrit-Lösung in absolutem Dioxam Man läßt 20 Minuten bei -1O⁰C rühren und gibt bei -40⁰C 2,9 ml N-Älhylrnorpholin und 2,67 g (3,7 mMol) H-D-Lys(Boc)-Leu-Arg-Pro-GIy-NH₂ zu. Man läßt über Nacht im Kühlraum bei 4°C stehen, engt ein und verreibt den Rückstand mit Äther. Analog Beispiel Ib wird katalytisch hydriert und die Rohsubstanz analog Beispiel Ie an einem hydroxypra pylierten vernetzten Dextrangcl chromatographisch gereinigt. Ausbeute an reiner amorpher Substanz 1,3 g (30%).

h) Pyroglu-His-Trp-Ser-Tyr-D-l ys(Boc)-Leu-Arg-Pro-GIy-NH₂-diacetat

Zu einer Lösung von 590 mg (0,5 mMol) H-Trp-Ser-

Tyr-D-Lys(Boc)Leu-ArgPro-Gly-NH₂ ■ 2 HCl,
151 mg (0,5 mMol) Pyroglu-His-OH und 135 mg HOBl in 5 ml Dimethylformamid gibt man bei 0⁰C 0,13 ml N-Äthylmorpholin und 110 mg DCC. Man läßt 1 Stunde bei 0⁰C und über Nacht bei Raumtemperatur stehen, saugt den Niederschlag ab, engt ein, und verreibt den Rückstand mit Äther. Man löst in Wasser, filtriert von Unlöslichem und reinigt analog Beispiel If an einem hydroxypropylierten vernetzten Dextrangel und Carboxymethylcellulose. Anschließend wird noch an einem stark basischen Polystyrol-Anionenaustauscher analog Beispiel Ie gereinigt. Ausbeute 155 mg. Der Gehalt an Peptid ist laut UV-Spektrum 78% (17% Ausbeute). [α]ί,' = -39° (c= 1, in Dimethylacetamid).

Beispiel 4
(analog Reaktionsschema 1)

Pyroglu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(Bu')-Leu-Arg-Pro-cyclopropylamid

a) Z-Pro-cycIopropylamid

Zu einer Lösung von 25 g (0,1 Mol) Z-Prolin, 13,5 g (0,1 Mol) HOBt und 5,71 g (0.1 Mol) Cyclopropylamin in 200 ml absolutem Tetrahydrofuran gibt man bei 0⁰C 22 g DCC, gelöst in 50 ml kaltem absolutem Tetrahydrofuran. Man läßt eine Stunde bei 0⁰C und drei Stunden bei Raumtemperatur rühren, saugt den Niederschlag av. und engt das Filtrat ein. Der ölige Rückstand wird in Essigester gelöst und nacheinander mit gesättigter NaHCO₃-Lösung, 2 η HCI. NaHCOj-Lösung und Wasser ausgeschüttelt, über Na₂SO₄ getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wird mit Petroläther verrieben und abgesaugt. Zur Reinigung wird aus Essigester/Petroläther umkristallisiert. Ausbeute 23 g ( = 80%). Schmp. 120-123°, [«]?= -45,5° (c=l, in Methanol).

b) H-Pro-cyclopropylamid · HCl

Analog Beispiel Ib werden 19 g Z-Pro-cyclopropylamid, in Methanol katalytisch hydriert Der Rückstand wird mit Äther verrieben. Ausb. 11 g (88%). Schmp. 169-173°C.

c) Z-Arg(Z2)-Pro-cyclopropyIamid

Zu einer Lösung von 28,85 g (50 mMol) Z-Arg(Z₂)-OH, 9,5 g 50 mMol) H-Pro-cyclopropylamid -HCl und 6,75 g (50 mMol) HOBt in 100 ml Methylenchlorid und 25 ml Dimethylformamid gibt man 6,5 ml N-Äthylmorpholin und bei 0°C eine Lösung von 11 g DCC in wenig Methylenchlorid. Man läßt eine Stunde bei 0⁰C und über Nacht bei Raumtemperatur stehen. Der Niederschlag wird abgesaugt und das Filtrat eingeengt Der Rückstand wird in Essigester aufgenommen und mit Wasser, NaHCO₃-Lösung, 1 η HCI, und

NaHCOj-Lösung gewaschen, mil Na2SC>4 getrocknet und eingeengt. Der Rückstand kristallisiert aus Essigester/Petroläther. Die Rohsubstanz (26,3 g) wird an einer 250g-Kieselgelsäule in Methylenchlorid/Aceton wie 9:1 und 8:2 chromatographisch gereinigt. Ausbeute ¹S 22,2g (62%), Schmp. 17PC. [α]ϊ = -33,0° (c=l, in Methanol).

d) H-Arg-l'ro-cycIopropylamid · 2 HCl

22 g (30,9 mMol) Z-Afg(Z2)-Pro-cyclopfopylarnid Ki werden in Methanol analog Beispiel Ib katalytisch hydriert. Der Rückstand wird im Hochvakuum getrocknet. Es resultieren 11 g (89%) eines amorphen Schaums.

eJZ-D-SerfBu'VLeu-Arg-Pro-cyclopropylamid ^.

Zu einer Lösung von 3,83 g (10 mMol) H-Arg-Pro-cyclopropylamid · 2 HCl in 20 ml Dimethylformamid gibt man bei 0⁰C 2,6 ml N-Äthylmorpholin und 2,75 g Z-Leu-ONSu. Man läßt über Nacht bei Raumtemperatur stehen, engt ein und verreibt den Rückstand je 2c» einmal mit Essigester und Äther. Man dekantiert die Lösungsmittel ab und trocknet das Öl im Hochvakuum Der Rückstand wird in Methanol gelöst und analog Beispiel Ib katalytisch hydriert. Der Rückstand wird mit Äther verrieben und am Hochvakuum getrocknet. Es entstehen 5.45 g amorphes H-Leu-Arg-Pro-cyclopropylamid · 2 HCI, das durch Salze verunreinigt ist (4,96 g= 100% bezogen auf H Arg-Pro-cyclopropylamid · 2 HCI). Die gesamte Substanz wird zusammen mit 1,35 g HOBt, 2,6 ml N-Äthylmorpholin und 4,8 g ίο Z-D-Ser(Bu')-OTcp in 20 ml Dimethylformamid gelöst. Man läßt 2 Stunden stehen, engt ein und verreibt den Rückstand 2mal mit gesättigter NaHCO₁-Lösung, löst in Methylenchlorid, trocknet über Na2SO4. engt ein und verreibt den Rückstand zweimal mit gesättigter NaHCO3-Lösung, löst in Methylenchlorid, trocknet über Na2SO4, engt ein und verreibt den Rückstand mit Äther. Ausbeute 4,55 g (65% bezogen auf H-Arg-Pro-cyclopropylamid · 2 HCI). Die Substanz ist amorph und wird ohne weitere Reinigung weiterverarbeitet.

f) H-Ser-Tyr-D-Ser(Bu')-Leu-Arg-Pro-cyclopropyliimid · 2 HCl

3,5 g (5 mMol) Z-D-SerfBu'J-Leu-Arg-Pro-cyclopropylamid werden in Methanol analog Beispiel Ib katalytisch hydriert. Der Rückstand wird mit Äther verrieben und am Hochvakuum getrocknet. Ausbeute 3 g (94%) amorphes Material.

Obige 3 g (4,7 mMol) H-D-Ser(Bu')-Leu-Arg-Pro-cyclopropylamid · 2 HCl werden zusammen mit 232 g (4,7 mMol) Z-Ser-Tyr(Bzl)-OH, 635 mg HOBt und 1,22 ml N-Äthylmorpholin in 10ml Dimethylformamid gelöst. Bei 0⁰C gibt man 1,04 g DCC zu und läßt eine Stunde bei 0⁰C und über Nacht bei Raumtemperatur stehen.

Der Niederschlag wird anderntags abgesaugt und das Filtrat eingeengt Der Rückstand wird zweimal mit gesättigter NaHCO₃-Lösung verrieben, in Methylenchloridlösung gelöst und die Lösung über Na2SO₄ getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wird mit Äther verrieben und abgesaugt Es resultieren 3,5 g (71%) Z-Ser-TyrfBzlJ-D-SeriBu^-Leu-Arg-Pro-cyclopropylamid, die analog Beispiel Ib katalytisch hydriert werden. Der Rückstand wird mit Äther verrieben Und am Hochvakuum getrocknet. Ausb. 2₍92g ( = 70% bezogen auf Z-Ser-Tyr(BzI)-OH). Die Rohsubstanz wird wie bei Beispiel Ie beschrieben chromatographisch an einem hydroxypropylierten vernetzten Dextrangel gereinigt. Ausbeute an chfornatographisch reiner Substanz 1.4 g. [α]? *= -44,2° (c= 1, in Methanol).

g)Pyroglu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(Bu')-Leu-Arg-Pfo-cyclopföpylamid-diacetat

Analog Beispiel If werden 500 mg Pyroglu-His-Trp-NH-NH₂ mit 390 mg H-Ser-Tyr-D-Ser(Bu')-Leu-Arg-Pro-cyclopropylamid · 2 HCl umgesetzt, aufgearbeitet und gereinigt. Ausbeute 420 mg chromatographisch reiner Substanz. Der Gehalt an Peptidbase ist laut

UV-Spektrum 77% (Ausbeute 32%). [α] 40,8°

(c= I,in Dimethylacetamid).

Beispiel 5
(Zubereitung zur oralen Anwendung)

10 g Pyroglu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(Bu')-Leu-Arg-Pro-NH-C₂H₅-diacetat werden mit 542 g Lactose verrieben. Man mischt die Verreibung mit 300 g Kartoffelstärke, befeuchtet mit der alkoholischen Lösung von 8 g Gelatine und granuliert Nach dem Trocknen mischt man 60 g Kartoffelstärke, 10 g Magnesiumstearat, 20 g hochdisperses Siliciumdioxid und 60 g Talk zu und preßt die Mischung zu 10 000 Tabletten von je 150 mg Gewicht. Jede Tablette enthält 1 mg Wirkstoff.

Beispiel 6
(Zubereitung zur intranasalen Anwendung)

4,0 g Pyroglu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Glu(OBu')-Leu-Arg-Pro-NH-C₂H₅-diacetat werden in 100 ml destilliertes Wasser gelöst. Gleichzeitig löst man 31,2 g NaHPO₄ ■ 2 H₂O, 66,29 g HPO₄, 25 g NaCl und 100 g Benzylalkohol in 81 dest. Wasser und gibt 500 g Polyvinylalkohol mit einem K-Wert von ca. 90 zu. Die beiden Lösungen werden vereinigt und filtrift. Die Einzeldosis von 20 μg ist in 0,05 ml enthalten.

Beispiel 7
(Zubereitung für Injektionen)

Man löst 2 mg Pyroglu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys(Boc)-Leu-Arg-Pro-NH-C₂H₅-diacetat in 500 ml bidestilliertes Wasser und versetzt mit 100 ml Phosphatpuffer pH 4,5. Dann gibt man 1 g Mannit und die errechnete Menge NaCl zur Isotonie zu und füllt mit Wasser auf 1 Liter auf. Nach Sterilfiltration wird in Ampullen zu 1 bzw. 2 ml abgefüllt und lyophilisiert.

Beispiel 8
(Zubereitung für Injektionen)

Man arbeitet nach Beispiel 7, gibt aber vor dem Auffüllen mit Wasser 2,5 g 4-Hydroxybenzoesäuremethylester zu. Nach Sterilfiltration wird in Ampullen zu 1 oder 2 ml abgefüllt

Claims

Patentansprüche:

1. Peptide der allgemeinen Formel I

Pyroglu-His-Trp-Ser-Tyr-X-Leu-Arg-Pro-NH-R ^

(D

worin X D-Ser(Bu'), D-Cys(Bu'), D-Asp(OBu'), D-GIu(OBu¹), D-Orn(Boc) oder D-Lys(Boc) und R Carbamoylmethyl, Äthyl oder Cyclopropyl bedeu- in ten.

Z Verfahren zur Herstellung von Peptiden gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man sie

a) durch in der Peptidchemie übliche Fragment- r> kondensation nach dem Kondensationsschema 1 -3+4-9(10)oder 1 -2+3-9(10)oder

b) durch stufenweisen Aufbau herstellt,