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Verfahren zur Herstellung von therapeutisch wirksamen, Steroidverbindungen
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von 1-Dehydro-6-methyl-9a-fluor-16a-oxyhydrocortison,
dessen 11-Ketoanalogen und dessen Estern.
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Erfindungsgemäß erfolgt die Herstellung dieser Verbindungen nachfolgendem
Reaktionsschema:
in dem Ac den Acylrest einer organischen Carbonsäure mit vorzugsweise
1 bis 12 C-Atomen, R und R' Wasserstoff oder einen Acylrest der obigen Bedeutung
und X ein Halogenatom mit der Ordnungszahl 17-35 darstellen.
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Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, dessen einzelne
Stufen an sich bekannt sind, wird ein 6 - Methyl -11 ß,21- dioxy - 4,16 - pregnadien
- 3,20 - dion-21-acylat (I) mit Osmiumtetroxyd zum 6-Methyl-11ß,16 a,17 a,21-tetraoxyd-4-pregnen-3,20-dion-21-acylat
(6-Methyl-16a-oxy-hydrocortison-21-acylat) (IIa) umgesetzt, das zum 6-Methyl-16a-oxyhydrocortison
(IIb) hydrolysiert und dann in den entsprechenden 16,21-Diester übergeführt werden
kann. Der Diester (IIc) kann auch durch Veresterung des Monoesters (II a) erhalten
werden. Durch Umsetzung der so erhaltenen Verbindungen mit einem N-Halogenacylamid
oder -imid und anschließende Behandlung mit Schwefeldioxyd erhält man das 6 - Methyl
-16a,17 a,21- trioxy - 4,9 (11) - pregnadien-3,20-dion bzw. dessen Ester (III).
Diese werden mit einer unterhalogenigen Säure oder mit einer eine solche Säure bildenden
Verbindung, wie einem N-Halogenacylamid oder N-Halogenacylimid in Gegenwart von
Perchlor- oder verdünnter Schwefelsäure, in das 6-Methyl-9a-halogen-11ß,16a,17a,
21-tetraoxy-4-pregnen-3,20-dion (IV) bzw. dessen Ester übergeführt. Die nachfolgende
Behandlung mit einer schwachen Base, wie Natrium- oder Kaliumacetat, oder der kleinsten,
eine Halogenwasserstoffabspaltung bewirkenden Menge einer starken Base ergibt das
6-Methyl-9ß,11ß-oxido-16a,17a,21-trioxy-4-pregnen-3,20-dion (V) bzw. dessen Ester.
Die erhaltene Oxidoverbindung wird dann mit Fluorwasserstoff zum 6-Methyl-9 a-fluor-11
ß,16 a,17 a,21-tetraoxy-4-pregnen-3,20 -dion (6-Methyl-9a-fluor-16a-oxyhydrocortison)
(VI) bzw. dessen Estern umgesetzt, deren Inkubierung mit in 1(2)-Stellung eine Doppelbindung
einführenden Mikroorganismen, z. B. solchen der Gattung Septomyxa, Corynebacterium,
FusariumProaminobacter, Mycobacterium, Streptomyces (z. B. lavendulae), Pseudomonas
(z. B. testosteroni), Ophiobolus, Calonectria, Alternaria, Dydimella, Cylindrocarpon,
Listeria, Colletotrichum, Erysipelothrix, Bacillus, (insbesondere B. sphaericus),
Nocardia, Mikroorganismen der Familie Tuberculariaceae, Micromonospora u. dgl.,
vorzugsweise Mikroorganismen der Gattung Septomyxa affinis, das 6-Methyl-9 a-fluor-11ß,16
a,17 a,21-tetraoxy-1,4-pregnadien-3,20-dion (VIIa) (1-Dehydro-6-methyl-9a-fluor-16a-oxy-hydrocortison)
ergibt. Die nachfolgende Veresterung mit einem Acylierungsmittel, z. B. einem Säurehalogenid
oder Säureanhydrid einer organischen Carbonsäure, führt zum entsprechenden Diester,
6-Methyl-9a - fluor - 11ß,16a,17a,21 - tetraoxy - 1,4 - pregnadien-3,20-dion-16,21-diacylat
(VIIb).
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Das 1-Dehydro-6-methyl-9a-fluor-16a-oxy-hydrocortison und dessen Ester
können auch dadurch erhalten werden, daß man das durch Behandlung mit Osmiumtetroxyd
erhaltene 6-Methyl-1lß,16a,17a,21-tetraoxy-4-pregnen-3,20-dion (IIb) oder dessen
Mono-(Ha) oder Diacylat (II c) einer mikrobiologischen Dehydrierung unterwirft und
dann in das erhaltene 6-Methyl-llß,16a, 17a,21-tetraoxy-1,4-pregnadien-3,20-dion
(VIIIa), das mit einem Acylierungsmittel in den entsprechenden Diester übergeführt
werden kann, auf die oben angegebene Weise ein 9a-ständiges Fluoratom einführt.
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Das 1-Dehydro-6-methyl-9a-fluor-16a-oxy-hydrocortison in Form seines
16,21-Diacylates kann anschließend mit einem Oxydationsmittel, wie Chromsäureanhydrid
in Essigsäure, zum entsprechenden 11-Ketoderivat umgesetzt werden, das, um den freien
Alkohol zu erhalten, nachfolgend hydrolysiert werden muß, z. B. mit einer Alkalimetallbase
unter Stickstoff. Als Ausgangsstoffe für das erfindungsgemäße Verfahren werden solche
bevorzugt, in denen die 6-ständige Methylgruppe a-Konfiguration besitzt. Auch die
Endprodukte sollen vorzugsweise eine 6a-ständige Methylgruppe enthalten.
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Die erfindungsgemäß erhältlichen neuen Verbindungen, insbesondere
ihre 6a-Epimeren, stellen hochwirksame Nebennierenrindenhormone dar, deren glucocorticoide
Wirksamkeit größer ist als die des Hydrocortisons oder Cortisons. So ist z. B. die
glucocorticoide Wirksamkeit des 1-Dehydro-6a-methyl-9a-fluor-16a-oxy-hydrocortisons
30- bis 35mal so groß wie die des Hydrocortisons. Seine entzündungswidrige Wirkung
beträgt das 10,6fache des Hydrocortisons. Da die Verbindungen der Erfindung zusätzlich
diuretische Wirksamkeit besitzen und Salzverluste hervorrufen, eignen sie sich insbesondere
für die Behandlung von chronischen, kongestiven Herzschäden, von Leberzirrhose,
nephrotischen und adrenogenitalen Syndromen sowie zur Behandlung von Eklampsie und
Präeklampsie. Hierzu können sie in oral, parenteral oder örtlich anzuwendenden therapeutischen
Zubereitungen verabreicht werden, in denen die Steroidverbindungen zusammen mit
geeigneten, in der pharmazeutischen Praxis üblichen Trägern und gegebenenfalls weiteren
Wirkstoffen, wie Antibiotika, Sulfonamiden u. dgl., enthalten sind.
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Für die parenterale Verabreichung eignen sich insbesondere wasserlösliche
Ester mehrbasischer Säuren und deren Salze, wie das Natriumsalz des 21-Hemisuccinats
oder Hemi-ß,ß-dimethylglutarats.
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Die folgenden Beispiele erläutern das erfindungsgemäße Verfahren Beispiel
1 a) 6a-Methyl-llß,16a,17a,21-tetraoxy-4-pregnen-3,20-dion Das als Ausgangsstoff
verwendete 6a-Methyl-11ß,21-dioxy-4,16-pregnadien-3,20-dion-21-acetat wurde in der
Weise hergestellt, daß man aus 1,65g Semicarbazidhydrochlorid und 10 ccm Wasser
eine Lösung herstellte und diese zu einer Lösung von 1 g 6a-Methyl-hydrocortisonacetat
(Spero et a1., J. Am. Chem. Soc., Bd. 7, 1956, 78, A. 6213) in 1,2 ccm Pyridin und
40 ccm Methanol gab. Dieses Gemisch wurde 18 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Darauf
engte man auf 20 ccm ein und goß in 500 ccm eiskaltes Wasser. Dann wurde das Reaktionsgemisch
6 Stunden auf 0°C gehalten und anschließend filtriert. Der Niederschlag wurde mit
Eiswasser gewaschen und getrocknet. Die 1,216 g farblose Kristalle, die das 3,20-Disemicarbazonvon
6 a-Methyl-hydrocortison-21-acetat darstellten, schmolzen über 300°C; [a]Dl= +173°
(in Dioxan). Analyse für C"H4o0sN6: Berechnet
... C 58,63, H 7,57; gefunden
... C 58,40, H 7,46. 1 g des so hergestellten 6a-Methylhydrocortison-acetat-3,20-disemicarbazons
wurde in 20 ccm Eisessig und 1 ccm Essigsäureanhydrid gelöst. Dieses Gemisch wurde
eine Stunde unter Stickstoff und unter Rückfluß erhitzt. Darauf wurde das Reaktionsgemisch
im Vakuum auf etwa 12 ccm eingeengt, mit 6 ccm Brenztraubensäure behandelt und anschließend
40 Stunden auf Raumtemperatur gehalten. Dann wurde 2 Stunden auf 60°C erhitzt, gekühlt
und mit 600 ccm Wasser verdünnt. Das wäßrige Gemisch wurde dreimal mit je 400 ccm
Chloroform extrahiert und die Chloroformextrakte zweimal mit je 100 ccm 5°/Qiger
Natriumkarbonatlösung und dreimal mit je 100 ccm Wasser gewaschen. Die gewaschenen,
vereinigten
Chloroformextraktewurden über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und zur Trockne
eingedampft. Der rohe, 6a-Methyl-11ß,21-dioxy-4,16-pregnadien-3,20-dion 21-acetat
enthaltende Rückstand wurde dann, wie in Tabelle I gezeigt, über 70 g Aluminiumoxyd
chromatographiert, wobei Fraktionen von jeweils 60 ccm aufgefangen wurden.
| Tabelle I |
| Fraktion Gewicht des |
| ,VTr. Lösungsmittel . Rückstandes |
| in mg |
| 1 bis 4 Benzol |
| 5 bis 7 Benzol zu Äther 9 : 1 |
| 8 bis 10 Benzol zu Äther 8 : 2 |
| 11 Benzol zu Äther 1 : 1 |
| 12 Benzol zu Äther 1 : 1 3 |
| 13 Benzol zu Äther 1 : 1 12 |
| 14 Äther 51 |
| 15 Äther 40 |
| 16 Äther 15 |
| 17 Äther 6 |
| 18 Äther 4 |
| 19 Äther zu Methylenchlorid 9 : 1 ' 1 |
| 20 Äther zu Methylenchlorid 9 : 1 1 |
| 21 Äther zu Methylenchlorid 8 : 2 |
| 22 Äther zu Methylenchlorid 1 : 1 |
| 23 bis 24 Äther zu Methylenchlorid 1 : 1 |
| 25 bis 28 Methylenchlorid |
| 29/30 Methanol |
Die Fraktionen 12 bis einschließlich 20 wurden vereinigt, kristallisiert und aus
Benzol-Hexankohlenwasserstoffen umkristallisiert. Sie ergaben insgesamt 122 mg 6
a- Methyl- l 1ß,21- dioxy - 4,16 - pregnadien - 3,20 - dion-21-acetat mit einem
Schmelzpunkt von etwa 115° C und einem zweiten Schmelzpunkt von 152 bis 154° C;
[a]D = 177° (in Chloroform). Analyse für C"H3205.
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Berechnet ... C 71,97, H 8,05; gefunden ... C 70,99,
H 8,07. Ein Gemisch aus 90 mg 6a-Methyl-11ß,21-dioxy-4,16-pregnadien-3,20-dion 21-acetat,
65 mg Osmiumtetroxyd in 2,5 ccm Benzol und 0,12 ccm Pyridin ließ man 95 Stunden
bei Raumtemperatur stehen. Darauf wurde dem Gemisch unter Rühren eine Lösung von
0,7 g wasserfreiem Natriumsulfit und 0,7 g Kaliumbikarbonat in 65 ccm Wasser zugegeben
und noch 16 Stunden gerührt. Dann wurde mit 10 ccm Chloroform verdünnt und filtriert.
Der Filterrückstand wurde mit insgesamt 100 ccm heißem Chloroform gewaschen. Die
Chloroformwaschlösungen und das Filtrat wurden vereinigt und mit einer Salzlösung
gesättigt, die Chloroformschicht abgetrennt, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet
und zur Trockne eingedampft. Der etwa 100 mg wiegende Rückstand wurde zweimal aus
Aceton-Äther umkristallisiert und ergab 39 mg 6 a-Methyl-l 1ß,16 a,17a,21-tetraoxy-4-pregnen-3,20-dion
mit einem Schmelzpunkt von 215 bis 217°C; [a]D = +68° (Dioxan). Analyse für C22
Hsa 0 s Berechnet ... C 67,32, H 8,22; gefunden . . . - C 66,76, H
8,37. a1) Ein Gemisch aus 200 mg 6a-Methyl-llß,21-dioxy-4,16-pregnadien-3,20-dion
21-acetat, 145 mg Osmiumtetroxyd in 6 ccm Benzol und 0,30 ccm Pyridin ließ man 76
Stunden bei Raumtemperatur stehen. Darauf wurde unter Rühren eine Lösung von 1,5
g wasserfreiem Natriumsulfit und 1,5 g Kaliumbikarbonat in 140 ccm Wasser zugegeben
und noch eine Stunde gerührt. Das Gemisch wurde mit 25 ccm Chloroform verdünnt und
filtriert und der Filterrückstand mit insgesamt 200 ccm heißem Chloroform gewaschen.
Die Chloroformvvaschlösungen und das Filtrat wurden vereinigt und mit Salzlösung
gesättigt, die Chloroformschicht abgetrennt, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet
und zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde zur Gewinnung des 6 a-Methyl-11ß,16
a,17a,21=tetraoxy=4-pregnen-3,20-dion-21-acetats zweimal aus Aceton-Äther umkristallisiert.
b) 6a-Methyl-llß,16a,17a,21-tetraoxy-4-pregnen-3,20-dion (6a-Methyl-16a-oxyhydrocortison)
0,5 g des erhaltenen 6a-Methyl-11ß,16a,17a,21-tetraoxy-4-pregnen-3,20-dion-21-acetats
wurden in 20 ccm einer Lösung von 0,3 g Natriumhydroxyd in 18 ccm Methanol und 2
ccm Wasser gelöst und 6 Stunden unter Stickstoff stehengelassen. Darauf wurde mit
100 ccm Wasser verdünnt und auf 0 bis 5°C gekühlt. Das wäßrige Gemisch wurde filtriert
und der Niederschlag zweimal aus Aceton-Hexankohlenwasserstoffen umkristallisiert.
Man erhielt reines 6a-Methyl-11ß,16a,17a,21-tetraoxy-4-pregnen-3,20-dion.
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c) 6a-Methyl-llß,16a,17a,21-tetraoxy-4-pregnen-3,20-dion-16,21-diacetat
(6a-Methyl-16a-oxyhydrocortison-16,21-diacetat) Ein Gemisch aus 0,2 g 6a-Methyl-11ß,16a,17a,21-tetraoxy-4-pregnen-3,20-dion,
0,1 ccm Essigsäureanhydrid und 1 ccm Pvridin ließ man 4 Stunden stehen. Darauf wurde
in 15 ccm Wasser gegossen, das wäßrige Gemisch auf 0 bis 5°C gekühlt und filtriert.
Der- so gesammelte Niederschlag wurde wiederholt mit Wasser gewaschen und dann aus
Methanol umkristallisiert. Man erhielt 6a-Methyl-11ß, 16a,17a,21-tetraoxy-4-pregnen-3,20-dion-16,21-diacetat,
d) 6a-Methyl-16a,17a,21-trioxy-4,9(11)-pregnadien-3,20-dion-16,21-diacetat Ein Gemisch
aus 1 g 6a-Methyl-11ß,16a,21-tetraoxy-4-pregnen-3,20-dion-16,21-diacetat, 650 mg
N-Bromacetamid und 6 ccm Pyridin würde im Dunkeln 30 Minuten gerührt. Dann wurde
in einem Eiswasserbad gekühlt und ein Schwefeldioxydstrom so lange auf die Oberfläche
des gerührten Gemisches geleitet, bis die Probe auf Kaliumjodid-Stärke-Papier negativ
war. Dann versetzte man mit 50 ccm Wasser und hielt 30 Minuten auf etwa 5°C. Der
ausgefällte weiße Feststoff wurde abfiltriert, mit Wasser gewaschen und unter Vakuum
getrocknet. Nach der Umkristallisation aus Aceton erhielt man 6a-Methyl-16a,17a,21-trioxy-4,9(11)-pregnadien-3,20-dion-16,21-diacetat.
e) 6a-Methyl-9a-brom-l1ß,16a,17a,21-tetraoxy-4-pregnen-3,20-dion-16,21-diacetat
Eine Lösung von 0,5g 6a-Methyl-16a,17a,21-trioxy-4,9(11)-pregnadien-3,20-dion-16,21-diacetat
in 20 ccm Methylenchlorid wurde mit einer Lösung von 1 ccm 71 o/oiger Perchlorsäure
in 10 ccm Wasser und 200 mg N-Bromacetamid in 50 ccm tert. Butylalkohol versetzt.
Die Lösung wurde 15 Minuten auf Raumtemperatur gehalten und dann mit einer Lösung
von 0,3 g Natriumsulfit in 12 ccm Wasser vermischt. Das Gemisch wurde so lange unter
vermindertem Druck destilliert, bis die Lösung im Kolben wolkig wurde. Darauf fällte
man das Produkt durch Zugabe von 100 ccm eines Eis-Wasser-Gemisches aus. Der. weiße
kristalline Niederschlag wurde abfiltriert, mit Wasser gewaschen, getrocknet und
aus einem Gemisch von Aceton und Hexankohlenwasserstoffen
umkristallisiert.
Er ergab 6a-Methyl-9a-brom-llß,16a, 17a,21-tetraoxy-4-pregnen-3,20-dion-16,21-diacetat.
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f) 6a-Methyl-9(11)-oxido-16a,17a,21-trioxy-4-pregnen-3,20-dion-16,21-diacetat
Ein Gemisch aus 0,45g 6a-Methyl-9a-brom-11ß,16a, 17a,21-tetraoxy-4-pregnen-3,20-dion-16,21-diacetat,
0,45 g wasserfreiem Kaliumacetat und 20 ccm Aceton wurde 5 Stunden unter Rückfluß
erhitzt. Dann wurde gekühlt in Wasser gegossen und mit Methylenchlorid extrahiert.
Der Methylenchloridextrakt wurde getrocknet und auf eine Säule aus 25 g synthetischem
Magnesiumsilikat gebracht. Die Säule wurde mit Hexankohlenwasserstoffen entwickelt,
die zunehmende Anteile Aceton enthielten. Das Eluat aus Hexankohlenwasserstoffen
+ 10 % Aceton enthielt das 6a-Metliyl-9ß,11ß-oxido-16a,17a,21-trioxy-4-pregnen-3,20-dion-16,21-diacetat.
g) 6a-Methyl-9a-fluor-1lß,16a,17a,21-tetraoxy-4-pregnen-3,20-dion-16,21-diacetat
1 g 6a-Methyl-9ß,llß-oxido-16a,17a,21-trioxy-4-pregnen-3,20-dion-16,21-diacetat
wurde in 50 ccm Methylenchlorid gelöst und mit 5 ccm 48°/oiger Fluorwasserstoffsäure
und 0,5 ccm 71°/oiger Perchlorsäure versetzt. Das Gemisch wurde 6 Stunden kräftig
gerührt und darauf in einen überSChuß kalter, wäßriger, 5%iger Natriumbikarbonatlösung
gegossen. Die Methylenchloridschicht wurde abgetrennt, mit wasserfreiem Natriumsulfat
getrocknet, zur Trockne eingedampft und der so erhaltene Rückstand aus Aceton und
Hexankohlenwasserstoffen umkristallisiert. Er ergab 6a-Methyl-9a-fluor-11ß,16a,17a,
21-tetraoxy-4-pregnen-3,20-dion-16,21-diacetat. h) 6a-Methyl-9a-fluor-11ß,16a,17a,21-tetraoxy-4-pregnen-3,20-dion
(6a-Methyl-9a-fluor-16a-oxyhydrocortison) Aus 0,5 g 6a-Methyl-9a-fluor-11ß,16a,17a,21-tetraoxy-4-pregnen-3,20-dion-16,21-diacetat
und 100 mg Kaliumhydroxyd in 10 ccm 1 ccm Wasser enthaltendem Methanol wurde eine
Lösung hergestellt. Diese wurde 6 Stunden unter Stickstoff stehengelassen, in 50
ccm Eiswasser gegossen und mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure neutralisiert. Anschließend
wurde auf etwa 5°C gekühlt, 2 Stunden bei dieser Temperatur stehengelassen und filtriert.
Der so erhaltene Niederschlag wurde mit Wasser gewaschen und zweimal aus Aceton-Hexankohlenwasserstoffen
umkristallisiert. Er ergab 6a-Methyl-9a-fluor-1 lß,16a,17a,21-tetraoxy-4-pregnen-3,20-dion.
i) 6a-Methyl-9a-fluor-11ß,16a,17a,21-tetraoxy-1,4-pregnadien-3,20-dion (1-Dehydro-6a-methyl-9a-fluor-16a-oxyhydrocortison)
Je 100 ccm eines Mediums aus 10/0 Glukose, 2 % Maisquellwasser (60 °/o Feststoffe)
und Leitungswasser in drei 250 ccm fassenden Erlenmeyer-Kolben wurden auf einen
p11-Wert von 4,9 eingestellt. Diese Medien wurden 45 Minuten bei einem Druck von
1;05 kg/cm2 sterilisiert und mit einem 1 bis 2 Tage alten Wachstum von Septomyxa
affinis A. T. C. C. 6737 geimpft. Die Erlenmeyer-Kolben wurden 3 Tage bei Raumtemperatur
(etwa 26 bis 28°C) geschüttelt. Nach Ablauf dieser Zeit wurden die gesamten 300
ccm als Impfstoff für 51 des gleichen Mediums aus Glukose und Maisquellwasser verwendet,
das zusätzlich 5 ccm eines Antischaummittels (ein Gemisch aus Specköl und Oktadekanol)
enthielt. Der Gärbehälter wurde in ein Wasserbad von 28°C gestellt und sein Inhalt
gerührt (300 UpM) und belüftet (0,31 Luft je 51 Gärmedium). Nach 20stündiger Inkubation,
als sich ein gutes Wachstum entwickelt hatte, wurden 1 g 6a-Methyl-9a-fluor-11ß,16a,17a,21-tetraoxy-4-pregnen-3,20-dion
und 1/2 g 3-Ketobienor-4-cholen-22-al, gelöst in 16 ccm Dimethylformamid, zugegeben
und die Inkubation bei der gleichen Temperatur (28°C) und Belüftung 72 Stunden fortgesetzt
(endgültiger p11-Wert 8,3). Das Mycel wurde abfiltriert und dreimal mit j e 200
ccm Methylenchlorid extrahiert. Darauf wurden die Extrakte des Gärmediums vereinigt,
über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, eingeengt und der erhaltene Rückstand
dreimal aus Aceton-Hexankohlenwasserstoffen umkristallisiert. Er ergab 6a-Methyl-9a-fluor-11ß,16a,17a,
21-tetraoxy-1,4-pregnadien-3,20-dion (1-Dehydro-6amethyl-9a-fluor-16a-oxyhydrocortison)
vom Schmelzpunkt 242 bis 247°C; 2, 95 % Athanol max. = 239 mp..
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Dieses kann anschließend in 16,21-Diester übergeführt werden. Geht
man bei der Veresterung von einem 21-Acylat aus, so können sich die Acylatgruppen
des Endproduktes von zwei verschiedenen ein- oder mehrbasischen, gesättigten oder
ungesättigten Carbonsäuren ableiten. Die Oxydation dieser 16,21-Dieseter ergibt
das entsprechende 11-Keto-Analoge, das durch Hydrolyse, die vorzugsweise unter Stickstoff
ausgeführt wird, in den freien Alkohol übergeht. Beispiel 2 a) 6a-Methyl-11ß,16a,17a,21-tetraoxy-1,4-pregnadien-3,20-dion
Je 100 ccm eines Mediums aus 1 % Glukose, 2 % Maisquellwasser
(600/, Feststoffe) und Leitungswasser in sechs 250 ccm fassenden Erlenmeyer-Kolben
wurden auf einen pH-Wert von 5,9 eingestellt. Diese Medien wurden 45 Minuten bei
einem Druck von 1,05 kg/cm' sterilisiert und mit einem 1 bis 2 Tage altem Wachstum
von Septomyxa affinis ATCC 6737 geimpft. Dann wurde 3 Tage bei Raumtemperatur (etwa
24°C) geschüttelt. Nach Ablauf dieser Zeit wurden die gesamten 600 ccm als Impfstoff
für 101 des gleichen Mediums aus Glukose und Maisquellwasser verwendet, das zusätzlich
10 ccm eines Antischaummittels (ein Gemisch aus Specköl und 1 °/o Oktadekanol) enthielt.
Der Gärbehälter wurde in ein Wasserbad von 28°C gestellt und sein Inhalt gerührt
(300 UpM) und belüftet (0,51 Luft j e 101 - Gärmedium). Nach 17stündiger Inkubation,
als sich ein gutes Wachstum entwickelt hatte und der pH-Wert auf 6,7 gestiegen war,
fügte man 2 g 6a-Methyl-11ß,16a,17a,21-tetraoxy-4-pregnen-3,20-dion-21-acetat und
1 g 3-Ketobisnor-4-cholen-22-al, gelöst in 115 ccm Dimethylformamid, zu. Die Inkubation
wurde bei der gleichen Temperatur und Belüftung 24 Stunden fortgesetzt. Dann wurde
das Mycel abfiltriert, das Steroidmaterial mit Methylenchlorid extrahiert, die Methylenchloridextrakte
zur Trockne eingedampft und der erhaltene Rückstand über eine Säule aus 200 g synthetischem
Magnesiumsilikat (Florisil) chromatographiert. Die Säule wurde mit 400 ccm Fraktion
aus Methylenchlorid, Hexankohlenwasserstoff-Aceton-Gemischen im Verhältnis 9: 1,
8: 2, 7: 3, 1 : 1 und Methanol entwickelt. Die mit Hexankohlenwasserstoff-Aceton
(7: 3) eluierte Fraktion wurde zweimal aus Aceton umkristallisiert und ergab
1-Dehydro-6a-methyl 16a-oxyhydrocortison (6a-Methyl-llß,16a,17a,21-tetraoxy-1,4-pregnadien-3,20-dion).
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b) 1-Dehydro-6-methyl-16a-hydrocortison-16,21-diacetat (1-Dehydro-6a-methyl-16a-hydrocortison-16,21-diacetat)
Eine Mischung aus 200 mg 6a-Methyl-11ß,16a,17a, 21-tetraoxy-1,4-pregnadien-3,20-dion,
1 ccm Essigsäureanhydrid und 2 ccm Pyridin ließ man 5 Stunden bei Raumtemperatur
stehen und goß sie dann in 25 ccm Wasser. Die wäßrige Lösung wurde auf etwa 5°C
gekühlt
und abfiltriert. Der Niederschlag ergab, zweimal aus MethanoI
umkristallisiert, 6a-Methyl-11ß,16a,17a,21-tetraoxy-1,4-pregnadien-3,20-dion-16,21-diacetat
(1-Dehydro-6a-methyl-16a-oxyhydrocortison-16,21-diacetat). In gleicher Weise lassen
sich auch andere 16,21-Diacylate des 6a-Methylllß,16a,17a,21-tetraoxy-1,4-pregnadien-3,20-dions
herstellen.
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c) 6a-Methyl-16a,17a,21-trioxy-1,4,9(11)-pregnatrien-3,20-dion-16,21-diacetat
Ein Gemisch aus 1 g 6a-Methyl-11ß,16a,17a,21-tetraoxy-1,4-pregnadien-3,20-dion-16,21-diacetat,
650 mg N-Bromacetamid und 6 ccm Pyridin wurde 30 Minuten im Dunkeln gerührt. Dann
wurde in einem Eis-Wasser-Bad gekühlt und ein Schwefeldioxydstrom so lange auf die
Oberfläche des gerührten Gemisches geleitet, bis die Probe mit Kaliumjodid-Stärkepapier
negativ war. Darauf wurde das Gemisch mit 50 ccm Wasser versetzt und 30 Minuten
bei etwa 5° C stehengelassen. Der ausgefallene weiße Feststoff wurde abfiltriert,
mit Wasser gewaschen und unter Vakuum getrocknet. Nach der Umkristallisation aus
Aceton erhielt man 6a-Methyl-16a,17a,21-trioxy-1,4,9(11)-pregnatrien-3,20-dion-16,21-diacetat.
d) 6a-Methyl-9a-brom-11ß,16a,17a,21-tetraoxy-1,4-pregnadien-3,20-dion-16,21-diacetat
Zu einer Lösung von 0,5 g 6a-Methyl-16a,17a,21-trioxy-1,4,9(11)-pregnätrien-3,20-dion-16,21-diacetat
in 20 ccm Methylenchlorid wurde eine Lösung von 1 ccm 71 °/oiger Perchlorsäure in
10 ccm Wasser und 200 mg N-Bromacetamid in 50 ccm tert. Butylalkohol gegeben. Man
ließ darauf 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen und gab dann eine Lösung von 0,3
g Natriumsulfit in 12 ccm Wasser zu. Das Gemisch wurde so lange unter vermindertem
Druck destilliert, bis der Kolbeninhalt wolkig wurde. Darauf fällte man das Produkt
durch Zugabe von 100 ccm einer Eis-Wasser-Mischung aus. Der weiße kristalline Niederschlag
wurde abfiltriert, mit Wasser getvaschen, getrocknet und aus einem Gemisch von Aceton
und Hexankohlenwasserstoffen umkristallisiert. Er ergab 6a-Methyl-9a-brom-11ß,16a,17a,21-tetraoxy-1,4-pregnadien-3,20-dion-16,21-diacetat.
e) 6a-Methyl-9ß,11ß-oxido-16a,17a,21-trioxy-1,4-pregnadien-3,20-dion-16,21-diacetat
Ein Gemisch aus 0,45g 6a -.Methyl-9a-brom-11ß,16a, 17a,21-tetraoxy-1,4-pregnadien-3,20-dion-16,21-diacetat,
0,45g wasserfreiem Kahumacetat und 20 ccm Aceton wurde 5 Stunden unter Rückfluß
erhitzt. Darauf wurde das Gemisch gekühlt, in Wasser gegossen und mit Methylenchlorid
extrahiert. Der Methylenchloridextrakt wurde getrocknet und auf eine Säule aus 25
g synthetischem Magnesiumsilikat (Florisil) gebracht. Die Säule wurde mit Hexankohlenwasserstoffen,
die zunehmende Anteile Aceton enthielten, entwickelt. Das mit Hexankohlenwasserstoffen
+ 10 °/o Aceton erhaltene Eluat enthielt das gewünschte 6a-Methyl-9ß,11ß-oxido-16a,17a,21-trioxy-1,4-pregnadien-3,20-dion-16,21-diacetat.
f) 6a-Methyl-9a-fluoi-llß,16a,17a,21-tetraoxy-1,4-pregnadien-3,20-dion-16,21-diacetat
Zu einer Lösung von 1 g 6a-Methyl-9ß,11ß-oxido-16a,17a,21-trioxy-1,4-pregnadien-3,20-dion-16,21-diacetat
in 50 ccm Methylenchlorid wurden 5 ccm 48 °/oige Fluorwasserstoffsäure und 0,5 ccm
71 °/oige Perchlorsäure gegeben. Das Gemisch wurde 6 Stunden kräftig gerührt und
dann in überschüssige, kalte, wäßrige 5°/eige Natriumbikarbonatlösung gegossen.
Die Methylenchloridschicht wurde abgetrennt, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet,
eingedampft und der so erhaltene Rückstand aus Aceton und Hexankohlenwasserstoffen
umkristallisiert. Er ergab reines 6a-Methyl-9a-fluor-11ß,16a,17a, 21-tetraoxy-1,4-pregnadien-3,20-dion-16,21-diacetat,
das durch Hydrolyse mit einer Base unter Stickstoff in ein Produkt übergeht, das
mit dem des Beispiels 1 identisch ist. Selbstverständlich kann das in den Beispielen
beschriebene Verfahren auch mit dem 6ß-Methyl Epimeren durchgeführt werden, worauf
man 1-Dehydro-6ß-methyl-9a-fluor-16a-oxy-hydröcörtison erhält.