DE10210571A1 - A process for the preparation of a fibrillar chitin-containing composition useful for humans, newly born and young animals, suckling, and small children, and for decreasing infant mortality, especially of breeding animals - Google Patents
A process for the preparation of a fibrillar chitin-containing composition useful for humans, newly born and young animals, suckling, and small children, and for decreasing infant mortality, especially of breeding animalsInfo
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Abstract
Description
Chitin ist nach Cellulose das am zweithäufigsten vorkommende natürliche Polysaccharid, das aus 2-Acetamido-2-desoxy-β-D-glucopyranose besteht und über 1-4-Verbindungen verknüpft ist. Obwohl die besonderen Eigenschaften von Chitin schon lange Zeit bekannt sind (erstmals wurde es 1811 von Braconnot isoliert) scheint bis auf die jüngste Vergangenheit kaum Gebrauch davon gemacht worden zu sein (Rinaudo, M. (1992) in: Chitin Chemistry, hrsg. von G. A. F. Roberts, The Maximilian Press, Hampshire, GB; Vorwort). Mittlerweile werden chitinhaltige Substrate und Chitinderivate bereits in der Technik als Absorber und Membranen zu verschiedenen Zwecken eingesetzt, wie z. B. zur Dekontamination von Abwässern und Sedimenten von Schwermetallionen sowie zur Dekontamination von radioaktiven Flüssigkeiten und Feststoffen (Gorowoj, L. F. und Kosjakow, V. N. (1997) Chitin and chitosan biosorbents for radionuclides and heavy metals, in: Advances in Chitin Sciences, Vol. 2, Proc. 7th Int. Conf. on Chitin/Chitosan, hrsg. von A. Dormard et al., Jacques Andre Publisher, Lyon, Frankreich, Seite 858-863). Bei diesen Anwendungen handelt es sich überwiegend um das Chitinderivat Chitosan, welches in der Regel aus Material von Crustacaen hergestellt wurde. Die Substanzen liegen dabei in kristalliner oder gelartiger Form vor. Auch sind einige medizinische Anwendungen mit chitinhaltigen Präparaten aus Pilzen beschrieben worden: z. B. als strahlenprotektive Substanz, Verbandsmaterial bei der Wundheilung, Nahrungszusatz bei viraler Hepatitis oder bei Gastroduodenitis. After cellulose, chitin is the second most common natural polysaccharide, which consists of 2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranose and is linked via 1-4 compounds. Although the special properties of chitin have been known for a long time (it was first isolated from Braconnot in 1811), it has hardly been used until recently (Rinaudo, M. (1992) in: Chitin Chemistry, ed. By GAF Roberts, The Maximilian Press, Hampshire, GB; preface). In the meantime, substrates and chitin derivatives containing chitin are already being used in technology as absorbers and membranes for various purposes, such as. B. for the decontamination of waste water and sediments from heavy metal ions and for the decontamination of radioactive liquids and solids (Gorowoj, LF and Kosjakow, VN (1997) Chitin and chitosan biosorbents for radionuclides and heavy metals, in: Advances in Chitin Sciences, Vol. 2, Proc 7 th Int., Conf. on chitin / chitosan, Ed. by A. Dormard et al., Jacques Andre Publisher, Lyon, France, pages 858-863). These applications are mainly the chitin derivative chitosan, which was usually made from Crustacaen material. The substances are in crystalline or gel-like form. Some medical applications with chitin-containing preparations from mushrooms have also been described: B. as a radiation protective substance, dressing material in wound healing, nutritional supplements for viral hepatitis or gastroduodenitis.
Die biologische Wirkung von Präparaten aus Chitinderivaten hängt entscheidend von der biologischen Quelle des Chitins, der Art der Modifikation und besonders von seinen zusätzlichen Bestandteilen ab. Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung und Verwendung von biologisch hochaktiven chitinhaltigen Präparaten (genannt: "NEO-IMMUN") und seiner Derivate/Komplexe insbesondere zur Senkung der Sterblichkeit von Neugeborenen bei Zuchttieren. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung dieser Präparate zur Steigerung der Vitalität bei Mensch und Tier und zur Erhöhung der mittleren Lebensspanne insbesondere bei Zuchttieren. Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung dieser Präparate als Immunmodulatoren [Biological Response Modifiers (BRM)]. Diese bewirken eine Stärkung der Immunantwort sowohl in vitro als auch in vivo. Der Nutzen von BRM für die Humantherapie ist erwiesen, wie die Zulassungen von Interferon α und Interleukin 2 für medizinische Anwendungen zeigen. The biological effect of preparations from chitin derivatives depends crucial from the biological source of chitin, the type of Modification and especially on its additional components. The present invention relates to the manufacture and use of biologically highly active preparations containing chitin (called: "NEO-IMMUN") and its derivatives / complexes in particular to reduce mortality of newborns in breeding animals. Furthermore, the present concerns Invention the use of these preparations to increase vitality Humans and animals and to increase the average lifespan especially in breeding animals. In addition, the present concerns Invention the use of these preparations as immunomodulators [Biological Response Modifiers (BRM)]. These strengthen the Immune response both in vitro and in vivo. The Benefits of BRM for Human therapy has been proven as the approvals of interferon α and Show Interleukin 2 for medical applications.
Im folgenden werden die Verfahren zur Herstellung und die Verwendung von "NEO-IMMUN" und seiner Derivate/Komplexe als biologisch hochaktive Präparate, insbesondere zur Beeinflussung der Wurfgröße, zur Herabsetzung der Säuglingssterblichkeit und zur Erhöhung der Vitalität/mittleren Lebenserwartung bei Zuchttieren sowie als potente Immunmodulatoren in vitro sowie in vivo beschrieben, wobei sich die Derivate/Komplexe in den aufgeführten Systemen als noch potenter erweisen. The following are the procedures for making and using "NEO-IMMUN" and its derivatives / complexes as biologically highly active Preparations, in particular for influencing the litter size, for Reducing infant mortality and increasing Vitality / average life expectancy in breeding animals as well as being potent Immunomodulators described in vitro and in vivo, the Derivatives / complexes in the listed systems as even more potent prove.
Für die meisten Anwendungen wird Chitin hauptsächlich aus Crustaceen isoliert. Auch niedere Pilze werden häufiger als Quellen genutzt, weniger jedoch höhere Pilze. Aufgrund der besseren Verfügbarkeit und Zugänglichkeit werden als Ausgangsmaterialien für das beschriebene erfindungsgemäße Verfahren gewöhnlich Fruchtkörper von Basidiomyceten, vorzugweise der Gattungen Corolius, Coriolus, Coriolellus, Caltricia, Daedalea, Daedaleopsis, Fomitopsis, Fomes, Ganoderma, Inonotus, Irpex, Lenzites oder Phellinnus verwendet. Biologisches Material anderer chitinproduzierender Organismen, wie z. B. Mollusken und Insekten, ist prinzipiell ebenfalls geeignet. Sie haben aber in der Regel den Nachteil, daß Wirkkomponenten teilweise aus anderen Quellen zugeführt werden müssen. For most applications, chitin is mainly made from crustaceans isolated. Lower mushrooms are also used more often as sources, less however higher mushrooms. Because of the better availability and Accessibility is described as starting materials for the Process according to the invention usually fruiting bodies of Basidiomycetes, preferably of the genera Corolius, Coriolus, Coriolellus, Caltricia, Daedalea, Daedaleopsis, Fomitopsis, Fomes, Ganoderma, Inonotus, Irpex, Lenzites or Phellinnus used. Biological material from others chitin producing organisms such as B. mollusks and insects in principle also suitable. But they usually have the disadvantage that Active components sometimes have to be supplied from other sources.
Das neue Verfahren zur Herstellung der bioaktiven Präparate erfolgt in zwei Hauptschritten: 1. Isolierung und Prozessierung der chitinhaltigen fasrigen Grundmasse 2. Modifikation/Zusatz potenzierender Substanzen und Prozessierung des Materials. The new process for producing the bioactive preparations takes place in two Main steps: 1. Isolation and processing of the chitinous fibrous Base 2. Modification / addition of potentiating substances and Processing of the material.
Der generelle Prozeß zur Isolierung der wasserunlöslichen Bestandteile aus
Basidiomyceten ist bekannt (Gorowoj, L. F. und Kosakow, W. N., The method
to obtain chitin-containing materials. Patent der Russischen Förderation, Nr.
RU 207315, 1997, Russ.). Die Isolierung der chitinhaltigen Grundmasse
erfolgt im wesentlichen nach dem o. g. bekannten Verfahren. Dieser Prozeß
ist durch folgende Schritte gekennzeichnet:
- 1. Zermahlen der Pilzmasse zu einem homogenen Pulver
- 2. Behandlung der Masse in alkalischer Lösung zur Deproteinisierung (gewöhnlich findet eine 0,5-40%ige NaOH-Lösung Verwendung)
- 3. Behandlung der unlöslichen Fraktionen mit wäßriger Lösung (gewöhnlich 3-malige Behandlung für je 20 min) zum Entfernen der schwer alkalilöslichen Bestandteile
- 4. Behandlung mit saurer Lösung zur Demineralisierung (HCl oder HNO3, R der Konzentration der bei Schritt 2 verwendeten alkalischen Lösung)
- 5. Waschen mit Wasser (5-mal für je 20 min. jeweils 15-faches Volumen)
- 6. Trocknen (60-80°C)
- 1. Grind the mushroom mass into a homogeneous powder
- 2. Treatment of the mass in alkaline solution for deproteinization (usually a 0.5-40% NaOH solution is used)
- 3. Treatment of the insoluble fractions with aqueous solution (usually 3 times for 20 min each) to remove the poorly alkali-soluble components
- 4. Treatment with acidic solution for demineralization (HCl or HNO 3 , R the concentration of the alkaline solution used in step 2)
- 5. Wash with water (5 times for 20 minutes each, 15 times the volume)
- 6. Drying (60-80 ° C)
Das Abtrennen der unlöslichen Fraktion erfolgt nach den einzelnen Schritten jeweils durch Filtration oder Zentrifugation. The insoluble fraction is separated off after the individual steps each by filtration or centrifugation.
Bis zu Schritt 4 verläuft das neue Verfahren analog. Neu an dem
erfindungsgemäßen Verfahren ist, daß ein exzessives Waschen mit Wasser
erfolgt (10-mal für je 30 min. jeweils 10-faches Volumen) und das Trocknen
bei moderaterer Temperatur (40-50°C) erfolgt. Außerdem erfolgt nach dem
Trocknen ein erneuter Waschzyklus mit Wasser (10-mal für je 30 min. jeweils
10-faches Volumen). Danach wird die unlösliche Masse mit absolutem
Ethanol gewaschen und bei 40-50°C unter ständiger Luftverwirbelung
getrocknet. Überraschenderweise werden durch diese Behandlung Präparate
mit extralangen Fasern von bis zu 10 mm Länge und ein optimales
Konzentrationsverhältnis der einzelnen Wirkkomponenten erreicht. Die durch
dieses Verfahren hergestellten Präparate haben in der Regel folgende
Zusammensetzung:
Chitin 70-80%, Glucan 10-25%, Melanin 5-10%.
Up to step 4, the new procedure is analogous. What is new about the process according to the invention is that excessive washing with water takes place (10 times for 30 min. In each case 10 times the volume) and drying takes place at a more moderate temperature (40-50 ° C.). In addition, after drying, there is another wash cycle with water (10 times for 30 minutes each, 10 times the volume). Then the insoluble mass is washed with absolute ethanol and dried at 40-50 ° C with constant air swirling. Surprisingly, this treatment enables preparations with extra-long fibers of up to 10 mm in length and an optimal concentration ratio of the individual active components to be achieved. The preparations made by this process usually have the following composition:
Chitin 70-80%, glucan 10-25%, melanin 5-10%.
Diese Grundsubstanz wird als "NEO-IMMUN" bezeichnet. This basic substance is called "NEO-IMMUN".
Auch Präparate in der nachfolgend aufgeführten Zusammensetzung können verwendet werden: Chitin 60-90%, Glucan 8-35%, Melanin 0,5-10%. Sie zeigen jedoch eine etwas geringere biologische Aktivität. Preparations with the following composition can also be used used are: chitin 60-90%, glucan 8-35%, melanin 0.5-10%. she however show a slightly lower biological activity.
Das Material kann sowohl für die In-vitro- als auch für die In-vivo-Applikation speziell hergestellt werden. Für intraperitoneale Applikationen (als ein Beispiel für eine mögliche In-vivo-Applikation) muß das Material zerkleinert werden. Dies kann z. B. mechanisch in einen Vibrator (Mikrodismembrator; Fa. Braun, Melsungen, Deutschland) erfolgen. Hierzu wird das Ausgangsprodukt in den Vibrator eingebracht und bei niedriger Umgebungstemperatur (4-15°C) durch die Wucht der darin befindlichen Kugel in kleine Bestandteile zerschlagen. Je nach Länge der Behandlung werden kleinere Partikel erhalten. In der Regel werden zwei Fraktionsgrößen hergestellt: a) "NEO-IMMUN-M" (M = medium) mit einer Fibrillenlänge von ca. 20-30 µm oder b) "NEO-IMMUN-F" (F = fine) mit sehr kleinen Fragmenten mit einer Teilchengröße von ca. 2-3 µm. Die angegebenen Teilchengrößen (Fibrillenlänge) wurden mit Hilfe der Scanning-Elektronenmikroskopie bestimmt. Alternativ kann das Material durch Behandlung mit flüssigem Stickstoff und anschließendes Mörsern zerkleinert werden. The material can be used for both in vitro and in vivo application be made specifically. For intraperitoneal applications (as one Example of a possible in vivo application) the material must be shredded become. This can e.g. B. mechanically in a vibrator (microdismembrator; Braun, Melsungen, Germany). For this, the Initial product introduced into the vibrator and at lower Ambient temperature (4-15 ° C) due to the force of the inside Break the ball into small parts. Depending on the length of treatment smaller particles are obtained. Usually two faction sizes manufactured: a) "NEO-IMMUN-M" (M = medium) with a fibril length of approx. 20-30 µm or b) "NEO-IMMUN-F" (F = fine) with very small fragments with a particle size of approx. 2-3 µm. The specified particle sizes (Fibril length) were determined using scanning electron microscopy certainly. Alternatively, the material can be treated with liquid Nitrogen and subsequent mortar are crushed.
200 g der Spezies Ganoderma applanatum wurden zu einem homogenen Pulver zermahlen und mit 1,5 Liter einer 30%igen NaOH-Lösung für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Abfiltrieren wurde die abgetrennte fasrige Masse 5-mal mit je 2 Liter Wasser für jeweils 20 min gewaschen. Die unlösliche Fraktion wurde wiederum abfiltriert und 30 min mit 7,5%iger HCl behandelt. Anschließend wurde die unlösliche Fraktion 10-mal für je 30 min mit jeweils dem 10-fachen Volumen an Wasser gewaschen und bei 50°C getrocknet. Das trockene abgekühlte Material wurde erneut 10-mal für je 30 min mit Wasser und anschließend mit absolutem Äthanol gewaschen und dann bei 40°C getrocknet. 200 g of the species Ganoderma applanatum became a homogeneous Grind powder and with 1.5 liters of a 30% NaOH solution for 1 hour incubated at room temperature. After filtering off, the separated one fibrous mass washed 5 times with 2 liters of water for 20 min each. The Insoluble fraction was again filtered off and 30 min with 7.5% HCl treated. The insoluble fraction was then 10 times for 30 min each washed with 10 times the volume of water and at 50 ° C dried. The dry, cooled material was again 10 times for 30 min each washed with water and then with absolute ethanol and then dried at 40 ° C.
Das erhaltene Material (ca. 120 g) hatte folgende Zusammensetzung: Chitin 83%, Glucan 11%, Melanin 6%. Die maximale Faserlänge betrug 8 mm. The material obtained (approx. 120 g) had the following composition: chitin 83%, glucan 11%, melanin 6%. The maximum fiber length was 8 mm.
300 g der Spezies Fomes fomentarius wurden zu einem homogenen Pulver zermahlen und mit 2 Liter einer 20%igen NaOH-Lösung für 1 Stunde bei 50°C inkubiert. Die fasrige Masse wurde abfiltriert und 5-mal mit jeweils 3 Liter Wasser für je 20 min gewaschen. Nach Filtration wurde die unlösliche Fraktion für 1 Stunde mit 5%iger HCl behandelt. Anschließend wurde die unlösliche Fraktion 10-mal für je 30 min mit jeweils dem 10-fachen Volumen an Wasser gewaschen und bei 50°C getrocknet. Das trockene abgekühlte Material wurde erneut mit 10-mal für je 30 min mit Wasser gewaschen. Danach wurde die Masse mit absolutem Äthanol gewaschen und bei 40°C getrocknet. Das erhaltene Material (ca. 195 g) hatte folgende Zusammensetzung: Chitin 76%, Glucan 15%, Melanin 9%. Die maximale Faserlänge betrug 7 mm. 300 g of the species Fomes fomentarius became a homogeneous powder grind and add 2 liters of a 20% NaOH solution for 1 hour Incubated at 50 ° C. The fibrous mass was filtered off and 5 times with 3 each Liters of water washed for 20 min each. After filtration, the insoluble one Treated fraction with 5% HCl for 1 hour. Then the insoluble fraction 10 times for 30 min each with 10 times the volume washed in water and dried at 50 ° C. The dry cooled Material was washed again with water 10 times for 30 min each. Then the mass was washed with absolute ethanol and at 40 ° C. dried. The material obtained (approx. 195 g) had the following Composition: chitin 76%, glucan 15%, melanin 9%. The maximal Fiber length was 7 mm.
Dieses Material wurde anschließend im Mikrodismembrator (Fa. Braun, Melsungen, Deutschland) bei 4°C für 15 min mechanisch zerkleinert. Die Teilchengröße des erhaltenen Präparates betrug 2 bis 3 µm. This material was then in the microdismembrator (Braun, Melsungen, Germany) mechanically crushed at 4 ° C for 15 min. The The particle size of the preparation obtained was 2 to 3 μm.
Das neue Verfahren unterscheidet sich überdies von dem Verfahren nach dem Stand der Technik grundsätzlich dadurch, daß die Ausgangspräparate "NEO-IMMUN", "NEO-IMMUN-M" oder "NEO-IMMUN-F" zwecks Erhöhung der biologischen Wirkung mit anderen Materialien versetzt und weiter prozessiert werden. Überraschenderweise werden dadurch die Präparate wasserlöslicher bzw. quellfähiger, wodurch offenbar die effektiven Bestandteile besser verfügbar gemacht werden. The new process also differs from the process the state of the art basically in that the starting preparations "NEO-IMMUN", "NEO-IMMUN-M" or "NEO-IMMUN-F" for the purpose of increasing the biological effects mixed with other materials and further be processed. Surprisingly, this makes the preparations more water-soluble or swellable, which obviously makes the effective Components are made more available.
Die Eigenschaften der Präparate werden einerseits dadurch deutlich verbessert, daß die beiden Hauptbestandteile, nämlich Chitin und die unlösliche Fraktion der Glucane, vorwiegend chemisch, z. T. auch enzymatisch modifiziert werden. Hierbei wird durch die Einführung polarer Gruppen eine bessere Wasserlöslichkeit vermittelt. Die Modifikationen erhöhen aber auch teilweise die Bindungskapazität für die hinzugesetzten potenzierenden Substanzen. The properties of the preparations become clear on the one hand improves that the two main components, namely chitin and the insoluble fraction of glucans, mainly chemical, e.g. T. also be modified enzymatically. Here, the introduction becomes more polar Groups imparted better water solubility. The modifications but also partially increase the binding capacity for the added potentiating substances.
Insbesondere durch den Zusatz von speziellen, in der Kombination mit den Ausgangspräparaten "NEO-IMMUN", "NEO-IMMUN-M" oder "NEO-IMMUN- F" potenzierend wirkenden Substanzen wird jedoch die Wirkung der Grundmasse entscheidend verstärkt und auch dessen Wirkspektrum erweitert. Darüber hinaus verändern diese Zusätze die physikochemischen Eigenschaften, insbesondere die Löslichkeit und das Quellvermögen der Präparate, was wiederum eine deutliche verbesserte Verfügbarkeit der wirksamen Bestandteile vermittelt. Zu diesen sich als potenzierend herausgestellten Substanzen gehören anorganische Polyphosphate einschließlich Metaphosphate (Kettenlängen n ≥ 2), wasserlösliche Silikate (Kieselsäure, Polykieselsäure, Metakieselsäure, Polysilikat; Kettenlängen n ≥ 2), polare Polysaccharide (Kettenlängen n ≥ 2) und polare Lipide. Especially through the addition of special, in combination with the Initial preparations "NEO-IMMUN", "NEO-IMMUN-M" or "NEO-IMMUN- F "potentiating substances, however, the effect of The base mass is decisively strengthened and also its range of action extended. In addition, these additives change the physicochemical Properties, especially the solubility and swelling capacity of the Preparations, which in turn significantly improved availability of the effective ingredients conveyed. To these turn out to be potentiating exposed substances include inorganic polyphosphates including metaphosphates (chain lengths n ≥ 2), water-soluble silicates (Silicic acid, polysilicic acid, metasilicic acid, polysilicate; chain lengths n ≥ 2), polar polysaccharides (chain lengths n ≥ 2) and polar lipids.
40 g "NEO-IMMUN", "NEO-IMMUN-M" oder "NEO-IMMUN-F" werden mit einer 20-30%igen NaOH-Lösung für 3 Stunden bei 100-120°C inkubiert. Die Reaktion wird unter einer Stickstoffatmosphäre durchgeführt, um eine übermäßige Hydrolyse der hochmolekularen Chitinketten zu vermeiden. Anschließend wird die Lösung neutralisiert, mit Wasser gewaschen bei 40-50°C getrocknet. Bei den so behandelten chitinhaltigem Material liegen 30-50% der Aminogruppen deacyliert vor, was durch metachromatische Titration (Gummow und Roberts (1985) Makromolekulare Chemie, Seite 186 und 1239) oder mittels IR-Spektroskopie (Miya et al. (1980) Int. J. Biol. Macromol. 2, 323) bestimmt wird. Die Reaktion kann alternativ enzymatisch durch die Chitindeacetylase durchgeführt werden. 40 g of "NEO-IMMUN", "NEO-IMMUN-M" or "NEO-IMMUN-F" are included a 20-30% NaOH solution incubated for 3 hours at 100-120 ° C. The reaction is carried out under a nitrogen atmosphere to a to avoid excessive hydrolysis of the high molecular chitin chains. The solution is then neutralized, washed with water 40-50 ° C dried. The chitin-containing material treated in this way 30-50% of the amino groups are pre-deacylated by metachromatic titration (Gummow and Roberts (1985) Macromolecular Chemistry, page 186 and 1239) or by means of IR spectroscopy (Miya et al. (1980) Int. J. Biol. Macromol. 2, 323) is determined. Alternatively, the reaction can be carried out enzymatically Chitin deacetylase can be performed.
Sulfatierungen können prinzipiell auf zwei verschiede Arten erfolgen: N- Sulfatierungen und O-Sulfatierungen. Bei den deacetylierten Chitinteilen hat sich die stereospezifische N-Sulfatierung als günstiger erwiesen. Sie erfolgt mit Schwefeltrioxid und Pyridin nach der Methode von Whistler und Kosic (Arch. Biochem. Biophys. 14, 106 (1971)). Nach der Reaktion wird die Probe neutralisiert und dialysiert, anschließend mit Ethanol gewaschen und bei 40°C getrocknet. In principle, sulfations can be carried out in two different ways: Sulphations and O-sulphations. With the deacetylated chitin parts the stereospecific N-sulfation proved to be more favorable. It is done with sulfur trioxide and pyridine using the Whistler and Kosic method (Arch. Biochem. Biophys. 14, 106 (1971)). After the reaction, the sample neutralized and dialyzed, then washed with ethanol and 40 ° C dried.
Die O-Sulfatierungen werden mit Chlorsulfonsäure und Pyridin nach der Methode von Horton und Just (Carbohydr. Res 29, 173-179 (1973)) durchgeführt. Bei dieser Reaktion werden verschiedene OH-Gruppen sowohl im Chitin als auch bei den Glucan-Anteilen sulfatiert. The O-sulfations are carried out with chlorosulfonic acid and pyridine after Horton and Just Method (Carbohydr. Res 29, 173-179 (1973)) carried out. In this reaction, different OH groups are both sulfated in the chitin as well as in the glucan fractions.
Sowohl bei den N-Sulfatierungen als auch bei den O-Sulfatierungen haben sich moderate Sulfatierungsgrade als günstig erwiesen. Die Reaktion wird deshalb nur in beschränktem Maße durchgeführt, so daß bei der N- Sulfatierungen max. 30% der Aminogruppen und bei der O-Sulfatierungen max. 10-20% der freien Hydroxylgruppen sulfatiert vorliegen. Both in the N-sulfation and in the O-sulfation moderate degrees of sulfation proved to be favorable. The reaction is therefore only carried out to a limited extent, so that the N- Sulphation max. 30% of the amino groups and in the O-sulfation Max. 10-20% of the free hydroxyl groups are sulfated.
Der Grad der Sulfatierungen kann mittels Elemantaranalyse bestimmt werden. The degree of sulfation can be determined using elemental analysis become.
Als weitere Modifikationen können die Chitinanteile in ein Xanthogenat überführt oder mit polaren Aminosäuren oder Oligopeptiden kovalent verknüpft werden. As further modifications, the chitin components can be converted into a xanthate transferred or covalent with polar amino acids or oligopeptides be linked.
Anorganische Polyphosphate entstehen durch Kondensation von Orthophosphat. Die Alkalisalze sind gut wasserlöslich, haben eine hohe Wasserbindungskapazität, sind in der Lage mit verschiedenen Makromolekülen Komplexe zu bilden und besitzen antibakterielle und antivirale Aktivität (DE P 43 20 597.6. "Verwendung von Polyphosphaten zur antiviralen Therapie und als Immunmodulatoren". Deutsches Patentamt 1993. Erfinder und Anmelder: H. C. Schröder, I. S. Kulaev and W. E. G. Müller). Für ihre Konzentrationsbestimmung existieren analytische Verfahren (z. B.: DE 197 03 025. "Verfahren zur Messung von Konzentrationen sowie zur kontinuierlichen oder diskontinuierlichen Messung des Umsatzes und der Geschwindigkeit enzymatischer oder nichtenzymatischer Reaktionen von Pyrophosphaten und/oder linearen Polyphosphaten unter Ausschluß von zyklischen Polyphosphaten als auch von Orthophosphaten in einer Probe sowie Anwendung des Verfahrens". Deutsches Patentamt 1997. Erfinder und Anmelder: B. Lorenz, W. E. G. Müller and H. C. Schröder). Ein Einfluß von Polyphosphaten auf die Wurfgröße, die Neugeborenen-Sterblichkeit und die Vitalität/mittlere Lebenserwartung von Nutztieren sowie eine immunmodulierende Wirkung dieser Polymere ist nach dem Stand der Technik nicht bekannt. Inorganic polyphosphates are formed by the condensation of Orthophosphate. The alkali salts are readily water-soluble and have a high level Water binding capacity, are capable of using different Macromolecules to form and possess antibacterial and complexes antiviral activity (DE P 43 20 597.6. "Use of polyphosphates for antiviral therapy and as immunomodulators ". German Patent Office 1993. Inventor and applicant: H. C. Schröder, I. S. Kulaev and W. E. G. Müller). For their concentration determination exist analytical methods (e.g .: DE 197 03 025. "Methods for measuring concentrations and for continuous or discontinuous measurement of sales and Speed of enzymatic or non-enzymatic reactions of Pyrophosphates and / or linear polyphosphates to the exclusion of cyclic polyphosphates as well as orthophosphates in one sample and application of the method ". German Patent Office 1997. Inventor and Applicants: B. Lorenz, W. E. G. Müller and H. C. Schröder). An influence of Polyphosphates on litter size, newborn mortality and Vitality / mean life expectancy of farm animals as well as a immunomodulating effect of these polymers is according to the state of the art Technology not known.
40 g "NEO-IMMUN", "NEO-IMMUN-M" oder "NEO-IMMUN-F" werden nach partieller Deacetylierung (siehe oben) in 1 Liter einer 3%igen Citronensäure- Lösung resuspendiert. Danach wird 1 Liter einer 1%igen Polyphosphatlösung (Phosphate Glass, "water soluble", durchschnittliche Kettenlänge: 15 Phosphatreste, Fa. Sigma, Kat.-Nr. P8510) unter moderatem Rühren langsam dazugetropft (ca. 8-10 Stunden). Anschließend wird die Suspension für weitere 3 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die unlösliche fasrige Fraktion wird abgefiltert, mit absolutem Äthanol gewaschen und für 6-8 Stunden bei 40°C getrocknet. 40 g "NEO-IMMUN", "NEO-IMMUN-M" or "NEO-IMMUN-F" become after partial deacetylation (see above) in 1 liter of a 3% citric acid Resuspended solution. Then 1 liter of a 1% polyphosphate solution (Phosphate Glass, "water soluble", average chain length: 15 Phosphate residues, Sigma, cat.-no. P8510) with moderate stirring slowly added dropwise (approx. 8-10 hours). Then the Incubated suspension for a further 3 hours at room temperature. The insoluble fibrous fraction is filtered off, washed with absolute ethanol and dried for 6-8 hours at 40 ° C.
Als Zusatz sind wasserlösliche Polyphosphate mit einer Kettenlänge zwischen 4 und 1000 Phosphatresten geeignet. Bei kurz- und mittelkettigen Polyphosphaten kann die Bindungskapazität der fibrillären chitinhaltigen Grundmasse durch vorherige partielle Deacetylierung deutlich erhöht werden. Langkettige Polyphosphate (Kettenlänge > 200 Phosphatreste) binden hingegen auch bei nichtmodifizierten "NEO-IMMUN"-Präparaten effektiv. Water-soluble polyphosphates with a chain length are added suitable between 4 and 1000 phosphate residues. With short and medium chain Polyphosphates can increase the binding capacity of fibrillar chitin-containing Base mass significantly increased by previous partial deacetylation become. Long chain polyphosphates (chain length> 200 phosphate residues) bind however also with unmodified "NEO-IMMUN" preparations effectively.
10 g "NEO-IMMUN", "NEO-IMMUN-M" oder "NEO-IMMUN-F" werden nach partieller Deacetylierung in 1 Liter einer 5%igen Äpfelsäure-Lösung resuspendiert. Danach werden 0,2 Liter einer 5%igen Trimetaphosphat- Lösung (Trisodiumtrimetaphosphate, Fa. Sigma, Kat.-Nr. T5508) unter moderatem Rühren langsam dazugetropft (ca. 8-10 Stunden). Die Suspension wird für weitere 3 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die unlösliche fasrige Fraktion wird abgefiltert, mit absolutem Äthanol gewaschen und für 6-8 Stunden bei 50°C getrocknet. 10 g of "NEO-IMMUN", "NEO-IMMUN-M" or "NEO-IMMUN-F" become after partial deacetylation in 1 liter of a 5% malic acid solution resuspended. Then 0.2 liters of a 5% trimetaphosphate Solution (Trisodiumtrimetaphosphate, Sigma, Cat.No. T5508) under Moderate stirring slowly added (about 8-10 hours). The Suspension is incubated for a further 3 hours at room temperature. The insoluble fibrous fraction is filtered off, washed with absolute ethanol and dried for 6-8 hours at 50 ° C.
Kieselsäuren und Silikate entstehen durch Kondensation von Orthokieselsäure. Zunächst wird die Orthodikieselsäure gebildet. Die weitere Kondensation führt über Polykieselsäuren zu Metakieselsäuren. Polykieselsäuren besitzen einen amorphen (ungeordneten) Aufbau und bilden eine gelartige Lösung mit einem hohen Wasserbindungsvermögen. Silicas and silicates are formed by the condensation of Ortho silicic acid. First, the orthodiesilicic acid is formed. The further one Condensation leads to metasilicic acids via polysilicic acids. Polysilicic acids have an amorphous (disordered) structure and form a gel-like solution with a high water-binding capacity.
20 g "NEO-IMMUN", "NEO-IMMUN-M" oder "NEO-IMMUN-F" werden nach partieller Deacetylierung in 1 Liter einer 2%igen Essigsäure-Lösung resuspendiert. Danach werden 0,2 Liter einer 10%igen Wasserglas-Lösung (Natronwasserglas, Fa. Merck, Kat.-Nr. 105621) unter moderatem Rühren langsam dazugetropft (ca. 8-10 Stunden). Die Suspension wird für weitere 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die unlösliche fasrige Fraktion wird abgefiltert, mit absolutem Äthanol gewaschen und für 6-8 Stunden bei 40°C getrocknet. 20 g of "NEO-IMMUN", "NEO-IMMUN-M" or "NEO-IMMUN-F" become after partial deacetylation in 1 liter of a 2% acetic acid solution resuspended. Then 0.2 liters of a 10% water glass solution (Soda water glass, Merck, Cat. No. 105621) with moderate stirring slowly added dropwise (approx. 8-10 hours). The suspension is used for a further 2 Incubated for hours at room temperature. The insoluble fibrous fraction will filtered off, washed with absolute ethanol and for 6-8 hours at 40 ° C dried.
Polysaccharide stellen eine vielfältige Stoffklasse dar, die sowohl wasserlösliche als auch unlösliche sowie polare oder unpolare Verbindungen umfaßt. Zur Komplexierung mit "NEO-IMMUN", "NEO-IMMUN-M" oder "NEO- IMMUN-F" kommen bevorzugt polare Polysaccharide zum Einsatz. Polysaccharides represent a diverse class of substances that both water-soluble as well as insoluble and polar or non-polar compounds includes. For complexation with "NEO-IMMUN", "NEO-IMMUN-M" or "NEO- IMMUN-F "polar polysaccharides are preferably used.
Hierzu wird wasserlösliches Ausgangsmaterial (Natrium-, Kalium- oder Ammoniumalginat) eingesetzt (z. B. Natrium-Salz: Fa. Sigma, Kat.-Nr. A2158, oder andere kommerziell erhältliche Handelsprodukte wie z. B. Manucol® oder Kelgin®) und bei Temperaturen unter 70°C zu einem etwa 5-10%igen Gel verarbeitet. 20 g "NEO-IMMUN", "NEO-IMMUN-M" oder "NEO-IMMUN-F" werden in 1 Liter Wasser resuspendiert und anschließend die Alginat-Gele hinzugesetzt. Die Suspension wird für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die unlösliche fasrige Fraktion wird abgefiltert und danach 2-mal mit Wasser gewaschen. Dadurch entsteht ein Gel/Suspensions-Präparat "NEO-IMMUN-Alginat", das typischerweise 5-10% Alginat oder Alginat-Lysat und 95-90% "NEO-IMMUN", "NEO-IMMUN-M" oder "NEO-IMMUN-F" enthält. For this, water-soluble starting material (sodium, potassium or Ammonium alginate) (e.g. sodium salt: Sigma, Cat.No. A2158, or other commercially available commercial products such. B. Manucol® or Kelgin®) and about 5-10% at temperatures below 70 ° C Gel processed. 20 g "NEO-IMMUN", "NEO-IMMUN-M" or "NEO-IMMUN-F" are resuspended in 1 liter of water and then the alginate gels added. The suspension is left for 2 hours at room temperature incubated. The insoluble fibrous fraction is filtered off and then twice washed with water. This creates a gel / suspension preparation "NEO-IMMUN alginate", which is typically 5-10% alginate or alginate lysate and 95-90% "NEO-IMMUN", "NEO-IMMUN-M" or "NEO-IMMUN-F" contains.
Kommerziell erhältliche Kartoffelstärke (Fa. Sigma, Kat.-Nr. S4251) wird als 2-25%ige wäßrige Suspension hergestellt. Als Quelltemperatur wird 50-65°C gewählt. Das entstehende visköse Material wird mit "NEO-IMMUN", "NEO- IMMUN-M" oder "NEO-IMMUN-F" gemischt. Das erhaltene Präparat "NEO- IMMUN-Stärke" enthält typischerweise 2-15% Stärke und 98-85% "NEO- IMMUN", "NEO-IMMUN-M" oder "NEO-IMMUN-F". Commercially available potato starch (Sigma, cat. No. S4251) is called 2-25% aqueous suspension prepared. The source temperature is 50-65 ° C selected. The resulting viscous material is "NEO-IMMUN", "NEO- IMMUN-M "or" NEO-IMMUN-F "mixed. The preparation" NEO- IMMUN starch "typically contains 2-15% starch and 98-85%" NEO- IMMUN "," NEO-IMMUN-M "or" NEO-IMMUN-F ".
Lipide werden als biopharmazeutische Komponente zur Applikation von wasserunlöslichen Materialien genutzt. Lipids are used as a biopharmaceutical component for the application of water-insoluble materials.
Glycerol-Triarachidonin (Fa. Sigma, Kat.-Nr. T6257) wird gewöhnlich bei einer Temperatur von etwa 50°C geschmolzen und in einem Wirbelschichtsprüher mit "NEO-IMMUN", "NEO-IMMUN-M" oder "NEO- IMMUN-F" zusammengebracht. Dadurch entsteht nach Austrocknen ein Material in Kleinverkapselung ("NEO-IMMUN-Arachidat"). "NEO-IMMUN- Arachidat" enthält typischerweise 5-15% Glycerol-Triarachidat und 95-85% "NEO-IMMUN", "NEO-IMMUN-M" oder "NEO-IMMUN-F". Glycerol triarachidonine (Sigma, cat. No. T6257) is usually used in melted at a temperature of about 50 ° C and in one Fluid bed sprayer with "NEO-IMMUN", "NEO-IMMUN-M" or "NEO- IMMUN-F "brought together. This creates after drying out Material in small encapsulation ("NEO-IMMUN-Arachidat"). "NEO-IMMUNOGLOBULIN Arachidat "typically contains 5-15% glycerol triarachidate and 95-85% "NEO-IMMUN", "NEO-IMMUN-M" or "NEO-IMMUN-F".
Der Einsatz von Chitin- und Chitinderivaten für eine Reihe technischer und medizinischer Anwendungen ist bereits beschrieben worden. Wie oben erwähnt hängen die Eigenschaften und die biologischen Wirkungen hauptsächlich von deren Modifizierungen und anderen Wirkkomponenten ab. Im Rahmen des beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahrens sind solche neuartigen Präparate hergestellt worden, die sich durch eine vollkommen neuartige biologische Wirkung auszeichnen. Zu diesen unerwarteten Wirkungen gehören insbesondere der im Tierexperiment gefundene Einfluß auf die Wurfgröße, die Herabsetzung der Säuglingssterblichkeit und die Erhöhung der mittleren Lebensspanne. Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten neuartigen Präparate sind weiterhin nicht nur potente Immunstimulanzien, sondern stabilisieren und fördern auch die Vitalität und den allgemeinen Gesundheitsstatus. Diese Wirkungen konnten durch den Zusatz der in Absatz 1.3.1 und 1.3.2 beschriebenen Modifikationen und Zusätze von potenzierenden Substanzen erreicht werden. Die Wirkungen und die sich aus dieser Erfindung ergebenen neuartigen Anwendungen werden im nachfolgenden beispielhaft dargestellt. The use of chitin and chitin derivatives for a number of technical and medical applications have already been described. As above mentioned properties and biological effects depend mainly on their modifications and other active components. In the context of the described method according to the invention, such are novel preparations have been manufactured, which are characterized by a perfect distinguish novel biological effects. To these unexpected Effects include in particular the influence found in animal experiments on the litter size, the reduction in infant mortality and the Increase in the average lifespan. The according to the invention Novel preparations produced by processes are still not only potent Immunostimulants, but also stabilize and promote vitality and the general health status. These effects could be achieved through the Add the modifications described in paragraphs 1.3.1 and 1.3.2 and Additions of potentiating substances can be achieved. The effects and the novel applications resulting from this invention are shown below as examples.
Einfluß von "NEO-IMMUN-M" und seiner Komplexe auf die Zytokin/Chemokin-Produktion: Hier ist als Beispiel der Effekt auf die Interferon-γ-Produktion ausgeführt. Interferon-γ (IFN-γ) stellt ein bekanntes Zytokin dar, das tierischen Zellen einen Schutz gegen Virus-Infektion verleiht und eine zytostatische und immunsuppressive Wirkungskomponente besitzt. Influence of "NEO-IMMUN-M" and its complexes on the Cytokine / Chemokine Production: Here is an example of the effect on Interferon γ production carried out. Interferon-γ (IFN-γ) represents a well-known Cytokine, which gives animal cells protection against virus infection and has a cytostatic and immunosuppressive component.
Die verwendete Versuchsanordnung, wie bereits publiziert (Voth et al. (1988) Induction of γ-interferon by Avarol in human peripheral blood lymphocytes. Jap. J. Cancer Res. (Gann) 79, 647-655), soll kurz zusammengefaßt werden. The experimental setup used, as already published (Voth et al. (1988) Induction of γ-interferon by Avarol in human peripheral blood lymphocytes. Jap. J. Cancer Res. (Gann) 79, 647-655), is to be briefly summarized.
Menschliche "buffy coat cells" (periphere Blutlymphozyten) werden mittels Ficoll-Hypaque-Dichtegradienten-Zentrifugation isoliert. Nach Waschen in RPMI 1640-Medium wird eine Suspension von 5 × 106 Zellen/ml eingestellt, die 10% fötales Kälberserum und 1% Glutamin enthält. Kulturen von 1 ml werden bei 37°C in einem Inkubator in 5% CO2/95% Luft kultiviert. Nach der anschließenden Inkubation der Zellen mit "NEO-IMMUN-M" oder seiner Komplexe (0-3 Tage) wird der Überstand gewonnen und auf IFN-γ-Gehalt hin untersucht. Human "buffy coat cells" (peripheral blood lymphocytes) are isolated by means of Ficoll-Hypaque density gradient centrifugation. After washing in RPMI 1640 medium, a suspension of 5 × 10 6 cells / ml is set, which contains 10% fetal calf serum and 1% glutamine. Cultures of 1 ml are cultured at 37 ° C in an incubator in 5% CO 2 /95% air. After the subsequent incubation of the cells with "NEO-IMMUN-M" or its complexes (0-3 days), the supernatant is obtained and examined for IFN-γ content.
Zur Quantifizierung wird ein Enzym-basierender Immungssay angewandt. 96- Well-Flachboden Platten werden mit humanem anti-IFN-γ (Fa. Hoffmann-La Roche; Basel) gecoated. Zellkultur-Überstände (50 µl) werden in die Wells gegeben und anschließend 50 µl humanes anti-IFN-γ, das mit Peroxidasegekoppelt ist (Fa. Hoffmann-La Roche; Basel), zugesetzt. Nach weiteren 24 Stunden werden die Ansätze gewaschen (PBS mit 0,5% Tween 20; PBS = "phosphate-buffered sahne": 0,02 M Phosphat-Puffer mit 0,15 M Natriumchlorid, pH 7,4). Letztlich wird Peroxidase-Substrat dazugegeben und die Extinktion bei einer Wellenlänge von 492 nm gemessen. Nach Aufstellung einer Eichkurve mit einem IFN-γ-Standard wird die Menge an IFN-γ im Medium quantifiziert. Die Konzentration an IFN-γ wird in Units/ml angegeben. An enzyme-based immunoassay is used for quantification. 96- Well-flat-bottom plates are coated with human anti-IFN-γ (Hoffmann-La Roche; Basel) coated. Cell culture supernatants (50 µl) are placed in the wells given and then 50 ul human anti-IFN-γ, which with Peroxidase coupled (Hoffmann-La Roche; Basel) added. After another 24 The batches are washed for hours (PBS with 0.5% Tween 20; PBS = "phosphate-buffered cream": 0.02 M phosphate buffer with 0.15 M Sodium chloride, pH 7.4). Ultimately, peroxidase substrate is added and the absorbance was measured at a wavelength of 492 nm. To Setting up a calibration curve with an IFN-γ standard will increase the amount of IFN-γ quantified in the medium. The concentration of IFN-γ is in units / ml specified.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt und lassen sich wie folgt
zusammenfassen:
- 1. "NEO-IMMUN-M" induziert dosisabhängig die Produktion von IFN-γ in peripheren Blutlymphozyten. Ein Plateau wird etwa nach einer Inkubation von 3 Tagen und einer Dosis von 1 µg/ml erreicht.
- 2. Die "NEO-IMMUN-M"-Komplexe zeigen eine erhöhte IFN-γ- Induktionskapazität im Vergleich zu "NEO-IMMUN-M" selbst. Die Differenz zwischen den Effekten von "NEO-IMMUN-M" und "NEO- IMMUN-M"-Komplex ist signifikant (P < 0.001; berechnet nach: Sachs (1984) Angewandte Statistik. Springer, Berlin). Die optimale Konzentration liegt bei den hier zusammengestellten Ergebnissen bei einer Dosis von 1 µg/ml und einer Inkubationsdauer von 3 Tagen.
- 3. Die "NEO-IMMUN-M"-Komplexe zeigen aufsteigend (Verstärkung der immunmodulierenden Eigenschaft von "NEO-IMMUN-M") folgende Skala: "NEO-IMMUN-M-Arachidat" ⇐ "NEO-IMMUN-M-Polyphosphat" ⇐ "NEO- IMMUN-M-Alginat". Die hier nicht aufgeführten Daten für den "NEO- IMMUN-M-Stärke"-Komplex und den "NEO-IMMUN-M-Silikat"-Komplex liegen zwischen "NEO-IMMUN-M" und "NEO-IMMUN-M-Arachidat".
- 1. "NEO-IMMUN-M" induces the production of IFN-γ in peripheral blood lymphocytes in a dose-dependent manner. A plateau is reached after an incubation of 3 days and a dose of 1 µg / ml.
- 2. The "NEO-IMMUN-M" complexes show an increased IFN-γ induction capacity compared to "NEO-IMMUN-M" itself. The difference between the effects of "NEO-IMMUN-M" and "NEO-IMMUN -M "complex is significant (P <0.001; calculated according to: Sachs (1984) Applied Statistics. Springer, Berlin). In the results summarized here, the optimal concentration is at a dose of 1 µg / ml and an incubation period of 3 days.
- 3. The "NEO-IMMUN-M" complexes show the following scale in ascending order (enhancement of the immunomodulating property of "NEO-IMMUN-M"): "NEO-IMMUN-M arachidate" ⇐ "NEO-IMMUN-M polyphosphate" ⇐ "NEO-IMMUN-M alginate". The data not listed here for the "NEO-IMMUN-M starch" complex and the "NEO-IMMUN-M-silicate" complex lie between "NEO-IMMUN-M" and "NEO-IMMUN-M arachidate" ,
Der Einfluß von "NEO-IMMUN-M" und der "NEO-IMMUN-M"-Komplexe (Polyphosphat, Alginat oder Arachidat) auf die Aktivierung von natürlichen Killerzellen wurde untersucht. Natürliche Killerzellen stellen eine heterogene Population mononukleärer Zellen dar, die ein spontanes oder erworbenes zytotoxisches Potential besitzen. Ihre Aktivität läßt sich z. B. durch Gabe von Tumor-Nekrosis-Faktor verstärken. The influence of "NEO-IMMUN-M" and the "NEO-IMMUN-M" complexes (Polyphosphate, alginate or arachidate) on the activation of natural Killer cells have been examined. Natural killer cells represent a heterogeneous one Population of mononuclear cells that are spontaneous or acquired have cytotoxic potential. Your activity can be z. B. by giving Increase tumor necrosis factor.
Der Versuch wurde nach entsprechender Anordnung, wie früher publiziert (Voth et al. (1988) In vivo and in vitro induction of natural killer cells by cloned human tumor necrosis factor. Cancer Immunol. Immunther. 27, 128-132), durchgeführt. The experiment was arranged according to the corresponding arrangement, as previously published (Voth et al. (1988) In vivo and in vitro induction of natural killer cells by cloned human tumor necrosis factor. Cancer Immunol. Immunther. 27, 128-132), carried out.
Menschliche "buffy coat cells" (periphere Blutlymphozyten) werden mittels Ficoll-Hypaque-Dichtegradienten-Zentrifugation isoliert. Nach Waschen in RPMI 1640-Medium wird eine Suspension von 5 × 106 Zellen/ml eingestellt, die 20% fötales Kälberserum und 1% Glutamin enthält. Kulturen von 1 ml werden bei 37°C in einem Inkubator 5% CO2/95% Luft kultiviert. Nach der Inkubation mit "NEO-IMMUN-M" oder der "NEO-IMMUN-M"-Komplexe (12 Stunden; 37°C) wird der Überstand gewonnen und auf "Killing-Aktivität" mit K 562-Zellen als Target hin untersucht. Die K 562-Zellen wurden in RPMI 1640- Medium mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum propagiert. Human "buffy coat cells" (peripheral blood lymphocytes) are isolated by means of Ficoll-Hypaque density gradient centrifugation. After washing in RPMI 1640 medium, a suspension of 5 × 10 6 cells / ml is set, which contains 20% fetal calf serum and 1% glutamine. Cultures of 1 ml are cultivated at 37 ° C in an incubator 5% CO 2 /95% air. After incubation with "NEO-IMMUN-M" or the "NEO-IMMUN-M" complexes (12 hours; 37 ° C.), the supernatant is obtained and examined for "killing activity" with K 562 cells as a target , The K 562 cells were propagated in RPMI 1640 medium with 10% heat inactivated fetal calf serum.
Die Target-Zellen werden mit Na2 51CrO4 (spezifische Aktivität von 50 mCi/mg Cr) für 1 Stunde bei 37°C unter bekannten Bedingungen beladen. Effektor- und Target-Zellen werden in geeignetem Verhältnis gemischt und für 1 Stunde bei 37°C weiter inkubiert. Die spontane 51Cr-Freisetzung sowie die totale Cr-Freisetzung (Triton X-100-Lyse) wird separat bestimmt. Nach Zellernte wird die Radioaktivität im Überstand in einem Gamma-Zähler gemessen. Dabei wird folgende Formel eingesetzt: Spezifische Lyse (%) = [(Test-Freisetzung) - (Kontrolle)].[(Gesamt-Freisetzung) - (Kontrolle)]-1. Alle Tests werden in 6 Parallelassays durchgeführt und die Mittelwerte (± Standardabweichung) bestimmt. Die Standardabweichung in allen Ansätzen war < 10% The target cells are loaded with Na 2 51 CrO 4 (specific activity of 50 mCi / mg Cr) for 1 hour at 37 ° C. under known conditions. Effector and target cells are mixed in a suitable ratio and further incubated at 37 ° C. for 1 hour. The spontaneous 51 Cr release and the total Cr release (Triton X-100 lysis) are determined separately. After cell harvesting, the radioactivity in the supernatant is measured in a gamma counter. The following formula is used: Specific lysis (%) = [(test release) - (control)]. [(Total release) - (control)] -1 . All tests are carried out in 6 parallel assays and the mean values (± standard deviation) are determined. The standard deviation in all approaches was <10%
Die in Tabelle 2 dargestellten Ergebnisse lassen sich wie folgt
zusammenfassen:
- 1. "NEO-IMMUN-M" aktiviert dosisabhängig die Funktion der Killer-Zellen. Eine Produktion von IFN-γ in peripheren Blutlymphozyten wird aktiviert.
- 2. Die "NEO-IMMUN-M"-Komplexe zeigen im Vergleich zu "NEO-IMMUN-M" eine höhere IFN-γ-Induktionskapazität. Der Unterschied zwischen den mit "NEO-IMMUN-M" und den "NEO-IMMUN-M"-Komplex erzielten Effekten ist signifikant (P < 0.001). Die optimale Konzentration bei den hier zusammengestellten Ergebnissen liegt bei einer Dosis von etwa 1 µg/ml bei der gewählten Inkubationsdauer von 12 Stunden.
- 3. Die "NEO-IMMUN-M"-Komplexe zeigen aufsteigend (Verstärkung der immunmodulierenden Eigenschaft von "NEO-IMMUN-M") folgende Skala: "NEO-IMMUN-M-Arachidat" ⇐ "NEO-IMMUN-M-Polyphosphat" ⇐ "NEO- IMMUN-M-Alginat". Die hier nicht aufgeführten Daten für den "NEO- IMMUN-M-Stärke"-Komplex und den "NEO-IMMUN-M-Silikat"-Komplex lagen erneut im Bereich zwischen "NEO-IMMUN-M" und "NEO-IMMUN-M- Arachidat".
- 1. "NEO-IMMUN-M" activates the function of the killer cells depending on the dose. Production of IFN-γ in peripheral blood lymphocytes is activated.
- 2. The "NEO-IMMUN-M" complexes show a higher IFN-γ induction capacity compared to "NEO-IMMUN-M". The difference between the effects achieved with "NEO-IMMUN-M" and the "NEO-IMMUN-M" complex is significant (P <0.001). The optimal concentration in the results compiled here is at a dose of approximately 1 µg / ml for the chosen incubation period of 12 hours.
- 3. The "NEO-IMMUN-M" complexes show the following scale in ascending order (enhancement of the immunomodulating property of "NEO-IMMUN-M"): "NEO-IMMUN-M arachidate" ⇐ "NEO-IMMUN-M polyphosphate" ⇐ "NEO-IMMUN-M alginate". The data not listed here for the "NEO-IMMUN-M starch" complex and the "NEO-IMMUN-M-silicate" complex were again in the range between "NEO-IMMUN-M" and "NEO-IMMUN-M - Arachidat ".
Der Einfluß von "NEO-IMMUN-M" und der "NEO-IMMUN-M"-Komplexe (Polyphosphat, Alginat oder Arachidat) auf die Aktivierung von natürlichen Killerzellen wurde in vivo an C3H/HeJ-Mäusen (Alter: 8-12 Wochen) untersucht. The influence of "NEO-IMMUN-M" and the "NEO-IMMUN-M" complexes (Polyphosphate, alginate or arachidate) on the activation of natural Killer cells were in vivo in C3H / HeJ mice (age: 8-12 weeks) examined.
C3H/HeJ-Mäuse wurden intraperitoneal mit einer definierten Dosis (5 mg/kg) an "NEO-IMMUN-M" oder "NEO-IMMUN-M"-Komplex behandelt (Injektionsvolumen: 0,2 ml). Nach einer Behandlung von 24 Stunden wurden die peritonealen Zellen gewonnen und anschließend mit PBS (Zusammensetzung siehe oben) gewaschen. Die Zellzahl wurde in einem Coulter-Counter bestimmt. In einem definierten Verhältnis von Effektor- zu Target-Zellen wurde die Killerzell-Aktivität bestimmt. Als Target-Zellen wurden YAC-1 Lymphoma-Zellen verwandt. YAC-1 Lymphoma-Zellen wurden in RPMI 1640-Medium mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum und 300 µg/ml Glutamin propagiert. Die Versuchsordnung ist publiziert (Voth et al. (1988) In vivo and in vitro induction of natural killer cells by cloned human tumor necrosis factor. Cancer Immunol. Immunther. 27, 128-132). C3H / HeJ mice were administered intraperitoneally with a defined dose (5 mg / kg) treated at "NEO-IMMUN-M" or "NEO-IMMUN-M" complex (Injection volume: 0.2 ml). After 24 hours of treatment the peritoneal cells were obtained and then with PBS (Composition see above) washed. The cell count was in one Coulter counter determined. In a defined ratio of effector to The target cells were determined the killer cell activity. As target cells YAC-1 lymphoma cells were used. YAC-1 lymphoma cells were found in RPMI 1640 medium with 10% heat inactivated fetal calf serum and 300 µg / ml glutamine propagated. The experimental regulations are published (Voth et al. (1988) In vivo and in vitro induction of natural killer cells by cloned human tumor necrosis factor. Cancer Immunol. Immunther. 27, 128-132).
Die Target-Zellen wurden mit Na2 51CrO4 beladen. Effektor- und Target-Zellen wurden in einem geeigneten Verhältnis gemischt, und die spezifische Lyse (in %) wurde wie oben beschrieben bestimmt. The target cells were loaded with Na 2 51 CrO 4 . Effector and target cells were mixed in an appropriate ratio and the specific lysis (in%) was determined as described above.
Die Ergebnisse lassen sich wie folgt zusammenfassen (Tabelle 3):
- 1. "NEO-IMMUN-M" aktiviert die Funktion der Killer-Zellen in vivo.
- 2. Die "NEO-IMMUN-M"-Komplexe zeigen eine höhere Killerzell-Aktivität im Vergleich zu "NEO-IMMUN-M". Der Unterschied zwischen den mit "NEO- IMMUN-M" und den "NEO-IMMUN-M"-Komplex erzielten Effekten ist signifikant (P < 0.001).
- 3. Die "NEO-IMMUN-M"-Komplexe zeigen aufsteigend (Verstärkung der immunmodulierenden Eigenschaft von "NEO-IMMUN-M") ⇐ folgende Skala: "NEO-IMMUN-M-Arachidat" ⇐ "NEO-IMMUN-M-Polyphosphat" ⇐ "NEO- IMMUN-M-Alginat". Die hier nicht aufgeführten Daten für den "NEO- IMMUN-M-Stärke"-Komplex liegen zwischen "NEO-IMMUN-M" und "NEO- IMMUN-M-Arachidat" der "NEO-IMMUN M-Silikat"-Komplex zeigte noch eine geringere Aktivität als "NEO-IMMUN-M".
- 1. "NEO-IMMUN-M" activates the function of the killer cells in vivo.
- 2. The "NEO-IMMUN-M" complexes show a higher killer cell activity compared to "NEO-IMMUN-M". The difference between the effects achieved with "NEO-IMMUN-M" and the "NEO-IMMUN-M" complex is significant (P <0.001).
- 3. The "NEO-IMMUN-M" complexes show increasing (increasing the immunomodulating property of "NEO-IMMUN-M")-the following scale: "NEO-IMMUN-M arachidate" ⇐ "NEO-IMMUN-M polyphosphate "⇐" NEO-IMMUN-M alginate ". The data not listed here for the "NEO-IMMUN-M starch" complex lie between "NEO-IMMUN-M" and "NEO-IMMUN-M-Arachidat" the "NEO-IMMUN M-Silicate" complex still showed less activity than "NEO-IMMUN-M".
Für diese Versuchsreihe wurden Mäuse des Stammes Balb/c, und zwar
jeweils 24 geschlechtsreife Weibchen (ca. 3 Monate alt) pro
Behandlungsgruppe, verwendet. Die weiblichen Tiere (3 Tiere pro Käfig)
wurden eine Woche lang gehalten, bevor sie mit einem männlichen Tier
verpaart wurden. Die Paarungszeit dauerte eine Woche. Danach wurde das
männliche Tier entfernt. Die Tiere wurden mit dem normalen Futter versorgt.
Mit dem Beginn der Verpaarung bis zum Werfen wurde das Futter mit den
Zusätzen ergänzt. Es wurden vier Gruppen untersucht:
- 1. Kontrollgruppe: Futter plus Placebo
- 2. Gruppe A: Futter plus Polyphosphat, 2 mg/kg
- 3. Gruppe B: Futter plus "NEO-IMMUN", 20 mg/kg
- 4. Gruppe C: Futter plus "NEO-IMMUN-Polyphosphat", 20 mg/kg
- 1st control group: food plus placebo
- 2. Group A: feed plus polyphosphate, 2 mg / kg
- 3. Group B: feed plus "NEO-IMMUN", 20 mg / kg
- 4. Group C: feed plus "NEO-IMMUN polyphosphate", 20 mg / kg
Die Futtermenge pro Tier und Tag war wie folgt:
Das Futter wurden täglich mit den Nahrungszusätzen versehen und das Personal überwachte, daß alle Getreidekörner komplett verzehrt wurden. Die Menge der Zusätze betrug pro Maus und Tag 2 mg Polyphosphat/kg Körpergewicht bzw. 20 mg "NEO-IMMUN" oder "NEO-IMMUN- Polyphosphat"/kg Körpergewicht. Die Größe der Würfe der einzelnen Muttertiere wurde erfaßt. Die Tiere, die nicht geworfen hatten, wurden bei der Auswertung nicht berücksichtigt. The feed was provided daily with the food additives and that Personnel monitored that all of the grains were consumed completely. The The amount of additives per mouse and day was 2 mg polyphosphate / kg Body weight or 20 mg "NEO-IMMUN" or "NEO-IMMUN- Polyphosphate "/ kg body weight. The size of the litters of each Dams were recorded. The animals that had not thrown were taken to the Evaluation not taken into account.
In Tabelle 4 ist die durchschnittliche Wurfgröße der einzelnen Gruppen gegenübergestellt. Die durchschnittliche Wurfgröße der Kontrolle lag bei 6,7 ± 1,7 (Mittelwert ± Standardabweichung). Bei der Gruppe A (Futter/Nahrungszusatz "Polyphosphat") kann man gegenüber der Kontrolle keinen Unterschied erkennen (6,9 ± 1,4), wohingegen bei der Gruppe B (Futter/Nahrungszusatz "NEO-IMMUN") eine signifikante (P < 0,01) Erhöhung (8,1 ± 1,6) und bei der Gruppe C (Futter/Nahrungszusatz "NEO-IMMUN- Polyphosphat") eine drastische Erhöhung der Wurfgröße gegenüber der Kontrollgruppe zu erkennen war (9,2 ± 1,9; P < 0,001). Table 4 shows the average litter size of the individual groups compared. The average litter size of the control was 6.7 ± 1.7 (mean ± standard deviation). In group A (Food / food additive "polyphosphate") can be compared to the control see no difference (6.9 ± 1.4), whereas in group B (Feed / food additive "NEO-IMMUN") a significant (P <0.01) increase (8.1 ± 1.6) and in group C (food / food additive "NEO-IMMUN- Polyphosphate ") a drastic increase in litter size compared to Control group was recognizable (9.2 ± 1.9; P <0.001).
Für diese Versuchsreihe wurden Mäuse des Stammes CC57W/Mv, und zwar jeweils 36 geschlechtsreife Weibchen (ca. 3 Monate alt) pro Behandlungsgruppe, verwendet. Insgesamt wurden 3 Behandlungsgruppen gebildet (Gesamtzahl der weiblichen Tiere: 108). Die weiblichen Tiere (3 Tiere pro Käfig) wurden eine Woche lang gehalten, bevor sie im Verhältnis 3 : 1 verpaart wurden. Die Paarungszeit dauerte eine Woche. Danach wurden die männlichen Tiere entfernt. Nach der Geburt wurden jeweils 6 Muttertiere mit ihren Nachkommen in je einem Käfig gehalten. Die Tiere wurden mit normalem Futter versorgt (wie im Beispiel II). Sofort nach der Geburt wurde das Futter mit den Zusätzen verabreicht. Die Sterberate der Neugeborenen wurde über einen Zeitraum von 5 Wochen verfolgt. For this series of experiments, mice of the strain CC57W / Mv were used, namely 36 sexually mature females (approx. 3 months old) each Treatment group used. A total of 3 treatment groups formed (total number of female animals: 108). The female animals (3rd Animals per cage) were kept for a week before being in proportion 3: 1 were mated. The mating season lasted one week. After that the male animals removed. After birth, 6 dams were born kept in a cage with their offspring. The animals were with normal feed (as in Example II). Immediately after birth the feed is administered with the additives. The death rate of newborns was followed over a 5 week period.
Es wurden drei Gruppen untersucht:
- 1. Kontrollgruppe: Futter plus Placebo
- 2. Gruppe A: Futter plus "NEO-IMMUN", 20 mg/kg
- 3. Gruppe B: Futter plus "NEO-IMMUN-Polyphosphat", 20 mg/kg
- 1st control group: food plus placebo
- 2. Group A: feed plus "NEO-IMMUN", 20 mg / kg
- 3. Group B: feed plus "NEO-IMMUN polyphosphate", 20 mg / kg
In Tabelle 5 ist die Anzahl der Nachkommen und die Sterblichkeit in den ersten 5 Wochen nach der Geburt dargestellt. Bei der Gruppe A (Futter/Nahrungszusatz "NEO-IMMUN") liegt die Sterblichkeit unter der Kontrolle. Bei der Gruppe B (Futter/Nahrungszusatz "NEO-IMMUN- Polyphosphat") ist eine starke Abnahme in der Sterblichkeit zu erkennen. Die statistische Auswertung der Ergebnisse der 6 Untergruppen der jeweiligen Behandlungsgruppe zeigte eine hohe Signifikanz sowohl zwischen der Gruppe A und Kontrolle (P < 0,01) als auch zwischen der Gruppe B und der Kontrolle (P < 0,001). Table 5 shows the number of offspring and mortality in the shown for the first 5 weeks after birth. In group A (Feed / food additive "NEO-IMMUN") the mortality rate is below Control. In group B (feed / food additive "NEO-IMMUN- Polyphosphate ") shows a sharp decrease in mortality statistical evaluation of the results of the 6 subgroups of the respective Treatment group showed high significance between both the Group A and control (P <0.01) as well as between group B and the Control (P <0.001).
Für diese Versuche wurden 4 Monate alte Mäuse des Stammes Balb/c
verwendet. Die 3 untersuchten Gruppen bestanden zu 50% aus weiblichen
und zu 50% aus männlichen Tieren; sie wurden in jeweils 10 verschiedenen
nach Geschlechtern getrennten Untergruppen gehalten:
- 1. Kontrollgruppe: Futter plus Placebo
- 2. Gruppe A: Futter plus "NEO-IMMUN", 20 mg/kg
- 3. Gruppe B: Futter plus "NEO-IMMUN-Polyphosphat", 20 mg/kg
- 1st control group: food plus placebo
- 2. Group A: feed plus "NEO-IMMUN", 20 mg / kg
- 3. Group B: feed plus "NEO-IMMUN polyphosphate", 20 mg / kg
Die Tiere wurden mit normalem Futter (analog wie im Beispiel II gezeigt) mit den jeweiligen Futterzusätzen versorgt. Die Futter/Nahrungsergänzung erfolgte täglich über den ganzen Versuchszeitraum. Die Anzahl der lebenden Tiere wurde über einen Zeitraum von 21 Monaten aufgenommen. Es wurde jeweils die Lebensspanne ermittelt, bei der noch 50% der Population lebte. The animals were fed with normal feed (analogous to that shown in Example II) the respective feed additives. The feed / food supplement took place daily over the entire test period. The number of living Animals were ingested over a period of 21 months. It was each determined the life span at which 50% of the population still lived.
In Abb. 1 sind die Überlebenskurven für die drei Gruppen über diesen
Zeitraum dargestellt. Die mittlere Lebenspanne war bei der Gruppe B (Futter
plus "NEO-IMMUN-Polyphosphat") deutlich und signifikant länger als bei der
Kontrolle (Futter plus Placebo); der beobachtete Anstieg in der mittleren
Lebensspanne bei der Gruppe A (Futter plus "NEO-IMMUN" ohne
Polyphosphat) war im Vergleich zur Gruppe B geringer. Folgende Werte
wurden bestimmt:
Im nachfolgenden sind die erläuternden Legenden zu den auf den Seiten 26-31 abgebildeten Tabellen und der Abbildung aufgeführt: Below are the explanatory legends to those on the pages 26-31 shown tables and the figure:
Induktion von IFN-γ in peripheren Blutlymphozyten durch "NEO- IMMUN-M" und dessen Komplexe. Die Konzentrationsangabe bezieht sich auf die entsprechende Menge an zugegebenem "NEO-IMMUN-M" in der jeweiligen Komponente. Die Mittelwerte (± Standardabweichung) von jeweils 10 Experimenten sind angegeben. Induction of IFN-γ in peripheral blood lymphocytes by "NEO- IMMUN-M "and its complexes. The concentration information relates to the appropriate amount of "NEO-IMMUN-M" added in the respective component. The mean values (± standard deviation) of each 10 experiments are given.
Aktivierung der Killerzell-Aktivität in menschlichen peripheren Blutlymphozyten durch "NEO-IMMUN-M" und dessen Komplexe. Die Konzentrationsangabe bezieht sich auf die entsprechende Menge an zugegebenem "NEO-IMMUN-M" in der jeweiligen Komponente. Die Mittelwerte (± Standardabweichung) von jeweils 10 Experimenten sind angegeben. Activation of killer cell activity in human peripheral Blood lymphocytes by "NEO-IMMUN-M" and its complexes. The Concentration refers to the corresponding amount added "NEO-IMMUN-M" in the respective component. The Mean values (± standard deviation) of 10 experiments each specified.
Aktivierung der Killerzell-Aktivität in Peritonealzellen von C3H/HeJ-Mäusen durch "NEO-IMMUN-M" und dessen Komplexe. Die Tiere wurden mit einer Dosis (5 mg/kg) von "NEO-IMMUN-M" oder dessen Komplexe behandelt. Die Konzentrationsangabe bezieht sich auf die entsprechende Menge an zugegebenem "NEO-IMMUN-M" in der jeweiligen Komponente. 20 Mäuse wurden pro Ansatz untersucht; die Mittelwerte (± Standardabweichung) sind angegeben. Activation of killer cell activity in peritoneal cells from C3H / HeJ mice by "NEO-IMMUN-M" and its complexes. The animals were with a dose (5 mg / kg) of "NEO-IMMUN-M" or its Complexes dealt with. The concentration information refers to the corresponding amount of "NEO-IMMUN-M" added in the respective Component. 20 mice were examined per batch; the mean values (± Standard deviation) are given.
Wurfgröße des Mäusestammes Balb/c in Abhängigkeit von den Futter/Nahrungszusätzen Polyphosphat, "NEO-IMMUN" und "NEO-IMMUN- Polyphosphat". Die Mittelwerte (± Standardabweichung) von jeweils 10 Experimenten sind angegeben. Litter size of the mouse strain Balb / c depending on the Food / food additives polyphosphate, "NEO-IMMUN" and "NEO-IMMUN- Polyphosphate ". The mean values (± standard deviation) of 10 each Experiments are given.
Sterblichkeit bei neugeborenen Mäusen des Stammes CC57W/Mv bei Futter/Nahrungszusatz von "NEO-IMMUN" oder "NEO-IMMUN- Polyphosphat". Gezeigt ist die Zusammenfassung der Ergebnisse der 3 Behandlungsgruppen. Mortality in newborn mice of the strain CC57W / Mv for food / food additives from "NEO-IMMUN" or "NEO-IMMUN- Polyphosphate ". The summary of the results of the third Treatment groups.
Überlebenskurven in Abhängigkeit von den
Futter/Nahrungszusätzen. (▪) Kontrollgruppe: Futter plus Placebo; (▴) Gruppe A:
Futter plus "NEO-IMMUN", 20 mg/kg; ( ≙) Gruppe B: Futter plus "NEO-
IMMUN-Polyphosphat", 20 mg/kg.
Tabelle 1
Tabelle 2
Tabelle 3
Tabelle 4
Tabelle 5
Survival curves depending on the feed / food additives. (▪) control group: feed plus placebo; (▴) Group A: feed plus "NEO-IMMUN", 20 mg / kg; (≙) Group B: feed plus "NEO-IMMUN-polyphosphate", 20 mg / kg. Table 1
Table 2
Table 3
Table 4
Table 5
Claims (20)
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE10210571A DE10210571A1 (en) | 2002-03-09 | 2002-03-09 | A process for the preparation of a fibrillar chitin-containing composition useful for humans, newly born and young animals, suckling, and small children, and for decreasing infant mortality, especially of breeding animals |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE10210571A DE10210571A1 (en) | 2002-03-09 | 2002-03-09 | A process for the preparation of a fibrillar chitin-containing composition useful for humans, newly born and young animals, suckling, and small children, and for decreasing infant mortality, especially of breeding animals |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE10210571A1 true DE10210571A1 (en) | 2003-09-25 |
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ID=27771163
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| DE (1) | DE10210571A1 (en) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE102005031364A1 (en) * | 2005-06-30 | 2007-01-11 | Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald | Free radical scavengers for food supplements, osteoporosis treatment, plant strengtheners, cosmetics and pharmaceuticals contain terrestrial fungus extract, microalgal biomass and fungal biopolymer from Basidomycetes |
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| CN112608399A (en) * | 2020-12-30 | 2021-04-06 | 华南理工大学 | Method for extracting chitin from ganoderma lucidum waste |
| CN116285018A (en) * | 2023-02-13 | 2023-06-23 | 武汉轻工大学 | Method for enhancing tensile property of squid cartilage, squid cartilage film and application |
-
2002
- 2002-03-09 DE DE10210571A patent/DE10210571A1/en not_active Withdrawn
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