DE2431776A1

DE2431776A1 - NEW PEPTIDE COMPOSITIONS

Info

Publication number: DE2431776A1
Application number: DE2431776A
Authority: DE
Inventors: Jun Paul Ernest Brazeau; Roger Cecil Burgus; Roger Charles Louis Guillemin; Nicholas Chikwan Ling; Jean Edouard Frederic Rivier; Jun Wylie Walker Vale
Original assignee: Salk Institute for Biological Studies
Current assignee: Salk Institute for Biological Studies
Priority date: 1973-07-02
Filing date: 1974-07-02
Publication date: 1975-01-30
Also published as: LU70447A1; CH603557A5; FR2235701B1; FR2235701A1; JPS5069071A; DK355374A; FI194374A; US3904594A; AU7073374A; IE39528L; NL7408940A; IE39528B1; SE7408686L; NO742383L; CA1064912A; GB1443281A; IL45160A; IL45160A0; PH12097A

Description

9 L ^ 1 7 7 R9 L ^ 1 7 7 R

Patentanwälte Dipl.-Ing. F. Weickmann,Patent attorneys Dipl.-Ing. F. Weickmann,

Dipl.-Ing. H.Weickm-ann, Dipl.-Phys. Dr. K. Fincke H/WE/MY Dipl.-Ing. E A.Weickmann, Dipl.-Chem. B. HuberDipl.-Ing. H.Weickm-ann, Dipl.-Phys. Dr. K. Fincke H / WE / MY Dipl.-Ing. E A.Weickmann, Dipl.-Chem. B. Huber

Case 32 747-F ^{8 M0NCHEN 8}^. denCase 32 747- ^{F8 M0NCHEN8} ^. the

POSTFACH 860 820PO Box 860 820

MÖHLSTRASSE 22, RUFNUMMER 48 39 21/22MÖHLSTRASSE 22, NUMBER 48 39 21/22

<983921/22><983921/22>

The SaIk Institute for Biological Studies, 10010 North ?orrey Pines Road, La Jolla, Californien / USAThe SaIk Institute for Biological Studies, 10010 North? Orrey Pines Road, La Jolla, California / USA

Neue PeptidzusammensetzungenNew peptide compositions

Die Erfindung betrifft neue Peptidzusammensetzungen, die eine inhibierende Wirkung auf die wachstumsaktivierende Funktion der Hypophysedrüse in Menschen und Tieren besitzen. Die Erfindung betrifft insbesondere neue Peptidzusammensetzungen, die die Freigabe von Wachstumshormon durch die Hypophysedrüse beeinflussen.The invention relates to new peptide compositions which have an inhibiting effect on the growth-activating function of the pituitary gland in humans and animals. The invention particularly relates to new peptide compositions, that affect the release of growth hormone by the pituitary gland.

Die Hypophysedrüse ist mit einem Stiel mit dem Bereich der Gehirnbasis, bekannt als Hypothalamus, verbunden. Die Hypophysedrüse besitzt zwei Lappen, den Vorder- und den Hinterlappen. Der Hinterlappen der Hypophysedrüse lagert und gibt in das allgemeine Kreislaufsystem zwei Hormone ab, die in dem Hypothalamus gebildet werden, und zwar sind dies Vasopressin und Oxytocin. Der Vorderlappen der Hypophysedrüse produziert eine Anzahl von Hormonen bzw. sondert eine Anzahl Hormone ab, die komplexe Protein- oder Glycoproteinmoleküle sind und die durch den Blutstrom zu den verschiedenen Organen transportiert werden und ihrerseits die Absonderung anderer Hormone von den peripheren Organen in den Blutstrom stimulieren. Die Hypophysedrüse sondert ein adenocorticotropes Hormon ab, welches die Nebennierenrinde stimuliert, um Corticosteroide abzusondern. Ein schilddrüsenstimulierendes Hormon, welches ebenfalls alsThe pituitary gland is stalked to the area of the Base of the brain known as the hypothalamus. The pituitary gland has two lobes, the anterior and posterior lobes. The posterior lobe of the pituitary gland stores and releases two hormones into the general circulatory system that are in the Hypothalamus, namely vasopressin and oxytocin. The anterior lobe of the pituitary gland produces secretes a number of hormones, which are complex protein or glycoprotein molecules and which be transported by the bloodstream to the various organs and in turn the secretion of other hormones from the stimulate peripheral organs into the bloodstream. The pituitary gland secretes an adenocorticotropic hormone, which the Adrenal cortex stimulates to secrete corticosteroids. A thyroid stimulating hormone, which is also known as

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Thyrotropin bekannt ist, wird freigegeben, welches die Absonderungen durch die Schilddrüse stimuliert. Follikelstimulierendes Hormon, luteinisierendes Hormon und Prolactin werden ebenfalls von der Hypophysendrüse abgegeben. Diese letzteren Hormone regulieren in verschiedenen Kombinationen die Lactation und die Funktion der Gonaden, um Testosteron in den Testis und Progesteron und Oestrogen in den Ovarien zu bilden, wie auch um die Bildung und Reifung der Gameten zu regulieren.Thyrotropin is known to be released which is the secretions stimulated by the thyroid gland. Follicle Stimulating Hormone, Luteinizing Hormone and Prolactin are also released from the pituitary gland. These latter regulate hormones in various combinations the lactation and function of the gonads to testosterone in the testis and progesterone and estrogen in the ovaries too as well as to regulate the formation and maturation of gametes.

Die Vorderhypophyse bildet ebenfalls ein Wachstumshormon, welches Körpergrößenwachstum in Säugetieren einschließlich der Menschen direkt beeinflußt. Dieses Wachstumshormon, das von der Hypophysedrüse freigegeben wird, wird ebenfalls als Somatotropin bezeichnet. Es wurde von L. Krulich et al, (Endocrinology, Vol. 85, S. 319, 1969) berichtet, daß ein Rohextrakt Hypothalamusursprungs bewirkt, daß die Sekretion des Wachstumshormons inhibiert wird.Ein aktives Material, das fähig ist, eine solche Inhibierung zuverlässig zu bewirken, wurde bis jetzt noch nicht charakterisiert. Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung von therapeutisch wertvollen Peptiden, die, wenn sie entweder in den Blutstrom direkt oder indirekt eingeführt werden, die Wirkung zeigen, die Sekretion des Wachstumshormons von der Hypophysedrüse von Menschen und Tieren zu inhibieren. Die Peptide können indirekt in den Blutstrom eingeführt werden, indem man die Peptide subkutan, intramuskulär oder nach einem anderen Verfahren entweder mit oder ohne einen Träger injiziert. Der Einfachheit halber wird in der vorliegenden Anmeldung ein Material, das eine inhibierende Wirkung auf die Sekretion des Wachstumshormons (Somatotropin) zeigt, als "Somatostatin" bezeichnet. Die besonderen erfindungsgemäßen Peptide, von denen gefunden wurde, daß sie die Sekretion des Wachstumshormons wirksam inhibieren, werden manchmal in der vorliegenden Anmeldung als "Somatostatinpeptide" bezeichnet.The anterior pituitary also produces a growth hormone that stimulates body size growth in mammals including the Affects people directly. This growth hormone, which is released by the pituitary gland, is also called Called somatotropin. It has been reported by L. Krulich et al, (Endocrinology, Vol. 85, p. 319, 1969) that a Crude extract of hypothalamic origin causes the secretion of growth hormone to be inhibited. An active material, capable of reliably effecting such inhibition has not yet been characterized. The present Invention relates to the manufacture of therapeutic valuable peptides which, when introduced either directly or indirectly into the bloodstream, have the effect of to inhibit the secretion of growth hormone from the pituitary gland of humans and animals. The peptides can Indirectly introduced into the bloodstream by taking the peptides subcutaneously, intramuscularly, or one at a time Procedure injected either with or without a carrier. For the sake of simplicity, a Material which has an inhibiting effect on the secretion of growth hormone (somatotropin), as "somatostatin" designated. The particular peptides of the invention which have been found to inhibit growth hormone secretion are sometimes referred to in the present application as "somatostatin peptides".

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Eine Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, Peptidmaterialien zu schaffen, die eine inhibierende Wirkung auf die Sekretion des Wachstumshormons durch die Hypophysedrüse in Säugetieren einschließlich Menschen zeigen.A main object of the present invention is to provide peptide materials which have an inhibiting effect indicate the secretion of growth hormone by the pituitary gland in mammals including humans.

Erfindungsgemäß.wurde.aus Schafshypothalamusfragmenten ein Peptid isoliert, welches die Sekretion in vitro des immunoreaktiven Wachstumshormons von Rattenhypophysezellen inhibiert und ebenfalls in vivo in Säugetieren einschließlich von Menschen wirksam ist. Als Ausgangsmaterial, aus dem das Peptid stammt, wurden Hypothalamusfragmente. von ungefährAccording to the invention, sheep hypothalamus fragments became a Peptide isolated which inhibits the secretion in vitro of immunoreactive growth hormone from rat pituitary cells and is also effective in vivo in mammals, including humans. As the starting material from which the Peptide derived were hypothalamic fragments. of about

500000 Schafgehirnen verwendet. Die Hypothalamusfragmente wurden mit einem System, welches aus 810 Vol-Teilen Äthanol, 100 Vol-Teilen Chloroform, 5 Vol-Teilen Eisessig und 90 Vol-Teilen Wasser besteht, extrahiert. Alle Teile, Prozentgehalte und Verhältnisse, die in der vorliegenden Anmeldung verwendet werden, sind - soweit nicht anders angegeben - durch das Volumen ausgedrückt. Der Extrakt wurde in einem System verteilt, welches 0,1% Essigsäure in Wasser, n-Butanol und Pyridin in einem Volumenverhältnis von 11:5:3 enthält. Das aus der organischen Phase erhaltene Material wurde dann erneut in n-Butanol, Eisessig und Wasser in einem Volumenverhältnis von 4:1:5 verteilt. Die wäßrige Phase von der zweiten Extraktion wurde der Ionenaustauschchromatographie an Carboxymethylcellulose unterworfen. Dabei erhielt man eine Fraktion mit Somatostatinaktivität. Diese Fraktion wurde durch Gelfiltration an "Sephadex G-25" in 0,5m Essigsäure weiter gereinigt. Eine weitere Reinigung erfolgte durch flüssige Verteilungschromatographie an einem "Sephadex G-25"-Träger in einem System, das n-Butanol, Eisessig und Wasser in einem Volumenverhältnis von 4:1:5 enthält. Das gereinigte Endprodukt wiegt 8,5 mg und enthält 77 Gew.# Aminosäuren und nur Spuren von Peptidverunreinigungen, wenn es der Dünnschichtchromatographie und der Elektrophorese unterworfen wird.500,000 sheep brains used. The hypothalamic fragments were with a system that consists of 810 parts by volume of ethanol, 100 parts by volume of chloroform, 5 parts by volume of glacial acetic acid and 90 parts by volume Water is extracted. All parts, percentages and ratios used in the present application are - unless otherwise stated - expressed in terms of volume. The extract was distributed in a system which contains 0.1% acetic acid in water, n-butanol and pyridine in a volume ratio of 11: 5: 3. That Material obtained from the organic phase was then redissolved in n-butanol, glacial acetic acid and water in a volume ratio distributed from 4: 1: 5. The aqueous phase from the second extraction was ion exchange chromatographed on carboxymethyl cellulose subject. A fraction with somatostatin activity was obtained. This fraction was filtered through gel further purified on "Sephadex G-25" in 0.5m acetic acid. A further purification was carried out by liquid partition chromatography on a "Sephadex G-25" support in a system containing n-butanol, glacial acetic acid and water in a volume ratio of 4: 1: 5. The purified end product weighs 8.5 mg and contains 77 wt. # amino acids and only traces of peptide impurities when it was thin layer chromatography and subjected to electrophoresis.

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Die quantitative Aminosäureanalyse des Peptids, das nach dem obigen Verfahren isoliert wird, ergibt die folgenden molaren Verhältnisse: AIa, 1; GIy, 1; Thr, 2; Lys, 2; Phe, 3; Ser, 1; Cys, 2; Trp, 1; Asp, 1; NHU, 1. Die Aminosäureanalyse nach der vollständigen enzymatischen Digestion mit Papain und Leucinaminopeptidase zeigte das gleiche Aminosäureverhältnis, mit der Ausnahme, daß Asp als Asn auftritt.The quantitative amino acid analysis of the peptide isolated by the above procedure gives the following molar ratios: Ala, 1; GIy, 1; Thr, 2; Lys, 2; Phe, 3; Ser, 1; Cys, 2; Trp, 1; Asp, 1; NHU, 1. Amino acid analysis after complete enzymatic digestion with papain and leucine aminopeptidase showed the same amino acid ratio, except that Asp appears as Asn.

Die Struktur des, Peptids wurde durch stufenweisen Edman-Abbau bestimmt, durchgeführt an einem intakten carboxymethylierten Peptid, wie auch den ungelösten bzw. nichtzerlegten Produkten des tryptischen und chymotryptischen' digerierten Materials des Peptids. Die Produkte des Edman-Abbaus wurden nach dem subtraktiven Verfahren durch Aminosäureanalyse, Bestimmung der sukzessiven Aminoendgruppen mit Dansylchlorid und Massenspektrometrie von 3-Phenyl-2-thiohydantoinderivaten bestimmt. Es wurde gefunden, daß die Struktur des Peptids, das aus hypothalamischen Fragmenten von Schafgehirnen isoliert wurde, überbrückt ist und folgendermaßen identifiziert wird:The structure of the peptide was determined by gradual Edman degradation determined, carried out on an intact carboxymethylated peptide, as well as the undissolved or non-decomposed peptides Products of the tryptic and chymotryptic 'digested material of the peptide. The products of Edman mining were determined by the subtractive method by amino acid analysis, determination of the successive amino end groups with dansyl chloride and mass spectrometry of 3-phenyl-2-thiohydantoin derivatives certainly. It was found that the structure of the peptide formed from hypothalamic fragments isolated from sheep brains, bridged and as follows is identified:

H-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Fhe-Thr-Ser-Cys-OHH-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Fhe-Thr-Ser-Cys-OH

Die oben verwendeten Abkürzungen sind üblich und basieren auf den Trivialnamen der Aminosäuren, die in dem Peptid enthalten sind, worin AIa Alanin, GIy Glycin, Cys Cystein, Lys Lysin, Asn Asparagin, Phe Phenylalanin, Trp Tryptophan, Tyr Tyrosin, Thr Trheonin und Ser Serin bedeuten. Die oben angegebene Formel entspricht der üblichen Darstellung der Peptide, wobei die Aminogruppe links und die Carboxylgruppe rechts auftreten. Die Isomeren der Aminosäuren sollen, wenn sie möglich sind, mit von den Trivialnamen, sofern nicht anders spezifisch angegeben, umfaßt werden.The abbreviations used above are common and are based on the common names of the amino acids contained in the peptide are, wherein AIa alanine, GIy glycine, Cys cysteine, Lys Mean Lysine, Asn Asparagine, Phe Phenylalanine, Trp Tryptophan, Tyr Tyrosine, Thr Trheonine and Ser Serine. The one given above Formula corresponds to the usual representation of peptides, with the amino group on the left and the carboxyl group occur on the right. The isomers of the amino acids should, if they are possible, with from the trivial names, if not otherwise specifically stated.

Im allgemeinen sind andere überbrückte Peptide, die die folgende Struktur besitzen, biologisch aktiv, um die SekretionIn general, other bridged peptides having the following structure are biologically active for secretion

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des Wachstumshormons in vitro und in vivo in Säugetieren einschließlich von Menschen zu inhibieren:of growth hormone in vitro and in vivo in mammals including to inhibit by humans:

1 I1 I.

R-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OHR-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH

worin R ein Acylierungsmittel oder Wasserstoff bedeutet. Es wurde gefunden, daß Tyrosin (Tyr) für irgendein Phe substituiert sein kann. Es ist ebenfalls wahrscheinlich, daß irgendein Aminosäuremolekülteil in dem Somatostatinpeptid durch andere Aminosäuren ersetzt sein kann.wherein R is an acylating agent or hydrogen. It has been found that tyrosine (Tyr) substitutes for any Phe can be. It is also likely that some amino acid moiety in the somatostatin peptide passes through other amino acids can be substituted.

Überraschenderweise wurde gefunden, daß lineare Peptide, die durch Fest-Phasenverfahren synthetisiert und durch Gelfiltration in Anwesenheit von 2-Mercaptoäthanol gereinigt wurden, eine gleiche biologische Aktivität zeigen im Hinblick darauf, daß die Wachstumshormon-Sekretion inhibiert wird, wie^die oben beschriebenen überbrückten Peptide. Lineare Peptide, von denen gefunden wurde, daß sie wirksam sind, besitzen die folgende Struktur:Surprisingly, it has been found that linear peptides synthesized by solid phase methods and by gel filtration were purified in the presence of 2-mercaptoethanol, show the same biological activity with regard to that growth hormone secretion is inhibited, like ^ the bridged peptides described above. Linear peptides, from which have been found to be effective have the following structure:

worin R die gleiche Bedeutung besitzt, wie es oben im Zusammenhang mit den überbrückten Peptiden beschrieben wurde. Die gleichen Aminosäuresubstitutionen können in den linearen Peptiden erfolgen, wie sie in Zusammenhang mit den überbrückten Peptiden beschrieben wurden.wherein R has the same meaning as it has above in connection with the bridged peptides. The same amino acid substitutions can be found in the linear Peptides take place as described in connection with the bridged peptides.

Der Ausdruck "Acylierungsmittel", wie er in der vorliegenden Anmeldung verwendet wird, bedeutet eine organische Verbindung, die in der Lage ist, eine Acylgruppe, nämlich 0The term "acylating agent" as used herein Registration is used means an organic compound that is capable of an acyl group, viz 0

R,.-C- zu ergeben. Bevorzugte Acylierungsmittel, die bei den erfindungsgemäßen Peptiden verwendet werden können, werden aus den folgenden ausgewählt: (a) eine Aminosäure. Für die überbrückten Peptide ist es bevorzugt, daß die Aminosäure keine Sulfhydrylgruppe enthält; (b) ein Dipeptid, hergestellt aus zwei Aminosäuren, worin die zweite Aminosäure, die mitR, .- C- to give. Preferred acylating agents used in the Peptides according to the invention are selected from the following: (a) an amino acid. For the For bridged peptides, it is preferred that the amino acid does not contain a sulfhydryl group; (b) a dipeptide from two amino acids, in which the second amino acid, the with

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Cys verbunden ist, nicht zur sterischen Hinderung beiträgt.Bevorzugte zweite Aminosäuren sind GIy, AIa und ß-Ala. Für die überbrückten Peptide ist es bevorzugt, daß die Aminosäuren der Dipeptide keine Sulfhydrylgruppe enthalten; (c) ein Tripeptid, worin die dritte Aminosäure, die mit Cys verbunden ist, zur sterischen Hinderung nicht beiträgt, und worin die restlichen zwei Aminosäuren irgendeine Aminosäure sind. Bevorzugte dritte Aminosäuren für das Tripeptid sind GIy, AIa und ß-Ala. Für die überbrückten Peptide ist es bevorzugt, daß keine der Aminosäuren des Tripeptide eine Sulfhydrylgruppe enthält; (d) aliphatische, aromatische und cyclische organische Säuren, mit Ausnahme der Aminosäuren, mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen. Die organischen Säuren können gesättigt sein und/oder sie können andere funktioneile Gruppen enthalten. Bevorzugte Acylierungsmittel werden aus organischen Verbindungen ausgewählt, die die folgenden Acylgruppdn ergeben: GIy, AIa, Ala-Gly, Acetyl-Ala-Gly, Tyr-Gly, Sarc-Gly, Tyr-Ala-Gly, Ala-Tyr-Gly, Acetyl, Acryl, Pivalyl und Benzoyl.Cys does not add steric hindrance. Preferred second amino acids are GIy, AIa and β-Ala. For the bridged For peptides, it is preferred that the amino acids of the dipeptides do not contain a sulfhydryl group; (c) a tripeptide, wherein the third amino acid linked to Cys does not contribute to steric hindrance, and wherein the remaining two amino acids are any amino acid. Preferred third amino acids for the tripeptide are GIy, AIa and ß-Ala. For the bridged peptides, it is preferred that none of the amino acids of the tripeptide have a sulfhydryl group contains; (d) aliphatic, aromatic and cyclic organic acids, with the exception of amino acids, with 1 to 10 carbon atoms. The organic acids can be saturated and / or they can contain other functional groups. Preferred acylating agents are selected from organic compounds which give the following acyl groups: GIy, AIa, Ala-Gly, Acetyl-Ala-Gly, Tyr-Gly, Sarc-Gly, Tyr-Ala-Gly, Ala-Tyr-Gly, acetyl, acrylic, pivalyl and benzoyl.

Jede der Aminosäuren in dem Teil der erfindungsgemäßen Somatostatinpeptide, der sich zwischen und einschließlich den zwei Cys-Gruppen erstreckt, ist das L-Isomer, worin die Aminosäure isomere Formen aufweist. Jede Aminosäure, die die R-Gruppe der erfindungsgemäßen Peptide enthält, kann entweder das L-Isomere oder das D-Isomere sein, worin die Aminosäure isomere Formen aufweist.Each of the amino acids in the part of the somatostatin peptides according to the invention which is between and inclusive extending between the two Cys groups is the L-isomer wherein the amino acid has isomeric forms. Any amino acid containing the R group of the peptides according to the invention can either the L-isomer or the D-isomer, wherein the Amino acid has isomeric forms.

Die erfindungsgemäßen Somatostatinpeptide werden nach einem Fest-Phasenverfahren synthetisiert. Die Synthese wird stufenweise an chlormethyliertem Harz durchgeführt. Das Harz besteht aus feinen Kügelchen (20 bis 70/U Durchmesser) aus einem synthetischen Harz, hergestellt durch Copolymerisation von Styrol mit 1 bis 2% Divinylbenzol. Die Benzolringe in dem Harz werden in einer Friedel-Crafts-Reaktion mit Chlormethyl-methyläther und Zinn(IV)-chlorid chlormethyliert. Das so eingeführte Chlor ist eine reaktive benzylchloridartigeThe somatostatin peptides according to the invention are synthesized according to a solid phase process. The synthesis is carried out in stages on chloromethylated resin. The resin consists of fine spheres (20 to 70 / U diameter) made of a synthetic resin produced by copolymerizing styrene with 1 to 2% divinylbenzene. The benzene rings in the resin are chloromethylated in a Friedel-Crafts reaction with chloromethyl methyl ether and tin (IV) chloride. The chlorine so introduced is a reactive benzyl chloride type

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Bindung. Die Friedel-Crafts-Reaktion wird weitergeführt, bis das Harz 0,5 bis 2 mMol Chlor/g Harz enthält. In der Anmeldung und bei der folgenden Beschreibung der Synthese von Somatostatinpeptiden werden die Reagentien zuerst mit ihren chemischen Namen bezeichnet und dann wird ihre übliche Abkürzung in Klammern angegeben. Danach wird das Reagens durch die übliche Abkürzung bezeichnet.Binding. The Friedel-Crafts reaction is continued until the resin contains 0.5 to 2 mmol chlorine / g resin. In the registration and in the following description of the synthesis of somatostatin peptides, the reagents will be given first with their chemical names and then their usual abbreviation is given in brackets. After that the reagent denoted by the usual abbreviation.

Das Triäthylammoniumsalz des geschützten Cys wurde zu dem chlormethylierten Harz verestert, indem man in Äthanol während ungefähr- 48 Stunden am Rückfluß erwärmte. Die Aminogruppe von Cys wurde mit t-Butyloxycarbonyl (Boc) geschützt. Die S-Seitenkette von Cys wurde mit p-Methoxybenzyl(MeOBzI) geschützt. Benzyl (BzI) kann ebenfalls als S-Schutzgruppe verwendet werden.The triethylammonium salt of the protected Cys was esterified to the chloromethylated resin by standing in ethanol during refluxed for about 48 hours. The amino group of Cys was protected with t-butyloxycarbonyl (Boc). The S side chain of Cys was made with p-methoxybenzyl (MeOBzI) protected. Benzyl (BzI) can also be used as an S protecting group.

Nach der Abspaltung der Schutzgruppe und Neutralisation wurde das N -Boc-Derivat der nächsten Aminosäure, Ser, zusammen mit einem Kupplungsmittel, nämlich Dicyclohexylcarbodiimid (DCC),zugegeben. Die Seitenkette von Ser wird mit Benzyläther (OBzI) geschützt. Die Abspaltung der Schutzgruppe, die Neutralisation und die Zugabe nachfolgender Aminosäuren wird entsprechend dem folgenden Schema durchgeführt.After deprotection and neutralization, the N -Boc derivative of the next amino acid, Ser, was put together with a coupling agent, namely dicyclohexylcarbodiimide (DCC), added. The side chain of Ser is made with benzyl ether (OBzI) protected. The cleavage of the protective group, the neutralization and the addition of the following amino acids is carried out carried out according to the following scheme.

Schema zur Kupplung von Aminosäuren, ausgenommen Asn, bei der Synthese in fester Phase von SomatostatinScheme for coupling amino acids, excluding Asn, in the solid phase synthesis of somatostatin

Stufe Reagens und Verfahren Mischzeit . Min. Reagent stage and procedure Mix time. Min.

1 CH₂Cl waschen 80 ml (zweimal) 31 CH ₂ Cl wash 80 ml (twice) 3

2 Methanol(MeOH) waschen 30 ml (zweimal) 32 methanol (MeOH) wash 30 ml (twice) 3

3 CH₂Cl₂ waschen 80 ml (dreimal) 33 CH ₂ Cl ₂ wash 80 ml (three times) 3

h 50% Trifluoressigsäure(TFA) plus 5% 1,2-Äthan- h 50% trifluoroacetic acid (TFA) plus 5% 1,2-ethane

dithiol in CH₉Cl₉ 70 ml (zweimal) 10dithiol in CH ₉ Cl ₉ 70 ml (twice) 10

5 CH₂Cl₂ waschen 80 ml (zweimal) 35 CH ₂ Cl ₂ wash 80 ml (twice) 3

6 Triäthylamin (Et₃N) 12,5% in Dimethylformamid (DMF) 70 ml (zweimal) " 56 triethylamine (Et ₃ N) 12.5% in dimethylformamide (DMF) 70 ml (twice) "5

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Stufe Reagens und Verfahren Mischzeit Min. Level Reagent and Procedure Mixing Time Min.

7 MeOH waschen 40 ml (zweimal) 27 MeOH wash 40 ml (twice) 2

8 CH₂Cl₂ waschen 80 ml (dreimal) 38 CH ₂ Cl ₂ wash 80 ml (three times) 3

9 Boc-Aminosäure (10 mMol) in 30 ml DMF (einmal) plus Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) (10 mMol)9 Boc-amino acid (10 mmol) in 30 ml DMF (one time) plus dicyclohexylcarbodiimide (DCC) (10 mmol)

in DMF 30in DMF 30

10 MeOH waschen 40 ml (zweimal) 310 MeOH wash 40 ml (twice) 3

11 Et^N 12,5% in DMF 70 ml (einmal) 311 Et ^ N 12.5% in DMF 70 ml (once) 3

12 MeOH waschen 30 ml (zweimal) 312 MeOH wash 30 ml (twice) 3

13 CH₂Cl₂ waschen 80 ml (zweimal) 313 CH ₂ Cl ₂ wash 80 ml (twice) 3

Nach der Stufe 13 wird ein aliquoter Teil für einen Ninhydrinversuch entnommen. Wenn der Versuch negativ ist, wird zur Stufe 1 zurückgegangen, um mit der nächsten Aminosäure zu kuppeln. Wenn der Versuch positiv ist oder etwas positiv, wird zu den Stufen 9 bis 13 zurückgegangen. -After step 13, an aliquot is used for a ninhydrin experiment taken. If the test is negative, it goes back to step 1 to go to the next amino acid to couple. If the attempt is positive or somewhat positive, it goes back to levels 9 to 13. -

Das obige Schema wird verwendet, um jede der Aminosäuren des Somatostatinpeptids mit Cys mit Ausnahme von Asn zu kuppeln. Für Asn sind die Stufen 1 bis 8 gleich und das folgende Schema wird für den Rest der Kupplungsreaktion verwendet.The above scheme is used to couple each of the amino acids of the somatostatin peptide to Cys with the exception of Asn. For Asn, steps 1 to 8 are the same and the following scheme is used for the remainder of the coupling reaction.

Schema für die Boc-Asn-ONp-Kupplung bei der Synthese von Somatostatin in fester PhaseScheme for the Boc-Asn-ONp coupling in the synthesis of Solid phase somatostatin

9 DMF waschen 60 ml (dreimal) 39 DMF wash 60 ml (three times) 3

10 Boc-Asn-ONp (15 mMol) in 20 ml DMF (zweimal) 80010 Boc-Asn-ONp (15 mmol) in 20 ml DMF (twice) 800

11 MeOH waschen 30 ml (viermal) 311 MeOH wash 30 ml (four times) 3

12 Et₃N 12,5% in DMF 30 ml (zweimal) 312 Et ₃ N 12.5% in DMF 30 ml (twice) 3

13 MeOH waschen 30 ml (zweimal) 313 MeOH wash 30 ml (twice) 3

14 CH₂Cl₂ waschen 80 ml (dreimal) 314 CH ₂ Cl ₂ wash 80 ml (three times) 3

Nach der Stufe 14 wird ein aliquoter Teil für einen Ninhydrinversuch entnommen. Wenn der Test negativ ist, wird zur Stufe zurückgegangen, um die nächste Aminosäure zu kuppeln.WennAfter step 14, an aliquot is used for a ninhydrin experiment taken. If the test is negative, it goes back to the stage to couple the next amino acid. If

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der Test positiv ist oder etwas positiv, wird zu Stufe 9 bis 14 zurückgegangen.the test is positive or slightly positive, it goes back to levels 9-14.

N^a-Boc-Schutz wurde für jede der restlichen Aminosäuren während der ganzen Synthese verwendet. OBzI wird als Nebenkettenschutzgruppe für Ser und Thr verwendet. P-Nitrophenyl(ONp)-ester wird verwendet, um das Carboxylende von Asn zu aktivieren. O-Nitropheny.lester kann ebenfalls zu diesem Zweck verwendet werden. Benzyloxycarbonyl (Z) oder Benzyloxycarbonyl-2Cl [Z (2-Cl)] wird als Schutzgruppe für die Lys-Seitenkette verwendet. Die N^a-Schutzgruppe für die letzte Aminosäure, die auf das Peptid angewendet wird, kann ebenfalls eine Oxycarbonylgruppe sein wie Boc oder Z. Wenn die R-Gruppe des Peptids eine organische Säure ist, wird die organische Säure an das Peptid angebracht,, bevor das Peptid von dem Harz abgespalten wird. Die organische Säure wird an das Peptid auf dem Harz gebunden, indem man die organische Säure in Anwesenheit von DCC einführt. Die organische Säure kann ebenfalls zugegeben werden, indem man die organische Säure als !^-Schutzgruppe für die letzte zugefügte Aminosäure verwendet.N ^a -Boc protection was used for each of the remaining amino acids throughout the synthesis. OBzI is used as a side chain protecting group for Ser and Thr. P-nitrophenyl (ONp) ester is used to activate the carboxyl end of Asn. O-nitrophenyl ester can also be used for this purpose. Benzyloxycarbonyl (Z) or benzyloxycarbonyl-2Cl [Z (2-Cl)] is used as a protecting group for the Lys side chain. The N ^a protecting group for the last amino acid applied to the peptide can also be an oxycarbonyl group such as Boc or Z. When the R group of the peptide is an organic acid, the organic acid is attached to the peptide before the peptide is cleaved from the resin. The organic acid is bound to the peptide on the resin by introducing the organic acid in the presence of DCC. The organic acid can also be added using the organic acid as a protecting group for the last amino acid added.

Die Spaltung der Peptide von dem Harz und die Abspaltung der Schutzgruppe der Seitenkettenschutzgruppen des Peptids erfolgt mit Fluorwasserstoffsäure in Anwesenheit von 100 molarem Anisol. Nach der Eliminierung der Fluorwasserstoffsäure im Hochvakuum wird das Peptid mit Äther gewaschen und mit entgaster, verdünnter Essigsäure extrahiert. Die Lyophilisierung des Essigsäureextrakts ergibt ein farbloses, flockenartiges Material. Dieses Material wird in 2n Essigsäure in Anwesenheit von ß-Mercaptoäthanol der Gelfiltration unterworfen.Cleavage of the peptides from the resin and deprotection of the side chain protecting groups of the peptide takes place with hydrofluoric acid in the presence of 100 molar anisole. After the elimination of hydrofluoric acid im The peptide is washed with ether under high vacuum and extracted with degassed, dilute acetic acid. Lyophilization of the acetic acid extract gives a colorless, flaky material. This material is in 2N acetic acid in the presence of ß-mercaptoethanol subjected to gel filtration.

Der aktive Ester kann bei der Synthese in fester Phase verwendet werden, und die klassischen Syntheseverfahren können ebenfalls verwendet werden, um die erfindungsgemäßen Somatostatinpeptide herzustellen.The active ester can be used in the solid phase synthesis, and the classical synthetic methods can can also be used to make the somatostatin peptides of the invention to manufacture.

A09885/U73A09885 / U73

- ίο -- ίο -

Ein in vitro-Versuch für die Wirksamkeit von Somatostatinpeptiden wurde entwickelt. Der Versuch wird durchgeführt, indem man Hypophysedrüsen, die von Ratten entfernt wurden, behandelt, um die Zellen davon abzutrennen. Die Zellen v/erden in Kulturplatten in Dulbecco-modifziertem Eagle Medium (Dulbecco et al, Virology, Vol. 8, S. 396, 1949) gegeben. Kohlendioxydgas und Sauerstoff werden zu den Zellkulturen zugefügt, die bei 37°C während 4 bis 5 Tagen vor der Verwendung in dem Versuch gehalten werden. Nach den Medienänderungen werden die Zellkulturen während einer Zeit von 4 Stunden inkubiert und besondere Somatostatinpeptide werden zugegeben. Die Radioimmunoversuchsanalyse wird verwendet, um die Geschwindigkeit der Wachstumshormonabsonderung zu bestimmen, die in Nanogram pro Stunde angegeben wird. Die Ergebnisse für verschiedene Somatostatinmaterialien werden in der folgenden Tabelle I aufgeführt.An in vitro test for the effectiveness of somatostatin peptides was developed. The experiment is carried out by treating pituitary glands removed from rats to separate cells therefrom. Ground the cells placed in culture plates in Dulbecco-modified Eagle medium (Dulbecco et al, Virology, Vol. 8, p. 396, 1949). Carbon dioxide gas and oxygen are added to the cell cultures, which are kept at 37 ° C for 4 to 5 days before use be kept in the attempt. After the media changes, the cell cultures are kept for a period of 4 hours incubated and special somatostatin peptides are added. Radioimmuno assay analysis is used to determine the rate of growth hormone secretion, which is given in nanograms per hour. The results for various somatostatin materials are given in the following Table I listed.

Table I.

Wirkungen von Schafshypothalamusextrakten und Somatostatinpeptiden auf die Sekretion von Wachstumshormon in Rattenhypophysezellen in monoschichtigen Kulturen; N = Anzahl der Zellkulturschalen, rGH = Rattenwachstumshormon durch Radioimmunitätsversuch Effects of sheep hypothalamic extracts and somatostatin peptides on growth hormone secretion in rat pituitary cells in monolayer cultures; N = number of Cell culture dishes, rGH = rat growth hormone by radioimmunity test

SomatostatinmaterialSomatostatin material Verwendete MengeAmount used IlIl NN rGHrGH (ng/h)(ng / h) Vergleich (kein Somato
statinmaterial )Comparison (no somato
statin material) ItIt 44th 421,7421.7 + 49,1+ 49.1 hypothalam.Extrakthypothalamic extract IlIl 33 231JO231JO + 13,6+ 13.6 η ηη η 0,001 Fragment/ml0.001 fragment / ml ItIt 33 118,7118.7 + 15,8+ 15.8 ti ηti η 0,010.01 titi 33 91,391.3 + 9,9+ 9.9 It HIt H 0,10.1 55 190,7190.7 + 23,4+ 23.4 It IlIt Il 0,0020.002 33 120,0120.0 + 22,7+ 22.7 η πη π 0,10.1 33 50,750.7 + 16,4+ 16.4 überbrücktes Somato-
statinpeptid, worin
R H-Ala-Gly bedeutetbridged somato-
statin peptide, wherein
R means H-Ala-Gly 0,50.5 33 304,0304.0 + 45,5+ 45.5 0,2 nM0.2 nM

409885/1473409885/1473

243T776243T776

Table I continued

Somatostatinmaterial Verwendete Menge N rGH (ng/h)Somatostatin material Amount used N rGH (ng / h)

überbrücktes Soraatostatinpeptid,worin Rbridged soraatostatin peptide wherein R

H-Ala-Gly bedeutetH-Ala-Gly means 1,01.0 nMnM IlIl 5,05.0 nMnM IlIl 25,025.0 nMnM lineares Somatostatin-
peptid,worin R H-AIa-
GIy bedeutetlinear somatostatin
peptide in which R H-AIa-
GIy means 0,20.2 nMnM HH 1,01.0 nMnM IlIl 5,05.0 nMnM IlIl 25,025.0 nMnM IlIl 3,33.3 /UM/AROUND

33 210,7 +210.7 + 17,017.0 33 70,7 +70.7 + 16,816.8 44th 52,5 +52.5 + 2,42.4 33 420,0 +420.0 + 23,123.1 44th 205,0 +205.0 + 23,823.8 33 110,0 +110.0 + 5,85.8 33 100,0 +100.0 + 6,16.1 33 29,3 +29.3 + 14,614.6

Der hypothalamische Extrakt wird durch Extraktion von Schafshypothalarausfragmenten mit einem System erhalten, welches Chloroform - Äthanol - Eisessig - Wasser in einem Gewichts verhältnis von 100:810:5:90 enthält. Die verwendete Menge an hypothalamischem Extrakt ist auf eine Einheit bezogen, die dem Somatostatinmaterial entspricht, welches potentiell aus einem einfachen hypothalamischen Fragment extrahiert werden kann.The hypothalamic extract is obtained by extracting sheep hypothalamic fragments with a system which Chloroform - ethanol - glacial acetic acid - water in one weight contains a ratio of 100: 810: 5:90. The amount of hypothalamic extract used is based on one unit, which corresponds to the somatostatin material, which potentially consists of a simple hypothalamic fragment can be extracted.

Die Ergebnisse zeigen eine konsistente Inhibierung der Sekretion von Wachstumshormon der Hypophysemonoschichtkulturen durch die Somatostatinmaterialien, wie in Tabelle I beschrieben. The results show consistent inhibition of growth hormone secretion from pituitary monolayer cultures by the somatostatin materials as described in Table I.

Ein synthetisch gebildetes lineares Somatostatinpeptid wurde verwendet, um die Wirksamkeit des Peptids bei der Inhibierung der Sekretion von Wachstumshormon in Ratten zu bestimmen. Das Somatostatinpeptid hatte die folgende Struktur:A synthetically formed linear somatostatin peptide was used used to determine the effectiveness of the peptide in inhibiting growth hormone secretion in rats. The somatostatin peptide had the following structure:

H-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OHH-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH

409885/ 147 3409885/147 3

Um die Lenksamkeit und Genauigkeit der Ergebnisse in den Vergleichsratten und jenen, die mit Peptid injiziert waren, sicherzustellen, wurden allen Ratten drei Tage vor dem Versuchen 0,5 ml Salzlösung injiziert. Jede der Ratten wurde von der gleichen Person injiziert und einige Minuten in der Hand gehalten, um sie zu beruhigen. Am dritten Tag wurden neun Ratten mit 0,5 ml Salzlösung und 36 Ratten mit verschiedenen Mengen an Somatostatinpeptid injiziert. 15 Minuten nach der Injektion wurden die Ratten getötet und Blutproben wurden entnommen. Die Blutproben wurden auf die Anwesenheit von Wachstumshormon untersucht und die Ergebnisse sind in der Folgenden Tabelle II aufgeführt.To improve the manageability and accuracy of the results in the control rats and those injected with peptide, To ensure that all rats were injected with 0.5 ml of saline three days prior to testing. Each of the rats was injected by the same person and held in hand for a few minutes to calm them down. On the third day were nine rats were injected with 0.5 ml of saline and 36 rats were injected with various amounts of somatostatin peptide. 15 minutes after the injection, the rats were sacrificed and blood samples were drawn. The blood samples were checked for presence of growth hormone and the results are shown in Table II below.

Table II

Injektioninjection

Anzahl der
Rattennumber of
Rats

GH/ml Serum in ng/mlGH / ml serum in ng / ml

SalzlösungSaline solution

0,4/Ug Somatostatinpeptid0.4 / Ug somatostatin peptide

2,0 » "
10,0 " "
50,0 " "2.0 »"
10.0 ""
50.0 ""

91,6 + 10,2 57,9 + 8,9 38,6 + 7,3 15,9 + 2,9 12,9 + 3,691.6 + 10.2 57.9 + 8.9 38.6 + 7.3 15.9 + 2.9 12.9 + 3.6

Ein synthetisch gebildetes Somatostatinpeptid entsprechend der folgenden Struktur wurde verwendet, um die Wirksamkeit des Peptids im Menschen zu untersuchen:A synthetically formed somatostatin peptide according to the following structure was used in order to determine the effectiveness to study the peptide in humans:

Da die Sekretionsrate von Wachstumshormon bei Menschen sehr niedrig ist, wurde zuerst eine Sekretionsrate von Wachstumshormon in jedem Subjekt stimuliert. Die erhöhte Sekretionsrate von Wachstumshormon wurde entweder durch orale Verabreichung an das Subjekt von 0,5 g L-Dopa oder durch Infusion (entweder direkt oder indirekt), von 0,5 g Aminosäure Arginin pro kg Körpergewicht in den Blutstrom des Subjekts im VerlaufSince the secretion rate of growth hormone is very low in humans, a secretion rate of growth hormone was first established stimulated in every subject. The increased secretion rate of growth hormone was either due to oral administration to the subject of 0.5 g of L-dopa or, by infusion (either direct or indirect), of 0.5 g of the amino acid arginine per kg of body weight into the subject's bloodstream over the course of time

409885/U73409885 / U73

einer halben Stunde induziert. Beide Verfahren sind annehmbare chemische Verfahren, um eine erhöhte Sekretion an Wachstumshormon in Tieren zu ergeben. Die Wirkung der Verabreichung von L-Dopa oder der Infusion von Arginin bei jedem Subjekt wurde im Verlauf von 3 Stunden bestimmt. Anschließend wurde an einem anderen Tag, beginnend zur Zeit Null, L-Dopa verabreicht oder Arginin dem Subjekt durch Infusion verabreicht. Ebenfalls beginnend -mit der Zeit Null wurden 250/ug des Somatostatinpeptids intravenös dem Subjekt injiziert. Eine weitere Menge an Somatostatinpeptid wurde einheitlich im Verlauf von 30 Minuten oder 1 Stunde dem Subjekt eingeflößt, beginnend zur Zeit Null im Falle von L-Dopa und beginnend 30 Minuten im Falle von Arginin. Die Rate der Wachstumshormonsekretion wurde wieder während einer 3stündigen Zeit gemessen. Die Versuchsbedingungen im Hinblick auf die neun Subjekte werden in der folgenden Tabelle III aufgeführt.half an hour. Both methods are acceptable chemical methods to increase secretion of growth hormone to surrender in animals. The effect of the administration of L-dopa or the infusion of arginine on each subject was determined over the course of 3 hours. Subsequently, L-dopa was administered on another day, beginning at time zero or arginine administered to the subject by infusion. Also starting at time zero, became 250 / ug of the somatostatin peptide injected intravenously into the subject. Another amount of somatostatin peptide became uniform over the course of Instilled into the subject for 30 minutes or 1 hour, starting at time zero in the case of L-Dopa and starting 30 minutes in the case of arginine. The rate of growth hormone secretion was again measured over a 3 hour period. the Experimental conditions with respect to the nine subjects are shown in Table III below.

Table III

Subjekt Wachstums- Verwendete Injizierte Menge Menge an ver-Subject Growth Used Injected Amount Amount of Consumed

Nr. hormon- Menge an an Somatostatin- abreichtemNo hormonal amount of somatostatin delivered

Stimulans Wachstums- peptid, intra- SomatostatinStimulant growth peptide, intrasomatostatin

hormon- venös zum Zeit- /ughormonal venous at the time / ug

L-DopaL-dopa Stimulans punktStimulant point Null, /UffZero, / Uff 500500 11 ArgininArginine 0,5 g0.5 g 250250 500500 22 L-DopaL-dopa 0,5 g/kg
Körpergewicht0.5 g / kg
body weight 250250 250250 33 ArgininArginine 0,5 g0.5 g 250250 250250 44th L-DopaL-dopa 0,5 g/kg Kör
pergewicht0.5 g / kg body
per weight 250250 500500 55 L-DopaL-dopa 0,5 g0.5 g 250250 500500 66th ArgininArginine 0,5 g0.5 g 250250 500500 77th ArgininArginine 0,5 g/kg Kör
pergewicht0.5 g / kg body
per weight 250250 500500 88th ArgininArginine IlIl 250250 500500 99 ItIt 250250

Die Wirkung auf die Sekretionsgeschwindigkeit von Wachstumshormon auf das Subjekt durch das Wachstumshormonstimulans istThe effect on the rate of secretion of growth hormone on the subject by the growth hormone stimulant is

409885/U73 '409885 / U73 '

in den Fig. 1a und 2a für L-Dopa und Arginin dargestellt, dies ist ein Vergleich. Die inhibierende Wirkung auf die Geschwindigkeit der Sekretion des Wachstumshormons durch Somatostatinpeptid ist graphisch in den Fig. 1b und 2b für L-Dopa und Arginin dargestellt. Die graphischen Darstellungen zeigen den mittleren + Standardfehler der verschiedenen bestimmten Metameter. Jeder Punkt entspricht vier menschlichen Subjekten im Falle von L-Dopa und vier menschlichen Subjekten im Falle von Arginin.shown in FIGS. 1a and 2a for L-dopa and arginine, this is a comparison. The inhibiting effect on speed the secretion of growth hormone by somatostatin peptide is graphically shown in Figures 1b and 2b for L-dopa and arginine shown. The graphs show the mean + standard error of the various certain metameter. Each point corresponds to four human ones Subjects in the case of L-dopa and four human subjects in the case of arginine.

Die klinische Bedeutung der erfindungsgemäßen Somatostatinpeptide ist leicht für die Behandlung von irgendwelchen Abnormalitäten erkennbar, bei denen eine erhöhte Menge Wachstumshormon abgeschieden wird. Man nimmt insbesondere an, daß die erfindungsgemäßen Somatostatinpeptide wertvoll bei der Behandlung von Akromegalie und bei der Behandlung von Diabetes sind, im letzteren Fall würde entweder Somatostatin allein oder zusammen mit Insulin verabreicht werden. Es wurde weiterhin gefunden, daß die erfindungsgemäßen Somatostatinpeptide wirksam sind, um die Sekretion von Schilddrüsestimulierendem Hormon durch die Hypophysedrüse zu inhibieren, und man nimmt an, daß sie von therapeutischem Wert für Patienten sind, die eine Krankheit oder eine Störung besitzen, wobei eine erhöhte Sekretion von Thyrotropin auftritt (ebenfalls bekannt als Schilddrüse-stimulierendes Hormoi}.The clinical importance of the somatostatin peptides according to the invention is easy for the treatment of any abnormalities recognizable, in which an increased amount of growth hormone is secreted. In particular, it is believed that the somatostatin peptides of the invention are valuable in When treating acromegaly and when treating diabetes, either would use somatostatin alone in the latter case or given with insulin. It was also found that the somatostatin peptides according to the invention are effective to inhibit the secretion of thyroid stimulating hormone by the pituitary gland, and are believed to be of therapeutic value to patients who have a disease or disorder, with increased secretion of thyrotropin (also known as thyroid-stimulating Hormoi}.

Die Fähigkeit der erfindungsgemäßen Somatostatinpeptide, die TSH-Sekretion zu inhibieren, wird in dem folgenden Beispiel erläutert. Es ist bekannt, daß ein Schilddrüse-stimulierendes Hormon (TSH) in höheren als den üblichen Werten freigesetzt werden"kann durch einen Schilddrüse-stimulierenden Hormonabgabefaktor (TRF). Die Struktur von TRF wird in Nature, Vol. 226, Seiten 321 bis 325, 1970, beschrieben. In einer Reihe von Versuchen injizierte man anaesthesierten Ratten verschiedene Mengen an TRF und TRF in Kombination mit einemThe ability of the somatostatin peptides of the invention to inhibit TSH secretion is demonstrated in the following example explained. It is known that a thyroid stimulating hormone (TSH) is released in higher than usual levels may be due to a thyroid-stimulating hormone release factor (TRF). The structure of TRF is described in Nature, Vol. 226, pp. 321-325, 1970. In a In a series of experiments, anesthetized rats were injected with various amounts of TRF and TRF in combination with one

409885/1473 *409885/1473 *

erfindungsgemäßen Somatostatinpeptid. Das Somatostatinpeptid besitzt die folgende Struktur:somatostatin peptide of the invention. The somatostatin peptide has the following structure:

5 Minuten nach der Injektion wurde eine Blutprobe entnommen und die Probe wurde auf TSH nach einem Radioimmunitätsversuch untersucht, vgl. beispielsweise Endocrinology, Vol. 91, Nr. 4, Seiten 1045 bis 1053, 1972. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle IV aufgeführt.A blood sample was drawn 5 minutes after the injection and the sample was tested for TSH after a radioimmunity assay investigated, see for example Endocrinology, Vol. 91, No. 4, pages 1045 to 1053, 1972. The results are shown in Table IV below.

Table IV

Injektion Anzahl der ng.TSH/mlInjection Number of ng.TSH / ml

Tiere PlasmaAnimals plasma

1 Kontrolle mit Salzlösung (0,5 ml) 5 0,605 + 0,0551 control with saline solution (0.5 ml) 5 0.605 + 0.055

2 13,3 g TRF 5 1,831 + 0,1782 13.3 g TRF 5 1.831 + 0.178

3 40 ng TRF 5 3,615 + 0,2233 40 ng TRF 5 3.615 + 0.223

4 120 ng TRF 5 6,215 + 0,9194 120 ng TRF 5 6.215 + 0.919

5 120 ng TRF + 300 ng Somatostatin- 5 5,168 + 0,4625 120 ng TRF + 300 ng somatostatin- 5 5.168 + 0.462

peptid ~peptide ~

6 120 ng TRF + 1/Ug " 5 4,128 + 0,7416 120 ng TRF + 1 / Ug "5 4.128 + 0.741

7 120 ng TRF + 10 /Ug " 5 2,054 + 0,304 Mehrfachbereichsversuch von Duncan: 4 vs 5 ^ 0,05; 4 vs 6 > 0,01; 4 vs 7 >0,01.7 120 ng TRF + 10 / Ug "5 2.054 + 0.304 Duncan's multiple range test: 4 vs 5 ^ 0.05; 4 vs 6 > 0.01; 4 vs 7> 0.01.

409885/ 14 7409885/14 7

Claims

1. Compound capable of secretion of
Inhibiting growth hormone in mammals, the compound being characterized as being a peptide

of the following formulas

ι ; ^: ιι; ^: ι

R-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH and

R-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH

is where R is an acylating agent or hydrogen.

2. A compound according to claim 1, characterized in that R is an acylating agent selected from the following Group: amino acids, dipeptides, tripeptides and aliphatic, aromatic and cyclic organic acids with

1 to 10 carbon atoms.

3 · Connection according to claim 2, characterized in that that R is an amino acid.

4. A compound according to claim 2, characterized in that R is a dipeptide.

5. A compound according to claim 2, characterized in that R is a tripeptide.

6. A compound according to claim 2, characterized in that R is an aliphatic organic acid having 1 to 10 carbon atoms means.

7. Compound according to Claim 2, characterized in that R is an aromatic acid having 1 to 10 carbon atoms
means.

409885/1 473

8. A compound according to claim 2, characterized in that R is a cyclic organic acid having 1 to 10 carbon atoms means.

9 · Connection according to claim 1, characterized in that that R is selected from the following group: GIy, AIa, Ala-Gly, Acetyl-Ala-Gly, Tyr-Gly, Sarc-Gly, Tyr-Ala-Gly, Ala-Tyr-Gly, Acetyl, Acrylic, Pivalyl and Benzoyl.

10. A compound according to claim 9, characterized in that that R means GIy,

11. A compound according to claim 9 »characterized in that R Ala.

12. A compound according to claim 9 »characterized in that R is Ala-Gly.

13. A compound according to claim 9 »characterized in that that R is acetyl-Ala-Gly,

14. A compound according to claim 9 »characterized in that R is Tyr-Gly.

15 · Compound according to claim 9, characterized in that R is Sarc-Gly.

16. A compound according to claim 9 »characterized in that R is Tyr-Ala-Gly.

17 · Compound according to claim 9, characterized in that R is Ala-Tyr-Gly.

18. A compound according to claim 9, characterized in that R is acetyl.

4 09885 / U73

19. A compound according to claim 9, characterized in that R is acrylic.

20. A compound according to claim 9, characterized in that R is pivalyl.

'21. Compound according to Claim 9, characterized in that R is benzoyl.

22. Procedure to increase the secretion of growth hormone
to inhibit in mammals, characterized in that
an effective amount of a peptide of the following formulas is introduced directly or indirectly into the bloodstream of the mammal

I II I

R-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH and

R-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH ^%

introduces, wherein R is an acylating agent or hydrogen.

23. The method according to claim 22, characterized in that R is an acylating agent such as amino acids, dipeptides, tripeptides and means aliphatic, aromatic and cyclic organic acids having 1 to 10 carbon atoms.

24. The method according to claim 23, characterized in that R is an amino acid.

25. The method according to claim 23, characterized in that that R is a dipeptide.

26. The method according to claim 23, characterized in that R is a tripeptide.

27. The method according to claim 23, characterized in that R is an aliphatic organic acid having 1 to 10 carbon atoms means.

409885/U73409885 / U73

28. The method according to claim 23, characterized in that R is an aromatic acid having 1 to 10 carbon atoms
means.

29. The method according to claim 23, characterized in that R is a cyclic organic acid having 1 to 10 carbon atoms means.

30. The method according to claim 22, characterized in that R GIy, Ala, Ala-Gly, Acetyl-Ala-Gly, Tyr-Gly, Sarc-Gly,
Tyr-Ala-Gly, JAla-Tyr-Gly, acetyl, acrylic, pivalyl and benzoyl
means.

31. The method according to claim 30, characterized in that R is GIy.

32. The method according to claim 30, characterized in that R denotes Ala.

33 · The method according to claim 30 ", characterized in that that R means Ala-Gly.

34. The method according to claim 30, characterized in that R is acetyl-Ala-Gly.

35 · The method according to claim 30, characterized in that that R is Tyr-Gly.

36. The method according to claim 30, characterized in that R is Sarc-Gly.

37. The method according to claim 30, characterized in that that R is Tyr-Ala-Gly.

38. The method according to claim 30, characterized in that R is Ala-Tyr-Gly.

409885/1473

39. The method according to claim 30, characterized in that R is acetyl.

40. The method according to claim 30, characterized in that that R means acrylic.

41. The method according to claim 30, characterized in that R is pivalyl.

42. The method according to claim 30, characterized in that R is benzoyl.

43. Procedure to stimulate the release of thyroid gland To inhibit hormone in mammals, characterized in that one enters directly or indirectly into the bloodstream of mammals, an effective amount of a peptide of the formulas

I II I

R-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH and R-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH

wherein R is an acylating agent or hydrogen.

44. The method according to claim 43, characterized in that R is an acylating agent such as amino acids, dipeptides, tripeptides and means aliphatic, aromatic and cyclic organic acids having 1 to 10 carbon atoms.

45. The method according to claim 44, characterized in that that R is an amino acid.

46. The method according to claim 44, characterized in that R is a dipeptide.

47. The method according to claim 44, characterized in that R is a tripeptide.

409885/U73 '409885 / U73 '

48. The method according to claim 44, characterized in that R is an aliphatic organic acid having 1 to 10 carbon atoms means.

49. The method according to claim 44, characterized in that R is an aromatic acid having 1 to 10 carbon atoms
means.

50. The method according to claim 44, characterized in that R is a cyclic organic acid having 1 to 10 carbon atoms means.

51. The method according to claim 43, characterized in that

that R GIy, Ala, Ala-Gly, Acetyl-Ala-Gly, Tyr-Gly, Sarc-Gly,
Tyr-Ala-Gly, Ala-Tyr-Gly, · acetyl, acrylic, pivalyl and
Means benzoyl.

52. The method according to claim 51, characterized in that R denotes GIy.

53. The method according to claim 51, characterized in that R denotes Ala.

54. The method according to claim 51, characterized in that R is Ala-Gly.

55 · The method according to claim 51, characterized in that that R is acetyl-Ala-Gly.

56. The method according to claim 51, characterized in that R is Tyr-Gly.

57. The method according to claim 51, characterized in that that R is Sarc-Gly.

4 09885/U734 09885 / U73

58. The method according to claim 51, characterized in that that R is Tyr-Ala-Gly.

59 · The method according to claim 51, characterized in that that R means Ala-Tyr-Gly.

60. The method according to claim 51, characterized in that that R is acetyl.

61. The method according to claim 51, characterized in that R is acrylic.

62. The method according to claim 51, characterized in that R is pivalyl.

63 · The method according to claim 51, characterized in that that R is benzoyl.

64. Unit dose of a peptide with pharmaceutical
Utility characterized by a pharmaceutically active carrier and a peptide of the formulas

ι: '■ ι

R-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH and
R-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH
wherein R is an acylating agent or hydrogen.

65. Dosage unit according to claim 64, characterized in that R is an acylating agent such as amino acids, dipeptides,
Means tripeptides and aliphatic, aromatic and cyclic organic acids having 1 to 10 carbon atoms.

66. Dosage unit according to claim 65, characterized in that R denotes an amino acid.

409885/U73409885 / U73

67 · Dose unit according to claim 65, characterized in that that R is a dipeptide.

68. Dosage unit according to claim 65, characterized in that R denotes a tripeptide.

69. Dosage unit according to claim 65, characterized in that R is an aliphatic organic acid having 1 to 10 carbon atoms means.

70. DC'Sis unit according to claim 65, characterized in that R e: .ne aromatic acid with 1 to 10 carbon atoms means.

71. Dose unit according to claim 65, characterized in that that R is a cyclic organic acid having 1 to 10 carbon atoms.

72. Dosage unit according to claim 64, characterized in that R GIy, AIa, Ala-Gly, Acetyl-Ala-Gly, Tyr-Gly, Sarc-GIy, Tyr-Ala-Gly, Ala-Tyr-Gly, acetyl, acrylic, Plvalyl and
Means benzoyl.

73 · Dose unit according to claim 72, characterized in that that R means GIy.

74. Dose unit according to claim 72, characterized in that that R AIa means

75. Dosage unit according to claim 72, characterized in that R denotes Ala-Gly.

76. Dosage unit according to claim 72, characterized in that R is acetyl-Ala-Gly.

409885 / U73

77. Dosage unit according to claim 72, characterized in that R is Tyr-Gly.

78. Dose unit according to claim 72, characterized in that that R means Sarc-Gly '.

79 · Dose unit according to claim 72, characterized in that that R means Tyr-Ala-G'ly.

80. Dose unit according to claim 72, characterized in that that R means Ala-Tyr-Gly.

81. Dose unit according to claim 72, characterized in that that R is acetyl.

82. Dosage unit according to claim 72, characterized in that R is acrylic.

83. Dosage unit according to claim 72, characterized in that R is pivalyl.

84. Dosage unit according to claim 72, characterized in that R is benzoyl.

85. Intermediate suitable for the preparation of peptides with pharmaceutical activity, wherein the intermediate is characterized by a peptide coupled to a resin, and wherein the intermediate has the structure
Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys resin.

86. Intermediate product according to claim 85, characterized in that it has an acylating agent or hydrogen thereon contains coupled.

87. Intermediate product according to claim 86, characterized in that the acylating agent is selected from

409885 / U73

Group: Amino acids, dipeptides, tripeptides and aliphatic, aromatic and cyclic organic acids with 1 to 10 carbon atoms.

88. Intermediate product according to claim 87 »characterized in that that the acylating agent is an amino acid.

89 Intermediate product according to Claim 87, characterized in that that the acylating agent is a dipeptide.

90. Intermediate product according to claim 87, characterized in that the acylating agent is a tripeptide.

91 · Intermediate product according to claim 87, characterized in that the acylating agent is an aliphatic organic Is acid of 1 to 10 carbon atoms.

92. Intermediate product according to claim 87, characterized in that the acylating agent is an aromatic acid having 1 to 10 carbon atoms.

93. Intermediate product according to claim 87, characterized in that the acylating agent is a cyclic organic Is acid of 1 to 10 carbon atoms.

94. Intermediate product according to Claim 87, characterized in that that the acylating agent is selected from the following group: GIy, AIa, Ala-Gly, Acetyl-Ala-Gly, Tyr-Gly, Sarc-Gly, Tyr-Ala-Gly, Ala-Tyr-Gly, Acetyl, Acryl, Pivalyl and benzoyl.

95. Intermediate product according to Claim 94, characterized in that that the acylating agent is GIy.

96. Intermediate product according to claim 94, characterized in that the acylating agent is AIa.

A09885 / U73

97. Intermediate product according to claim 94, characterized in that the acylating agent is Ala-Gly.

98. Intermediate product according to Claim 94, characterized in that that the acylating agent is Acetyl-Ala-Gly.

99 · Intermediate product according to claim 94, characterized in that the acylating agent is Tyr-Gly.

100. Intermediate product according to claim 94, characterized in that the acylating agent is Sarc-Gly.

101. Intermediate product according to Claim 94, characterized in that that the acylating agent is Tyr-Ala-Gly.

102. Intermediate product according to claim 94, characterized in that the acylating agent is Ala-Tyr-Gly.

103. Intermediate product according to claim 94, characterized in that the acylating agent is acetyl.

104. Intermediate product according to claim 94, characterized in that the acylating agent is acrylic.

105. Intermediate product according to Claim 94, characterized in that that the acylating agent is pivalyl.

106. Intermediate product according to claim 94, characterized in that the acylating agent is benzoyl.

107 · Process for the production of a pharmaceutically valuable peptide, characterized in that an ester of an N ^a -protected Cys-amino acid and a chloromethylated resin is formed and the protective group is split off from the Cys-amino acid and N ^a -protected amino acids are gradually coupled with Cys, wherein a peptide coupled to the resin with the

409885/14 73409885/14 73

Structure R-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-. Ser-Cys resin is formed where R is an acylating agent or hydrogen.

108. The method according to claim 107, characterized in that R is an acylating agent such as amino acids, dipeptides, Means tripeptides and aliphatic, aromatic and cyclic organic acids having 1 to 10 carbon atoms.

109. The method according to claim 108, characterized in that

that R is an amino acid.

I \

110. The method according to claim 108, characterized in that that R is a dipeptide.

111. The method according to claim 108, characterized in that R is a tripeptide.

112. The method according to claim 108, characterized in that R is an aliphatic organic acid having 1 to 10 carbon atoms means.

113. The method according to claim 108, characterized in that that R is an aromatic acid having 1 to 10 carbon atoms.

114. The method according to claim 108, characterized in that that R is a cyclic organic acid having 1 to 10 carbon atoms.

115. The method according to claim 107, characterized in that R GIy, AIa, Ala-Gly, Acetyl-Ala-Gly, Tyr-Gly, Sarc-Gly, Tyr-Ala-Gly, Ala-Tyr-Gly, acetyl, acrylic, pivalyl and benzoyl means.

409885/1473

116. The method according to claim 115, characterized in that that R means GIy.

117 · The method according to claim 115, characterized in that that R Ala means ..

118. The method according to claim 115, characterized in that that R means Ala-Gly.

119 · The method according to claim 115, characterized in that R denotes acetyl-JLla-Gly.

120. The method according to claim 115, characterized in that that R is Tyr-Gly.

121. "The method according to claim 115, characterized in that that R is Sarc-Gly.

122. The method according to claim 115, characterized in that that R is Tyr-Ala-Gly.

123. The method according to claim 115, characterized in that that R means Ala-Tyr-Gly.

124. The method according to claim 115, characterized in that R is acetyl. "

125. The method according to claim 115, characterized in that that R means acrylic. . :

126. The method according to claim 115, characterized in that that R is pivalyl.

127. The method according to claim 115, characterized in that that R is benzoyl. ....;

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