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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zur automatisierten Positionierung
eines Entnahmewerkzeugs zur Entnahme von Zellobjekten sowie Verwendungen
des Verfahrens. Weiterhin betrifft die Erfindung eine Vorrichtung
zur automatisierten Positionierung eines Entnahmewerkzeugs.
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Zur
Ernte von sehr kleinen Zellkolonien, Einzelzellen oder Teilen von
Zellkolonien oder Einzelzellen, die im Folgenden allgemein als Zellobjekt
bezeichnet werden, ist eine sehr genaue Positionierung eines durch
ein Aufnahmeelement aufgenommenen Entnahmewerkzeugs, d. h. einer
Kapillare oder Kanüle, in einer bestimmten, geringen Differenzhöhe über
dem zu erntenden Zellobjekt notwendig.
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Die
Herstellung entsprechend präziser Entnahmewerkzeuge sowie
deren Positionierung mit einer Genauigkeit im Bereich einiger Mikrometer
sind technisch meist möglich. Jedoch lassen sich vor allem
gezogene Glaskapillaren – welche meist zur Ernte von Einzelzellen
verwendet werden – nur sehr schwer exakt genug fertigen,
um deren Anwendung automatisieren zu können.
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Aus
der
DE 102 53 939
A1 ist eine teilweise vollautomatische Kalibrierung des
verwendeten Entnahmewerkzeugs vor der Entnahme des Zellobjekts bekannt,
die eine genaue Positionierung nicht exakt gleicher Entnahmewerkzeuge
ermöglicht. Die Kalibrierung erfolgt dadurch, dass jedes
Entnahmewerkzeug mittels zweier in einer horizontalen Ebene rechtwinklig
zu einander verlaufenden und in vertikaler Richtung minimal versetzten
Laserstrahlen vermessen wird. Die Spitze des Entnahmewerkzeugs wird
anschließend zu einem festen Hilfspunkt bewegt, der den
Nullpunkt eines Koordinatensystems darstellt. Von dort aus erfolgt
anschließend eine Bewegung des Entnahmewerkzeugs zum Zellobjekt.
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Ein
großes Problem stellen jedoch die in Laboren verwendeten
Probenbehälter in Form von Petrischalen und Titerplatten
unterschiedlichster Größen, Formen und Materialen
dar. Diese üblicherweise eingesetzten Probenbehälter
verfügen nicht über ausreichend ebene Bilden,
um mit einem einmaligen Kalibrierschritt bzw. einer zumutbaren Anzahl
an Kalibrierungsschritten die entsprechende Höhenposition
der Spitze des Entnahmewerkzeugs für den jeweilig zu bearbeitenden
Probenbehälter allgemeingültig einzustellen. Die
Anwendung hochpräziser Behälter ist sehr kostenintensiv
und für viele Applikationen auf Grund benötigter
besonderer Beschichtungen nicht möglich.
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Auf
Grund dieser Problematik ist die Ernte kleiner, nicht bzw. wenig
adhärenter Zellobjekte nicht sicher automatisierbar, da
die Sogwirkung, welche zur Aufnahme der Zellobjekte verwendet wird,
stark abhängig von der Entfernung bzw. der Position des Entnahmewerkzeugs
in Bezug auf das Zellobjekt ist. Fehlernten bzw. die Ernte nicht
gewünschter benachbarter Zellobjekte sind die Folge.
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Der
Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, eine genauere Positionierung
des Entnahmewerkzeugs gegenüber dem zu entnehmenden Zellobjekt
zu ermöglichen.
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Diese
Aufgabe wird durch ein Verfahren nach Anspruch 1 und eine Vorrichtung
nach Anspruch 12 gelöst. Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen
der Erfindung sind in den Unteransprüchen enthalten.
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Erfindungsgemäß besteht
die Lösung der Aufgabe in einem Verfahren zur automatisierten
Positionierung eines Entnahmewerkzeugs zur Entnahme von Zellobjekten,
wobei das Entnahmewerkzeug von einem Aufnahmeelement an einem Werkzeugkopf
aufgenommen, die räumliche Position des Zellobjektes in
einem Probenbehälter mittels einer Bildaufnahmeeinheit
und einer Bildauswerteeinheit erfasst und das Entnahmewerkzeug mittels
einer Steuer- und Speichereinheit und einer Verfahrmechanik zuerst
in eine Kalibrierposition und dann in eine Position über
dem Zellobjekt verfahren werden. Anschließend erfassen
die Bildaufnahmeeinheit und die Bildauswerteeinheit auch die räumliche
Position des Entnahmewerkzeugs über dem Zellobjekt und
ermitteln eine Abweichung von der erforderlichen Position. Die Steuer-
und Speichereinheit korrigiert dann die Position des Entnahmewerkzeugs
mittels der Verfahrmechanik.
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Das
Erfassen und Korrigieren der Position des Entnahmewerkzeugs über
dem Zellobjekt ermöglicht eine hochpräzise Positionierung
des Entnahmewerkzeugs vor der Aufnahme des Zellobjekts. Der Wesentliche
Vorteil dieser vollständigen Kalibrierung ist, dass keine
aufwändige Zusatzeinrichtung, wie sie z. B. in der
DE 10 253 939 A1 beschrieben
ist, benötigt wird.
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In
einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung erfassen die Bildaufnahmeeinheit
und die Bildauswerteeinheit die vertikale Position des Entnahmewerkzeugs
in der Kalibrierposition. Anschließend werden das Entnahmewerkzeug
angehoben und zum Zellobjekt verfahren, die vertikale Position des
Zellobjektes erfasst und der vertikale Abstand des Entnahmewerkzeugs
zum Zellobjekt auf eine vorgegebene Differenzhöhe verkleinert.
Dadurch wird der Abstand des Entnahmewerkzeugs gegenüber
dem Zellobjekt optimal eingestellt. Dies ist besonders bei unebenen
Böden von Probenbehältern vorteilhaft, bei denen
die vertikale Position der Zellobjekte variiert.
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Die
Bildaufnahmeeinheit erfasst die Position des Entnahmewerkzeugs und/oder
des Zellobjekts mittels eines Fokussiersystems. Das Fokussiersystem
ermöglicht insbesondere eine Ermittlung der vertikalen
Position des Entnahmewerkzeugs bzw. des Zellobjekts.
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Zweckmäßigerweise
werden das Entnahmewerkzeug nach der Positionierung vertikal auf
das Zellobjekt zu bewegt und der Werkzeugkopf und/oder das Aufnahmeelement
und/oder das Entnahmewerkzeug bei einer Kollision des Entnahmewerkzeugs
mit dem Boden des Probenbehälters abgefedert. Das Abfedern
verhindert eine Verformung bzw. einen Bruch der empfindlichen Entnahmewerkzeuge,
die oft aus Glas hergestellt sind.
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Die
Bildaufnahmeeinheit und die Bildauswerteeinheit überwachen
die Bewegung des Entnahmewerkzeugs und senden bei einer Kollision
ein Signal an die Steuerung. Auf diese Weise kann durch die bereits
vorhandenen Komponenten, d. h. der Bildaufnahmeeinheit und der Bildauswerteeinheit,
eine Kollision an das System oder an den Benutzer gemeldet werden.
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Vorzugsweise
erfasst ein Sensor am Entnahmewerkzeug und/oder Aufnahmeelement
und/oder Werkzeugkopf bei einer Kollision eine Relativbewegung zwischen
dem Entnahmewerkzeug und dem Aufnahmeelement und/oder zwischen dem
Aufnahmeelement und dem Werkzeugkopf und sendet ein Signal an die
Steuerung. Ein Sensor stellt ein einfaches, aber hochwirksames Mittel
zur Erkennung einer Kollision dar.
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In
einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung stoppt
die Steuerung mittels der Verfahrmechanik die Bewegung des Entnahmewerkzeugs
und verfährt das Entnahmewerkzeug in eine Position mit
einem vorgegebenen vertikalen Abstand zum Boden des Probenbehälters.
Durch das Stoppen der Bewegung wird zusätzlich zum oben
beschriebenen Abfedern eine Verformung bzw. ein Bruch des Entnahmewerkzeugs
verhindert. Das anschließende Verfahren des Entnahmewerkzeugs
in einen vorgegebenen Abstand zum Boden des Probenbehälters
begünstigt eine neue Positionierung und Bewegung des Entnahmewerkzeugs
zum nächsten Zellobjekt.
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Vorzugsweise
wird das Verfahren zur Entnahme von Zellobjekten aus Behältern
mit unebenen Böden im Bereich der Zellbiologie oder Biochemie, insbesondere
bei Beads verwendet. In diesem Bereich kommt es aufgrund der mikroskopisch
kleinen Abmessungen der Zellobjekte besonders auf Präzision
an.
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Weiterhin
wird die Aufgabe durch eine erfindungsgemäße Vorrichtung
zur automatisierten Positionierung eines Entnahmewerkzeugs für
das oben beschriebene Verfahren gelöst. Das Entnahmewerkzeug
ist mittels eines Aufnahmeelements an einem Werkzeugkopf eines Robotsystems
zur Aufnahme von Zellobjekten aus dem Probenbehälter aufgenommen.
Die Vorrichtung weist mindestens eine Bildaufnahmeeinheit mit einer
Bildauswerteeinheit, eine Steuerung und eine Verfahrmechanik auf.
Die Bildaufnahmeeinheit, die Bildauswerteeinheit, die Steuerung
und die Verfahrmechanik bilden einen Regelkreis zur Positionierung des
Entnahmewerkzeugs. Der Regelkreis ermöglicht eine hoch
präzise Einstellung der Position des Entnahmewerkzeugs.
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Die
Bildaufnahmeeinheit umfasst zweckmäßig eine Mikroskopeinheit
mit einem motorisierten Fokussiersystem. Eine Mikroskopeinheit eignet
sich besonders gut zur Erkennung der Zellobjekte. Ein motorisiertes
Fokussiersystem ermöglicht außerdem ein hochpräzises
Messen der vertikalen Position des Zellobjekts bzw. des Entnahmewerkzeugs.
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Vorzugsweise
umfasst das motorisierte Fokussiersystem eine Autofokuseinrichtung.
Durch die automatische Fokussiereinrichtung kann die Erkennung der
vertikalen Position des Zellobjekts bzw. des Entnahmewerkzeugs weiter
automatisiert werden.
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In
einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung weisen der Werkzeugkopf
eine Federung für das Aufnahmeelement und/oder das Aufnahmeelement
eine Federung für das Entnahmewerkzeug auf. Die Federung
verhindert eine Verformung bzw. einen Bruch des empfindlichen Entnahmewerkzeugs
bei einer Kollision mit dem Boden des Probenbehälters.
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Der
Werkzeugkopf und/oder das Aufnahmeelement und/oder das Entnahmewerkzeug
umfassen mindestens einen Sensor. Mit Hilfe des Sensors kann eine
Kollision des Entnahmewerkzeugs mit dem Boden des Probenbehälters
mit einem einfachen Mittel erkannt werden.
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Vorzugsweise
ist der Sensor ein optischer Sensor, insbesondere eine Lichtschranke.
Optische Sensoren sind ein bewährtes Mittel zum Erkennen von
Bewegungen.
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Nachfolgend
wird das erfindungsgemäße Verfahren anhand einer
Vorrichtung zur automatisierten Positionierung eines Entnahmewerkzeugs
und von drei Ausführungsbeispielen beschrieben. Es zeigen:
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1 eine
Ansicht der Vorrichtung,
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2 ein
Entnahmewerkzeug und einen Z-Stapel.
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Die
Ausführungsbeispiele beschreiben:
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die vertikale Positionierung des Entnahmewerkzeugs,
- 2. das Verhindern einer Beschädigung des Entnahmewerkzeugs
und
- 3. die vertikale und horizontale Positionierung des Entnahmewerkzeugs.
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1 zeigt
eine Vorrichtung zur automatisierten Positionierung eines Entnahmewerkzeugs 10a.
Die Vorrichtung enthält eine Mikroskopeinheit 1 mit
einer Reihe optischer Komponenten, insbesondere eine Anordnung aus
Umlenkprismen 1a und ein Linsensystem 1b für
eine Strahlenführung und mikroskopische Abbildung. Die
Mikroskopeinheit 1 ist mit einer Bildaufnahmeeinheit 2,
in der Regel einer CCD-Kamera bzw. einem CCD-Feld, gekoppelt. Zur Verarbeitung
der aus der Bildaufnahmeeinheit 2 ausgelesenen Bildinformation
ist eine Bildauswerteeinheit 3a vorgesehen. Die Bildauswerteeinheit 3a befindet
sich in einem Personal Computer 3 und besitzt eine auf
ihr ablaufende Bildverarbeitungssoftware. Weiterhin ist eine Steuer-
und Speichereinheit 4 vorgesehen, die in den Personal Computer 3 integriert ist
und deren Funktionen durch weitere Softwarekompo nenten ausgeführt
werden. Die Steuer- und Speichereinheit 4 weist einen Monitor
bzw. ein Display 4a auf.
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Die
Vorrichtung enthält weiterhin ein Erntemodul 5,
das auf einer Verfahrmechanik montiert ist. Die Verfahrmechanik
besteht aus einer Hubsäule 5a und einem Verfahrantrieb 5b und
wird von der Steuer- und Speichereinheit 4 gesteuert. Die
Hubsäule 5a und der Verfahrantrieb 5b sind
für größere Verfahrwege ausgelegt und
dienen dem Heranführen des Erntemoduls 5 an eine
in einem Probenbehälter 8 befindliche Zellkultur
und einer Grobeinstellung des Erntemoduls 5 dessen an einem
Werkzeugkopf 10 gehaltertes Entnahmewerkzeug 10a bis über
den Probenbehälter 8 verfahrbar ist. Die hoch
präzise Positionierung des Entnahmewerkzeugs 10a über
einem im Probenbehälter 8 befindliches Zellobjekt
erfolgt mittels eines Regelkreises, der aus der Bildaufnahmeeinheit 2,
der Bildauswerteeinheit 3a, der Steuer- und Speichereinheit 4 und
der Verfahrmechanik gebildet wird. Nach dem Aufnahmen des Zellobjekts
mittels des Entnahmewerkzeugs 10a bewegen die Hubsäule 5a und
der Verfahrantrieb 5b das Entnahmewerkzeug 10a zu
den entsprechenden Vereinzelungsstationen 11 für
die entnommenen Zellobjekte.
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Die
erwähnte Mikroskopeinheit 1 ist als ein Durchlichtmikroskop
ausgebildet. Hierzu ist eine Beleuchtung 6 mit einer Reihe
von zuschaltbaren Beleuchtungsfiltern 7 vorgesehen. Die
Beleuchtung 6 durchstrahlt die in dem Probenbehälter 8 liegende Zellkultur.
Der Probenbehälter 8 ist auf einem motorisierten
xy-Tisch 9 befestigt, mit dem die Zellkultur mit einer
mikroskopischen Einstellgenauigkeit von einigen Mikrometern sowohl
in x- als auch in y-Richtung unter der optischen Anordnung aus Beleuchtung 6 und
darunter befindlichem Umlenkprisma 1a bewegt werden kann.
Dabei werden die Stellkoordinaten des xy-Tisches 9 an die
Speicher- und Steuereinheit 4 übertragen bzw.
von der Speicher- und Steuereinheit 4 eingestellt.
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Die
Mikroskopeinheit 1 besteht aus einem handelsüblichen
inversen Mikroskopstativ, auf dem sich der motorisierte xy-Tisch 9 befindet.
Optional kann diese Mikroskopeinheit 1 auch mit einer handelsüblichen
Fluoreszenzeinrichtung ausgerüstet werden. Außerdem
wird die Bildaufnahmeeinheit 2 mit CCD-Chip auf der Mikroskopeinheit 1 montiert, durch
welche ein Abscannen der Zellobjekte möglich ist. Ein der
Mikroskopeinheit 1 zugeordnetes, nicht näher dargestelltes,
motorisiertes Fokussiersystem ermöglicht ein präzises
Erfassen der Position des jeweils aufzunehmenden Zellobjekts. Das
motorisierte Fokussiersystem umfasst außerdem eine Autofokusfunktion,
durch die das Erfassen der Position des Zellobjekts automatisiert
abläuft.
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Der
handelsübliche Personal Computer 3 ist über
eine Netzwerkverbindung mit der Mikroskopeinheit 1 und
der Verfahrmechanik verbunden. Auf dem Personal Computer 3 läuft
eine handelsübliche Standardbildverarbeitungssoftware ab,
welche zusammen mit der Steuer- und Speicheinheit 4, der
Bildauswerteeinheit 3a sowie Modulen für diese
Bildverarbeitungssoftware die Steuerung der Verfahrmechanik und
die Analyse der Bilddaten übernimmt.
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In
Verbindung mit der Bewegung des xy-Tisches 9 wird, wie
im Folgenden näher erläutert wird, das Entnahmewerkzeug 10a positioniert.
Die Bewegung des xy-Tisches 9 dient dazu, die Zellkultur
für eine Entnahme der aufgefundenen Zellobjekte zu vorzupositionieren.
Hierzu wird das Erntemodul 5 durch die Verfahrmechanik über
der Zellkultur positioniert, während der xy-Tisch 9 auf
die zuvor ermittelten Positionen der gefundenen Zellobjekte eingestellt wird
und dem Erntemodul 5 ein Entnehmen der Zellobjekte ermöglicht.
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Das
Entnahmemodul 5 weist den Werkzeugkopf 10 auf,
der mit einer Absenk- und Saugmechanik ausgestattet ist. Am Ende
des Werkzeugkopfs 10 befindet sich ein konisches Aufnahmeelement
zur Aufnahme des Entnahmewerkzeugs 10a. Die Position des
Entnahmewerkzeugs 10a wird mittels der Bildaufnahmeeinheit 2 erfasst
und ggf. mittels des Regelkreises präzise korrigiert, wie
in dem nachfolgenden ersten und dritten Ausführungsbeispiel
beschrieben ist.
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Das
Entnehmen der Zellobjekte aus der im Probenbehälter 8 befindlichen
Zellkultur erfordert ein Absenken des Entnahmewerkzeugs 10a auf
das jeweilige Zellobjekt. Beim Absenken kann es zu einer Kollision
des Entnahmewerkzeugs 10a mit dem Boden des Probenbehälters 8 kommen.
Daher weist der Werkzeugkopf 10 eine Federung für
das Aufnahmeelement und/oder das Entnahmewerkzeug 10a,
die die Kollision abfedert, sowie einen Sensor auf, der am Werkzeugkopf,
am Aufnahmeelement oder am Entnahmewerkzeug angeordnet ist. Der
Sensor meldet die Kollision an die Steuer- und Speichereinheit 4, um
eine Beschädigung des Entnahmewerkzeugs 10a zu
verhindern, wie im zweiten Ausführungsbeispiel beschrieben
ist. Danach wird das jeweilige Zellobjekt aufgenommen.
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Die
aufgenommenen Zellobjekte werden in einer Vereinzelungsbatterie 11 abgelegt.
Diese besteht aus einer Reihe von Reagenzglasern bzw. Röhrchen,
die durch die Hubsäule 5a und den Verfahrantrieb 5b einzeln
angefahren werden können und in die durch den Werkzeugkopf 10 die
entnommenen Zellobjekte abgesetzt werden können.
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Die
Vereinzelungsstationen 11 können auch in Teilen
als ein Magazin zum Bereitstellen von Entnahmewerkzeugen 10a ausgebildet
sein, die durch ein nicht näher dargestelltes konisches
Aufnahmeelement, dass am Werkzeugkopf 10 angebracht ist und
das Entnahmewerkzeug 10a aufnimmst, an den Werkzeugkopf 10 angekoppelt
werden. Die konische Form des Aufnahmeelements führt zu
einer Selbstzentrierung der teilweise hochpräzise zu positionierenden
Entnahmewerkzeuge 10a bei der Aufnahme. Durch die Verwendung
einer Verdickung am Aufnahmeelement kann das Entnahmewerkzeug 10a mittels einer
einfachen, nicht dargestellten Abstreifvorrichtung wieder vom Aufnahmeelement
entfernt werden, um eine Aufnahme des nächsten Entnahmewerkzeugs 10a zu
ermöglichen.
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Grundsätzlich
werden die hier im Prinzip beschriebenen Funktionen durch die Speicher-
und Steuereinheit 4 gesteuert und laufen im wesentlichen vollautomatisch
ab. Dem Benutzer stehen jedoch durch die Überwachung der
Funktionen am Monitor bzw. Display 4a durch die bekannten
Eingabemittel wie Tastatur und Maus und eine entsprechende Nutzeroberflache
bei den innerhalb der Speicher- und Steuereinheit 4 ablaufenden
Softwarekomponenten eine Reihe von Möglichkeiten zur Funktionsbeeinflussung
zur Verfügung.
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So
ist insbesondere durch einen Zugriff auf die Steuerung der Mikroskopeinrichtung
eine Einstellung des Vergrößerungsfaktors und
eine Änderung des Auflösungsvermögens
der Bildaufnahmeeinheit 2 möglich. Des weiteren
ist eine Adressierung des Erntemoduls 5 möglich,
bei der menügesteuert einzelne, durch die Mikroskopeinheit
ermittelte Zellobjekte ausgewählt und einem bestimmten
Platz in der Vereinzelungsbatterie 11 zugeordnet werden
können. Außerdem kann auch eine Betriebsweise
des Erntemoduls 5 festgelegt werden, bei der in Abhängigkeit
von den selektierten Zellobjekten bestimmte Entnahmewerkzeuge 10a von
der konischen Aufnahme des Werkzeugkopfs 10 aufgenommen
werden, um die selektierten Zellobjekte auf eine bestimmte Art und
Weise zu entnehmen.
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Bei
den drei Ausführungsbeispielen wird die horizontale Position
des Entnahmewerkzeugs 10a über dem Zellobjekt
durch die Fertigungs- und Aufnahmegenauigkeit sowie durch die Positioniergenauigkeit
einer Kalibrierung voreingestellt. Das Problem besteht jedoch darin,
dass die vertikale Position von Zellobjekten aufgrund unebener Böden
der Probenbehälter 8 variiert und zumindest die
vertikale Position des Entnahmewerkzeugs über dem Zellobjekt eventuell
korrigiert werden muss.
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1. Vertikale Positionierung
des Entnahmewerkzeugs
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Durch Übermittlung
der Daten vom motorisierten Fokussiersystem der Mikroskopeinheit 1 zur Ermittlung
der jeweiligen Höhe der Fokussierebene, in der das Zellobjekt
liegt, an die Steuer- und Speichereinheit 4 für
die Verfahrmechanik ist es möglich, die vertikale Position
des Zellobjekts festzustellen und das Entnahmewerkzeug 10a auf
die entsprechende, einstellbare Differenzhöhe über
dem Zellobjekt zu positionieren. Durch Verstellen des Fokus auf die
theoretische Höhe des Entnahmewerkzeugs 10a können
die Position des Entnahmewerkzeugs 10a geprüft
und durch Verstellen des Fokus und Korrigieren der vertikalen Position
des Entnahmewerkzeuges 10a eine Feinjustage des Entnahmewerkzeugs 10a auf
die gewünschte Differenzhöhe über dem
im Probenbehälter 8 befindlichen Zellobjekt erfolgen. Ein
schnelles Zusammenspiel zwischen Bildaufnahmeeinheit 2, Bildauswerteeinheit 3a,
Steuer- und Speichereinheit 4 und Verfahrmechanik ist Grundvoraussetzung
für dieses Verfahren.
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Vor
allem im Bereich stärkerer Vergrößerungen
weist eine Mikroskopoptik nur sehr schmale Schärfentiefenbereiche
auf. Somit ist es mit einem motorisierten Mikroskop, das aufgrund
der Motorisierung des Fokussierantriebs und einer entsprechenden
Rückmeldung, z. B. über gekoppelte Encoder, die
Position des Fokussierantriebs bestimmen kann, möglich,
die vertikale Position gut erkennbarer Objekte, d. h. des Zellobjekts
oder des Entnahmewerkzeugs 10a, innerhalb des Bildbereiches über
eine entsprechende Funktion der Bildverarbeitung automatisiert zu
ermitteln.
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Voraussetzung
ist lediglich eine Positionierung des Zellobjektes bzw. des Entnahmewerkzeugs 10a im
Suchbereich der Autofokusfunktion. Je kleiner dieser Bereich ist,
der der Anzahl der Bilder entspricht, die als Z-Stapel 16 aufgenommen
und analysiert werden müssen, desto schneller kann die
Ermittlung der vertikalen Position des Objektes durchgeführt
werden.
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2 zeigt
den Z-Stapel 16, der beim senkrechten Abscannen der Zellkultur
zur Bestimmung der senkrechten Position des Zellobjekts entsteht. Um
die senkrechte Position der Spitze des Entnahmewerkzeugs 10a zu
ermitteln, wird ein vordefinierter Bereich mit einer oberen Begrenzung 12 und
einer unteren Begrenzung 13 in senkrechter Richtung abgescannt. Ähnlich
wie beim horizontalen Abscannen, bei dem ein Aneinanderreihen von
Bildern der Proben erfolgt, geschieht dies auch in senkrechter Richtung.
Hier ist die Bildgrenze zum nächsten Bild der Schärfentiefebereich 15 des
jeweils gewählten optischen Systems.
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An
jedem aufgenommenen Bild 14 zur Analyse und Ermittlung
der Autofokusposition wird der Schärfegrad ermittelt. Das
Bild mit dem höchsten Schärfegrad ist das Bild
in senkrechter Position, das der Kapillarspitze am nächsten
kommt. Je weniger Bilder zur Analyse benötigt werden, desto
schneller erfolgt die Kalibrierung. Je mehr Bilder 14 aufgenommen
werden, wobei der senkrechte Abstand auch kleiner als der Schärfentiefenbereich
sein kann, desto genauer kann die senkrechte Position der Spitze des
Entnahmewerkzeugs 10a ermittelt werden, aber desto länger
dauert auch der Kalibrierprozess. Das Verfahren kann also flexibel
entsprechend den jeweils benötigten Genauigkeiten angewendet
werden.
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Das
Positionierverfahren läuft folgendermaßen ab:
Zuerst
wird der horizontal verfahrbare xy-Tisch 9 mit einem Probenbehälter 8 mit
einer Zellkultur bestückt. Als Nächstes nimmt
das Aufnahmeelement ein Entnahmewerkzeug 10a auf. Daraufhin
wird der xy-Tisch 9 in eine Kalibrierposition innerhalb
der optischen Achse des Mikroskops verfahren, wobei eine Bohrung
im xy-Tisch 9 einen freien Blick auf die in diesem Bereich
zu positionierende Spitze des Entnahmewerkzeugs 10a ermöglicht.
Anschließend erfolgt ein Verfahren des Aufnahmeelements
mit dem Entnahmewerkzeug 10a zur Kalibrierposition.
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Danach
wird die Autofokusfunktion der Bildauswerteeinheit 3a zur
Ermittlung der vertikalen Position der Spitze des Entnahmewerkzeugs 10a angewendet.
Die Grenzen des Suchbereiches der Autofokusfunktion können über
die Fertigungstoleranzen und Positioniergenauigkeiten der Verfahrmechanik vorgegeben
werden.
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Der
nächste Schritt ist ein Auslesen der Motorposition des
Fokussierantriebes in der Autofokus-Position.
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Daraufhin
erfolgt ein Anheben des Aufnahmeelementes mit dem Entnahmewerkzeug 10a.
Der Probenbehälter 8 wird nachfolgend abgescannt,
ggf. mit der Autofokusfunktion. Als nächstes wird das Aufnahmeelement
mit dem Entnahmewerkzeug 10a zu einem aufzunehmenden Zellobjekt
verfahren.
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Danach
wird mit Hilfe der Autofokusfunktion die vertikale Position des
Zellobjekts erfasst. Die vertikalen Positionen des Entnahmewerkzeugs
und des Zellobjekts werden miteinander verglichen, und es wird die
optimale vertikale Position, d. h. die vorgegebene Differenzhöhe
des Entnahmewerkzeugs 10a über dem im Probenbehälter 8 befindlichen
Zellobjekt eingestellt.
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Zum
Schluss wird das Zellobjekt vom Entnahmewerkzeug 10a aufgenommen.
Nach einem Wechsel des Entnahmewerkzeugs 10a erfolgt eine neue
Kalibrierung. Bei Verwendung der gleichen Kapillare zur Aufnahme
des nächsten Zellobjektes erfolgt nur noch die Ermittlung
der vertikalen Position des nächsten Zellobjekts und eine
Ermittlung und Einstellung der neuen Differenzhöhe.
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2. Verhindern einer Beschädigung
des Entnahmewerkzeugs
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Das
Aufnahmeelement wird mit einem Sensor versehen, der eine Kollision
des Entnahmewerkzeugs
10a mit dem Boden des Probenbehälters
signalisiert. Durch die besondere Konstruktion des Werkzeugkopfes
nach
DE 10 2004 046 740 weicht dieser
bei einer Kollision des Entnahmewerkzeugs mit dem Boden des Probenbehälters
aus und ermöglicht so eine Detektion der Kollision, ohne
das Entnahmewerkzeug
10a zu zerstören.
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Das
Signal wird an die Steuer- und Speichereinheit 4 weitergeleitet,
die die Abwärtsbewegung des Aufnahmeelements sofort stoppt
und das Entnahmewerkzeug 10a wieder auf einen vorgegebenen Abstand
anhebt, so dass das Entnahmewerkzeug 10a in einem definierten
vertikalen Abstand über dem zu entnehmenden Zellobjekt
schwebt. Da es sich bei den verwendeten Entnahmewerkzeugen 10a in
diesem Ausführungsbeispiel um sehr dünne, zerbrechliche
Kanülen handelt, ist die Kombination aus ausweichendem
Werkzeugkopf 10 und empfindlich schaltendem Sensor wichtig,
um eine bleibende Verformung oder gar Zerstörung der Kapillaren
zu vermeiden.
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Das
Verfahren läuft folgendermaßen ab:
Zuerst
wird der xy-Tisch 9 mit einem Probenbehälter 8 mit
einer Zellkultur bestückt. Danach wird mittels eines geeigneten
Aufnahmeelements ein Entnahmewerkzeug 10a aufgenommen.
Als Nächstes wird der Probenbehälter 8 abgescannt.
Das Entnahmewerkzeug 10a wird zu einem gewünschten
Zellobjekt verfahren und über dem Zellobjekt positioniert.
Im Anschluss daran wird das Aufnahmeelement langsam abgesenkt.
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Die
Kapillare berührt den Boden des Probenbehälters 8 und
das Aufnahmeelement wird langsam weiter abgesenkt. Der Werkzeugkopf
mit dem Entnahmewerkzeug 10a bleibt nun in der durch das
Auftreffen auf den Boden des Probenbehälters 8 erzwungenen
vertikalen Position stehen, während sich das Aufnahmeelement
selbst, an dem der entsprechende Sensor angebracht ist, weiter absenkt.
Durch die Relativbewegung zwischen dem Werkzeugkopf 10 und
dem Aufnahmeelement wird durch den Sensor ein Signal ausgelöst,
das der Steuer- und Speichereinheit 4 der Verfahrmechanik
signalisiert, dass der Boden des Probenbehälters 8 erreicht
wurde. Bei anliegendem Sensorsignal werden die vertikale Position
des Aufnahmeelementes gespeichert und das Absenken des Aufnahmeelementes
sofort eingestellt.
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Auf
der Basis des werkzeugspezifisch ermittelten Abstands zwischen Endlage
des Werkzeugkopfes 10 und der Auslöseposition
des Sensors und der durch den Nutzer vorgegebenen Differenzhöhe über
dem Boden des Probenbehälters 8 wird zur Erlangung
optimaler Aufnahmebedingungen nun die anzufahrende vertikale Position
ermittelt. Das Aufnahmeelement wird auf die ermittelte Position
angehoben und das Zellobjekt aufgenommen.
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Die
Detektion der Kollision durch den Sensor erfolgt im Einzelnen durch
Erkennung einer geringfügigen Bewegung des ausweichenden
Werkzeugkopfes nach oben durch einen feinen Lichtstrahl einer Lichtschranke.
Diese wird so justiert, dass sie in Ruhelage des Werkzeugkopfs durch
dessen Unterkante gerade soweit abgedeckt wird, dass der Sensor
noch nicht auslöst. Nach Erreichen des Bodens des Probenbehälters
durch die Spitze des Entnahmewerkzeugs 10a, das fest oder über
ein konisches Aufnahmeelement mit dem Werkzeugkopf 10 verbunden
ist, erfolgt ein weiteres Absenken des Aufnahmeelementes. Der Werkzeugkopf 10 bleibt
allerdings in gleicher Höhe stehen. Der am Aufnahmeelement
befindliche Sensorkopf bewegt sich also ebenfalls weiter nach unten,
während sich der den Lichtstrahl des Sensors abschattende
Werkzeugkopf 10 relativ zum Sensor nach oben bewegt und
den abgedeckten Sensorteil des Sensors freigibt.
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Der
Sensor detektiert das nun einfallende Licht und löst in
der Sensoreinheit einen Schaltvorgang aus, der die Kollision durch
ein elektrisches Signal am Sensorausgang an die Steuer- und Speichereinheit 4 signalisiert.
Die Kollision wird nun der Steuer- und Speichereinheit 4 bekannt,
die entsprechend rea giert, das Absenken des Aufnahmeelements stoppt
und die voreingestellte Differenzhöhe anfährt.
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Je
nach Sensorjustage, Reaktionsgeschwindigkeit des eingesetzten Sensors,
Verfahrgeschwindigkeit des Aufnahmeelementes und Zykluszeit der Steuer-
und Speichereinheit 4 können die Verfahrwege nach
der Kollision im Bereich weniger Mikrometer bis zu einigen hundertstel
Millimetern minimiert werden.
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Durch
die geringe, rein axiale Belastung des vertikalen Entnahmewerkzeugs
im Moment der Kollision und die relativ hohe Stabilität
des Entnahmewerkzeugs in axialer Richtung bleiben eine sichtbare Beschädigung,
bleibende Verformung oder gar Zerstörung dieser dünnwandigen,
biege- und scherempfindlichen Entnahmewerkzeuge aus. Die Differenzhöhe
lässt sich durch diese Methode mit einer Genauigkeit im
Bereich von einigen Mikrometern einstellen.
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3. Vertikale und horizontale
Positionierung des Entnahmewerkzeugs
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Wie
bereits oben erwähnt wurde, ist vor allem die Herstellung
gezogener Glaskapillaren als Entnahmewerkzeug in genügend
reproduzierbarer Genauigkeit für eine voll automatisierte
Anwendung kaum möglich. Glaskapillaren werden vor allem
für die Aufnahme von Einzelzellen verwendet und sind somit
an ihrer Spitze entsprechend klein, mit Öffnungen bis zu
1 μm für Patch-Clamp-Untersuchungen oder Injektionen
in eine Einzelzelle.
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Ein
Auftreffen derartiger empfindlicher Glaskapillaren auf den Boden
des Probenbehälters 8 kann zu einer Beschädigung
oder Zerstörung führen. Daher ist das zweite Ausführungsbeispiel
mit sehr feine Glaskapillaren kaum anwendbar. Hinzu kommt die Problematik,
dass sowohl die horizontale als auch die vertikale Position der
Spitze der Glaskapillare in Bezug auf die Aufnahmegeometrie der
Glaskapillare nicht präzise genug herstellbar sind.
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Dazu
kommt die Problematik der unebenen Böden von Probenbehältern 8.
Durch Übermittlung der Daten des motorisierten Fokussiersystems
zur Ermittlung der jeweiligen Höhe der Fokusebene und der
aus der Bilderkennung ermittelten horizontalen Position der Glaskapillare
und des Zellobjekts an die Steuer- und Speichereinheit 4 der
Verfahrmechanik ist es möglich, die Position der Glaskapillare
in Bezug auf die Position des Zellobjekts festzustellen und die Glaskapillare
auf die entsprechend einstellbare Differenzhöhe zu positionieren.
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Durch
Verstellen des Fokus auf die theoretische Höhe der Glaskapillare
kann die Position der Glaskapillare geprüft werden, und
durch Verstellen des Fokus' und Nachregeln des vertikalen Antriebs des
Werkzeugkopfs 10 kann eine Feinjustage der Glaskapillare
auf die korrekte Position über der Zelle erfolgen. Ein
schnelles Zusammenspiel zwischen Bilderkennung, Bildverarbeitung,
Steuer- und Speichereinheit 4 und Verfahrmechanik ist Grundvoraussetzung
für dieses Verfahren.
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Vor
allem im Bereich stärkerer Vergrößerungen
weist eine Mikroskopoptik nur sehr schmale Schärfentiefenbereiche
auf. Somit ist es mit einem motorisierten Mikroskop, das aufgrund
der Motorisierung des Fokussierantriebs und einer entsprechenden
Rückmeldung, z. B. über gekoppelte Encoder, die
Fokusposition bestimmen kann, möglich, die vertikale Position
gut erkennba rer Objekte, d. h. des Zellobjekts oder des Entnahmewerkzeugs,
innerhalb des Bildbereiches über eine entsprechende Funktion der
Bildverarbeitung automatisiert zu ermitteln.
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Zusätzlich
kann eine geeignete Bilderkennung die horizontale Position der Spitze
der Glaskapillare innerhalb des Bildfeldes ermitteln und die Differenz
zur Bildmitte, auf die das Entnahmewerkzeug kalibriert ist, als
Korrekturwerte an die Steuer- und Speichereinheit 4 der
Verfahrmechanik ausgeben. Voraussetzung ist lediglich die Positionierung
der Glaskapillare im Bild- und Suchbereich der Autofokusfunktion
und eine Positionserkennung in der Bildebene. Je kleiner dieser
Bereich ist, der der Anzahl der Bilder entspricht, die als Z-Stapel
aufgenommen werden und analysiert werden müssen, desto
schneller kann die Ermittlung der vertikalen Position der Glaskapillare
durchgeführt werden.
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Das
Verfahren weist im Wesentlichen die gleichen Schritte auf wie das
Verfahren zur speziell vertikalen Positionierung (vgl. Ausführungsbeispiel 1):
Zuerst
wird der horizontal verfahrbare xy-Tisch 9 mit einem Probenbehälter 8 mit
einer Zellkultur bestückt. Als Nächstes nimmt
das Aufnahmeelement ein Entnahmewerkzeug 10a auf. Daraufhin
wird der xy-Tisch 9 in eine Kalibrierposition innerhalb
der optischen Achse des Mikroskops verfahren, wobei eine Bohrung
im xy-Tisch 9 einen freien Blick auf die in diesem Bereich
zu positionierende Kapillarspitze ermöglicht. Anschließend
erfolgt ein Verfahren des Aufnahmeelements mit dem Entnahmewerkzeug 10a zur
Kalibrierposition.
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Danach
wird die Autofokusfunktion der Bildauswerteeinheit 3a zur
Ermittlung der vertikalen Position der Kapillarspitze angewendet.
Die Grenzen des Suchbereiches der Autofokusfunktion können über
die Fertigungstoleranzen und Positioniergenauigkeiten der Verfahrmechanik
vorgegeben werden.
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Zusätzlich
zu dem im ersten Ausführungsbeispiel beschriebenen Verfahren
zur senkrechten Positionierung des Entnahmewerkzeugs 10a führt die
Bildaufnahmeeinheit 2 eine horizontale Positionserkennung
zur Ermittlung der Position des Zentrums der Spitze der Glaskapillare
in der Bildebene durch.
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Der
nächste Schritt ist, wie im ersten Ausführungsbeispiel,
ein Auslesen der Motorposition des Fokussierantriebes in der Autofokus-Position.
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Abweichend
von dem im ersten Ausführungsbeispiel beschriebenen Verfahren
erfolgt dann eine Übergabe der vollständigen räumlichen
Koordinaten der Kapillarspitze an die Steuer- und Speichereinheit 4 der
Verfahrmechanik. Des Weiteren erfolgen ein Abheben des Aufnahmeelements
mit dem zugehörigen Entnahmewerkzeug 10a und eine
Korrektur der horizontalen Position durch die Verfahrmechanik. Basis
für die Korrekturwerte ist eine Nullposition im Bildbereich,
auf die die Ausgangsposition des Entnahmewerkzeugs 10a eingestellt
ist und an welche das detektierte Zellobjekt zur Aufnahme positioniert
wird. Diese Nullposition entspricht in der Regel der Bildmitte.
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Der übrige
Verlauf des Verfahrens entspricht wieder dem ersten Ausführungsbeispiel:
Es
erfolgt ein Anheben des Aufnahmeelementes mit dem Entnahmewerkzeug.
Der Probenbehälter 8 wird nachfolgend abgescannt,
ggf. mit der Autofokusfunktion. Als nächstes wird das Aufnahmeelement
mit dem Entnahmewerkzeug 10a zu einem aufzunehmenden Zellobjekt
verfahren.
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Danach
wird mit Hilfe der Autofokusfunktion die vertikale Position des
Zellobjekts erfasst. Die vertikalen Positionen des Entnahmewerkzeugs 10a und des
Zellobjekts werden miteinander verglichen, und es wird die optimale
vertikale Position, d. h. die vorgegebene Differenzhöhe,
des Entnahmewerkzeugs 10a über dem im Probenbehälter 8 befindlichen
Zellobjekt eingestellt.
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Zum
Schluss wird das Zellobjekt vom Entnahmewerkzeug 10a aufgenommen.
Nach einem Wechsel des Entnahmewerkzeugs 10a erfolgt eine neue
Kalibrierung. Bei Verwendung der gleichen Kapillare zur Aufnahme
des nächsten Zellobjektes erfolgt nur noch die Ermittlung
der vertikalen Position des nächsten Zellobjekts und eine
Ermittlung und Einstellung der neuen Differenzhöhe.
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- 1
- Mikroskopeinheit
- 1a
- Umlenkprisma
- 1b
- Linsensystem
- 2
- Bildaufnahmeeinheit
- 3
- Personal
Computer
- 3a
- Bildauswerteeinheit
- 4
- Steuer-
und Speichereinheit
- 4a
- Monitor
bzw. Display
- 5
- Erntemodul
- 5a
- Hubsäule
- 5b
- Verfahrantrieb
- 6
- Beleuchtung
- 7
- Beleuchtungsfilter
- 8
- Zellkultur
- 9
- xy-Tisch
- 10
- Werkzeugkopf
- 10a
- Entnahmewerkzeug
- 11
- Vereinzelungsbatterie
- 12
- obere
Begrenzung
- 13
- untere
Begrenzung
- 14
- aufgenommenes
Bild
- 15
- Schärfentiefenbereich
- 16
- Z-Stapel
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- - DE 10253939
A1 [0004, 0010]
- - DE 102004046740 [0052]