DE1543462C3 - Verfahren zur mikrobiologischen 11-Hydroxylierung von Steroiden der Pregnanreihe in Gegenwart von Dimethylsulfoxyd - Google Patents

Verfahren zur mikrobiologischen 11-Hydroxylierung von Steroiden der Pregnanreihe in Gegenwart von Dimethylsulfoxyd

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DE1543462C3 DE1543462A DE1543462A DE1543462C3 DE 1543462 C3 DE1543462 C3 DE 1543462C3 DE 1543462 A DE1543462 A DE 1543462A DE 1543462 A DE1543462 A DE 1543462A DE 1543462 C3 DE1543462 C3 DE 1543462C3
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Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur selektiven, mikrobiologischen 11-Hydroxylierung von Steroiden der Pregnanreihe durch Fermentation des Steroids mit bekannten Stämmen von 11-hydroxylierenden Organismen in Anwesenheit von Dimethylsulfoxyd.
Die 11-Hydroxylierung von Steroiden unter Verwendung verschiedener Stämme von Fungi und Bakterien ist ein bekanntes Verfahren, das schon einige Jahre in der Technik angewendet wurde. So wurde z. B. die Verwendung von Fungi der Art Mucorales zur 11-Hydroxylierung verschiedener Steroide beschrieben. Im allgemeinen führen einige dieser Fungi eine 11 α-Hydroxylgruppe ein, und bestimmte andere der Art Mucorales aus der Familie der Mucoraceae, wie z. B. Cunninghamella (blakesleeana, bainieri, elegans, echinulata), führen eine 11 ^-Hydroxylgruppe ein. Verschiedene Patentschriften und Veröffentlichungen zeigten, daß andere Familien und Arten von Fungi und Bakterien ebenfalls die 11-Hydroxylgruppe einführen können, wie z. B. Curvularia, Streptomyces usw.
Im allgemeinen waren die durch die bekannten Verfahren erhältlichen Ausbeuten nicht quantitativ und gingen selten über 50% 11-hydroxyliertes Steroid, bezogen auf das Ausgangsmaterial, hinaus, obgleich in manchen Fällen durch Verwendung bestimmter Steroide und Kulturen die Ausbeuten etwas über dieser Menge lagen. Zur Erklärung dieser niedrigen Ausbeuten wurden verschiedene Theorien vorgebracht, und es ist z. B. bekannt, daß in vielen Fällen Nebenreaktionen die Bildung 6-hydroxylierter Produkte, 15-hydroxylierter Produkte und polyhydroxylierter Produkte bewirkten. Weiterhin traten auch in manchen Fällen Seitenketten- und andere Steroidzersetzungen auf. Diese Nebenreaktionen haben nicht nur die Ausbeuten an gewünschtem Steroid verringert, sondern auch Mischungen von Produkten geliefert, die sehr schwer zu trennen sind.
In Appl. Microbiol. 8 (I960), S. 345 bis 348, wird ein Verfahren zur Hydroxylierung in 11 α-Stellung mittels verschiedener Mikroorganismen beschrieben. Den Tabellen auf S. 346 kann entnommen werden, daß die Ausbeute bei einem nicht vorbehandelten Steroid 40 bis 60% beträgt. Nur bei in spezieller Weise durch Feinvermahlung vorbehandelten Ausgangsmaterialien kann eine höhere Ausbeute erhalten werden. Ziel der vorliegenden Erfindung ist es nun, auch ohne Vorbehandlung von Steroiden höhere Ausbeuten, und zwar auch bei der 11/7-Hydroxylierung zu erreichen.
Das vorliegende Verfahren zur Herstellung von 11-hydroxylierten. Steroiden der Pregnanreihe durch bekannte mikrobiologische 11-Hydroxylierungsverfahren ist nun dadurch gekennzeichnet, daß man die Reaktion in Anwesenheit von Dimethylsulfoxyd durchführt. Es ist nicht ganz bekannt, welche Erklärung für diese überraschende und günstige Wirkung gegeben werden kann.
Möglicherweise verändert das Dimethylsulfoxyd selektiv, oder es beschleunigt den Transport des Steroids und/oder der Enzyme durch die Zellmembran oder das Gewebe. Die festgestellte, merkliche Wirkung beruht möglicherweise auch auf einer Inhibierung bestimmter Enzyme, oder das Wachstum von Fungi und/oder Bakterien kann selektiv sein, was die 11-Hydroxylierung auf Kosten von Nebenreaktionen begünstigt. Weiterhin kann das Dimethylsulfoxyd auch die Extraktion des Steroids aus dem Mycellium
«5 unterstützen. So wurde festgestellt, daß durch Zugabe von 1 bis 50% Dimethylsulfoxyd zu einer Cunninghamella blakesleeana enthaltenden Fermentationsbrühe und anschließende Zugabe des Steroids zu diesem Fermentationsmedium und Bebrütung der erhaltenen Mischung für die Dauer von 4 bis 48 Stunden eine höhere Ausbeute des 11/3-hydroxylierten
". Steroids erhalten und gleichzeitig die Gesamtausbeute an Steroid erhöht wird. Weiterhin zeigt eine Untersuchung der Produkte aus der obigen Reaktion, daß
*5 weniger Produkte mit einer Hydroxylgruppe an an-. deren Stellen als C-Il sowie weniger Produkte aus ' Nebenreaktionen, die unter Zersetzung der Steroidseitenketten am C-16 und/oder C-17 erfolgten, vorliegen.
Die erfindungsgemäße Reaktion ist besonders geeignet zur Fermentation der oa-Fluoro-loJV-acetonid-Verbindung »S«.
' Erfindungsgemäß wird daher gezeigt, daß das in steroiden· Fermentationen, die als Ziel die Herstellung von 11-hydroxylierten Steroiden haben, verwendete Dimethylsulfoxyd eine sehr wesentliche Wirkung hat und in Konzentrationen von etwa 1 bis 50% der gesamten Ausgangsbrühe verwendet werden kann. Vorzugsweise werden etwa 10% verwendet. Es wird jedoch darauf hingewiesen, daß die für eine optimale Wirkung verwendete Konzentration für verschiedene Arten von Fermentationen unterschiedlich sein kann. Der optimale Prozentsatz an Dimethylsulfoxyd für die Art Cunninghamella blakesleeana und für die Fermentation der oa-Fluoro-loJT-acetonid-Verbindung »S« scheint bei etwa 10% zu liegen. Ist das fermentierte Steroid die Verbindung »S«, so liefert selbst mit der-
j, selben Art Stamm eine andere Dimethylsulfoxydkonzentration innerhalb des oben angegebenen, allgemeinen Bereiches optimale Ergebnisse. Bei Verwendung anderer, bekannter Steroide und anderer KuI-• türen in den Fermentationen und bei Verwendung von Dimethylsulfoxyd sind möglicherweise wieder andere Konzentrationen zur Begünstigung der Bildung 11-hydroxylierter Produkte am wirksamsten.
Als Ausgangsmaterial für das erfindungsgemäße Verfahren kann praktisch jede Steroidverbindung der Pregnanreihe verwendet werden, die 18 bis 27 Kohlenstoffatome enthält und am C-Il unsubstituiert ist.
Die verwendeten Verbindungen besitzen häufig eine Keto- oder Hydroxylgruppe am C-3, sie können aber auch an dieser Stellung unsubstituiert sein. Die verwendeten Verbindungen können gesättigt oder ungesättigt sein, wobei Doppelbindungen am C-I, C-4, C-5, C-6 und/oder C-16 anwesend sein können. Das Pregnanmolekül kann einen oder mehrere weitere Substituenten enthalten, insbesondere Halogenatome am C-2, 6,16 und/oder 21, Alkylgruppen am C-2,4, 6,
16, 17 usw., Alkylidendioxygruppen am C-16,17 usw. Am C-1,2,4,6,7,12,14,15,16,17,19 und 21 können auch andere Substituenten anwesend sein.
Geeignete Ausgangsmaterialien sind z. B.: Progesteron, 17a-Hydroxy-progesteron, 17a-Acetoxyprogesteron, Pregnenolon, Allopregnenolon, 6a-Methyl - 17a - hydroxy - progesteron, 6a - Fluoro - 17ahydroxy - progesteron, 6 - Chloro - 6 - dehydro - 17ahydroxy - progesteron, 21 - Fluoro - progesteron, 3-Desoxy-progesteron, 19-nor-Progesteron, Desoxycorticosteron, Δ4 - Pregnen - 17a,21 - diol - 3,20 - dion (Verbindung »S«), 6a - Methyl »S«, 6a - Fluoro »S«, 6a - Chloro »S«, 16a - Methyl »S«, 16/3 - Methyl »S«, 16a-Hydroxy»S«, 16a,17a-Acetonid von 16a-Hydroxy »S«, 6a-Fluoro-16a-methyl »S«, 16a,17a-Acetonid von 6a-Fluoro-16a-hydroxy »S«, /I5-Pregnen-3/3,17a,21 - triol - 20 - on, 6,16a - Dimethyl »S«, AlIopregnan-30,17a,21 -triol-20-on, Allopregnan-170,21* diol-3,20-dion, 16a-Methyl-allopregnan-17a,21 -diol-3,20-dion, 1-Dehydro »S«, 6 - Dehydro »S«, 1-Dehydro - 16a - methyl »S«, 1,6 - Bisdehydro »S« und 6-Fluoro-16a-methyl-l-dehydro »S« usw.
Wie oben ausgeführt, sind die erfindungsgemäß verwendbaren Mikroorganismen diejenigen, die in der Literatur zur Bewirkung der lla- oder 11/S-Hydroxylierung beschrieben sind. Diese Mikroorganismen sind Fungi oder Bakterien.
Die verwendeten Fungi gehören zu den Klassen Phycomyceteae, Ascomyceteae,Basidiomyceteae und Fungi Imperfecti.
Die am häufigsten zur 11-Hydroxylierung verwendeten Phycomycetes gehören zur Gruppe Mucorales, Familie Mocuraceae, insbesondere solche, die zum Genus Absidia oder Rhizopus gehören, wie z. B. Absidia glauca, Rhizopus nigricans und Rhizopus arrhizur, oder zur Familie Choanephoraceae, insbesondere der Genus Cunninghamella; besonders wirksam sind Cunninghamella blakesleeana, Cunninghamella bainieri, Cunninghamella elegans und Cunninghamella echinulata.
Die für derartige Reaktionen verwendeten Ascomycetes gehören zu den Gruppen Hypocreales, Sphaeriales und Eurotiales, wie z. B. Giberella fujikuroi, Neurospora sitophila und Eurotium chevalieri.
Die für die 11-Hydroxylierung verwendeten Basidiomycetes gehören insbesondere zur Gruppe Agaricales, Familie Agaricaceae, der Genera Psilocybe, Stropharia und Conobybe und insbesondere die Arten Panaeolus campanulatus und Psilocybe caerulescens, var. Mazatecorum.
Erfindungsgemäß geeignete Fungi Imperfecti sind z.B.:
Curvularia Iunata,
Fusarium moniliforme und andere Fusarium-Arten,
Stachylidium bicola,
Helmintosporium sativum,
Cephalotecium roseum,
Pestalotia foedans,
Dactylium dendroides,
Aspergillus ochraceus,
' Aspergillus niger und andere Aspergillus-Arten, Penipillium chrysogenum,
Penicillium notatum,
Penicillium nigricans,
Penicillium roqueforti und andere Peniciliium-Arten,
Spondylocladium australe,
Arthrobotrys superba,
Coniothyrium-Arten,
Pycnosporium-Arten,
Rhodoseptoria-Arten,
Trichothecium roseum,
Stachylidium theobromae und
Epicoccum-Arten.
ίο Erfindungsgemäß können auch andere Mikroorganismen verwendet werden, die zu den Bakterien (Gruppe Actinomycetales) und insbesondere Streptomyces-Arten, wie Streptomyces fradia, gehören.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Kulturmedien enthalten hauptsächlich eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, Kofaktoren und Mineralien.
Kohlenstoffquellen sind z. B. Kohlehydrate, wie Glucose, Maltose, Mannose, Dextrose, Lactose, Sucrose, Galactose, Melassen usw., Polyalkohole, wie Glycerin, Mannit usw., Stärken usw.
Geeignete Quellen für organischen Stickstoff sind pflanzliche oder tierische Proteine, wie Sojabohnenmehl, Maismehl, Milcheiweiß, Kasein, Peptone, Aminosäuren oder handelsübliche Produkte, wie »Phytone« (enzymatisches Verdauungsprodukt von Sojamehl), »Casitone« oder »Edamine« (Milcheiweißhydrolysate), »Micophil« (Sojabohnenprotein), »Nutrient L-l« (Milcheiweißhydrolysat der Scheffield
30; Farms, Norwick, N. Y.), »N.Z.-amine« (pankreatisches Hydrolysat von Kasein; Baltimore Biol. Lab., Baltimore Md.) und andere ähnliche Produkte. Als Stickstoffquellen können auch verschiedene Nitrate oder Ammoniumsalze, wie Natrium- oder Kaliumnitrat, Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfat, Ammoniumhydroxydlösungen, Harnstoff usw. verwendet werden.
Die Mineralbestandteile sind in Form von Salzen, insbesondere als Chloride, Phosphate und Sulfate von Natrium, Kalium, Mangan, Eisen usw., anwesend. Als Kofaktoren können Hefeextrakt, Kartoffelabsud, Vitamine usw. erwähnt werden.
Im allgemeinen sind die erfindungsgemäß verwendeten, flüssigen Kulturmedien diejenigen, die in den bekannten Verfahren verwendet werden und variieren mit dem oxygenierenden Mikroorganismus.
Weiterhin ist es zweckmäßig, ein Antischaummittel, wie z. B. Silicium, Glyceridöle und Wachse, Sojabohnenöl, Rizinusöl, sulfonierte öle, Mineralöle usw. zuzufügen. Der pH-Wert der Kulturmedien wird auf den zum Wachstum jedes Mikroorganismus geeigneten, optimalen Wert eingestellt.
Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird zu einem Mycelialwachstum des oxygenierenden Mikroorganismus, das nach Bebrütung einer Kultur desselben im entsprechenden flüssigen Medium für die Dauer zwischen 6 bis 48 Stunden, vorzugsweise 24 Stunden, erhalten wird, vorsichtig die gewünschte Dimethylsulfoxydmenge zugefügt, wobei dafür gesorgt wird, daß die Temperatur des Mediums nicht über etwa 28° C steigt. Zu dem ganzen wird dann das als Substrat verwendete Steroid in fester Form oder in der Mindestmenge eines Lösungsmittels, wie Äthanol, Dioxan, Aceton, usw., gelöst zugegeben. Das zu hydroxylierende Steroid kann auch in einer kleinen Menge Dimethylsulfoxyd gelöst werden, wie sie für die gewünschte Konzentration im Medium als notwendig berechnet wurde. Nach Zugabe des Steroids
wird die Bebrütung — abhängig vom Substrat — für die Dauer zwischen 4 bis 48 Stunden wieder aufgenommen, wobei von Zeit zu Zeit Aliquote entnommen werden, die durch Papierchromatographie analysiert werden.
Nach beendeter Reaktion wird die Mischung mit dem Zweifachen ihres Volumens eines organischen, mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittels, wie Äther, Methylendichlorid, Äthylacetat usw., insbesondere Methylendichlorid, extrahiert, und der organische Extrakt wird einige Mal mit Wasser gewaschen, um das Dimethylsulfoxyd zu eliminieren, wobei die vereinigten Waschmaterialien zur Vermeidung eines Steroidverlustes erneut mit Methylendichlorid extrahiert werden. Der vereinigte Extrakt wird getrocknet, zur Trockne eingedampft und nach üblichen Verfahren gereinigt.
Selbstverständlich kann das erfindungsgemäße Verfahren an Stelle einer Kultur des Mikroorganismus auch mit einer Lösung der dadurch gebildeten Enzyme oder mit einer Sporensuspension durchgeführt werden.
Beispiel 1
In fünf 1-1-Erlenmeyerkolben, die je 200 ecm eines Kulturmediums der folgenden Zusammensetzung enthielten, wurde eine Kultur von Cunninghamella blakesleeana ATCC 8688b hergestellt:
Sojabohnenmehl 5 g
Hefeextrakt (»Difco«) 5 g
K2HPO4 5 g
NaCl 5 g
Cerelose (handelsübl. Glucose) 20 g
Dest. Wasser auf 11
Der pH-Wert dieses Kulturmediums wurde auf 7,2 eingestellt.
Nach 24stündigem Wachstum bei 28 bis 300C unter Belüftung und Rühren (250 U/Min.) wurde der Inhalt der Kolben vereinigt und in ein Fermentationsgefäß von 14 1 Inhalt aus rostfreiem Stahl gegeben, das 41 desselben Kulturmediums und 10 g »Silicone A« als Antischaummittel enthielt. Unter Aufrechterhaltung einer Temperatur unter 28° C wurden dann vorsichtig 500 ecm Dimethylsulfoxyd (10 Volumprozent) und 500 mg 6a-Fluoro-16a,17a-isopropylidendioxyzl4-pregnen-21-ol-3,20-dion in 50 ecm 95%igem Äthanol zugegeben und die Bebrütung bei derselben Temperatur unter Rühren (273 U/Min.) und Belüftung (1 Yol/1/min) 12 Stunden fortgesetzt. Nach dieser Zeit wurde das Produkt dreimal mit Methylenchlorid extrahiert und der organische Extrakt einige Male zur Eliminierung des Dimethylsulfoxyds gewaschen, wobei die Waschwasser zur Vermeidung eines Steroidverlustes erneut extrahiert wurden. Die vereinigten Extrakte wurden über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Der feste Rückstand wurde durch Chromatographie auf Kieselsäuregel-Celite gereinigt, wodurch oa-Fluoro-loa.na-isopropylidendioxy - A4 - pregnen -11 /9,21 - diol - 3,20 - dion (Acetonid von oa-Fluoro-loa-hydroxyhydrocortison) in reiner, mit einer authentischen Probe identischer Form in 76%iger Ausbeute erhalten wurde.
Beispiel 2
Beispiel 1 wurde unter Weglassen von Dimethylsulfoxyd wiederholt. So wurde das Acetonid von
6a-Fluoro- 16a-hydroxy-hydrocortison in 30- bis 40%iger Ausbeute erhalten.
Beispiel 3
Beispiel 1 wurde wiederholt, wobei die Bebrütungszeit auf 6 Stunden verringert wurde; so wurde das Acetonid von 6a-Fluoro-16a-hydro-hydrocortison in 68%iger Ausbeute erhalten.
Beispiel 4
Im Verfahren von Beispiel 1 wurde die Bebrütungszeit auf 8 Stunden verringert, wodurch die 11/9-hydroxylierte Verbindung in 72%iger Ausbeute erhalten wurde.
Beispiel5
Beispiel 1 wurde wiederholt, wobei jedoch 25 Volumprozent Dimethylsulfoxyd zugegeben wurden; so wurde das Acetonid von 6a-Fluoro-16a-hydroxyhydrocortison in 50%iger Ausbeute erhalten. In einem anderen Versuch wurden gleiche Mengen an Kulturmedium und Dimethylsulfoxyd verwendet, wodurch das hydroxylierte Produkt in 40%iger Ausbeute erhalten wurde.
B e i s ρ i e 1 6
Im Verfahren von Beispiel 1 wurde die Bebrütungszeit auf 12 Stunden ausgedehnt, wodurch das Acetonid von 6a - Fluoro - 16a - hydroxy - hydrocortison in 70%iger Ausbeute erhalten wurde.
Beispiel 7
Die im folgenden unter I genannten Verbindungen wurden gemäß Beispiel 1 mit einer Kultur von Cunninghamella blakesleeana ATCC 8688 b in Anwesenheit von 10 Volumprozent Dimethylsulfoxyd bebrütet, wodurch die entsprechenden, unter II aufgeführten 11/9-Hydroxy-Verbindungen erhalten wurden.
Verbindung »S«
Acetonid von
16a-Hydroxy »S«
6a-Fluoro-,d4-pregnen-17a,21-diol-3,20-dion
6a-Chloro-zl4-pregnen-17a,21-diol-3,20-dion
■ 6a-Methyl-/)4-pregnen-
17a,21-diol-3,20-dion
16a-Methyl-zl4-pregnen-17a,21-diol-3,20-dion
16/3-Methyl-zl4-pregnen-17a,21-diol-3,20-dion
6a-Fluoro-16a-methyl-/J4-pregnen-17a,21 -diol-3,20-dion
6a-Fluoro-16/S-methyl-/d4-pregnen-17a,21-diol-
3,20-dion
Progesteron
Hydrocortison
Acetonid von
16a-Hydroxyhydro-
cortison
6a-Fluoro-hydrocortison
6a-Chloro-hydro-
cortison
6a-Methyl-hydro-
cortison
16a-Methyl-hydro-
cortison
16/9-Methyl-hydro-
cortison
6a-Fluoro-16a-methyl-
hydrocortison
6a-Fluoro-l 6/J-methylhydrocortison
11/9-Hydroxyprogesteron
Fortsetzung
I II
17a-Hydroxy-progesteron ll|8,17a-Dihydroxy-
progesteron
όα-Methyl- 17a-acetoxy- 6a-Methyl-l lß-hydroxy-
progesteron 17a-acetoxy-
progesteron
6-Chloro-^l4i6-pregnadien- 6-Chloro-zl4>6-pregna-
17a-ol-3,20-dion-acetat dien-ll/3,17a-diol-
3,20-dion-17-acetat
zl^-Pregnadien-na^l- <d1>4-Pregnadien-
diol-3,20-dion ll/3,17a,21-triol-
3,20-dion
6a-Fluoro-zl1'4-pregna- oa-Fluoro-^1 i4-pregna-
dien-17a,21-diol- dien-ll/3,17a,21-triol-
3,20-dion 3,20-dion
όα-Fluoro-16a-methyl- 6a-Fluoro-16a-methyl-
Δ1 <4-pregnadien-17a,21 - /I1>4-pregnadien-
diol-3,20-dion ll/S,17a,21-triol-
3,20-dion
6a-Fluoro-16/3-methyl- 6a-Fluoro-16ß-methyl-
zl1'4-pregnadien-17a,21- zl1'4-pregnadien-
diol-3,20-dion Ilftl7a,21-triol-
3,20-dion
Beispiel 8
Es wurde eine Kultur von Rhizopus nigricans hergestellt, indem man ein wäßriges, 2% Pepton und 5% . Maissirup enthaltendes Medium mit einer wachsenden Kultur des obigen Pilzes im selben Medium beimpfte und 24 Stunden unter Belüftung bei 28° C rührte.
Zu 340 ecm dieser Kultur wurden dann langsam 30 ecm Dimethylsulfoxyd zugegeben, wobei die Temperatur um 280C gehalten wurde; dann wurden 100 mg Progesteron in 4 ecm Dimethylsulfoxyd zugefügt und die Mischung weitere 24 Stunden bei 28° C unter Belüftung gerührt. Das Produkt dieser Bebrütung wurde einige Male mit Methylenchlorid extrahiert, der Extrakt mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck auf ein kleines Volumen konzentriert.
Die konzentrierten Extrakte wurden auf einer Kolonne aus 20 g Kieselsäuregel und 20 g Celit absorbiert, die vorher mit Methylenchlorid gewaschen worden war. Die Eluierung mit einer 80:20-Mischung aus Methylenchlorid und Aceton und Umkristallisation ergab das lla-Hydroxy-progesteron in 75%iger Ausbeute.
Beispiel 9
Ein Stamm Curvularia lunata ATCC 13935 wurde in einem Sabouraud-Glucose-Agar-Medium (»Difco«) gezüchtet. Das nach einwöchiger Bebrütung bei 25° C erhaltene Wachstum wurde in 5 ecm sterilem Wasser suspendiert. Diese Suspension wurde in fünf Anteile von je 1 ecm geteilt, die zur Beimpfung von fünf Erlenmeyerkolben von 250 ecm Fassungsvermögen verwendet wurden, die je 50 ecm eines Kulturmediums der folgenden Zusammensetzung enthielten:
Glucose 20 g
(NHJ2HPO4 5 g oder.
NaNO3 3 g
K2HPO4 Ig
MgSO4 -7H2O 0,2 g
KCl 0,5 g
ZnSO4 Spuren
FeSO4 · 7H2O Spuren
Dest. Wasser auf 11
Die Kulturen wurden 72 Stunden bei 25° C unter rotierendem Rühren bebrütet. Das Wachstum wurde
1 Minute in einem Waring-Mischer homogenisiert;
2 ecm Anteile der so erhaltenen Suspension wurden zur Beimpfung von 100 Erlenmeyerkolben verwendet, die die gleiche Menge des oben beschriebenen Mediums enthielten. Die Mischungen wurden 24 Stunden bei 25°C und Rühren bei 280 U/Min, bebrütet; zu jedem Kolben wurden 5 ecm Dimethylsulfoxyd und 50 mg Verbindung »S« in 2 ecm 95%igem Äthanol zugefügt und die Bebrütung unter denselben Bedingungen 24 Stunden fortgesetzt. Die Kolbeninhalte wurden vereinigt und mit 4 Teilen Methylenchlorid extrahiert. Der vereinigte Extrakt wurde zur Eliminierung von Dimethylsulfoxyd gut mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und bei niedriger Temperatur auf ein Volumen von 25 ecm konzentriert. Diese Lösung wurde auf 4 g Kieselsäuregel absorbiert und mit einer 9:1-Mischung aus Methylenchlorid und Äther eluiert; so wurde Hydrocortison in 75%iger Ausbeute erhalten.
Beispiel-10
Eine Kultur Psilocybe caerulescens, Var. Mazatecorum (Heim) ATCC 13964 wurde durch reihenweise Überführung (transference) alle 2 Wochen in einem Mycophyl-Agar- oder Malz-Agar-Medium unter Bebrütung bei einer Temperatur von 25 bis 28° C gehalten.
Das in einem geneigten Agarrohr erhaltene Wachstum wurde in 10 ecm sterilem Wasser suspendiert; 2 ecm dieser Suspension wurden zum Beimpfen eines Erlenmeyerkolbens verwendet, der 200 ecm des folgenden Kulturmediums enthielt:
Phyton 2 g
Dextrose 2 g
Wasser auf 200 ecm
Die Kulturen wurden unter rotierendem Rühren (200 U/Min.) 3 Tage bei 25 bis 28°C bebrütet; das so erhaltene Mycelium wurde in einem Mischer dispergiert. 20 ecm der so erhaltenen mikrobialen Suspension wurden zum Beimpfen von zehn 1-1-Erlenmeyerkolben verwendet, die je 200 ecm desselben Kulturmediums enthielten; dann wurde weitere 24 Stunden bebrütet. Anschließend wurde jedem Kolben langsam 10 ecm Dimethylsulfoxyd zugefügt.
Jedem Kolben wurden 50 mg des 3,21-Diacetates
von zl5-Pregnen-3/?,17a,21-triol-20-on zugefügt, und es wurde weitere 48 Stunden bei derselben Temperatur unter Belüftung weiter gerührt. Die Kolbeninhalte wurden vereinigt und einige Male mit Methylenchlorid extrahiert; der Extrakt wurde mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in einer mit 12 g Kieselsäuregel und 12 g Celite gefüllten Kolonne absorbiert; so wurde das zl4-Pregnen-lla,17a,21-triol-3,20-dion mit einem F. von 217 bis 219° C, das mit einer authentischen Probe von 11-Epi »F« identisch ist, erhalten.
409 644/20
Beispiel 11
Das vegetative Wachstum von Gibberella fujikuroi (Fusarium moniliforme), ATCC 11161, das nach einwöchigem Bebrüten bei 25° C in einem ehr Kartoffeldextrose-Agar-Medium enthaltenden, geneigten Testrohr erhalten wurde, wurde in 10 ecm sterilem Wasser suspendiert. Dann wurde 1 ecm dieser Suspension zum Beimpfen von zehn 1-1-Erlenmeyerkolben verwendet, die je 200 ecm einer mit 0,05% Hefeextrakt angereicherten Scapeks Lösung enthielten. Die KoI-ben wurden in Anwesenheit von Luft unter Tauch-(submerged-)Bedingungen (rotierende Schüttelvorrichtungen mit 150 U/Min.) 18 bis 21 Stunden gerührt, um ein reichliches Wachstum des Mikroorganismus zu erhalten. Jedem Kolben wurden dann 15 ecm Dimethylsulfoxyd unter Aufrechterhaltung einer Temperatur von 25 bis 28° C und 50 mg 6a-Fluoro-16a, 17a - isopropylidendioxy - Δ4 - pregnen - 21 - ol-3,20-dion zugefügt, worauf weitere 18 Stunden unter denselben Bedingungen bebrütet wurde. Nach dieser Bebrütung wurden die Kolbeninhalte vereinigt und einige Male mit Methylenchlorid extrahiert; der Extrakt wurde gut mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft, Der Rückstand wurde in Methylenchlorid gelöst und in einer mit 15 g Kieselsäuregel und 15 g Celite gefüllten Kolonne absorbiert. Die aus der Kolonne mit Äther und einer 90:10-Mischung aus Äther und Aceton eluierten Fraktionen enthielten 400 mg όα-ΡηιοΓο-Ιόα,Πα-ΐβορΓΟ-pyliden-dioxy-zJ4-pregnen-lla,21-diol-3,20-dion, das mit einer authentischen Probe identisch war.

Claims (1)

  1. Patentanspruch:
    Verfahren zur Herstellung von 11-hydroxylierten Steroiden der Pregnanreihe durch bekannte mikrobiologische 11 - Hydroxylierungsverfahren, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reaktion in Anwesenheit von Dimethylsulfoxyd durchführt.
DE1543462A 1965-03-15 1966-03-12 Verfahren zur mikrobiologischen 11-Hydroxylierung von Steroiden der Pregnanreihe in Gegenwart von Dimethylsulfoxyd Expired DE1543462C3 (de)

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