DE19741084A1

DE19741084A1 - New library of chemically modified nucleic acid molecules

Info

Publication number: DE19741084A1
Application number: DE19741084A
Authority: DE
Inventors: Stefan Woelfl; Marian Kujau
Original assignee: Hans Knoell Institut fuer Naturstoffforschung
Current assignee: Hans Knoell Institut fuer Naturstoffforschung
Priority date: 1997-09-18
Filing date: 1997-09-18
Publication date: 1999-03-25
Also published as: WO1999014355A3; WO1999014355A2

Abstract

A library of chemically modified nucleic acid molecules is new. They have a high-affinity selectivity for nucleic acid ligands that recognise target molecules comprising molecules in which the pyrimidine nucleotides have 2'-amino groups of which a few of the internal pyrimidine nucleotides are coupled to functional groups. Also claimed are high-affinity nucleic acid molecules obtainable by enrichment from the above library.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Einfügung funktioneller Gruppen in kombinatorische Nukleinsäure-Bibliotheken. Die so modifizierten Nukleinsäuremoleküle erhalten dadurch zusätzliche Eigenschaften, die die Erkennung von bestimmten Zielmolekülen oder komplexen molekularen Zielstrukturen erleichtern. Diese neuartige Modifikation ermöglicht insbesondere die Bindung an Zielmoleküle, die sonst nicht oder nur bedingt von Nukleinsäuremolekülen gebunden werden können.The invention relates to a method for inserting functional groups in combinatorial nucleic acid libraries. The so modified This gives nucleic acid molecules additional properties that the Detection of certain target molecules or complex molecular ones Facilitate target structures. This new modification enables in particular the binding to target molecules that would otherwise not or only to a limited extent can be bound by nucleic acid molecules.

State of the art

In vitro Selektion von Nukleinsäure-Aptameren verbindet die Möglichkeiten, die die kombinatorischer Synthese und die enzymatische Amplifizierbarkeit von Nukleinsäuremolekülen bieten, um aus einer großen Bibliothek von Nukleinsäureoligomeren Moleküle zu selektionieren, die spezifisch an Targetmoleküle binden. Diese Methode, die oft auch als SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment, Tuerk und Gold, 1990; Überblick in Osborne und Ellington, 1997) bezeichnet wird, bietet die Möglichkeit, positive und negative Selektionsschritte zu kombinieren, um Nukleinsäuremoleküle mit der gewünschten Eigenschaft anzureichern und zu isolieren [vgl. auch US 5,475,096; US 5,270,163; US 5,582,981].In vitro selection of nucleic acid aptamers combines the possibilities that the combinatorial synthesis and the enzymatic amplifiability of Nucleic acid molecules provide order from a large library of To select nucleic acid oligomeric molecules that specifically target Bind target molecules. This method, often called SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment, Tuerk and Gold, 1990; Overview in Osborne and Ellington, 1997), offers the Possibility to combine positive and negative selection steps to Enrich and add nucleic acid molecules with the desired property isolate [cf. also US 5,475,096; US 5,270,163; US 5,582,981].

Mit dieser Methode wurden unter anderem erfolgreich Nukleinsäure-Aptamere isoliert, die an Zielmoleküle (Targetmoleküle) binden, wie solche mit niedrigem Molekulargewicht, z. B. Cibacron blue (Ellington und Szostak, 1990), ATP (Sassanfar und Szostak, 1993), Theophillin (Jenison et al. 1994) oder Arginin (Burgstaller et al. 1995; Geiger et al. 1996), oder auch biologische Makromoleküle, z. B. Thrombin (Bock et al. 1992), HIV Rev Protein (Giver et al. 1993) oder vasodermal endothelial growth factor (VEGF; Jellinek et al. 1994) (siehe Abb. 1).With this method, inter alia, nucleic acid aptamers which bind to target molecules (target molecules), such as those with a low molecular weight, e.g. B. Cibacron blue (Ellington and Szostak, 1990), ATP (Sassanfar and Szostak, 1993), Theophillin (Jenison et al. 1994) or Arginin (Burgstaller et al. 1995; Geiger et al. 1996), or also biological macromolecules, e.g. B. Thrombin (Bock et al. 1992), HIV Rev Protein (Giver et al. 1993) or vasodermal endothelial growth factor (VEGF; Jellinek et al. 1994) (see Fig. 1).

Die Möglichkeiten für den Einsatz dieses Verfahrens werden im wesentlichen durch zwei Faktoren eingeschränkt: durch die Stabilität der Nukleinsäuremoleküle insbesondere in biologischen Flüssigkeiten und durch den Mangel an funktionellen Gruppen, wie z. B. lipophilen Seitenketten, in den Nukleinsäuren, die daher nur begrenzt Möglichkeiten zur Bindung an lipophile Domänen (Oberflächen) von anderen Molekülen aufweisen. Die Stabilität der Nukleinsäuren kann durch verschiedene Maßnahmen erhöht werden. So wurden in den letzten Jahren eine Reihe von Nukleinsäuremodifikationen entwickelt, die alle im wesentlichen auf einer chemischen Veränderung der Zucker-Phosphat-Kette beruhen. Erhöhte Resistenz gegen Degradation wird durch Verwendung von Phosphorothioaten oder 2'-Amino-, 2'-Fluoro- und 2'-O- Methyl-Zuckern erhalten (Heidenreich et al. 1993). Für die Verwendung zur in vitro Selektion ist es erforderlich, daß die Modifikationen mit den Reaktionen des Selektionsprozesses kompatibel sind. Dies ist z. B. bei der Verwendung von 2-Aminopyrimidin-Nukleotiden gegeben. Der Einbau durch enzymatische Synthese kann ebenso erfolgen wie die Amplifikation der 2'-Amino-Pyrimidine- Nukleinsäure durch Kopieren mit reverser Transkriptase (Aurup et al. 1994, Lin etal. 1994).The options for using this method are essentially limited by two factors: the stability of the Nucleic acid molecules especially in biological liquids and through the lack of functional groups such as B. lipophilic side chains in the Nucleic acids, therefore, only limited possibilities for binding to lipophilic Have domains (surfaces) of other molecules. The stability of the Nucleic acids can be increased by various measures. So have undergone a number of nucleic acid modifications in recent years developed, all essentially based on a chemical change in the Sugar-phosphate chain based. Increased resistance to degradation becomes by using phosphorothioates or 2'-amino-, 2'-fluoro- and 2'-O- Preserved methyl sugars (Heidenreich et al. 1993). For use in Vitro selection requires modifications with the reactions of the selection process are compatible. This is e.g. B. in use given by 2-aminopyrimidine nucleotides. Installation by enzymatic Synthesis can take place as well as amplification of the 2'-amino-pyrimidines Nucleic acid by copying with reverse transcriptase (Aurup et al. 1994, Lin et al. 1994).

Für den Einbau von lipophilen Gruppen, der auch mit den Schritten des Selektionsverfahrens kompatibel ist, wurde bisher nur ein Verfahren beschrieben. Dazu werden Derivate von Basen, genauer Nukleotidtriphosphate, die eine zusätzliche lipophile Seitenkette in der Base enthalten, hergestellt und anstelle der nicht modifizierten Base während des Selektionsverfahrens eingesetzt. So wurde von Dewey und Kollegen (Dewey et al. 1995) der Einsatz von Uridin-Derivaten beschrieben. Die Anwendung dieses Verfahrens erfordert es, die Modifikationen bereits vor dem Einbau in die RNA bei der Synthese der modifizierten Basen durchzuführen; dieses Verfahren ist daher für viele Applikationen nicht geeignet. Bei der Verwendung von modifizierten Nukleotidtriphosphaten ist es erforderlich, alle Basen eines Typs zu modifizieren: Wird zur enzymatischen Synthese ein Gemisch aus modifizierten und nicht modifizierten Nukleotidtriphosphaten einer Base zugegeben, erfolgt der Einbau zufällig, d. h. die Position der Modifizierung in der Nukleinsäure-Sequenz kann nicht beeinflußt werden; die Suche nach einer spezifischen Modifikation wird behindert. Daher werden bei diesem Verfahren in der Regel alle Positionen einer Base (z. B. Uridin) mit der modifizierten Base hergestellt.For the incorporation of lipophilic groups, which also with the steps of Selection procedure is compatible, so far only one procedure described. To do this, derivatives of bases, more precisely Nucleotide triphosphates that have an additional lipophilic side chain in the base included, produced and instead of the unmodified base during the Selection procedure used. For example, Dewey and colleagues (Dewey et al. 1995) described the use of uridine derivatives. The application of this The process requires the modifications to be made prior to incorporation into the RNA to perform in the synthesis of the modified bases; this procedure is therefore not suitable for many applications. When using Modified nucleotide triphosphates require all bases of one type to be modified: Is a mixture of for enzymatic synthesis modified and unmodified nucleotide triphosphates of a base admitted, the installation is random, d. H. the position of the modification in the nucleic acid sequence cannot be influenced; looking for one specific modification is hindered. Therefore, in this procedure usually all positions of a base (e.g. uridine) with the modified base manufactured.

Eine weitere Möglichkeit, zusätzliche Gruppen in Nukleinsäuren einzuführen, ist die Kopplung an das 3'- und 5'- Ende der Nukleinsäurekette, die vor allem bei der Oligonukleotid-Synthese gebräuchlich ist (Jäschke et al., 1994). Obwohl dadurch die Funktionalität der RNA-Moleküle erweitert wird, fehlt den so erhaltenen Molekülen eine wesentliche Qualität. Durch die Kopplung an die Enden der Nukleinsäuremoleküle sind die zusätzlichen Gruppen weit vom randomisierten Bereich entfernt und haben kaum einen Einfluß auf die Struktur der Bindungsdomänen, die von Sequenz-Motiven des randomisierten Bereichs gebildet werden. Daher werden endständige Modifikationen z. B. für die Markierung von Nukleinsäure-Molekülen bevorzugt, weil diese in der Regel die strukturellen Eigenschaften nicht beeinflussen. Endständige Modifikationen ermöglichen es auch, unabhängige funktionelle Gruppen anzufügen. Eine Reihe von Kombinationen sind so möglich, die zur Konstruktion bifunktioneller Moleküle genutzt werden können. Die freie Verfügbarkeit der Enden in hochaffinen Nukleinsäuremolekülen, die entsprechend der Erfindung hergestellt wurden, ermöglicht auch diese als Bausteine von bi-funktionellen Molekülen einzusetzen. Another way to introduce additional groups in nucleic acids is the coupling to the 3 'and 5' end of the nucleic acid chain, which, above all is common in oligonucleotide synthesis (Jaschke et al., 1994). Although this extends the functionality of the RNA molecules, it is missing molecules thus obtained have an essential quality. By coupling to the Ends of the nucleic acid molecules are the additional groups far from randomized area removed and have little effect on the structure of the binding domains, from sequence motifs of the randomized region be formed. Therefore, terminal modifications such. B. for the Labeling of nucleic acid molecules preferred because these are usually the do not affect structural properties. Final modifications also make it possible to add independent functional groups. A A number of combinations are possible, which are more bifunctional for construction Molecules can be used. The free availability of the ends in high affinity nucleic acid molecules according to the invention manufactured, this also enables them as building blocks of bi-functional To use molecules.

Subject of the invention

Der Gegenstand der Erfindung besteht in der Herstellung von hochaffinen Nukleinsäuremolekülen (Nukleinsäure-Aptamere oder Nukleinsäure-Liganden). Diese hochaffinen Nukleinsäuremoleküle, die funktionelle Gruppen zur spezifischen Erkennung von Zielmolekülen enthalten, sind dadurch gekennzeichnet, daß sie über 2'-Amino-Zucker in den Pyrimidin-Nukleotiden verfügen und daß an wenigen internen 2'-Amino-Zuckern dieser Pyrimidin- Nukleotide über die Amino-Gruppen funktionelle Gruppen geknüpft sind, und daß sie über eine hohe Bindungsaffinität für ausgewählte Zielmoleküle verfügen. Durch die funktionelle Gruppe werden eine erhöhte Lipophilie oder andere zusätzliche Eigenschaften im Bereich der Bindungsdomäne vermittelt. Bei solchen funktionellen Gruppen handelt es sich z. B. um eine C_n-Kette (n größer als 4), einen Aminosäurerest, einen Peptidrest oder eine licht aktivierbare Seitenkette (z. B. N-Succinimidyl-[4-azidophenyl]-1,3'- dithiopropionat). Diese hochaffinen Nukleinsäuremoleküle werden aus Bibliotheken durch Anreicherungsverfahren erhalten. Diese Bibliotheken bestehen aus Nukleinsäuremolekülen, die aus einem randomisierten Bereich und zwei flankierenden Bereichen bestehen, wobei der randomisierte Bereich ca. 20 bis 200 und die definierten, flankierenden Bereiche ca. 20 Nukleotide enthalten. Zielmoleküle können z. B. niedermolekulare organische Substanzen oder biologische Makromoleküle sein. Die spezifische Erkennung von Zielmolekülen wird durch den Einbau der funktionellen Gruppen an internen Amino-Gruppen in 2'-Amino-pyrimidin-Nukleinsäuren mit Hilfe von aktivierten Molekülen (z. B. Succinimid-Estern) erreicht (siehe Fig. 2). Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt die Modifikation erst nach der enzymatischen Synthese. Sie wird durch die Sekundärstruktur beeinflußt und kann durch die Reaktionsbedingungen gesteuert werden.The object of the invention is the production of high-affinity nucleic acid molecules (nucleic acid aptamers or nucleic acid ligands). These high-affinity nucleic acid molecules, which contain functional groups for the specific recognition of target molecules, are characterized in that they have 2'-amino sugars in the pyrimidine nucleotides and that on a few internal 2'-amino sugars of these pyrimidine nucleotides they have the Amino groups are functional groups linked, and that they have a high binding affinity for selected target molecules. The functional group mediates increased lipophilicity or other additional properties in the area of the binding domain. Such functional groups are e.g. B. a C _n chain (n greater than 4), an amino acid residue, a peptide residue or a light-activated side chain (e.g. N-succinimidyl- [4-azidophenyl] -1,3'- dithiopropionate). These high affinity nucleic acid molecules are obtained from libraries by enrichment methods. These libraries consist of nucleic acid molecules which consist of a randomized area and two flanking areas, the randomized area containing approximately 20 to 200 and the defined flanking areas containing approximately 20 nucleotides. Target molecules can e.g. B. be low molecular weight organic substances or biological macromolecules. The specific recognition of target molecules is achieved by incorporating the functional groups on internal amino groups in 2'-amino-pyrimidine nucleic acids with the aid of activated molecules (e.g. succinimide esters) (see FIG. 2). In the method according to the invention, the modification takes place only after the enzymatic synthesis. It is influenced by the secondary structure and can be controlled by the reaction conditions.

Die Reaktionsbedingungen (Puffer, Temperatur und Zeit) werden dabei so gewählt, daß durch die sekundäre Faltungsstruktur der Nukleinsäuren der Einbau an wenigen, bevorzugten Positionen erfolgt (ca. 1 bis 5, bevorzugt 1). Die so hergestellten Nukleinsäuren enthalten dann eine (ggf. mehrere) zusätzliche funktionelle Gruppe, die an einem internen Zucker gebunden ist, d. h. einem Zucker, der sich in der Nukleinsäurekette und nicht an einem der Enden befindet. Die Kopplung an einer internen Position erleichtert den direkten Einfluß auf die Bildung der spezifischen Bindungsdomäne durch die neu eingefügte Gruppe. Die auf diese Weise hergestellten Bibliotheken von kombinatorisch modifizierten Nukleinsäuremolekülen werden dann über die spezifische Target-Bindung selektioniert und die angereicherten bindenden Moleküle anschließend amplifiziert (siehe Fig. 3).The reaction conditions (buffer, temperature and time) are chosen so that the secondary folding structure of the nucleic acids means that they are incorporated at a few preferred positions (about 1 to 5, preferably 1). The nucleic acids produced in this way then contain an (possibly several) additional functional group which is bound to an internal sugar, ie a sugar which is located in the nucleic acid chain and not at one of the ends. The coupling at an internal position facilitates the direct influence on the formation of the specific binding domain by the newly inserted group. The libraries of combinatorially modified nucleic acid molecules produced in this way are then selected via the specific target binding and the enriched binding molecules are then amplified (see FIG. 3).

Für die enzymatische Synthese des Selektionspools werden 2'-amino modifizierte Pyrimidin-Nukleotid-Triphosphate eingesetzt, die bereits für die Herstellung von nuklease-resistenten Nukleinsäuremolekülen Verwendung finden. Dies ist ein wesentlicher Vorteil im Vergleich zu anderen Verfahren zur Herstellung funktionalisierter, wie lipophiler, Nukleinsäuremoleküle für die in vitro Selektion. Die so erhaltenen Nukleinsäuremoleküle verfügen durch die primäre Modifikation, 2'-Amino-pyrimidin-Nukleotide, sowohl über erhöhte Stabilität gegen Nukleasen als auch über die für die sekundäre Modifikation erforderlichen reaktiven Amino-Gruppen. Durch die sekundäre Modifikation werden dann die zusätzlichen funktionellen Gruppen eingebaut, die z. B. die Erhöhung der Lipophilie des Nukleinsäuremoleküls bewirken.For the enzymatic synthesis of the selection pool, 2'-amino modified pyrimidine nucleotide triphosphates already used for Production of Nuclease Resistant Nucleic Acid Molecules Use Find. This is a major advantage compared to other methods Production of functionalized, such as lipophilic, nucleic acid molecules for the in vitro selection. The nucleic acid molecules thus obtained have the primary modification, 2'-aminopyrimidine nucleotides, both via increased Stability against nucleases as well as that for the secondary modification required reactive amino groups. Through the secondary modification the additional functional groups are then installed, which, for. B. the Increase the lipophilicity of the nucleic acid molecule.

Dabei unterscheidet sich das hier vorgestellte Verfahren wesentlich von den bekannten Verfahren, bei denen bereits lipophil substituierte Basen eingesetzt werden. Nur die primäre Modifikation, die sowohl für die Stabilität gegen Nukleasen als auch für die sekundäre Modifikation erforderlich ist, findet sich an der 2'-Position aller Zucker von Pyrimidin-Nukleotide. Die funktionelle sekundäre Modifikation hingegen erfolgt selektiv nur an wenigen Positionen des Moleküls. Beim direkten Einbau modifizierter Basen gemäß Stand der Technik werden dagegen alle Positionen dieser Base modifiziert (s. o.). Ein weiterer wesentlicher Vorteil des hier vorgestellten Verfahrens ist die interne Modifikation der Nukleinsäure. Die Bildung einer Bindungsdomäne wird im wesentlichen durch die räumliche Nähe der am Aufbau der Domäne beteiligten Gruppen bestimmt. Die Wahrscheinlichkeit für die Bildung einer einheitlichen Domäne wird bei einem Polymer, wie hier die Nukleinsäure, dadurch erhöht, daß die daran beteiligten Gruppen in direkter Nachbarschaft auf dem Polymer angeordnet sind. Daher bietet das erfindungsgemäße Verfahren einen wesentlichen Vorteil gegenüber den bekannten Möglichkeiten, funktionelle Gruppen an den Enden des Nukleinsäurerpolymers einzufügen. Eine nicht modifizierte Nukleinsäure zeigt im wesentlichen zwei Strukturmerkmale. Doppelsträngige Helix-Elemente werden gebildet, wenn zueinander revers-komplementäre Sequenzen vorliegen. Einzelsträngige Bereiche, die die Enden von Helix-Elementen verbinden, werden als Loops bezeichnet, direkte Übergänge zwischen Helix-Elementen als Junktions. Die Oberflächenmerkmale dieser Elemente, die eine spezifische Bindungsdomaine bilden können, sind für die Helix: die Zucker-Phosphat Kette, die kleine und die große Furche (minor, major groove) und das Übereinanderliegen der Basen (Base Stacking); und für den Loop: die Zucker-Phosphat Kette und "frei" zugängliche Basen. Modifikationen mit zusätzlichen Seitenketten ermöglichen es, neue wählbare chemische Eigenschaften in dieses System einzufügen. Bei internen Modifikationen ist auch ein Einfluß auf die Struktur der Nukleinsäuren, d. h. auf die Bildung von Helix- und Loop-Domänen, zu erwarten.The method presented here differs significantly from that known processes in which bases already substituted by lipophils are used become. Only the primary modification, both for stability against Nucleases as well as for the secondary modification is found at the 2'-position of all sugars of pyrimidine nucleotides. The functional secondary modification, on the other hand, takes place selectively at only a few positions of the molecule. With the direct installation of modified bases according to the status of In contrast, all positions of this base are modified using technology (see above). Another major advantage of the method presented here is that internal modification of the nucleic acid. The formation of a binding domain essentially by the spatial proximity of the structure of the domain groups involved. The likelihood of forming one uniform domain in a polymer, like here the nucleic acid, thereby increased that the groups involved in the immediate vicinity are arranged on the polymer. Therefore, the invention offers Process a significant advantage over the known possibilities insert functional groups at the ends of the nucleic acid polymer. An unmodified nucleic acid essentially shows two Structural features. Double-stranded helix elements are formed when mutually complementary sequences are present. Single-stranded Areas that connect the ends of helix elements are called loops referred to, direct transitions between helix elements as junctions. The Surface features of these elements that have a specific binding domain are for the helix: the sugar-phosphate chain, the small and the large furrow (minor, major groove) and the superposition of the bases (Base stacking); and for the loop: the sugar-phosphate chain and "free" accessible bases. Allow modifications with additional side chains it is to insert new selectable chemical properties in this system. At internal modifications also affect the structure of the nucleic acids, d. H. on the formation of helix and loop domains.

Die gefundenen hochaffinen Nukleinsäuremoleküle können für eine Reihe von Anwendungen, die auf der spezifischen Interaktion mit dem jeweiligen Zielmolekül beruhen, genutzt werden. Sie können so zum Aufbau analytischer Verfahren für das Zielmolekül, wie z. B. organische Moleküle oder biologische Moleküle (s. o.), eingesetzt werden. Von besonderem Interesse ist der Einsatz zum Nachweis von Biomolekülen. Hohe Bindungsaffinität und Bindungsspezifität, bei gleichzeitiger Stabilität gegen Nukleasen ermöglichen es, die gefundenen Moleküle sowohl für Diagnoseverfahren, in vitro, ex vivo und in vivo, als auch für die Therapie, z. B. zur Aktivierung oder Inhibierung physiologischer Prozesse oder für Drug-Targeting durch die spezifische Interaktion mit dem jeweiligen Zielmolekül, einzusetzen.The high affinity nucleic acid molecules found can be used for a number of Applications based on the specific interaction with each Target molecule based, can be used. You can use this to build analytical Methods for the target molecule, such as. B. organic molecules or biological Molecules (see above) can be used. The application is of particular interest for the detection of biomolecules. High binding affinity and Binding specificity, while allowing stability against nucleases es, the molecules found both for diagnostic procedures, in vitro, ex vivo and in vivo, as well as for therapy, e.g. B. for activation or inhibition physiological processes or for drug targeting by the specific Interaction with the respective target molecule.

Examples

1. Es wurden zwei DNA Primer und ein DNA Templat synthetisiert. Das Templat enthielt zwei definierte, flankierende Sequenzelemente, die zur Sequenz der Primer passen und einen zentralen Bereich mit randomisierter Sequenz mit einer Länge von 75 Nukleotiden (N75). Zunächst wurde ein doppelsträngiger DNA-Pool aus 100 nmol Templat (<10¹⁵ Moleküle) und jeweils 500 nmol Primer mit Taq-DNA-Polymerase und dNTPs hergestellt. Dieser dsDNA-Pool wurde in 2'-Amino-pyrimidin-RNA durch T7-RNA-Polymerase in Anwesenheit von 2'-Amino-dUTP, 2'-Amino-dCTP, GTP und ATP überschrieben (transkribiert). Der 2'-Amino-RNA-Pool, der an jeder Pyrimidin-Position eine 2'- Amino-Gruppe enthält, wurde mit succinimid-aktiviertem Fluorescein für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von Hydroxylamin gestoppt. Die Nukleinsäuremoleküle wurden durch Ethanolfällung gereinigt. Die Bibliothek mit den modifizierten Nukleinsäuremolekülen (<10¹⁵ Moleküle) wurde im Bindungspuffer aufgenommen, auf 95°C erhitzt und auf Eis abgekühlt.1. Two DNA primers and one DNA template were synthesized. The template contained two defined, flanking sequence elements that match the sequence of the primers and a central region with a randomized sequence with a length of 75 nucleotides (N75). First, a double-stranded DNA pool was made from 100 nmol template (<10 ¹⁵ molecules) and 500 nmol primer each with Taq DNA polymerase and dNTPs. This dsDNA pool was overwritten in 2'-amino-pyrimidine-RNA by T7-RNA polymerase in the presence of 2'-amino-dUTP, 2'-amino-dCTP, GTP and ATP. The 2'-amino RNA pool, which contains a 2'-amino group at each pyrimidine position, was incubated with succinimide-activated fluorescein for 2 hours at room temperature. The reaction was stopped by adding hydroxylamine. The nucleic acid molecules were purified by ethanol precipitation. The library with the modified nucleic acid molecules (<10 ¹⁵ molecules) was taken up in the binding buffer, heated to 95 ° C. and cooled on ice.

Diese Molekül-Bibliothek wurde mit auf einer Plastikschale immobilisierten VEGF-Rezeptoren inkubiert. Nach 2 Stunden Inkubation wurde der Überstand abgenommen und die gebundenen Moleküle kurz dreimal gewaschen. Die auch nach dem Waschen gebundenen Nukleinsäuremoleküle (gebundene Fraktion) wurden durch Erhitzen denaturiert und aus der Bindung gelöst. Anschließend wurde die gebundene Fraktion mittels reverser Transkription und anschließender PCR amplifiziert. Der so erhaltene dsDNA-Pool wurde erneut als Ausgangsmaterial für eine weitere Affinitätsreinigung eingesetzt. Nach mehreren Zyklen zur Anreicherung bindender Moleküle wurden die Nukleinsäuremoleküle der bindenden Fraktion in einen Plasmidvektor ligiert und in E.coli transformiert. Plasmide von Einzelkolonien wurden isoliert und die Inserts sequenziert.This molecule library was immobilized on a plastic dish VEGF receptors incubated. After 2 hours of incubation, the supernatant became removed and the bound molecules briefly washed three times. The also after washing bound nucleic acid molecules (bound Fraction) were denatured by heating and released from the binding. The bound fraction was then by means of reverse transcription and subsequent PCR amplified. The dsDNA pool thus obtained was again used as starting material for further affinity purification. After several cycles for the enrichment of binding molecules, the Nucleic acid molecules of the binding fraction ligated into a plasmid vector and transformed into E. coli. Single colonies were isolated and the plasmids Inserts sequenced.

2. Das Verfahren wurde wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt; anstelle von succinimid-aktiviertem Fluorescein wurde succinimid-aktivierter Biotin-S-S- Ester eingesetzt.
Die gebundenen Nukleinsäuren wurden sowohl durch Denaturierung als auch durch Spaltung von Disulfidbrücken abgelöst.2. The procedure was carried out as described in Example 1; instead of succinimide-activated fluorescein, succinimide-activated biotin SS ester was used.
The bound nucleic acids were detached both by denaturation and by cleavage of disulfide bridges.

3. Das Verfahren wurde wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt; anstelle von succinimid-aktiviertem Fluorescein wurde aktiviertes Leucin eingesetzt.3. The procedure was carried out as described in Example 1; instead of Succinimide-activated fluorescein was activated leucine.

4. Das Verfahren wurde wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt; anstelle von succinimid- aktiviertem Fluorescein wurde succinimid-aktivierte Caprylsäure (C₈) eingesetzt. 4. The procedure was carried out as described in Example 1; instead of succinimide-activated fluorescein, succinimide-activated caprylic acid (C ₈ ) was used.

5. Das Verfahren wurde wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt; anstelle von succinimid-aktiviertem Fluorescein wurde aktivierte Cholsäure eingesetzt.5. The process was carried out as described in Example 1; instead of Succinimide-activated fluorescein activated cholic acid was used.

6. Das Verfahren wurde wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt; anstelle des VEGF-Rezeptors wurde gegen den EGF-Rezeptor selektioniert.6. The procedure was carried out as described in Example 1; instead of VEGF receptor was selected against the EGF receptor.

7. Das Verfahren wurde wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt; anstelle von succinimid-aktiviertem Fluorescein wurde aktiviertes Leucin eingesetzt und anstelle des VEGF-Rezeptor wurde gegen den Vitamin D3-Rezeptor selektioniert. 7. The procedure was carried out as described in Example 1; instead of succinimide-activated fluorescein, activated leucine was used and instead of the VEGF receptor was against the vitamin D3 receptor selected.

credentials

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Claims

1. Molecular library consisting of high-affinity nucleic acid molecules which contain functional groups for the specific recognition of target molecules, characterized in that said nucleic acid molecules have 2'-amino sugars in the pyrimidine nucleotides and on a few internal 2'-amino sugars of these pyrimidine Nucleotides to which amino groups are attached functional groups.

2. Molecular library consisting of high-affinity nucleic acid molecules according to Claim 1, characterized in that the nucleic acid molecules in randomized area about 20 to 200 and in the flanking areas about 20 Contain nucleotides.

3. Molecular library consisting of high-affinity nucleic acid molecules according to Claim 1, characterized in that the nucleic acid molecules 1-5 contain functional groups on internal 2-amino sugars.

4. High affinity nucleic acid molecules obtainable by enrichment processes the molecule library according to claim 1.

5. Use of the high-affinity nucleic acid molecules according to claim 4 for specific recognition of defined target molecules in analysis, diagnosis and Therapy.