DE1189763B - Reagent for controlling the coagulability of the blood during anticoagulant therapy and method for the preparation of the reagent - Google Patents
Reagent for controlling the coagulability of the blood during anticoagulant therapy and method for the preparation of the reagentInfo
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Description
BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLANDFEDERAL REPUBLIC OF GERMANY
DEUTSCHESGERMAN
PATENTAMTPATENT OFFICE
AUSLEGESCHRIFTEDITORIAL
Int. CL:Int. CL:
GOInGOIn
Deutsche KL: 421-3/54German KL: 421-3 / 54
Nummer: 1189 763Number: 1189 763
Aktenzeichen: O6747IXb/421File number: O6747IXb / 421
Anmeldetag: 30. April 1959 Filing date: April 30, 1959
Auslegetag: 25. März 1965Opening day: March 25, 1965
Orale Antikoagulantien (Dikumarol und Dikumarolabkömmlinge, Phenylindandion und ähnliche Substanzen) bewirken eine Herabsetzung der Gerinnungsfähigkeit des Blutes. Sie kommen in großem Maße bei der Behadlung und Vorbeugung thrombotischer Geschehen zur Anwendung. Die Thromboseprophylaxe findet mehr und mehr bei arteriosklerotischen Leiden (Coronar-Infarkt, Angina pectoris, cerebrale und periphere arterielle Thrombosen) allgemeine Anwendung.Oral anticoagulants (dikumarol and dikumarol derivatives, Phenylindandione and similar substances) reduce the ability to clot of the blood. They come in great measure in the treatment and prevention of thrombotic Done for application. The thrombosis prophylaxis takes place more and more in arteriosclerotic Conditions (coronary infarction, angina pectoris, cerebral and peripheral arterial thrombosis) general Use.
Eine wirkungsvolle Behandlung mit Antikoagulantien fordert eine regelmäßige Überwachung der Gerinnungsfähigkeit des Blutes. Es ist notwendig, die Dosierung individuell zu gestalten; denn auf der einen Seite gilt es, Blutungskomplikationen, bedingt durch Überdosierung, zu meiden, auf der anderen Seite ist die Behandlung bei zu kleinen Gaben wirkungslos. Effective treatment with anticoagulants requires regular monitoring of the ability to clot of the blood. It is necessary to customize the dosage; because on the On the one hand it is important to avoid bleeding complications caused by overdosing, on the other hand On the other hand, the treatment is ineffective if the dose is too small.
Mit früher beschriebenen Kontrollmethoden war es nicht möglich, die Gerinnungsfähigkeit des Blutes in jedem Fall mit ausreichender Sicherheit individuell genug zu bestimmen, um die Schwierigkeiten bei der Dosierung zu lösen. Man benötigt daher dringend eine Bestimmungsmethode, die eine genaue Kontrolle möglich macht.With the control methods described earlier it was not possible to determine the coagulability of the blood individually enough to determine each case with sufficient certainty to identify the difficulties in the To solve dosage. There is therefore an urgent need for a method of determination that allows precise control makes possible.
Aus der folgenden Darlegung der Erfindung geht hervor, wie das vorliegende Problem mit Hilfe eines besonderen, hierfür entwickelten Reagens in einer zufriedenstellenden Weise gelöst ist.From the following statement of the invention it is apparent how the present problem with the help of a special reagent developed for this purpose is dissolved in a satisfactory manner.
Um die Erfindung leichter verständlich zu machen, soll zunächst ein kurzer Überblick über den Wirkungsmechanismus der Antikoagulantien gegeben werden.In order to make the invention easier to understand, a brief overview of the mechanism of action should first be given the anticoagulants are given.
Die Blutgerinnung ist abhängig von zwei teilweise voneinander getrennten Gerinnungssystemen, dem externen und dem internen System. Die peroral appli-Blood coagulation depends on two partially separate coagulation systems, the external and the internal system. The peroral appli-
Reagens zur Kontrolle der Gerinnungsfähigkeit des Blutes während einer Antikoagulantien-Therapie und Verfahren zur Herstellung des ReagensReagent to control the coagulability of the blood during anticoagulant therapy and methods of making the reagent
Anmelder:Applicant:
Dr. med. Paul Arnor Owren,Dr. med. Paul Arnor Owren,
Blommenholm, Baerum (Norwegen)Blommenholm, Baerum (Norway)
Vertreter:Representative:
Dr. F. Zumstein,Dr. F. Zumstein,
Dipl.-Chem. Dr. rer. nat. E. Assmann und Dipl.-Chem. Dr. R. Koenigsberger, Patentanwälte, München 2, Bräuhausstr. 4Dipl.-Chem. Dr. rer. nat. E. Assmann and Dipl.-Chem. Dr. R. Koenigsberger, Patent Attorneys, Munich 2, Bräuhausstr. 4th
Als Erfinder benannt:Named as inventor:
Dr. med. Paul Arnor Owren,Dr. med. Paul Arnor Owren,
Blommenholm, Baerum (Norwegen)Blommenholm, Baerum (Norway)
Beanspruchte Priorität:Claimed priority:
Norwegen vom 16. Mai 1958 (128 104)Norway dated May 16, 1958 (128 104)
zierten Antikoagulantien bewirken eine Verminderung folgender Blutgerinnungsfaktoren: Prothrombin, Stuart-Faktor, Proconvertin und Antihaemophilie-B-Faktor. Von diesen Faktoren sind das Prothrombin und der Stuart-Faktor an beiden Systemen beteiligt. An beiden Systemen sind außerdem auch Proaccelerin und Fibrinogen beteiligt. Proconvertin ist nur im externen System und der Antihaemophilie-B-Faktor nur im internen System wirksam. Dies zeigt das folgende Schema:anticoagulants reduce the following blood coagulation factors: prothrombin, Stuart factor, proconvertin and antihaemophilia B factor. Of these factors, they are prothrombin and the Stuart factor involved in both systems. There are also on both systems Proaccelerin and fibrinogen involved. Proconvertin is only in the external system and the antihaemophilia B-factor only effective in the internal system. This shows the following scheme:
Systeme der BlutgerinnungSystems of blood clotting
Das »interne« System (»Kephalin-Zeit«)The "internal" system ("Kephalin period")
Blut-Plättchen-Faktor 3 (»Kephalin«) Antihaemophilie-A-Faktor (A. H. G.) Antihaemophilie-B-Faktor (P. T. C.) Antihaemophilie-C-Faktor (P. T. A.) »Hageman«-FaktorBlood platelet factor 3 ("Kephalin") antihaemophilia A factor (A. H. G.) Antihaemophilia B factor (P. T. C.) Antihaemophilia C factor (P. T. A.) "Hageman" factor
»Stuart«-Faktor Protombin"Stuart" factor protombin
Das »externe« System
(»Thromboplastin-Zeit«)The "external" system
("Thromboplastin Time")
Gewebsthromboplastin
ProconvertinTissue thromboplastin
Proconvertin
ProaccelerinProaccelerin
FibrinogenFibrinogen
Bisher gab es keine brauchbare Methode, die es ermöglichte, das völlige Ausmaß der Verminderung der vier für den ganzen Gerinnungsprozeß bedeutungsvollen Faktoren quantitativ zu erfassen, d.h. sowohl im internen als auch im externen System.So far there has been no viable method that would allow the full extent of the reduction in four important factors for the whole coagulation process to be recorded quantitatively, i.e. both in the internal as well as external system.
509 520/34*509 520/34 *
Die bisher gebräuchlichsten Methoden, nämlich die Quicksche Methode und die sogenannte PP-Methode (Prothrombin-Proconvertin-Methode), zeigen nur Veränderungen im externen System an. Sie weisen daher, wenn sie zur Überwachung der Antikoagulantienbehandlung verwendet werden, nur eine Verminderung von Proconvertin, Stuart-Faktor und Prothrombin nach. Eine Verminderung von Antihaemophilie-B-Faktor wird durch die Quicksche Methode überhaupt nicht und mit der PP-Methode nur zu einem sehr geringen Maße erfaßt.The most common methods so far, namely the Quick method and the so-called PP method (Prothrombin-Proconvertin-Method), only show changes in the external system. You wise therefore, when used to monitor anticoagulant treatment, only one Decrease in proconvertin, Stuart factor and prothrombin after. A decrease in antihaemophilia B-factor is not recorded at all by Quick's method and only to a very small extent with the PP method.
Das erfindungsgemäße Reagens zur Kontrolle der Gerinnungsfähigkeit des Blutes während einer Antikoagulantien-Therapie ist dadurch gekennzeichnet, daß es ein Thromboplastin mit schwacher, aber konstanter Aktivität in Kombination mit einem Kepha-Hn oder Kephalinsubstituenten mit sehr großer Aktivität menschlichem Plasma gegenüber enthält.The reagent according to the invention for controlling the coagulability of the blood during anticoagulant therapy is characterized in that it is a thromboplastin with weak but constant Activity in combination with a Kepha-Hn or Kephalin substituent with very high activity to human plasma.
Vorzugsweise enthält das Reagens daneben noch Rinderplasma, aus dem Prothrombin, Stuart-Faktor, Proconvertin und Antihaemophilie-B-Faktor entfernt sind. Ferner enthält es vorteilhaft auch Gerinnungsfaktoren, die durch die peroralen Antikoagulantien nicht vermindert werden, in großer Konzentration. Das Reagens enthält vorzugsweise auch Calciumchlorid in einer Menge, die nach Wiederauflösung des Reagens und Zufügung des Testplasmas eine optimale Konzentration für die Gerinnung gewährleistet. The reagent preferably also contains bovine plasma, from which prothrombin, Stuart factor, Proconvertin and antihaemophilia B-factor are removed. Furthermore, it advantageously also contains coagulation factors caused by the oral anticoagulants not be diminished, in great concentration. The reagent also preferably contains calcium chloride in an amount that after redissolution of the reagent and addition of the test plasma one ensures optimal concentration for coagulation.
Zur Herstellung des Reagens nach der Erfindung verfährt man wie folgt: Das in an sich bekannter Weise hergestellte Thromboplastin wird mit der ebenfalls in an sich bekannter Weise hergestellten Kephalinsuspension gemischt, aus Rinderplasma wird Prothrombin, Stuart-Faktor, Proconvertin und Antihaemophilie-B-Faktor durch wiederholte Absorption an unlöslichen Schwermetallsalzen, insbesondere Bariumsulfat, und anschließende Abtrennung des Salzes durch Filtrieren oder Zentrifugieren entfernt, die erhaltene verarmte Plasmalösung wird dialysiert, und die dialysierte Plasmalösung wird zu dem Thromboplastin-Kephalin-Gemisch gegeben, der pH-Wert des Gemisches wird auf 6 bis 8 eingestellt, und schließlich setzt man das CaCl2 hinzu.The procedure for preparing the reagent according to the invention is as follows: The thromboplastin prepared in a manner known per se is mixed with the cephalin suspension, likewise prepared in a manner known per se, and prothrombin, Stuart factor, proconvertin and antihaemophilia B factor are produced from bovine plasma repeated absorption of insoluble heavy metal salts, especially barium sulfate, and subsequent separation of the salt by filtration or centrifugation removed, the resulting depleted plasma solution is dialyzed, and the dialyzed plasma solution is added to the thromboplastin-cephalin mixture, the pH of the mixture is adjusted to 6 adjusted to 8, and finally the CaCl 2 is added.
Das grundlegende Problem bei der Herstellung des Reagens besteht darin, daß es sich hierbei um ein Gemisch enzymatisch aktiver Proteine handelt, bei deren Abtrennung und Reinigung von den begleitenden Proteinen alles vermieden werden muß, was eine Denaturierung zur Folge haben könnte. Nun stellt die Isolierung und Reinigung eines Proteins fast immer eine empirische Aufgabe dar, da die bekannten Fraktioniermethoden, wie z. B. Fraktionierung mit Salzen, insbesondere Ammonsulfat, Fällung mit organischen Lösungsmitteln, wie Alkohol und Aceton, Absorbierung an Cellulose, Aktivkohle, Aluminiumoxyd, Ionenaustauschern usw., alle unspezifisch sind und ihre zweckmäßige Zusammensetzung und Aufeinanderfolge nicht voraussehbar ist. Eine weitere Voraussetzung bildet ein entsprechend leistungsfähiger Test, mit dem die Ergebnisse der angewandten Trennverfahren überprüft werden können.The fundamental problem with making the reagent is that it is a mixture of enzymatically active proteins is involved in their separation and purification from the accompanying ones Proteins everything must be avoided that could lead to denaturation. Isolating and purifying a protein is almost always an empirical task since the known fractionation methods, such as. B. fractionation with salts, especially ammonium sulfate, precipitation with organic solvents such as alcohol and acetone, absorption on cellulose, activated charcoal, Aluminum oxide, ion exchangers, etc., all are unspecific and their appropriate composition and succession is unpredictable. Another requirement is a corresponding powerful test that checks the results of the separation processes used can be.
Die Herstellung des Thromboplastins und der Kephalinsuspension erfolgt in Anlehnung an bekannte ältere Verfahren, die ebenfalls auf den Erfinder zurückgehen. Die Herstellung eines enzymatisch aktiven und stabilen Rinderplasmas, aus dem Prothrombin, Stuart-Faktor, Proconvertin und Antihaemophilie-B-Faktor entfernt wurden, gelang erstmalig, wobei überraschenderweise die wiederholte Absorption an unlöslichen Schwermetallsalzen zum Ziel führte. Schwermetallionen sind bekanntlich starke Enzymgifte und haben gewöhnlich auch in Spuren eine Inaktivierung der Proteine zur Folge, so daß üblicherweise den Lösungen sogenannte Schwermetallfänger, wie z. B. Komplexbildner, zugesetzt werden, um spurenweise aus Gefäßen odei sonstigen Geräten herausgelöste Ionen zu entfernen. Auch die folgenden Verfahrensschritte waren keinesfalls naheliegend, da z. B. die Dialyse ebenfalls in vielen Fällen eine Inaktivierung des Enzyms zur Folge hat und daher zumeist nur vorsichtig und zui Entfernung von hohen Salzkonzentrationen, wie sie z. B. bei der Magnesiumsulfatfällung auftreten, angewendet wird.The production of the thromboplastin and the cephalin suspension is based on known methods older processes, which also go back to the inventor. The production of an enzymatic active and stable bovine plasma, from prothrombin, Stuart factor, proconvertin and antihaemophilia B factor were removed, succeeded for the first time, surprisingly the repeated absorption of insoluble heavy metal salts to Goal led. Heavy metal ions are known to be strong enzyme poisons and usually also have in Traces result in inactivation of the proteins, so that usually the solutions so-called Heavy metal scavenger, such as B. complexing agents are added to odei in trace amounts from vessels to remove leached ions from other devices. The following procedural steps were also by no means obvious, since z. B. dialysis also in many cases inactivating the enzyme As a result, it is usually only done carefully and to remove high salt concentrations like them z. B. occur in magnesium sulfate precipitation is applied.
In der Zeichnung zeigt F i g. 1 die Empfindlichkeit der drei diskutierten Methoden gegenüber abfallenden Mengen von Antihaemophilie-B-Faktor. Dit »Konzentration« des Antihaemophilie-B-Faktors im Vergleich zu den übrigen Faktoren ist in Prozent der Norm auf der Abszisse abgetragen. Die Gerinnungszeit ist in Sekunden (20 bis 160 Sekunden) auf der Ordinate abgetragen.In the drawing, F i g. 1 the sensitivity of the three methods discussed to declining Amounts of antihaemophilia B-factor. The "concentration" of the antihaemophilia B-factor in the Compared to the other factors, the percentage of the norm is plotted on the abscissa. The clotting time is plotted on the ordinate in seconds (20 to 160 seconds).
Die Untersuchung wurde durch Mischen von Antihaemophilie-B-Plasma mit Normalplasma in verschiedenen Mengenverhältnissen ausgeführt.The study was carried out by mixing antihaemophilia B plasma carried out with normal plasma in various proportions.
Kurve A zeigt die Empfindlichkeit der neuen Methode auf die Verminderung des Antihaemophilie-B-Faktors. Curve A shows the sensitivity of the new method to the reduction of the antihaemophilia B factor.
Kurve B zeigt die Empfindlichkeit der PP-Methode und Kurve C die der Quickschen Methode auf Verminderung des Antihaemophilie-B-Faktors.Curve B shows the sensitivity of the PP method and curve C that of Quick's method to reduce the antihaemophilia B factor.
Die in den Kurven dargestellten Unterschiede lassen sich dadurch erklären, daß bei der PP-Methode und der Quickschen Methode dem Plasma oder Blut ein sehr aktives Gewebsthromboplastin zugeführt wird.The differences shown in the curves can be explained by the fact that with the PP method and Quick's method, a very active tissue thromboplastin is added to the plasma or blood will.
Bei der Quickschen Methode verwendet man ein Kaninchenhirnextrakt und bei der PP-Methode ein Menschenhirnextrakt. Diese sehr aktiven Gewebsthromboplastine bewirken, daß ausschließlich eine Gerinnung über das äußere System abläuft, da sich der Gerinnungsvorgang hierbei sehr schnell vollzieht, lange bevor das interne System voll aktiviert ist. Daher beträgt die normale Gerinnungszeit von Plasma nach Zugabe von aktivem Thromboplastin, wie bei der Quickschen Methode, nur 12 bis 13 Sekunden. Das interne System braucht dagegen sogar nach Zufügung einer optimalen Menge von Kepha-Iin mindestens 50 Sekunden zur Bildung von Thrombin, das in einem weiteren Schritt Fibrinogen zur Gerinnung bringt. Die Hinzufügung von derartig aktivem Thromboplastin umgeht das interne System völlig. Die Quicksche Methode der Gerinnungszeitbestimmung (auch »Prothrombin-Zeit« oder »Thromboplastin-Zeit« genannt) weist demnach sogar bei völligem Fehlen des Antihaemophilie-B-Faktors ganz normale Werte auf (vgl. F i g. 1).With the Quick method one uses a rabbit brain extract and with the PP method one Human brain extract. These very active tissue thromboplastins cause only one Coagulation takes place via the external system, since the coagulation process takes place very quickly here, long before the internal system is fully activated. Therefore, the normal clotting time is Plasma after the addition of active thromboplastin, as with Quick's method, only 12 to 13 seconds. The internal system, on the other hand, needs even after adding an optimal amount of Kepha-Iin at least 50 seconds for the formation of thrombin, which in a further step fibrinogen for coagulation brings. The addition of such active thromboplastin bypasses the internal system fully. Quick's method of coagulation time determination (also »prothrombin time« or “Thromboplastin time”) shows even in the complete absence of the antihaemophilia B factor completely normal values (see Fig. 1).
Es soll auch darauf hingewiesen werden, daß es Methoden zur Kontrolle des internen Systems gibt, die Kephalin an Stelle von Thromboplastin verwenden. Diese Methoden können je nach ihrer Art für die Bestimmung der verschiedenen Antihaemophiliefaktoren verwendet werden. Methoden dieser Art wurden jedoch aus zwei Gründen nie zur Über-It should also be noted that there are methods of controlling the internal system, who use cephalin in place of thromboplastin. Depending on their type, these methods can be used for the determination of the various antihaemophilicity factors can be used. Methods of this kind However, for two reasons they were never
wachung der Antikoagulantien-Therapie benutzt. Erstens sind solche »Kephalin-Zeiten« sehr empfindlich gegenüber einer Reihe äußerer Einflüsse. Zweitens sprechen sie überhaupt nicht auf Veränderungen im externen Gerinnungssystem an, wobei insbesondere Schwankungen in der Proconvertinkonzentration sehr bedeutungsvoll sein können.used to monitor anticoagulant therapy. First, such "cephalin times" are very sensitive against a number of external influences. Second, they don't talk about change at all in the external coagulation system, with fluctuations in the proconvertin concentration in particular can be very meaningful.
Die vorliegende Erfindung stellt eine Methode dar, die es möglich macht, in einem Untersuchungsgang gleichzeitig die Gerinnungsfähigkeit des Blutes im internen und externen System zu bestimmen. Mit Hilfe des neuen Reagens wird der Gerinnungsablauf im internen und externen System gleichzeitig in Gang gesetzt, und zwar in der Art, daß sie annähernd mit der gleichen Geschwindigkeit ablaufen. Hierdurch wird erreicht, daß beide Systeme annähernd gleichen Einfluß auf die Gerinnungszeit des Bestimmungssystems ausüben.The present invention represents a method which makes it possible in one examination at the same time to determine the coagulability of the blood in the internal and external system. With With the help of the new reagent, the coagulation process in the internal and external system is simultaneously in Set in gear, and in such a way that they proceed at approximately the same speed. Through this it is achieved that both systems have approximately the same influence on the coagulation time of the determination system exercise.
Frühere Methoden zur Überwachung der
Antikoagulantien-TherapiePrevious methods of monitoring the
Anticoagulant Therapy
Hauptsächlich zwei Methoden wurden bisher, wie bereits berichtet, zur Überwachung der Antikoagulantien-Therapie verwendet:As previously reported, two main methods have been used to monitor anticoagulant therapy used:
I. Die Quicksche Methode.
II. Die PP-Methode.I. Quick's method.
II. The PP method.
I. Die Quicksche Methode
(A. J. Quick: Biol. Chem. J., 109, LXXIII [1935])I. Quick's method
(AJ Quick: Biol. Chem. J., 109, LXXIII [1935])
Die Quicksche Methode war ursprünglich als Methode zur Bestimmung des Prothrombins im Blut eingeführt worden. Das Proconvertin, der Stuart-Faktor und das Proaccelerin waren zu der Zeit noch unbekannt. Bei dieser Methode werden die Konzentrationen von Calcium und Thromboplastin konstant gehalten.Quick's method was originally used as a method for determining prothrombin in blood has been introduced. The Proconvertin, the Stuart Factor and the Proaccelerin were still there at the time unknown. With this method, the concentrations of calcium and thromboplastin become constant held.
Diese Methode wurde geringfügigen Veränderungen unterzogen.This method has undergone minor changes.
Die Ausführung ist in Kürze die folgende.The execution is as follows in brief.
Reagenzien:Reagents:
1. Thromboplastinsuspension: Acetongetrockneter Kaninchenhirnextrakt.1. Thromboplastin suspension: acetone-dried rabbit brain extract.
2. Calciumchloridlösung 0,01 molar.2. Calcium chloride solution 0.01 molar.
Bestimmung: 0,1 ml Oxalatplasma wird mit 0,1 ml Thromboplastinlösung versetzt und im Wasserbad bei 37° C gehalten. Nach Zufügung von 0,1 ml einer 0,01 molaren Calciumchloridlösung wird die Gerinnungszeit bzw. »Thromboplastin-Zeit« (auch »Quicksche Prothrombin-Zeit« genannt) bestimmt.Determination: 0.1 ml of oxalate plasma is mixed with 0.1 ml of thromboplastin solution and placed in a water bath held at 37 ° C. After adding 0.1 ml of a 0.01 molar calcium chloride solution, the clotting time or “thromboplastin time” (also called “Quick prothrombin time”).
Beurteilung: Die Methode erfaßt nur das externe Gerinnungssystem (s. Schema). Wie bereits dargelegt, ist das interne Gerinnungssystem ohne Einfluß auf diese Bestimmung.Assessment: The method only covers the external coagulation system (see scheme). As already stated, the internal coagulation system has no influence on this determination.
Nur das Thromboplastin und Calcium werden bei der Quickschen Methode konstant gehalten. Die Veränderung irgendeines der übrigen Faktoren im externen System: Prothrombin, Proconvertin, Stuart-Faktor, Proaccelerin und Fibrinogen, würde demnach die beschriebene Quicksche »Thromboplastin-Zeit« beeinflussen können. Man nimmt an, daß während einer Behandlung mit Antikoagulantien Proaccelerin und Fibrinogen weitgehend konstant bleiben. Jede Verlängerung der Quickschen »Thromboplastin-Zeit« wird so auf eine Verminderung des Proconvertins, Stuart-Faktors und/oder Prothrombins zurückzuführen sein. Auf der anderen Seite wird eine Verminderung des Antihaemophilie-B-Faktors mit dieser Methode überhaupt nicht erfaßt. Bei der Haemophilie B ist die Quicksche »Thromboplastin-Zeit« normal (s. F i g. 1). Wird diese Methode daher zur Kontrolle bei der Dosierung im Verlaufe einer Antikoagulantien-Therapie verwendet, so besteht die Gefahr einer Blutungskomplikation infolgeOnly the thromboplastin and calcium are kept constant in Quick's method. the Change in any of the other factors in the external system: prothrombin, proconvertin, Stuart factor, Proaccelerin and fibrinogen, would therefore the described Quick's "thromboplastin time" can influence. It is believed that during treatment with anticoagulants, proaccelerin and fibrinogen remain largely constant. Any extension of Quick's "thromboplastin time" is thus aimed at a reduction in proconvertin, Stuart factor and / or prothrombin be due. On the other hand, there will be a decrease in antihaemophilia B-factor not detected at all with this method. In hemophilia B, Quick's "thromboplastin time" is normal (see Fig. 1). This method is therefore used to control the dosage in the course If used in anticoagulant therapy, there is a risk of bleeding complications as a result
ίο einer besonders starken Verminderung des Antihaemophilie-B-Faktors, da solch eine Veränderung mit Hilfe dieser Methode nicht nachgewiesen werden kann. Bei dem quantitativen Nachweis der verschiedenen beteiligten Faktoren in spezifischen Bestimmungssystemen wurde gefunden, daß der Antihaemophilie-B-Faktor oft bedeutend stärker vermindert ist als alle übrigen Faktoren. Dies kann man aus der F i g. 2 ersehen. Diese Ergebnisse gelten für Phenylindandion, aber Dikumarol und Dikumarolabkömmlinge haben grundsätzlich den gleichen Effekt.ίο a particularly strong reduction in the antihaemophilia B factor, since such a change cannot be detected with the help of this method. With the quantitative evidence of the various factors involved in specific determination systems has been found to be the antihaemophilia B-factor is often much more diminished than any other factor. This can be seen from the F i g. 2 see. These results apply to phenylindandione, but dikumarol and its derivatives basically have the same effect.
Auf der Abszisse bedeuten die Zahlen 8-30 das Datum im März 1957, als diese Untersuchungen ausgeführt wurden. Die Untersuchungen wurden am 2. April 1957 abgeschlossen.On the abscissa, the numbers 8-30 indicate the date in March 1957 when these investigations were carried out became. The investigations were completed on April 2, 1957.
Auf der Ordinate ist der Prozentgehalt (dieser versteht sich nicht absolut, 100% bedeutet: normale »Konzentration«) an Prothrombin, Proconvertin und Antihaemophilie-B-Faktor, der an den betreffenden Tagen im Blut gefunden wurde, abgetragen.On the ordinate is the percentage (this is not absolute, 100% means: normal »Concentration«) of prothrombin, proconvertin and antihaemophilia B-factor, which is related to the Days found in the blood.
Kurve D zeigt den Prozentgehalt an Prothrombin im Blut; Kurve E zeigt den Prozentgehalt an Proconvertin und Kurve F den Prozentgehalt an Antihaemophilie-B-Faktor. Curve D shows the percentage of prothrombin in the blood; Curve E shows the percentage of proconvertin and curve F the percentage of antihaemophilia B-factor.
Wie hieraus hervorgeht, war der Spiegel der drei erwähnten Faktoren bei Beginn der Untersuchung annähernd lOOfl/o. Am 9. März 1957 wurde mit der Gabe des Antikoagulans Phenylindandione begonnen. Die tägliche Dosis ist im oberen Anteil der Figuren aufgezeichnet. Die vertikale Linie zur Linken dieses Anteils bedeutet 100 mg Phenylindandione. Die Größe jeder Tagesdosis erscheint, auf der vertikalen Linie herab abgetragen, in Höhe des betreffenden auf der Abszisse verzeichneten Datums. Am 25. März wurde mit der Verabreichung des Antikoagulans aufgehört. Der Prozentgehalt der Faktoren stieg daraufhin schnell an.As can be seen from this, the level of the three factors mentioned was approximately 100 fl / o at the start of the investigation. On March 9, 1957, the administration of the anticoagulant phenylindandione was started. The daily dose is recorded in the upper part of the figures. The vertical line to the left of this portion means 100 mg of phenylindanediones. The size of each daily dose, plotted down on the vertical line, appears at the level of the relevant date recorded on the abscissa. On March 25, the administration of the anticoagulant was stopped. The percentage of the factors then increased rapidly.
Man ist der Ansicht, daß die Tatsache, daß die Quicksche Methode unempfindlich gegenüber einet Verminderung an Antihaemophilie-B-Faktor ist, eine der Ursachen für die relativ häufigen Blutungskomplikationen, wenn die Quicksche Methode als Kontrolle für die Antikoagulantien-Therapie benutzt wird, ist.It is believed that the fact that Quick's method is insensitive to unity Decrease in antihaemophilia B-factor is one of the causes of the relatively common bleeding complications when using Quick's method Control used for anticoagulant therapy is.
Unter anderen Nachteilen dieser Methode möge noch hervorgehoben werden, daß sie unempfindlich gegenüber Veränderungen aller drei beteiligten Faktoren, sofern diese sich im Bereich von 50 bis 100 % des Normalen bewegen, ist. Ferner ist die verwendete Calciumkonzentration, wenn der Hämatokritwert des Blutes nicht normal ist, nicht optimal. Außerdem ist die »Thromboplastin-Zeit« durch die Proaccelerinkonzentration im Testplasma beeinflußt. Das Proaccelerin ist unstabil und wird während der Lagerung von Oxalatplasma beeinflußt. Das Proaccelerin ist unstabil und wird während der Lagerung von Oxalatplasma inaktiviert. Aus diesem Grunde werden für diese Methode relativ frische Blutproben benötigi.Among other disadvantages of this method it should be emphasized that it is insensitive against changes in all three factors involved, provided that these are in the range of 50 to 100% move of the normal is. Furthermore, the calcium concentration used is when the hematocrit value of the blood is not normal, not optimal. In addition, the "thromboplastin time" is through the Affects the pro-accelerin concentration in the test plasma. The Proaccelerin is unstable and becomes during the Storage of oxalate plasma affected. The Proaccelerin is unstable and becomes during storage inactivated by oxalate plasma. Because of this, they are relatively fresh for this method Blood samples required.
II. PP-Methode (Prothrombin-Proconvertin-Methode)II. PP method (Prothrombin proconvertin method)
1. Thromboplastinsuspension: schenhimextrakt.1. Thromboplastin suspension: shemales extract.
Wäßriger Men-Watery men
2. Absorbiertes Rinderplasma.2. Bovine plasma absorbed.
3. Calciumchloridlösung in optimaler Konzentration (normalerweise 0,025 molar).3. Calcium chloride solution in optimal concentration (normally 0.025 molar).
Ausführung: 0,2 ml absorbiertes Rinderplasma werden mit 0,2 ml Thromboplastinsuspension und 0,2 ml einer 1:10-Verdünnung des Testplasmas versetzt. Dieses Inkubationsgemisch wird im Wasser bad bei 37° C gehalten. Nach Zufügung von 0,2 ml Calciumchloridlösung wird die Gerinnungszeit gemessen. Execution: 0.2 ml of absorbed bovine plasma are mixed with 0.2 ml of thromboplastin suspension and 0.2 ml of a 1:10 dilution of the test plasma. This incubation mixture is kept at 37 ° C. in a water bath. After adding 0.2 ml of calcium chloride solution, the clotting time is measured.
Beurteilung: Wie im Falle der Quickschen Me thode ist die PP-Methode eine Bestimmung der Thromboplastin-Zeit, d. h., sie ist in erster Linie eine Methode zur Bestimmung der Aktivität im externen Gerinnungssystem. Die hauptsächlichen Unterschiede zwischen der PP-Methode und der Quickschen Methode sind folgende: Assessment: As in the case of Quick's method, the PP method is a determination of the thromboplastin time, ie it is primarily a method for determining the activity in the external coagulation system. The main differences between the PP method and Quick's method are as follows:
1. Zur Stabilisierung der Proaccelerin- und Fi- brinogeakonzentrationen wird ein neues Reagens, das absorbierte Rinderplasma, eingeführt. Die Bestimmung ist daher unabhängig von der Konzentra tion dieser Faktoren im Testplasma. Da die Faktoren, die im Verlaufe einer Antikoagulantienbehandlung vermindert werden, während der Lagerung von Blut oder Plasma relativ stabil sind, kann diese Methode auch bei gelagerten Blutproben zur Anwendung kommen. 1. A new reagent, absorbed bovine plasma, is introduced to stabilize proaccelerin and fibrinogeal concentrations. The determination is therefore independent of the concentration of these factors in the test plasma. Since the factors that are reduced in the course of anticoagulant treatment are relatively stable during storage of blood or plasma, this method can also be used with stored blood samples .
2. Es kommt eine Verdünnung des Testplasmas im Verhältnis 1:10 zur Anwendung. Dies erhöht die Empfindlichkeit der Methode, besonders im Be reich zwischen 50 und 100%. Die Verdünnung des Testplasmas hat außerdem den Vorteil, daß bei unterschiedlichen Hämatokritwerten das Risiko einer inoptimalen Calciumkonzentration weit geringer als bei der Quickschen Methode ist. Das Verdünnen eliminiert auch noch die Einwirkung kleiner Heparinmengen auf das Testplasma. 2. The test plasma is diluted 1:10. This increases the sensitivity of the method, especially in the range between 50 and 100%. The dilution of the test plasma also has the advantage that with different hematocrit values the risk of an inoptimal calcium concentration is far lower than with Quick's method . The dilution also eliminates the effects of small amounts of heparin on the test plasma.
Wie die Quicksche Methode so ist auch die PP- Methode empfindlich gegenüber Verminderungen des Prothrombine, des Stuart-Faktors und des Proconvertins. Like Quick's method , the PP method is also sensitive to reductions in prothrombin, Stuart factor and proconvertin.
Das in der PP-Methode verwendet Thromboplastin (wäßriger Menschenhirnextrakt) übt zusätz lich zu seinem thromboplastischen Effekt einen Kephalineffekt auf das interne Gerinnungssystem aus. Dieser Effekt ist jedoch nicht optimal. Als Folge dieses Kephalineffektes und der Testplasmaverdünnung kann man nachweisen, daß die PP-Methode eine gewisse, wenn auch außerordentlich geringe Empfindlichkeit gegenüber einer starken Verminde rung des Antihaemophilie-B-Faktors, falls das äußere Gerinnungssystem bereits weitgehend im Verlaufe einer Antikoagulantienbehandlung gestört ist, besitzt (s. Fig. 1). Diese Empfindlichkeit der PP-Methode auf Verminderung an Antihaemophilie-B-Faktor ist, vom Standpunkt der klinischen Praxis aus gesehen, bei weitem zu gering, als daß sie einen sicheren Schutz gegen Blutungskomplikationen infolge starker Verminderung des Antihaemophilie-B-Faktors bieten könnte. The thromboplastin (watery human brain extract) used in the PP method has a cephalic effect on the internal coagulation system in addition to its thromboplastic effect. However, this effect is not optimal. As a result of this cephalic effect and the test plasma dilution , it can be demonstrated that the PP method has a certain, albeit extremely low, sensitivity to a strong reduction in the antihaemophilia B factor if the external coagulation system is already largely disturbed in the course of an anticoagulant treatment (see Fig. 1). This sensitivity of the PP method to a reduction in antihaemophilia B-factor is, from the standpoint of clinical practice, far too low to offer reliable protection against bleeding complications as a result of strong reductions in antihaemophilia B-factor.
Im Laufe der Zeit wurden andere Modifikationen der Quickschen Methode empfohlen, z. B. die Anwendung anderer Thromboplastinpräparate — aus. Kaninchenlunge oder Menschenhirn, einige in acetongetrockneter Form, und andere in lyophilisierter Form. Testplasmaverdünnungen mit der Absicht, die Empfindlichkeit der Methode besonders im Bereich von 50 bis 100% zu erhöhen, kamen ebenfalls zur Anwendung. Die Änderung der Calciumkonzentration in bezug auf den Hämatokritwert des Blutes wurde auch schon empfohlen, um eine optimale Rekalzifizierung zu sichern. Jedoch hat keine dieser Modifikationen das Prinzip der Methode geändert, und keine vermochte es, die fehlende Empfindlichkeit der Methode gegenüber einer Verminderung des Antihaemophilie-B-Faktors zu beheben.Over time, other modifications of Quick's method have been recommended, e.g. B. the application other thromboplastin preparations - from. Rabbit lung or human brain, some in acetone-dried form, and others in lyophilized form. Test plasma dilutions with the intention of It was also possible to increase the sensitivity of the method, especially in the range from 50 to 100% to use. The change in calcium concentration in relation to the hematocrit value of the Blood has also been recommended to ensure optimal recalcification. However, has not these modifications changed the principle of the method, and none was able to, the lack of sensitivity the method towards a reduction in the antihaemophilia B factor.
Die Reagenzien für die PP-Methode — das absorbierte Rinderplasma und die Thromboplastinsuspensionen — wurden auch in lyophilisierter Form hergestellt. Diese Änderung übte natürlich keinen Einfluß auf die fehlende Empfindlichkeit der Methode gegenüber einer Verminderung des Antihaemophilie-B-Faktors aus.The reagents for the PP method - the absorbed bovine plasma and the thromboplastin suspensions - were also produced in lyophilized form. Of course, this change had no effect the lack of sensitivity of the method to a reduction in the antihaemophilia B factor the end.
Methode bei der Anwendung des erfindungsgemäßen Reagens zur Überwachung der Gerinnungsfähigkeit des Blutes während der Antikoagulantien-TherapieMethod of using the reagent according to the invention for monitoring the coagulability of the blood during anticoagulant therapy
Aus obiger Beschreibung geht hervor, daß keines der bisher zur Verfügung stehenden Hilfsmittel eine zufriedenstellende Kontrolle bei der Antikoagulantien-Therapie darstellt. Das erfindungsgemäße Präparat erlaubt dagegen eine zufriedenstellende Kontrolle dieser Therapie.From the above description it can be seen that none of the previously available tools is a represents satisfactory control in anticoagulant therapy. The preparation according to the invention allows, however, a satisfactory control of this therapy.
Dieser Vorgang basiert auf einem gänzlich neuen Prinzip, und zwar darauf, daß die Bestimmung der Aktivität im internen und externen Gerinnungssystem gleichzeitig und kombiniert durchgeführt wird. Bisher gab es keine Methode für solch eine kombinierte Bestimmung. Die beiden Gerinnungssysteme wurden immer getrennt untersucht. Die Methode basiert auf einem Reagenz, das beide Gerinnungssysteme gleichzeitig und derart in Gang setzt, daß beide nahezu die gleiche Zeit gebrauchen. Um diese Bedingung zu erfüllen, wurden dem internen Gerinnungssystem optimale Bedingungen für größte Geschwindigkeit gegeben, indem Kephalin aus Menschenhirn oder andere Kephaline, welche die gleiche Aktivität besitzen, dem Reagens in optimaler Konzentration zugesetzt wurden. Unter diesen Bedingungen wird das interne Gerinnungssystem allein in ungefähr 50 Sekunden zur vollständigen Gerinnung führen.This process is based on an entirely new principle, namely that the determination of the Activity in the internal and external coagulation system carried out simultaneously and in combination will. So far there has been no method for such a combined determination. The two coagulation systems were always examined separately. The method is based on a reagent that both coagulation systems at the same time and in such a way that both use almost the same amount of time. In order to meet this condition, the internal coagulation system were optimal conditions for greatest speed given by kephalin from human brain or other cephalins, which have the same activity, to which reagent has been added at an optimal concentration. Under these Conditions alone, the internal coagulation system becomes complete in about 50 seconds Lead to coagulation.
Gleichzeitig enthält das Reagens ein Thromboplastin, das das externe Gerinnungssystem in Gang setzt. Dieses Thromboplastin ist solcher Natur, daß es in optimaler Konzentration eine geringe und eine konstante Aktivität besitzt. Das hat zur Folge, daß die Geschwindigkeit im externen Gerinnungssystem im Vergleich zu der normalen Geschwindigkeit aktiver Thromboplastinarten, wie sie bei der Quickschen und PP-Methode zur Anwendung kommen, bedeutend herabgesetzt ist. Das Thromboplastin, das bei dieser Methode zur Anwendung kommt, soll in optimaler Konzentration bei der Verwendung von normalem Plasma eine Thromboplastin-Zeit von 35 bis 50 Sekunden geben.At the same time, the reagent contains a thromboplastin, which activates the external coagulation system puts. This thromboplastin is of such a nature that in optimal concentration there is a low and a has constant activity. This has the consequence that the speed in the external coagulation system compared to the normal rate of active thromboplastin types such as those in Quick's and PP method are used, is significantly reduced. The thromboplastin, that is used in this method should be in optimal concentration when using give normal plasma a thromboplastin time of 35 to 50 seconds.
Theoretisch könnte ein solch schwaches Thromboplastin durch Verdünnung eines aktiven Thrombo-Theoretically, such a weak thromboplastin could be produced by diluting an active thrombo-
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plastins (derart, wie es für die Quicksche und PP- Index dar. Der entscheidende Unterschied gegen-plastins (such as it is for the Quick's and PP indexes. The decisive difference compared to
Methode verwendet wird) erhalten werden. Bei sol- über früheren Mechoden ist, wie bereits beschrieben,Method is used). In such earlier mechodes, as already described,
chem Vorgehen erhält man jedoch ein labiles und die Empfindlichkeit der neuen Methode gegenüberchem procedure, however, one obtains an unstable and the sensitivity to the new method
praktisch unbrauchbares Reagens, da kleine Ände- einer Verminderung des Antihaemophilie-B-Faktors.practically useless reagent, since small changes - a decrease in antihaemophilia B-factor.
runeen in ihrer Aktivität beträchtliche Schwankun- 5 _. ,τ.runes vary considerably in their activity. , τ.
gen in der Zeitmessung verursachen. Im erfindungs- Zusammensetzung des Reagenscause genes in the timekeeping. In the invention composition of the reagent
gemäßen Reagens kommt daher ein Thromboplastin Das neue Reagens hat die folgende Zusammen-According to the reagent there is therefore a thromboplastin The new reagent has the following composition
zur Anwendung, das eine stabile und niedrigere Setzung:for the application that has a stable and lower settlement:
Aktivität bei optimaler Konzentration aufweist und 1. Thromboplastin. Dieses Thromboplastin hat inHas activity at optimal concentration and 1. Thromboplastin. This thromboplastin has in
einen relativ weiten Bereich optimaler Konzentratio- io optimaler Konzentration eine niedrige Aktivität unda relatively wide range of optimal concentration io optimal concentration low activity and
nen besitzt. zeigt mit Normalplasma eine Thromboplastin-Zeitowns. shows a thromboplastin time with normal plasma
Als Ausgangsmaterial zur Herstellung eines sol- von 35 bis 50 Sekunden. Dieses ThromboplastinAs a starting material for the production of a sol- from 35 to 50 seconds. This thromboplastin
chen Thromboplastins werden Organe gewisser Tier- wird aus tierischen Organen, die auf Grund ihrerChen thromboplastins are made of certain animal organs, because of their animal organs
arten verwendet. Das hergestellte Thromboplastin ist Artspezifität nur langsam mit menschlichem Procon-types used. The thromboplastin produced is species-specific only slowly with human procon-
artspezifisch und reagiert nur langsam mit mensch- 15 vertin reagieren, hergestellt. Beispiele sind: Rinder-,species-specific and only reacts slowly with humans. Examples are: cattle,
lichem Proconvertin. Thromboplastine, hergestellt Pferde- und Schweinegehirn.lichem proconvertin. Thromboplastins, produced horse and pig brain.
aus Rinder-, Schweine- und Pferdehirn, haben dieses 2. Kephalin. Dieses Kephalin ist dadurch charak-from cattle, pig and horse brains have this 2nd cephalin. This cephalin is charac-
Charakteristikum. terisiert, daß es mit menschlichem Plasma intensivCharacteristic. terized that it is intense with human plasma
Diese Kombination in einem Reagens: Ein Throm- reagiert. Es kann aus Menschenhirn hergestellt wer-This combination in one reagent: a throme reacts. It can be made from human brain
boplastin mit schwacher Aktivität gegenüber Men- zo den. Auch andere Kephalin-Lezithin-Präparate, dieboplastin with weak human activity. Also other kephalin-lecithin preparations that
schenplasma, zusammen mit einem menschlichen intensiv mit menschlichem Plasma reagieren, könnenhuman plasma, together with a human, can react intensively with human plasma
Kephalin (oder Kephalinsubstituenten), beide in opti- verwendet werden, z. B. ein Kephalinpräparat vonKephalin (or cephalin substituents), both of which can be used in opti-, e.g. B. a cephalin preparation from
maler Konzentration, zu mischen, hat zur Folge, daß Sojabohnen.painter concentration, to mix, the result is that soybeans.
das interne und externe Gerinnungssystem nahezu 3. Absorbiertes Ochsenplasma. Dieses wird in derthe internal and external coagulation system nearly 3. Absorbed ox plasma. This is in the
gleichen Einfluß auf die Gerinnungszeit ausüben. 25 Art hergestellt, daß es eine hohe und gleichblei-exert the same influence on the clotting time. 25 type manufactured so that there is a high and constant
Daher ist diese Methode sowohl empfindlich gegen- bende Menge all der Gerinnungsfaktoren, die durchHence, this method is both sensitive to the amount of all of the coagulation factors caused by
über einer Verminderung des Antihaemophilie-B- die Antikoagulantienbehandlung nicht verändertabout a decrease in antihaemophilia-B- did not change the anticoagulant treatment
Faktors im internen System als auch gegenüber einer werden, enthält, während es gleichzeitig frei von denFactor in the internal system as well as being opposite to one, while at the same time it is free from the
Verminderung des Proconvertins im externen System. folgenden vier Faktoren Prothrombin, Stuart-Faktor,Reduction of the proconvertin in the external system. the following four factors prothrombin, Stuart factor,
Außerdem zeigen natürlich der Stuart-Faktor und 30 Proconvertin und Antihaemophilie-B-Faktor ist.Also, of course, the Stuart factor and 30 show proconvertin and antihaemophilia B factor's.
das Prothrombin, die in beiden Systemen eingreifen, 4. Calciumchlorid. Calciumchlorid ist dem Reagensthe prothrombin, which intervene in both systems, 4. calcium chloride. Calcium chloride is the reagent
ihre Wirkung. in einer Menge zugesetzt, die nach Zufügung destheir effect. added in an amount after the addition of the
Fig. 1 zeigt die deutliche Empfindlichkeit dieser Testplasmas eine optimale Konzentration für dieFig. 1 shows the clear sensitivity of this test plasma an optimal concentration for the
Methode gegenüber einer großen Verminderung des Gerinnung bietet.Method towards a large reduction in coagulation.
Antihaemophilie-B-Faktors, im Gegensatz zu der 35 All die vier aufgeführten Anteile werden in einemAntihaemophilia B-Factor, in contrast to the 35 All of the four proportions listed are in one
sehr mangelhaften Empfindlichkeit der Quickschen Reagens vereinigt. Dieses Reagens ist so stabil, daßthe very poor sensitivity of Quick's reagent. This reagent is so stable that
Methode und der sehr schwachen Empfindlichkeit es sogar in Lösung nach 24 Stunden Lagerung beiMethod and the very weak sensitivity it even in solution after 24 hours of storage
der PP-Methode. Hieraus folgt, daß die prinzipiellen Zimmertemperatur unveränderte Aktivität zeigt.the PP method. It follows from this that the basic room temperature shows unchanged activity.
Unzulänglichkeiten der bisher gebräuchlichen Me- Diese Stabilität wird unter anderem dadurch erzielt,Inadequacies of the previously used Me- This stability is achieved, among other things, by
thoden und Reagenzien in allen wesentlichen Punk- 40 daß es gelang, die obenerwähnten vier Gerinnungs-methods and reagents in all essential points 40 that the abovementioned four coagulation
ten abgeschafft wurden. faktoren völlig zu eliminieren. Natürlich war esth were abolished. to completely eliminate factors. Of course it was
Die Erfindung basiert fernerhin auf der Erkennt- früher möglich, Thromboplastin und Calcium inThe invention is also based on the recognition - earlier possible, thromboplastin and calcium in
nis, daß die bestimmten Gerinnungszeiten unabhän- einem Reagens zu vereinigen. Jedoch war es nichtnis that the determined coagulation times can be combined independently of a reagent. However, it wasn't
gig von Veränderungen aller der Gerinnungsfakto- möglich, nach Zusatz von Calcium zu einem absor-gig of changes in all of the coagulation factors- possible after adding calcium to an absor-
ren, die bei der Antikoagulantienbehandlung nicht 45 bierten Plasma in oder ohne Gegenwart von Throm-ren which did not breathe plasma in or without the presence of thrombus during anticoagulant treatment
betroffen werden, sein sollen. Dem wird Rechnung boplastin dieses als ein stabiles Reagens zu erhalten,should be affected. That will allow boplastin to get this as a stable reagent,
getragen, indem alle diese Faktoren in hoher und Dieses »Alles-in-einem«-Reagens wird ampulliertborne by all of these factors in high and this "all-in-one" reagent is ampouled
konstanter Menge in das Reagens einbezogen wer- in lyophilisierter Form zur Verteilung gebracht. Dieconstant amount included in the reagent are brought in lyophilized form for distribution. the
den. Hierzu wird ein sorgfältig absorbiertes Ochsen- Untersuchungen zeigten eindeutig die optimalen Be-the. For this purpose, a carefully absorbed ox- examinations clearly showed the optimal loading
plasma, ähnlich wie bei der PP-Methode, verwendet. 50 dingungen für die Stabiliät des getrockneten Präpa-plasma, similar to the PP method. 50 conditions for the stability of the dried preparation
Dieses absorbierte Rinderplasma enthält eine große rates, insbesondere in bezug auf die Ionenstärke, dieThis absorbed bovine plasma contains great rates, particularly as regards the ionic strength, which
Menge an Antihaemophilie-A-Faktor, Antihaemo- Konzentration der Antikoagulantien usw.Amount of anti-haemophilia A factor, anti-haemo- concentration of anticoagulants, etc.
philie-C-Faktor und Hageman-Faktor (aus dem in- Das lyophilisierte Reagens wird für die Kapillar-Philie C factor and Hageman factor (from the in- The lyophilized reagent is used for the capillary
ternen System) und Proaccelerin und Fibrinogen (die methode oder die Venenblutmethode in destillierteminternal system) and Proaccelerin and Fibrinogen (the method or the venous blood method in distilled
auf beide Systeme einwirken). Ferner ist es derart 55 Wasser bzw. einer Calciumchloridlösung gelöst,act on both systems). Furthermore, it is dissolved in water or a calcium chloride solution in such a way that
aufbereitet, daß es keine nachweisbaren Mengen an Stabilität: Nach Lagerung der Ampullen überprocessed so that there are no detectable amounts of stability: After storing the ampoules over
Proconvertin, Antihaemophilie-B-Faktor, Stuart- 30 Tage bei 47° C zeigte das Reagens unveränderteProconvertin, antihaemophilia B factor, Stuart- 30 days at 47 ° C showed the reagent unchanged
Faktor und Prothrombin (gerade die vier während Aktivität.Factor and prothrombin (just the four during activity.
der Antikoagulantienbehandlung verminderten Fak- . _ , _anticoagulant treatment reduced fac-. _, _
toren) enthält. 60 Aufbereitung des Reagensgates). 60 Preparation of the reagent
Daraus folgt, daß das Reagens spezifisch für und Im folgenden wird die Aufbereitung des zur Erfin-It follows that the reagent is specific for and.
empfindlich gegenüber all den vier während einer dung gehörigen neuen Reagens beschrieben.sensitive to all the four new reagents belonging to a manure.
Antikoagulantienbehandlung verminderten Faktoren Thromboplastin: Man verwendete Rinderhirn, da,Anticoagulant treatment reduced factors Thromboplastin: Bovine brain was used because,
ist. Gleichzeitig wird es durch Veränderungen an- wie schon oben beschrieben, das Rinderhirnthromboderer Gerinnungsfaktoren nicht beeinflußt. Die 65 plastin träge mit menschlichem Proconvertin aufis. At the same time, changes in the cattle brain thromboder, as already described above Coagulation factors not affected. The 65 plastin apply sluggishly with human proconvertin
durch diese Methode erzielten Gerinnungszeiten stel- Grund ihrer Artspezifität reagiert. RinderhirnextraktThe coagulation times achieved by this method react because of their species specificity. Beef brain extract
len daher einen der vollständigen Wirkung der Anti- gibt in optimaler Konzentration mit normalemlen therefore gives one of the full effects of the anti- in optimal concentration with normal
koagulantien auf die Blutgerinnung entsprechenden menschlichem Plasma eine Thromboplastin-Zeit voncoagulants on blood clotting equivalent human plasma a thromboplastin time of
annähernd 35 Sekunden. Es wird in der gleichen Weise wie das Menschenhirnthromboplastin aufbereitet (P. A. Owren, J. elin. &Lab. Invest., I, S. 81 [1949]).approximately 35 seconds. It is prepared in the same way as the human brain thromboplastin (P.A. Owren, J. Elin. & Lab. Invest., I, p. 81 [1949]).
»Rohe« Kephalinsuspension: Diese wird entsprechend der kürzlich veröffentlichten Methode aus Menschenhirn hergestellt (P. Hjort, S. I. Rapaport und P. A. Owren, J. Lab. elin. Medicine, 46, S. 89 bis 97 [1955])."Raw" cephalin suspension: This is made according to the recently published method Human brain produced (P. Hjort, S. I. Rapaport and P. A. Owren, J. Lab. Elin. Medicine, 46, Pp. 89 to 97 [1955]).
Die Menge an Thromboplastin und Kephalin (oder Kephalinsubstituenten) ist derart abgestimmt, daß ihre Konzentration im endgültigen Reagens optimal ist.The amount of thromboplastin and cephalin (or cephalin substituents) is coordinated in such a way that that their concentration in the final reagent is optimal.
Absorbiertes OchsenplasmaAbsorbed ox plasma
1. Blut und Plasma werden so behandelt, daß das absorbierte Plasma neben dem Antihaemophilie-A-Faktor, Hageman-Faktor, Proaccelerin und Fibrinogen eine hohe Konzentration an Antihaemophilie-C-Faktor in nicht aktivisierter Form enthält. Das entscheidende dieses Umstandes hat man früher nicht verstanden.1. Blood and plasma are treated in such a way that the absorbed plasma, in addition to the antihaemophilia A factor, Hageman factor, proaccelerin and fibrinogen have high concentrations of antihaemophilia C factor contains in non-activated form. The decisive factor of this circumstance was used in the past not understood.
2. Absorption wird mit Bariumsulfat ausgeführt, und zwar in solcher Menge und durch wiederholte Absorption, daß das Substrat völlig frei von Prothrombin, Stuart-Faktor, Proconvertin und Antihaemophilie-B-Faktor ist.2. Absorption is carried out with barium sulfate, in such an amount and by repeated use Absorption that the substrate is completely free of prothrombin, Stuart factor, proconvertin and antihaemophilia B factor is.
3. Zur vollständigen Entfernung des suspendierten Bariumsulfates wird außerordentlich sorgfältig zentrifugiert.3. Extra care must be taken to completely remove the suspended barium sulfate centrifuged.
4. Als neues Prinzip kommt die Dialyse bei der Aufbereitung dieses Reagens zur Anwendung, um folgendes zu erreichen:4. As a new principle, dialysis is used to prepare this reagent to achieve the following:
a) Entfernung des plasmatischen Kohlensäure-Bikarbonat-Puffer-Systems. Dies ist für eine genaue Einstellung und Stabilisierung des pH in dem endgültigen, getrockneten Präparat nötig.a) Removal of the plasmatic carbonic acid-bicarbonate buffer system. This is for precise adjustment and stabilization of the pH in the final, dried preparation necessary.
b) Entfernung des Oxalates. Dies ist nötig erstens für die Stabilität des Proaccelerins, zweitens um das Ausfallen des Calciumoxalates mit der damit verknüpften Absorption von Gerinnungsfaktoren während der Ausführung des Tests zu verhindern, und drittens, um die Verwendung von Citrattestplasma während der Bestimmungen zu erlauben.b) Removal of the oxalate. This is necessary firstly for the stability of the Proaccelerin, secondly to the precipitation of calcium oxalate with the associated absorption of coagulation factors during the execution of the test, and thirdly, to prevent the use of citrate test plasma during the determinations to allow.
5. Nach der Dialyse wird das pH sorgfältig eingestellt (auf einen Wert zwischen pH 6 und 8, um ein optimales und stabiles pH nach der Wiederauflösung des getrockneten Präparates zu erzielen. Dies hat entscheidenden Einfluß auf die bleibende Qualität des Reagens und auf die Löslichkeit des Fibrinogen? bei der Wiederauflösung).5. After dialysis, the pH is carefully adjusted (to a value between pH 6 and 8 in order to achieve a to achieve an optimal and stable pH after the redissolution of the dried preparation. this has decisive influence on the constant quality of the reagent and on the solubility of the fibrinogen? at the redissolution).
Thromboplastin, Kephalin (oder Kephalinsubstituent) und Calcium werden dem absorbierten Ochsenplasma in einer für den im Test ablaufenden Gerinnungsprozesses optimalen Konzentration zugesetzt. Thromboplastin, cephalin (or cephalin substituent) and calcium are absorbed by ox plasma added in a concentration that is optimal for the coagulation process taking place in the test.
Das so erhaltene Präparat wird gefriergetrocknet.The preparation thus obtained is freeze-dried.
GebrauchsanweisungInstructions for use
Bei der Verwendung des Präparates zur Kontrolle der Gerinnungsfähigkeit des Blutes verfährt man aut folgende Weise:When using the preparation to control the coagulability of the blood, the same procedure is followed in the following way:
Nach Auflösung des Reagens in destilliertem Wasser oder einer Calciumchloridlösung (s. oben) werden 0,5 ml davon mit Hilfe einer Pipette in kleine Teströhrchen (Durchmesser 8 bis 9 mm, Länge 60 mm) übergeführt. Eine abgemessene Menge des zu untersuchenden Plasmas oder Blutes (s. unten) wird hinzugefügt und die Gerinnungszeit mit einer Stoppuhr gemessen. Die erhaltene Zeit bringt die Einwirkung der Antikoagulantienbehandlung auf den Gerinnungsprozeß zum Ausdruck. Die Bestimmung wird in einem Wasserbad bei 37° C ausgeführt. After dissolving the reagent in distilled water or a calcium chloride solution (see above) 0.5 ml of it with the help of a pipette into small test tubes (diameter 8 to 9 mm, length 60 mm). A measured amount of the plasma or blood to be tested (see below) is added and the clotting time is measured with a stopwatch. The time received brings the Effect of anticoagulant treatment on the coagulation process expresses itself. The determination is carried out in a water bath at 37 ° C.
ίο Die erhaltene Gerinnungszeit wird auf die in Prozenten ausgedrückte relative Aktivität an Hand einer Korrelationskurve übertragen. Beispiele für Korrelationskurven sind in der Fig. 3 gegeben. Diese Korrelationskurven zeigen das Verhältnis der erzielten Gerinnungszeit in den zwei Systemen zur Gerinnungsaktivität in Prozent.ίο The coagulation time obtained is based on the percentage transferred expressed relative activity on the basis of a correlation curve. Examples of correlation curves are given in FIG. 3. These correlation curves show the ratio of the achieved Coagulation time in the two systems for coagulation activity in percent.
Auf doppeltlogarithmischem Papier wird die Konzentration des Normalplasmas in Prozent auf der Abszisse und die Gerinnungszeit in Sekunden aufOn logarithmic paper, the concentration of normal plasma is shown in percent on the Abscissa and the clotting time in seconds
ao der Ordinate abgetragen. Die Kurve K zeigt die Kapillarblutmethode, die eine Menge von 0,10 ml gebraucht. Kurve H zeigt die Methode, die für Citratvollblut, Menge 0,10 ml, und für Citratplasma in folgender Verdünnung: 3 Teile Plasma zu 2 Teilenao of the ordinate. The curve K shows the capillary blood method which uses an amount of 0.10 ml. Curve H shows the method used for citrated whole blood, amount 0.10 ml, and for citrated plasma in the following dilution: 3 parts of plasma to 2 parts
as physiologischer Kochsalzlösung, Menge 0,10 ml. Die Kurve G zeigt die Methode für Citratplasma in Verdünnung 1:5 und mit einer Plasmamenge von 0,20 ml.As physiological saline solution, amount 0.10 ml. Curve G shows the method for citrated plasma in a dilution of 1: 5 and with a plasma amount of 0.20 ml.
Die Methode kann sowohl für Kapillarblut (VoIlblut), das keinen Zusatz an Antikoagulantien enthält, als auch für Citratblut oder Citratplasma verwendet werden. Das Reagens ist mit einer optimalen Calciumkonzentration für Kapillarblut versehen und kann daher nicht ohne weiteres für Citratblut odei Citratplasma, da die Calciumkonzentration hierfür nicht optimal ist, verwendet werden.The method can be used for capillary blood (whole blood), which does not contain any added anticoagulants, as well as used for citrated blood or citrated plasma will. The reagent is provided with an optimal calcium concentration for capillary blood and can therefore not easily be used for citrated blood or citrated plasma, since the calcium concentration for this is not optimal.
Bei Verwendung von Citratblut oder Citratplasma muß daher das getrocknete Reagens mit einer 3,2-mMol-Calciumchloridlösung, die die in der zu testenden Blutprobe befindliche Citratmenge kompensiert, aufgelöst werden.When using citrated blood or citrated plasma, the dried reagent must therefore with a 3.2 mmol calcium chloride solution, which is contained in the to the amount of citrate in the blood sample to be tested is compensated for.
1. Kapillarblut. In die Fingerbeere oder das Ohrläppchen wird ein Hautschnitt gelegt, der ausreichenden Blutaustritt gewährleistet. 0,10 ml des VoIlblutes werden in eine Pipette aufgezogen und sofort mit 0,5 ml des Reagens, das bereits bei 37° C in einem Wasserbad aufbewahrt wurde, gemischt. Die Gerinnungszeit wird daraufhin bestimmt.1. Capillary blood. A skin incision is made in the fingertip or earlobe, which is sufficient Blood leakage guaranteed. 0.10 ml of the whole blood are drawn into a pipette and immediately mixed with 0.5 ml of the reagent already stored in a water bath at 37 ° C. the The clotting time is then determined.
2. Citratblut. Venenblut wird mit 3,13%iger Natrium-Citrat-Dihydrat-Lösung (im Verhältnis 1 Teil Natriumcitratlösung zu 9 Teilen Blut) versetzt. Beispiel: 0,2 ml Natriumcitratlösung wird in eine 2-ml-Spritze aufgezogen. Aus einer Venenpunktion wird dann die Spritze bis zur Menge von 2 ml mit Blut aufgefüllt. Die Blutprobe wird dann in ein Teströhrchen gefüllt, 0,10 ml Citratblut werden mit Hilfe einer Pipette entfernt und mit 0,5 ml Reagens vermischt. Die Gerinnungszeit wird in der oben beschriebenen Weise bestimmt.2. Citrated blood. Venous blood is made with 3.13% sodium citrate dihydrate solution (in a ratio of 1 part sodium citrate solution to 9 parts blood). Example: 0.2 ml of sodium citrate solution is poured into a 2 ml syringe raised. From a venipuncture, the syringe is filled with blood up to an amount of 2 ml filled up. The blood sample is then filled into a test tube, 0.10 ml of citrated blood are made with the aid removed from a pipette and mixed with 0.5 ml of reagent. The clotting time is described in the above Way determined.
3. Citratplasma. Citratblut wird in der gleichen Weise wie unter Punkt 2 abgenommen. Nach dem Zentrifugieren werden 0,6 ml Citratplasma in ein Teströhrchen übergeführt, 0,4 ml physiologische Kochsalzlösung hinzugefügt und beides gemischt.3. Citrated plasma. Citrated blood is drawn in the same way as in point 2. After this Centrifugation, 0.6 ml citrated plasma are transferred to a test tube, 0.4 ml physiological Saline solution added and both mixed.
Mit Hilfe einer Pipette werden 0,10 ml des verdünnten Plasmas entfernt und sofort mit 0,5 ml des Reagens vermischt. Die Gerinnungszeit wird in der oben angegebenen Weise bestimmt.With the help of a pipette, 0.10 ml of the diluted plasma are removed and immediately with 0.5 ml des Reagent mixed. The clotting time is determined in the manner indicated above.
Das neue »Alles-in-einenKK-Reagens gemäß der Erfindung macht es möglich, eine kombinierte Bestimmung der Gerinnungsaktivität sowohl des internen als auch des externen Gerinnungssystems auszuführen. The new »all-in-one KK reagent according to the Invention makes it possible to carry out a combined determination of the coagulation activity of both the internal as well as the external coagulation system.
Die Herstellung des Reagens beruht auf bisher noch nicht angewandten Grundsätzen.The preparation of the reagent is based on principles not previously applied.
Das Reagens zeigt im Vergleich zu früheren Reagenzien eine Anzahl von Vorteilen:The reagent exhibits a number of advantages over previous reagents:
1. ist es sehr stabil bei Zimmertemperatur und vereinfacht so die Verteilung und Lagerung.1. It is very stable at room temperature and thus simplifies distribution and storage.
2. hält es eine Erhitzung bis zu 47° C für mindestens 30 Tage aus und kann daher auch in tropischen Regionen verwendet werden.2. It can withstand heating up to 47 ° C for at least 30 days and can therefore also be used in tropical areas Regions are used.
3. erweist sich, da man nur ein Reagens benötigt, die Herstellung als vereinfacht, und die Ausführung des Tests geht schneller vor sich als bei früheren Methoden.3. Since only one reagent is required, the production and the execution are simplified of the test is faster than previous methods.
2020th
4. stellt sie die einzige bisher bekannte Methode dar, die einen durch orale Antikoagulantien hervorgerufenen Gerinnungsdefekt in genügend sicherer Weise erkennen läßt. Im Gegensatz zu früheren Methoden zeigt diese sich gegenüber einer Verminderung des Antihaemophilie-B-Faktors empfindlich.4. It is the only previously known method that uses oral anticoagulants caused coagulation defect can be detected in a sufficiently reliable manner. In contrast to earlier methods show this against a decrease in the antihaemophilia B-factor sensitive.
5. Infolge der oben beschriebenen Besonderheiten gewährt diese Methode einen weit größeren Schutz gegenüber Blutungskomplikationen als andere Methoden.5. As a result of the special features described above, this method grants a far greater one Protection against bleeding complications than other methods.
6. ist die Methode zeitsparend.6. the method is time-saving.
7. zeigt sie auf Grund der Stabilität des Reagens7. shows it due to the stability of the reagent
in wiederaufgelöster Form verläßliche und reproduzierbare Ergebnisse.reliable and reproducible results in redissolved form.
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