DE19636917A1

DE19636917A1 - Nucleinsäuremoleküle codierend Enzyme aus Weizen, die an der Stärkesynthese beteiligt sind

Info

Publication number: DE19636917A1
Application number: DE1996136917
Authority: DE
Inventors: Horst Prof Dr Loerz; Stephanie Dr Luetticke; Lennart Walter; Claus Dr Frohberg; Jens Dr Kossmann
Original assignee: Hoechst Schering Agrevo GmbH
Current assignee: Bayer CropScience AG
Priority date: 1996-09-11
Filing date: 1996-09-11
Publication date: 1998-03-12

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Nucleinsäuremoleküle, die Enzyme aus Weizen codieren, die an der Stärkesynthese in Pflan zen beteiligt sind. Bei diesen Enzymen handelt es sich um Iso formen der Stärkesynthase.

Weiterhin betrifft diese Erfindung Vektoren und Bakterien, die derartige Nucleinsäuremoleküle enthalten, sowie mit den be schriebenen Nucleinsäuremolekülen transformierte Pflanzenzellen und Pflanzen.

Ferner werden Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen be schrieben, die aufgrund der Einführung von DNA-Molekülen, die eine Stärkesynthase aus Weizen codieren, eine in ihren Eigen schaften veränderte Stärke synthetisieren.

Im Hinblick auf die zunehmende Bedeutung, die pflanzlichen In haltsstoffen als erneuerbaren Rohstoffquellen in letzter Zeit beigemessen wird, ist es eine der Aufgaben der biotechnologi schen Forschung, sich um eine Anpassung dieser pflanzlichen Rohstoffe an die Anforderungen der verarbeitenden Industrie zu bemühen. Um eine Anwendung von modifizierten nachwachsenden Rohstoffen in möglichst vielen Einsatzgebieten zu ermöglichen, ist es darüber hinaus erforderlich, eine große Stoffvielfalt zu erreichen.

Neben Ölen, Fetten und Proteinen stellen Polysaccharide die we sentlichen nachwachsenden Rohstoffe aus Pflanzen dar. Eine zen trale Stellung bei den Polysacchariden nimmt neben Cellulose die Stärke ein, die einer der wichtigsten Speicherstoffe in hö heren Pflanzen ist. Hierbei ist Weizen eine interessante Kul turpflanze, da ca. 20% der Gesamtstärkeproduktion der Euro päischen Gemeinschaft aus ihr gewonnen werden.

Das Polysaccharid Stärke ist ein Polymer aus chemisch einheit lichen Grundbausteinen, den Glucosemolekülen. Es handelt sich dabei jedoch um ein sehr komplexes Gemisch aus unterschiedli chen Molekülformen, die sich hinsichtlich ihres Polymerisa tionsgrades und des Auftretens von Verzweigungen der Glucose ketten unterscheiden. Daher stellt Stärke keinen einheitlichen Rohstoff dar. Man unterscheidet insbesondere die Amylose-Stärke, ein im wesentlichen unverzweigtes Polymer aus α-1,4- glycosidisch verknüpften Glucosemolekülen, von der Amylopektin- Stärke, die ihrerseits ein komplexes. Gemisch aus unter schiedlich verzweigten Glucoseketten darstellt. Die Verzwei gungen kommen dabei durch das Auftreten von zusätzlichen α-1,6- glycosidischen Verknüpfungen zustande. In Weizen besteht die synthetisierte Stärke zu ca. 11-37% aus Amylose-Stärke, je nach Kultivar.

Um eine möglichst breite Anwendung von Stärke zu ermöglichen, erscheint es wünschenswert, Pflanzen zur Verfügung zu stellen, die in der rage sind, modifizierte Stärke zu synthetisieren, die sich für verschiedene Verwendungszwecke besonders eignet. Eine Möglichkeit, derartige Pflanzen bereitzustellen, besteht in züchterischen Maßnahmen. Diese gestalten sich beim Weizen aufgrund des polyploiden Charakters von Kulturweizen (tetra- und hexaploid) jedoch sehr schwer. Erst kürzlich gelang durch Kreuzung natürlich auftretender Mutanten die Herstellung eines "waxy" (Amylose-freien) Weizens (Nakamura et al., Mol. Gen. Genet. 248 (1995), 253-259). Eine andere Möglichkeit besteht in der gezielten genetischen Veränderung des Stärkemetabolismus stärkeproduzierender Pflanzen durch gentechnologische Methoden. Voraussetzung hierfür ist jedoch die Identifizierung und Charakterisierung der an der Stärkesynthese und/oder -modifi kation beteiligten Enzyme sowie die Isolierung der entspre chenden, diese Enzyme codierenden DNA-Moleküle.

Die biochemischen Synthesewege, die zum Aufbau von Stärke füh ren, sind im wesentlichen bekannt. Die Stärkesynthese in pflanzlichen Zellen findet in den Plastiden statt. In photo synthetisch aktiven Geweben sind dies die Chloroplasten, in photosynthetisch inaktiven, stärkespeichernden Geweben die Amy loplasten.

Die wichtigsten an der Stärkesynthese beteiligten Enzyme sind die Stärkesynthasen sowie die Verzweigungsenzyme. Bei den Stär kesynthasen sind verschiedene Isoformen beschrieben, die alle eine Polymerisierungsreaktion durch Übertragung eines Glucosyl restes von ADP-Glucose auf α-1,4-Glucane katalysieren. Verzwei gungsenzyme katalysieren die Einführung von α-1,6-Verzweigungen in lineare α-1,4-Glucane.

Stärkesynthasen können in zwei Klassen eingeteilt werden: die Stärkekorn-gebundenen Stärkesynthasen ("granule-bound starch synthases"; GBSS) und die löslichen Stärkesynthasen ("soluble starch synthases"; SSS). Diese Unterscheidung ist nicht in je dem Fall eindeutig zu treffen, da einige der Stärkesynthasen sowohl stärkekorngebunden als auch in löslicher Form vorliegen (Denyer et al., Plant J. 4 (1993), 191-198; Mu et al., Plant J. 6 (1994), 151-159). Für verschiedene Pflanzenspezies werden in nerhalb dieser Klassen wiederum verschiedene Isoformen be schrieben, die sich hinsichtlich ihrer Abhängigkeit von Star termolekülen unterscheiden (sogenannte primer dependent" (Typ II) und "primer independent" (Typ I) starch synthases).

Lediglich für die Isoform GBSS I gelang es bisher, die genaue Funktion bei der Stärkesynthese zu ermitteln. Pflanzen, in de nen diese Enzymaktivität stark oder vollkommen reduziert ist, synthetisieren eine amylosefreie (sogenannte "waxy") Stärke (Shure et al., Cell 35 (1983), 225-233; Visser et al., Mol. Gen. Genet. 225 (1991), 289-296; WO 92/11376), so daß diesem Enzym eine entscheidende Rolle bei der Synthese der Amylose- Stärke zugesprochen wird. Dieses Phänomen wird ebenfalls in Zellen der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii beobachtet (Delrue et al., J. Bacteriol. 174 (1992), 3612-3620). Bei Chlamydomonas konnte darüber hinaus gezeigt werden, daß GBSS I nicht nur an der Synthese der Amylose beteiligt ist, sondern auch einen Einfluß auf die Amylopektinsynthese besitzt. In Mu tanten, die keine GBSS I-Aktivität aufweisen, fehlt eine be stimmte Fraktion des normalerweise synthetisierten Amylopek tins, die längerkettige Glucane aufweist.

Die Funktionen der anderen Isoformen der Stärkekorn-gebundenen Stärkesynthasen, insbesondere der GBSS II, und der löslichen Stärkesynthasen sind bisher unklar. Es wird angenommen, daß die löslichen Stärkesynthasen zusammen mit Verzweigungsenzymen an der Synthese des Amylopektins beteiligt sind (siehe z. B. Pon stein et al., Plant Physiol. 92 (1990), 234-241) und daß sie eine wichtige Funktion bei der Regulation der Stärkesynthese rate spielen.

Bei Weizen wurden mindestens zwei Isoformen der Stärkekorn-ge bundenen Stärkesynthase (60 kDa und 100-105 kDa) und eine weitere Isoform, die möglicherweise eine lösliche Stärke synthase (Denyer et al., Planta 196 (1995), 256-265; Rahman et al., Aust. J. Plant Physiol. 22 (1995), 793-803) repräsen tiert, auf der Proteinebene identifiziert. Das Vorhandensein mehrerer SSS-Isoformen wurde schon früher mit Hilfe chromato graphischer Methoden nachgewiesen (Rÿven, Plant Physiol. 81 (1986), 448-453). Eine GBSS I aus Weizen codierende cDNA ist bereits beschrieben (Ainsworth et al., Plant Mol. Biol. 22 (1993) , 67-82).

Nucleinsäuresequenzen, die weitere Stärkesynthase-Isoformen aus Weizen codieren, liegen bisher nicht vor.

cDNA-Sequenzen, die andere Stärkesynthasen als die GBSS I co dieren, wurden bisher lediglich für Erbse (Dry et al., Plant J. 2 (1992), 193-202), Reis (Baba et al., Plant Physiol. 103 (1993), 565-573) und Kartoffel (Edwards et al., Plant J. 8 (1995) , 283-294) beschrieben.

Außer beim Weizen wurden lösliche Stärkesynthasen auch in einer Reihe weiterer Pflanzenarten identifiziert. Lösliche Stärke synthasen sind beispielsweise bis zur Homogenität aus Erbse (Denyer und Smith, Planta 186 (1992), 609-617) und Kartoffel (Edwards et al., Plant J. 8 (1995), 283-294) isoliert worden. In diesen Fällen stellte sich heraus, daß die als SSS II iden tifizierte Isoform der löslichen Stärkesynthase identisch ist mit der Stärkekorn-gebundenen Stärkesynthase GBSS II (Denyer et al., Plant J. 4 (1993), 191-198; Edwards et al., Plant J. 8 (1995), 283-294). Für einige weitere Pflanzenspezies wurde das Vorhandensein mehrerer SSS-Isoformen mit Hilfe chromatographi scher Methoden beschrieben, beispielsweise bei Gerste (Tyynelä und Schulman, Physiologia Plantarum 89 (1993) 835-841; Kreis, Planta 148 (1980), 412-416). DNA-Sequenzen, die diese Proteine codieren, wurden jedoch bisher nicht beschrieben.

Um weitere Möglichkeiten bereitzustellen, beliebige stärke speichernde Pflanzen, insbesondere Weizen, dahingehend zu ver ändern, daß sie eine modifizierte Stärke synthetisieren, ist es erforderlich, jeweils DNA-Sequenzen zu identifizieren, die weitere Isoformen der Stärkesynthasen codieren.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, Nucleinsäuremoleküle zur Verfügung zu stellen, die an der Stär kebiosynthese beteiligte Enzyme, insbesondere solche aus Wei zen, codieren und mit deren Hilfe es möglich ist, gentechnisch veränderte Pflanzen herzustellen, die eine erhöhte oder ernied rigte Aktivität dieser Enzyme aufweisen, wodurch es zu einer Veränderung der chemischen und/oder physikalischen Eigen schaften der in diesen Pflanzen synthetisierten Stärke kommt.

Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung der in den Patent ansprüchen bezeichneten Ausführungsformen gelöst.

Die vorliegende Erfindung betrifft daher in einem ersten Aspekt Nucleinsäuremoleküle, die Proteine aus Weizen mit der biologi schen Aktivität einer löslichen Stärkesynthase codieren, wobei derartige Moleküle vorzugsweise Proteine codieren, die die unter Seq ID No. 2 angegebenen Aminosäuresequenz umfassen. Insbesondere betrifft die Erfindung Nucleinsäuremoleküle, die die unter Seq ID No. 1 angegebene Nucleotidsequenz oder einen Teil davon enthalten, bevorzugt Moleküle, die die in Seq ID No. 1 angegebene codierende Region umfassen bzw. entsprechende Ribonucleotidsequenzen.

Die Erfindung betrifft auch Nucleinsäuremoleküle, die eine Se quenz aufweisen, die zu der gesamten oder einem Teil der unter Seq ID No. 1 dargestellten Sequenz komplementär ist.

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Nucleinsäuremoleküle, die eine lösliche Stärkesynthase aus Weizen codieren und die mit einem der oben beschriebenen Moleküle hybridisieren.

Gegenstand der Erfindung sind ebenfalls Nucleinsäuremoleküle, die eine lösliche Stärkesynthase aus Weizen codieren und deren Sequenz aufgrund der Degeneration des genetischen Codes von den Nucleotidsequenzen der oben beschriebenen Moleküle abweicht.

Bei den durch die vorangehend beschriebenen Nucleinsäuremolekü len codierten Proteine handelt es sich um lösliche Stärke synthasen aus Weizen. Diese Proteine weisen gewisse Homologie bereiche zu bisher bekannten löslichen Stärkesynthasen aus an deren Pflanzenarten auf.

In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung Nucleinsäuremoleküle, die Proteine mit der biologischen Aktivi tät einer Stärkesynthase aus Weizen codieren, wobei derartige Moleküle vorzugsweise Proteine codieren, die die unter Seq ID No. 6 angegebenen Aminosäuresequenz umfassen. Insbesondere be trifft die Erfindung Nucleinsäuremoleküle, die die unter Seq ID No. 5 angegebene Nucleotidsequenz oder einen Teil davon enthalten, bevorzugt Moleküle, die die in Seq ID No. 5 angege bene codierende Region umfassen bzw. entsprechende Ribonucleo tidsequenzen.

Die Erfindung betrifft auch Nucleinsäuremoleküle, die eine Se quenz aufweisen, die zu der gesamten oder einem Teil der unter Seq ID No. 5 dargestellten Sequenz komplementär ist.

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Nucleinsäuremoleküle, die eine Stärkesynthase aus Weizen codieren und die mit einem der oben beschriebenen Moleküle hybridisieren.

Gegenstand der Erfindung sind ebenfalls Nucleinsäuremoleküle, die eine Stärkesynthase aus Weizen codieren und deren Sequenz aufgrund der Degeneration des genetischen Codes von den Nucleo tidsequenzen der oben beschriebenen Moleküle abweicht.

Bei dem durch die vorangehend beschriebenen Nucleinsäuremolekü len codierten Protein handelt es sich um ein Protein mit der biologischen Aktivität einer Stärkesynthese aus Weizen. Homolo gievergleiche mit bekannten Sequenzen zeigen die höchste Homo logie mit Sequenzen aus Erbse, die eine Stärkekorn-gebundene Stärkesynthase codieren.

Bei den erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekülen kann es sich sowohl um DNA- als auch RNA-Moleküle handeln. Entsprechende DNA-Moleküle sind beispielsweise genomische oder cDNA-Moleküle. Die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle können aus na türlichen Quellen isoliert werden oder können nach bekannten Verfahren synthetisiert werden.

Der Begriff "Hybridisierung" bedeutet im Rahmen dieser Erfin dung eine Hybridisierung unter konventionellen Hybridisie rungsbedingungen, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, wie sie beispielsweise in Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl. (1989) Cold Spring Harbor Labora tory Press, Cold Spring Harbor, NY) beschrieben sind.

Nucleinsäuremoleküle, die mit den erfindungsgemäßen Molekülen hybridisieren, können z. B. aus genomischen oder aus cDNA-Bi bliotheken isoliert werden, die aus Weizengewebe hergestellt wurden.

Die Identifizierung und Isolierung derartiger Nucleinsäuremo leküle kann dabei unter Verwendung der erfindungsgemäßen Mole küle oder Teile dieser Moleküle bzw. der reversen Komplemente dieser Moleküle erfolgen, z. B. mittels Hybridisierung nach Standardverfahren (siehe z. B. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl. Cold Spring Harbor Labo ratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

Als Hybridisierungsprobe können z. B. Nucleinsäuremoleküle ver wendet werden, die exakt die oder im wesentlichen die unter Seq ID No. 1 unter unter Seq ID No. 5 angegebene Nucleotidsequenz oder Teile dieser Sequenzen aufweisen. Bei den als Hybridi sierungsprobe verwendeten Fragmenten kann es sich auch um syn thetische Fragmente handeln, die mit Hilfe der gängigen Syn thesetechniken hergestellt wurden und deren Sequenz im wesent lichen mit der eines erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküls übereinstimmt. Hat man Gene identifiziert und isoliert, die mit den erfindungsgemäßen Nucleinsäuresequenzen hybridisieren, ist eine Bestimmung der Sequenz und eine Analyse der Eigenschaften der von dieser Sequenz codierten Proteine erforderlich.

Die mit den erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekülen hybridi sierenden Moleküle umfassen auch Fragmente, Derivate und alle lische Varianten der oben beschriebenen Nucleinsäuremoleküle, die ein erfindungsgemäßes Protein aus Weizen codieren. Unter Fragmenten werden dabei Teile der Nucleinsäuremoleküle ver standen, die lang genug sind, um eines der beschriebenen Pro teine zu codieren. Der Ausdruck Derivat ,bedeutet in diesem Zu sammenhang, daß die Sequenzen dieser Moleküle sich von den Se quenzen der oben beschriebenen Nucleinsäuremoleküle an einer oder mehreren Positionen unterscheiden und einen hohen Grad an Homologie zu diesen Sequenzen aufweisen. Homologie bedeutet dabei eine Sequenzidentität von mindestens 40%, insbesondere eine Identität von mindestens 60%, vorzugsweise über 80% und besonders bevorzugt über 90%. Die Abweichungen zu den oben be schriebenen Nucleinsäuremolekülen können dabei durch Deletion, Substitution, Insertion oder Rekombination entstanden sein.

Homologie bedeutet ferner, daß funktionelle und/oder struktu relle Äquivalenz zwischen den betreffenden Nucleinsäuremolekü len oder den durch sie codierten Proteinen, besteht. Bei den Nucleinsäuremolekülen, die homolog zu den oben beschriebenen Molekülen sind und Derivate dieser Moleküle darstellen, handelt es sich in der Regel um Variationen dieser Moleküle, die Modifikationen darstellen, die dieselbe biologische Funktion ausüben. Es kann sich dabei sowohl um natürlicherweise auftre tende Variationen handeln, beispielsweise um Sequenzen aus an deren Organismen, oder um Mutationen, wobei diese Mutationen auf natürliche Weise aufgetreten sein können oder durch ge zielte Mutagenese eingeführt wurden. Ferner kann es sich bei den Variationen um synthetisch hergestellte Sequenzen handeln. Bei den allelischen Varianten kann es sich sowohl um natürlich auftretende Varianten handeln, als auch um synthetisch herge stellte oder durch rekombinante DNA-Techniken erzeugte Varian ten.

Die von den verschiedenen Varianten der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle codierten Proteine weisen bestimmte ge meinsame Charakteristika auf. Dazu können z. B. Enzymaktivität, Molekulargewicht, immunologische Reaktivität, Konformation etc. gehören, sowie physikalische Eigenschaften wie z. B. das Lauf verhalten in Gelelektrophoresen, chromatographisches Verhalten, Sedimentationskoeffizienten, Löslichkeit, spektroskopische Eigenschaften, Stabilität; pH-Optimum, Temperatur-Optimum etc.

Wichtige Charakteristika einer Stärkesynthase sind: i) ihre Lo kalisation im Stroma der Plastiden pflanzlicher Zellen; ii) ihre Fähigkeit zur Synthese linearer α-1,4-verknüpfter Poly glucane unter Verwendung von ADP-Glucose als Substrat. Diese Aktivität kann wie in Denyer und Smith (Planta 186 (1992), 606- 617) oder wie in den Beispielen beschrieben bestimmt werden.

Gegenstand der Erfindung sind auch Nucleinsäuremoleküle, die spezifisch mit Transkripten der erfindungsgemäßen Nucleinsäu remoleküle hybridisieren. Dabei handelt es sich vorzugsweise um Oligonucleotide mit einer Länge von mindestens 10, insbesondere von mindestens 15 und besonders bevorzugt von mindestens 50 Nucleotiden. Diese Nucleinsäuremoleküle hybridisieren jeweils spezifisch mit Transkripten erfindungsgemäßer Nucleinsäuremo leküle, d. h. sie hybridisieren jeweils nicht oder nur in sehr geringem Ausmaß mit Transkripten, die andere Proteine, insbesondere andere Stärkesynthasen codieren. Die erfindungs gemäßen Oligonucleotide können beispielsweise als Primer für eine PCR-Reaktion verwendet werden. Ebenso können sie Bestand teile von antisense-Konstrukten sein oder von DNA-Molekülen, die geeignete Ribozyme codieren.

Ferner betrifft die Erfindung Vektoren, insbesondere Plasmide, Cosmide, Viren, Bacteriophagen und andere in der Gentechnik gängige Vektoren, die die oben beschriebenen erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle enthalten.

In einer bevorzugten Ausführungsform sind die in den Vektoren enthaltenen Nucleinsäuremoleküle verknüpft mit regulatorischen Elementen, die die Transkription und Synthese einer transla tierbaren RNA in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen gewährleisten.

Die Expression der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle in prokaryontischen Zellen, beispielsweise in Escherichia coli, ist insofern interessant, als daß auf diese Weise eine genauere Charakterisierung der enzymatischen Aktivitäten der Enzyme, die diese Moleküle codieren, ermöglicht wird. Es ist insbesondere möglich, das Produkt, das von den entsprechenden Enzymen in Abwesenheit anderer, in der pflanzlichen Zelle an der Stärkesynthese beteiligter Enzyme synthetisiert wird, zu cha rakterisieren. Dies läßt Rückschlüsse zu auf die Funktion, die das entsprechende Protein bei der Stärkesynthese in der Pflan zenzelle ausübt.

Darüber hinaus ist es möglich, mittels gängiger molekularbio logischer Techniken (siehe z. B. Sambrook et al., 1989, Molecu lar Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) verschiedenartige Mu tationen in die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle einzu führen, wodurch es zur Synthese von Proteinen mit eventuell veränderten biologischen Eigenschaften kommt. Hierbei ist zum einen die Erzeugung von Deletionsmutanten möglich, bei denen durch fortschreitende Deletionen vom 5′- oder vom 3′-Ende der codierenden DNA-Sequenz Nucleinsäuremoleküle erzeugt werden, die zur Synthese entsprechend verkürzter Proteine führen. Durch derartige Deletionen am 5′-Ende der Nucleotidsequenz ist es beispielsweise möglich, Aminosäuresequenzen zu identifizieren, die für die Translokation des Enzyms in die Plastiden verant wortlich sind (Transitpeptide). Dies erlaubt es, gezielt Enzyme herzustellen, die durch Entfernen der entsprechenden Sequenzen nicht mehr in den Plastiden, sondern im Cytosol lokalisiert sind, oder aufgrund der Addition von anderen Signalsequenzen in anderen Kompartimenten lokalisiert sind.

Andererseits ist auch die Einführung von Punktmutationen denk bar an Positionen, bei denen eine Veränderung der Aminosäure sequenz einen Einfluß beispielweise auf die Enzymaktivität oder die Regulierung des Enzyms hat. Auf diese Weise können z. B. Mu tanten hergestellt werden, die einen veränderten K_m-Wert be sitzen oder nicht mehr den normalerweise in der Zelle vorlie genden Regulationsmechanismen über allosterische Regulation oder kovalente Modifizierung unterliegen.

Des weiteren können Mutanten hergestellt werden, die eine ver änderte Substrat- oder Produktspezifität aufweisen, wie z. B. Mutanten, die als Substrat ADP-Glucose-6-Phosphat anstatt ADP-Glucose verwenden. Weiterhin können Mutanten hergestellt wer den, die ein verändertes Aktivitäts-Temperatur-Profil aufwei sen.

Für die gentechnische Manipulation in prokaryontischen Zellen können die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle oder Teile dieser Moleküle in Plasmide eingebracht werden, die eine Muta genese oder eine Sequenzveränderung durch Rekombination von DNA-Sequenzen erlauben. Mit Hilfe von Standardverfahren (vgl. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A laboratory manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA) können Basenaustausche vorgenommen oder natürliche oder synthetische Sequenzen hinzugefügt werden. Für die Verbindung der DNA-Frag mente untereinander können an die Fragmente Adaptoren oder Lin ker angesetzt werden. Ferner können Manipulationen, die pas sende Restriktionsschnittstellen zur Verfügung stellen oder die überflüssige DNA oder Restriktionsschnittstellen entfernen, eingesetzt werden. Wo Insertionen, Deletionen oder Substitu tionen in Frage kommen, können in vitro-Mutagenese, "primer repair", Restriktion oder Ligation verwendet werden. Als Analy semethode werden im allgemeinen eine Sequenzanalyse, eine Re striktionsanalyse und weitere biochemisch-molekularbiologische Methoden durchgeführt.

In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung Wirts zellen, insbesondere prokaryontische oder eukaryontische Zel len, die mit einem oben beschriebenen erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekül oder einem erfindungsgemäßen Vektor trans formiert sind und/oder genetisch modifiziert sind, sowie Zel len, die von derart transformierten und/oder modifizierten Zel len abstammen und ein erfindungsgemäßes Nucleinsäuremolekül oder Vektor enthalten. Dabei handelt es sich vorzugsweise um bakterielle Zellen oder pflanzliche Zellen. Derartige Zellen sind dadurch gekennzeichnet, daß das eingeführte erfindungsge mäße Nucleinsäuremolekül entweder heterolog in Bezug auf die transformierte Zelle ist, d. h. natürlicherweise nicht in diesen Zellen vorkommt, oder an einem anderen Ort im Genom lokalisiert ist als die entsprechende natürlicherweise auftretende Sequenz.

Gegenstand der Erfindung sind ferner die Proteine, die durch die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle codiert werden, so wie Verfahren zu deren Herstellung, wobei eine erfindungsgemäße Wirtszelle unter Bedingungen kultiviert wird, die die Synthese des Proteins erlauben, und anschließend das Protein aus den kultivierten Zellen und/oder dem Kulturmedium isoliert wird.

Durch die Bereitstellung der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremo leküle ist es nun möglich, mit Hilfe gentechnischer Methoden gezielt in den Stärkemetabolismus von Pflanzen einzugreifen, wie es bisher durch züchterische Maßnahmen nicht möglich war, und ihn dahingehend zu verändern, daß es zur Synthese einer mo difizierten Stärke kommt, die beispielsweise in ihren physi kalisch-chemischen Eigenschaften, insbesondere dem Amy lose/Amylopektin-Verhältnis, dem Verzweigungsgrad, der durch schnittlichen Kettenlänge, dem Phosphatgehalt, dem Verklei sterungsverhalten, der Stärkekorngröße und/oder der Stärke kornform im Vergleich zu in Wildtyp-Pflanzen synthetisierter Stärke verändert ist. Durch eine Erhöhung der Aktivität der er findungsgemäßen Proteine, beispielsweise durch Überexpression entsprechender Nucleinsäuremoleküle, oder durch die Bereitstel lung von Mutanten, die nicht mehr den zelleigenen Regulations mechanismen unterliegen und/oder unterschiedliche Temperatur abhängigkeiten in bezug auf ihre Aktivität besitzen, besteht die Möglichkeit der Ertragssteigerung in entsprechend gentech nisch veränderten Pflanzen. Die wirtschaftliche Bedeutung der Möglichkeit des Eingriffs in die Stärkesynthese bei Weizen ist offensichtlich, da diese Pflanze einer der wichtigsten Stärke lieferanten ist.

Möglich ist somit die Expression der erfindungsgemäßen Nuclein säuremoleküle in pflanzlichen Zellen, um die Aktivität der ent sprechenden Stärkesynthase zu erhöhen, oder die Einführung in Zellen, die dieses Enzym normalerweise nicht exprimieren. Fer ner ist es möglich, die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle nach dem Fachmann bekannten Methoden zu modifizieren, um erfin dungsgemäß Stärkesynthasen zu erhalten, die nicht mehr den zelleigenen Regulationsmechanismen unterliegen, bzw. veränderte Temperaturabhängigkeiten oder Substrat- bzw. Pro duktspezifitäten aufweisen.

Bei der Expression der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle in Pflanzen besteht grundsätzlich die Möglichkeit, daß das syn thetisierte Protein in jedem beliebigen Kompartiment der pflanzlichen Zelle lokalisiert sein kann. Um die Lokalisation in einem bestimmten Kompartiment zu erreichen, muß die die Lo kalisation in Plastiden gewährleistende Sequenz deletiert wer den und die verbleibende codierende Region gegebenenfalls mit DNA-Sequenzen verknüpft werden, die die Lokalisierung in dem jeweiligen Kompartiment gewährleisten. Derartige Sequenzen sind bekannt (siehe beispielsweise Braun et al., EMBO J. 11 (1992), 3219-3227; Wolter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 846-850; Sonnewald et al., Plant J. 1 (1991), 95-106).

Die vorliegende Erfindung betrifft somit auch transgene Pflan zenzellen, die mit einem oder mehreren erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekül(en) transformiert wurden, sowie transgene Pflanzenzellen, die von derartig transformierten Zellen abstam men. Derartige Zellen enthalten ein oder mehrere erfindungsge mäße(s) Nucleinsäuremolekül(e), wobei diese(s) vorzugsweise mit regulatorischen DNA-Elementen verknüpft ist/sind, die die Transkription in pflanzlichen Zellen gewährleisten, insbeson dere mit einem Promotor. Derartige Zellen lassen sich von na türlicherweise vorkommenden Pflanzenzellen dadurch unterschei den, daß sie mindestens ein erfindungsgemäßes Nucleinsäuremole kül enthalten, das natürlicherweise in diesen Zellen nicht vor kommt, oder dadurch, daß ein solches Molekül an einem Ort im Genom der Zelle integriert vorliegt, an dem es natürlicherweise nicht vorkommt, d. h. in einer anderen genomischen Umgebung.

Die transgenen Pflanzenzellen können nach dem Fachmann bekann ten Techniken zu ganzen Pflanzen regeneriert werden. Die durch Regeneration der erfindungsgemäßen transgenen Pflanzenzellen erhältlichen Pflanzen sind ebenfalls Gegenstand der vorliegen den Erfindung. Ferner sind Gegenstand der Erfindung Pflanzen, die die oben beschriebenen transgenen Pflanzenzellen enthalten. Bei den transgenen Pflanzen kann es sich prinzipiell um Pflan zen jeder beliebigen Pflanzenspezies handeln, d. h. sowohl monokotyle als auch dikotyle Pflanzen. Bevorzugt handelt es sich um Nutzpflanzen, insbesondere um stärkesynthetisierende bzw. stärkespeichernde Pflanzen, wie z. B. Getreidearten (Roggen, Gerste Hafer, Weizen etc.), Reis, Mais, Erbse, Maniok oder Kartoffel.

Die Erfindung betrifft ebenfalls Vermehrungsmaterial der er findungsgemäßen Pflanzen, beispielsweise Früchte, Samen, Knol len, Wurzelstöcke, Sämlinge, Stecklinge etc.

Die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzenzellen und Pflanzen synthetisieren aufgrund der Expression bzw. zusätzlichen Ex pression mindestens eines erfindungsgemäßen Nucleinsäuremole küls eine Stärke, die beispielsweise in ihren physikalisch-che mischen Eigenschaften, insbesondere dem Amylose/Amylopektin- Verhältnis, dem Verzweigungsgrad, der durchschnittlichen Ket tenlänge, dem Phosphatgehalt, dem Verkleisterungsverhalten, der Stärkekorngröße und/oder der Stärkekornform im Vergleich zu in Wildtyp-Pflanzen synthetisierter Stärke verändert ist. Insbe sondere kann eine solche Stärke im Hinblick auf die Viskosität und/oder die Gelbildungseigenschaften von Kleistern dieser Stärke im Vergleich zu Wildtypstärke verändert sein.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit auch die aus den erfindungsgemäßen transgenen Pflanzenzellen, Pflanzen sowie dem Vermehrungsmaterial erhältliche Stärke.

Ferner ist es möglich, mit Hilfe der erfindungsgemäßen Nuclein säuremoleküle Pflanzenzellen und Pflanzen zu erzeugen, bei de nen die Aktivität mindestens eines erfindungsgemäßen Proteins verringert ist. Dies führt ebenfalls zur Synthese einer Stärke mit veränderten chemischen und/oder physikalischen Eigenschaf ten verglichen mit Stärke aus Wildtyp-Pflanzenzellen.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind somit auch transgene Pflanzenzellen, in denen die Aktivität mindestens eines erfindungsgemäßen Proteins verringert ist im Vergleich zu nicht-transformierten Pflanzen.

Die Herstellung von Pflanzenzellen mit einer verringerten Ak tivität mindestens eines erfindungsgemäßen Proteins kann bei spielsweise erzielt werden durch die Expression mindestens einer entsprechenden antisense-RNA, einer sense-RNA zur Erzie lung eines Cosuppressionseffektes oder die Expression minde stens eines entsprechend konstruierten Ribozyms, das spezifisch Transkripte spaltet, die eines der erfindungsgemäßen Proteine codieren, unter Verwendung der erfindungsgemäßen Nucleinsäu remoleküle.

Vorzugsweise wird zur Reduzierung der Aktivität eines erfin dungsgemäßen Proteins in pflanzlichen Zellen antisense-RNA ex primiert.

Hierzu können zum einen DNA-Moleküle verwendet werden, die die gesamte ein erfindungsgemäßes Protein codierende Sequenz ein schließlich eventuell vorhandener flankierender Sequenzen um fassen, als auch DNA-Moleküle, die nur Teile der codierenden Sequenz umfassen, wobei diese Teile lang genug sein müssen, um in den Zellen einen antisense-Effekt zu bewirken. Es können im allgemeinen Sequenzen bis zu einer Mindestlänge von 15 bp, vor zugsweise einer Länge von 100-500 bp, für eine effiziente anti sense-Inhibition insbesondere Sequenzen mit einer Länge über 500 bp verwendet werden. In der Regel werden DNA-Moleküle ver wendet, die kürzer als 5000 bp, vorzugsweise Sequenzen, die kürzer als 2500 bp sind.

Möglich ist auch die Verwendung von DNA-Sequenzen, die einen hohen Grad an Homologie zu den Sequenzen der erfindungsgemäßen DNA-Moleküle aufweisen, aber nicht vollkommen identisch sind. Die minimale Homologie sollte größer als ca. 65% sein. Die Verwendung von Sequenzen mit Homologien zwischen 95 und 100% ist zu bevorzugen.

Die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzenzellen können nach dem Fachmann bekannten Techniken zu ganzen Pflanzen regeneriert werden. Gegenstand der Erfindung sind somit auch Pflanzen, die die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzenzellen enthalten. Bei diesen Pflanzen handelt es sich vorzugsweise um Nutzpflanzen, insbesondere stärkesynthetisierende bzw. stärkespeichernde Pflanzen. Besonders bevorzugt ist hierbei Weizen. Die Erfindung betrifft ebenfalls Vermehrungsmaterial der erfindungsgemäßen Pflanzen, insbesondere Samen.

Die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzenzellen und Pflanzen synthetisieren aufgrund der Verringerung der Aktivität minde stens eines der erfindungsgemäßen Proteine eine Stärke, die beispielsweise in ihren physikalisch-chemischen Eigenschaften, insbesondere dem Amylose/Amylopektin-Verhältnis, dem Verzwei gungsgrad, der durchschnittlichen Kettenlänge, dem Phosphatge halt, dem Verkleisterungsverhalten, der Stärkekorngröße und/oder der Stärkekornform im Vergleich zu in Wildtyp-Pflanzen synthetisierter Stärke verändert ist. Diese Stärke kann beispielsweise veränderte Viskositäten und/oder Gelbildungs eigenschaften ihrer Kleister zeigen im Vergleich zu Stärke aus Wildtyp-Pflanzen.

Gegenstand der Erfindung ist somit auch die aus den vorgehend beschriebenen transgenen Pflanzenzellen, Pflanzen sowie aus dem Vermehrungsmaterial erhältliche Stärke.

Die erfindungsgemäßen Stärken können nach dem Fachmann bekann ten Verfahren modifiziert werden und eignen sich in unmodifi zierter oder modifizierter Form für verschiedene Verwendungen im Nahrungsmittel- oder Nicht-Nahrungsmittelbereich.

Grundsätzlich läßt sich die Einsatzmöglichkeit der Stärke in zwei große Bereiche unterteilen. Der eine Bereich umfaßt die Hydrolyseprodukte der Stärke, hauptsächlich Glucose und Glucan bausteine, die über enzymatische oder chemische Verfahren er halten werden. Sie dienen als Ausgangsstoff für weitere chemi sche Modifikationen und Prozesse, wie Fermentation. Für eine Reduktion der Kosten kann hierbei die Einfachheit und kosten günstige Ausführung eines Hydrolyseverfahrens von Bedeutung sein. Gegenwärtig verläuft es im wesentlichen enzymatisch unter Verwendung von Amyloglucosidase. Vorstellbar wäre eine Kosten einsparung durch einen geringeren Einsatz von Enzymen. Eine Strukturveränderung der Stärke, z. B. Oberflächenvergrößerung des Korns, leichtere Verdaulichkeit durch geringeren Verzwei gungsgrad oder eine sterische Struktur, die die Zugänglichkeit für die eingesetzten Enzyme begrenzt, könnte dies bewirken.

Der andere Bereich, in dem die Stärke wegen ihrer polymeren Struktur als sogenannte native Stärke verwendet wird, gliedert sich in zwei weitere Einsatzgebiete:

1. Nahrungsmittelindustrie

Stärke ist ein klassischer Zusatzstoff für viele Nah rungsmittel, bei denen sie im wesentlichen die Funktion des Bindens von wäßrigen Zusatzstoffen übernimmt bzw. eine Erhöhung der Viskosität oder aber eine erhöhte Gelbildung hervorruft. Wichtige Eigenschaftsmerkmale sind das Fließ- und Sorptionsverhalten, die Quell- und Verkleiste rungstemperatur, die Viskosität und Dickungsleistung, die Löslichkeit der Stärke, die Transparenz und Kleister struktur, die Hitze-, Scher- und Säurestabilität, die Nei gung zur Retrogradation, die Fähigkeit zur Filmbildung, die Gefrier/Taustabilität, die Verdaulichkeit sowie die Fähigkeit zur Komplexbildung mit z. B. anorganischen oder organischen Ionen.

Ein bevorzugtes Einsatzgebiet der Stärken ist auf dem Ge biet der Teig- und Backwaren.

2. Nicht-Nahrungsmittelindustrie

In diesem großen Bereich kann die Stärke als Hilfsstoff für unterschiedliche Herstellungsprozesse bzw. als Zu satzstoff in technischen Produkten eingesetzt. Bei der Verwendung der Stärke als Hilfsstoffist hier insbesondere die Papier- und Pappeindustrie zu nennen. Die Stärke dient dabei in erster Linie zur Retardation (Zurückhaltung von Feststoffen), der Abbindung von Füllstoff- und Fein stoffteilchen, als Festigungsstoff und zur Entwässerung. Darüber hinaus werden die günstigen Eigenschaften der Stärke in bezug auf die Steifigkeit, die Härte, den Klang, den Griff, den Glanz, die Glätte, die Spaltfestigkeit so wie die Oberflächen ausgenutzt.

2.1 Papier- und Pappeindustrie

Innerhalb des Papierherstellungsprozesses sind vier An wendungsbereiche, nämlich Oberfläche, Strich, Masse und Sprühen, zu unterscheiden.

Die Anforderungen an die Stärke in bezug auf die Oberflä chenbehandlung sind im wesentlichen ein hoher Weißegrad, eine angepaßte Viskosität, eine hohe Viskositätsstabili tät, eine gute Filmbildung sowie eine geringe Staubbil dung. Bei der Verwendung im Strich spielt der Feststoff gehalt, eine angepaßte Viskosität, ein hohes Bindevermögen sowie eine hohe Pigmentaffinität eine wichtige Rolle. Als Zusatz zur Masse ist eine rasche, gleichmäßige, ver lustfreie Verteilung, eine hohe mechanische Stabilität und eine vollständige Zurückhaltung im Papierfließ von Bedeu tung. Beim Einsatz der Stärke im Sprühbereich sind eben falls ein angepaßter Feststoffgehalt, hohe Viskosität so wie ein hohes Bindevermögen von Bedeutung.

2.2 Klebstoffindustrie

Ein großer Einsatzbereich der Stärken besteht in der Kleb stoffindustrie, wo man die Einsatzmöglichkeiten in vier Teilbereiche gliedert: die Verwendung als reinem Stär keleim, die Verwendung bei mit speziellen Chemikalien auf bereiteten Stärkeleimen, die Verwendung von Stärke als Zu satz zu synthetischen Harzen und Polymerdispersionen sowie die Verwendung von Stärken als Streckmittel für syntheti sche Klebstoffe. 90% der Klebstoffe auf Stärkebasis wer den in den Bereichen Wellpappenherstellung, Herstellung von Papiersäcken, Beuteln und Tüten, Herstellung von Ver bundmaterialien für Papier und Aluminium, Herstellung von Kartonagen und Wiederbefeuchtungsleim für Briefumschläge, Briefmarken usw. eingesetzt.

2.3 Textil- und Textilpflegemittelindustrie

Ein großes Einsatzfeld für die Stärken als Hilfsmittel und Zusatzstoffist der Bereich Herstellung von Textilien und Textilpflegemitteln. Innerhalb der Textilindustrie sind die folgenden vier Einsatzbereiche zu unterscheiden: Der Einsatz der Stärke als Schlichtmittel, d. h. als Hilfsstoff zur Glättung und Stärkung des Klettverhaltens zum Schutz gegen die beim Weben angreifenden Zugkräfte sowie zur Er höhung der Abriebfestigkeit beim Weben, Stärke als Mittel zur Textilaufrüstung vor allem nach qualitätsverschlech ternden Vorbehandlungen, wie Bleichen, Färben usw., Stärke als Verdickungsmittel bei der Herstellung von Farb pasten zur Verhinderung von Farbstoffdiffusionen sowie Stärke als Zusatz zu Kettungsmitteln für Nähgarne.

2.4 Baustoffindustrie

Der vierte Einsatzbereich ist die Verwendung der Stärken als Zusatz bei Baustoffen. Ein Beispiel ist die Herstel lung von Gipskartonplatten, bei der die im Gipsbrei ver mischte Stärke mit dem Wasser verkleistert, an die Ober fläche der Gipsplatte diffundiert und dort den Karton an die Platte bindet. Weitere Einsatzbereiche sind die Bei mischung zu Putz- und Mineralfasern. Bei Transportbeton werden Stärkeprodukte zur Verzögerung der Abbindung ein gesetzt.

2.5 Bodenstabilisation

Ein weiterer Markt für die Stärke bietet sich bei der Her stellung von Mitteln zur Bodenstabilisation an, die bei künstlichen Erdbewegungen zum temporären Schutz der Boden partikel gegenüber Wasser eingesetzt werden. Kombina tionsprodukte aus der Stärke und Polymeremulsionen sind nach heutiger Kenntnis in ihrer Erosions- und ver krustungsmindernden Wirkung den bisher eingesetzten Pro dukten gleichzusetzen, liegen preislich aber deutlich un ter diesen.

2.6 Einsatz bei Pflanzenschutz- und Düngemitteln

Ein Einsatzbereich liegt bei der Verwendung der Stärke in Pflanzenschutzmitteln zur Veränderung der spezifischen Eigenschaften der Präparate. So kann die Stärke zur Ver besserung der Benetzung von Pflanzenschutz- und Düngemit teln, zur dosierten Freigabe der Wirkstoffe, zur Umwand lung flüssiger, flüchtiger und/oder übelriechender Wirk stoffe in mikrokristalline, stabile, formbare Substanzen, zur Mischung inkompatibler Verbindungen und zur Verlänge rung der Wirkdauer durch Verminderung der Zersetzung ein gesetzt werden.

2.7 Pharmaka, Medizin und Kosmetikindustrie

Ein weiteres Einsatzgebiet besteht im Bereich der Phar maka, Medizin und Kosmetikindustrie. In der pharmazeuti schen Industrie kann die Stärke als Bindemittel für Ta bletten oder zur Bindemittelverdünnung in Kapseln einge setzt werden. Weiterhin kann die Stärke als Tabletten sprengmittel dienen, da sie nach dem Schlucken Flüssigkeit absorbieren und nach kurzer Zeit soweit quellen, daß der Wirkstoff freigesetzt wird. Medizinische Gleit- und Wundpuder basieren aus qualitativen Gründen auf Stärke. Im Bereich der Kosmetik werden Stärken beispielsweise als Träger von Puderzusatzstoffen, wie Düften und Salicylsäure eingesetzt. Ein relativ großer Anwendungsbereich für die Stärke liegt bei Zahnpasta.

2.8 Stärkezusatz zu Kohlen und Briketts

Einen Einsatzbereich bietet die Stärke als Zusatzstoff zu Kohle und Brikett. Kohle kann mit einem Stärkezusatz quan titativ hochwertig agglomeriert bzw. brikettiert werden, wodurch ein frühzeitiges Zerfallen der Briketts verhindert wird. Der Stärkezusatz liegt bei Grillkohle zwischen 4 und 6%, bei kalorierter Kohle zwischen 0,1 und 0,5%. Des weiteren gewinnen Stärken als Bindemittel an Bedeutung, da durch ihren Zusatz zu Kohle und Brikett der Ausstoß schädlicher Stoffe deutlich vermindert werden kann.

2.9 Erz- und Kohleschlammaufbereitung

Die Stärke kann ferner bei der Erz- und Kohleschlammauf bereitung als Flockungsmittel eingesetzt werden.

2. 10 Gießereihilfsstoff

Ein weiterer Einsatzbereich besteht als Zusatz zu Gieße reihilfsstoffen. Bei verschiedenen Gußverfahren werden Kerne benötigt, die aus Bindemittel-versetzten Sänden her gestellt werden. Als Bindemittel wird heute überwiegend Bentonit eingesetzt, das mit modifizierten Stärken, meist Quellstärken, versetzt ist.

Zweck des Stärkezusatzes ist die Erhöhung der Fließfe stigkeit sowie die Verbesserung der Bindefestigkeit. Dar über hinaus können die Quellstärken weitere produk tionstechnische Anforderungen, wie im kalten Wasser dis pergierbar, rehydratisierbar, gut in Sand mischbar und ho hes Wasserbindungsvermögen, aufweisen.

2.11 Einsatz in der Kautschukindustrie

In der Kautschukindustrie kann die Stärke zur Verbesserung der technischen und optischen Qualität eingesetzt werden. Gründe sind dabei die Verbesserung des Oberflächenglanzes, die Verbesserung des Griffs und des Aussehens, dafür wird Stärke vor der Kaltvulkanisation auf die klebrigen gummierten Flächen von Kautschukstoffen gestreut, sowie die Verbesserung der Bedruckbarkeit des Kautschuks.

2.12 Herstellung von Lederersatzstoffen

Eine weitere Absatzmöglichkeit der modifizierten Stärken besteht bei der Herstellung von Lederersatzstoffen.

2.13 Stärke in synthetischen Polymeren

Auf dem Kunststoffsektor zeichnen sich folgende Einsatz gebiete ab: die Einbindung von Stärkefolgeprodukten in den Verarbeitungsprozeß (Stärke ist nur Füllstoff, es besteht keine direkte Bindung zwischen synthetischem Polymer und Stärke) oder alternativ die Einbindung von Stärkefolge produkten in die Herstellung von Polymeren (Stärke und Po lymer gehen eine feste Bindung ein).

Die Verwendung der Stärke als reinem Füllstoff ist verglichen mit den anderen Stoffen wie Talkum nicht wettbewerbsfähig. An ders sieht es aus, wenn die spezifischen Stärkeeigenschaften zum Tragen kommen und hierdurch das Eigenschaftsprofil der End produkte deutlich verändert wird. Ein Beispiel hierfür ist die Anwendung von Stärkeprodukten bei der Verarbeitung von Thermo plasten, wie Polyethylen. Hierbei werden die Stärke und das synthetische Polymer durch Coexpression im Verhältnis von 1 : 1 zu einem "master batch" kombiniert, aus dem mit granuliertem Polyethylen unter Anwendung herkömmlicher Verfahrenstechniken diverse Produkte hergestellt werden. Durch die Einbindung von Stärke in Polyethylenfolien kann eine erhöhte Stoffdurchlässig keit bei Hohlkörpern, eine verbesserte Wasserdampfdurchlässig keit, ein verbessertes Antistatikverhalten, ein verbessertes Antiblockverhalten sowie eine verbesserte Bedruckbarkeit mit wäßrigen Farben erreicht werden.

Eine andere Möglichkeit ist die Anwendung der Stärke in Poly urethanschäumen. Mit der Adaption der Stärkederivate sowie durch die verfahrenstechnische Optimierung ist es möglich, die Reaktion zwischen synthetischen Polymeren und den Hydroxygrup pen der Stärken gezielt zu steuern. Das Ergebnis sind Poly urethanfolien, die durch die Anwendung von Stärke folgende Eigenschaftsprofile erhalten: eine Verringerung des Wärmeaus dehnungskoeffizienten, Verringerung des Schrumpfverhaltens, Verbesserung des Druck/Spannungsverhaltens, Zunahme der Was serdampfdurchlässigkeit ohne Veränderung der Wasseraufnahme, Verringerung der Entflammbarkeit und der Aufrißdichte, kein Ab tropfen brennbarer Teile, Halogenfreiheit und verminderte Alte rung. Nachteile, die gegenwärtig noch vorhanden sind, sind ver ringerte Druckfestigkeit sowie eine verringerte Schlagfestig keit.

Die Produktentwicklung beschränkt sich inzwischen nicht mehr nur auf Folien. Auch feste Kunststoffprodukte, wie Töpfe, Plat ten und Schalen, sind mit einem Stärkegehalt von über 50% her zustellen. Des weiteren sind Stärke/ Polymermischungen günstig zu beurteilen, da sie eine sehr viel höhere biologische Abbau barkeit aufweisen.

Außerordentliche Bedeutung haben weiterhin auf Grund ihres ex tremen Wasserbindungsvermögen Stärkepfropfpolymerisate gewon nen. Dies sind Produkte mit einem Rückgrat aus Stärke und einer nach dem Prinzip des Radikalkettenmechanismus aufgepfropften Seitengitters eines synthetischen Monomers. Die heute verfügba ren Stärkepfropfpolymerisate zeichnen sich durch ein besseres Binde- und Rückhaltevermögen von bis zu 1000 g Wasser pro g Stärke bei hoher Viskosität aus. Die Anwendungsbereiche für diese Superabsorber haben sich in den letzten Jahren stark aus geweitet und liegen im Hygienebereich mit Produkten wie Win deln und Unterlagen sowie im landwirtschaftlichen Sektor, z. B. bei Saatgutpillierungen.

Entscheidend für den Einsatz der neuen, gentechnisch veränder ten Stärken sind zum einen die Struktur, Wassergehalt, Pro teingehalt, Lipidgehalt, Fasergehalt, Asche/Phosphatgehalt, Amylose/Amylopektinverhältnis, Molmassenverteilung, Verzwei gungsgrad, Korngröße und -form sowie Kristallinität, zum ande ren auch die Eigenschaften, die in folgende Merkmale münden: Fließ- und Sorptionsverhalten, Verkleisterungstemperatur, Vis kosität, Dickungsleistung, Löslichkeit, Kleisterstruktur und -transparenz, Hitze-, Scher- und Säurestabilität, Retrograda tionsneigung, Gelbildung, Gefrier/Taustabilität, Komplexbil dung, Jodbindung, Filmbildung, Klebekraft, Enzymstabilität, Verdaulichkeit und Reaktivität.

Die Erzeugung modifizierter Stärken mittels gentechnischer Ein griffe in einer transgenen Pflanze kann zum einen die Eigen schaften der aus der Pflanze gewonnenen Stärke dahingehend verändern, daß weitere Modifikationen mittels chemischer oder physikalischer Verfahren nicht mehr notwendig erscheinen. Zum anderen können die durch gentechnische Verfahren veränderte Stärken weiteren chemischen Modifikationen unterworfen werden, was zu weiteren Verbesserungen der Qualität für bestimmte der oben beschriebenen Einsatzgebiete führt. Diese chemischen Modi fikationen sind grundsätzlich bekannt. Insbesondere handelt es sich dabei um Modifikationen durch

- Hitzebehandlung,
- Säurebehandlung,
- Oxidation und
- Veresterungen,

welche zur Entstehung von Phosphat-, Nitrat-, Sulfat-, Xanthat-, Acetat- und Citratstärken führen. Weitere organische Säuren können ebenfalls zur Veresterung eingesetzt werden:

- Erzeugung von Stärkeethern Stärke-Alkylether, O-Allylether, Hydroxylalkylether, O-Carboxylmethylether, N-haltige Stärkeether, P-haltige Stärkeether, S-haltige Stärkeether,
- Erzeugung von vernetzten Stärken,
- Erzeugung von Stärke-Pfropf-Polymerisaten.

Bevorzugte Verwendungen der erfindungsgemäßen Stärken liegen bei der Herstellung von Verpackungsmaterial und Einwegartikeln.

Zur Expression der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle in sense- oder antisense-Orientierung in pflanzlichen Zellen wer den diese mit regulatorischen DNA-Elementen verknüpft, die die Transkription in pflanzlichen Zellen gewährleisten. Hierzu zäh len insbesondere Promotoren. Generell kommt für die Expression jeder in pflanzlichen Zellen aktive Promotor in Frage.

Der Promotor kann dabei so gewählt sein, daß die Expression konstitutiv erfolgt oder nur in einem bestimmten Gewebe, zu einem bestimmten Zeitpunkt der Pflanzenentwicklung oder zu einem durch äußere Einflüsse determinierten Zeitpunkt. In Bezug auf die Pflanze kann der Promotor homolog oder heterolog sein. Sinnvolle Promotoren sind z. B. der Promotor der 355 RNA des Cauliflower Mosaic Virus und der Ubiquitin-Promotor aus Mais für eine konstitutive Expression, der Patatingen-Promotor B33 (Rocha-Sosa et al., EMBO J. 8 (1989), 23-29) für eine knol lenspezifische Expression in Kartoffeln oder ein Promotor, der eine Expression lediglich in photosynthetisch aktiven Geweben sicherstellt, z. B. der ST-LS1-Promotor (Stockhaus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 7943-7947; Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989), 2445-2451) oder für eine. endosperm-spezifi sche Expression der HMG-Promotor aus Weizen, der USP-Promotor, der Phaseolinpromotor oder Promotoren von Zein-Genen aus Mais. Ferner kann eine Terminationssequenz vorhanden sein, die der korrekten Beendigung der Transkription dient sowie der Addition eines Poly-A-Schwanzes an das Transkript, dem eine Funktion bei der Stabilisierung der Transkripte beigemessen wird. Derartige Elemente sind in der Literatur beschrieben (vgl. Gielen et al., EMBO J. 8 (1989), 23-29) und sind beliebig austauschbar.

Die vorliegende Erfindung stellt Nucleinsäuremoleküle zur Ver fügung, die zwei verschiedene Formen der Stärkesynthase aus Weizen codieren. Dies erlaubt nun sowohl die Identifizierung der Funktion dieser Isoformen bei der Stärkebiosynthese, als auch die Herstellung gentechnisch veränderter Pflanzen, bei denen die Aktivität mindestens eines dieser Enzyme verändert ist. Dies ermöglicht die Synthese einer Stärke mit veränderter Struktur und somit veränderten physikalisch-chemischen Eigen schaften in derartig manipulierten Pflanzen.

Die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle können prinzipiell auch dazu verwendet werden, Pflanzen herzustellen, bei denen die Aktivität mindestens einer der erfindungsgemäßen Stärke synthasen erhöht oder verringert ist und gleichzeitig die Akti vitäten anderer, an der Stärkebiosynthese beteiligter Enzyme verändert sind. Dabei sind alle Kombinationen und Permutationen denkbar. Durch die Veränderung der Aktivitäten einer oder meh rerer Isoformen der Stärkesynthasen in Pflanzen kommt es zur Synthese einer in ihrer Struktur veränderten Stärke. Durch die Steigerung der Aktivität einer oder mehrerer Isoformen der Stärkesynthasen in den Zellen der stärkespeichernden Gewebe transformierter Pflanzen wie z. B. in dem Endosperm von Mais oder Weizen oder in der Knolle bei der Kartoffel kann es darüber hinaus zu einer Ertragssteigerung kommen. Beispiels weise können Nucleinsäuremoleküle, die ein erfindungsgemäßes Protein codieren oder entsprechende antisense-Konstrukte, in Pflanzenzellen eingebracht werden, bei denen bereits die Syn these endogener GBSS I-, SSS- oder GBSS II-Proteine aufgrund eines antisense-Effektes oder einer Mutation inhibiert ist oder die Synthese des Verzweigungsenzyms inhibiert ist (wie z. B. beschrieben in Nakamura et al. (loc. cit.)).

Soll die Inhibierung der Synthese mehrerer Stärke-Synthasen in transformierten Pflanzen erreicht werden, so können DNA-Mole küle zur Transformation verwendet werden, die gleichzeitig meh rere, die entsprechenden Stärkesynthasen codierenden Regionen in antisense-Orientierung unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors enthalten. Hierbei kann alternativ jede Sequenz unter der Kontrolle eines eigenen Promotors stehen, oder die Se quenzen können als Fusion von einem gemeinsamen Promotor trans kribiert werden. Letztere Alternative wird in der Regel vorzu ziehen sein, da in diesem Fall die Synthese der entsprechenden Proteine in etwa gleichem Maße inhibiert werden sollte.

Weiterhin ist die Konstruktion von DNA-Molekülen möglich, bei denen neben DNA-Sequenzen, die Stärkesynthasen codieren, wei tere DNA-Sequenzen, die andere Proteine, die an der Stärkesyn these oder -modifikation beteiligt sind, in antisense-Orientie rung an einen geeigneten Promotor gekoppelt sind. Die Sequenzen können hierbei wiederum hintereinandergeschaltet sein und von einem gemeinsamen Promotor transkribiert werden. Für die Länge der einzelnen codierenden Regionen, die in einem derartigen Konstrukt verwendet werden, gilt das, was oben bereits für die Herstellung von antisense-Konstrukten ausgeführt wurde. Eine obere Grenze für die Anzahl der in einem derartigen DNA-Molekül von einem Promotor aus transkribierten antisense-Fragmente gibt es nicht. Das entstehende Transkript sollte aber in der Regel eine Länge von 10 kb, vorzugsweise von 5 kb nicht überschreiten.

Codierende Regionen, die in derartigen DNA-Molekülen in Kombi nation mit anderen codierenden Regionen in. antisense-Orientie rung hinter einem geeigneten Promotor lokalisiert sind, können aus DNA-Sequenzen stammen, die für folgende Proteine codieren: Stärkekorn-gebundene (GBSS I und II), andere lösliche Stärke synthasen, Verzweigungsenzyme, "Debranching" -Enzyme, Dispro portionierungsenzyme und Stärkephosphorylasen. Dies ist nur eine beispielhafte Aufzählung. Auch die Verwendung anderer DNA-Sequenzen im Rahmen einer derartigen Kombination ist denkbar.

Mit Hilfe derartiger Konstrukte ist es möglich, in Pflanzen zellen, die mit diesen transformiert wurden, die Synthese meh rerer Enzyme gleichzeitig zu inhibieren.

Weiterhin können die Konstrukte in klassische Mutanten einge bracht werden, die für ein oder mehrere Gene der Stärkebiosyn these defekt sind. Diese Defekte können sich auf folgende Pro teine beziehen: Stärkekorn-gebundene (GBSS I und II) und lös liche Stärkesynthasen (SSS I und II), Verzweigungsenzyme (BE I und II), "Debranching"-Enzyme (R-Enzyme), Disproportionie rungsenzyme und Stärkephosphorylasen. Dies ist nur eine bei spielhafte Aufzählung.

Mit Hilfe einer derartigen Vorgehensweise ist es weiterhin mög lich, in Pflanzenzellen, die mit diesen transformiert wurden, die Synthese mehrerer Enzyme gleichzeitig zu inhibieren.

Zur Vorbereitung der Einführung fremder Gene in höhere Pflanzen stehen eine große Anzahl von Clonierungsvektoren zur Verfügung, die ein Replikationssignal für E.coli und ein Markergen zur Selektion transformierter Bakterienzellen enthalten. Beispiele für derartige Vektoren sind pBR322, pUC-Serien, M13mp-Serien, pACYC184 usw. Die gewünschte Sequenz kann an einer passenden Restriktionsschnittstelle in den Vektor eingeführt werden. Das erhaltene Plasmid wird für die Transformation von E.coli-Zellen verwendet. Transformierte E.coli-Zellen werden in einem ge eigneten Medium gezüchtet, anschließend geerntet und lysiert. Das Plasmid wird wiedergewonnen. Als Analysemethode zur Cha rakterisierung der gewonnenen Plasmid-DNA werden im allgemeinen Restriktionsanalysen, Gelelektrophoresen und weitere bioche misch-molekularbiologische Methoden eingesetzt. Nach jeder Ma nipulation kann die Plasmid-DNA gespalten und gewonnene DNA-Fragmente mit anderen DNA-Sequenzen verknüpft werden. Jede Plasmid-DNA-Sequenz kann in den gleichen oder anderen Plasmiden cloniert werden.

Für die Einführung von DNA in eine pflanzliche Wirtszelle ste hen eine Vielzahl von Techniken zur Verfügung. Diese Techniken umfassen die Transformation pflanzlicher Zellen mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes als Transformationsmittel, die Fusion von Pro toplasten, die Injektion, die Elektroporation von DNA, die Ein bringung von DNA mittels der biolistischen Methode sowie wei tere Möglichkeiten.

Bei der Injektion und Elektroporation von DNA in Pflanzenzellen werden an sich keine speziellen Anforderungen an die ver wendeten Plasmide gestellt. Es können einfache Plasmide wie z. B. pUC-Derivate verwendet werden. Sollen aber aus derartig transformierten Zellen ganze Pflanzen regeneriert werden, ist die Anwesenheit eines selektierbaren Markergens notwendig.

Je nach Einführungsmethode gewünschter Gene in die Pflanzen zelle können weitere DNA-Sequenzen erforderlich sein. Werden z. B. für die Transformation der Pflanzenzelle das Ti- oder Ri- Plasmid verwendet, so muß mindestens die rechte Begrenzung, häufig jedoch die rechte und linke Begrenzung der Ti- und Ri- Plasmid T-DNA als Flankenbereich mit den einzuführenden Genen verbunden werden.

Werden für die Transformation Agrobakterien verwendet, muß die einzuführende DNA in spezielle Plasmide cloniert werden, und zwar entweder in einen intermediären Vektor oder in einen bi nären Vektor. Die intermediären Vektoren können aufgrund von Sequenzen, die homolog zu Sequenzen in der T-DNA sind, durch homologe Rekombination in das Ti- oder Ri-Plasmid der Agrobak terien integriert werden. Dieses enthält außerdem die für den Transfer der T-DNA notwendige vir-Region. Intermediäre Vektoren können nicht in Agrobakterien replizieren. Mittels eines Helferplasmids kann der intermediäre Vektor auf Agrobacterium tumefaciens übertragen werden (Konjugation) . Binäre Vektoren können sowohl in E.coli als auch in Agrobakterien replizieren. Sie enthalten ein Selektionsmarker-Gen und einen Linker oder Polylinker, welche von der rechten und linken T-DNA Grenzregion eingerahmt werden. Sie können direkt in die Agrobakterien transformiert werden (Holsters et al. Mol. Gen. Genet. 163 (1978), 181-187). Das als Wirtszelle dienende Agrobakterium soll ein Plasmid, das eine vir-Region trägt, enthalten. Die vir-Region ist für den Transfer der T-DNA in die Pflanzenzelle notwendig. Zusätzliche T-DNA kann vorhanden sein. Das derartig transformierte Agrobakterium wird zur Transformation von Plan zenzellen verwendet.

Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflanzen zellen ist intensiv untersucht und ausreichend in EP 120 516; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System Offsetdrukkerÿ Kanters B.V., Alblasserdam (1985), Chapter V; Fraley et al., Crit. Rev. Plant. Sci., 4, 1-46 und An et al. EMBO J. 4 (1985), 277-287 beschrieben worden.

Für den Transfer der DNA in die Pflanzenzelle können Pflanzen-Ex plantate zweckmäßigerweise mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes kokultiviert werden. Aus dem infizier ten Pflanzenmaterial (z. B. Blattstücke, Stengelsegmente, Wur zeln, aber auch Protoplasten oder Suspensions-kultivierte Pflanzenzellen) können dann in einem geeigneten Medium, welches Antibiotika oder Biozide zur Selektion transformierter Zellen enthalten kann, wieder ganze Pflanzen regeneriert werden. Die so erhaltenen Pflanzen können dann auf Anwesenheit der einge führten DNA untersucht werden. Andere Möglichkeiten der Einfüh rung fremder DNA unter Verwendung des biolistischen Verfahrens oder durch Protoplastentransformation sind bekannt (vgl. z. B. Willmitzer, L., 1993 Transgenic plants. In: Biotechnology, A Multi-Volume Comprehensive Treatise (H.J. Rehm, G. Reed, A. Pühler, P. Stadler, eds.), Vol. 2, 627-659, VCH Weinheim-New York-Basel-Cambridge).

Alternative Systeme zur Transformation von monokotylen Pflanzen sind die Transformation mittels des biolistischen Ansatzes, die elektrisch oder chemisch induzierte DNA-Aufnahme in Protoplasten, die Elektroporation von partiell permeabilisier ten Zellen, die Makroinjektion von DNA in Blütenstände, die Mi kroinjektion von DNA in Mikrosporen und Pro-Embryonen, die DNA-Aufnahme durch keimenden Pollen und die DNA-Aufnahme in Embryo nen durch Quellung (zur Übersicht: Potrykus, Physiol. Plant (1990) , 269-273).

Während die Transformation dikotyler Pflanzen über Ti-Plasmid- Vektorsysteme mit Hilfe von Agrobacterium tumefaciens wohl eta bliert ist, weisen neuere Arbeiten darauf hin, daß auch monoko tyle Pflanzen der Transformation mittels Agrobacterium basie render Vektoren sehr wohl zugänglich sind (Chan et al., Plant Mol. Biol. 22 (1993), 491-506; Hiei et al., Plant J. 6 (1994), 271-282; Bytebier et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 5345-5349; Raineri et al., Bio/Technology 8 (1990), 33-38; Gould et al., Plant Physiol. 95 (1991), 426-434; Mooney et al., Plant, Cell Tiss. & Org. Cult. 25 (1991), 209-218; Li et al., Plant Mol. Biol. 20 (1992), 1037-1048).

Drei der oben genannten Transformationssysteme konnten in der Vergangenheit für verschiedene Getreide etabliert werden: die Elektroporation von Gewebe, die Transformation von Protoplasten und der DNA-Transfer durch Partikel-Beschuß in regenerierbare Gewebe und Zellen (zur Übersicht: Jähne et al., Euphytica 85 (1995), 35-44).

Die Transformation von Weizen wird in der Literatur verschie dentlich beschrieben (zur Übersicht: Maheshwari et al., Critical Reviews in Plant Science 14 (2) (1995), 149-178) Hess et al. (Plant Sci. 72 (1990), 233) benutzten das Verfahren der Makroinjektion, um Pollen und Agrobakterien in unmittelbare Nähe zu bringen. Die Mobilisierung des Plasmids, daß das nptII Gen als selektierbaren Marker enthielt, wurde mittels Southern Blot Analyse und NPTII Test nachgewiesen. Die Transformanten zeigten einen normalen Phenotyp und waren fertil. Die Kanamy cin-Resistenz konnte in zwei aufeinanderfolgende Generationen nachgewiesen werden.

Die erste transgene, fertile Weizenpflanze, die nach Beschuß mit Mikroprojektil-gebundener DNA regeneriert werden konnte, wurde von Vasil et al. (Bio/Technology 10 (1992), 667 - 674) beschrieben. Das Zielgewebe für den Beschuß war eine embryogene Kalluskultur (Typ C Kallus). Als Selektionsmarker wurde das bar Gen eingesetzt, das eine Phosphinothricin Phosphotransferase codiert und somit eine Resistenz gegen das Herbicid Phosphinothricin vermittelt.

Ein weiteres System wurde von Weeks et al. (Plant Physiol. 102 (1993), 1077-1084), sowie Becker et al. (Plant J. 5(2) (1994), 299-307) beschrieben. Hier ist das Zielgewebe für die DNA-Transformation das Skutellum unreifer Embryonen, das in einer einleitenden in vitro Phase zur Induktion somatischer Embryonen angeregt wurde. Die Effizienz der Transformation liegt bei dem von Becker et al. (loc cit.) entwickelten System mit 1 transgene Pflanze pro 83 Embryonen der Sorte "Florida" deutlich höher als bei dem von Weeks et al. etablierten System mit 1-2 transgenen Pflanzen pro 1000 Embryonen der Sorte "Bobwhite".

Das von Becker et al. (loc. cit.) entwickelte System bildet die Basis für die in den Beispielen beschriebenen Transformations experimente.

Ist die eingeführte DNA einmal im Genom der Pflanzenzelle in tegriert, so ist sie dort in der Regel stabil und bleibt auch in den Nachkommen der ursprünglich transformierten Zelle er halten. Sie enthält normalerweise einen Selektionsmarker, der den transformierten Pflanzenzellen Resistenz gegenüber einem Biozid, wie Phosphinotricin, oder einem Antibiotikum, wie Ka namycin, G 418, Bleomycin oder Hygromycin u. a. vermittelt. Der individuelle gewählte Marker sollte daher die Selektion trans formierter Zellen gegenüber Zellen, denen die eingeführte DNA fehlt, gestatten.

Die transformierten Zellen wachsen innerhalb der Pflanze in der üblichen Weise (siehe auch McCormick et al., Plant Cell Reports 5 (1986), 81-84). Die resultierenden Pflanzen können normal an gezogen werden und mit Pflanzen, die die gleiche transformierte Erbanlage oder andere Erbanlagen besitzen, gekreuzt werden. Die daraus entstehenden hybriden Individuen haben die entspre chenden phenotypischen Eigenschaften. Von den Pflanzenzellen können Samen gewonnen werden.

Es sollten zwei oder mehrere Generationen angezogen werden, um sicherzustellen, daß das phenotypische Merkmal stabil beibe halten und vererbt wird. Auch sollten Samen geerntet werden, um sicherzustellen, daß der entsprechende Phenotyp oder andere Eigenarten erhalten geblieben sind.

In den Beispielen werden die folgenden Methoden verwendet:

1. Clonierungsverfahren

Zur Clonierung in E.coli wurde der Vektor pBluescript II SK (Stratagene) verwendet.

2. Bakterienstämme

Für den Bluescript-Vektor und für die antisense-Konstrukte wurde der E.coli-Stamm DH5α (Bethesda Research Laborato ries, Gaithersburgh, USA) verwendet. Für die in vivo Excision wurde der E.coli-Stamm XL1-Blue verwendet.

3. Transformation unreifer Weizenembryonen Medien

MS: 100 ml/l Makrosalze (D. Becker und H. Lörz, Plant Tissue Culture Manual (1996), B12: 1-20)
1 ml/l Mikrosalze
2 ml/l Fe/NaEDTA
30 g/l Saccharose
30: MS + 2,4-D (2 mg/l)
31: MS + 2,4-D (2 mg/l) + Phosphinothricin (PPT, aktive Komponente des Herbizids BASTA (2 mg/l)
32: MS + 2,4-D (0,1 mg/l) + PPT (2 mg/l)
39: MS + 2,4-D (2 mg/ml) + je 0,5 M Mannit/Sorbit.

Die angegebenen Medien wurden auf den pH-Wert 5,6 mit KOH eingestellt und mit 0,3% Gelrite verfestigt.

Die Methode zur Transformation unreifer Embryonen aus Wei zen wurde von Becker und Lörz (D. Becker und H. Lörz, Plant Tissue Culture Manual (1996), B12: 1-20) entwickelt und optimiert.

In den nachfolgend beschriebenen Experimenten wurde sich an das von Becker und Lörz (loc. cit.) ausgearbeitete Proto koll gehalten.

Zur Transformation werden Ähren mit Karyopsen der Entwick lungsstufe 12 bis 14 Tage nach Anthesis geerntet und ober flächensterilisiert. Die isolierten Skutella werden mit der dem Medium zugewandten Embryoachse auf Induktionsmedium 30 plattiert.

Nach 2-4tägiger Vorkultur (26°C, dunkel) werden die Ex plantate auf Medium 39 zur osmotischen Vorkultur (2-4 h, 26°C, dunkel) umgesetzt.

Zur biolistischen Transformation werden pro Schuß ca. 29 µg Goldpartikel, auf die zuvor 5 µg der Ziel-DNA gefällt wurde, eingesetzt. Da es sich bei den durchgeführten Expe rimenten um Co-Transformationen handelt, wird die Ziel-DNA in einem Verhältnis von 1:1, bestehend aus dem Zielgen und einem Resistenzmarkergen (bar-Gen) dem. Fällungsansatz zu gegeben.

4. DIG-Markierung von DNA-Fragmenten

Die Markierung von DNA-Fragmenten, die als Screeningsonden eingesetzt wurden, erfolgte über eine spezifische PCR unter Einbau von DIG-markiertem dUTP (Boehringer Mannheim, Deutschland).

Beispiel 1 Identifizierung Isolierung und Charakterisierung einer cDNA′ die eine lösliche Stärkesynthase aus Weizen (Triticum aestivum L., cv Florida) codiert

Die Synthese der cDNA erfolgte aus poly(A)⁺-RNA von ca. 21 Tage alten Weizenkaryopsen. Alle im folgenden angegebenen Durchfüh rungen erfolgten gemäß Protokoll des Herstellers (ZAP-cDNA Syn thesis Kit und ZAP-cDNA Gigapack II Gold Cloning Kit, Strata gene GmbH, Heidelberg).

Nach Titerbestimmung der cDNA-Bank konnte ,ein Primärtiter von 1,25 × 10⁶ pfu/µl ermittelt werden. Das Screenen wurde mit einem DIG-markierten DNA-Fragment durchgeführt. Als Probe wurde hierbei ein DIG-markiertes PCR-Fragment verwendet, das ein Sub fragment der löslichen Stärkesynthase aus Reis codiert (Baba et al., loc. cit.). Die für die PCR verwendeten Primer hatten die Sequenz

Zum Durchmustern wurden ca. 5 × 10⁴ pfu pro Platte (15 cm Durchmesser) ausplattiert. Positive Clone wurden vereinzelt. Über in vivo Excision wurden vereinzelte Clone als pBluescript SK (-) Phagemide erhalten.

Nach Analyse der Clone über Minipräparierungen und Restringie rung der Plasmid-DNA wurde der Clon TaSSS weiterbearbeitet.

Beispiel 2 Sequenzanalyse der cDNA-Insertion des Plasmids pTaSSS

Aus dem Clon TaSSS wurde die Plasmid-DNA isoliert und die Se quenz der cDNA-Insertion durch Standardverfahren mittels der Didesoxynucleotidmethode (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 74 (1977), 5463-5467) bestimmt.

Die Insertion des Clons TaSSS ist 2055 bp lang und stellt eine partielle cDNA dar. Die Nucleotidsequenz ist unter Seq ID No. 1 angegeben. Die korrespondierende Aminosäuresequenz ist unter Seq ID No. 2 dargestellt.

Eine Sequenzanalyse und ein Vergleich mit bereits publizierten Sequenzen zeigte, daß die unter Seq ID No. 1 dargestellte Se quenz neu ist und eine partielle codierende Region umfaßt, die Homologien zu löslichen Stärkesynthasen aus anderen Organismen aufweist. Mit Hilfe der partiellen cDNA-Sequenz von TaSSS ist es für eine molekularbiologisch erfahrene Person möglich, die im 5′-Bereich fehlende Region zu isolieren und somit einen vollständigen cDNA-Clon zu erhalten. Dazu kann einerseits der 5′-Bereich des Clon TaSSS als Sonde zum Screenen der gesamten cDNA eingesetzt und über Standardverfahren mittels Hybridisie rung ein vollständiger Clon isoliert werden. Andererseits kann das fehlende 5′-Ende über die Anwendung einer 5′-Race-Methode (z. B. von Boehringer Mannheim o.a. Herstellern) erhalten wer den.

Beispiel 3 Herstellung des Pflanzentransformationsvektors pTaSSS-as

Zur Expression einer antisense-RNA zu der isolierten cDNA aus Weizen wurde auf der Grundlage von pUC19 als Basisplasmid ein Pflanzentransformationsvektor konstruiert, bei dem die cDNA-In sertion des Plasmids pTaSSS in antisense-Orientierung an ein DNA-Fragment geknüpft ist, wobei die Expression durch den Ubi quitin-Promotor reguliert wird. Dieser Promotor besteht aus dem ersten untranslatierten Exon und dem ersten Intron des ubi qiutin1 Gens aus Mais (Christensen A.H. et al., Plant Molecular Biology 18 (1992), 675-689).

Teile des Polylinkers und der NOS-Terminator stammen aus dem Plasmid pActl.cas (CAMBIA, TG 0063; Cambia, GPO Box 3200, Can berra ACT 2601, Australia). Vektorkonstrukte mit diesem Termi nator und Konstrukten, die auf pAct1.cas basieren, sind in McElroy et al. (Molecular Breeding 1 (1995), 27-37) beschrie ben. Der Vektor pTaSSS-as wurde zur Transformation von Weizen wie oben beschrieben verwendet.

Beispiel 4 Identifizierung Isolierung und Charakterisierung einer weite ren cDNA. die eine Stärkesynthase aus Weizen (Triticum aestivum L., cv Florida) codiert

Aus einem Sequenzvergleich zwischen den bisher bekannten Se quenzen, die lösliche und Stärkekorn-gebundene Stärkesynthasen aus Pflanzen codieren, war ersichtlich, daß es drei stark kon servierte Bereiche zwischen den verschiedenen Proteinen gibt.

Um eine lösliche Stärkesynthase aus Weizen zu isolieren, wurden diese drei Bereiche ausgewählt, um polyclonale Peptidantikörper zu erzeugen. Dazu wurden drei synthetische Polypeptide mit den folgenden Aminosäuresequenzen hergestellt:
Peptid 1: NH₂-PWSKTGGLGDVC-COOH (SEQ ID NO: 7)
Peptid 2: NH₂-PSRFEPCGLNQLY-COOH (SEQ ID NO: 8)
Peptid 3: NH₂-GTGGLRDTVENC-COOH (SEQ ID NO: 9).

Diese Peptide wurden an den KLH-Carrier ("keyhole limpet homocyanin") gekoppelt und anschließend zur Herstellung poly clonaler Antikörper in Kaninchen verwendet (Eurogentec, Seraing, Belgien).

Die resultierenden Antikörper wurden folgendermaßen bezeichnet:
anti-SS1 polyclonaler Antikörper gegen das Peptid 1
anti-SS2 polyclonaler Antikörper gegen das Peptid 2
anti-SS3 polyclonaler Antikörper gegen das Peptid 3.

Die Antikörper wurden anschließend verwendet, um eine cDNA-Bi bliothek aus Weizenkaryopsen nach Sequenzen durchzumustern, die Stärkesynthasen aus Weizen codieren. Hierfür wurde eine cDNA-Expressionsbibliothek, die wie in Beispiel 1 beschrieben herge stellt wurde, verwendet. Zur Analyse der Phagenplaques wurden diese auf Nitrozellulosefilter übertragen, die vorher für 30-60 min in einer 10 mM IPTG-Lösung inkubiert und anschließend auf Filterpapier getrocknet wurden. Der Transfer erfolgte für 3 h bei 37°C. Anschließend wurden die Filter für 30 min bei Raum temperatur in Blockreagenz inkubiert und zweimal für 5-10 min in TBST-Puffer gewaschen. Die Filter wurden mit dem polyclona len Antikörper anti-SS1 in geeigneter Verdünnung für 1 h bei Raumtemperatur oder für 16 h bei 4°C geschüttelt. Die Identifi zierung von Plaques, die ein Protein exprimierten, das von einem der Antikörper erkannt wurde, erfolgte mit Hilfe des Immun-Blot Assay Kit; Goat Anti-Rabbit IgG (Biorad) nach den Angaben des Herstellers.

Phagenclone der cDNA-Bibliothek, die ein Protein exprimierten, das von dem Antikörper anti-SSI erkannt wurde, wurden unter An wendung von Standardverfahren weiter gereinigt. Mit Hilfe der in vivo excision-Methode (Stratagene) wurden von positiven Pha genclonen E.Coli-clone gewonnen, die ein doppelsträngiges pBlueskript II SK-Plasmid mit der jeweiligen cDNA-Insertion zwischen der EcoRI- und der Xhol-Schnittstelle des Polylinkers enthalten. Nach Überprüfung der Größe und des Restriktionsmu sters der Insertionen wurde ein geeigneter Clon, TaSS1, einer Sequenzanalyse unterzogen.

Beispiel 5 Sequenzanalyse der cDNA-Insertionen des Plasmids pTaSS1

Aus dem Clon pTaSS1 wurde die Plasmid-DNA isoliert und die Se quenz der cDNA-Insertionen durch Standardverfahren mittles der Didesoxynucleotidmethode (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463-5467) bestimmt.

Die Insertion des Clons pTaSS1 ist 1742 bp lang und stellt eine partielle cDNA dar. Die Nucleotidsequenz ist unter Seq ID No. 5 angegeben. Die korrespondierende Aminosäuresequenz ist unter Seq ID No. 6 dargestellt.

Eine Sequenzanalyse und ein Vergleich mit bereits publizierten Sequenzen zeigte, daß die unter Seq ID No. 5 dargestellte Se quenz neu ist und eine partiell codierende Region umfaßt, die Homologien zu Stärkesynthasen aus anderen Organismen aufweist. Mit Hilfe der partiellen cDNA-Sequenz von TaSS1 ist es für eine molekularbiologisch erfahrene Person möglich, die im 5′-Bereich fehlende Region zu isolieren und somit einen vollständigen cDNA-Clon zu erhalten. Dazu kann einerseits der 5′-Bereich des Clon TaSSS als Sonde zum Screenen der gesamten cDNA eingesetzt und über Standardverfahren mittels Hybridisierung ein voll ständiger Clon isoliert werden. Andererseits kann das fehlende 5′-Ende über die Anwendung einer 5′-Race-Methode (z. B. von Boehringer Mannheim o.a. Herstellern) erhalten werden.

Beispiel 6 Herstellung des Pflanzentransformationsvektors pTaSS1-as

Zur Expression einer partiellen antisense-RNA zu der isolierten cDNA aus Weizen wurde auf der Grundlage von pUC19 als Basis plasmid ein Pflanzentransformationsvektor konstruiert, der die cDNA-Insertion des Plasmids pTaSS1 partiell in antisense ent hält. Dabei wird die Expression durch den Ubiquitin-Promotor reguliert. Dieser Promotor besteht aus dem ersten untransla tierten Exon und dem ersten Intron des ubiquitin1 Gens aus Mais (Christensen A. H. et al., Plant Molecular Biology 18 (1992), 675-689).

Teile des Polylinkers und der NOS-Terminator stammen aus dem Plasmid pAct1.cas (CAMIA, TG 0063; Cambia, GPO Box 3200, Can berra ACT 2601, Australia). Vektorkonstrukte mit diesem Termi nator und Konstrukte, die auf pAct1.cas basieren, sind in McElroy et al., (Molecular Breeding 1 (1995), 27-37) beschrie ben.

Der Vektor pTaSS1-as wird zur Transformation von Weizen wie oben beschrieben verwendet.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Nucleinsäuremolekül, codierend eine Stärkesynthase aus Weizen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus

(a) Nucleinsäuremolekülen, die ein Protein codieren, das die unter Seq ID No. 2 angegebene Aminosäuresequenz umfaßt;
(b) Nucleinsäuremolekülen, die die unter Seq ID No. 1 dargestellte Nucleotidsequenz umfassen oder eine kor respondierende Ribonucleotidsequenz;
(c) Nucleinsäuremolekülen, die mit den unter (a) oder (b) genannten Nucleinsäuremolekülen hybridisieren und eine lösliche Stärkesynthase codieren;
(d) Nucleinsäuremolekülen, deren Nucleotidsequenz auf grund der Degeneration des genetischen Codes von der Sequenz der unter (a), (b) oder (c) genannten Nucleinsäuremoleküle abweicht;
(e) Nucleinsäuremolekülen, die ein Protein codieren, das die unter Seq ID No. 6 angegebene Aminosäuresequenz umfaßt;
(f) Nucleinsäuremolekülen, die die unter Seq ID No. 5

dargestellte Nucleotidsequenz umfassen oder eine kor respondierende Ribonucleotidsequenz;

(g) Nucleinsäuremolekülen, die mit den unter (e) oder (f) genannten Nucleinsäuremolekülen hybridisieren; und
(h) Nucleinsäuremolekülen, deren Nucleotidsequenz auf grund der Degeneration des genetischen Codes von der Sequenz der unter (e) bis (g) genannten Moleküle ab weicht.

2. Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1, das ein DNA-Molekül ist.

3. DNA-Molekül nach Anspruch 2, das ein cDNA-Molekül ist.

4. Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1, das ein RNA-Molekül ist.

5. Nucleinsäuremolekül, das spezifisch mit einem Transkript eines Nucleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 4 hybridisiert.

6. Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 5, das ein Oligonucleo tid mit einer Länge von mindestens 15 Nucleotiden ist.

7. Vektor, enthaltend ein Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 4.

8. Vektor nach Anspruch 7, wobei das Nucleinsäuremolekül in sense-Orientierung mit regulatorischen Elementen verknüpft ist, die die Transkription und Synthese einer translatier baren RNA in pro- oder eukaryontischen Zellen gewährlei sten.

9. Wirtszelle, die mit einem Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder einem Vektor nach Anspruch 7 oder 8 transformiert ist oder von einer solchen Zelle ab stammt.

10. Protein, codiert durch ein Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 4.

11. Verfahren zur Herstellung eines Proteins nach Anspruch 10, bei dem eine Wirtszelle nach Anspruch 9 unter Bedingungen kultiviert wird, die die Synthese des Proteins erlauben und das Protein aus den kultivierten Zellen und/oder dem Kulturmedium isoliert wird.

12. Transgene Pflanzenzelle, die mit einem Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder einem Vektor nach Anspruch 7 oder 8 transformiert wurde oder die von einer solchen Zelle abstammt, wobei das Nucleinsäuremolekül, das eine lösliche Stärkesynthase aus Weizen codiert, unter der Kontrolle regulatorischer Elemente steht, die die Transkription einer translatierbaren mRNA in pflanzlichen Zellen erlauben.

13. Pflanze, enthaltend Pflanzenzellen nach Anspruch 12.

14. Pflanze nach Anspruch 13, die eine Nutzpflanze ist.

15. Pflanze nach Anspruch 14, die eine stärkespeichernde Pflanze ist.

16. Pflanze nach Anspruch 15, die eine Weizenpflanze ist.

17. Vermehrungsmaterial einer Pflanze nach einem der Ansprüche 13 bis 16, enthaltend Pflanzenzellen nach Anspruch 12.

18. Stärke, erhältlich aus einer Pflanze nach einem der An sprüche 13 bis 16 oder aus Vermehrungsmaterial nach An spruch 17.

19. Transgene Pflanzenzelle, dadurch gekennzeichnet, daß in dieser Pflanzenzelle die Aktivität eines Proteins nach An spruch 10 verringert ist.

20. Pflanzenzelle nach Anspruch 19, wobei die Verringerung der Aktivität in dieser Zelle durch die Expression einer anti sense-RNA zu Transkripten eines DNA-Moleküls nach Anspruch 1 erreicht wird.

21. Pflanze, enthaltend Pflanzenzellen nach Anspruch 19 oder 20.

22. Pflanze nach Anspruch 21, die eine Nutzpflanze ist.

23. Pflanze nach Anspruch 22, die eine stärkespeichernde Pflanze ist.

24. Pflanze nach Anspruch 23, die eine Weizenpflanze ist.

25. Vermehrungsmaterial einer Pflanze nach einem der Ansprüche 21 bis 24, enthaltend Zellen nach Anspruch 19 oder 20.

26. Stärke, erhältlich aus Pflanzen nach einem der Ansprüche 21 bis 24 oder aus Vermehrungsmaterial nach Anspruch 25.

27. Verwendung der Stärke nach Anspruch 18 oder 26 zur Her stellung von Nahrungsmitteln.

28. Verwendung nach Anspruch 27, wobei die Nahrungsmittel Back- oder Teigwaren sind.

29. Verwendung der Stärke nach Anspruch 18 oder 26 zur Her stellung von Verpackungsmaterial oder Einwegartikeln.