DE10202419A1 - Verfahren zur Hemmung der Expression eines durch eine Chromosomen-Aberration entstandenen Zielgens - Google Patents

Verfahren zur Hemmung der Expression eines durch eine Chromosomen-Aberration entstandenen Zielgens

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Hemmung der Expression eines durch eine Chromosomen-Aberration entstandenen aus mindestens zwei Genen an einer Fusionsstelle fusionierten Zielgens in einer Zelle, wobei das Zielgen einen die Fusionsstelle enthaltenden Abschnitt A aufweist und mindestens eine doppelsträngige Ribonukleinsäure (dsRNA) in die Zelle eingeführt wird, deren erster Strang S1 einen zu dem Abschnitt A zumindest abschnittsweise komplementären Bereich aufweist.

Description

  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Hemmung der Expression eines durch eine Chromosomen-Aberration entstandenen Zielgens und ein Medikament zur Therapie einer durch eine Chromosomen-Aberration verursachten Erkrankung. Weiterhin betrifft die Erfindung eine doppelsträngige Ribonukleinsäure (dsRNA) und deren Verwendung zur Hemmung der Expression eines durch eine Chromosomen-Aberration entstandenen Zielgens.
  • Aus der WO 99/32619 ist ein Verfahren zur Hemmung der Expression eines Zielgens mittels eines doppelsträngigen Oligoribonukleotids bekannt. Das bekannte Verfahren zielt auf die Hemmung der Expression von Genen in Zellen von Invertebraten ab. Dazu ist es erforderlich, daß das doppelsträngige Oligoribonukleotid eine zum Zielgen identische Sequenz mit einer Länge von mindestens 25 Basen aufweist.
  • Ein Verfahren zur Hemmung der Expression eines Zielgens in einer Zelle sowie ein Medikament sind aus der WO 00/44895 bekannt. Bei dem Verfahren wird ein Oligoribonukleotid mit doppelsträngiger Struktur (dsRNA) in die Zelle eingeführt. Ein Strang der dsRNA weist einen zum Zielgen zumindest abschnittsweise komplementären aus höchstens 49 aufeinanderfolgenden Nukleotidpaaren bestehenden Bereich auf. Das Medikament enthält mindestens eine dsRNA zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Zielgens, wobei ein Strang der dsRNA zum Zielgen zumindest abschnittsweise komplementär ist.
  • Bei einer Chromosomen-Aberration handelt es sich um strukturelle Änderungen und Defekte ein oder mehrerer Chromosomen. Dabei kann es zu einem Verlust oder zu einer Vervielfältigung von Genmaterial kommen. Es kann zu einer Translokation, einer Inversion, einer Deletion, einer Insertion, einer Duplikation oder einer Ringbildung kommen. Bei der Duplikation sind einzelne Chromosomenabschnitte verdoppelt. Bei der Inversion liegt ein Chromosomenabschnitt mit umgekehrter Nukleotidsequenz vor. Unter Deletion versteht man einen Stückverlust eines Chromosoms. Bei einer Translokation findet ein Stückaustausch zwischen nicht homologen Chromosomen statt. Bei einer Chromosomen-Aberration kann ein aus mindestens zwei Genen fusioniertes Gen entstehen. Steht dieses so entstandene mutierte Gen unter der Kontrolle eines Promotors, so kann es exprimiert werden und dadurch eine Beeinträchtigung hervorrufen. Diese Beeinträchtigung kann beispielsweise eine Erkrankung des hämatopoetischen Systems sein, wie eine akute myeloische Leukämie (AML) oder eine chronisch myeloische Leukämie (CML).
  • Akute myeloische Leukämien sind heterogene, maligne Erkrankungen des hämatopoetischen Systems. Der Verlust des Differenzierungspotenzials unter Beibehaltung der Proliferationsfähigkeit hat eine Expansion eines malignen Zellklons und die Verdrängung der normalen Hämatopoese zur Folge. Unbehandelt führt AML meist innerhalb weniger Wochen zum Tod des Patienten. Die Inzidenz von AML ist altersabhängig und steigt von 1/100.000 bei unter Dreißigjährigen auf 14/100.000 bei über Siebzigjährigen an.
  • Bis zu 90% der adulten AML-Fälle weisen chromosomale Aberrationen auf. Eine der häufigsten Aberrationen ist die Translokation t(8; 21)(q22; q22), die in 10-15% aller AML-Fälle auftritt. Bei dieser Translokation wird der für die Hämatopoese essentielle Transkriptionsfaktor AML-1 mit dem Transkriptionsrepressor MTG8 fusioniert. Das resultierende Fusionsprotein AML-1/MTG8 besitzt anstatt der C-terminalen Transaktivierungsdomäne von AML-1 die fast vollständige MTG8-Sequenz. Die dadurch bewirkte Änderungen der hämatopoetischen Genexpression führen in CD34-positiven Zellen zu einer Inhibition der Zelldifferenzierung und zu einer Initiation der leukämischen Transformation der betroffenen Zellen.
  • Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Nachteile nach dem Stand der Technik zu beseitigen. Es soll insbesondere ein Verfahren und ein Medikament angegeben werden, mit dem eine durch eine Chromosomen-Aberration verursachte Beeinträchtigung weitgehend verhindert werden kann.
  • Diese Aufgabe wird durch die Merkmale der Ansprüche 1, 17, 35 und 50 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen ergeben sich aus den Ansprüche 2 bis 16, 18 bis 34 und 36 bis 49.
  • Nach Maßgabe der Erfindung ist ein Verfahren zur Hemmung der Expression eines durch eine Chromosomen-Aberration entstandenen aus mindestens zwei Genen an einer Fusionsstelle fusionierten Zielgens in einer Zelle vorgesehen, wobei das Zielgen einen die Fusionsstelle enthaltenden Abschnitt A aufweist und mindestens eine doppelsträngige Ribonukleinsäure (dsRNA) in die Zelle eingeführt wird, deren erster Strang S1 einen zu dem Abschnitt A zumindest abschnittsweise komplementären Bereich aufweist. Unter dem "Zielgen" wird der DNA-Strang der doppelsträngigen DNA in der Zelle verstanden, welcher komplementär zu einem bei der Transkription als Matrize dienenden DNA-Strang einschließlich aller transkribierten Bereiche ist. Bei dem Zielgen handelt es sich also im allgemeinen um den Sinn-Strang. Der Strang S1 kann somit komplementär zu einem bei der Expression des Zielgens gebildeten RNA-Transkript oder dessen Prozessierungsprodukt, wie z. B. einer mRNA, sein. Eine dsRNA liegt vor, wenn die aus einem oder zwei Ribonukleinsäure-Strängen bestehende Ribonukleinsäure eine doppelsträngige Struktur aufweist. Nicht alle Nukleotide der dsRNA müssen Watson-Crick-Basenpaarungen aufweisen. Insbesondere einzelne nicht komplementäre Basenpaare beeinträchtigen das Verfahren kaum oder gar nicht. Die maximal mögliche Zahl der Basenpaare ist die Zahl der Nukleotide in dem kürzesten in der dsRNA enthaltenen Strang, sofern die dsRNA aus zwei Strängen besteht. Der Abschnitt A "enthält" die Fusionsstelle, wenn sich auf einer Seite der Fusionsstelle mindestens ein Nukleotid befindet. Der Rest des Abschnitts A umfaßt Nukleotide auf der anderen Seite der Fusionsstelle. Das bedeutet, daß sich die Fusionsstelle weder ganz am Anfang noch ganz am Ende des Abschnitts A befindet. Der Abschnitt A sollte mindestens 16 Nukleotide umfassen. Unter "eingeführt werden" wird das Aufnehmen in die Zelle verstanden. Das Aufnehmen kann durch die Zelle selbst erfolgen. Es kann aber auch durch Hilfsstoffe oder Hilfsmittel vermittelt werden. Der Strang S1 ist abschnittsweise komplementär zu dem Abschnitt A des Zielgens, wenn er im wesentlichen dazu komplementär ist. Einzelne oder wenige nicht komplementäre Nukleotide schaden nicht, sofern sich die Nukleotide des Zielgens, zu denen diese nicht komplementär sind, nicht im Bereich der Fusionsstelle befinden. Dieser Bereich kann beiderseits der Fusionsstelle bis zu drei Nukleotide umfassen.
  • Es hat sich überraschenderweise gezeigt, daß es das Verfahren ermöglicht, spezifisch die Expression von fusionierten Genen effizient zu inhibieren. Dadurch kann eine durch eine Chromosomen-Aberration verursachte Beeinträchtigung weitgehend verhindert werden. Unerwünschte Nebeneffekte sind nicht bekannt. Die intrazelluläre Konzentration einer zur Expression des Zielgens gebildeten mRNA kann durch das Verfahren nahezu auf Null reduziert werden. Durch Einführen einer dsRNA, die keinen zum Zielgen zumindest abschnittsweise komplementären Bereich aufweist, kann die Konzentration der genannten mRNA nicht reduziert werden. Weist die dsRNA einen zu einem die Fusionsstelle nicht umfassenden Abschnitt B des Zielgens zumindest abschnittsweise komplementären Bereich auf, so kann dadurch auch die Expression normaler, d. h. nicht mutierter bzw. fusionierter, Gene gehemmt werden.
  • Vorzugsweise weist der die Fusionsstelle umfassende Abschnitt A zumindest zwei, insbesondere drei, Nukleotide auf jeder Seite der Fusionsstelle auf. Bei einem bspw. 21 Nukleotide langen Abschnitt A können dann z. B. drei Nukleotide auf der einen und 18 Nukleotide auf der anderen Seite der Fusionsstelle angeordnet sein. Dadurch ist eine besondere effiziente und spezifische Hemmung der Expression des Zielgens zu erreichen. Bevorzugt besteht der zumindest abschnittsweise komplementäre Bereich aus weniger als 50, vorzugsweise weniger als 25, aufeinanderfolgenden Nukleotiden.
  • Als besonders vorteilhaft hat es sich erwiesen, wenn zumindest ein Ende der dsRNA einen aus 1 bis 4, insbesondere 1 oder 2, Nukleotiden gebildeten einzelsträngigen Überhang aufweist. Eine solche dsRNA weist gegenüber einer dsRNA ohne einzelsträngige Überhänge an mindestens einem Ende eine bessere Wirksamkeit bei der Hemmung der Expression des Zielgens auf. Ein Ende ist dabei ein Bereich der dsRNA, in welchem ein 5'- und ein 3'-Strangende vorliegen. Eine nur aus dem Strang S1 bestehende dsRNA weist demnach eine Schleifenstruktur und nur ein Ende auf. Eine aus dem Strang S1 und einem Strang S2 gebildete dsRNA weist zwei Enden auf. Ein Ende wird dabei jeweils von einem auf dem Strang S1 und einem auf dem Strang S2 liegenden Strangende gebildet.
  • Vorzugsweise befindet sich der einzelsträngige Überhang am 3'-Ende des Strangs S1. Diese Lokalisation des einzelsträngigen Überhangs führt zu einer weiteren Steigerung der Effizienz des Verfahrens. In einem Ausführungsbeispiel weist die dsRNA nur an einem, insbesondere dem am 3'-Ende des Strangs S1 gelegenen, Ende einen einzelsträngigen Überhang auf. Das andere Ende ist bei einer zwei Enden aufweisenden dsRNA glatt, d. h. ohne Überhänge, ausgebildet. Eine solche dsRNA hat sich sowohl in verschiedenen Zellkulturmedien als auch in Blutserum als besonders beständig erwiesen.
  • Der komplementäre Bereich des Strangs S1 der dsRNA kann 19 bis 24, vorzugsweise 20 bis 23, insbesondere 22, Nukleotide aufweisen. Eine dsRNA mit dieser Struktur ist besonders effizient in der Inhibition des Zielgens. Der Strang S1 der dsRNA kann weniger als 30, vorzugsweise weniger als 25, besonders vorzugsweise 21 bis 24, Nukleotide aufweisen. Die Zahl dieser Nukleotide ist zugleich die Zahl der in der dsRNA maximal möglichen Basenpaare.
  • Mindestens ein Ende der dsRNA kann modifiziert werden, um einem Abbau in der Zelle oder einer Dissoziation der doppelsträngigen Struktur in die Einzelstränge entgegenzuwirken. Weiterhin kann der durch komplementäre Nukleotidpaare bewirkte Zusammenhalt der doppelsträngigen Struktur durch mindestens eine, vorzugsweise zwei, weitere chemische Verknüpfung/en erhöht werden. Die chemische Verknüpfung kann durch eine kovalente oder ionische Bindung, eine Wasserstoffbrückenbindung, hydrophobe Wechselwirkungen, vorzugsweise van- der-Waals- oder Stapelungswechselwirkungen, oder durch Metall-Ionenkoordination gebildet werden. Sie kann auch durch in der doppelsträngigen Struktur anstelle von Purinen benutzten Purinanaloga gebildet werden. Die Verknüpfung wird bevorzugt an einem Ende der dsRNA, insbesondere durch Verbindung mittels eines Hexaethylenglykol-Linkers, gebildet. Als besonders effizient hat es sich erwiesen, wenn die Verknüpfung zwischen dem 5'-Ende des Strangs S1 und dem 3'-Ende eines zweiten Strangs S2 der dsRNA gebildet wird.
  • Das Zielgen kann mindestens ein aus den Genen für AML-1 und für MTG8 fusioniertes Gen sein. Dann besteht die dsRNA vorzugsweise aus dem Strang S1 mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 und dem Strang S2 mit der Sequenz SEQ ID NO: 2 gemäß dem anliegenden Sequenzprotokoll. Eine solche dsRNA ist in der Hemmung der Expression eines aus den Genen für AML-1 und für MTG8 fusionierten Zielgens besonders wirksam. Bei der Zelle kann es sich um einen Leukozyten, insbesondere eine myeloische Zelle, handeln. Zum Einbringen der dsRNA in die Zelle kann eine die dsRNA umschließende micellare Struktur, vorzugsweise ein Liposom, oder ein die dsRNA umschließendes Kapsid verwendet werden. Das Kapsid kann insbesondere ein virales natürliches Kapsid oder ein auf chemischem oder enzymatischem Weg hergestelltes künstliches Kapsid oder eine davon abgeleitete Struktur sein.
  • Weiterhin betrifft die Erfindung ein Medikament zur Therapie einer durch eine Chromosomen-Aberration verursachten Erkrankung enthaltend mindestens eine doppelsträngige Ribonukleinsäure (dsRNA) zur Hemmung der Expression eines durch die Chromosomen-Aberration entstandenen aus mindestens zwei Genen an einer Fusionsstelle fusionierten Zielgens, wobei das Zielgen einen die Fusionsstelle enthaltenden Abschnitt A aufweist und ein Strang S1 der dsRNA einen zu dem Abschnitt A zumindest abschnittsweise komplementären Bereich aufweist. Das Medikament ist so zu dosieren, daß die Hemmung der Expression mindestens eines Zielgens erreicht werden kann. Überraschenderweise hat sich gezeigt, daß ein solches Medikament dazu sehr niedrig dosiert eingesetzt werden kann. Eine Dosierung von 5 mg dsRNA pro Kilogramm Körpergewicht und Tag sind ausreichend, um eine Hemmung oder vollständige Unterdrückung der Expression des Zielgens zu erreichen. Weiterhin hat sich gezeigt, daß das Medikament hochspezifisch nur die Expression des Zielgens, nicht aber die Expression der zum Zielgen fusionierten, ursprünglich auf verschiedenen Chromosomen lokalisierten einzelnen Gene hemmt. Aufgrund der möglichen niedrigen Dosierung und der hohen Spezifität des Medikaments können Nebenwirkungen weitgehend ausgeschlossen werden.
  • Besonders vorteilhaft ist es, wenn der Abschnitt A zumindest zwei, insbesondere drei, Nukleotide auf jeder Seite der Fusionsstelle aufweist. Bevorzugt besteht der zumindest abschnittsweise komplementäre Bereich aus weniger als 50, vorzugsweise weniger als 25, aufeinanderfolgenden Nukleotiden. Vorzugsweise weist zumindest ein Ende der dsRNA einen aus 1 bis 4, insbesondere 1 oder 2, Nukleotiden gebildeten einzelsträngigen Überhang auf. Der einzelsträngige Überhang kann sich am 3'-Ende des Strangs S1 befinden. Besonders bevorzugt weist die dsRNA nur an einem, insbesondere dem am 3'-Ende des Strangs S1 gelegenen, Ende einen einzelsträngigen Überhang auf. Es hat sich herausgestellt, daß eine solche dsRNA im Körper besonders beständig ist. Sie wird in Blut langsamer abgebaut bzw. ausgeschieden als eine dsRNA mit einzelsträngigen Überhängen an beiden Enden. Dadurch ist eine niedrige Dosierung möglich.
  • Der komplementäre Bereich des Strangs S1 der dsRNA kann 19 bis 24, bevorzugt 20 bis 23, insbesondere 22, Nukleotide aufweisen. Der Strang S1 kann weniger als 30, vorzugsweise weniger als 25, besonders vorzugsweise 21 bis 24, Nukleotide aufweisen. Bei einer Ausführungsform ist mindestens ein Ende der dsRNA modifiziert, um einem Abbau in den Zellen oder einer Dissoziation in die Einzelstränge entgegenzuwirken. Der durch komplementäre Nukleotidpaare bewirkte Zusammenhalt der doppelsträngigen Struktur kann durch mindestens eine, vorzugsweise zwei, weitere chemische Verknüpfungen erhöht sein.
  • Die Verknüpfung ist vorzugsweise an einem Ende der dsRNA, insbesondere durch Verbindung mittels eines Hexaethylenglykol-Linkers, gebildet. Besonders vorteilhaft ist es, wenn die Verknüpfung zwischen dem 5'-Ende des Strangs S1 und dem 3'- Ende eines zweiten Strangs S2 der dsRNA gebildet ist.
  • Das Zielgen ist vorzugsweise mindestens ein aus den Genen für AML-1 und für MTG8 fusioniertes Gen. Dann kann die dsRNA aus dem Strang S1 mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 und dem Strang S2 mit der Sequenz SEQ ID NO: 2 gemäß dem anliegenden Sequenzprotokoll bestehen. Die mit dem Medikament zu behandelnde Erkrankung kann eine akute myeloische Leukämie oder eine chronisch myeloische Leukämie sein. Die dsRNA kann in dem Medikament in einer Lösung oder von einer micellaren Struktur, vorzugsweise einem Liposom, oder einem Kapsid umschlossen vorliegen. Eine micellare Struktur oder ein Kapsid kann die Aufnahme der dsRNA in die Zellen erleichtern. Das Medikament kann eine Zubereitung aufweisen, die zur Inhalation, oralen Aufnahme oder Injektion, insbesondere zur intravenösen oder intraperitonealen Injektion oder zur Injektion direkt in ein befallenes Knochenmark, geeignet ist. Eine zur Inhalation oder Injektion geeignete Zubereitung kann im einfachsten Fall aus einem physiologisch verträglichen Puffer, insbesondere einer phosphatgepufferten Salzlösung, und der dsRNA bestehen. Es hat sich nämlich überraschenderweise herausgestellt, daß eine lediglich in einem solchen Puffer gelöste dsRNA von den Zellen aufgenommen wird und die Expression des Zielgens hemmt, ohne daß die dsRNA dazu in ein besonderes Vehikel verpackt werden muß.
  • Ferner betrifft die Erfindung eine doppelsträngige Ribonukleinsäure (dsRNA) zur Hemmung der Expression eines durch eine Chromosomen-Aberration entstandenen aus mindestens zwei Genen an einer Fusionsstelle fusionierten Zielgens, wobei das Zielgen einen die Fusionsstelle enthaltenden Abschnitt A aufweist und ein Strang S1 der dsRNA einen zu dem Abschnitt A zumindest abschnittsweise komplementären Bereich aufweist. Vorteilhafte Ausgestaltungen der dsRNA können den Ansprüchen 36 bis 49 sowie der vorstehenden Beschreibung entnommen werden. Weiterhin betrifft die Erfindung eine Verwendung einer erfindungsgemäßen doppelsträngigen Ribonukleinsäure (dsRNA) zur Hemmung der Expression eines durch eine Chromosomen- Aberration entstandenen aus mindestens zwei Genen fusionierten Zielgens
  • Nachfolgend werden anhand der Figuren Beispiele der Erfindung erläutert. Es zeigen:
  • Fig. 1 ein Autoradiogramm einer RNase-Protektion und
  • Fig. 2 eine graphische Darstellung des jeweiligen Verhältnisses der Intensitäten der von AML-1/MTG8-mRNA und AML-1-mRNA gebildeten Banden auf jeweils einer Spur des Autoradiogramms.
  • Die für Transfektionen eingesetzten doppelsträngigen Oligoribonukleotide weisen die folgenden, im Sequenzprotokoll mit SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 6 bezeichneten, Sequenzen auf:
    AGF2: dsRNA, deren einer Strang S1 zu einer ersten Sequenz aus einem aus den Genen für AML-1 und MTG8 fusionierten Gen (AML-1/MTG8-Gen) komplementär ist:


    AGF3L: dsRNA mit derselben Sequenz wie AGF2 und einer Verknüpfung zwischen dem 5'-Ende des Strangs S1 und dem 3'-Ende des Strangs S2 durch einen Hexaethylenglykol-Linker:


  • Die bei den Darstellungen von AGF2 und AGF3L unterstrichenen Sequenzen entsprechen dem zum MTG8-Gen komplementären und die nicht unterstrichenen Sequenzen dem zum AML-1-Gen komplementären Bereich der jeweiligen dsRNA. K3: Kontroll-dsRNA, deren einer Strang S1 zu einer Sequenz aus dem 5'-untranslatierten Bereich eines Neomycin-Resistenz- Gens komplementär ist:


  • HCV10L: Kontroll-dsRNA, deren einer Strang S1 zu einer Sequenz aus dem HCV-Gen komplementär ist und eine Verknüpfung zwischen dem 5'-Ende des Strangs S1 und dem 3'-Ende des Strangs S2 durch einen Hexaethylenglykol-Linker aufweist:


  • Die RNA-Einzelstränge wurden mit einem RNA-Synthesizer (Typ Expedite 8909, Applied Biosystems, Weiterstadt, Deutschland) und herkömmlichen chemischen Verfahren synthetisiert. Anschließend erfolgte die Reinigung der rohen Syntheseprodukte mit Hilfe der HPLC. Als Säulen wurden NucleoPac PA-100, 9 × 250 mm der Fa. Dionex, verwendet. Als Niedersalz-Puffer diente 20 mM Tris, 10 mM NaClO4, pH 6,8, 10% Acetonitril und als Hochsalz-Puffer 20 mM Tris, 400 mM NaClO4, pH 6,8, 10% Acetonitril. Der Fluß betrug 3 ml/Minute. Die Hybridisierung der Einzelstränge (je 10 µM) zum Doppelstrang erfolgte durch Erhitzen des stöchiometrischen Gemischs der Einzelstränge auf 95°C für 5 Minuten in 25 mM Tris-HCl pH 7,5 und 100 mM NaCl und anschließendes Abkühlen über 30 Minuten auf 37°C.
  • Für die Transfektionsexperimente wurde die Zelllinie Kasumi-1 (Asou, H. et al. (1991) Blood 77, 2031-2036), welche die Translokation t(8; 21) aufweist, verwendet. Pro Transfektionsansatz wurden 106 Zellen in 100 µl RPMI1640 mit 10% FCS in eine 0,4 cm breite Elektroporationsküvette pipettiert. Nach Zugabe von dsRNAs bis zu einer Endkonzentration von 200 nM wurden die Zellen bei 300 V für 10 ms mittels eines Fischer- Elektroporators (Fischer, Heidelberg) elektroporiert. Nach 15-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Zellsuspension in 2 ml RPMI1640 mit 10% fötalem Kälberserum überführt und bei 37°C, 5% CO2 und 95% Luftfeuchtigkeit für 20 Stunden inkubiert.
  • Die cytoplasmatische RNA wurde mit Hilfe des RNeasy-Kits (Qiagen, Hilden) aufgereinigt und einer RNase-Protektion- Untersuchung unterzogen (Ausubel, F. M. et. al. (1993) Current Protocols in Molecular Biology. Greene and Wiley, New York). Dazu wurde die RNA nach der Rnase-Behandlung in einem denaturierenden 6%igen Polyacrylamidgel separiert und mittels Phosphoimaging quantifiziert. Das Polyacrylamidgel ist in Fig. 1 dargestellt. Die durch die Elektroporation in die Zellen eingeführten dsRNAs sind jeweils oberhalb der Spur angegeben. In Spur 1 ist die cytoplasmatische RNA aus einer Zelle aufgetragen, welche in Abwesenheit einer dsRNA elektroporiert worden ist. Als unverdaute Proben-RNA fand eine 314 Nukleotide lange, zur AML-1/MTG8-Fusionsstelle komplementären RNA Verwendung (Fig. 1, Spur 7). Die Denaturierungstemperatur betrug 95°C, die Hybridisierungstemperatur 60°C. Die Verdauung der Hybride erfolgte mit RNaseT1. Die Bedingungen für eine vollständige Verdauung wurden mit einer tRNA als Probe überprüft (Fig. 1, Spur 6).
  • In allen Ansätzen sind sowohl AML-1/MTG8-spezifische Fragmente mit einer Länge von 239 Nukleotiden als auch AML-1- spezifische Fragmente mit einer Länge von 91 Nukleotiden zu sehen, auf die in Fig. 1 durch Pfeile hingewiesen wird. Die den 91 Nukleotide langen Fragmenten entsprechenden Banden zeigen die Expression des nicht translozierten Wildtypallels an. Weder Kontroll- noch AML-1/MTG8-spezifische dsRNAs reduzieren das AML-1-Signal für die nicht-fusionierte mRNA (Fig. 1, vergleiche Spur 1 mit Spuren 3 und 5). Im Gegensatz zu den Kontroll-dsRNAs (K3 und HCV10L, Fig. 1, Spuren 3 und 5) reduzieren jedoch sowohl die aus zwei Ribooligonukleotiden hybridisierte dsRNA AGF2 (spezifisch für die AML-1/MTG8 Fusions- mRNA, Fig. 1, Spur 2) als auch die durch intramolekulare Hybridisierung entstandene monomolekulare dsRNA AGF3L, bei der beide Stränge durch den Hexaethylenglykol-Linker verknüpft sind (Fig. 1, Spur 4), das AML-1/MTG8-Signal. Während sowohl bei Zellen, die in Abwesenheit von dsRNA elektroporiert wurden, als auch bei mit Kontroll-dsRNA transfizierten Zellen das Verhältnis der Intensitäten der Banden von AML-1/MTG8 zu AML-1 zwischen 1,1 und 1,4 schwankt, führt die Elektroporation in Gegenwart von AML-1/MTG8-spezifischen dsRNAs zu einer Reduktion des Verhältnisses auf 0,4 bis 0,6 (Fig. 2). Damit ist gezeigt, dass sowohl bimolekulare dsRNA als auch ein monomolekulares, mit einem Hexaethylenglykol-Linker versehenes dsRNA-Molekül die Expression des leukämischen Fusionsgens AML-1/MTG8 auf 46% reduziert. Diese Inhibition ist spezifisch. Die Expression des nichttranslozierten Allels wird durch die hier verwendeten dsRNA-Moleküle nicht beeinflusst. Berücksichtigt man eine abgeschätzte Porationseffizienz von 50%, so wird deutlich, dass in allen elektroporierten Zellen, und damit in allen Zellen, in die eine dsRNA eingefügt wird ist, die Fusions-mRNA vollständig einem intrazellulären Abbau zugeführt wird. SEQUENZPROTOKOLL



Claims (50)

1. Verfahren zur Hemmung der Expression eines durch eine Chromosomen-Aberration entstandenen aus mindestens zwei Genen an einer Fusionsstelle fusionierten Zielgens in einer Zelle, wobei das Zielgen einen die Fusionsstelle enthaltenden Abschnitt A aufweist und mindestens eine doppelsträngige Ribonukleinsäure (dsRNA) in die Zelle eingeführt wird, deren erster Strang S1 einen zu dem Abschnitt A zumindest abschnittsweise komplementären Bereich aufweist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Abschnitt A zumindest zwei, insbesondere drei, Nukleotide auf jeder Seite der Fusionsstelle aufweist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Bereich aus weniger als 50, vorzugsweise weniger als 25, aufeinanderfolgenden Nukleotiden besteht.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei zumindest ein Ende der dsRNA einen aus 1 bis 4, insbesondere 1 oder 2, Nukleotiden gebildeten einzelsträngigen Überhang aufweist.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei sich der einzelsträngige Überhang am 3'-Ende des Strangs S1 befindet.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die dsRNA nur an einem, insbesondere dem am 3'-Ende des Strangs S1 gelegenen, Ende einen einzelsträngigen Überhang aufweist.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der komplementäre Bereich des Strangs S1 der dsRNA 19 bis 24, bevorzugt 20 bis 23, insbesondere 22, Nukleotide aufweist.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Strang S1 weniger als 30, vorzugsweise weniger als 25, besonders vorzugsweise 21 bis 24, Nukleotide aufweist.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei mindestens ein Ende der dsRNA modifiziert wird, um einem Abbau in der Zelle oder einer Dissoziation in die Einzelstränge entgegenzuwirken.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der durch komplementäre Nukleotidpaare bewirkte Zusammenhalt der dsRNA durch mindestens eine, vorzugsweise zwei, weitere chemische Verknüpfungen erhöht wird.
11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Verknüpfung an einem Ende der dsRNA, insbesondere durch Verbindung mittels eines Hexaethylenglykol-Linkers, gebildet wird.
12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Verknüpfung zwischen dem 5'-Ende des Strangs S1 und dem 3'-Ende eines zweiten Strangs S2 der dsRNA gebildet wird.
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Zielgen mindestens ein aus den Genen für AML-1 und für MTG8 fusioniertes Gen ist.
14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die dsRNA aus dem Strang S1 mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 und dem Strang S2 mit der Sequenz SEQ ID NO: 2 gemäß dem anliegenden Sequenzprotokoll besteht.
15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Zelle ein Leukozyt, insbesondere eine myeloische Zelle, ist.
16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die dsRNA mittels einer die dsRNA umschließenden micellaren Struktur, vorzugsweise einem Liposom, oder eines die dsRNA umschließenden Kapsids, in die Zelle eingebracht wird.
17. Medikament zur Therapie einer durch eine Chromosomen- Aberration verursachten Erkrankung enthaltend mindestens eine doppelsträngige Ribonukleinsäure (dsRNA) zur Hemmung der Expression eines durch die Chromosomen-Aberration entstandenen aus mindestens zwei Genen an einer Fusionsstelle fusionierten Zielgens, wobei das Zielgen einen die Fusionsstelle enthaltenden Abschnitt A aufweist und ein Strang S1 der dsRNA einen zu dem Abschnitt A zumindest abschnittsweise komplementären Bereich aufweist.
18. Medikament nach Anspruch 17, wobei der Abschnitt A zumindest zwei, insbesondere drei, Nukleotide auf jeder Seite der Fusionsstelle aufweist.
19. Medikament nach Anspruch 17 oder 18, wobei der Bereich aus weniger als 50, vorzugsweise weniger als 25, aufeinanderfolgenden Nukleotiden besteht.
20. Medikament nach einem der Ansprüche 17 bis 19, wobei zumindest ein Ende der dsRNA einen aus 1 bis 4, insbesondere 1 oder 2, Nukleotiden gebildeten einzelsträngigen Überhang aufweist.
21. Medikament nach einem der Ansprüche 17 bis 20, wobei sich der einzelsträngige Überhang am 3'-Ende des Strangs S1 befindet.
22. Medikament nach einem der Ansprüche 17 bis 21, wobei die dsRNA nur an einem, insbesondere dem am 3'-Ende des Strangs S1 gelegenen, Ende einen einzelsträngigen Überhang aufweist.
23. Medikament nach einem der Ansprüche 17 bis 22, wobei der komplementäre Bereich des Strangs S1 der dsRNA 19 bis 24, bevorzugt 20 bis 23, insbesondere 22, Nukleotide aufweist.
24. Medikament nach einem der Ansprüche 17 bis 23, wobei der Strang S1 weniger als 30, vorzugsweise weniger als 25, besonders vorzugsweise 21 bis 24, Nukleotide aufweist.
25. Medikament nach einem der Ansprüche 17 bis 24, wobei mindestens ein Ende der dsRNA modifiziert ist, um einem Abbau in den Zellen oder einer Dissoziation in die Einzelstränge entgegenzuwirken.
26. Medikament nach einem der Ansprüche 17 bis 25, wobei der durch komplementäre Nukleotidpaare bewirkte Zusammenhalt der dsRNA durch mindestens eine, vorzugsweise zwei, weitere chemische Verknüpfungen erhöht ist.
27. Medikament nach einem der Ansprüche 17 bis 26, wobei die Verknüpfung an einem Ende der dsRNA, insbesondere durch Verbindung mittels eines Hexaethylenglykol-Linkers, gebildet ist.
28. Medikament nach einem der Ansprüche 17 bis 27, wobei die Verknüpfung zwischen dem 5'-Ende des Strangs S1 und dem 3'-Ende eines zweiten Strangs S2 der dsRNA gebildet ist.
29. Medikament nach einem der Ansprüche 17 bis 28, wobei das Zielgen mindestens ein aus den Genen für AML-1 und für MTG8 fusioniertes Gen ist.
30. Medikament nach einem der Ansprüche 17 bis 29, wobei die dsRNA aus dem Strang S1 mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 und dem Strang S2 mit der Sequenz SEQ ID NO: 2 gemäß dem anliegenden Sequenzprotokoll besteht.
31. Medikament nach einem der Ansprüche 17 bis 30, wobei die Erkrankung eine akute myeloische Leukämie oder eine chronisch myeloische Leukämie ist.
32. Medikament nach einem der Ansprüche 17 bis 31, wobei die dsRNA in dem Medikament in einer Lösung oder von einer micellaren Struktur, vorzugsweise einem Liposom, oder einem Kapsid umschlossen vorliegt.
33. Medikament nach einem der Ansprüche 17 bis 32, wobei das Medikament eine Zubereitung aufweist, die zur Inhalation, oralen Aufnahme oder Injektion, insbesondere zur intravenösen oder intraperitonealen Injektion oder zur Injektion direkt in ein befallenes Knochenmark, geeignet ist.
34. Medikament nach Anspruch 33, wobei die Zubereitung aus einem physiologisch verträglichen Puffer, insbesondere einer phosphatgepufferten Salzlösung, und der dsRNA besteht.
35. Doppelsträngige Ribonukleinsäure (dsRNA) zur Hemmung der Expression eines durch eine Chromosomen-Aberration entstandenen aus mindestens zwei Genen an einer Fusionsstelle fusionierten Zielgens, wobei das Zielgen einen die Fusionsstelle enthaltenden Abschnitt A aufweist und ein Strang S1 der dsRNA einen zu dem Abschnitt A zumindest abschnittsweise komplementären Bereich aufweist.
36. dsRNA nach Anspruch 35, wobei der Abschnitt A zumindest zwei, insbesondere drei, Nukleotide auf jeder Seite der Fusionsstelle aufweist.
37. dsRNA nach Anspruch 35 oder 36, wobei der Bereich aus weniger als 50, vorzugsweise weniger als 25, aufeinanderfolgenden Nukleotiden besteht.
38. dsRNA nach einem der Ansprüche 35 bis 37, wobei zumindest ein Ende der dsRNA einen aus 1 bis 4, insbesondere 1 oder 2, Nukleotiden gebildeten einzelsträngigen Überhang aufweist.
39. dsRNA nach einem der Ansprüche 35 bis 38, wobei sich der einzelsträngige Überhang am 3'-Ende des Strangs S1 befindet.
40. dsRNA nach einem der Ansprüche 35 bis 39, wobei die dsRNA nur an einem, insbesondere dem am 3'-Ende des Strangs S1 gelegenen, Ende einen einzelsträngigen Überhang aufweist.
41. dsRNA nach einem der Ansprüche 35 bis 40, wobei der komplementäre Bereich des Strangs S1 der dsRNA 19 bis 24, bevorzugt 20 bis 23, insbesondere 22, Nukleotide aufweist.
42. dsRNA nach einem der Ansprüche 35 bis 41, wobei der Strang S1 weniger als 30, vorzugsweise weniger als 25, besonders vorzugsweise 21 bis 24, Nukleotide aufweist.
43. dsRNA nach einem der Ansprüche 35 bis 42, wobei mindestens ein Ende der dsRNA modifiziert ist, um einem Abbau in der Zelle oder einer Dissoziation in die Einzelstränge entgegenzuwirken.
44. dsRNA nach einem der Ansprüche 35 bis 43, wobei der durch komplementäre Nukleotidpaare bewirkte Zusammenhalt der dsRNA durch mindestens eine, vorzugsweise zwei, weitere chemische Verknüpfungen erhöht ist.
45. dsRNA nach einem der Ansprüche 35 bis 44, wobei die Verknüpfung an einem Ende der dsRNA, insbesondere durch Verbindung mittels eines Hexaethylenglykol-Linkers, gebildet ist.
46. dsRNA nach einem der Ansprüche 35 bis 45, wobei die Verknüpfung zwischen dem 5'-Ende des Strangs S1 und dem 3'- Ende eines zweiten Strangs S2 der dsRNA gebildet ist.
47. dsRNA nach einem der Ansprüche 35 bis 46, wobei das Zielgen mindestens ein aus den Genen für AML-1 und für MTG8 fusioniertes Gen ist.
48. dsRNA nach einem der Ansprüche 35 bis 47, wobei die dsRNA aus dem Strang S1 mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 und dem Strang S2 mit der Sequenz SEQ ID NO: 2 gemäß dem anliegenden Sequenzprotokoll besteht.
49. dsRNA nach einem der Ansprüche 35 bis 48, wobei die dsRNA von einer micellaren Struktur, vorzugsweise einem Liposom, oder einem Kapsid umschlossen ist.
50. Verwendung einer doppelsträngigen Ribonukleinsäure (dsRNA) gemäß einem der Ansprüche 35 bis 49 zur Hemmung der Expression eines durch eine Chromosomen-Aberration entstandenen aus mindestens zwei Genen fusionierten Zielgens.
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