DE102012108599B4 - A-beta oligomer-binding peptides and their use - Google Patents
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Abstract
Peptid, enthaltend mindestens eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 und Homologe mit einer Identität von mindestens 70% davon und Polymere der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 und deren Homologe mit einer Identität von mindestens 70%.Peptide containing at least one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 and homologues with an identity of at least 70% thereof and polymers of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 and their homologues with at least 70% identity.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft neue A-Beta-Oligomer-bindende Peptide und deren Verwendung, insbesondere in der Medizin.The present invention relates to new A-beta oligomer-binding peptides and their use, particularly in medicine.
Aufgrund der demographischen Entwicklung in den nächsten Jahrzehnten wird sich die Zahl der Personen, die an altersbedingten Erkrankungen leiden, erhöhen. Hier ist insbesondere die sog. Alzheimer-Krankheit (AD, Alzheimersche Demenz, lateinisch = Morbus Alzheimer) zu nennen.Due to the demographic development in the coming decades, the number of people suffering from age-related diseases will increase. The so-called Alzheimer's disease (AD, Alzheimer's dementia, Latin = Alzheimer's disease) should be mentioned here in particular.
Ein Merkmal der Alzheimer-Erkrankung sind extrazelluläre Ablagerungen des Amyloid-Beta-Peptids (A-Beta-Peptid). Diese Ablagerung des A-Beta-Peptids in Plaques ist typischerweise in den Gehirnen von AD-Patienten post mortem festzustellen. Deshalb werden verschiedene Formen des A-Beta-Peptids - wie z.B. Fibrillen - für die Entstehung und das Fortschreiten der Krankheit verantwortlich gemacht. Zusätzlich werden seit einigen Jahren die kleinen, frei diffundierbaren A-Beta-Oligomere als hauptsächliche Verursacher der Entstehung und des Fortschritts der AD gesehen.A feature of Alzheimer's disease is extracellular deposits of amyloid-beta peptide (A-beta peptide). This plaque deposition of the A-beta peptide is typically seen in the brains of AD patients post mortem. Therefore, different forms of the A-beta peptide - such as fibrils - are held responsible for the development and progression of the disease. In addition, the small, freely diffusible A-beta oligomers have been seen as the main cause of the development and progression of AD for several years.
A-Beta-Monomere, als Bausteine der A-Beta-Oligomere, entstehen im menschlichen Körper ständig und sind vermutlich per se nicht toxisch. Möglicherweise haben sie sogar eine neuroprotektive Funktion. A-Beta-Monomere können sich in Abhängigkeit von ihrer Konzentration zufällig zusammen lagern. Die Konzentration ist abhängig von ihrer Bildungs- und Abbaurate im Körper. Findet mit zunehmendem Alter eine Erhöhung der Konzentration an A-Beta-Monomeren im Körper statt, so ist eine spontane Zusammenlagerung der Monomere zu A-Beta-Oligomeren immer wahrscheinlicher. Die so entstandenen A-Beta-Oligomere könnten sich analog zu den Prionen vermehren und letztendlich zur Morbus Alzheimer-Krankheit führen.A-beta monomers, as building blocks of A-beta oligomers, are constantly produced in the human body and are probably not toxic per se. They may even have a neuroprotective function. A-beta monomers can randomly aggregate depending on their concentration. The concentration depends on the rate at which they are formed and broken down in the body. If the concentration of A-beta monomers in the body increases with increasing age, spontaneous agglomeration of the monomers to form A-beta oligomers is more and more likely. The resulting A-beta oligomers could multiply analogously to the prions and ultimately lead to Alzheimer's disease.
Bisher existiert kein Wirkstoff oder Medikament, das gegen die Ursachen von AD wirkt. Die bisher eingesetzten und zugelassenen Medikamente mildern einige der bei der AD auftretenden Symptome. Sie sind aber nicht in der Lage, den Krankheitsfortschritt zu verlangsamen oder eine Heilung herbeizuführen. Es existieren einige Substanzen, die im Tierversuch Erfolge bei der Prävention, aber nicht (unbedingt) bei der Behandlung von AD gezeigt haben.To date, there is no active substance or medication that counteracts the causes of AD. The drugs used and approved to date alleviate some of the symptoms associated with AD. However, they are unable to slow down the progression of the disease or bring about a cure. There are some substances that have shown success in preventing AD in animal experiments, but not (necessarily) in treating AD.
Ein wichtiger Unterschied zwischen Prävention und Behandlung oder gar Heilung der AD liegt in der Tatsache, dass eine Prävention möglicherweise schon durch die Verhinderung der Bildung der ersten A-Beta-Oligomere erreicht werden kann. Zur Prävention sind einige, wenige A-Beta-Liganden ausreichend, die nicht notwendigerweise hochaffin und selektiv bezüglich der A-Beta-Oligomere sind.An important difference between prevention and treatment or even cure of AD lies in the fact that prevention can possibly be achieved by preventing the formation of the first A-beta oligomers. A few A-beta ligands, which do not necessarily have high affinity and are selective with respect to the A-beta oligomers, are sufficient for prevention.
Die Bildung der A-Beta-Oligomere aus vielen Monomeren ist eine Reaktion hoher Ordnung und damit in hoher Potenz von der A-Beta-Monomer-Konzentration abhängig. Somit führt schon eine kleine Verringerung der aktiven A-Beta-Monomer-Konzentration zu einer Verhinderung der Bildung der ersten A-Beta-Oligomere. Auf diesem Mechanismus basieren die bisher sich in der Entwicklung befindlichen eher präventiven Therapiekonzepte und Substanzen. Bei der Behandlung von AD ist jedoch von einer völlig veränderten Situation auszugehen. Hier liegen A-Beta-Oligomere oder evtl. auch schon größere Polymere oder Fibrillen vor, die sich durch Prion-ähnliche Mechanismen vermehren. Diese Vermehrung ist jedoch eine Reaktion niederer Ordnung und ist somit kaum noch von der A-Beta-Monomer-Konzentration abhängig.The formation of the A-beta oligomers from many monomers is a high-order reaction and thus highly dependent on the A-beta monomer concentration. Thus, even a small reduction in the active A-beta monomer concentration results in prevention of the formation of the first A-beta oligomers. The more preventive therapy concepts and substances currently being developed are based on this mechanism. In the treatment of AD, however, a completely different situation can be assumed. Here A-beta oligomers or possibly even larger polymers or fibrils are present, which multiply by prion-like mechanisms. However, this increase is a low-order reaction and is thus hardly dependent on the A-beta monomer concentration.
Die aus dem Stand der Technik bekannten Substanzen verringern die Konzentration von A-Beta-Monomeren und/oder Oligomeren auf verschiedenste Art und Weise. So sind z.B. Gamma-Sekretase-Modulatoren bekannt, die im Tierversuch zur Prävention eingesetzt wurden.The substances known from the prior art reduce the concentration of A-beta monomers and/or oligomers in a wide variety of ways. For example, gamma-secretase modulators are known that have been used in animal experiments for prevention.
Aus der
Aus der
Bei vielen Substanzen, die im Tierversuch positive Ergebnisse gezeigt haben, konnte diese Wirkung in klinischen Studien am Menschen nicht bestätigt werden. In klinischen Studien der Phase II und III dürfen nur Menschen behandelt werden, die eindeutig mit AD diagnostiziert wurden. Hier reicht eine geringe Verringerung der A-Beta-Monomerkonzentration nicht mehr aus, um zu verhindern, dass sich aus den bereits vorhandenen A-Beta-Oligomeren noch mehr bilden, z.B. durch einen Prion-ähnlichen Mechanismus. Die Vermehrung der A-Beta-Oligomere oder noch besser ihre Zerstörung oder Unschädlichmachung ist aber unbedingt erforderlich, um Einfluss auf den Krankheitsverlauf zu nehmen.For many substances that have shown positive results in animal experiments, this effect could not be confirmed in clinical studies on humans. Only people who have been clearly diagnosed with AD may be treated in phase II and III clinical trials. Here, a small reduction in the A-beta monomer concentration is no longer sufficient to prevent the already existing A-beta oligomers from forming more, e.g. by a prion-like mechanism. However, the multiplication of the A-beta oligomers or, even better, their destruction or rendering them harmless is absolutely necessary in order to influence the course of the disease.
Bisher wird die AD hauptsächlich durch neuropsychologische Tests diagnostiziert, durch Untersuchungen an Personen, bei denen bereits Demenzsymptome aufgetreten sind. Es ist jedoch bekannt, dass A-Beta-Oligomere und die zeitlich im Krankheitsverlauf darauf folgenden Fibrillen und Plaques bis zu 20 Jahre vor dem Auftreten der Symptome im Gehirn der Patienten entstehen, und schon irreversible Schäden verursacht haben können. Allerdings gibt es bisher in der Praxis noch keine Möglichkeit, die AD vor dem Ausbruch der Symptome zu diagnostizieren.So far, AD has been diagnosed mainly through neuropsychological tests, through examinations of people who have already shown symptoms of dementia. However, it is known that A-beta oligomers and the fibrils and plaques that follow in the course of the disease up to 20 years before the symptoms appear in the patient's brain and may have already caused irreversible damage. However, in practice there is still no way to diagnose AD before the onset of symptoms.
Es besteht somit weiterhin ein Bedarf an neuen Verbindungen (Wirkstoffen), die sehr spezifisch und mit hoher Affinität an A-Beta-Oligomere binden, und so deren Vermehrung verhindern. Diese Verbindungen sollten keine unerwünschten Nebenwirkungen zeigen, insbesondere keine Immunreaktion hervorrufen. Die Verbindungen sollen außerdem toxische A-Beta-Oligomere und damit auch die kleinen frei diffundierbaren Oligomere in kleinen Konzentrationen erkennen, vollständig vernichten und/oder deren (Prionenähnliche) Vermehrung verhindern.There is therefore still a need for new compounds (active ingredients) which bind very specifically and with high affinity to A-beta oligomers and thus prevent their proliferation. These compounds should not show any undesirable side effects, in particular they should not cause an immune reaction. The compounds should also recognize toxic A-beta oligomers and thus also the small, freely diffusible oligomers in small concentrations, destroy them completely and/or prevent their (prion-like) proliferation.
Des Weiteren besteht auch ein Bedarf an neuen Verbindungen, die als Sonden für die Erkennung und Markierung von A-Beta-Oligomeren einsetzbar sind, insbesondere, wenn die Krankheit noch nicht weit fortgeschritten ist und die Oligomere erst in geringen Konzentrationen auftreten.Furthermore, there is also a need for new compounds that can be used as probes for the recognition and labeling of A-beta oligomers, especially when the disease is not yet advanced and the oligomers are only present at low concentrations.
Weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, Substanzen zur Verfügung zu stellen, die nicht nur auf extrazelluläre A-Beta-Peptide fokussieren, wie die meisten aus dem Stand der Technik bekannten Verbindungen, sondern gezielt lösliche A-Beta-Oligomere binden. Ferner sollen die neuen Verbindungen die Fibrillenbildung von A-Beta-Peptiden hemmen oder verhindern.A further object of the present invention was to provide substances which not only focus on extracellular A-beta peptides, like most of the compounds known from the prior art, but also specifically bind soluble A-beta oligomers. Furthermore, the new compounds are said to inhibit or prevent the fibril formation of A-beta peptides.
Gelöst wird diese Aufgabe durch ein Peptid enthaltend eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 (DO 3), SEQ ID NO: 2 und/oder SEQ ID NO: 3 und/oder Homologe, Fragmente und Teile davon. Gelöst wird diese Aufgabe auch durch Polymere der SEQ ID NO: 1 (DO 3), SEQ ID NO: 2 und/oder SEQ ID NO: 3 und/oder deren Homologe.This object is achieved by a peptide containing an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 1 (DO 3), SEQ ID NO: 2 and/or SEQ ID NO: 3 and/or homologues, fragments and parts thereof. This object is also achieved by polymers of SEQ ID NO: 1 (DO 3), SEQ ID NO: 2 and/or SEQ ID NO: 3 and/or their homologues.
Fragmente und Teile zeigen eine ähnliche beziehungsweise identische Wirkung wie die erfindungsgemäßen Peptide.Fragments and parts show a similar or identical effect as the peptides according to the invention.
In einer Variante bestehen die Peptide gemäß SEQ ID NO: 1 (DO 3), SEQ ID NO: 2 und/oder SEQ ID NO: 3 und deren Homologe im Wesentlichen, bevorzugt mindestens 60%, 75%, 80%, besonders bevorzugt 85%, 90%, 95%, insbesondere 96%, 97%, 98%, 99%, 100% aus D-Aminosäuren.In one variant, the peptides according to SEQ ID NO: 1 (DO 3), SEQ ID NO: 2 and/or SEQ ID NO: 3 and their homologs essentially, preferably at least 60%, 75%, 80%, particularly preferably 85 %, 90%, 95%, especially 96%, 97%, 98%, 99%, 100% of D-amino acids.
Ein Polymer im Sinne der Erfindung ist gebildet aus 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 oder mehr Monomeren ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1 (DO 3), SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 und deren Homologe, die für sich bereits A-Beta-Oligomer. Erfindungsgemäß sind die Polymere aus einem Monomer aufgebaut oder aus einer Kombination von 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 unterschiedlichen oben genannten Monomeren. Monomere und Polymere werden im Folgenden als erfindungsgemäße Peptide bezeichnet.A polymer within the meaning of the invention is formed from 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 or more monomers selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 (DO 3), SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 and their homologues, which are already A beta oligomers by themselves. According to the invention, the polymers are built up from one monomer or from a combination of 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 different monomers mentioned above. In the following, monomers and polymers are referred to as peptides according to the invention.
In einer Variante der Erfindung handelt es sich um ein Peptid mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 und/oder SEQ ID NO: 3 undloder Homologe davon mit einer Identität von 50%. „Homologe Sequenzen“ oder „Homologe“ bedeutet im Sinne der Erfindung, dass eine Aminosäuresequenz eine Identität mit einer der oben genannten Aminosäuresequenz der Monomere von mindestens 50, 55, 60, 65, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ,100 % aufweist. Anstelle des Begriffs „Identität“ werden in der vorliegenden Beschreibung die Begriffe „homolog“ oder „Homologie“ gleichbedeutend verwendet. Die Identität zwischen zwei Nukleinsäuresequenzen oder Polypeptidsequenzen wird durch Vergleich mit Hilfe des Programms BESTFIT basierend auf dem Algorithmus von Smith, T.F. und Waterman, M.S (Adv. Appl. Math. 2: 482-489 (1981)) berechnet unter Einstellung folgender Parameter für Aminosäuren: Gap creation penalty: 8 und Gap extension penalty: 2; und folgender Parameter für Nukleinsäuren: Gap creation penalty: 50 und Gap extension penalty: 3. Bevorzugt wird die Identität zwischen zwei Nukleinsäuresequenzen oder Polypeptidsequenzen durch die Identität der Nukleinsäuresequenz / Polypeptidequenz über die jeweils gesamte Sequenzlänge definiert, wie sie durch Vergleich mit Hilfe des Programms GAP basierend auf dem Algorithmus von Needleman, S.B. und Wunsch, C.D. (J. Mol. Biol. 48: 443-453) unter Einstellung folgender Parameter für Aminosäuren berechnet wird: Gap creation penalty: 8 und Gap extension penalty: 2; und die folgenden Parameter für Nukleinsäuren Gap creation penalty: 50 und Gap extension penalty: 3.In a variant of the invention it is a peptide with the amino acid sequence according to SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 and/or SEQ ID NO: 3 and/or homologues thereof with an identity of 50%. In the context of the invention, "homologous sequences" or "homologs" means that an amino acid sequence has an identity with one of the above-mentioned amino acid sequences of the monomers of at least 50, 55, 60, 65, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76 , 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% . Instead of the term “identity”, the terms “homologous” or “homology” are used interchangeably in the present description. The identity between two nucleic acid sequences or polypeptide sequences is determined by comparison using the BESTFIT program based on the algorithm of Smith, T.F. and Waterman, M.S. (Adv. Appl. Math. 2:482-489 (1981)) calculated setting the following parameters for amino acids: gap creation penalty: 8 and gap extension penalty: 2; and the following parameters for nucleic acids: gap creation penalty: 50 and gap extension penalty: 3. The identity between two nucleic acid sequences or polypeptide sequences is preferably defined by the identity of the nucleic acid sequence/polypeptide sequence over the entire sequence length in each case, as determined by comparison using the program GAP based on the algorithm of Needleman, S.B. and Desire, C.D. (J. Mol. Biol. 48: 443-453) by setting the following parameters for amino acids: gap creation penalty: 8 and gap extension penalty: 2; and the following parameters for nucleic acids gap creation penalty: 50 and gap extension penalty: 3.
Zwei Aminosäuresequenzen sind im Sinne der vorliegenden Erfindung identisch wenn sie die selbe Aminosäuresequenz besitzen.Two amino acid sequences are identical within the meaning of the present invention if they have the same amino acid sequence.
Unter Homologe sind in einer Variante die entsprechenden retro-inversen Sequenzen der oben genannten Monomere zu verstehen. Mit dem Begriff „retro-inverse Sequenz“ wird erfindungsgemäß eine Aminosäuresequenz bezeichnet, die sich aus Aminosäuren in der enantiomeren Form zusammensetzt (invers: Chiralität des alpha-C-Atoms invertiert) und bei der zusätzlich die Sequenzreihenfolge zur ursprünglichen Aminosäuresequenz umgekehrt wurde (retro = rückwärts).In one variant, homologues are to be understood as meaning the corresponding retro-inverse sequences of the abovementioned monomers. According to the invention, the term "retro-inverse sequence" refers to an amino acid sequence which is composed of amino acids in the enantiomeric form (inverse: chirality of the alpha-C atom inverted) and in which the sequence order of the original amino acid sequence was also reversed (retro = backward).
In einer weiteren Variante binden die erfindungsgemäßen Peptide an Teile des Amyloid beta-Peptids.In a further variant, the peptides according to the invention bind to parts of the amyloid beta peptide.
In einer weiteren Variante weisen die erfindungsgemäßen Peptide Sequenzen auf, die sich von den angegebenen Sequenzen um bis zu drei Aminosäuren unterscheiden.In a further variant, the peptides according to the invention have sequences which differ from the specified sequences by up to three amino acids.
Ferner werden als Peptide auch Sequenzen eingesetzt, die die oben genannten Sequenzen enthalten.Furthermore, sequences which contain the above-mentioned sequences are also used as peptides.
In einer weiteren Variante weisen die Peptide Fragmente der oben genannten Sequenzen auf oder weisen homologe Sequenzen zu den oben genannten Sequenzen auf.In a further variant, the peptides have fragments of the abovementioned sequences or have sequences homologous to the abovementioned sequences.
Erfindungsgemäß handelt es sich um ein Peptid zur Verwendung in der Medizin, bevorzugt zur Behandlung der Morbus Alzheimer.According to the invention, it is a peptide for use in medicine, preferably for the treatment of Alzheimer's disease.
In einer Ausführung der vorliegenden Erfindung besteht das Peptid im Wesentlichen aus D-Aminosäuren.In one embodiment of the present invention, the peptide consists essentially of D-amino acids.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff „im Wesentlichen aus D-Aminosäuren“, dass die einzusetzenden Monomere mindestens 60%, bevorzugt 75%, 80%, besonders bevorzugt 85%, 90%, 95%, insbesondere 96%, 97%, 98%, 99%, 100% aus D-Aminosäuren aufgebaut sind.For the purposes of the present invention, the term "essentially from D-amino acids" means that the monomers to be used make up at least 60%, preferably 75%, 80%, particularly preferably 85%, 90%, 95%, in particular 96%, 97%, 98%, 99%, 100% made up of D-amino acids.
In einer weiteren Variante handelt es sich um ein erfindungsgemäßes Peptid zur Hemmung der Fibrillenbildung von Amyloid-Beta-Peptiden. Die erfindungsgemäßen Polymere enttoxifizieren die A-Beta-Oligomere oder daraus gebildete Polymere, sowie Fibrillen, indem sie daran binden und so in nicht toxische Verbindungen überführen. Demgemäß ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung auch ein Verfahren zur Enttoxifizierung der A-Beta-Oligomeren, daraus gebildeten Polymeren oder Fibrillen.Another variant is a peptide according to the invention for inhibiting fibril formation of amyloid beta peptides. The polymers according to the invention detoxify the A-beta oligomers or polymers formed from them, as well as fibrils, by binding to them and thus converting them into non-toxic compounds. Accordingly, the subject matter of the present invention is also a process for detoxifying the A-beta oligomers, polymers or fibrils formed therefrom.
Gegenstand der Erfindung sind in einer Ausführung auch erfindungsgemäße Peptide die mit einer weiteren Substanz verknüpft sind.In one embodiment, the invention also relates to peptides according to the invention which are linked to another substance.
Bei der Verknüpfung handelt es sich im Sinne der Erfindung um eine chemische Bindung wie sie in Römpp Chemie Lexikon, 9. Auflage, Band 1, Seite 650 ff, Georg Thieme Verlag Stuttgart definiert ist, bevorzugt um eine Hauptvelenz Bindung, insbesondere eine kovalente Bindung.In the context of the invention, the link is a chemical bond as defined in Rompp Chemie Lexikon, 9th edition,
Bei den Substanzen handelt es sich in einer Variante um Arzneimittel oder Wirkstoffe, definiert gemäß Arzneimittelgesetz §2 beziehungsweise. §4 (19), Stand September 2012. In einer Alternative sind Wirkstoffe therapeutisch aktive Stoffe die als arzneilich wirksame Stoffe verwendet werden. Bevorzugt werden Entzündungshemmer eingesetzt.In one variant, the substances are drugs or active ingredients, defined in accordance with the Drugs Act §2 or. §4 (19), as of September 2012. In an alternative, active substances are therapeutically active substances that are used as medicinally active substances. Anti-inflammatory drugs are preferred.
Bei den Substanzen handelt es sich in einer weiteren Variante um Verbindungen die die Wirkung der Peptide verstärken.In another variant, the substances are compounds that enhance the effect of the peptides.
In einer Alternative sind solche Verbindungen Aminopyrazol und/oder Aminopyrazolderivate. Aminopyrazolderivate im Sinne der Erfindung ist 3-Aminopyrazol-5-carbonsäure oder 3-Nitropyrazol-5-carbonsäure sowie alle Abkömmlinge, in denen die heterocyclische CH-Gruppe gegen -CR- oder -N- oder -O- oder -S- ausgetauscht wurde, sowie alle daraus abgeleiteten peptidischen Dimere, Trimere oder -Tetramere, bevorzugt Aminopyrazol-Trimer.In an alternative, such compounds are aminopyrazole and/or aminopyrazole derivatives. Aminopyrazole derivatives in the context of the invention are 3-aminopyrazole-5-carboxylic acid or 3-nitropyrazole-5-carboxylic acid and all derivatives in which the heterocyclic CH group has been replaced by -CR- or -N- or -O- or -S- , and all peptidic dimers, trimers or tetramers derived therefrom, preferably aminopyrazole trimer.
In einer weiteren Alternative handelt es sich um Verbindungen die die Löslichkeit der Peptide und/oder die Passage der Blut-Hirn-Schranke verbessern.Another alternative involves compounds that improve the solubility of the peptides and/or the passage of the blood-brain barrier.
In einer Alternative haben die Peptide erfindungsgemäß jede beliebige Kombination von mindestens zwei oder mehr Merkmalen der oben beschriebenen Varianten, Ausführungen und/oder Alternativen.In an alternative, the peptides according to the invention have any combination of at least two or more features of the variants, embodiments and/or alternatives described above.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein erfindungsgemäßes Peptid zur Bindung an aggregierte A-Beta-Peptide.The invention also relates to a peptide according to the invention for binding to aggregated A-beta peptides.
Weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen Peptids durch Peptidsynthese, wie zum Beispiel dem Fachmann bekannt, organische Synthesemethoden für beliebige Verbindungen mit geringem Molekulargewicht (low-molecular weight compounds) und/oder Mutagenese und rekombinante Herstellung.Another object of the invention is a method for producing the peptide according to the invention by peptide synthesis, such as known to those skilled in the art, organic synthesis methods for any compounds with low molecular weight (low-molecular weight compounds) and / or mutagenesis and recombinant production.
Die Erfindung betrifft ferner auch eine Zusammensetzung enthaltend das erfindungsgemäße Peptid, insbesondere zur Behandlung von Morbus Alzheimer.The invention also relates to a composition containing the peptide according to the invention, in particular for the treatment of Alzheimer's disease.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner eine Zusammensetzung enthaltend das erfindungsgemäße Peptid, insbesondere zur Verhinderung von toxischen A-Beta-Oligomeren, oder zur Zerstörung von daraus gebildeten Polymere oder Fibrillen.The subject matter of the present invention is also a composition containing the peptide according to the invention, in particular for preventing toxic A-beta oligomers, or for destroying polymers or fibrils formed therefrom.
Die erfindungsgemäße „Zusammensetzung“ kann z. B. ein Impfstoff, ein Medikament (z. B. in Tablettenform), eine Injektionslösung, ein Nahrungs- oder Nahrungsergänzungsmittel sein, enthaltend das erfindungsgemäße Peptid in einer aufgrund des Fachwissens herzustellenden Formulierung.The "composition" according to the invention can, for. B. a vaccine, a drug (z. B. in tablet form), a solution for injection, a food or dietary supplement containing the peptide according to the invention in a formulation to be produced on the basis of expert knowledge.
Die Erfindung betrifft ferner auch ein KIT enthaltend das erfindungsgemäße Peptid.The invention also relates to a KIT containing the peptide according to the invention.
In einem solchen KIT können die erfindungsgemäßen Peptide in Behältern ggf. mit/in Puffern oder Lösungen verpackt sein. Alle Komponenten des KITs können in demselben Behälter oder getrennt voneinander verpackt sein. Ferner kann das KIT Anweisungen für dessen Gebrauch enthalten. Ein solches KIT kann beispielsweise die erfindungsgemäßen in einer Injektionsflasche mit Stopfen und/oder Septum enthalten. Ferner kann darin beispielsweise auch eine Einmal-Spritze enthalten sein.In such a KIT, the peptides according to the invention can be packaged in containers, optionally with/in buffers or solutions. All the components of the KIT can be packed in the same container or separately from each other. Furthermore, the KIT may contain instructions for its use. Such a KIT can contain, for example, the substances according to the invention in an injection bottle with a stopper and/or septum. Furthermore, it can also contain a disposable syringe, for example.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung des erfindungsgemäßen Peptids als Sonde zur Identifizierung, qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung von Amyloid-Beta-Oligomeren oder Fibrillen. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch eine Sonde, enthaltend das erfindungsgemäße Peptid zur Identifizierung, qualitativen undloder quantitativen Bestimmung von Amyloid-Beta-Oligomeren.Another object of the present invention is the use of the peptide according to the invention as a probe for the identification, qualitative and/or quantitative determination of amyloid beta oligomers or fibrils. The subject matter of the present invention is also a probe containing the peptide according to the invention for the identification, qualitative and/or quantitative determination of amyloid beta oligomers.
Solche Sonden sind von großer Bedeutung, da damit eine frühe Diagnose der AD möglich wird. Mit der Frühdiagnose kann der Krankheit schon in einem sehr frühen Stadium entgegengewirkt werden.Such probes are of great importance as they enable early diagnosis of AD. With early diagnosis, the disease can be counteracted at a very early stage.
Solche molekularen Sonden enthalten das erfindungsgemäße Polymer und gegebenenfalls Farbstoffe, Fluoreszenzfarbstoffe, radioaktive Isotope, (PET etc.), Gadolinium (MRI), sowie alternative Stoffe geeignet für die Bildgebung der Sonden und können den Patienten z.B. intravenös injiziert werden. Nach Passage über die Bluthirnschranke können die Sonden an A-Beta-Oligomere und/oder Plaques binden. Die so markierten A-Beta-Oligomere und/oder Plaques können mittels bildgebender Verfahren wie z.B. SPECT, PET, CT, MRT, Protonen-MR-Spektroskopie usw. sichtbar gemacht werden.Such molecular probes contain the polymer according to the invention and optionally dyes, fluorescent dyes, radioactive isotopes (PET etc.), gadolinium (MRI), as well as alternative substances suitable for imaging the probes and can be injected intravenously into the patient, for example. After passage across the blood-brain barrier, the probes can bind to A-beta oligomers and/or plaques. The A-beta oligomers and/or plaques labeled in this way can be visualized using imaging methods such as SPECT, PET, CT, MRI, proton MR spectroscopy, etc.
Ferner betrifft die Erfindung auch die Verwendung des Peptids zur Verhinderung von Amyloid-Beta-Oligomeren und/oder Amyloid-Beta-Peptid-Aggregaten und/oder Amyloid-Beta-Fibrillen.The invention also relates to the use of the peptide to prevent amyloid beta oligomers and/or amyloid beta peptide aggregates and/or amyloid beta fibrils.
Das erfindungsgemäße Peptid wird auch zur Enttoxifizierung von toxischen Amyloid-Beta-Oligomeren und/oder Aggregaten verwendet. insbesondere wird es verwendet, um an Amyloid-Beta-Oligomere und/oder Aggregate zu binden und so amorphe, nicht toxische Aggregate zu bilden.The peptide of the invention is also used to detoxify toxic amyloid beta oligomers and/or aggregates. in particular, it is used to bind to amyloid beta oligomers and/or aggregates to form amorphous, non-toxic aggregates.
Weiterer Gegenstand ist die Verwendung des erfindungsgemäßen Peptids als Therapeutikum von Morbus Alzheimer.Another object is the use of the peptide according to the invention as a therapeutic agent for Alzheimer's disease.
Die erfindungsgemäßen Peptide binden besonders gut an A-Beta-Oligomere, insbesondere an lösliche A-Beta-Oligomere. In einer Ausführung der Erfindung besitzen die Peptide gemäß SEQ ID NO: 2 und/oder SEQ ID NO: 3 durch die angefügten Sequenzen (und Arginine) eine erhöhte Bluthirnschrankengängigkeit und/oder Löslichkeit als das Peptid laut SEQ ID NO. 1.The peptides according to the invention bind particularly well to A beta oligomers, in particular to soluble A beta oligomers. In one embodiment of the invention, the peptides according to SEQ ID NO: 2 and/or SEQ ID NO: 3 have an increased blood-brain barrier penetration and/or solubility than the peptide according to SEQ ID NO. 1.
Eine besonders starke Bindung der erfindungsgemäßen Peptide an die Zielmoleküle wird durch eine hohe Spezifität und/oder Affinität zu dem Zielmolekül der erfindungsgemäßen Peptide hervorgerufen. Die gebildeten Komplexe haben eine geringe Dissoziationskonstante (KD-Wert).A particularly strong binding of the peptides according to the invention to the target molecules is brought about by a high specificity and/or affinity for the target molecule of the peptides according to the invention. The complexes formed have a low dissociation constant (KD value).
Komplexe gebildet aus A-Beta-Monomeren und den erfindungsgemäßen Peptiden haben eine KD-Wert von höchstens 3 µM, 2 pM, bevorzugt 1 µM, besonders bevorzugt 0,5 µM, insbesondere 0,4 µM, 0,3 µM.Complexes formed from A-beta monomers and the peptides according to the invention have a KD value of at most 3 μM, 2 μM, preferably 1 μM, particularly preferably 0.5 μM, in particular 0.4 μM, 0.3 μM.
Komplexe gebildet aus A-Beta-Oligomeren und den erfindungsgemäßen Peptiden haben eine KD-Wert von höchstens 3 µM, 2 µM, 1 µM, bevorzugt 0,5 µM, 04 µM, 0,3 µM, besonders bevorzugt 0,2 µm, 0,1 µM, insbesondere 0,05 µM, 0,04 µM.Complexes formed from A-beta oligomers and the peptides according to the invention have a KD value of at most 3 μM, 2 μM, 1 μM, preferably 0.5 μM, 04 μM, 0.3 μM, particularly preferably 0.2 μm, 0 .1 µM, especially 0.05 µM, 0.04 µM.
Komplexe gebildet aus A-Beta-Fibrillen und den erfindungsgemäßen Peptiden haben eine KD-Wert von höchstens 3 µM, 2 µM, 1 µM, bevorzugt 0,8 µm, besonders bevorzugt 0,5 µM, 04 µM, 0,3 µM, insbesondere 0,2 pM.Complexes formed from A-beta fibrils and the peptides according to the invention have a KD value of at most 3 μM, 2 μM, 1 μM, preferably 0.8 μm, particularly preferably 0.5 μM, 04 μM, 0.3 μM, in particular 0.2 pM.
Die erfindungsgemäßen Sequenzen, insbesondere SEQ ID NO: 1, binden bevorzugt an aggregierte (oligomere) Formen des A-Beta-Peptids. Die Bindung ist stärker als die der aus dem Stand der Technik bekannten D1- und D3-Peptide.The sequences according to the invention, in particular SEQ ID NO: 1, preferentially bind to aggregated (oligomeric) forms of the A-beta peptide. The binding is stronger than that of the prior art D1 and D3 peptides.
Die erfindungsgemäßen Peptide, insbesondere SEQ ID NO: 1, hemmt die Fibrillenbildung von A-Beta-Peptiden sehr effizient.The peptides according to the invention, in particular SEQ ID NO: 1, very efficiently inhibit the fibril formation of A-beta peptides.
Ferner binden die erfindungsgemäßen Peptide, insbesondere SEQ ID NO: 1, an A-Beta-Oligomere, wodurch amorphe Aggregate gebildet werden - wie durch dynamische Lichtstreuung bewiesen - die im ThT-Test negativ sind.Furthermore, the peptides according to the invention, in particular SEQ ID NO: 1, bind to A-beta oligomers, as a result of which amorphous aggregates are formed - as evidenced by dynamic light scattering - which are negative in the ThT test.
Weiterer Gegenstand ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Peptide in einem Verfahren zur Behandlung (in vitro, ex vivo) von Blut, Blutprodukten und/oder Organen, dadurch gekennzeichnet, dass das Blut, die Blutprodukte und/oder Organe dem menschlichen oder tierischen Körper entnommen werden und A--Beta-Oligomere entfernt und/oder enttoxifiziert werden.Another subject is the use of the peptides according to the invention in a method for the treatment (in vitro, ex vivo) of blood, blood products and / or organs, characterized in that the blood, blood products and / or organs are taken from the human or animal body and A--beta oligomers are removed and/or detoxified.
Beispieleexamples
Mittels Spiegelbild-Phagendisplay wurden Peptidsequenzen selektiert, die sich durch die Eigenschaft auszeichnen, spezifisch A-Beta-1-42 Oligomere zu binden. Momentan wird angenommen, dass frei diffundierende Oligomere für die Zellen am schädlichsten wirken. Für die Selektion wurden Oligomere von D-enantiomerem A-Beta-Monomeren mittels Gelfiltrationschromatographie präpariert und als Zielmoleküle im Spiegelbild-Phagendisplay eingesetzt. Im Verlauf der Phagendisplays wurde das Peptid mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1 als selektierter Ligand identifiziert.Using mirror image phage display, peptide sequences were selected which are characterized by the property of specifically binding A-beta-1-42 oligomers. It is currently believed that freely diffusing oligomers are most damaging to cells. For selection, oligomers of D-enantiomeric A-beta monomers were prepared by gel filtration chromatography and used as targets in mirror-image phage display. In the course of the phage displays, the peptide with the amino acid sequence SEQ ID NO: 1 was identified as the selected ligand.
Die D-enantiomere Form dieses Peptids, mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1, das DO3 genannt wurde, wurde bezüglich seiner in vitro-Bindung an verschiedene A-Beta-Konformere (Monomere, -Oligomere, -Fibrillen) im ELISA getestet. Für DO3 wurden relativ hohe Affinitäten für sämtliche Konformere im ELISA nachgewiesen (
Weiterhin wurde DO3 im Thioflavin T (ThT)-Aggregationstest eingesetzt. ThT ist ein Fluoreszenzfarbstoff, der an beta-Faltblatt-reiche Strukturen verschiedener amyloider Proteine bindet und nach der Anregung bei 440 nm fluoresziert. Die Emission kann auf diese Weise mit dem relativen Fibrillengehalt in der Probe korreliert werden. ThT-Tests werden zur Messung der Fibrillation von A-Beta-Monomeren genutzt und vor allem bei Liganden verwendet, um eine mögliche inhibitorische Wirkung dieser auf die A-Beta-Aggregation nachzuweisen. DO3 wurde in verschiedenen molaren Verhältnissen mit einer 10 µM A-Beta-Monomer-Lösung eingesetzt. Fünfzehn Stunden später, nach Erreichen der Sättigungsphase in der A-Beta-Kontrolle ohne Zusatz von Liganden, wurde die ThT-Fluoreszenz der Koinkubation von D-Peptiden und A-Beta-Monomeren ausgewertet und prozentual in Abhängigkeit von der A-Beta-Kontrollinkubation dargestellt. Dabei zeigt sich, das DO3 die A-Beta-Fibrillenbildung deutlich reduziert (
Da für DO3 eine starke Inhibition der Fibrillation von A-Beta-1-42 beobachtet wurde, erfolgten zusätzliche Messungen mit dynamischer Lichtstreuung, um die Aggregatbildung im Allgemeinen, unabhängig von der Sekundärstruktur der Partikel, zu verfolgen. Hierfür wurden 5 µM A-Beta-1-42-Monomere und DO3 ebenfalls im Verhältnis 10:1, 2:1 sowie 1:1 untersucht. Es zeigte sich, dass eine Aggregatbildung in Anwesenheit von Dβ3 stattgefunden hat (
Messungen mittels Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie weisen eine Bindung von DO3 an N-terminal biotinylierte A-Beta-Monomere, A-Beta-Oligomere und A-Beta-Fibrillen (letztere bestehend aus 10 % N-terminal biotinyliertem A-Beta-Monomeren und 90 % nicht-biotinyliertem A Beta-Monomeren nach (
DO3 bindet an alle getesteten A-Beta-Konformere sehr affin (siehe
Figurenlistecharacter list
-
1 : ELISA zur relativen Quantifizierung der Bindung von DO3-FITC an verschiedene Aß1-42-Konformere. Seediess-Monomere aus Carboxy-terminal biotinyliertem Aß, Monomere und Oligomere aus Aminoterminal biotinyliertem Aß und Fibrillen, die aus 10% aminoterminal biotinyliertem Aß und 90% nichtbiotinlyiertem Aß bestehen, wurden zu je 5 µg/ml immobilisiert und das D-Peptid in einer Konzentration von 10 und 20 µg/ml appliziert. Dargestellt ist die relative Quantifizierung der Bindung der Peptide in einer zweifachen Bestimmung als Absorption (AU = absorption unit) bei 450 nm nach Abzug der Hintergrundabsorption.1 : ELISA for relative quantification of DO3-FITC binding to different Aß1-42 conformers. Seediess monomers of carboxy-terminally biotinylated Aß, monomers and oligomers of aminoterminally biotinylated Aß and fibrils consisting of 10% aminoterminally biotinylated Aß and 90% non-biotinylated Aß were immobilized at 5 µg/ml each and the D-peptide in one concentration of 10 and 20 µg/ml applied. The relative quantification of the binding of the peptides in a duplicate determination as absorption (AU=absorption unit) at 450 nm after subtracting the background absorption is shown. -
2 : ThT-Aggregationstest von A-Beta-1-42 zur Quantifizierung des relativen Fibrillengehalts in Gegenwart von DO3. Die Konzentration von A-Beta-Monomer betrug 10 µM, DO3 wurde im Verhältnis von 10:1, 2:1 und 1:1 (A-Beta-Monomere:DO3) sowie als Kontrolle einzeln in einer 1, 5 und 10 µM Konzentration gemessen. Die Fluoreszenz von 10 µM A-Beta-Monomer wurde als 100 % gesetzt und die Werte und Standardabweichungen der übrigen Inkubationen sind als prozentuale Anteile dieses Maximalwerts angegeben. RFU: relative Fluoreszenzeinheiten2 : ThT aggregation assay of A-beta-1-42 to quantify relative fibril content in the presence of DO3. The concentration of A-beta monomer was 10 µM, DO3 was used in the ratio of 10:1, 2:1 and 1:1 (A-beta monomer:DO3) and as a control individually in a 1, 5 and 10 µM concentration measured. The fluorescence of 10 µM A-beta monomer was set as 100% and the values and standard deviations of the remaining incubations are given as percentages of this maximum value. RFU: relative fluorescence units -
3 : Zeitabhängige Messung der dynamischen Lichtstreuung von Aß1-42 in Gegenwart von DO3. Dargestellt ist der hydrodynamische Radius der Partikel in Abhängigkeit von der Zeit. Rechts angegeben sind molare Verhältnisse von Aβ1-42 und DO3.3 : Time-dependent measurement of the dynamic light scattering of Aβ1-42 in the presence of DO3. The hydrodynamic radius of the particles is shown as a function of time. Indicated on the right are molar ratios of Aβ1-42 and DO3. -
4 : Messung der Bindung von DO3 an A-Beta-Monomere (4a) , Oligomere (4b) und Fibrillen4c ). Auf verschiedenen Flusszellen wurden jeweils N-terminal biotinylierte A-Beta-1-42-Monomere und Oligomere/Fibrillen (bestehend aus 10 % N-terminal biotinyliertem A-Beta-Monomeren und 90 % nicht-biotinyliertem A-Beta-Monomeren) immobilisiert.4 : Measurement of DO3 binding to A-beta monomers (4a) , oligomers (4b) and fibrils4c ). N-terminally biotinylated A-beta-1-42 monomers and oligomers/fibrils (consisting of 10% N-terminally biotinylated A-beta monomers and 90% non-biotinylated A-beta monomers) were immobilized on different flow cells.
Die Messung erfolgte unter nativen Pufferbedingungen und bei 25 °C bei einer Flussrate von 30 µl/min.The measurement took place under native buffer conditions and at 25 °C at a flow rate of 30 µl/min.
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