DE10318087B4

DE10318087B4 - Genetic control of flowering time and pathogen attack in plants

Info

Publication number: DE10318087B4
Application number: DE2003118087
Authority: DE
Inventors: Nikolaus Dr. Schlaich; Nicolas Sauerbrunn
Original assignee: Rheinisch Westlische Technische Hochschuke RWTH
Current assignee: Rheinisch Westlische Technische Hochschuke RWTH
Priority date: 2003-04-17
Filing date: 2003-04-17
Publication date: 2005-07-28
Anticipated expiration: 2023-04-18
Also published as: DE10318087A1

Abstract

Verfahren zur Steuerung des Blühzeitpunkts einer transgenen Pflanze, das umfasst:
(a) Einbringen eines Nukleinsäuremoleküls, das für ein pflanzliches Protein aus der PCC1-Familie von Proteinen kodiert, wobei das Protein eine Aminosäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 6, SEQ ID Nr. 8, SEQ ID Nr. 10 und SEQ ID Nr. 12, ausgewählt wird, in eine Pflanze, und
(b) heterologe Expression des Nukleinsäuremoleküls aus (a), um die Aktivität des korrespondierenden Polypeptids nach oben bzw. unten zu regulieren.A method of controlling the flowering time of a transgenic plant comprising:
(a) introducing a nucleic acid molecule that encodes a protein from the PCC1 family of proteins, wherein the protein comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 1, 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 12, into a plant, and
(b) heterologous expression of the nucleic acid molecule of (a) to up-regulate the activity of the corresponding polypeptide.

Description

Die Erfindung betrifft die genetische Kontrolle des Blühzeitpunkts von Pflanzen. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Steuerung des Blühzeitpunkts einer transgenen Pflanze, das das Einbringen eines Nukleinsäuremoleküls, das für ein pflanzliches Protein aus einer Familie kleiner Proteine, die sowohl den Blühzeitpunkt der Pflanzen regulieren als auch eine erhöhte Resistenz gegen Pathogenbefall vermitteln, kodiert und die heterologe Expression des besagten Nukleinsäuremoleküls, um die Aktivität des korrespondierenden Proteins zu regulieren, umfasst.The The invention relates to the genetic control of the time of flowering of plants. In particular, the invention relates to a method to control the flowering time a transgenic plant that involves the introduction of a nucleic acid molecule, the for a vegetable Protein from a family of small proteins that both the flowering time regulate the plants as well as an increased resistance to pathogen infestation mediate, encoded and the heterologous expression of said nucleic acid molecule to the activity of the corresponding protein.

Der Übergang von vegetativem Wachstum zur Blüte stellt den wichtigsten Schritt im Entwicklungszyklus einer Pflanze dar, da die zeitliche Kontrolle des Blühzeitpunkts entscheidend für ihren reproduktiven Erfolg ist. Daher haben die meisten Pflanzen zum Teil sehr komplexe Mechanismen entwickelt, um den Blühzeitpunkt abhängig von Umwelteinflüssen sowie dem eigenen Entwicklungsstadium exakt steuern zu können.The transition from vegetative growth to flowering represents the most important step in the development cycle of a plant because the timing of the flowering time is crucial for their reproductive success is. Therefore, most plants have part very complex mechanisms designed to depend on the flowering time environmental influences as well as the own stage of development to control exactly.

Die molekulargenetische Analyse der Blühzeitpunktkontrolle hat in den letzten Jahren ein mannigfach verschaltetes Netzwerk aus verschiedenen Stoffwechselwegen identifiziert, welche die Blütenbildung regulieren (Übersichten in [1–3]). So spielen die Photoperiode, der circadiane Rhythmus, die Lichtqualität, der Einfluss niedriger Temperaturen (Vernalisation), die Verfügbarkeit bzw. Aktivität von Phytohormonen oder auch die Chromatinstruktur für die Kontrolle des Blühzeitpunkts eine wichtige Rolle.The molecular genetic analysis of flowering time control has in In recent years, a manifold interconnected network of different metabolic pathways Identifies the flower formation regulate (overviews in [1-3]). Thus, the photoperiod, the circadian rhythm, the quality of light, the influence low temperatures (vernalization), the availability or activity of phytohormones or also the chromatin structure for the control of the time of flowering an important role.

Die Aufklärung dieser Regulationsmechanismen ist insbesondere bei Kultur- und Nutzpflanzen von großer Bedeutung, um Strategien zur Optimierung des Ertrags entwickeln zu können. Eine Beschleunigung des Blühbeginns könnte zum Beispiel die Aussaat bestimmter Nutzpflanzen auch in Regionen ermöglichen, in denen die Wachstumssaison aufgrund der klimatischen Verhältnisse ansonsten zu kurz wäre. Im Gartenbau ist häufig die Blüte, und nicht der Same oder die Frucht das gewünschte Produkt, sodass auch hier eine schnellere Blütenbildung vorteilhaft wäre. In vielen Fällen ist aber auch eine Verzögerung oder gar Verhinderung der Blütenbildung erwünscht, wie etwa beim Anbau von Grünfutter (u.a. Alfalfa, Klee), Kohlgewächsen, Spinat oder Salat, um dadurch die Ernteerträge zu steigern. Gleiches gilt für Pflanzen, bei denen die Wurzeln oder Wurzelknollen geerntet werden, also z.B. für Kartoffeln, Karotten oder Zuckerrüben. Bei letzteren würde eine Verhinderung der Blütenbildung weiterhin dazu führen, dass mehr Energie zur Zuckerproduktion verwendet werden könnte als unter normalen Umständen.The clarification, clearing up of something of these regulatory mechanisms is particularly in crops and crops of greater Importance to develop strategies to optimize revenue to be able to. An acceleration of the beginning of flowering could For example, the sowing of certain crops in regions enable, in which the growing season due to climatic conditions otherwise it would be too short. Horticulture is common the blossom, and not the seed or the fruit the desired product, so too here a faster flowering beneficial would. In many cases but it is also a delay or even prevention of flowering he wishes, such as in the cultivation of green fodder (including alfalfa, clover), cabbage, Spinach or salad to increase crop yields. same for for plants, where the roots or tubers are harvested, e.g. for potatoes, Carrots or sugar beet. With the latter one would Prevention of flower formation continue to cause that more energy could be used for sugar production than under normal circumstances.

Mittlerweile konnten mehrere Regulatoren der Blühzykluskontrolle identifiziert und molekulargenetisch charakterisiert werden, und zwar primär in Arabidopsis thaliana, dem verbreitetsten pflanzlichen Modellorganismus. Das U.S. Patent [4] offenbart die Klonierung und Charakterisierung des LHY-Gens aus A. thaliana, dessen Überexpression zur einer verzögerten Blüte unter Langtagbedingungen führt. Der endogene LHY-Promotor reguliert dabei die Transkription in Abhängigkeit vom circadianen Rhythmus und der Photoperiode. Ein weiterer Regulator dieser Gruppe, der "Flowering Locus T" (FT) aus A. thaliana, ist in der U.S. Patentanmeldung [5] offenbart. Eine heterologe Überexpression dieses Gens in Pflanzen hat im Vergleich zu Wildtyppflanzen einen deutlich früheren Blühzeitpunkt zur Folge, während die Expression eines FT-Antisensemoleküls eine Verzögerung der Blüte hervorruft. Die internationale Patentanmeldung [6] beschreibt die Isolation und Charakterisierung des Hd3a-Gens, eines Orthologs des FT-Gens im Reis.meanwhile Several regulators of flowering cycle control were identified and molecular genetically characterized, primarily in Arabidopsis thaliana, the most common plant model organism. The U.S. Patent [4] discloses the cloning and characterization of A. thaliana LHY gene whose overexpression under delayed flowering Longday conditions leads. The endogenous LHY promoter regulates the transcription in dependence from the circadian rhythm and the photoperiod. Another regulator this group, the "Flowering Locus T "(FT) off A. thaliana is described in U.S. Pat. Patent Application [5]. A heterologous overexpression this gene in plants has one compared to wild-type plants much earlier flowering entailed while the expression of an FT antisense molecule causes a delay of the Causes flowering. International patent application [6] describes the isolation and characterization of the Hd3a gene, an orthologue of the FT gene in rice.

Die Blütenbildung wird auch abhängig vom Entwicklungsstadium der Pflanze gesteuert. Diese Kontrolle erfolgt über den "autonomen" Regulationsweg. Eine Steuerkomponente dieser Stoffwechselkaskade, das RNA-bindende Protein FPA, wird in der Internationalen Patentanmeldung [7] offenbart. Die transgene Expression des FPA-Gens führt dabei zu einer Induktion der Blütenbildung sowohl unter Lang- als auch Kurztagbedingungen. FPA scheint weiterhin auch die Genexpression von FLC zu beeinflussen, einem potentiellen Bindeglied der autonomen und der Vernalisations-abhängigen Kaskade.The flowering will also depend controlled by the stage of development of the plant. This control takes place via the "autonomous" regulatory pathway. A controlling component of this metabolic cascade, the RNA-binding Protein FPA is disclosed in International Patent Application [7]. The transgenic expression of the FPA gene leads to an induction the flower formation under both long and short day conditions. FPA also seems to continue to influence the gene expression of FLC, a potential link the autonomous and the vernalization-dependent cascade.

Die Europäische Patentanmeldung [8] beschreibt schließlich die Klonierung und Charakterisierung von MPC1, einem weiteren Regulator der Blütenbildung in A. thaliana, sowie seinem Ortholog Os-MPC1 aus Reis. Transgene Pflanzen ohne funktionelles MPC1 bilden unmittelbar nach der Keimung Blüten aus ("super early flowering"). Die Faktoren, welche die Genexpression von MPC1 steuern, sind bislang allerdings noch unklar.The European Patent application [8] finally describes the cloning and characterization of MPC1, another regulator of flowering in A. thaliana, and its orthologue Os-MPC1 from rice. Transgenic plants without functional MPC1 form buds immediately after germination ("super early flowering"). The factors which control the gene expression of MPC1, are so far still not clear.

Obwohl durch die heterologe Expression der oben beschriebenen Regulatoren transgene Pflanzen mit veränderten Blüheigenschaften generiert werden können, sind diese häufig anfälliger gegenüber Umweltfaktoren als vergleichbare Wildtyppflanzen, da eine Verkürzung bzw. Verlängerung der Periode bis zur Blüte einen massiven Eingriff in die Entwicklung einer Pflanze darstellt, der nicht nur mit der gewünschten Änderung des Blühzeitpunkts, sondern auch mit einer Reihe weiterer, phänotypisch oft nicht wahrnehmbarer physiologischer Konsequenzen einhergeht. So muss zum Beispiel eine verfrühte Blüte einer Pflanze unter klimatisch unvorteilhaften Bedingungen nicht zwangsläufig zu den gewünschten höheren Erträgen führen, da der gentechnisch modifizierte Organismus seinem "normalen" Entwicklungszustand "voraus" ist und dadurch aufgrund unzureichend ausgebildeter Schutzmechanismen anfälliger gegen Witterungseinflüsse und insbesondere gegen Schädlingsbefall wird, da für pathogene Organismen wesentlich geringere Barrieren zu überwinden sind.Although transgenic plants with altered flowering properties can be generated by the heterologous expression of the regulators described above, these are often more susceptible to environmental factors than comparable wild-type plants, since shortening or extending the period to flowering represents a massive intervention in the development of a plant not only with the desired change in the time of flowering, but also with a series of other phenotypically often imperceptible physiological consequences. For example, a premature flowering of a plant under climatically unfavorable conditions The genetically modified organism is not necessarily "ahead" of its "normal" state of development and, as a result of inadequately developed protective mechanisms, becomes more susceptible to weathering and, in particular, to pest infestation, since pathogens have to overcome much lower barriers.

Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein neuartiges Verfahren zur Regulation des Blühzeitpunkts von Pflanzen bereitzustellen, mit Hilfe dessen diese Einschränkung umgangen werden kann, sodass nach heterologer Expression dieser Regulatoren die jeweiligen Wirtspflanzen weniger anfällig gegen Pathogenbefall sind.task The invention therefore provides a novel method for regulation the flowering time of Provide plants with the help of which circumvented this restriction so that after heterologous expression of these regulators the respective host plants are less susceptible to pathogen attack.

Dieses Ziel wird mit Hilfe eines Verfahrens zur Steuerung des Blühzeitpunkts einer transgenen Pflanze gemäß Anspruch 1 über die Expression von regulatorischen Proteinen erreicht, deren funktionelle Aktivität in der Kontrolle des Blühzeitpunkts von Pflanzen und der gleichzeitigen Vermittlung einer erhöhten Resistenz gegen Pathogene liegt.This The target is determined by a method of controlling the flowering time a transgenic plant according to claim 1 over achieved the expression of regulatory proteins whose functional activity in the Control of the flowering time of plants and the simultaneous mediation of increased resistance against pathogens.

Die Erfindung beruht dabei auf dem überraschenden Befund, dass die erzwungene konstitutive Expression der hier offenbarten Proteine aus der PCC1-Familie in Pflanzen nicht nur zu einer deutlich verfrühten Blütenbildung, sondern auch zur Resistenz gegenüber dem Oomyceten Hyaloperonospora parasitica (Falscher Mehltau) führte.The Invention is based on the surprising Find that the forced constitutive expression of those disclosed here Proteins from the PCC1 family in plants not only lead to a distinctly premature flowering, but also to resistance the Oomyceten Hyaloperonospora parasitica (downy mildew) led.

Die Proteine bzw. die korrespondierenden Gene der Erfindung wurden dabei im Rahmen von Mikroarray-Experimenten identifiziert [9]. Gesucht wurde dabei nach Genen, deren Expression in Arabidopsis thaliana nach Behandlung mit einem Pathogen (Pseudomonas syringae pv. tomato) erhöht war. Dabei wurde eine cDNA (EST163B24T7) isoliert, deren Expression sich nach der Exposition innerhalb von 10 Minuten um den Faktor drei erhöhte. Weitere Experimente zeigten, dass diese cDNA in unbehandelten Pflanzen auch einer circadianen Kontrolle mit einem Expressionsmaximum am Tagesende unterliegt, die jedoch nach Kontakt mit einem Pathogen zugunsten einer längerfristigen erhöhten Expression aufgehoben wird, d.h. die Pathogenkontrolle ist gegenüber der circadianen Kontrolle epistatisch. Daher wurde das Gen als PCC1 für "Pathogen and Circadian Controlled" bezeichnet.The Proteins or the corresponding genes of the invention were included identified in the context of microarray experiments [9]. Wanted according to genes whose expression in Arabidopsis thaliana after Treatment with a pathogen (Pseudomonas syringae pv. Tomato) elevated was. In this case, a cDNA (EST163B24T7) was isolated, their expression after the exposure within 10 minutes by the factor three increased. Further experiments showed that this cDNA is present in untreated plants also a circadian control with an expression maximum at End of the day is subject, however, after contact with a pathogen favor a longer term increased Expression is canceled, i. the pathogen control is opposite to the circadian control epistatic. Therefore, the gene was called PCC1 for "Pathogen and Circadian Controlled ".

Das PCC1-Gen (SEQ ID Nr. 1) ist auf Chromosom 3 von A. thaliana lokalisiert (Genlocus-Bezeichnung: At3g22231) und kodiert ein Protein aus 81 Aminosäuren (SEQ ID Nr. 2; Accession Number: NM_113121), zu dem in anderen Organismen keinerlei strukturelle Homologe in den Datenbanken gefunden wurden.The PCC1 gene (SEQ ID NO: 1) is located on chromosome 3 of A. thaliana (Gene locus: At3g22231) and encodes a protein from 81 amino acids (SEQ ID NO: 2; Accession Number: NM_113121), to that in other organisms No structural homologues were found in the databases.

In A. thaliana wurden fünf weitere Proteine mit signifikanter Homologie zu PCC1 (33–65% Aminosäureidentität, 41–73% Aminosäureähnlichkeit; siehe 1) identifiziert: At3g22240 (SEQ ID Nr. 4), At2g32190 (SEQ ID Nr. 6; Accession Number: AY088012), At2g32200 (SEQ ID Nr. 8), At2g32210 (SEQ ID Nr. 10; Accession Number: AY074358) und At1g05340 (SEQ ID Nr. 12). Die sechs Proteine besitzen neben einer analogen Genstruktur mit drei Exons und zwei Introns nicht nur eine ähnliche Größe (68–81 Aminosäuren), sondern auch zwei hochkonservierte Bereiche im zentralen Bereich der Sequenz (PPP^I/_LGYPT bzw. VET^N/_KSKG), die auch eine funktionelle Bedeutung dieser Sequenzmotive nahe legen. Detaillierte Struktur-Funktionsanalysen der Proteine liegen bislang allerdings noch nicht vor.In A. thaliana, five other proteins with significant homology to PCC1 (33-65% amino acid identity, 41-73% amino acid similarity; 1 ): At3g22240 (SEQ ID NO: 4), At2g32190 (SEQ ID NO: 6, Accession Number: AY088012), At2g32200 (SEQ ID NO: 8), At2g32210 (SEQ ID NO: 10, Accession Number: AY074358), and At1g05340 (SEQ ID NO: 12). In addition to an analogous gene structure with three exons and two introns, the six proteins not only have a similar size (68-81 amino acids), but also two highly conserved regions in the central region of the sequence (PPP ^I / _L GYPT or VET ^N / _K SKG). , which also suggest a functional significance of these sequence motifs. However, detailed structure-function analyzes of the proteins are not yet available.

Die heterologe Expression von PCC1 führt zu einer deutlich verfrühten Blüte der Wirtspflanzen, was in Verbindung mit dem circadianen Muster der Genexpression eine Funktion im Rahmen der Regulation der Photoperiode möglich erscheinen lässt. Die schnellere Induktion der Blütenbildung geht einher mit einer erhöhten Resistenz gegen Pathogenbefall. Der Begriff Pathogen bezeichnet in diesem Zusammenhang einen beliebigen Organismus, der eine Pflanze infizieren und in ihrer Entwicklung beeinträchtigen kann, d.h. phytopathogene Bakterien, Viren, Nematoden, Insekten und Pilze.The heterologous expression of PCC1 leads to a much premature one Blossom of the Host plants, associated with the circadian pattern of gene expression a function within the regulation of the photoperiod appear possible leaves. The faster induction of flowering goes hand in hand with an elevated one Resistance to pathogen attack. The term pathogen designates In this context, any organism that has a plant infect and interfere with their development, i. phytopathogenic Bacteria, viruses, nematodes, insects and fungi.

Eine erhöhte Pathogenresistenz einer transgenen Pflanze, in der ein Protein gemäß der Erfindung exprimiert wurde, bezieht sich immer auf den Vergleich mit der unbehandelten Wildtyppflanze. Eingeschlossen in die Erfindung sind daher alle Proteine, die einer transgenen Wirtspflanze neben einem veränderten Blühverhalten eine teilweise oder vollständige Resistenz gegenüber mindestens einem Pathogen verleihen.A increased Pathogen resistance of a transgenic plant in which a protein according to the invention is always related to the comparison with the untreated Wild-type plant. Therefore, all are included in the invention Proteins that modified a transgenic host plant next to one flowering behavior a partial or complete Resistance to confer at least one pathogen.

Die Erfindung umfasst Verfahren zur Steuerung des Blühzeitpunkts einer transgenen Pflanze, die das Einbringen eines Nukleinsäuremoleküls, das für PCC1 (At3g22231; SEQ ID Nr. 2; Accession Number: NM_113121), At3g22240 (SEQ ID Nr. 4), At2g32190 (SEQ ID Nr. 6; Accession Number: AY088012), At2g32200 (SEQ ID Nr. 8), At2g32210 (SEQ ID Nr. 10; Accession Number: AY074358) oder At1g05340 (SEQ ID Nr. 12), wobei insbesondere PCC1 (SEQ ID Nr. 2) bevorzugt wird (siehe auch 1), kodiert und dessen heterologe Expression um die Aktivität des korrespondierenden Polypeptids nach oben bzw. unten zu regulieren umfasst.The invention includes methods for controlling the time of flowering of a transgenic plant comprising introducing a nucleic acid molecule encoding PCC1 (At3g22231; SEQ ID NO: 2; Accession Number: NM_113121), At3g22240 (SEQ ID NO: 4), At2g32190 (SEQ ID NO: 2) Accession Number: AY088012), At2g32200 (SEQ ID NO: 8), At2g32210 (SEQ ID NO: 10, Accession Number: AY074358) or At1g05340 (SEQ ID NO: 12), in particular PCC1 (SEQ ID NO: 2 ) is preferred (see also 1 ) and its heterologous expression to up-regulate the activity of the corresponding polypeptide.

Die Nukleinsäuremoleküle der Erfindung sind nicht auf Nukleinsäuresequenzen von Arabidopsis thaliana beschränkt, sondern schließen alle Nukleinsäuremoleküle ein, die ein Protein gemäß der Erfindung kodieren. Ein hier gemäß dem Verfahren nach Anspruch 1 verwendetes Nukleinsäuremolekül kann "operativ" mit einer regulatorischen Sequenz verknüpft sein, um die Expression des Nukleinsäuremoleküls zu ermöglichen.The nucleic acid molecules of the invention are not limited to nucleic acid sequences of Arabidopsis thaliana, but include all nucleic acid molecules comprising a protein according to the Er coding. A nucleic acid molecule used herein according to the method of claim 1 may be operably linked to a regulatory sequence to facilitate expression of the nucleic acid molecule.

Ein Nukleinsäuremolekül wird als "fähig zur Expression einer Nukleinsäuresequenz" bezeichnet, wenn es Sequenzelemente umfasst, die Informationen hinsichtlich der Regulation von Transkription und/oder Translation enthalten, und diese Elemente "operativ" mit der das Polypeptid kodierenden Nukleinsäuresequenz verknüpft sind. Eine operative Verknüpfung ist eine Verknüpfung, bei der die regulatorischen Sequenzelemente und die proteinkodierende Sequenz derart verbunden sind, dass Genexpression möglich ist. Die genaue Beschaffenheit der zur Genexpression erforderlichen regulatorischen Bereiche kann zwischen verschiedenen Spezies variieren. In der Regel umfassen diese Bereiche jedoch einen Promotor, der in der Regel aus dem Promotor per se besteht, i.e. DNA-Elemente, welche die Transkriptionsinitiation steuern, sowie aus DNA-Elementen, die nach ihrer Transkription in mRNA den Beginn der Translation regulieren. Solche Promotoren schließen normalerweise 5' nicht-kodierende Sequenzen ein, die an der Initiation von Transkription und Translation beteiligt sind, wie zum Beispiel die -35/-10-Elemente und das Shine-Dalgarno Element in Prokaryonten oder die TATA-Box, CAAT-Sequenzen und 5'-Capping-Elemente in Eukaryonten. Diese Regionen können ferner auch Enhancer- oder Repressorelemente enthalten sowie translatierte Signalsequenzen, um die native Polypeptidkette in ein spezielles Kompartiment der Wirtszelle zu dirigieren Zusätzlich können auch die 3' nicht-kodierenden Regionen regulatorische Elemente enthalten, die an der Termination der Transkription, der Polyadenylierung o.ä. beteiligt sind. Falls diese Terminationssequenzen in einer speziellen Wirtszelle nicht oder nur unzureichend funktionell sind, können sie durch Signale ersetzt werden, die in der betreffenden Zelle ausreichend funktionell sind.One Nucleic acid molecule is said to be "capable of expressing a nucleic acid sequence" when It includes sequence elements containing information regarding regulation of transcription and / or translation, and these elements "operatively" with the polypeptide coding nucleic acid sequence connected are. An operative link is a link in which the regulatory sequence elements and the protein coding sequence are linked so that gene expression is possible. The exact texture the regulatory regions required for gene expression vary between different species. Usually include however, these areas have a promoter, usually from the promoter per se, i. e. DNA elements representing transcription initiation control, as well as DNA elements, after their transcription in mRNA regulate the onset of translation. Such promoters usually close 5 'non-coding Sequences involved in the initiation of transcription and translation are, such as the -35 / -10 elements and the Shine-Dalgarno element in prokaryotes or the TATA box, CAAT sequences and 5'-capping elements in eukaryotes. These regions can also contain enhancer or repressor elements as well as translated Signal sequences to the native polypeptide chain in a special In addition, the 3 'non-coding can also direct the compartment of the host cell Regions contain regulatory elements involved in the termination transcription, polyadenylation or similar involved. If this Termination sequences in a special host cell are not or are insufficiently functional, they can be replaced by signals, which are sufficiently functional in the cell in question.

Ein Nukleinsäuremolekül gemäß der Erfindung kann demnach eine regulatorische Sequenz, insbesondere eine Promotorsequenz umfassen. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das Nukleinsäuremolekül gemäß der Erfindung eine Promotorsequenz sowie eine Transkriptionsterminationssequenz. Hinsichtlich der Promotorsequenz kann es sich um einen konstitutiven oder einen induzierbaren Promotor handeln. Geeignete prokaryontische Promotoren sind zum Beispiel der lacUV5-Promotor oder der T7-Promotor. Beispiele für geeignete eukaryontische Promotoren sind der SV40-Promotor oder der CMV-Promotor. Besonders bevorzugt werden jedoch Nukleinsäuremoleküle, die regulatorische Sequenzen aus Pflanzen umfassen [11, 12]. Geeignete pflanzliche Promotoren sind zum Beispiel die 35S RNA und 19S RNA Promotoren des Cauliflower Mosaic Virus, der durch Licht induzierbare Promotor der kleinen Untereinheit der Ribulose-1,5-bisphosphat-carboxylase (RUBISCO) oder die Promotoren der Nopalin- und Octopinsynthase auf dem Ti-Plasmid von Agrobacterium tumefaciens, die auch in Pflanzen aktiv sind. Ein Beispiel eines pflanzlichen Terminators ist die 3'-untranslatierte Region (UTR) der kleinen RUBISCO Untereinheit. Weiterhin wurden Systeme beschrieben, die eine Expression nach Aufbringen von Substanzen auf die Pflanze (z. B. Steroidhormone) ermöglichen.One Nucleic acid molecule according to the invention may therefore have a regulatory sequence, in particular a promoter sequence include. In a further preferred embodiment, the nucleic acid molecule according to the invention comprises a Promoter sequence and a Transkriptionsterminationssequenz. Regarding the promoter sequence may be constitutive or inducible Act promoter. Suitable prokaryotic promoters are for Example, the lacUV5 promoter or the T7 promoter. Examples of suitable Eukaryotic promoters are the SV40 promoter or the CMV promoter. However, particularly preferred are nucleic acid molecules, the regulatory sequences from plants include [11, 12]. Suitable herbal promoters are for example the 35S RNA and 19S RNA promoters of Cauliflower Mosaic virus, the light-inducible promoter of the small Subunit of ribulose-1,5-bisphosphate-carboxylase (RUBISCO) or the promoters of nopaline and octopine synthase the Ti plasmid of Agrobacterium tumefaciens, which is also present in plants are active. An example of a plant terminator is the 3'-untranslated region (UTR) of the small RUBISCO subunit. Furthermore, systems were described an expression after application of substances to the plant (eg steroid hormones).

Ein Nukleinsäuremolekül gemäß der Erfindung kann dabei mit der regulatorischen Sequenz in Sense- oder in Antisense-Orientierung verknüpft sein. Eine Verknüpfung in Sense-Orientierung führt zur Transkription eines mRNA-Moleküls und in weiterer Konsequenz zur Synthese eines Polypeptids der PCC1-Familie. Eine Verknüpfung in Antisense-Orientierung dagegen hat die Synthese eines zur mRNA komplementären RNA- Moleküls (i.e. antisense RNA) zur Folge, das als genetisches Werkzeug zur Inhibierung der Genexpression eingesetzt werden kann, wobei auch Fragmente des Nukleinsäuremoleküls zur Inhibierung ausreichen.One Nucleic acid molecule according to the invention may be linked to the regulatory sequence in sense or antisense orientation. A link in sense orientation leads to Transcription of a mRNA molecule and, further, for the synthesis of a polypeptide of the PCC1 family. A link in antisense orientation, on the other hand, the synthesis of an mRNA-complementary RNA molecule (i.e. antisense RNA), which acts as a genetic tool for inhibition Gene expression can be used, including fragments of the Nucleic acid molecule for inhibition suffice.

Die Nukleinsäuremoleküle der Erfindung können ferner in einem Vektor oder einem anderen Klonierungsvehikel enthalten sein, wie zum Beispiel Phagen, Phagemiden, Cosmiden, Baculoviren oder künstlichen Chromosomen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Nukleinsäuremolekül in einem Vektor enthalten, insbesondere in einem Expressionsvektor. Ein derartiger Expressionsvektor kann neben den oben bereits beschriebenen regulatorischen Sequenzen und der Nukleinsäuresequenz, die ein Pflanzenprotein gemäß der Erfindung kodiert, Replikations- und Kontrollsequenzen umfassen, die von einem Organismus stammen, der mit dem zur Expression verwendeten Wirt kompatibel ist, sowie weiterhin mindestens einen Selektionsmarker, der einen selektierbaren Phänotyp auf eine transformierte Zelle überträgt. Eine große Zahl geeigneter Vektoren, z.B. pBluescript, pUC18, pET oder pcDNA3, ist detailliert beschrieben und kommerziell erhältlich. Insbesondere bevorzugt werden Vektoren, die zur Genexpression in Pflanzen geeignet sind. Beispiele derartiger Vektoren sind Ti-Plasmide, Ri-Plasmide, Shuttle-Vektoren wie pPZP221 oder Pflanzenviren, z.B. der Cauliflower Mosaic Virus [11, 12].The Nucleic acid molecules of the invention may further be used contained in a vector or other cloning vehicle such as phages, phagemids, cosmids, baculoviruses or artificial Chromosomes. In a preferred embodiment, the nucleic acid molecule is in one Vector, in particular in an expression vector. Such a Expression vector can be in addition to the regulatory described above Sequences and the nucleic acid sequence, the a vegetable protein according to the invention encoded, replication and control sequences included by a Organism derived with the host used for expression compatible and at least one selection marker, of a selectable phenotype transmits to a transformed cell. A size Number of suitable vectors, e.g. pBluescript, pUC18, pET or pcDNA3, is described in detail and commercially available. Especially preferred become vectors which are suitable for gene expression in plants. Examples of such vectors are Ti plasmids, Ri plasmids, shuttle vectors such as pPZP221 or plant viruses, e.g. the Cauliflower Mosaic Virus [11, 12].

Die Nukleinsäuremoleküle, die ein Protein gemäß der Erfindung kodieren, und insbesondere ein Vektor, der die kodierende Sequenz eines solchen Proteins enthält, können gemäß dem Verfahren aus Anspruch 1 in eine entsprechende Pflanze eingebracht und zur Expression gebracht werden.The Nucleic acid molecules that a protein according to the invention and in particular a vector encoding the coding sequence contains such a protein, can according to the method introduced from claim 1 in a corresponding plant and the Expression be brought.

Das Klonieren in einen zur Expression in Pflanzen geeigneten Vektor kann dabei entweder mit einem Nukleinsäuremolekül, das nur ein Protein aus der PCC1-Familie kodiert, durchgeführt werden oder mit einem Nukleinsäuremolekül, in dem das Protein operativ mit einer regulatorischen Sequenz verknüpft ist. Der so erhaltene rekombinante Vektor kann in der Folge mittels verschiedener etablierter Verfahren in Pflanzenzellen eingebracht werden [11, 12]. Eine routinemäßig verwendete Methode ist die Transformation mittels Agrobacterium tumefaciens, einem Bodenbakterium, das in infizierten Pflanzen die Bildung von Wurzelhalsgallen auslöst. Dabei inseriert es einen Teil seiner DNA, die sogenannte T-DNA, die auf dem Ti-Plasmid ("tumor inducing") kodiert ist, in das Genom der Wirtszelle. Durch Insertion einer heterologen DNA in die T-DNA Region verliert das Ti-Plasmid seine Virulenz und kann als "Genfähre" zur Transformation von Pflanzenzellen eingesetzt werden. Alternative Transformationsverfahren umfassen zum Beispiel Elektroporation, Mikroinjektion, DNA-Präzipitation mit Polyethylenglykol und Hochgeschwindigkeitsbeschuss der Zellen mit Partikeln, welche die heterologe DNA in ihrem Inneren oder auf ihrer Oberfläche tragen. An die Transformation schließt sich die Regeneration der vollständigen transgenen Pflanze an. Diese kann u.a. ausgehend von einer einzelnen Pflanzenzelle, einem Protoplasten, Kallus oder Gewebeabschnitt oder dem Samen erfolgen. Nahezu jede Pflanze kann aus Zellen, Geweben oder Teilen vollständig regeneriert werden. Die dazu erforderlichen Techniken sind zum Beispiel in den Übersichten [11, 12] detailliert beschrieben.Cloning into an expression in Plant suitable vector can be carried out either with a nucleic acid molecule which encodes only a protein from the PCC1 family, or with a nucleic acid molecule in which the protein is operatively linked to a regulatory sequence. The resulting recombinant vector can subsequently be introduced into plant cells by various established methods [11, 12]. One method routinely used is transformation by means of Agrobacterium tumefaciens, a soil bacterium that causes the formation of root gall in infected plants. It inserts a part of its DNA, the so-called T-DNA, which is encoded on the Ti-plasmid ("tumor inducing") into the genome of the host cell. By insertion of a heterologous DNA into the T-DNA region, the Ti plasmid loses its virulence and can be used as a "gene shuttle" for the transformation of plant cells. Alternative transformation methods include, for example, electroporation, microinjection, DNA precipitation with polyethylene glycol and high velocity bombardment of the cells with particles carrying the heterologous DNA in their interior or on their surface. The transformation is followed by the regeneration of the complete transgenic plant. This can be done, inter alia, starting from a single plant cell, a protoplast, callus or tissue section or the seed. Nearly every plant can be completely regenerated from cells, tissues or parts. The techniques required for this purpose are described in detail in the overviews [11, 12], for example.

Als "Targetpflanzen" können dabei sowohl monokotyle als auch dikotyle Spezies verwendet werden. Von besonderer Bedeutung sind Kultur- und Nutzpflanzen, bei denen die gezielte Modulation des Blühzeitpunkts bzw. eine erhöhte Pathogenresistenz eine Ertragssteigerung und damit einen wirtschaftlichen Vorteil mit sich bringt. Beispiele solcher Pflanzen sind Getreide (Weizen, Roggen, Hafer, Gerste, Reis, Mais), Kartoffeln, Raps, Sojabohnen, Zuckerrüben, Klee, Karotten, Sonnenblumen oder Baumwolle, oder auch Blütenpflanzen/Schnittblumen.As "target plants" can thereby both monocot and dicot species are used. From of particular importance are crops and crops where the targeted modulation of the flowering time or an increased Pathogen resistance an increase in yield and thus an economic Advantage brings with it. Examples of such plants are cereals (Wheat, rye, oats, barley, rice, maize), potatoes, rapeseed, soybeans, sugar beets, Clover, carrots, sunflowers or cotton, or even flowering plants / cut flowers.

Demnach betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Steuerung des Blühzeitpunkts einer transgenen Pflanze, das die folgenden Schritte umfasst:

(a) Einbringen eines Nukleinsäuremoleküls der Erfindung in eine Pflanze, und
(b) heterologe Expression des Nukleinsäuremoleküls aus
(a), um die Aktivität des korrespondierenden Polypeptids nach oben bzw. unten zu regulieren.

Accordingly, the invention relates to a method for controlling the flowering time of a transgenic plant comprising the following steps:

(a) introducing a nucleic acid molecule of the invention into a plant, and
(b) heterologous expression of the nucleic acid molecule
(a) to up-regulate the activity of the corresponding polypeptide.

Die Regulation der Genexpression kann dabei auf transkriptioneller, post-transkriptioneller, translationeller oder post-translationeller Ebene erfolgen. So kann zum Beispiel durch Einbringen einer zweiten oder weiterer Kopien eines Gens aus der PCC1-Familie in eine Pflanze die PCC1-Aktivität erhöht werden, was wiederum zu einer schnelleren Induktion der Blütenbildung führt. Die Expression einer Nukleinsäuresequenz, die nur einen Teil eines Proteins gemäß der Erfindung kodiert, kann aber andererseits auch zu einer Verzögerung des Blühzeitpunkts führen, indem dieses Peptid mit der Funktion des endogenen Proteins interferiert. Ein solches Peptid wird als dominant-negative Mutante bezeichnet. Enthält eine Pflanze eine transgene Kopie eines endogenen Gens (bzw. die Kopie eines Fragments davon) in Sense-Orientierung, d.h. in der gleichen Orientierung wie die endogene Kopie, kann dies zu einer transkriptionellen Inaktivierung ("silencing") beider Genkopien führen, weshalb man bei diesem Phänomen auch von Cosuppression spricht (Übersichten in [15, 16]). Alternativ kann die Genexpression eines Nukleinsäuremoleküls der Erfindung aber auch durch die Expression eines Antisensemoleküls herunterreguliert werden (Übersichten in [17, 18]). Ein Antisense-Nukleinsäuremolekül gemäß der Erfindung ist in umgekehrter Orientierung zur endogenen Kopie der Sequenz kloniert. Seine Transkription führt daher zu einem RNA-Molekül, das zur mRNA des endogenen Gens komplementär ist, d.h. diese mRNA binden und deren Translation verhindern kann. In den letzten Jahren wurde mit der RNA-Interferenz (in Pflanzen auch als "posttranscriptional gene silencing" bezeichnet) eine weitere Methode zur Verminderung der Genexpression beschrieben, die auf der Aktivität doppelsträngiger RNA basiert (Übersichten in [19, 20]). Verantwortlich für diesen Prozess sind 21–25 Nukleotide lange siRNAs ("small interfering RNAs"), die an die zu inaktivierende endogene Nukleinsäuresequenz binden und deren Degradation durch Rekrutierung eines spezifischen Enzymkomplexes einleiten. Solche siRNAs können entweder in vivo aus transkribierten DNA-Vorläufermolekülen hergestellt oder chemisch synthetisiert und anschließend in die Zellen eingeschleust werden.The Regulation of gene expression can be based on transcriptional, post-transcriptional, translational or post-translational Level. Thus, for example, by introducing a second or other copies of a gene from the PCC1 family into a plant the PCC1 activity is increased, which in turn leads to a faster induction of flowering leads. Expression of a nucleic acid sequence, which encodes only part of a protein according to the invention can but on the other hand also lead to a delay of the flowering time by this peptide interferes with the function of the endogenous protein. Such a peptide is called a dominant-negative mutant. Contains one Plant a transgenic copy of an endogenous gene (or the copy a fragment thereof) in sense orientation, i.e. in the same orientation as the endogenous copy, this can be lead to a transcriptional inactivation ("silencing") of both gene copies, which is why one in this phenomenon also speaks of Cosuppression (reviews in [15, 16]). Alternatively, gene expression of a nucleic acid molecule of the invention but also downregulated by the expression of an antisense molecule (Overviews in [17, 18]). An antisense nucleic acid molecule according to the invention is in reverse Orientation to the endogenous copy of the sequence cloned. His transcription leads therefore to an RNA molecule, which is complementary to the mRNA of the endogenous gene, i. bind this mRNA and prevent their translation. In recent years has been with RNA interference (also referred to in plants as "post-transcriptional gene silencing") described another method for reducing gene expression, the on the activity double RNA based (overviews in [19, 20]). Responsible for this process is 21-25 Nucleotides of long siRNAs ("small interfering RNAs "), which bind to the endogenous nucleic acid sequence to be inactivated and their Degradation by recruitment of a specific enzyme complex initiate. Such siRNAs can either in vivo from transcribed DNA precursor molecules or chemically synthesized and subsequently be introduced into the cells.

Die Erfindung wird ferner durch die folgenden nichteinschränkenden Figuren und Beispiele veranschaulicht.The Invention is further characterized by the following non-limiting Figures and examples illustrated.

1 zeigt einen multiplen Vergleich der Aminosäuresequenzen von PCC1 (At3g22231) sowie der homologen Proteine At3g22240, At2g32190, At2g32200, At2g32210 und At1g05340. Übereinstimmungen zwischen PCC1 und den jeweiligen Paralogen an einer bestimmten Position sind schwarz unterlegt. 1 shows a multiple comparison of the amino acid sequences of PCC1 (At3g22231) and the homologous proteins At3g22240, At2g32190, At2g32200, At2g32210 and At1g05340. Matches between PCC1 and the respective paralogues at a particular position are highlighted in black.

2 zeigt Arabidopsis thaliana Wildtyppflanzen (Col-Wt) sowie transgene Pflanzen, die das PCC1 (At3g22231) Gen überexprimieren (PCC1ox). Das PCC1-Gen wurde dabei mit Hilfe von Agrobacterium tumefaciens unter Verwendung etablierter Verfahren in die Pflanzen eingebracht (siehe auch Beispiel 2). PCC1ox-Pflanzen zeigen eine deutlich verfrühte Blüte sowohl unter Kurz- wie auch Langtagbedingungen. Daneben ist auch ein verstärktes Wurzelwachstum sowie ein insgesamt kräftigerer Wuchs erkennbar (wenn auch noch nicht statistisch ausgewertet). 2 shows Arabidopsis thaliana wild type plants (Col-Wt) as well as transgenic plants overexpressing the PCC1 (At3g22231) gene (PCC1ox). The PCC1 gene was amplified using Agrobacterium tumefaciens using established Ver drive into the plants introduced (see also Example 2). PCC1ox plants show a distinctly premature flowering in both short and long day conditions. In addition, increased root growth and an overall stronger growth are recognizable (although not yet statistically evaluated).

Beispiel 1: Klonierung des PCC1 (At3g322210)-GensExample 1: Cloning of the PCC1 (At3g322210) gene

Der DNA-Klon, der die Sequenz des PCC1-Gens (Genlocus-Bezeichnung: At3g322231) enthält wurde im Rahmen von Mikroarray-Experimenten isoliert [10]. Der vollständige kodierende Bereich wurde mittels RT-PCR aus Gesamt-RNR von Arabidopsis thaliana Col-0 amplifiziert (alle beschriebenen Verfahren sind molekularbiologische Standardmethoden; [13, 14]). Dazu wurden der Titan One-Tube RT-PCR Kit (Roche) entsprechend der Herstelleranweisung und die folgenden Primer verwendet: vorwärts 5'-AAGGATCCAGAATGAATCAATCCGCGC-3' (BamHI-Schnittstelle), rückwärts 5'-AAAAAGTCGACTTACTCTGTACAGRGGC-3' (SalI-Schnittstelle). Das gereinigte DNA-Fragment wurde mit den entsprechenden Restriktionsendonukleasen gespalten und in den binären Expressionsvektor pCHF1 (erhalten von C. Fankhauser, Universität Genf) kloniert. pCHF1 ist von pPZP221 [21] abgeleitet und kodiert den starken 35S CaMV Promotor (EcoRI/SacI-Fragment) stromaufwärts sowie als Terminator die 3'UTR der kleinen Untereinheit von RUBISCO (PstI/HindIII-Fragment) stromabwärts der multiplen Klonierungsstelle.Of the DNA clone containing the sequence of the PCC1 gene (gene locus name: At3g322231) isolated in the context of microarray experiments [10]. The complete coding Range was determined by RT-PCR from total RNR of Arabidopsis thaliana Col-0 amplified (all procedures described are molecular biological Standard methods; [13, 14]). For this purpose, the Titan One-Tube RT-PCR Kit (Roche) according to the manufacturer's instructions and the following Primer used: forward 5'-AAGGATCCAGAATGAATCAATCCGCGC-3 '(BamHI site), reverse 5'-AAAAAGTCGACTTACTCTGTACAGRGGC-3' (SalI site). The purified DNA fragment was ligated with the appropriate restriction endonucleases split and in the binary Expression vector pCHF1 (obtained from C. Fankhauser, University of Geneva) cloned. pCHF1 is derived from pPZP221 [21] and encodes the strong 35S CaMV promoter (EcoRI / SacI fragment) upstream as well as terminator the 3'UTR the small subunit of RUBISCO (PstI / HindIII fragment) downstream of the multiple Cloning site.

Der rekombinante Vektor wurde anschließend in den chemisch kompetenten Agrobacterium tumefaciens Stamm GV3101 (DSM 12365, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) transformiert. Dazu wurden 5 μg Plasmid-DNA mit den aufgetauten Zellen 5 min auf Eis inkubiert, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und danach 5 min bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde 1 ml YEP-Medium (1% Hefeextrakt, 1% Pepton, 0.5% NaCl, pH 7.0) zugegeben und die Zellen 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Bakterien wurden auf Selektivmedium plattiert, und die Agarplatten drei Tage bei 28°C bebrütet. Transformanten konnten aufgrund ihrer erworbenen Resistenz gegenüber Spectinomycin isoliert werden.Of the recombinant vector was subsequently added to the chemically competent Agrobacterium tumefaciens strain GV3101 (DSM 12365, German Collection of microorganisms and cell cultures). In addition were 5 μg of plasmid DNA incubated with the thawed cells on ice for 5 min, in liquid nitrogen shock-frozen and then incubated at 37 ° C for 5 min. Subsequently was 1 ml of YEP medium (1% yeast extract, 1% peptone, 0.5% NaCl, pH 7.0) was added and the cells are incubated for 2 hours at room temperature. The bacteria were plated on selective medium and the agar plates three days at 28 ° C incubated. Transformants failed due to their acquired resistance to spectinomycin be isolated.

Beispiel 2: Generierung PCC1-überexprimierender transgener PflanzenExample 2: Generation PCC1 overexpressing transgenic plants

Die T-DNA von transformierten Agrobacterium tumefaciens wurde im Anschluss in Arabidopsis thaliana Ökotyp Columbia (Col-0) Pflanzen transferiert. Dazu wurde die "Floral dip"-Methode [22] verwendet, wobei das zu transformierende Pflanzengewebe in eine Lösung getaucht wird, die transformierte Agrobacterium tumefaciens Zellen, 5% (w/v) Sucrose und 500 μl/l Surfactant Silwet L-77 enthält. Transformierte Pflanzen, die das PCC1-Gen konstitutiv exprimieren (i.e. im Vergleich zum Wildtyp PCC1 überexprimieren), wurden auf MS-Platten "halber Stärke" supplementiert mit 50 μg/ml Gentamicin (Sigma) selektiert. Aus fünf unabhängig transformierten Linien, die eine singuläre T-DNA Insertion tragen (gemäß einer 3:1 Segregation der Gentamicin-Resistenz in der T₂-Generation) wurden homozygote Linien selektiert.The T-DNA of transformed Agrobacterium tumefaciens was subsequently transferred to Arabidopsis thaliana ecotype Columbia (Col-0) plants. For this purpose, the "floral dip" method [22] was used, wherein the plant tissue to be transformed is immersed in a solution containing transformed Agrobacterium tumefaciens cells, 5% (w / v) sucrose and 500 μl / l of surfactant Silwet L-77 , Transformed plants constitutively expressing the PCC1 gene (ie overexpressing PCC1 in comparison to the wild type) were selected on half strength MS plates supplemented with 50 μg / ml gentamicin (Sigma). Homozygous lines were selected from five independently transformed lines carrying a single T-DNA insert (according to a 3: 1 segregation of gentamicin resistance in the T ₂ generation).

Die Pflanzen wurden unter kontrollierten Wachstumsbedingungen bei 22°C, etwa 65% relativer Luftfeuchtigkeit und einer Lichtintensität von etwa 150 μE m^–2 sec^–1 angezogen (siehe 2; Col-Wt = Wildtyp, PCC1ox = transgene Pflanzen). Sämtliche PCC1ox-Pflanzen zeigten eine deutlich verfrühte Blüte, insbesondere wenn sie unter permanenter Lichteinstrahlung (i.e. Langtagbedingungen) angezogen wurden. Die PCC1ox-Pflanzen blühten bereits in einem Stadium mit vier echten Blättern, während die Blüte bei den Wildtyppflanzen erst mit 8–10 Blättern erfolgte. Unter Kurztagbedingungen (8.5 h Licht und 15.5 h Dunkelheit) blühten die PCC1ox-Pflanzen ebenfalls signifikant früher als der Col-0 Wildtyp. Die transgenen Pflanzen entwickelten dabei innerhalb von 5–6 Wochen 15–20 Rosettenblätter, bevor sie zu blühen begannen. Wildtyp-Pflanzen benötigten hingegen mehr als zwei Wochen länger, um die gleiche Blütenstandshöhe (1 cm) zu erreichen, und wiesen dabei 30–35 Rosettenblätter auf.The plants were grown under controlled growth conditions at 22 ° C, about 65% relative humidity and a light intensity of about 150 μE m ^-2 sec ^-1 (see 2 ; Col-Wt = wild type, PCC1ox = transgenic plants). All PCC1ox plants showed a markedly premature flowering, especially when grown under permanent light (ie long-term conditions). The PCC1ox plants already bloomed at one stage with four true leaves, while the bloom in the wild-type plants took place only with 8-10 leaves. Under short day conditions (8.5 h light and 15.5 h dark), the PCC1ox plants also bloomed significantly earlier than the Col-0 wild type. The transgenic plants developed 15-20 rosette leaves within 5-6 weeks before they began to flower. In contrast, wild-type plants needed more than two weeks longer to reach the same inflorescence height (1 cm), with 30-35 rosette leaves.

Während des Wachstums der PCC1ox-Pflanzen auf MS-Platten konnte ferner ein verstärktes Wurzelwachstum beobachtet werden, das nicht nur an der Hauptwurzel, sondern auch an den Seitenwurzeln auftrat, die eine stärkere Verzweigung aufwiesen und längeres Wachstum zeigten. Möglicherweise lässt sich dadurch auch der insgesamt kräftigere Wuchs der transgenen Pflanzen im Vergleich zu den Wildtyppflanzen erklären. Diesbezüglich liegen aber derzeit noch keine statistisch gesicherten Ergebnisse vor.During the Growth of PCC1ox plants on MS plates also increased root growth not only at the main root, but also occurred at the lateral roots, which had a stronger branching and longer Growth showed. possibly let yourself thereby also the overall stronger Growth of the transgenic plants compared to the wild-type plants to explain. In this regard, but currently there are no statistically proven results in front.

Überraschenderweise besaßen die PCC1ox-Pflanzen jedoch eine erhöhte Resistenz gegenüber dem Oomyceten Hyaloperonospora parasitica (Falscher Mehltau). Während das H. parasitica Isolat NOCO gegenüber den Wildtyppflanzen virulent ist, waren alle getesteten PCC1ox-Linien dagegen resistent. Unter dem Mikroskop ließ sich lediglich ein sehr begrenztes Hyphenwachstum erkennen. Die Hyphen waren dabei von apoptotischen Pflanzenzellen umgeben – ein klassischer Marker für die Ausbildung einer Resistenz.Surprisingly had However, the PCC1ox plants have increased resistance to the Oomyceten hyaloperonospora parasitica (downy mildew). While that H. parasitica isolate NOCO opposite wild-type plants were all PCC1ox lines tested against it resistant. Under the microscope, only a very limited Recognize hyphal growth. The hyphae were apoptotic Surrounded by plant cells - one classic marker for the training of a resistance.

Da die Genexpression von PCC1 sowohl nach Behandlung mit virulenten als auch avirulenten Stämmen von Pseudomonas syringae pva. tomato signifikant induziert wird, könnte PCC1 – basierend auf den vorliegenden Ergebnissen – auch eine Rolle in der basalen Pathogenabwehr der Pflanze spielen. Dementsprechend könnte man bei konstitutiver Expression des PCC1-Gens eine erhöhte Abwehrbereitschaft der Pflanze erwarten, ähnlich dem Phänomen der "systemic aquired resistance" (SAR; [10]). Darunter versteht man den Effekt, dass eine Pflanze nach Abwehr einer Infektion eines nekrotisierenden Pathogens, Vorbehandlung mit β-Aminobuttersäure oder Salicylsäure oder Kontakt mit Pseudomonas spec. im Wurzelbereich eine schnellere und verstärkte Antwort auf Pathogenbefall zeigt.Since the gene expression of PCC1 both after treatment with virulent and avirulent strains of Pseudomonas syringae pva. tomato is significantly induced, PCC1 - based on the available results - might also play a role play in the basal pathogen defense of the plant. Accordingly, one could expect an increased preparedness of the plant with constitutive expression of the PCC1 gene, similar to the phenomenon of "systemic aquired resistance"(SAR; [10]). This refers to the effect that a plant, after defense against infection of a necrotizing pathogen, pretreatment with β-aminobutyric acid or salicylic acid or contact with Pseudomonas spec. in the root area shows a faster and stronger response to pathogen infestation.

Referenzenreferences

[1] Mouradov, A. et al. (2002) Plant Cell 14 Suppl. S111-S130.
[2] Simpson, G.G. & Dean, C. (2002) Science 296, 285-289.
[3] Yanovsky, M.J. & Kay, S.A. (2003) Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 4, 265-276.
[4] U.S. Pat. Patent 6,265,637
[5] U.S. Pat. Patent Application 2002/0029395
[6] International Patent Application WO 02/42475
[7] International Patent Application WO 02/12518
[8] European patent application EP 0 967 278 A2
[9] Scheideler, M. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277, 10556ff
[10] Ryals, J.A. et al. (1996) Plant Cell 8, 1809-1819.
[11] Vasil, I.K. (1984) Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants. Laboratory Procedures and Their Applications, Vol. I-III, Academic Press, New York.
[12] Weisbach, A. & Weisbach, H. (1989) Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, New York.
[13] Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.
[14] Ausubel, F.M. et al. (2002) Short Protocols in Molecular Biology, 5th Ed., John Wiley & Sons, Hoboken, NJ.
[15] Baulcombe, D.C. & English, J.J. (1996) Curr. Opin. Biotechnol. 7, 173-180.
[16] Smyth, D.R. (1997) Curr. Biol. 7, R793-R795.
[17] Baker, B.F. & Monia, B.P. (1999) Biochim. Biophys. Acta 1489, 318.
[18] Brantl, S. (2002) Biochim. Biophys. Acta 1575, 15-25.
[19] Sharp, P.A. (1999) Genes Dev. 13, 139-142.
[20] Vaucheret, H. et al. (2001) J. Cell Sci. 114, 3083-3091.
[21] Hajdukiewicz, P. et al. (1994) Plant Mol. Biol. 25, 989-994.
[22] Clough, S.J. & Bent, A. F. (1998) Plant J. 16, 735-743.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.It follows a sequence listing according to WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.This can from the official publication platform downloaded from the DPMA.

Claims

Method for controlling the flowering time of a Transgenic plant comprising: (a) introducing a nucleic acid molecule which for a encodes protein from the PCC1 family of proteins, wherein the protein is an amino acid sequence which is selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 10 and SEQ ID No. 12, selected will, in a plant, and (b) heterologous expression of the nucleic acid molecule of (a), about the activity up or down regulate the corresponding polypeptide.

Method according to claim 1, wherein the amino acid sequence from the group consisting of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 10, and SEQ ID No. 12.

Method according to one the claims 1 to 2, wherein the amino acid sequence SEQ ID NO: 2.

Method according to one the claims 1-2, where the plant protein is a protein or peptide affinity epitope having at its N and / or C terminus.

Method according to one the claims 1 to 4, wherein the nucleic acid molecule is operative is linked to a regulatory sequence to expression of the nucleic acid molecule.

Method according to claim 5, wherein the nucleic acid molecule in sense or antisense orientation is linked to the regulatory sequence.

Method according to claim 5 or 6, wherein the regulatory sequence is a promoter sequence and a transcription termination sequence.

Method according to one the claims 1 to 7, wherein the nucleic acid molecule in a Vector is included.

Method according to claim 8, wherein the vector is adapted for gene expression in plants.