DE10149786A1

DE10149786A1 - Oberfläche für Untersuchungen aus Populationen von Einzelmolekülen

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Publication number: DE10149786A1
Application number: DE10149786A
Authority: DE
Inventors: Dmitri Tcherkassov; Walter Traut; Englbert Baeuml; Christian Hennig; Norman Kock
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2001-10-09
Filing date: 2001-10-09
Publication date: 2003-07-03
Anticipated expiration: 2021-10-10
Also published as: DE10149786B4

Abstract

Die Erfindung beschreibt eine Oberfläche, die besonders für eine Sequenzierung von Populationen einzelner Nukleinsäurekettenmoleküle geeignet ist. Die Sequenzierungsreaktion erfolgt durch den sequentiellen Aufbau eines komplementären Stranges immobilisierter einzelsträngiger Nukleinsäureketten.

Description

Einleitung

Abkürzungen und Begriffserläuterungen

Reaktionsoberfläche - Oberfläche eines Gels. Das Gel besteht aus einer oder mehreren Polymerarten (Gelmatrix) und einer Flüssigkeit. Die Reaktionsoberfläche ist vorzugsweise plan.
Targetmoleküle - direkt oder indirekt an das Gel bzw. an die Gelmatrix, gebundene Moleküle oder Molekülkomplexe, die durch Reaktionen mit anderen Molekülen zu deren Immobilisation führen, z. B. 1) immobilisierte Nukleinsäureketten sind Targetmoleküle für die markierte Oligonukleotide, die an diese Nukleinsäureketten hybridisiert werden, 2) immobilisierte Primer sind Targetmoleküle für die NSKs, die an diese Primer hybridisiert werden, 3) NSK-Primer- Komplexe sind Targetmoleküle für markierte NT*s, die eingebaut und dadurch immobilisiert werden.
Plane Oberfläche: Oberfläche, die vorzugsweise folgende Merkmale aufweist: 1) Sie erlaubt, mehrere einzelne Moleküle, vorzugsweise mehr als 100, noch besser mehr als 1000, mit dem jeweiligen gegebenen Objektiv-Oberfläche-Abstand bei einer Objektivposition gleichzeitig zu detektieren. 2) Die immobilisierten einzelnen Moleküle befinden sich in derselben Fokusebene (unter Berücksichtigung der Tiefenschärfe), die reproduzierbar eingestellt werden kann. DNA - Desoxyribonukleinsäure verschiedenen Ursprungs und unterschiedlicher Länge:
(genomische DNA, cDNA, ssDNA, dsDNA)
RNA - Ribonukleinsäure (meist mRNA)
Polymerasen-Enzyme, die komplementäre Nukleotide in einen wachsenden DNA- oder RNA- Strang einbauen können (z. B. DNA-Polymerasen, Reverse-Transkriptasen, RNA-Polymerasen)
dNTP - 2'-desoxi-Nucleosid-Triphosphate für DNA-Polymerasen und Reverse-Transkriptasen
NTP - Nukleosid-Triphosphate für RNA-Polymerasen
NT - natürliches Nukleotid, meist dNTP, wenn nicht ausdrücklich anders gekennzeichnet.
Abkürzung "NT" wird auch bei der Längenangabe einer Nukleinsäuresequenz verwendet, z. B. 1.000 NT. In diesem Fall steht "NT" für Nukleosid-Monophosphate.
Im Text wird bei Abkürzungen die Mehrzahl durch Verwendung des Suffixes "s" gebildet, "NT" steht zum Beispiel für "Nukleotid", "NTs" steht für mehrere Nukleotide. NT* - ein mit einem Fluoreszenzfarbstoff und mit einer zur Termination führenden Gruppe reversibel modifiziertes Nukleotid, meist dNTP, wenn nicht ausdrücklich anders gekennzeichnet. NT*s bedeutet: modifizierte Nukleotide
NSK - Nukleinsäurekette. DNA oder RNA
NSKF - Nukleinsäurekettenfragment, NSKFs-Nukleinsäurekettenfragmente. Fragmente von DNA oder RNA.
Definition der Termination: Als Termination wird in dieser Anmeldung der reversible Stop des Einbaus der modifizierten ungespalteten NT*s bezeichnet.
Dieser Begriff ist von dem üblichen Gebrauch des Wortes "Termination" durch Dideoxy-NTP bei einer konventionellen Sequenzierung zu trennen.
Die Termination kommt nach dem Einbau eines modifizierten NT* zustande. Das modifizierte eingebaute NT* trägt eine reversibel gekoppelte Gruppe, die zur Behinderung des Einbaus eines nächsten komplementären NT* in den wachsenden Strang durch eine Polymerase führt. Diese Gruppe wird auch als "zur Termination führende Gruppe" bezeichnet (Beispiele für solche NT*s sind in Anmeldungen (Tcherkassov et al. "Verfahren zur Bestimmung der Genexpression" DPuMA-Aktenzeichen 101 20 798.0-41, Tcherkassov et al. "Verfahren zur Analyse von Nukleinsäureketten" DPuMA-Aktenzeichen 101 20 797.2-41, Tcherkassov et al. "Verfahren zur Analyse von Nukleinsäurekettensequenzen und der Genexpression" DPuMA- Aktenzeichen 101 42 256.3) und Patenten (Kwiatkoxski WO-Patent 01/25247 A1, Kwiatkowski US-Patent 6.255.475, Conard et al. US-Patent 6.001.566, Dower (US Patent 5.547.839), Canard et al. (US Patent 5.798.210), Rasolonjatovo (Nucleosides & Nucleotides 1999, v. 18 S. 1021), Metzker et al. (NAR 1994, v. 22, S. 4259), Welch et al. (Nucleosides & Nucleotides 1999, v. 18, S. 197) angegeben. Genprodukte - mRNA-Transkripte oder von der mRNA abgeleitete Nukleinsäureketten (z. B. einzelsträngige cDNA, von einzelsträngiger cDNA synthetisierte doppelsträngige cDNA, von cDNA abgeleitete RNA oder von cDNA amplifizierte DNA). Die Genprodukte können auch als NSKFs auftreten.
SNP - single nucleotide polymorphism
PBS - Primerbindungsstelle
DPuMA - Deutsches Patent- und Markenamt

Stand der Technik

Seit Mitte der 90er Jahre führt man Experimente mit auf einer Oberfläche immobilisierten einzelnen Molekülen durch, die auf optischen Detektion der Fluoreszenzsignale basieren (Trabesinger et al. Anal. Chem. 1999 v. 71 S. 279, Tokunaga et al. Biochem. and Biophys. Res. Comm. 1997 v. 235 S. 47). Oft handelt es sich um Fragestellungen zur spezifischen Bindung oder Ankopplung von markierten Molekülen an die auf der Oberfläche immobilisierten Reaktionspartner-Moleküle, Targetmoleküle. Das Auftreten bzw. Verschwinden der Signale von einzelnen Molekülen an einer definierten Position der Oberfläche spielt dabei eine sehr wichtige Rolle für die korrekte Beurteilung des Reaktionsergebnisses. Bei Exprimenten mit einzelnen Molekülen wurde üblicherweise Glas- oder Kunststoffoberfläche (Festphasen- Oberfläche) zur Immobilisierung der Moleküle verwendet. Die Verwendung einer solchen Oberfläche führte oft zu einer unspezifischen Bindung verschiedener markierter Reaktionspartner an die Oberfläche, was zu falschpositiven Signalen führte und somit die Aussagekraft der Ergebnisse von Experimenten einschränkte.
Das Ziel der Erfindung bestand in der Entwicklung einer Oberfläche mit verringerter unspezifischer Bindung einzelner markierter Moleküle an die Reaktionsoberfläche, wobei viele spezifisch an die Targetmoleküle gebundene markierte Moleküle gleichzeitig detektiert werden müssen. Diese Aufgabe ist erfindungsgemäß durch den Einsatz der Geloberfläche gelöst. Die Erfindung kann sowohl im Bereich der Sequenzierung von Populationen einzelner Nukleinsäureketten als auch in anderen Bereichen der Einzelmolekülanalytik zur Anwendung kommen.

Allgemeine Beschreibung

Die Erfindung beschreibt eine Oberfläche, die zur Durchführung verschiedener Reaktionen mit einzelnen immobilisierten Molekülen geeignet ist. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Oberfläche zur gleichzeitigen Sequenzierung einer Vielzahl einzelner immobilisierter Nukleinsäureketten eingesetzt.
Bei diesen Reaktionen (Fig. 1) ist mindestens ein Reaktionspartner 1 (Targetmoleküle) an das Gel bzw. an die Gelmatrix gebunden, der andere oder die anderen Reaktionspartner 2 befinden sich in der Reaktionslösung. Die Reaktion wird durch den Kontakt der auf dem Gel immobilisierten Moleküle und der Reaktionslösung durchgeführt. Zur Erfassung des spezifischen Reaktionsergebnisses, vorzugsweise eines spezifischen Bindungs-, Additions- oder Abspaltungsereignisses, wird bevorzugt die optische Detektion von Fluoreszenzsignalen verwendet. Dabei kann einer oder mehrere Reaktionspartner mit einem für ihn charakteristischen Fluoreszenzfarbstoff markiert sein. Beim Einsatz einzelner immobilisierter Moleküle als Detektionsobjekt wird das Auftreten oder Verschwinden der Signale an einer definierten x,y-Position auf der Reaktionsoberfläche oft als einziges Kriterium für die Beurteilung des Reaktionsergebnisses eingesetzt (Ja/Nein-Signal).
Die erfindungsgemäße Oberfläche ist eine plane Geloberfläche eines auf einem festen Träger liegenden Gels. Die Gelmatrix der erfindungsgemäß eingesetzten Oberfläche weist eine sehr geringe unspezifische Bindungskapazität oder Bindungsfähigkeit gegenüber den markierten Reaktionsmolekülen 2 auf, so dass es zu geringeren unspezifischen Bindungsereignissen kommt als bei herkömmlichen Oberflächen (Glas, Kunststoff).
Es können sowohl eine als auch mehrere Reaktionen mit denselben immobilisierten Molekülen/Targetmolekülen durchgeführt werden. Die Detektion kann vor, während oder auch nach der Reaktion stattfinden. Ein oder mehrere Waschschritte können zur Entfernung der Reaktionspartner verwendet werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die erfindungsgemäße Geloberfläche in einem Verfahren zur Sequenzierung von Nukleinsäureketten eingesetzt (Tcherkassov et al. "Verfahren zur Bestimmung der Genexpression" DPuMA-Aktenzeichen 101 20 798.0-41, Tcherkassov et al. "Verfahren zur Analyse von Nukleinsäureketten" DPuMA-Aktenzeichen 101 20 797.2-41, Tcherkassov et al. "Verfahren zur Analyse von Nukleinsäurekettensequenzen und der Genexpression" DPuMA-Aktenzeichen 101 42 256.3). Die Grundlage der Methode ist die Detektion von Fluoreszenzsignalen einzelner mit charakteristischen Farbstoffen markierter Nukleotidmoleküle, die durch eine Polymerase in eine wachsende Nukleinsäurekette eingebaut werden. Die Reaktion verläuft auf einer planen Geloberfläche, auf der viele einzelne Nukleinsäureketten-Primer-Komplexe immobilisiert sind. Die Nukleinsäureketten (NSKs) sind einzelsträngig und dienen als Matrizen für den Aufbau des komplementären Stranges. Die NSKs können RNA oder DNA sein, wobei ursprüngliche NSKs (z. B. mRNA) oder deren Abkömmlinge (z. B. cDNA) verwendet werden können. Alle auf der Reaktionsoberfläche immobilisierte NSK-Primer-Komplexe (Fig. 2) sind den gleichen Bedingungen ausgesetzt, so dass an vielen NSKs gleichzeitig eine Aufbaureaktion eines komplementären Stranges ablaufen kann. Das Verfahren umfaßt im wesentlichen folgende Schritte:

1. Bereitstellung einer Population immobilisierter, mit einem Primer hybridisierter einzelsträngiger NSK-Molekülen.
2. Durchführen einer zyklischen Aufbaureaktion, wobei jeder Zyklus aus folgenden Schritten besteht:
- a) Zugabe einer Lösung mit markierten Nukleotiden (NT*s) und Polymerase zu immobilisierten Nukleinsäureketten,
- b) Inkubation der immobilisierten Nukleinsäureketten mit dieser Lösung unter Bedingungen, die zur Verlängerung der komplementären Stränge um ein NT geeignet sind,
- c) Waschen,
- d) Detektion der Signale von einzelnen Molekülen,
- e) Entfernung der Markierung und der zur Termination führenden Gruppe von den eingebauten Nukleotiden,
- f) Waschen.
Gegebenenfalls erfolgt eine mehrfache Wiederholung des Zyklus.
3. Analyse der detektierten Signale der einzelnen Moleküle.
4. Rekonstruktion der Sequenzen aus den Einzeldaten.

Die erfindungsgemäße Oberfläche kann bei verschiedenen Sequenzierungsexperimenten eingesetzt werden. Die Aufgaben der Sequenzierung (z. B. Genexpressionsanalysen, Sequenzierung unbekannter NSKs, SNP-Analyse), die Art der immobilisierten Nukleinsäureketten (einzelsträngige RNA, z. B. mRNA, DNA, z. B. genomische DNA oder klonierte DNA, Fragmente einer langen NSK, Abkömmlinge der mRNA, z. B. EST, cDNA) und die Zahl der Zyklen (20 bis 5000) können variieren, so dass eine Vielzahl von Fragestellungen bearbeitet werden kann. Detaillierte Beispiele für die Anwendung einer solchen Sequenzierungstechnik sind in den oben genannten Anmeldungen beschrieben und werden hier zum Teil zu Erläuterungszwecken erwähnt.

Spezielle Beschreibung

Das Gel besteht aus miteinander verknüpften Polymeren (die Gelmatrix), z. B. Agarose-, Cellulose- oder Polyacrylamid-Polymeren, die in einer Lösung, z. B. einer wässerigen Pufferlösung, ein mehr oder weniger stabiles Gerüst bilden. Ein Gel ist für Moleküle verschiedener Größen unterschiedlich durchlässig: Einerseits können sich kleine Moleküle z. B. Monomere wie Wasser-, Puffer-, Aminosäure-, Nukleotide-, Zuckermoleküle fast ungehindert zwischen den Maschen der Gelmatrix bewegen, andererseits werden größere Moleküle wie Proteine, Nukleinsäureketten oder Polysaccharide in ihrer Beweglichkeit durch diese Matrix gehindert. Je geringer der Raum zwischen den Gelmaschen (mit anderen Worten, je höher der Vernetzungsgrad im Gel), desto größer ist das Hindernis, welches das Gel für die Bewegung von Molekülen darstellt. Die Geloberfläche bildet eine gewisse Barriere zwischen dem Gelinneren und der das Gel umgebenden Lösung für die Diffusion von größeren Molekülen in das Gel hinein, während kleinere Moleküle schnell in das Gel hinein und aus dem Gel heraus diffundieren können.
Verschiedene Substanzen oder Polymere kommen als gelbidende Matrizes in Frage, z. B. Agarose, Cellulose, Dextrane, Acrylamidpolymere (Polyacrylamid) und deren Derivate bzw. Modifikationen wie z. B. cross-linked Agarose oder Dextrane, Dimethylacrylamid-, Trisacryl- oder Methacrylpolymere. Auch andere Derivate mit einer Formel R-CH=CH-R', wobei R und R' sowohl hydrophile als auch hydrophobe Substituenten darstellen kann, können in die Polymerisationsreaktion eingesetzt werden. Auch gemischte Polymerkompositionen wie z. B. Polyacryamid-agarose-Gele sind möglich. Diese und andere Gele sind ausführlich in fogenden Literaturquellen beschrieben: ("Affinity Chromatography a practical approach" Ed. Dean at al. IRL Press 1991; "Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology: an introduction to affinity chromatography" C. R. Lowe Elsevier Biomedical Press 1985; in Chromatographic science series v. 27 "Affinity chromatography, template chromatography of nucleic acids and proteins" H. Schott, Marcel Dekker Inc. 1984; ; in Chromatographic science series v. 33 "Affinity chromatography, practical and theoretical aspects" P. Mohr and K. Pommerening, Marcel Dekker inc. 1985).
Die Immobilisierung der einzelnen Moleküle auf einer Gel-Oberfläche hat gegenüber einer Immobilisierung auf einer Festphasen-Oberfläche (z. B. Glas oder Kunststoff) folgende Vorteile:

1. Das Problem einer unspezifischen Bindung von Proben auf der Oberfläche spielt bei Untersuchungen mit einzelnen Molekülen eine besonders große Rolle und verhinderte bis jetzt einen breiten Einsatz dieser Technik. Auf der Gel-Oberfläche erfolgt eine sehr viel geringere unspezifische Bindung von Molekülen wie z. B. Nukleinsäuren, Proteinen, Oligosacchariden im Vergleich zu einer Festphasen-Oberfläche (z. B. Glas), was zu weniger falsch-positiv detektierten Signalen führt. Durch den Einsatz einer Geloberfläche kann man somit diese unspezifische Bindung stark reduzieren oder komplett vermeiden.
2. Durch die Verlagerung der Reaktionsoberfläche in die Lösung verringert sich die Reflexion des Lichts an der Festphase-Lösung-Oberfläche, so dass es zu einem geringeren Hintergrundsignal durch Reflexionslicht kommt.
3. Die Reaktionsbedingungen können wesentlich variabler gestaltet werden. Es ist z. B. bekannt, dass Nukleinsäuren bei niedrigen pH-Werten schneller und stärker an die Glasoberflächen binden, als bei höheren pH-Werten (Allemand J. F. et al. Biophysical Journal 1997 v. 73 S. 2064). Das kann allerdings zu einer starken unerwünschten unspezifischen Bindung führen. Für gewisse Reaktionen mit Nukleinsäuren ist ein niedriger pH-Wert erwünscht. Durch den Einsatz einer Geloberfläche kann in Experimenten mit Nukleinsäuren ein pH-Wert von 3-5 verwendet werden, ohne dass es dabei zu einer unspezifischen Bindung von Nukleinsäuren an die Oberfläche kommt.

Die Eigenschaften von Gelen, wie mechanische Stabilität, chemische Reaktivität, Temperaturstabilität, unspezifische Adsorbtion von Substanzen usw. hängen sowohl von der Zusammensetzung der Gelmatrix als auch von dem Vernetzungsgrad der Polymeren ab. Die erfindungsgemäß verwendeten Gelmatrizes sind vorzugsweise mechanisch und thermisch (zwischen 0 Grad und 70 Grad C, noch besser zwischen 0 und 100) stabil. Mehrere gelbildende Substanzen besitzen diese Eigenschaften und können je nach Experimentaufbau verwendet werden. Beispielsweise Gele auf Acrylamid-, Dimethylacrylamid-, Trisacryl- oder Methacrylbasis können bei Temperaturen zwischen 0 und 100 Grad C mechanisch stabile, chemisch und enzymatisch wenig reaktive Matrizen bilden und sind in der Molekularbiologie als Trägermaterialien weit verbreitet ("Affinity Chromatography a practical approach" Ed. Dean at al. IRL Press 1991; "Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology: an introduction to affinity chromatography" C. R. Lowe Elsevier Biomedical Press 1985; in Chromatographic science series v. 27 "Affinity chromatography, template chromatography of nucleic acids and proteins" H. Schott, Marcel Dekker Inc. 1984; ; in Chromatographic science series v. 33 "Affinity chromatography, practical and theoretical aspects" P. Mohr and K. Pommerening, Marcel Dekker inc. 1985). Die Anwendung von Agarose-, Dextran- und Cellulosegele können auch verwendet werden, besitzen allerdings den Nachteil einer verringerten thermischen bzw. mechanischen Stabilität. Auch gemischte Polymere, z. B. Polyacrylamid-Agarose-Gele können verwendet werden.
Zur Anschaulichkeit und nicht zur Einschränkung werden im folgenden die Gele auf Acrylamidbasis betrachtet. Diese Gele werden durch eine Polymerisation von Acrylamidmonomeren zu langen Polymerketten und durch Verknüpfung dieser Polymerketten mit brückenbildenden Crosslinkern, z. B. bis-Acrylamid-Monomeren, gebildet ("Affinity Chromatography a practical approach" Ed. Dean at al. IRL Press 1991; "Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology: an introduction to affinity chromatography" C. R. Lowe Elsevier Biomedical Press 1985; "Electrophoresis" A. T. Andrews Oxford science publications 1995). Der Anteil der Acrylamid-Monomere bei der Gelvorbereitung kann zwischen 2 und 40% w/v liegen, vorzugsweise zwischen 5 und 20%. Der Anteil an Crosslinker-Monomeren (wie z. B. Bisacrylamid, 1,4-Diacryloylpiperazin, N,N'-Diallyltartardiamid) liegt im Verhältnis zu Acrylamid-Monomeren zwischen 1 : 5 und 1 : 200, vorzugsweise zwischen 1 : 20 und 1 : 50. Die Polymerisation verläuft normalerweise in einer wässrigen Umgebung und wird z. B. durch UV-Licht oder durch Radikalbildner gestartet.
Man kann verschiedene Substanzen/Moleküle an das Gel binden. Wobei Moleküle unmittelbar an die Gelmatrix oder auch durch ein Verbindungsstück, einen Linker, oder durch einen Verbindungspartner gebunden werden können. Im Falle einer direkten Bindung der Moleküle an die Gelmatrix (z. B. ein Linker für weitere Bindungspartner) wird eine kovalente Bindung bevorzugt. Es existieren viele Möglichkeiten einer kovalenten Ankopplung von Substanzen an die Gelmatrix (s. "Affinity Chromatography a practical approach" Ed. Dean at al. IRL Press 1991; "Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology: an introduction to affinity chromatography" C. R. Lowe Elsevier Biomedical Press 1985; in Chromatographic science series v. 27 "Affinity chromatography, template chromatography of nucleic acids and proteins" H. Schott, Marcel Dekker Inc. 1984; ; in Chromatographic science series v. 33 "Affinity chromatography, practical and theoretical aspects" P. Mohr and K. Pommerening, Marcel Dekker inc. 1985). An das Gel gebundene Substanzen können ihrerseits andere Moleküle binden und somit zu deren Immobilisierung führen. Wie bei der Affinitätbindung (z. B. Biotin-Avidin) oder z. B. wie bei der Hybridisierung von Nukleinsäuren.
Die Bindung verschiedener Substanzen an die Gelmatrix kann im gesamten Gelvolumen erfolgen oder sich nur auf die Geloberfläche beschränken. Im wesentlichen häng die abzustrebende Verteilung von gebundenen Molekülen im Gel von der Aufgabestellung und von der Art der durchzuführenden Experimente ab. So können beispielsweise in der dargestellten Ausführungsform die an die Gelmatrix gebundenen Primer für die Sequenzierungsreaktion im gesamten Gelvolumen verteilt sein (Fig. 3). Die Primer können direkt oder über einen Linker an das Gel gebunden werden, s. Beispiele. An diese Primer können entsprechende NSKs während eines Hybridisierungsschrittes gebunden werden, wobei NSKs unterschiedlich tief in das Gelinnere eindringen, weil die Geloberfläche eine Barriere für die Diffusion größerer Moleküle darstellt (Fig. 4). Kürzere NSKs dringen tiefer in das Gel ein als längere NSKs. Die Tiefe der Diffusion der NSKs in das Gel hängt unter anderem von der Gelmaschengröße und von der Zeit der Inkubation der NSKs mit der Geloberfläche ab. Bevorzugt wird eine Oberfläche, die zu einer möglichst geringen Diffusion der NSKs in das Gel führte. Das kann man beispielsweise durch eine kürzere Inkubationszeit und einen größeren Vernetzungsgrad des Gels erreichen. Die auf diese Weise gebildete NSK-Primer-Komplexe dienen als Matrizen für den Einbau markierter NT*s. Da die Polymerase zum Einbau von NT*s in die NSK-Primer- Komplexe selbst an diese Komplexe binden muß, spielt die Zugänglichkeit dieser Komplexe für die Polymerase eine wichtige Rolle. Diese Zugänglichkeit wird unter anderem durch die Gelmaschengröße und die Zeit der Inkubation der Reaktionslösung mit Polymerase und NT*s mit den NSK-Primer-Komplexen bestimmt. Bevorzugt werden Gelzusammensetzungen und Reaktionsbedingungen so gewählt, dass sie eine Einbaureaktion auf der Geloberfläche bzw. nahe der Geloberfläche (vorzugsweise in der Tiefenschärfe der Detektionsapparatur) erlauben und die Diffusion der Polymerase in das Gel weitgehend verhindern.
Die Immobilisierung von Substanzen kann an bestimmten Positionen oder in zufälliger Anordnung, randomisiert, im Gel oder auf der Oberfläche erfolgen. In der bevorzugten Anwendung der erfindungsgemäßen Oberfläche zur Sequenzierung einzelner NSKs werden NSKs in zufälliger Anordnung auf der Oberfläche immobilisiert. Dies kann beispielsweise durch eine zufällige Immobilisierung von Primern auf oder im Gel und anschließende Hybridisierung von NSKs and die Primer erzielt werden (s. o.). Durch die Immobilisierung behält jede NSK über die gesamte Sequenzierungsreaktion dieselben x,y-Koordinaten auf der Reaktionsoberfläche, was als Voraussetzung für die Sequenzbestimmung gilt (s. Tcherkassov et al. "Verfahren zur Bestimmung der Genexpression" DPuMA-Aktenzeichen 101 20 798.0-41, Tcherkassov et al. "Verfahren zur Analyse von Nukleinsäureketten" DPuMA-Aktenzeichen 101 20 797.2-41, Tcherkassov et al. "Verfahren zur Analyse von Nukleinsäurekettensequenzen und der Genexpression" DPuMA-Aktenzeichen 101 42 256.3 Anmeldungen).
Die Immobilisierung von an der Reaktion beteiligten Molekülen soll in einer Dichte erfolgen, die eine eindeutige Identifizierung der Mehrzahl einzelner markierter Moleküle (z. B. 50 bis 95% eingebauter NT*s) auf der Oberfläche erlaubt. Beispielsweise werden Moleküle in einer solchen Dichte immobilisiert, die eine Signaldetektion von durchschnittlich zwischen 10 und 100 Signale von einzelnen Molekülen pro 100 µm² erlaubt. Da die Verteilung der NSKs auf der Oberfläche zufällig erfolgt, besteht die Wahrscheinlichkeit, daß einige Moleküle zu dicht aneinander immobilisiert werden und so die Signale von eingebauten NT*s (mit jeweiliger Apparatur detektiert) nicht eindeutig zu bestimmten NSKs zugeordnet werden können. Einnerseits steigt die Wahrscheinlichkeit, daß einige NSKs zu dicht immobilisiert werden, mit der Dichte der Immobilisierung und so kann man bei einer zu hohen Immobilisierungsdichte keine eindeutige Zuordnung detektierter Signale zu NSKs vornehmen. Andererseits möchte man möglichst viele NSKs immobilisieren und damit einen möglichst großen Durchsatz (große Parallelität) bei der Analyse erreichen. Die Fähigkeit die Signale von benachbarten markierten Molekülen zu unterscheiden, hängt unter anderem von dem Auflösungsvermögen der Apparatur und der analysierenden Software ab. In der Zukunft wird es leistungsstärkere Detektionssysteme und Programme geben, deswegen ist die Immobilisationsdichte vorzugsweise so zu wählen, daß ca. 50 bis 90% detektierter Signale von einzelnen eingebauten NT*s eindeutig zu bestimmten NSKs zugeordnet werden können. Der Wert "10 bis 100 detektierter Signale pro 100 µm²" gilt nur als Beispiel für die Immobilisierungsdichte.
Die Immobilisationsdichte kann durchschnittlich 10 bis 100 Targetmoleküle (z. B. NSK-Primer- Komplexe) pro 100 µm² sein, wenn alle Targetmoleküle markiert werden. Falls die Markierungsreaktion nur an einem geringen Anteil immobilisierter Targetmolekülen abläuft, muß die Immobilisationsdichte der Targetmoleküle höher sein.
Die Fläche der Geloberfläche kann beliebig groß sein. Die Geldicke liegt vorzugsweise zwischen 1 und 100 µm, idealerweise zwischen 4 und 10 µm. Damit erreicht man einerseits einen ausreichenden Abstand vom festen Träger, so dass die an den festen Träger unspezifisch gebundenen markierten Moleküle nicht im Fokus des Objektivs liegen und so nur unwesentlich zum Hintergrundsignal beitragen, andererseits können markierte Substanzen mit niedrigem Molekulargewicht bei einem Waschschritt schnell aus dem dünnen Gel herausdiffundieren.
Man kann das Ergebnis einer Reaktion mit einzelnen immobilisierten Molekülen durch die Detektion von Fluoreszenzsignalen erfassen. Dazu wird mindestens ein Reaktionspartner mit einem oder mehreren Fluoreszenzfarbstoffen markiert, in der beschriebenen Ausführungsform sind NT*s markiert. Das Signal kann je nach Reaktionablauf an einem bestimmten Ort auftreten oder verschwinden oder sich in seinen Eigenschaften verändern. Das Auftreten des Signals kommt z. B. dann vor, wenn ein markiertes Molekül an das auf der Geloberfläche immobilisierte Molekül während der Reaktion gebunden hat. Die Abspaltung eines Fluoreszenzfarbstoffs vom an das Gel gebundenen Molekül führt zum Verschwinden des Signals. Eine Signalveränderung (z. B. eine spektrale Verschiebung) kann beispielsweise durch die Bindung eines anderen Moleküls verursacht werden.
Durch die Verwendung der erfindungsgemäßen Oberfläche wird die unspezifische Bindung reduziert und im Idealfall werden nur spezifische Immobilisierungereignisse detektiert. Diese Immobilisierung kann als Folge unterschiedlicher Reaktionen auftreten. Zu solchen Reaktionen gehören beispielsweise:

1. spezifische Bindungsreaktionen (wie z. B. Ligand-Rezeptor-, oder Antigen-Antikörper- Bindung, oder Bindung zwischen komplementären Nukleinsäuren)
2. Enzymatische Synthesereaktionen, Primerextensionsreaktionen

Die erfindungsgmäße Geloberfläche kann somit bei verschiedenen Screeninguntersuchungen und sequentiell ablaufenden Reaktionen eingesetzt werden, die auf der Einzelmoleküldetektion basieren. Eine kurze Beschreibung einer sequentiellen Reaktion, eine Sequenzierungsreaktion, ist in Beispiel 2 und Beispiel 3 dargestellt. Ausführliche Beschreibung findet man in Anmeldungen (Tcherkassov et al. "Verfahren zur Bestimmung der Genexpression" DPuMA- Aktenzeichen 101 20 798.0-41, Tcherkassov et al. "Verfahren zur Analyse von Nukleinsäureketten" DPuMA-Aktenzeichen 101 20 797.2-41, Tcherkassov et al. "Verfahren zur Analyse von Nukleinsäurekettensequenzen und der Genexpression" DPuMA-Aktenzeichen 101 42 256.3).
Zur Detektion der Fluoreszenzsignale von einzelnen Molekülen können verschiedene Techniken verwendet werden, einige mögliche Varianten der Detektionsapparatur sind im Beispiel 4 angegeben. Zur optimalen Detektion müssen sich die zu detektierenden Moleküle in einer Fokusebene (unter Berücksichtigung der Tiefenschärfe des jeweiligen Objektivs) befinden. Dies wird durch die Verwendung einer planen Geloberfläche erreicht. Das Gel muß eine gewisse mechanische Stabilität besitzen, so dass die Geloberfläche mindestens über die Reaktions- und Detektionsdauer plan bleibt.
Das Gel mit seiner Reaktionsoberfläche liegt vorzugsweise auf einem festen Träger. Dieser feste Träger ist vorzugsweise plan. Das Material, aus dem der feste Träger besteht, darf die Reaktions- und Detektionsschritte nicht stören und besteht beispielsweise aus Glas oder Kunststoff. Der feste Träger, das Gel und die Geloberfläche können Teile eines Reaktionsgefäßes oder eines Mikroflüssigkeitskanals (MFK), eines sogenannten "microfluidic channel" oder einer "flow cell", sein. Je nach Aufbau des MFK kann der feste Träger lichtdurchlässig oder lichtundurchlässig sein. In Fig. 5 ist ein beispielhafter Aufbau dargestellt, bei dem das Anregungslicht direkt auf die Geloberfläche (Fig. 5a) oder durch das Gel auf die Geloberfläche (Fig. 5b) gelangt. Bei der zweiten Ausführungsform (Fig. 5b) muß der feste Träger sowohl für das Anregungs-, als auch für das Fluoreszenzlicht durchlässig sein.
Das Gel kann an den festen Träger durch Adhäsion oder durch kovalente Bindung befestigt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird auf die Geloberfläche ein Muster aufgebracht. Dieses Muster besteht vorzugsweise aus Mikroteilchen, deren Durchmesser kleiner oder gleich 5 µm ist, vorzugsweise zwischen 300 nm und 1000 nm liegt. Dieses Muster ist für die Auffindung der Geloberflächeebene und zur Fokussierung mit optischen Mitteln wichtig. Diese Teilchen besitzen vorzugsweise andere optische Eigenschaften, als die zu untersuchenden markierten Proben, so dass sie die Detektion nicht beeiträchtigen. In einer Ausführungsform sind sie lichtundurchlässig bzw. absorbieren Licht und können dadurch im Transmissionslicht detektiert werden. Als Beispiel solcher Teilchen dienen Tusche-Kohle-Teilchen, Polystyrene- oder Latex- Teilchen.

Beispiele

Beispiel 1

Gelvorbereitung

Polyacrylgel

Das Polyacrylamid-Gel für die Analyse von Reaktionen mit einzelnen Molekülen wird nach allgemeinen Regeln der Gel-Vorbereitung für elektrophoretische Auftrennung erstellt ("Electrophoresis" A. T. Andrews, Oxford science publications 1995).
Die Polymerisationsreaktion kann z. B. durch UV-Licht oder durch Radikalbildner durchgeführt werden. Im folgende Beispiel wird Ammoniumpersulfat (APS) und TEMED (Tetramethyethylendiamin) zur Radikalreaktion verwendet, z. B. TEMED 0.01% v/v und APS 0.04% w/v.
Die Komponentenzusammensetzung kann breit variieren, die Konzentrationen einzelner Komponenten liegen in folgenden Bereichen (errechnet für die gebrauchsfertige wässrige AA- bisAA-Lösung):
Acrylamid-monomer (AA) zwischen 3 bis 30%, idealerweise zwischen 10 und 20%
Bis-Acrylamid (bis-AA) im Verhältnis zum Acrylamid-Monomer 1 : 10 bis 1 : 50, vorzugsweise 1 : 20.
Zur Herstellung werden 2 saubere Glasplatten verwendet (mit Aceton und danach mit MP- Wasser gewaschen). Eine Glasplatte (P1) wird vorzugsweise mit einem wasserabweisenden Reagenz vorbehandelt, z. B Repel-silan, Dimethyldichlorsilane-Lösung, Amersham Pharmacia- Biotech. P2 dient als fester Träger für das Gel und kann mit gelbindenden Reagenzien z. B. Bindsilan, Methacryloxypropyltrimethoxysilane, Amersham Pharmacia-Biotech, vorbehandelt werden, so dass es zu einer kovalenten Bindung zwischen dem Gel und der Glasoberfläche kommt. Die P2-Vorbehandlung mit gelbindenden Reagentien ist dann sinnvoll, wenn mehrere Reaktionen mit immobilisierten Molekülen durchgeführt werden müssen. Bei einer geringeren Anzahl an Reaktionen ist eine solche Vorbehandlung nicht notwendig. In diesen Fällen reicht, für P2 eine saubere Glas-Oberfläche aus, so dass das Gel allein durch adhäsive Kräfte an der Glasoberfläche haften bleibt.
Die fertige Polymerisationslösung (AA- bis AA-Lösung mit Radikalbildnern) wird zwischen P1 und P2 gegossen, so dass eine Schicht von ca. 10 bis 30 km resultiert. Die Dicke des Gels kann z. B. durch Abstandhalter kontrolliert werden. Nach Erhärtung wird P1 entfernt. Das Gel bleibt auf P2 haften. Es wird mit entionisiertem Wasser gewaschen.
Das ausgebildete Gel kann direkt weiter verwendet werden oder in verschiedenen Fertigungsstadien getrocknet und gelagert werden. Vor einer Reaktion mit markierten Molekülen wird das Gel normalerweise einige Minuten in der Reaktions-Pufferlösung aufgequollen und erst dann in die Reaktion eingesetzt.

Kovalente Bindung an das Polyacrylamidgel

Je nach Methode zur Immobilisierung von Target-Molekülen können einerseits Substanzen eingesetzt werden, die an der radikalischen Polymerisationsreaktion teilnehmen und so in die Gelmatrix eingebunden werden, andererseits kann die Gelmatrix nach der abgelaufenen Polymerisation mit verschiedenen Substanzen modifiziert werden ("Affinity Chromatography a practical approach" Ed. Dean at al. IRL Press 1991; "Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology: an introduction to affinity chromatography" C. R. Lowe Elsevier Biomedical Press 1985; in Chromatographic science series v. 27 "Affinity chromatography, template chromatography of nucleic acids and proteins" H. Schott, Marcel Dekker Inc. 1984; ; in Chromatographic science series v. 33 "Affinity chromatography, practical and theoretical aspects" P. Mohr and K. Pommerening, Marcel Dekker inc. 1985).
Für die Einbindung der Substanzen in die Gelmatrix während der Polymerisation, besitzen diese Substanzen im allgemeinen eine Alkengruppe, die zum Einbau in die Gelmatrix geeignet ist (z. B. eine Allylgruppe), weiterhin eine Kohlenstoffkette (Abstandhalter/Spacer) und eine reaktive funktionelle Gruppe, die zur Ankopplung anderer Moleküle dienen kann. Diese funktionelle Gruppe kann z. B. eine Epoxid-, Aldehyd-, Thiol- oder Aminogruppe usw. sein. Beispiel für solche Substanzen ist Allyl-glycidylether, weitere Beispiele findet man in oben angegebenen Literaturhinweisen. Sie werden zum Polymerisationsgemisch zugegeben und dienen in späteren Reaktionen als Linker zur Ankopplung anderer Substanzen an das Gel. Als Ergebnis entsteht ein Polymer (Gel) mit funktionellen Gruppen. Beispiel für solches Polymer stellt Eupergit C (Rohm Pharma) dar. An das Eupergit C können beispielsweise Substanzen mit freien Aminogruppen (z. B. Primer mit einer an das 5'-Ende gekoppelten Aminogruppe) gebunden werden ("Affinity Chromatography a practical approach" Ed. Dean at al. IRL Press 1991).

Primerimmobilisierung

In einer bevorzugten Ausführungsform werden an die Gelmatrix Primer fixiert. An diese Primer werden vor der Sequenzierung die zu analysierenden NSKs hybridisiert und somit an der Geloberfläche immobilisiert. Sowohl ein einheitlicher Primer als auch eine Primerbibliothek können an die Gelmatrix gebunden werden. Vorzugweise werden Primer mit einer Konzentration (Primermenge bezogen auf Gelvolumen) immobilisiert, die zwischen 20 nM und 200 µM liegt (entspricht ca. 10 Primermoleküle pro 1 µm³ bis 100.000 Primermoleküle pro 1 µm³), vorzugsweise zwischen 200 nM und 20 µM liegt (entspricht ca. 100 bis 10.000 Primermolekülen pro 1 µm³).
Die Primer können an das Gel beispielsweise nach Verfahren gebunden werden, die in Mirzabekov et al. US-Patent 5.981.734, Timofeev et al. NAR 1996 v. 24, S. 3142, Fahy et al. NAR 1993 v. 21 S. 1819 beschrieben sind.
In einer anderen Ausführungsform kann Allyl-glycidylether als Linker zwischen den Primern und der Gelmatrix verwendet werden. Dabei wird Allyl-glycidylether zum Polymerisationsgemisch in Konzentration zugegeben, die für die zu immobilisierenden Primer errechnet wurde, z. B. 2 µM. Nach der Polymerisation und einem anschließenden Waschschritt werden Primer mit einer Aminogruppe am 5'-Ende zur Ankopplung an die Allyl-glycidylether auf das Gel gebracht. Die nichtgebundenen Primer werden in einem Waschschritt entfernt und die nicht abreagierten Epoxy-gruppen des Eupergit C im Gel durch Zugabe einer nucleophilen Substanz (z. B. Ethanolamine oder Gamma-Aminobuttersäure) deaktiviert.
An die immobilisierten Primer können komplementäre NSKs gebunden werden.

Agarosegel

Ein Agarosegel kann beispielsweise folgendermaßen vorbereitet werden:
In eine 0.5 bis 2% heiße wäßrige Agarose-lösung wird ein fester Träger eingetaucht, so dass eine Schicht der Agarose-Lösung auf dem Träger bleibt. Anschließend wird der Träger getrocknet. Es entsteht eine dünne Schicht mit ausgetrocknetem Agarosagel.

Muster auf der Geloberfläche

In einer Ausführungsform wird eine wässrige Suspension von Kohle-Teilchen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 0.5-1 µm (verdünnte Tusche) auf das trockene Gel aufgetragen und getrocknet, so dass Tusche-Teilchen fest mit dem Gel verbunden sind. Diese Teilchen dienen als optische Justierung zum Auffinden der Fokusebene.

Unspezifische Bindung langer NSKs an das Gel

Lange NSK (mehr als 1000 NT) können auch durch ihre schwache unspezifische Bindung an das Gel (z. B. Acrylamid-, Cellulose- oder Agarosegel) gebunden werden. Diese Art der Bindung ist nicht stabil, genügt aber in Fällen, wenn nur wenige Reaktionen mit immobilisierten Molekülen durchgeführt werden müssen. Dabei wird eine NSK-enthaltende Lösung auf das trockene Gel aufgetragen und bei erhöhter Temperatur (ca. 50-90 Grad C) an das Gel fixiert. Beim Aufquellen des Gels mit dem Puffer löst sich ein wesentlicher Teil der gebundenen NSKs wieder vom Gel, so dass in der Regel weniger als 10% der aufgetragenen NSKs mit dem Gel verbunden bleiben.

Beispiel 2

Sequenzierung

Die erfindungsgemäße Oberfläche kann bei einem Verfahren zur Ermittlung der Nukleinsäuresequenzen in verschiedenen Bereichen der Genetik eingesetzt werden. Dazu zählen insbesondere die Bestimmung unbekannter, langer Sequenzen, Analyse der Genexpression, Analysen von Sequenz-Polymorphismen und Punktmutationen sowie die parallele Analyse einer großen Zahl an Gensequenzen. Bei der Analyse langer Nukleinsäureketten (z. B. 100 Kb und länger) hängt die Vorbereitung des zu analysierenden Materials (einzel- und doppelsträngige Nukleinsäuresequenzen) von der Aufgabestellung ab und hat das Ziel, aus einer langen Nukleinsäurekette eine Population an relativ kleinen, einzelsträngigen Nukleinsäurekettenfragmenten (NSKFs) zu bilden, diese Fragmente mit einem für den Start der Sequenzierungsreaktion geeigneten Primer zu versehen und auf einer planen Oberfläche zu fixieren.
Dabei werden einzelne NSKFs auf der Geloberfläche in einer solchen Weise fixiert, dass eine enzymatische Reaktion an diesen Molekülen ablaufen kann. Prinzipiell sind verschiedene Arten der Immobilisation möglich, die von der Zielsetzung, der Art der NSK und der für die Reaktion eingesetzten Polymerase abhängen. Die NSKFs werden bei der Immobilisierung zufällig auf der Oberfläche verteilt, d. h. es muß also nicht auf eine exakte Positionierung der einzelnen Ketten geachtet werden. Die Nukleinsäureketten müssen dabei in einer solchen Dichte auf der Oberfläche fixiert werden, dass eine eindeutige Zuordnung der später detektierten Signale zu einzelnen NSKFs gewährleistet ist.
Nach der Vorbereitung der NSKFs startet man mit allen auf der Oberfläche immobilisierten Molekülen die Sequenzierungsreaktion. Als Grundlage der Sequenzierung dient die Synthese des komplementären Stranges zu jedem einzelnen immobilisierten NSKF. Dabei werden in den neu synthetisierten Strang markierte NT*s eingebaut. Die Polymerase baut nur ein einziges markiertes NT* in die wachsende Kette ein. Dies wird durch die reversible Ankopplung eines zur Termination führenden Substituenten an NT*s erreicht. Der Einbau eines weiteren markierten NT* wird dadurch unmöglich gemacht.
Die Sequenzierungsreaktion verläuft in mehreren Zyklen. Ein Zyklus umfasst folgende Schritte:

a) Zugabe einer Lösung mit markierten Nukleotiden (NT*s) und Polymerase zu immobilisierten Nukleinsäureketten,
b) Inkubation der immobilisierten Nukleinsäureketten mit dieser Lösung unter Bedingungen, die zur Verlängerung der komplementären Stränge um ein NT geeignet sind,
c) Waschen,
d) Detektion der Signale von einzelnen Molekülen,
e) Entfernung der Markierung und der zur Termination führenden Gruppe von den eingebauten Nukleotiden,
f) Waschen.

Gegebenenfalls erfolgt eine mehrfache Wiederholung des Zyklus (a-f).
Die Reaktionsbedingungen des Schrittes (b) in einem Zyklus werden so gewählt, dass die Polymerasen an mehr als 50% der an der Sequenzierungsreaktion beteiligten NSKFs in einem Zyklus ein markiertes NT* einbauen können, vorzugsweise an mehr als 90%.
Die Anzahl der durchzuführenden Zyklen hängt dabei von der jeweiligen Aufgabenstellung ab, ist theoretisch nicht beschränkt und liegt vorzugsweise zwischen 20 und 5000.
Danach wird für jedes fixierte NSKF seine spezifische Sequenz aus der Reihenfolge der eingebauten NT*s ermittelt. Aus den überlappenden NSKF-Sequenzen kann die ursprüngliche NSK-Sequenz rekonstruiert werden ("Automated DNA sequencing and analysis" S. 231 ff. 1994 M. Adams et al. Academic Press, Huang et al. Genom Res. 1999 v. 9 S. 868, Huang Genomics 1996 v. 33 S. 21, Bonfield et al. NAR 1995 v. 23 S. 4992, Miller et al. J. Comput. Biol. 1994 v.1 S. 257). Dabei sucht man in der gesamten Population von NSKF-Sequenzen nach Übereinstimmungen/Überlappungen in den Sequenzen von NSKFs. Durch diese Übereinstimmungen/Überlappungen kann man die NSKF in eine Reihe bringen, z. B.:
In der Praxis hat sich bei einer Sequenzierung von unbekannten Sequenzen bewährt, eine Länge der sequenzierten Stücke von mehr als 300 bp zu erreichen. Das erlaubt die Sequenzierung von Genomen aus Eukaryonten im Schrotschuss-Verfahren.
Dabei können die Fehler der Methode mit verschiedenen Mitteln erfasst und korrigiert werden. Sämtliche Schritte des Verfahrens können weitgehend automatisiert werden.
Durch die Arbeit mit einzelnen Molekülen ergeben sich mehrere Vorteile:

1. Da die Moleküle einzeln detektiert werden, besteht keine Gefahr, dass das Signal durch die Desynchronisation in der Population fehlerhaft wird. Für jedes fixierte NSKF wird eine eigene Sequenz erstellt. Daher spielt es keine Rolle, ob an einem benachbarten Molekül die Synthese bereits weiter fortgeschritten oder zurückgeblieben ist.
2. Es ist nicht notwendig, Moleküle in einer definierten Anordnung auf der Oberfläche zu fixieren, da das Signal von einzelnen Molekülen ausgeht und nicht von einer räumlich definierten Population.

Im folgenden sollen anhand der Sequenzierung langer DNA-Stücke beispielhaft die allgemeinen Prinzipien der Reaktion dargestellt werden. Der Sequenzierung und der Rekonstruktion von Nukleinsäurensequenzen liegt das Shotgun-Prinzip zugrunde ("Automated DNA sequencing and analysis" S. 231 ff. 1994 M. Adams et al. Academic Press, Huang et al. Genom Res. 1999 v. 9 S. 868, Huang Genomics 1996 v. 33 S. 21, Bonfield et al. NAR 1995 v. 23 S. 4992, Miller et al. J. Comput. Biol. 1994 v. 1 S. 257). Die Sequenz eines langen DNA-Stücks wird dabei durch die Sequenzierung kleiner DNA-Fragmente und die nachfolgende Rekonstruktion ermittelt. Das zu analysierende Material (1) wird für die Sequenzierungsreaktion vorbereitet, indem es in Fragmente von vorzugsweise 50 bis 1000 bp Länge zerlegt wird (2). Jedes Fragment wird anschließend mit einer Primerbindungsstelle und einem Primer versehen (3). Dieses Gemisch aus verschiedenen DNA-Fragmenten wird nun auf einer planen Geloberfläche fixiert (4). Die nicht gebundenen DNA-Fragmente werden durch einen Waschschritt entfernt. Danach wird die Sequenzierungsreaktion an der gesamten Reaktionsoberfläche durchgeführt. Diese Reaktion verläuft zyklisch. Im 1. Schritt des Zyklus wird ein mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiertes NT* in den wachsenden Strang eingebaut: Dabei wird die Reaktion so gesteuert, dass in jedem Zyklus jeweils nur ein markiertes NT* von einer Polymerase in den wachsenden Strang eingebaut werden kann. Das wird durch die Verwendung von NT*s erreicht, die eine reversibel gekoppelte, zur Termination führende Gruppe tragen. Der Einbau eines weiteren markieren NT* wird dadurch unmöglich gemacht. Die Polymerase und die markierten NT*s werden gleichzeitig in die Reaktion eigesetzt (5). Danach wird das Reaktionsgemisch entfernt und die Oberfläche in geeigneter Art und Weise gewaschen (6). Nun folgt ein Detektionsschritt (7): Die Oberfläche wird mit einer für die Einzelmoleküldetektion geeigneten Vorrichtung (bestehend aus Lichtquelle, Mikroskop, Kamera, Scantisch, Computer mit Steuerungs- und Bilderkennungs- bzw. Bildverarbeitungssoftware) abgescannt und die Signale der einzelnen, eingebauten markierten NT*s identifiziert. Nach dem Detektionsschritt wird die Markierung und die zur Termination führende Gruppe von allen eingebauten NT*s entfernt (8). Nach einem sich anschließenden Waschschritt kann ein neuer Zyklus beginnen. Zur Rekonstruktion einer größeren ursprünglichen DNA-Sequenz (z. B. mehrere Mb langes DNA-Stück) sollen die DNA- Fragmente einige Hundert NT lang sein, falls man die Rekonstruktion nach dem Shotgun- Prinzip durchführt ("Automated DNA sequencing and analysis" S. 231 ff. 1994 M. Adams et al. Academic Press, Huang et al. Genom Res. 1999 v. 9 S. 868, Huang Genomics 1996 v. 33 S. 21, Bonfield et al. NAR 1995 v. 23 S. 4992, Miller et al. J. Comput. Biol. 1994 v. 1 S. 257). Da pro Zyklus nur jeweils ein markiertes NT* eingebaut wird, sind mindestens 300 Zyklen zur Sequenzierung notwendig.

Beispiel 3

Genexpressionaanalyse

Die erfindungsgemäße Oberfläche kann auch bei einem Verfahren zur Analyse der Genexpression eingesetzt werden. Dieses Verfahren hat durch eine gleichzeitige Sequenzierung einzelner Genproduktmoleküle mehrere Vorteile gegenüber bekannten Methoden der Analyse der Genexpression:

1. Die Genprodukte können in einer beliebigen Anordnung auf der Oberfläche binden. Eine vorherige aufwendige Synthese von verschiedenen Oligonukleotiden an bestimmten Positionen (wie beispielsweise bei der Hybridisierungsmethode) ist somit nicht notwendig.
2. Das Material kann auf einer standardisierten Oberfläche analysiert werden.
3. Auch die Expression noch unbekannter Gene kann ermittelt werden, weil alle im Ansatz enthaltenen Genprodukte analysiert werden.
4. Die große Anzahl der analysierten Moleküle erlaubt auch die Detektion schwach exprimierter Gene.
5. Kleinste Mengen an Ausgangsmaterial können eingesetzt werden: mRNA aus einer einzelnen Zelle kann für die Analyse ausreichend sein.
6. Sämtliche Schritte des Verfahrens können weitgehend automatisiert werden.

Die Methode basiert auf mehreren Prinzipien:

1. Kurze Nukleotidsequenzen (10-50 NTs) enthalten genügend Informationen zur Identifizierung des korrespondierenden Gens, wenn die Gensequenz selbst bereits in einer Datenbank enthalten ist.
Eine Sequenz aus beispielsweise 10 NTs kann mehr als 10⁶ verschiedene Kombinationen bilden. Das ist z. B. für die meisten Gene im menschlichen Genom, das nach heutiger Schätzung 32000 Gene enthält, ausreichend. Für Organismen mit weniger Genen kann die Sequenz noch kürzer sein.
2. Der Methode liegt die Sequenzierung einzelner Nukleinsäurekettenmoleküle zugrunde.
3. Es können Nukleinsäureketten-Gemische untersucht werden.
4. Die Sequenzierungsreaktion läuft an vielen Molekülen gleichzeitig ab, wobei die Sequenz jeder einzelnen immobilisierten Nukleinsäurekette analysiert wird. Es ist bekannt, dass zur Untersuchung der Genexpression mRNAs oder von der mRNA abgeleitete Nukleinsäureketten (z. B. einzelsträngige cDNAs, doppelsträngige cDNAs, von cDNA abgeleitete RNA oder von cDNA amplifizierte DNA) eingesetzt werden. Unabhängig von der genauen Zusammensetzung werden sie im folgenden als Genprodukte bezeichnet. Auch Teilsequenzen dieser Genprodukte werden im folgenden als Genprodukte bezeichnet.

Diese Genprodukte stellen ein Gemisch aus Nukleinsäureketten unterschiedlicher Länge dar. Sie werden erfindungsgemäß auf einer geeigneten planen Oberfläche in zufälliger Anordnung fixiert. Nach der Fixierung startet man mit allen auf der Oberfläche immobilisierten Genprodukten die Sequenzierungsreaktion.
Als Grundlage der Sequenzierung dient die Synthese eines zum immobilisierten Genprodukt komplementären Stranges. Dabei werden in den neu synthetisierten Strang markierte NT*s eingebaut. Die Signale der eingebauten markierten NT*s werden detektiert. Die Sequenzierungsreaktion verläuft in mehreren Zyklen. Pro Zyklus wird jeweils nur ein einziges markiertes NT* in den wachsenden Strang eingebaut. Ein Zyklus umfasst folgende Schritte:

a) Zugabe einer Lösung mit markierten Nukleotiden (NT*s) und Polymerase zu immobilisierten Nukleinsäureketten,
b) Inkubation der immobilisierten Nukleinsäureketten mit dieser Lösung unter Bedingungen, die zur Verlängerung der komplementären Stränge um ein NT geeignet sind,
c) Waschen,
d) Detektion der Signale von einzelnen Molekülen,
e) Entfernung der Markierung und der zur Termination führenden Gruppe von den eingebauten Nukleotiden
f) Waschen.

Gegebenenfalls erfolgt eine mehrfache Wiederholung des Zyklus (a-f).
Dieser Zyklus kann mehrmals wiederholt werden, so dass von jedem immobilisierten Genprodukt vorzugsweise 10 bis 50 NTs ermittelt werden. Danach erfolgt die Rekonstruktion der Nukleinsäuresequenzen aus den detektierten Signalen. Die ermittelten Sequenzen der immobilisierten Genprodukte werden zur Bestimmung der Abundanzen untereinander verglichen und durch Vergleich mit Gensequenzen in Datenbanken bestimmten Genen zugeordnet.
Dies wird an einem Beispiel verdeutlicht:
Als Ausgangsmaterial dient ein Gemisch aus mRNA-Molekülen. Das zu analysierende Material (1) wird auf einer geeigneten planen Geloberfläche fixiert (2). Die Oberfläche trägt immobilisierte poly-dT-Oligonukleotide, die als Primer zum Reaktionsstart und als Linker für die Immobilisierung dienen (oligo-dT-Primer). Die nicht gebundenen mRNA-Moleküle werden durch einen Waschschritt entfernt. Danach wird die Sequenzierungsreaktion an der gesamten Reaktionsoberfläche durchgeführt. Diese Reaktion verläuft zyklisch. Im 1. Schritt des Zyklus wird ein markiertes NT* in den wachsenden Strang eingebaut: Dabei wird die Reaktion so gesteuert, dass in jedem Zyklus jeweils nur ein markiertes NT* von einer Polymerase (Reverse Transcriptase) in den wachsenden Strang eingebaut werden kann. Das wird durch die Verwendung von NT*s erreicht, die eine reversibel gekoppelte, zur Termination führende Gruppe tragen. Der Einbau eines weiteren markierten NT* wird dadurch gehindert. Die Polymerase und die markierten NT*s werden gleichzeitig in die Reaktion eingesetzt (3). Danach wird das Reaktionsgemisch entfernt und die Oberfläche in geeigneter Art und Weise gewaschen (4). Nun folgt ein Detektionsschritt (5). Die Oberfläche wird mit einer für die Einzelmoleküldetektion geeigneten Vorrichtung (bestehend z. B. aus Lichtquelle, Mikroskop, Kamera, Scantisch, Computer mit Steuerungs- und Bilderkennungs- bzw. Bildverarbeitungssoftware) abgescannt und die Signale der einzelnen, eingebauten markierten NT*s identifiziert. Nach dem Detektionsschritt wird die Markierung und die zur Termination führende Gruppe von allen eingebauten NT*s entfernt (6). Die Entfernung kann chemisch, physikalisch oder enzymatisch erfolgen. Nach einem sich anschließenden Waschschritt kann ein neuer Zyklus beginnen.

Beispiel 4

Apparatur

Erfindungsgemäß werden Fluoreszenz-Signale einzelner in die Nukleinsäurekette eingebauter NT*s vorzugsweise mit einem Weitfeld-Fluoreszenz-Mikroskop oder einem Laser-Scanning- Mikroskop detektiert.
Es sind verschiedene Varianten der Konstruktion einer solchen Apparatur möglich (Weston et al. J. Chem. Phys. 1998 v. 109 S. 7474, Trabesinger et al. Anal. Chem. 1999 v. 71 S. 279, Unger et al. BioTechniques 1999 v. 27 S. 1008, "Confocal Laser Scanning Microscopy" 1997 Ed. Sheppard, BIOS Scientific Publishers, "New Techniques of optical microscopy and microspectroscopy" 1991 Ed. R. Cherry CRC Press, Inc., "Fluorescence microscopy" 1998 2. ed. Herman BIOS Scientific Publishers, "Handbook of biological confocal microscopy" 1995 J. Pawley Plenum Press). Unterschiede in ihrem konkreten Aufbau ergeben sich aus der Variation ihrer Einzelteile. Die Vorrichtung für das Anregungslicht kann z. B. auf der Basis eines Lasers, einer Lampe oder von Dioden funktionieren. Für die Detektionsvorrichtung können sowohl CCD-Kameras als auch PMT dienen. Andere Beispiele für technische Details siehe ("Confocal Laser Scanning Microscopy" 1997 Ed. Sheppard, BIOS Scientific Publishers, "New Techniques of optical microscopy and microspectroscopy" 1991 Ed. R. Cherry CRC Press, Inc., "Fluorescence microscopy" 1998 2. ed. Herman BIOS Scientific Publishers, "Handbook of biological confocal microscopy" 1995 J. Pawley Plenum Press). Der prinzipielle Aufbau einer geeigneten Apparatur wird in einem Schema Fig. 6 erläutert. Sie besteht aus folgenden Elementen: 201 Lichtquelle für Epifluoreszenzmodus
202 Fukussierungsoptik (1)
203 Shutter (S1)
204 Lichtstrahl des Anregungslichts
205 Filtersatz bzw. mehrere Filtersätze zur Selektion von Lichtwellenlängen und Farbteiler
206 Objektiv
207 MFK mit Reaktionsoberfläche und zugehörige Vorrichtungen zum Flüssigkeitsaustausch (Vorratsbehälter, Schleuche, Ventille, Pumpe).
208 Translationstisch (Scantisch)
209 Kondensor
210 Spiegel
211 Shutter (S2)
212 Fokussierungsoptik (2)
213 Lichtquelle für Transmissionmodus
214 Lichtstrahl des Transmissionslichts
215 Tubus-Optik-1
216 Detektionsvorrichtung
Gehäuse ist nicht gezeigt.
Diese Elemente der Apparatur können kommerziell erworben werden (Mikroskop-Firmen: Zeiss, Leica, Nikon).
Im folgenden soll beispielsweise eine für die Detektion einzelner Moleküle geeignete Kombination aus diesen Elementen vorgestellt werden:
Weitfeld-Fluoreszenz-Mikroskop Axioplan 2 (Zeiss) mit Quecksilberdampflampe HBO 100
Objektiv Planneofluar 100x, NA 1.4 (Zeiss)
Kamera SenSysTM (Photometrix)
Computer mit Software zur Steuerung und Analyse.
Zur Erläuterung wird die Erfindung beispielhaft an einigen Figuren schematisch dargestellt:
Fig. 1 allgemeines Schema für Reaktionsoberfläche;
Fig. 2 schematische Darstellung der Einbaureaktion von NT*s in die komplementäre Stränge immobilisierter NSKs;
Fig. 3 schematische Darstellung von immobilisierten Primern;
Fig. 4 schematische Darstellung von immobilisierten NSKs; 101 fester Träger
102 Gel/Gelmatrix
103 Targetmolekül (Reaktionspartner 1)
104 Reaktionspartner 2
105 immobilisierte Primer
106 einzelsträngige NSK
107 Polymerase
108 NT* in der Lösung
109 eingebautes NT*
Fig. 5a, b schematische Darstellung der Beleuchtung der Reaktionsoberfläche; 110 Mikroflüssigkeitskanal, "flow cell", mit dem Gel und der Reaktionsoberfläche
111 Anregungslicht
112 Fluoreszenzlicht
113 Objektiv des Mikroskops (Detektionsapparatur) (entspricht 206 in Fig. 6)
Fig. 6 schematische Darstellung der Detektionsapparatur.

Claims

1. Eine Reaktionsoberfläche zur Durchführung von Reaktionen mit auf dieser Oberfläche immobilisierten Molekülen charakterisiert dadurch, dass diese Reaktionsoberfläche eine Geloberfläche ist und die an der Reaktion beteiligten immobilisierten Moleküle einzeln erfasst werden können.

2. Eine Reaktionsoberfläche nach Anspruch 1, wobei die Geloberfläche plan und das Gel auf einem planen festen Träger fixiert ist.

3. Eine Geloberfläche nach Anspruch 1, wobei Polymere aus Acrylsäurederivaten den Hauptanteil der Gelmatrix bilden.

4. Eine Geloberfläche nach Anspruch 1, wobei das Polyacrylamid oder seine Derivate den Hauptanteil der Gelmatrix bilden.

5. Eine Geloberfläche nach Anspruch 1, wobei die Agarose oder deren Derivate den Hauptanteil der Gelmatrix bilden.

6. Eine Geloberfläche nach Anspruch 1, wobei die Cellulose oder deren Derivate den Hauptanteil der Gelmatrix bilden.

7. Eine Geloberfläche nach Anspruch 1, wobei Dextrane oder deren Derivate den Hauptanteil der Gelmatrix bilden.

8. Eine Geloberfläche nach Anspruch 1, wobei der Hauptanteil der Gelmatrix aus einem Gemisch der unter Ansprüchen 3 bis 7 genannten Polymerarten besteht und dieses Gemisch zwei, drei oder mehr von diesen Polymerarten enthält.

9. Reaktionsoberfläche nach Ansprüchen 1 bis 8, wobei die an die Gelmatrix immobilisierten Moleküle Targetmoleküle sind.

10. Reaktionsoberfläche mit immobilisierten Targetmolekülen nach Anspruch 9, wobei Targetmoleküle Nukleinsäureketten (NSKs) sind.

11. Reaktionsoberfläche mit immobilisierten Nukleinsäureketten nach Anspruch 10, wobei Nukleinsäureketten einzelsträngige Oligonukleotide sind.

12. Reaktionsoberfläche mit immobilisierten einzelsträngigen Oligonukleotiden nach Anspruch 11, wobei Oligonukleotide zwischen 10 und 100 Nukleotide lang sind.

13. Reaktionsoberfläche mit immobilisierten einzelsträngigen Oligonukleotiden nach Anspruch 11, wobei Oligonukleotide als Primer auftreten.

14. Reaktionsoberfläche mit Targetmolekülen nach Ansprüchen 9 bis 13, wobei Reaktionen oder Reaktionsergebnisse an mindestens 50% der einzelnen Targetmoleküle individuell detektiert werden können.

15. Reaktionsoberfläche mit Targetmolekülen nach Ansprüchen 9 bis 13, wobei Reaktionen oder Reaktionsergebnisse an mindestens 90% der einzelnen Targetmoleküle individuell detektiert werden können.

16. Reaktionsoberfläche mit Targetmolekülen nach Ansprüchen 14 oder 15, wobei Detektion mit optischen Mitteln erfolgt.

17. Geloberfläche nach Ansprüchen 1 bis 16, wobei die Geldicke 1 bis 100 µm beträgt.

18. Reaktionsoberfläche nach Ansprüchen 9 und 10, wobei die Targetmoleküle die zu sequenzierenden, einzelsträngigen, mit einem Primer hybridisierten Nukleinsäureketten (NSKs) sind, die in einer solchen Dichte immobilisiert sind, die eine Identifizierung der Fluoreszenzsignale von einzelnen in die den zu sequenzierenden NSKs komplementären Stränge eingebauten markierten Nukleotid-Molekülen (NT*s) und eine Zuordnung dieser Signale zur jeweiligen bestimmten NSKs erlaubt.

19. Ein Verfahren zur parallelen Analyse der Sequenzen von einzelnen Nukleinsäurekettenmolekülen bei dem man:
einzelsträngige NSKs mit einer Länge von etwa 50 bis 1000 Nukleotiden bereitstellt, man
die NSKs auf der Reaktionsoberfläche nach Ansprüchen 1 bis 18 immobilisiert, man
eine zyklische Aufbaureaktion des komplementären Stranges der NSKs unter Verwendung eines oder mehrerer Primer und einer oder mehrerer Polymerasen durchführt, indem man

a) zu den immobilisierten NSKs eine Lösung zugibt, die eine oder mehrere Polymerasen und ein bis vier modifizierte Nukleotide (NT*s) enthält, die mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind, wobei die bei gleichzeitiger Verwendung von mindestens zwei NT*s jeweils an den NT*s befindlichen Fluoreszenzfarbstoffe so gewählt sind, dass sich die verwendeten NT*s durch Messung unterschiedlicher Fluoreszenzsignale voneinander unterscheiden lassen, wobei die NT*s strukturell so modifiziert sind, dass die Polymerase nach Einbau eines solchen NT* in einen wachsenden komplementären Strang nicht in der Lage ist, ein weiteres NT* in denselben Strang einzubauen, wobei die zur Termination führende Gruppe mit dem Fluoreszenzfarbstoff abspaltbar ist, man

b) die in Stufe a) erhaltene stationäre Phase unter Bedingungen inkubiert, die zur Verlängerung der komplementären Stränge geeignet sind, wobei die komplementären Stränge jeweils um ein NT* verlängert werden, man

c) die in Stufe b) erhaltene stationäre Phase unter Bedingungen wäscht, die zur Entfernung nicht in einen komplementären Strang eingebauter NT*s geeignet sind, man

d) die einzelnen, in komplementäre Stränge eingebauten NT*s durch Messen des für den jeweiligen Fluoreszenzfarbstoff charakteristischen Signals detektiert, wobei man gleichzeitig die relative Position der einzelnen Fluoreszenzsignale auf der Reaktionsoberfläche bestimmt, man

e) zur Erzeugung unmarkierter (NTs oder) NSKs die zur Termination führenden Gruppen mit den Fluoreszenzfarbstoffen von den am komplementären Strang angefügten NT*s abspaltet, man

f) die in Stufe e) erhaltene stationäre Phase unter Bedingungen wäscht, die zur Entfernung der Substituenten mit den Fluoreszenzfarbstoffen geeignet sind, man

die Stufen a) bis f) gegebenenfalls mehrfach wiederholt,
wobei man die relative Position einzelner NSKs auf der Reaktionsoberfläche und die Sequenz dieser NSKFs durch spezifische Zuordnung der in Stufe d) in aufeinanderfolgenden Zyklen an den jeweiligen Positionen detektierten Fluoreszenzsignale zu den NTs bestimmt.