DE10144252A1 - Nanopartikel mit daran immobilisiertem biologisch aktivem TNF - Google Patents

Nanopartikel mit daran immobilisiertem biologisch aktivem TNF

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Nanopartikel mit daran immobilisiertem Tumor-Nekrose-Faktgor (TNF), wobei TNF in Form eines Trimers gerichtet und unter Beibehaltung seiner biologischen Aktivität am Träger immobilisiert ist, Verfahren zur gerichteten Immobilisierung von TNF an Nanopartikeln, die Verwendung der immobilisierten TNF aufweisenden Nanopartikel zur Identifizierung und/oder Isolierung von TNF-Bindungspartnern sowie zur Identifizierung und/oder Isolierung von Hemmstoffen der Interaktion zwischen TNF und seinen Bindungspartnern, die Verwendung derartiger Naopartikel zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, insbesondere zur Therapie von Tumoren, sowie pharmazeutische und diagnostische Zusammensetzungen, die derartige Nanopartikel enthalten.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft Nanopartikel mit daran immobilisiertem Tumor-Nekrose-Faktor (TNF), wobei TNF in Form eines Trimers gerichtet und unter Beibehaltung seiner biologischen Aktivität am Träger immobilisiert ist, Verfahren zur gerichteten Immobilisierung von TNF an Nanopartikeln, die Verwendung der immobilisierten TNF aufweisenden Nanopartikel zur Identifizierung und/oder Isolierung von TNF-Bindungspartnern sowie zur Identifizierung und/oder Isolierung von Hemmstoffen der Interaktion zwischen TNF und seinen Bindungspartnern, die Verwendung derartiger Nanopartikel zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, insbesondere zur Therapie von Tumoren, sowie pharmazeutische und diagnostische Zusammensetzungen, die derartige Nanopartikel enthalten.
  • In lebenden biologischen Geweben ist eine koordinierte Signalübertragung zwischen unterschiedlichen Zellen und/oder Zellkompartimenten, das heißt über Membranstrukturen hinweg, erforderlich, um die Homöostase zu erhalten und eine Adaption an äußere Veränderungen zu ermöglichen. Während die durch lösliche Mediatoren vermittelten inter- und intrazellulären Signaltransduktions-Mechanismen bereits heute anhand zahlreicher Beispiele gut charakterisiert sind, sind interzelluläre Signale, die durch membranständige Interaktionspartner vermittelt werden, oft noch weitgehend unverstanden. Zellvermittelte Signale sind jedoch für alle vielzelligen Organismen und damit auch für die Aufrechterhaltung multizellulärer Organverbände bei höheren Lebewesen essentiell. So hat sich gezeigt, dass normale Körperzellen bei Entfernung aus ihrem Gewebeverband wichtige Überlebenssignale verlieren. Sie sterben dann über einen Prozess ab, der als Anoikis (Vereinsamung) bezeichnet wird, wobei dessen molekularer Mechanismus dem programmierten Zelltod (Apoptose) entspricht. Die Kenntnis solcher Überlebenssignale und ihrer molekularen Wirkmechanismen ist insbesondere für das gesamte Gebiet der Onkologie relevant, da Tumorzellen genau diese Regulationssysteme umgehen beziehungsweise ausschalten müssen, damit maligne Tumore gebildet werden können.
  • Die Probleme bei der Erforschung interzellulärer Signalmechanismen sind teilweise rein technischer Art. So ist es beispielsweise in vielen Fällen nicht möglich oder aus methodischen oder technischen Gründen sehr aufwendig, zwei unterschiedliche Zellpopulationen räumlich und zeitlich kontrolliert interagieren zu lassen und dabei ihre Reaktionen parallel zu beobachten. Darüber hinaus löst eine solche Interaktion stets eine Vielzahl von Signalen aus, die nicht oder kaum der großen Zahl von Signalmolekülen zugeordnet werden können. Um die Wirkung eines einzelnen Signalstoffes gezielt bestimmen zu können, werden im Stand der Technik daher rekombinante lösliche Derivate membranständiger Liganden und ihrer Rezeptoren hergestellt und untersucht. Die auf diese Weise erhaltenen Daten können jedoch zu einer Fehleinschätzung der eigentlichen physiologischen Bedeutung eines definierten Signalprozesses führen, da das zugrunde liegende Testsystem gegenüber dem tatsächlichen Geschehen eine grobe Vereinfachung darstellt.
  • Der Tumor-Nekrose-Faktor gehört zu der Klasse der Cytokine, bei denen es sich um Substanzen handelt, die von einer Vielzahl von Zellarten gebildet und sezerniert werden und die als interzelluläre Mediatoren eine Vielzahl zellulärer Prozesse regulieren. Cytokine umfassen beispielsweise Lymphokine, Interleukine, Monokine und Wachstumsfaktoren. Der Tumor- Nekrose-Faktor (TNF, auch TNF-alpha oder Kachektin genannt) und das verwandte Cytokin Lymphotoxin (LT, auch LT-alpha genannt) besitzen sehr ähnliche Signaleigenschaften, da sie an die gleichen Rezeptoren binden. Im Gegensatz zu Lymphotoxin (LT-α), das ein echtes sezerniertes Protein darstellt, wird TNF von der produzierenden Zelle jedoch immer erst als membranständiges TNF produziert, aus dem sich das klassische lösliche Cytokin TNF erst durch proteolytische Spaltung bildet. Dieses Membran-TNF stellt ein echtes Transmembranprotein dar, welches in trimerer Form vorliegt und biologisch aktiv ist. Dabei konnte gezeigt werden, dass Membran-TNF ein besonderes Spektrum an zellulären Wirkungen besitzt, die von löslichem TNF und auch von LT-α nicht erreicht werden (Grell et al., Cell, 83 (1995), 793-802). TNF wird von Makrophagen/Monocyten, Lymphocyten und Mastzellen gebildet und hat Einfluss auf Entzündungen, Sepsis, den Lipid- und Proteinstoffwechsel, die Blutbildung, Angiogenese, Wundheilung und Immunabwehr und übt cytolytische beziehungsweise cytostatische Wirkung auf Tumorzellen aus. Lymphotoxin-β wirkt cytotoxisch auf einige Tumorzelllinien. Über die molekulare Basis der vielfältigen TNF-α- Wirkungen in vivo und in vitro ist relativ wenig bekannt. Die Analyse der TNF-α-Kristallstruktur hat ergeben, dass diese Substanz ein oligomeres Protein ist, das aus drei identischen Untereinheiten von jeweils 17,5 kDA besteht.
  • Bislang sind zwei verschiedene TNF-spezifische Membranrezeptoren von 55 kDA und 75 kDA identifiziert worden. Es ist bekannt, dass TNF-α-Oligomere an die Membranrezeptoren binden müssen, damit zumindest in physiologischen Lösungen einige der verschiedenen biologischen Aktivitäten von TNF-α induziert werden können. Obwohl gezeigt worden ist, dass TNF-α in Lösung als Oligomer vorkommt, hat sich jedoch herausgestellt, dass diese nichtkovalent verknüpften TNF-α-Oligomere instabil sind und in inaktive Formen überführt werden. Man geht allerdings davon aus, dass die strukturellen Veränderungen von TNF-α auch in vivo erfolgen, da Monomere und Oligomere in unterschiedlichen Anteilen in der Hirn-Rückenmark-Flüssigkeit von Patienten mit Meningitis gefunden werden.
  • TNF-α wurde ursprünglich als ein Endotoxin- induzierter Faktor identifiziert, der die Nekrose von Tumoren in Mäusen induzieren kann. Es ist jedoch bekannt, dass die Antitumor-Wirkung von TNF-α nicht nur aus den cytotoxischen Wirkungen gegen Tumorzellen resultiert, sondern auch auf einer Aktivierung von Antitumor-Effektor-Immunzellen im Blut, beispielsweise Makrophagen, cytotoxische Lymphocyten und Neutrophilen, basiert. Die Antitumorwirkung von TNF-α beruht ferner auf einer spezifischen Schädigung von Tumor-Blutgefäßen.
  • Da TNF-α sehr geringe Stabilität aufweist und in vivo pleiotrope Wirkungen ausübt, waren die bisherigen Versuche, TNF-α als systemisches Antitumor- Mittel einzusetzen, nicht erfolgreich. Es zeigte sich, das bei Verabreichung von TNF-α äußerst schwere systemische Nebenwirkungen, wie Fieber und niedriger Blutdruck auftreten, bevor therapeutische Dosen erreicht werden. Trotz der nach wie vor großen Erwartungen bezüglich einer potentiellen Verwendung von TNF-α als Antitumormittel ist die klinische Anwendbarkeit dieser Substanz also nach wie vor stark eingeschränkt.
  • Im Allgemeinen ist es schwer, biologisch aktive Proteine, wie Cytokine, für therapeutische Zwecke einzusetzen, da biologisch aktive Proteine sehr häufig geringe Stabilität und kurze Halbwertzeiten aufweisen. Die Proteine werden durch Leber, Nieren und andere Organe schnell aus dem Blut entfernt, wobei die Clearance-Rate von der Größe der Moleküle und dem Ausmaß der Proteolyse abhängt. Insbesondere Plasma-Proteasen verursachen den Abbau solcher Proteine und bewirken den schnellen Verlust der biologischen Aktivität.
  • Um diese Probleme zu überwinden, wurden in den letzten Jahren Systeme zur Immobilisierung biologisch aktiver Proteine an oder in Trägersystemen entwickelt. Beispielsweise sind Controlled Release- Systeme für therapeutische Wirkstoffe oder Arzneistoffe bekannt, wobei Arzneistoffe beispielsweise durch Einschluss in eine Matrix, immobilisiert werden. Nach Verabreichung solcher Controlled-Release- Systeme werden dann die Arzneistoffe durch Degradationsprozesse innerhalb des lebenden Körpers kontrolliert freigesetzt. Bei diesen Systemen ist die Konformation des Wirkstoffes im immobilisierten Zustand nicht entscheidend. Wichtig ist vielmehr, dass nach der Freisetzung der Wirkstoff im aktiven Zustand vorliegt.
  • Auch die Immobilisierung von Proteinen an partikuläre Systeme ist bekannt (Cell Separation and Protein Purification, Technical Handbook, 2. Ausgabe (1996), Dynal, Oslo), wobei die Proteinbindung an die Partikel jedoch unselektiv, beispielsweise mittels Adsorption, und nicht gerichtet erfolgt (Michaelis et al., Anticancer Drugs, 11 (5) (2000), 369-376). Darüber hinaus ist eine einfache Übertragung der dabei gewonnenen Erkenntnisse auf die Immobilisierung an Nanopartikeln nicht ohne weiteres möglich, da eine Variation der funktionellen Oberflächengruppen immer mit einem Eingriff in das kolloidale System verbunden ist und beispielsweise eine unerwünschte Koagulation auslösen kann.
  • Yokozawa et al., Exp. Hematol., 28 (10) (2000), 1129-1136, beschreiben die nicht-kovalente Immobilisierung von Fas-spezifischen Antikörpern auf 2,5 µm großen Gelatine-Beads. Dabei werden die Antikörper adsorptiv, das heißt nicht gerichtet, immobilisiert. Diese künstliche Zellen genannte Systeme können auf Zielzellen Apoptose auslösen.
  • Hurst et al., Anal. Chem., 71 (1999), 9727-4733, beschreiben die kovalente Oberflächenmodifizierung von magnetischen Polymerpartikeln mit einer Größe im µm-Bereich mit TNF-Antikörpern, mit denen anschließend TNF aus einer komplexen Lösung gefischt werden kann. Dieses Verfahren dient zur Probenvorbereitung von MALDI-TOF-MS-Verfahren. Die Immobilisierung eines Proteins über einen Antikörper ist zwar im Prinzip eine gerichtete Immobilisierung. Eine derartige Protein-Immobilisierung ist jedoch gegenüber einer kovalenten Bindung sehr instabil.
  • Ferner ist die Immobilisierung von TNF auf Agarose- Partikeln beziehungsweise in PLGA-Partikeln bekannt (Kanulainen et al., J. Biol. Chem., 273/31 (1996), 18759-18766; Iwata et al., J. Microencaps., 16 (1999), 777-792). Auch hier erfolgt keine kovalente Anbindung von TNF. TNF wird anschließend langsam von den Partikeln freigesetzt und ist erst in gelöster Form biologisch aktiv.
  • Chong et al., Cell. Immunol., 134 (1) (1991), 96-110, beschreiben die Immobilisierung von Tumor- Membranproteinen auf hydrophoben Partikeln. Diese Pseudocytes genannten Systeme werden genutzt, um auf anderen Zellen die Produktion von Cytokinen, beispielsweise TNF, zu stimulieren und dadurch die Lyse von Tumorzellen auszulösen. Hierbei handelt es sich also um einen indirekten Ansatz.
  • Poiesi et al., Cytokine, 5/6 (1993), 539-545, beschreiben die Immobilisierung von TNF auf planaren Chip-Oberflächen für Oberflächen-Plasmonen- Resonanz-Untersuchungen. Zur Immobilisierung wurden Verfahren der Standard-Proteinchemie wie EDC und NHS eingesetzt. Hier zeigte sich, dass das Molekül nicht stabil gebunden wurde, da ein Teil des TNF durch Waschen entfernt werden konnte.
  • Fassina et al., Arch. Biochem. Biophys., 296 (1992), 137-143, beschreiben die Herstellung multimerer komplementärer Peptide für TNF. Diese wurden anschließend auf Chromatographie-Säulen beziehungsweise Mikrotiterplatten immobilisiert. Diese Oberflächen wurden dann genutzt, um TNF-Trimere aus komplexen Matrices abzutrennen. Allerdings ist die Wechselwirkung zwischen Peptid und TNF zu gering, um TNF dauerhaft zu immobilisieren.
  • Kamada et al., Cancer Res., 60 (2000), 6416-6420, beschreiben die kovalente Konjugation von TNF mit Polymeren wie PVP oder PEG, um die biologische Aktivität und die biologische Verfügbarkeit zu erhöhen. Durch diese Form wird allerdings die TNF- Trimer-Form, also die eigentlich biologisch aktive Form, nicht stabilisiert.
  • Der vorliegenden Erfindung liegt daher das technische Problem zugrunde, Mittel und Verfahren zur Immobilisierung von Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) an einer Trägeroberfläche bereitzustellen, wobei TNF so immobilisiert wird, dass seine vor der Immobilisierung vorhandenen biologischen Aktivitäten auch im immobilisierten Zustand beibehalten werden, so dass immobilisiertes TNF beispielsweise mit seinen Rezeptoren wechselwirken kann und dadurch seine biologischen Aktivitäten induziert werden können. Dabei soll TNF im immobilisierten Zustand, also gemeinsam mit seinem Träger, sowohl für in vitro- Untersuchungen, beispielsweise bezüglich seiner Wechselwirkungen mit anderen zellulären Bestandteilen, als auch als Arzneistoff zur Behandlung von Krankheiten, insbesondere von Tumorerkrankungen einsetzbar sein, ohne dass die im Stand der Technik bekannten Nebenwirkungen auftreten. Im Zeitraum der Verwendung soll keine nennenswerte Degradation der Trägersysteme beziehungsweise von immobilisiertem TNF stattfinden beziehungsweise bei einer in vivo- Anwendung soll die Degradation erst nach Entfaltung der biologischen Aktivität von immobilisierten TNF zu einem späteren Zeitpunkt stattfinden.
  • Die vorliegende Erfindung löst das ihr zugrunde liegende technische Problem durch die Bereitstellung von Nanopartikeln, umfassend einen Träger mit einer funktionelle Gruppen 1A aufweisenden Oberfläche und an dem Träger immobilisiertem Tumor- Nekrose-Faktor (TNF) mit die funktionellen Gruppen 1A bindenden komplementären funktionellen Gruppen 2A, wobei TNF in Form eines Trimers immobilisiert ist.
  • Das heißt, die vorliegende Erfindung stellt nanopartikuläre Trägersysteme, insbesondere Nanopartikel, mit daran immobilisiertem TNF bereit, wobei die Immobilisierung auf einer affinen Bindung von TNF an die Nanopartikel-Oberfläche basiert. Die Immobilisierung von TNF an den Nanopartikeln erfolgt erfindungsgemäß über eine Bindung zwischen ersten auf der Trägeroberfläche vorhandenen funktionellen Gruppen 1A und im TNF-Molekül vorhandenen funktionellen Gruppen 2A, die komplementär zu den funktionellen Gruppen 1A sind und mit diesen eine affine, vorzugsweise kovalente Bindungen eingehen können. Vorzugsweise ist die funktionelle Gruppe 2A von TNF innerhalb des TNF-Moleküls so positioniert, dass sie außerhalb der für die biologische TNF- Aktivität verantwortlichen Domänen in einem geeigneten Abstand zu diesen Domänen angeordnet ist. Auf diese Weise ist es erfindungsgemäß möglich, TNF gerichtet und unter Beibehaltung seiner biologischen Aktivitäten auf dem Träger zu immobilisieren.
  • Nach TNF-Immobilisierung ist TNF erfindungsgemäß so auf der Trägeroberfläche fixiert, dass die dreidimensionale Struktur der für die biologische Aktivität erforderlichen Domäne(n) gegenüber nichtimmobilisiertem TNF nicht verändert ist und dass die TNF-Domäne(n) bei Kontakt mit zellulären Reaktionspartnern für diese frei zugänglich ist/sind. Dabei ist TNF in Form von Trimeren fixiert. Erfindungsgemäß ist es vorgesehen, dass der Zerfall von TNF-Trimeren durch die Einbringung bestimmter Proteinelemente verhindert wird, insbesondere solchen Proteinstrukturen, die natürlicherweise fest verknüpfte Trimere bilden. Nach einer solchen Stabilisierung ist dann erfindungsgemäß vorgesehen, dass nicht jede TNF-Untereinheit eines TNF-Trimers über affine Bindungen zwischen den funktionellen Gruppen 1A und 2A an der Oberfläche des Nanopartikel- Trägers fixiert sein muss, sondern es ist ausreichend, wenn mindestens eine TNF-Untereinheit eines Trimers am Träger gebunden ist.
  • Erfindungsgemäß ist insbesondere vorgesehen, dass es sich bei den erfindungsgemäß verwendeten Trägersystemen um kompakte oder hohle Nanopartikel mit Größen zwischen 5 und 500 nm handelt. Diese bestehen entweder aus organischen oder anorganischen Partikelmaterialien. Die Art des Materials kann erfindungsgemäß entsprechend der späteren Anwendung variiert werden, wobei der Träger der Nanopartikel vorzugsweise aus biologisch verträglichen und/oder biologisch abbaubaren Materialien besteht.
  • Erfindungsgemäß verhalten sich daher die erfindungsgemäßen Nanopartikel, an deren Oberfläche TNF fixiert ist, bezüglich der immobilisierten TNF- Moleküle wie Zellen. Das heißt, die erfindungsgemäßen Nanopartikel können beispielsweise mit Zellen, auf deren Oberfläche einer oder mehrere TNF- Rezeptoren, beispielsweise TNFR1 und TNFR2 vorhanden sind, in Kontakt treten und TNF-spezifische Signale und damit TNF-spezifische Wirkungen auslösen. Da die Nanopartikel zumindest in einer Dimension kleiner als 1 µm sind, werden sie erfindungsgemäß auch als "Nanocytes" bezeichnet.
  • Da die erfindungsgemäßen Nanopartikel einerseits in Analogie zu membranständigen Molekülen reagieren, andererseits aber auch vollkommen neue überraschende Funktionen entwickeln, besitzen die erfindungsgemäßen Nanocytes ein sehr breites Anwendungspotential. Erfindungsgemäß können die Nanopartikel als Werkzeuge für die molekularbiologische, zellbiologische und klinische Forschung eingesetzt werden. Dabei bietet die Verwendung der erfindungsgemäßen Nanopartikel den Vorteil, das etablierte Verfahren für die Bioaktivitätsbestimmung verwendet werden können und somit ein schnelles Materialscreening durchgeführt werden kann.
  • Die erfindungsgemäßen Nanopartikel können beispielsweise in vitro eingesetzt werden, um die Wirkungsweise membranständiger Moleküle, insbesondere bei der Signaltransduktion, zu untersuchen. Gegenüber der direkten Zell-Zell-Interaktion bieten die erfindungsgemäßen Nanopartikel den Vorteil, dass einzelne Effekte isoliert untersucht werden können. Die erfindungsgemäßen Nanopartikel lassen sich daher auch für die in vitro-Diagnostik einsetzen, um beispielsweise bestimmte Zellen, insbesondere Tumorzellen, zu erkennen und/oder zu markieren. Darüber hinaus können unter Verwendung der erfindungsgemäßen Nanopartikel gezielt Zellen in einen erwünschten Zustand überführt werden beziehungsweise besteht die Möglichkeit, zwischen verschiedenen Zell-Zuständen hin- und herzuschalten.
  • Die erfindungsgemäßen Nanopartikel können auch dazu verwendet werden, bestimmte Zellen aus komplexen biologischen Medien oder Flüssigkeiten, wie Blut, zu isolieren oder direkt in diesen Flüssigkeiten oder Medien bei diesen Zellen entsprechende Reaktionen auszulösen, wie beispielsweise Differenzierung, Proliferation oder auch Apoptose. Darüber hinaus können auf der Basis der erfindungsgemäßen Nanopartikel auch technische Systeme konstruiert werden, die eine gezielte und kontinuierliche Separation bestimmter Zellen erlauben.
  • Die erfindungsgemäßen Nanopartikel, insbesondere solche mit biologisch verträglichen oder biologisch abbaubaren Trägersystemen, können in vivo für die Therapie verschiedener Krankheiten eingesetzt werden. Unter Verwendung der erfindungsgemäßen Nanopartikel können prinzipiell alle Krankheiten therapiert werden, bei denen die normale Zell-Zell- Interaktion gestört ist, also insbesondere Tumorerkrankungen, Wundheilungsprozesse und ähnliche. Erfindungsgemäße Nanopartikel können aber auch für Aufgaben, die normalerweise Zellen des Immunsystems übernehmen, verwendet werden. Vorteilhafterweise können die erfindungsgemäßen Nanopartikel, insbesondere solche auf der Basis biologisch verträglicher oder biologisch abbaubarer Trägersysteme, direkt in vivo appliziert werden. Die erfindungsgemäßen Nanopartikel können auch in Form poröser Filme abgeschieden werden. Mikroporöse Systeme besitzen ein großes Potential für extrakorporale therapeutische Anwendungen, beispielsweise auf dem Gebiet der Tumortherapie, um frei zirkulierende maligne Zellen selektiv zu erkennen und gegebenenfalls abzutöten.
  • Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter "TNF" ein Molekül, insbesondere Protein, verstanden, das spezifische biologische Aktivitäten in vivo und/oder in vitro ausübt. Erfindungsgemäß ist TNF daher ein Protein, dass in vivo Einfluss auf Entzündungen, Sepsis, den Lipid- und Proteinstoffwechsel, die Blutbildung, Angiogenese, Wundheilung und Immunabwehr hat und in vitro und/oder in vivo cytolytische beziehungsweise cytostatische oder cytotoxische Wirkungen ausübt. TNF ist darüber hinaus ein Protein, das sich zumindest zeitweise an einer Zelloberfläche innerhalb eines natürlichen Zellverbandes befindet und die Kommunikation der Zelle mit ihrer Umgebung steuert. Insbesondere kann TNF mit Zellen, auf deren Oberfläche TNF-Rezeptoren, wie TNFR1 und TNFR2 vorliegen, in Kontakt treten und TNF-spezifische Signale und damit TNF-spezifische Wirkungen auslösen. Erfindungsgemäß kann es sich bei TNF sowohl um TNF-α als auch um TNF-β handeln.
  • Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem "Protein" ein Molekül verstanden, das mindestens zwei über eine Amidbindung miteinander verbundene Aminosäuren umfasst. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung kann ein Protein, insbesondere TNF, also auch ein Peptid, zum Beispiel ein Oligopeptid, ein Polypeptid oder ein Teil davon, beispielsweise eine Domäne oder eine Bindungstasche, sein. Das Protein, insbesondere TNF, kann natürlichen oder synthetischen Ursprungs sein. Es kann durch gentechnische Verfahren gegenüber dem Wildtyp-Protein modifiziert sein und/oder unnatürliche und/oder ungewöhnliche Aminosäuren enthalten. Ein Protein, insbesondere ein TNF-Molekül, kann gegenüber der Wildtyp-Form derivatisiert sein, beispielsweise Glykosylierungen aufweisen, es kann verkürzt sein, es kann mit anderen Proteinen fusioniert sein oder mit Molekülen anderer Art, beispielsweise Kohlenhydraten, verbunden sein.
  • Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden unter "Nanopartikeln" Bindematrices verstanden, die einen Träger mit einer Oberfläche umfassen, an dem chemisch reaktive funktionelle Gruppen angeordnet sind, die mit komplementären funktionellen Gruppen von zu bindenden Molekülen, insbesondere TNF-Molekülen, affine Bindungen, also kovalente und/oder nicht-kovalente Bindungen, eingehen und auf diese Weise die Moleküle an ihren Oberflächen stabil fixieren können. Die Träger der Nanopartikel bestehen aus chemisch inerten anorganischen oder organischen Materialien und besitzen eine Größe von weniger als 1 µm, vorzugsweise von 5 bis 500 nm.
  • Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einer "ersten funktionellen Gruppe 1A" eine auf der Oberfläche des Nanopartikel-Trägers aufgebrachte chemische Gruppe verstanden, die in der Lage ist, mit einer komplementären funktionellen Gruppe 2A, die beispielsweise auf dem zu immobilisierenden TNF-Molekül vorhanden ist, derart zu interagieren, dass eine affine, bevorzugt kovalente Bindung zwischen den beiden Bindungspartnern stattfinden kann.
  • In bevorzugter Ausführungsform der Erfindung ist die erste funktionelle Gruppe 1A der Trägeroberfläche ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Aminogruppe, Carboxygruppe, Epoxygruppe, Maleinimidogruppe, Alkylketongruppe, Aldehydgruppe, Hydrazingruppe, Hydrazidgruppe, Thiolgruppe und Thioestergruppe.
  • Erfindungsgemäß sind die funktionellen Gruppen 2A der zu immobilisierenden TNF-Moleküle ausgewählt aus einer Gruppe, die die gleichen Spezies wie für die funktionelle Gruppe 1A der Trägeroberfläche enthält. Ein erfindungsgemäßer Nanopartikel weist also in seiner Oberfläche eine erste funktionelle Gruppe 1A auf, die kovalent mit einer funktionellen Gruppe 2A des zu immobilisierenden TNF- Moleküls verknüpft ist, wobei die funktionelle Oberflächen-Gruppe 1A eine andere Gruppe als die funktionelle Protein-Gruppe 2A ist. Die beiden miteinander in Bindung tretenden Gruppen 1A und 2-A müssen dabei komplementär zueinander sein, das heißt in der Lage sein, eine kovalente Bindung miteinander einzugehen.
  • Wird erfindungsgemäß als funktionelle Gruppe 1A beispielsweise eine Aminogruppe verwendet, ist die funktionelle Gruppe 2A des zu immobilisierenden Proteines eine Carboxygruppe. Wird erfindungsgemäß umgekehrt eine Carboxygruppe als funktionelle Oberflächen-Gruppe 1A verwendet, ist erfindungsgemäß die funktionelle komplementäre Protein-Gruppe 2A eine Aminogruppe. Wird erfindungsgemäß als funktionelle Oberflächen-Gruppe 1A eine Thiolgruppe gewählt, ist erfindungsgemäß die komplementäre Protein-Gruppe eine Maleinimidogruppe. Wird umgekehrt eine Maleinimidogruppe als funktionelle Oberflächen-Gruppe 1A ausgewählt, ist erfindungsgemäß die komplementäre funktionelle Protein-Gruppe 2A eine Thiolgruppe. Wird erfindungsgemäß als funktionelle Oberflächen-Gruppe 1A eine Alkylketongruppe, insbesondere Methylketon- oder Aldehydgruppe verwendet, ist die funktionelle komplementäre Protein- Gruppe 2A eine Hydrazin- oder Hydrazidgruppe. Wird erfindungsgemäß umgekehrt eine Hydrazin- oder Hydrazidgruppe als funktionelle Oberflächen-Gruppe 1A verwendet, ist erfindungsgemäß die funktionelle komplementäre Protein-Gruppe 2A eine Alkylketon-, insbesondere Methylketon- oder Aldehydgruppe.
  • Erfindungsgemäß besonders bevorzugt handelt es sich bei der funktionellen Gruppe 1A auf der Trägeroberfläche des Nanopartikels um eine Maleinimido- Gruppe und bei der funktionellen Gruppe 2A von TNF um eine Thiol-Gruppe.
  • In bevorzugter Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass TNF als Trimer gerichtet und unter Beibehaltung seiner biologischen Aktivität auf der Oberfläche der erfindungsgemäßen Nanopartikel immobilisiert vorliegt.
  • Erfindungsgemäß handelt es sich bei immobilisiertem TNF um synthetisches, natürlicherweise vorkommendes oder rekombinant hergestelltes TNF-α oder TNF-β mit Wildtyp-Sequenz oder mit mutierter Sequenz. Erfindungsgemäß ist es auch möglich, dass TNF chemisch modifiziert vorliegt.
  • Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff "gerichtet immobilisiert" oder "gerichtete Immobilisierung", dass ein Molekül, insbesondere TNF, an definierten Positionen innerhalb des TNF-Moleküls dergestalt an einem Träger immobilisiert ist, dass die dreidimensionale Struktur der für die biologische Aktivität erforderlichen TNF-Domäne(n) gegenüber dem nichtimmobilisierten Zustand nicht verändert ist und dass diese TNF-Domäne(n), beispielsweise Bindungstaschen für zelluläre Reaktionspartner, bei Kontakt mit zellulären Reaktionspartnern für diese frei zugänglich ist/sind. "Gerichtet immobilisiert" bedeutet auch, dass die Fixierung von TNF auf der Trägeroberfläche so erfolgt, dass das immobilisierte Protein bei einer späteren Verwendung in einer zellulären beziehungsweise zellähnlichen Umgebung durch Protein-degradierende Enzyme nicht oder nur sehr langsam degradiert werden kann. Das heißt, das immobilisierte TNF-Molekül ist auf der Trägeroberfläche so ausgerichtet, das es so wenig wie möglich Angriffspunkte für Proteasen bietet.
  • "Beibehaltung der biologischen Aktivität" bedeutet, dass TNF, insbesondere das TNF-Trimer, nach Immobilisierung an der Oberfläche eines Nanopartikels die gleichen oder nahezu gleichen biologischen Funktionen in zumindest ähnlichem Ausmaß ausüben kann wie die gleichen TNF-Moleküle im nicht-immobilisierten Zustand unter geeigneten in vitro-Bedingungen beziehungsweise die gleichen TNF-Moleküle in ihrer natürlichen zellulären Umgebung.
  • Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem "Trimer" oder "TNF-Trimer" eine Verbindung verstanden, die durch Verknüpfung von drei Untereinheiten, insbesondere drei TNF-Monomeren, gebildet wird, wobei die Verknüpfung der Monomere untereinander durch Disulfid-Brückenbildung zwischen Cystein-Resten erfolgt. Die Trimerisierung von TNF führt gegenüber dem TNF-Monomer zu einer Stabilisierung der Moleküle. Bei den drei zu einem Trimer verknüpften TNF-Untereinheiten kann es sich um identische TNF-Monomere handeln, das heisst das Trimer kann als Homotrimer vorliegen. Das Trimer kann erfindungsgemäß aber auch unterschiedliche TNF- Monomere umfassen, wobei sich diese sowohl bezüglich ihrer Zusammensetzung, beispielsweise Aminosäuresequenz, als auch bezüglich ihrer Länge unterscheiden können. Ferner muss bei dem immobilisierten TNF-Trimer nicht jede TNF-Untereinheit an der Oberfläche des Nanopartikel-Trägers gebunden sein. Das TNF-Trimer kann auch dadurch an Nanopartikeln fixiert sein, das nur eine TNF-Untereinheit des Trimers über eine kovalente Bindung zwischen seiner funktionellen Gruppe 2A und der funktionellen Gruppe 1A am Träger fixiert ist.
  • Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass die Trimer- Bildung entweder vor oder während der Immobilisierung durch hochaffine Bindung nicht-kovalenter Art, aber auch insbesondere durch kovalente Disulfid- Brückenbildung zwischen Cystein-Resten spontan erfolgt. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass die zu immobilisierenden TNF-Moleküle ein natürliches oder synthetisch hergestelltes Multimerisierungsmodul enthalten, das die Trimererisierung von TNF durch hochaffine Bindung nicht-kovalenter Art, aber insbesondere durch Ausbildung von kovalenten Disulfidbrücken, und damit eine regelmäßige und stabile Trimerisierung von TNF bewirkt. Erfindungsgemäß besonders bevorzugt wird das Tenascin C- Multimerisierungsmodul in die zu immobilisierenden TNF-Moleküle auf gentechnischem Wege oder unter Verwendung chemischer Syntheseverfahren eingeführt. Die so modifizierten TNF-Moleküle werden dann entweder vor oder während der Immobilisierung an den erfindungsgemäßen Nanopartikeln trimerisiert.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass die Oberfläche des erfindungsgemäßen Nanopartikels weitere funktionelle Gruppen 1B und TNF weitere, die funktionellen Gruppen 1B bindende komplementäre Gruppen 2B aufweist, wobei die funktionellen Gruppen 1B und 2B erfindungsgemäß insbesondere eine nicht-kovalente Bindung eingehen können.
  • Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einer "zweiten funktionellen Gruppe 1B" eine chemische Gruppe verstanden, die in der Lage ist, mit einer komplementären funktionellen Gruppe 2B, die in einem zu immobilisierenden TNF-Molekül vorhanden ist, derart zu interagieren, dass eine nicht-kovalente Bindung zwischen den beiden Bindungspartnern stattfinden kann.
  • In bevorzugter Ausführungsform der Erfindung ist die zweite funktionelle Gruppe 1B der Trägeroberfläche ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Oligohistidingruppe, Strep-Tag I, Strep-Tag II, Desthiobiotin, Biotin, Chitin, Chitinderivate, Chitinbindedomäne, Metallionenchelatkomplex, Streptavidin, Streptactin, Avidin und Neutravidin.
  • Erfindungsgemäß ist die funktionelle Gruppe 2B des zu immobilisierenden TNF-Moleküls ausgewählt aus einer Gruppe, die die gleichen Spezies wie für die funktionelle Gruppe 1B der Trägeroberfläche enthält. Ein erfindungsgemäßes Nanopartikel weist also in seiner Oberfläche eine funktionelle Gruppe 1B auf, die nicht-kovalent mit einer funktionellen Gruppe 2B von TNF verknüpft ist, wobei die funktionelle Oberflächen-Gruppe 1B eine andere Gruppe als, die funktionelle TNF-Gruppe 2B ist. Die beiden miteinander in nicht-kovalente Bindung tretenden Gruppen müssen komplementär zueinander sein, das heißt in der Lage sein, eine nicht-kovalente Bindung miteinander einzugehen.
  • Wird erfindungsgemäß als funktionelle Oberflächen- Gruppe 1B ein Metallionenchelatkomplex verwendet, ist die funktionelle komplementäre TNF-Gruppe 2B eine Oligohistidingruppe. Wird als funktionelle Oberflächengruppe 1B eine Oligohistidingruppe verwendet, ist die funktionelle komplementäre TNF- Gruppe 2B ein Metallchelatkomplex.
  • Wird als funktionelle Oberflächen-Gruppe 1B Strep- Tag I, Strep-Tag II, Biotin oder Desthiobiotin verwendet, wird als komplementäre funktionelle TNF- Gruppe 2B Steptavidin, Streptactin, Avidin oder Neutravidin eingesetzt. Wird als funktionelle Oberflächen-Gruppe 1B Streptavidin, Streptactin, Avidin oder Neutravidin eingesetzt, wird als komplementäre funktionelle TNF-Gruppe 2B Strep-Tag I, Strep-Tag II, Biotin oder Desthiobiotin eingesetzt.
  • Wird in einer weiteren Ausführungsform Chitin oder ein Chitinderivat als funktionelle Oberflächen- Gruppe 1B eingesetzt, wird als funktionelle komplementäre TNF-Gruppe 2B eine Chitinbindungsdomäne eingesetzt. Wird als funktionelle Oberflächen- Gruppe 1B eine Chitinbindungsdomäne eingesetzt, wird als funktionelle komplementäre TNF-Gruppe 2B Chitin oder ein Chitinderivat eingesetzt.
  • Die vorstehend genannten funktionellen Gruppen der Trägeroberfläche und/oder von TNF werden erfindungsgemäß vorzugsweise mittels eines Spacers mit dem zu immobilisierenden TNF-Molekül beziehungsweise der Trägeroberfläche verbunden beziehungsweise unter Verwendung eines Spacers an den Träger oder in das TNF-Molekül eingeführt. Der Spacer dient somit einerseits als Abstandshalter der funktionellen Gruppen zu dem Träger beziehungsweise dem TNF- Molekül, andererseits aber auch als Träger für die funktionelle Gruppe. Ein derartiger Spacer kann erfindungsgemäß ein Alkylen oder Ethylenglykol-Spacer mit 2 bis 50 C-Atomen sein, der in bevorzugter Ausführungsform substituiert ist und Heteroatome aufweist. Erfindungsgemäß kann der Spacer flexibel und/oder linear sein. Bei Verwendung eines Spacers im Zusammenhang mit der ersten funktionellen Gruppe 1A der Oberfläche bindet der Spacer kovalent an eine Seitenkette einer Aminosäure von TNF, wobei die Aminosäure, an die die Bindung erfolgt, eine natürliche oder unnatürliche Aminosäure sein kann. Sofern die Aminosäure eine natürliche Aminosäure ist, wird sie durch Bindung an den Spacer und die damit verbundene funktionelle erste Oberflächen- Gruppe 1A zu einer unnatürlichen Aminosäure im Sinne der Erfindung.
  • Sofern der Spacer eine funktionelle TNF-Gruppe 2A mit einem Träger verbindet, geschieht dies vorzugsweise über eine auf dem Träger angeordnete Ankergruppe, die vorzugsweise als Silan mit reaktiven Gruppen ausgeführt ist, beispielsweise die mit Si- OH-Gruppen der Oberfläche des vorzugsweise oxidischen Si-Trägers kovalente Si-O-Si-Bindungen (Silox-Anbindungen) ausbilden kann.
  • Im Sinne der vorliegenden Erfindung verbindet der Spacer entweder eine funktionelle Gruppe der Trägeroberfläche mit TNF oder eine funktionelle Gruppe des Proteins mit dem Träger, wobei die funktionelle Gruppe auch als Bestandteil des Spacers, das heißt eine seiner funktionellen Gruppen, angesehen werden kann.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden als erste funktionelle Oberflächen-Gruppe 1A die Aminogruppe, Carboxygruppe, Epoxygruppe, Maleinimidogruppe, Alkylketongruppe, Aldehydgruppe, Hydrazingruppe, Hydrazidgruppe, Thiolgruppe oder Thioestergruppe verwendet, die mittels eines Spacers, beispielsweise im Falle einer Alkylketongruppe mittels Lävulinsäure, mit einer Seitenkette einer in dem zu immobilisierenden TNF- Molekül vorhandenen natürlichen oder unnatürlichen Aminosäure verbunden werden beziehungsweise durch den Spacer in das TNF-Molekül eingeführt werden. Sofern die Verbindung zu einer natürlichen Aminosäure erfolgt, wird diese durch die Bindung mit dem die funktionelle Gruppe aufweisenden Spacer zu einer unnatürlichen Aminosäure.
  • Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem "Träger" ein chemisch inerter Stoff verstanden, der als Gerüst für das zu immobilisierende TNF-Molekül dient. In bevorzugter Ausführungsform der Erfindung besteht der Träger aus einem biologisch verträglichen Material. Erfindungsgemäß ist der Träger ein kompaktes oder hohles Partikel mit einer Größe von 5 nm bis 500 nm. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff "biologisch verträglich", dass der Träger beziehungsweise die Oberfläche des Nanopartikels sowohl hinsichtlich seiner Materialzusammensetzung als auch hinsichtlich seiner Struktur weder im Körper eines Rezipienten noch in isolierten biologischen Geweben oder Flüssigkeiten eine immunologische, toxische oder sonstige Reaktion hervorruft und zelluläre oder molekulare Prozesse nicht oder kaum stört. Wenn ein biologisch verträglicher Träger "biologisch abbaubar" ist, bedeutet dies, dass ein Träger im Körper eines Rezipienten beziehungsweise in biologischen Geweben oder Flüssigkeiten langsam abgebaut beziehungsweise metabolisiert werden kann, vorzugsweise, nachdem das am Träger immobilisierte TNF-Molekül seine biologische Aktivität entfaltet hat, wobei die Produkte des Abbaus beziehungsweise der Metabolisierung keine immunologischen, toxischen oder sonstigen Reaktionen hervorrufen und darüber hinaus im Körper des Rezipienten gut resorbierbar sind.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass der Träger des erfindungsgemäßen Nanopartikels ein biologisch verträgliches, vorzugsweise ein anorganisches oder ein organisches, Material enthält oder aus diesem besteht. In bevorzugter Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht der erfindungsgemäße Nanopartikel aus einem anorganischen Trägermaterial wie Silicium, SiO2, SiO, einem Silikat, Al2O3, SiO2.Al2O3, ZrO2, Fe2O3, Ag2O, Zr2O3, Ta2O5, Zeolith, TiO2, Glas, Indiumzinnoxid, Hydroxylapatit, Au, Fe3O4, ZnS, CdSe oder ein Gemisch davon. Bei einem organischen, biologisch verträglichen Trägermaterial kann es sich um Stoffe wie Polypropylen, Polystyrol, Polyacrylate oder ein Gemisch davon handeln.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform besteht der Träger des erfindungsgemäßen Nanopartikels aus einem biologisch abbaubaren Material oder enthält dieses. Die biologisch abbaubaren Materialien müssen für den Zeitraum der Anwendung stabil sein, können danach jedoch so abgebaut werden, dass ausscheidbare Bruchstücke erhalten werden. Insbesondere handelt es sich dabei um Polyester der Polymilchsäure, die durch Quervernetzung zusätzlich stabilisiert wurden und dadurch in besonderer Weise kontrolliert biologisch abbaubar sind. Besonders bevorzugt ist die Verwendung eines Polyesters von Polymilchsäure, insbesondere Poly(D,L-milchsäureco-glykolsäure) (PLGA).
  • Die Herstellung der Träger der erfindungsgemäßen Nanopartikel kann unter Verwendung üblicher, auf dem Fachgebiet bekannter Verfahren, wie Sol-Gel- Synthese-Verfahren, Emulsionspolymerisation, Suspensionspolymerisation erfolgen.
  • Die Oberflächen des Nanopartikel-Trägers werden durch chemische Modifizierungsreaktionen mit spezifischen funktionellen Gruppen ausgebildet. Diese funktionellen Gruppen weisen dabei eine chemische Reaktivität auf, die geeignet ist, mit spezifischen in TNF-Moleküle eingebrachten funktionellen Gruppen zu reagieren. Die Bindung von TNF erfolgt dabei sowohl kovalent als auch nicht-kovalent über eine chemische Reaktion zwischen TNF und Oberfläche. Die Träger, insbesondere deren Oberflächen, werden daher nach ihrer Herstellung unter Verwendung üblicher Verfahren, beispielsweise Propfpolymerisation, Silanisierung, chemischer Derivatisierung etc. mit geeigneten funktionellen Gruppen 1A beziehungweise funktionellen Gruppen 1A und 1B versehen. Die Dichte der funktionellen Gruppen und der Abstand dieser Gruppen zueinander können optimiert werden. Auch die Umgebung der funktionellen Gruppen kann hinsichtlich einer möglichst effizienten gerichteten Immobilisierung vorbereitet werden.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird der anorganische Träger, beispielsweise der in Form von Quarz, Kieselerde, Kieselgur, Silikagel und/oder SiO2-Pulver vorliegende Träger vor Ausbringen der funktionellen Gruppen 1A und 1B silanisiert, vorzugsweise nach vorhergehender Hydrophilisierung.
  • In besonders bevorzugter Ausführungsform kann vorgesehen sein, dass die Anzahl der funktionellen Gruppen 1A und 1B der Oberfläche durch Zugabe von Verdünnersilanen bei der vorzugsweise vorgesehenen Silanisierung variiert werden kann. Unter dem Begriff Verdünnersilan wird ein Organosilan, das biochemisch inerte funktionelle Gruppen trägt, verstanden, das überdies nicht in der Lage ist, einen die funktionellen Oberflächen-Gruppen tragenden Spacer zu binden. Vorzugsweise wird das Verdünnersilan eingesetzt, um neben dem Verdünnungseffekt auch die unspezifische Bindung von Proteinen an die Oberfläche des Trägers zu reduzieren. In einer bevorzugten Ausführungsform weist das Verdünnersilan von der Silankopfgruppe ausgehend 2 bis 20 Alkylengruppen auf, an die sich vorzugsweise 2 bis 6 Oxoethylengruppen anschließen und durch beispielsweise eine Hydroxygruppe oder Methylethergruppe terminiert sind.
  • In besonders bevorzugter Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Verdünnersilane der Trägeroberfläche durch entsprechende Alkylkettenlänge den Self- Assembly-Effekt begünstigen. Zudem kann vorgesehen sein, dass diese Verdünnersilane, die bei der Silanisierung des Trägers verwendet werden, die unspezifische Adsorption von Proteinen an der Nanopartikel-Oberfläche durch zugefügte entsprechende funktionelle Einheiten, wie zum Beispiel Oligoethylenglykol-Einheiten, verringern. Erfindungsgemäß können auch andere chemische Verbindungen eingesetzt werden, sofern sie bezüglich ihres unspezifischen Bindungsverhaltens Protein-abweisend wirken.
  • Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass die Nanopartikel, insbesondere die Oberfläche, zusätzliche Funktionalitäten aufweisen. Erfindungsgemäß kann der Träger insbesondere Fluoreszenzmarkierungen, UV/Vis-Markierungen, superparamagnetische Funktionen, ferromagnetische Funktionen und/oder radioaktive Markierungen aufweisen. Aufgrund der erfindungsgemäß eingesetzten Funktionalitäten können entsprechend ausgestattete Nanopartikel unter Verwendung geeigneter Vorrichtungen leicht detektiert und/oder isoliert werden.
  • Die Oberfläche des Nanopartikelträgers kann erfindungsgemäß aber auch zusätzliche chemische Verbindungen aufweisen. Diese zusätzlich aufgebrachten chemischen Funktionalitäten richten sich unter anderem nach der späteren Verwendung der erfindungsgemäßen Nanocytes. Sollen diese beispielsweise zur Therapie und/oder Diagnose von Krankheiten verwendet werden, können die Nanopartikel geeignete chemische Verbindungen mit therapeutischer und/oder diagnostischer Wirkung enthalten. In besonders bevorzugter Ausführungsform ist vorgesehen, dass die erfindungsgemäßen Nanopartikel zusätzlich Arzneistoffe wie Cytostatika enthalten. Sie sind dementsprechend besonders zur Therapie von Tumorerkrankungen geeignet.
  • Erfindungsgemäß kann aber auch vorgesehen sein, dass die Funktionalisierung des Trägers unter Verwendung einer oder mehrerer chemischer Verbindungen erfolgt, die zur sterischen Stabilisierung und/oder zur Verhinderung einer Konformationsänderung von immobilisiertem TNF und/oder zur Verhinderung der Anlagerung einer weiteren biologisch aktiven Verbindung an den Träger dient. Erfindungsgemäß besonders bevorzugt ist, dass es sich bei dieser chemischen Verbindung um ein Polyethylenglykol, ein Oligoethylenglykol, Dextran oder ein Gemisch davon handelt.
  • Erfindungsgemäß kann das zu immobilisierende TNF- Molekül natürlichen oder synthetischen Ursprungs sein. Es kann auch durch gentechnische Verfahren gegenüber dem Wildtyp-Protein modifiziert sein und/oder unnatürliche und/oder ungewöhnliche Aminosäuren enthalten.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das zu immobilisierende TNF- Molekül nach peptidsynthetischen Verfahren oder durch in vitro-Translation hergestellt. Dabei werden in bevorzugter Ausführungsform bei der Herstellung unnatürliche, vorzugsweise Linker-Spacertragende Aminosäuren gezielt eingebaut, so dass nachfolgend eine gerichtete und mit dem Erhalt der biologischen TNF-Aktivität kompatible TNF- Immobilisierung an den Träger möglich ist. Die Anwendung des Prinzip des Einbaus unnatürlicher Aminosäuren ermöglicht darüber hinaus den gezielten und selektiven Einbau von Fluorophoren oder anderen Markern an diesen unnatürlichen Aminosäuren.
  • In besonders bevorzugter Weise können diese Modifikationen darin bestehen, dass in dem TNF-Molekül natürlicherweise vorkommende Aminosäuren durch unnatürliche Aminosäuren ausgetauscht sind, das heißt, in einer bestimmten Position eine natürlicherweise vorkommende Aminosäure entfernt und an gleicher Stelle eine unnatürliche Aminosäure insertiert wird. Das Einfügen einer unnatürlichen Aminosäure kann durch das Einfügen eines Stop-Codons an der gewünschten Stelle, durch das Verwenden beziehungsweise den Einsatz einer mit der entsprechenden unnatürlichen Aminosäure beladenen Supressor-tRNA und eines damit durchgeführten in vitro- Translationsansatzes erfolgen. Solche unnatürlichen Aminosäuren sind Verbindungen, die eine Aminosäurefunktion und einen Rest R aufweisen und nicht über einen natürlich vorkommenden genetischen Code definiert sind, zum Beispiel L-(6,7-Dimethyloxycoumaryl)-Alanin. In bevorzugter Weise weisen diese Aminosäuren eine Alkylketongruppe oder eine Aldehydgruppe, Thioestergruppe, Thiolgruppe, Hydrazingruppe oder Hydrazidgruppe auf. Diese unnatürlichen Aminosäuren können durch gentechnologische Verfahren oder während einer chemischen Synthese von TNF in das Molekül eingefügt werden, vorzugsweise zusammen mit einem Spacer oder Linker.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist also zumindest eine Aminosäure von TNF derivatisiert, insbesondere durch Einführung einer Alkylketongruppe, Thiolgruppe, Aldehydgruppe, Thioestergruppe, Hydrazingruppe und/oder Hydrazidgruppe. Insbesondere wird eine der vorhergehenden Funktionen über einen Spacer mit der Seitenkette einer unnatürlichen oder natürlichen Aminosäure verbunden beziehungsweise der Spacer weist eine solche Funktion auf. Der Spacer kann in bevorzugter Ausführungsform flexibel oder linear sein und beispielsweise eine Kettenlänge von 2 bis 50 Atomen aufweisen. Der Spacer ist in weiterer bevorzugter Ausführungsform durch gegebenenfalls substituierte und/oder Heteroatome enthaltende Alkylengruppen gebildet.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird der Spacer durch die Bindung einer Seitenkette einer Aminosäure von TNF, beispielsweise Lysin, an Lävulinsäure (4-Oxopentansäure) gebildet, wobei gleichzeitig eine Methylketongruppe eingeführt wird und der Spacer dem gemäß aus Seitenkette und Lävulinsäure gebildet wird.
  • Sofern die einzusetzende unnatürliche Aminosäure bereits eine Alkylketongruppe, Aldehydgruppe, Thiolgruppe, Thioestergruppe, Hydrazidgruppe oder Hydrazingruppe aufweist, ist eine vorgenannte Derivatisierung nicht mehr nötig. Es kann also vorgesehen sein, eine natürlicherweise vorkommende Aminosäure, beispielsweise Lysin, zu modifizieren, beispielsweise durch Derivatisierung von deren Seitenkette, insbesondere deren primärer Aminogruppe, mit der Carbonsäurefunktion der Lävulinsäure. TNF- Moleküle, die eine solche natürlicherweise vorkommende Aminosäure mit unnatürlicher Derivatisierung aufweisen, sind im Sinne der vorliegenden Lehre modifiziert. Der Einbau von beispielsweise Lävulinsäure in eine unnatürliche oder natürliche Aminosäure ermöglicht es, an definierter Stelle der Sequenz eine Ketofunktion einzubauen, die dann selektiv beispielsweise mit einem Hydrazin oder Hydrazid zu Hydrazon reagieren kann.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt die Modifikation von TNF dadurch, dass Tags, also Markierungen, insbesondere mindestens drei Histidin-Reste, vorzugsweise Oligohistidine, in das TNF-Molekül eingeführt werden, vorzugsweise am C-Terminus oder N-Terminus. Solche Tags können jedoch auch intramolekular angeordnet sein. In einer derartigen Ausführungsform ist vorgesehen, die Oberfläche des Trägers, beispielsweise die silanisierte Oberfläche des Trägers, durch Aufbringen von Metallchelatkomplexen mit funktionellen Gruppen zu versehen. Auf diese Weise wird eine nicht-kovalente Bindung der Metallchelatkomplexe mit dem Oligohistidin-Rest des zu immobilisierenden TNF-Moleküls erreicht. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung stellt die Metallkomponente des Metallchelatkomplexes ein zweiwertiges Metallkation, insbesondere Nickel2+, dar. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der Metallchelatkomplex Nickel-NTA (NTA: Nitrilotriessigsäure), insbesondere ein Derivat davon. Der Metallchelatkomplex, insbesondere Ni-NTA oder ein Derivat davon, ist in bevorzugter Ausführungsform an der Oberfläche des Trägers gebunden, beispielsweise mittels einer Bindung zwischen einer primären Aminogruppe des NTA-Derivats und einer Oberflächen-gebundenen Epoxygruppe.
  • Erfindungsgemäß kann auch vorgesehen sein, die Modifizierung von TNF dadurch vorzunehmen, dass diesem, vorzugsweise am C-Terminus oder N-Terminus, mindestens ein Strep-Tag, beispielsweise Strep-Tag I oder Strep-Tag II oder Biotin oder Desthiobiotin hinzugefügt wird. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden unter einem "Strep-Tag" auch funktionelle und/oder strukturelle Äquivalente verstanden, sofern Streptavidin und/oder dessen Äquivalente binden können. Der Begriff "Streptavidin" erfasst im Sinne der vorliegenden Erfindung also auch dessen funktionelle und/oder strukturelle Äquivalente. In dieser Ausführungsform ist vorgesehen, die Oberfläche des Trägers, vorzugsweise eines anorganischen Trägers, insbesondere die silanisierte Oberfläche des Trägers, mit Streptactin, Avidin, Neutravidin oder Streptavidin zu versehen. Die erfindungsgemäß vorgesehene Bindung zwischen zu imobilisierenden TNF-Molekülen und Oberfläche des Trägers erfolgt also durch eine Affinitätsbindung zwischen beispielsweise Strep-Tag und beispielsweise Streptavidin. Es ist auch möglich, dass beispielsweise Streptavidin am TNF-Molekül und beispielsweise das Strep-Tag als funktionelle Gruppe des Trägers vorgesehen ist. Selbstverständlich ist es erfindungsgemäß auch möglich, mehrere der genannten Modifikationen an dem zu immobilisierenden TNF- Molekül vorzunehmen, zum Beispiel eine unnatürliche Aminosäure, die Oligohistidin- und/oder Strep-Tags enthält, einzuführen.
  • Die Erfindung sieht also vor, beispielsweise mit unnatürlichen Aminosäuren, natürlichen, jedoch unnatürlich derivatisierten Aminosäuren, spezifischen Histidin- und/oder Strep-Tags modifizierte TNF- Moleküle mit dazu komplementär reaktiven Oberflächen derart zur Bindung zu bringen, dass eine geeignete Anbindung der TNF-Moleküle und damit eine Immobilisierung dieser erfolgt.
  • In vorteilhafter Weise behält gebundenes TNF dabei vollständig seine biologische Funktionen bei. Durch die bereitgestellten Linker beziehungsweise Spacer zwischen Träger- und TNF-Oberfläche wird den sterischen Anforderungen für eine Immobilisierung von TNF unter Erhalt von seiner Aktivität genüge getan. Zudem ermöglicht die Erfindung auch den ortsspezifischen Einbau von Reporter- oder Markergruppen, zum Beispiel Fluorophoren, Spin-Labeln, Goldpartikeln für Lichtstreuung etc. in Positionen, die die funktionellen Eigenschaften von TNF nicht beeinträchtigen. Die Vorteile der erfindungsgemäßen Nanopartikel und des erfindungsgemäßen Verfahrens zur spezifischen und gerichteten Immobilisierung und Markierung von TNF im Vergleich zum Stand der Technik resultieren aus den spezifischen chemischen Reaktionen zwischen TNF-Molekülen, die mit unnatürlichen Aminosäuren oder spezifischen Gruppen modifiziert wurden und komplementär reaktiven Festphasen sowie aus der selektiven Modifikation des zu immobilisierenden TNF-Moleküls. Die immobilisierten und gegebenenfalls auch markierten TNF-Moleküle sind durch den Erhalt ihrer nativen Konformation stabiler gegen enzymatischen oder chemischen Abbau und behalten ihre biologischen Funktionen bei. Dabei werden insbesondere die biologischen Aktivitäten, die auf Protein-Protein-Wechselwirkung beruhen, durch die immobilisierten TNF-Moleküle weitervermittelt.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass das TNF-Molekül mit Markern, die seinen Nachweis erlauben, markiert ist. Dabei kann es sich beispielsweise um Fluorophore, Spin-Label, Goldpartikel, radioaktive Marker oder ähnliches handeln. In besonders bevorzugter Weise sind diese Marker, beispielsweise die Fluorophore, in der Lage, bei der Bindung eines in einem Test nachzuweisenden Bindungspartners an das gebundene TNF-Molekül eine spezifische Änderung der Fluoreszenzemission zu zeigen. Die Fluorophore können in das zu immobilisierende TNF mittels Aminosäuren, insbesondere unnatürlicher Aminosäuren, eingefügt werden. Erfindungsgemäß geeignet Fluormarker sind beispielsweise N-Methyl-Aza-Tryptophan oder Coumarinderivate, wie DCA(6,7-Dimethoxy-4- coumaryl) oder NBD (N-β-7-nitro-benzofurazan-L-N- diaminopropionsäure). Erfindungsgemäß kann das zu immobilisierende TNF-Molekül auch mit Fluorophoren markiert sein, die eine Einzelmoleküldetektion ermöglichen, zum Beispiel die Fluoreszenzfarbstoffe CyDye (Ammersham Pharmacia Freiburg) oder Alexa (Molecular Probes, Eugene, USA).
  • Die erfindungsgemäß ermöglichte Detektion von oberflächengebundenen Liganden des immobilisierten TNF- Moleküls, also zum Beispiel der Nachweis eines Zelloberflächen-Rezeptors, kann zum Beispiel durch Matrix-unterstützte Laser-Desorptions/Ionisations- Massenspektrometrie (MALDI-TOF) erfolgen. Der massenspektroskopische Nachweis umfasst die Identifizierung und Charakterisierung der gebundenen Liganden in situ sowie die ortsaufgelöste Analytik. Der Nachweis der oberflächengebundenen Liganden kann durch Fluoreszenzspektroskopie erfolgen. Die Bindung des Liganden an den erfindungsgemäß immobilisierten Festphasen-Liganden, also TNF, ruft eine Änderung der Fluoreszenzeigenschaften der erfindungsgemäß eingesetzten Fluoreszenzmarker hervor, die eine Quantifizierung der Bindungsereignisse ermöglicht.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft also auch Verfahren zum Nachweis einer Interaktion von immobilisiertem TNF mit beispielsweise Liganden wie Rezeptoren, funktionellen oder strukturellen Äquivalenten, Analoga, Agonisten, Antagonisten oder ähnlichen, insbesondere zum Zweck der medizinischen Forschung und Diagnostik, wobei die erfindungsgemäßen Nanopartikel eingesetzt werden, um die vorgenannten Bindungspartner von immobilisiertem TNF zu identifizieren. Gemäß diesem Verfahren werden erfindungsgemäße Nanopartikel mit daran immobilisiertem TNF mit einer zu untersuchenden Lösung, die potentielle Bindungspartner enthält, in Kontakt gebracht und eine Wechselwirkung oder eine Hemmung dieser Wechselwirkung nachgewiesen. Das vorgenannte Verfahren stellt also auch ein Verfahren zum Identifizieren oder Screenen von potentiellen Bindungspartnern, beispielsweise potentiellen Liganden, des erfindungsgemäß immobilisierten TNF dar.
  • Ebenso betrifft die Erfindung Verfahren zum quantitativen Isolieren von Substanzen, die mit dem erfindungsgemäß immobilisierten TNF-Molekül reagieren, das heißt binden. Bei solchen Substanzen handelt es sich insbesondere um Proteine.
  • In besonders bevorzugter Weise können die erfindungsgemäßen Verfahren und die erfindungsgemäßen Nanopartikel auch eingesetzt werden, um Stoffe zu identifizieren, die beispielsweise als Modulatoren, das heißt Verstärker, Induktoren oder Hemmstoffe für die, insbesondere physiologischen, Interaktionen von TNF mit anderen Proteinen fungieren. Derartige nachzuweisende Hemmstoffe können beispielsweise gentechnisch veränderte, körpereigene Proteine, chemische synthetisierte Verbindungen aus Substanzbibliotheken oder andere auch unbekannte Substanzen sein, die gegebenenfalls therapeutischen Nutzen mit sich bringen können.
  • In einer weiteren Ausführungsform kann vorgesehen sein, TNF zu immobilisieren, das einen ersten von zwei Reaktanten trägt oder diesen darstellt und die Wechselwirkung des zweiten Reaktanten mit dem ersten Reaktanten durch eine geeignete Nachweismethode nachweist. Dabei kann vorzugsweise auch vorgesehen sein, dass die Wechselwirkung des zweiten Reaktanten mit dem ersten Reaktanten in Gegenwart oder Abwesenheit eines potentiellen Modulators, zum Beispiel Induktors oder Inhibitors durch geeignete Nachweisverfahren nachgewiesen wird und so potentielle Induktoren oder Inhibitoren in ihrer Wirksamkeit, beispielsweise als Arzneimittel, überprüft werden können. Die zu überprüfenden potentiellen Induktoren oder Inhibitoren können beispielsweise aus Substanzbibliotheken stammen. In besonders bevorzugter Ausführungsform kann vorgesehen sein, dass der Inhibitor oder der zweite Reaktant, also zum Beispiel ein Protein, eine in Genom-Sequenzier- Projekten identifiziertes Protein ist.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft also auch Verfahren zur Identifizierung und/oder Detektion einer Substanz, die die Interaktion zwischen immobilisiertem TNF und dessen Interaktionspartner modifizieren, insbesondere fördern oder hemmen kann, wobei das an Nanopartikeln immobilisierte TNF zusammen mit einem, vorzugsweise aufgereinigten und isolierten, Interaktionspartner, in Gegenwart oder Abwesenheit der zu testenden Substanz inkubiert und eine Auswirkung dieser Substanz auf die Interaktion zwischen immobilisiertem TNF und dessen Bindungspartner nachgewiesen wird.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zur gerichteten Immobilisierung von TNF an einem Nanopartikel unter Beibehaltung der biologischen TNF-Aktivität, wobei die Oberfläche eines anorganischen oder organischen Trägers durch Aufbringen einer ersten funktionellen Gruppe 1A und gegebenenfalls einer zweiten funktionellen Gruppe 1B modifiziert und komplementäre funktionelle Gruppen 2A und gegebenenfalls funktionelle Gruppen 2B aufweisende modifizierte TNF-Moleküle mit der modifizierten Nanopartikel-Oberfläche derart in Kontakt gebracht, dass eine kovalente Bindung zwischen den funktionellen Gruppen 1A und 2A und gegebenenfalls eine nicht-kovalente Bindung zwischen den Gruppen 1B und 2B dergestalt stattfindet, dass das Protein gerichtet und unter Beibehaltung seiner biologischen Aktivität an das Nanopartikel bindet.
  • Erfindungsgemäß ist insbesondere vorgesehen, dass die funktionellen Gruppen 1A und 2A ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Aminogruppe, Carboxygruppe, Epoxygruppe, Maleinimidogruppe, Alkylketongruppe, Aldehydgruppe, Hydrazingruppe, Hydrazidgruppe, Thiolgruppe und Thioestergruppe. Die funktionellen Gruppen 1B und 2B sind erfindungsgemäß ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Oligohistidingruppe, Strep-Tag I, Strep-Tag II, Desthiobiotin, Biotin, Chitin, Chitinderivate, Chitinbindedomäne, Metallionenchelatkomplex, Streptavidin, Streptactin, Avidin und Neutravidin. Erfindungsgemäß können die funktionellen Gruppen 1A, 1B, 2A und/oder 2B unter Verwendung eines Spacers mit dem Träger und/oder Protein verbunden sein.
  • In bevorzugter Ausführungsform werden die funktionellen Gruppen 1A und 1B mittels Propfpolymerisation, Silanisierung oder chemischer Derivatisierung auf die Trägeroberfläche aufgebracht. Beispielsweise kann der Träger nach seiner Herstellung zunächst hydrophylisiert und dann silanisiert werden. Die Silanisierung der Trägeroberfläche erfolgt beispielsweise mit einem Organosilan, insbesondere SiR1R2R3R4, wobei R1 bis R3 hydrolisierbare Gruppen wie Alkoxygruppen oder Halogenide, bevorzugt Chloride, und R4 ein organischer Rest ist, der als Spacer mit einer ersten funktionellen Gruppe 1A oder als Bindestelle für einen die erste funktionelle Gruppe 1A tragenden Spacer ausgeführt sein kann. Sofern in einer anderen Ausführungsform der Erfindung R4 als Bindestelle, zum Beispiel als Epoxygruppe, für den die funktionelle Gruppe aufweisenden Spacer ausgeführt ist, werden im Anschluss an die Silanisierung die funktionellen Gruppen auf die Oberfläche aufgebracht, das heißt zum Beispiel die Maleinimidogruppe usw.
  • Die Dichte der funktionellen Gruppen oder der Abstand der funktionellen Gruppen von der Oberfläche und damit die Flexibilität können gegebenenfalls optimiert werden. Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass die Umgebung der funktionellen Gruppen auf der Trägeroberfläche bezüglich elektrostatischer und sterischer Ausstattung für eine möglichst effiziente, gerichtete Immobilisierung vorbereitet wird. Darüber hinaus können die Trägeroberflächen zusätzlich mit Molekülen wie Polyethylenglykolen, Oligoethylenglykolen, Dextranen und ähnlichen ausgestattet werden, um eine unerwünschte Konformationsänderung der immobilisierten TNF-Moleküle zu verhindern, die unspezifische Adsorption anderer biologischer Verbindungen zu minimieren und/oder die Trägersysteme sterisch zu stabilisieren.
  • In einem weiteren Schritt wird TNF an der modifizierten Oberfläche des Nanopartikelträgers immobilisiert, wobei je nach Oberflächenmodifikation die entsprechende Proteinmodifikation zu wählen ist. Dabei wird das zu immobilisierende TNF-Molekül erfindungsgemäß mit der modifizierten Oberfläche unter solchen Bedingungen in Kontakt gebracht, dass ein Abbau des Proteins minimiert oder verhindert wird.
  • Nach der TNF-Immobilisierung an der Trägeroberfläche ist erfindungsgemäß vorgesehen, die erfindungsgemäßen Nanopartikel gegebenenfalls mit Hilfe eines Stealth-Verfahrens, insbesondere durch Verpacken in beispielsweise Liposomen, zu maskieren, um bei späterer Verwendung der erfindungsgemäßen Nanopartikel eine ausreichende biologische Zirkulation zu erreichen.
  • Erfindungsgemäß besteht auch die Möglichkeit, die Nanopartikel mit dem daran den immobilisierten TNF auf einer Membran abzuscheiden, wobei der entstehende Film durch Quervernetzung mechanisch und/oder chemisch stabilisiert wird.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Nanopartikel zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, insbesondere zur Tumortherapie. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einer "pharmazeutischen Zusammensetzung" ein zu diagnostischen, therapeutischen und/oder prophylaktischen Zwecken verwendetes Gemisch verstanden, das natürliche oder synthetisch hergestellte Wirkstoffe in einer beim Patienten gut applizierbaren Form enthält. Erfindungsgemäß ist also vorgesehen, dass die herzustellende pharmazeutische Zusammensetzung den Wirkstoff, insbesondere TNF, in einer an einem Nanopartikel immobilisierten Form enthält. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann ein festes oder flüssiges Gemisch sein. Eine pharmazeutische Zusammensetzung kann gegebenenfalls einen oder mehrere pharmazeutische Träger sowie weitere Zusatzstoffe wie Stabilisatoren, Verdickungsmittel, Trennmittel, Gleitmittel, Farbstoffe, Geruchsstoffe, Geschmacksstoffe, Gerüststoffe, Emulgatoren oder ähnliche enthalten.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft daher auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, die die erfindungsgemäßen Nanopartikel enthält, das heißt also, die TNF in immobilisierter Form an einem erfindungsgemäßen Nanopartikel enthält.
  • Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen.
  • Die Erfindung wird anhand der Figuren und der folgenden Beispiele näher erläutert.
  • Fig. 1 zeigt die Ergebnisse eines Biotests, wobei die Wirkung erfindungsgemäßer Nanopartikel auf KYM- 1-Tumorzellen im Vergleich zu der von löslichem humanem rekombinanten TNF als Kontrolle untersucht wurde.
  • Fig. 2 zeigt die Ergebnisse eines Biotests, wobei die Wirkung erfindungsgemäßer Nanopartikel auf Colo205-Tumorzellen im Vergleich zu der von löslichem humanem rekombinanten TNF als Kontrolle untersucht wurde. Kontrollen wurden mit löslichem humanem TNF mit oder ohne Coinkubation mit dem monoclonalen Antikörper 80M2, der selbst keine agonistische Aktivität besitzt, durchgeführt.
  • Fig. 3 zeigt die Ergebnisse eines Biotests, wobei die Wirkung erfindungsgemäßer Nanopartikel auf L929-Tumorzellen im Vergleich zu der von löslichem humanem rekombinanten TNF als Kontrolle untersucht wurde.
  • Fig. 4 zeigt die Ergebnisse von Wellenleiterspektroskopie-Resonanz-Analysen, wobei der modifizierte Tumornekrosefaktor-Rezeptor 1 (TNFR1-Fc) über α- Aminogruppen auf eine Carboxymethyldextran-Matrix (CMD-Matrix) immobilisiert und danach Bindungsstudien mit CyHISTNF durchgeführt wurden. Die Auftragung des Ausmaßes an Bindung von CysHisTNF (extent) gegen die eingesetzte Konzentration (ligate) resultiert in einer Bindungskurve, die im Sättigungsbereich die maximal mögliche Bindung beschreibt (Bmax). Durch die Auftragung des Quotienten aus dem Ausmaß der Bindung und der CysHisTNF-Konzentration (extent/ligate) gegen das Ausmaß der Bindung (extent) wird eine Geradengleichung erhalten, deren Steigung der negativen Affinitätskonstanten KD entspricht (Scatchard Plot). Die Auftragung der Assoziationsraten-Konstante (kon) gegen die CysHisTNF- Konzentration ist eine weitere Methode, den KD-Wert zu bestimmen und dient zur Bestimmung des ermittelten KD-Wertes. Der Schnittpunkt der Geraden mit der Y-Achse entspricht der Halbwertzeit t1/2 des Ligand- Rezeptor-Komplexes und ist somit ein Maß der Stabilität des CysHisTNF-Rezeptor-Komplexes.
  • Fig. 5 zeigt die Ergebnisse von Wellenleiterspektroskopie-Resonanz-Analysen, wobei der modifizierte Tumornekrosefaktor-Rezeptor 2 (TNFR2-Fc) über α- Aminogruppen auf eine CMD-Matrix immobilisiert und danach Bindungsstudien mit CyHISTNF durchgeführt wurden. Die Auftragung des Ausmaßes an Bindung von CysHisTNF (extent) gegen die eingesetzte Konzentration (ligate) resultiert in einer Bindungskurve, die im Sättigungsbereich die maximal mögliche Bindung beschreibt (Bmax). Der Schnittpunkt der Geraden mit der Y-Achse entspricht der Halbwertzeit t1/2 des Ligand-Rezeptor-Komplexes und ist somit ein Maß der Stabilität des CysHisTNF-Rezeptor-Komplexes.
  • Fig. 6 zeigt die Ergebnisse von Wellenleiterspektroskopie-Resonanz-Analysen, wobei der modifizierte Tumornekrosefaktor-Rezeptor 1 (TNFR1-Fc) über α- Aminogruppen auf eine CMD-Matrix immobilisiert und danach Bindungsstudien mit TNF durchgeführt wurden. Die Auftragung des Ausmaßes an Bindung von TNF (extent) gegen die eingesetzte Konzentration (ligate) resultiert in einer Bindungskurve, die im Sättigungsbereich die maximal mögliche Bindung beschreibt (Bmax). Der Schnittpunkt der Geraden mit der Y-Achse entspricht der Halbwertzeit t1/2 des Ligand-Rezeptor-Komplexes und ist somit ein Maß der Stabilität des TNF-Rezeptor-Komplexes.
  • Fig. 7 zeigt die Ergebnisse von Wellenleiterspektroskopie-Resonanz-Analysen, wobei der modifizierte Tumornekrosefaktor-Rezeptor 2 (TNFR2-Fc) über α- Aminogruppen auf eine CMD-Matrix immobilisiert und danach Bindungsstudien mit TNF durchgeführt wurden. Die Auftragung des Ausmaßes an Bindung von TNF (extent) gegen die eingesetzte Konzentration (ligate) resultiert in einer Bindungskurve, die im Sättigungsbereich die maximal mögliche Bindung beschreibt (Bmax). Der Schnittpunkt der Geraden mit der Y-Achse entspricht der Halbwertzeit t1/2 des Ligand-Rezeptor-Komplexes und ist somit ein Maß der Stabilität des TNF-Rezeptor-Komplexes.
    • Beispiel 1 Herstellung eines Trägers 1.1 Silica-Träger
  • Zu 200 ml Ethanol wurden 12 mMol Tetraethoxysilan und 90 mNol NH3 gegeben. Das Gemisch wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und anschließend wurden die gebildeten Partikel durch mehrfaches Zentrifugieren gereinigt. Dabei wurden 650 mg Silica-Partikel mit einer mittleren Partikelgröße von 125 nm erhalten.
    • 1.2 Magnetische Eisenoxid-Träger
  • 200 ml einer 1 M FeCl3-Lösung und 5 ml einer 2 M FeSO4-Lösung in 2 M HCl wurden unter kräftigem Rühren zu 250 ml einer 0,7 M NH3-Lösung gegeben. Anschließend wurde 30 Minuten gerührt und der gebildete schwarze Feststoff wurde mit 200 ml Wasser gewaschen. Anschließend wurde der Niederschlag 30 Minuten mit 100 ml 2 M HNO3 gerührt und dreimal mit jeweils 100 ml Wasser gewaschen. Die superparamagnetischen Eisenoxid-Träger wurden in 50 ml einer 0,1 M Tetramethylammoniumhydroxid-Lösung resuspendiert. Dabei wurden 2 g Eisenoxid-Partikel mit einer mittleren Partikelgröße von 10 nm erhalten.
    • 1.3 Magnetische Komposit-Träger
  • 50 mg der in Beispiel 1.2 erhaltenen magnetischen Eisenoxid-Partikel wurden zweimal mit 5 ml Ethanol gewaschen und anschließend in 200 ml Ethanol aufgenommen. Zu der Lösung wurden 12 mMol Tetraethoxysilan und 90 mMol NH3 gegeben. Anschließend wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Danach wurden die Partikel durch mehrfache Zentrifugation gereinigt. Dabei wurden 600 mg magnetische Komposit- Partikel mit einer mittleren Partikelgröße von 150 nm erhalten.
    • 1.4 Fluoreszierende Träger
  • 190 µMol Fluoresceinamin und 170 µMol Isocyanatopropyltriethoxysilan in 50 ml Ethanol wurden 3 Stunden unter Rückfluss gekocht. Zu 50 ml Ethanol wurden 3 mMol Tetraethoxysilan und 880 µl einer Silan-Farbstoff-Lösung gegeben. Nach Zugabe von 22,5 mMol NH3 wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurden die erhaltenen Partikel durch mehrfache Zentrifugation aufgereinigt. Dabei wurden 160 mg Silica-Partikel mit einer mittleren Partikelgröße von 110 nm erhalten.
    • 1.5 Organische Polymer-Träger
  • 50 mg des Emulgators p-(11-Acrylamido)- undecenoyloxyphenyl-dimethylsulfonium-methylsulfat wurden in 30 ml Wasser unter Rühren gelöst. Anschließend wurde eine Stunde lang Argon durch die Lösung geleitet. Unter Rühren erfolgte dann die Zugabe von 1,8 ml Methylmethacrylat. Die entstandene Emulsion wurde auf 60°C erwärmt. Durch Zugabe von 10 mg 2,2'-Azobis-(2-Amidinopropan)dihydrochlorid wurde die Polymerisation gestartet. Nach 5 Stunden wurde die Partikelsuspension abgekühlt und die Partikel wurden durch Zentrifugation gereinigt. Dabei wurden 1,6 g Partikel mit einer mittleren Partikelgröße von 145 nm erhalten. Die erhaltenen Partikel tragen kovalent verknüpfte Sulfoniumgruppen auf ihrer Oberfläche (Zetapotential im Phosphat Puffer, pH 7,0: +22 mV) und sind zur Anbindung von Nukleophilen befähigt.
    • Beispiel 2 Oberflächenmodifizierung der Träger 2.1 Aminiofunktionalisierte Oberfläche
  • Eine 1 Gew.-% wässrige Suspension der in den Beispielen 1.1 bis 1.4 erhaltenen Träger wurde mit 10 Vol.-% 25% Ammoniak versetzt. 20 Gew.-% Aminopropyltriethoxysilan, bezogen auf die Träger, wurden zugegeben und es wurde eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Die Partikel wurden durch mehrfaches Zentrifugieren gereinigt. Die erhaltenen Partikel tragen funktionelle Aminogruppen auf ihrer Oberfläche (Zetapotential im 0,1 M Acetat-Puffer: +35 mV).
    • 2.2 Aminofunktionalisierte organische Polymerträger
  • 10 mg der in Beispiel 1.5 erhaltenen Träger wurden in 50 µl eines 10 mMol Phosphatpuffers (pH 7,8) gegeben. Anschließend wurden 950 µl einer 1 M Ethylendiamin-Lösung in 10 mMol Phosphatpuffer (pH 7,8) zugegeben. Dann wurde zwei Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Die Partikel wurden dann durch Zentrifugation aufgereinigt. Die so erhaltenen Träger tragen kovalent gebundene Amino-Gruppen auf ihrer Oberfläche.
    • 2.3 Carboxy-funktionalisierte Oberfläche
  • Zunächst wurde eine 2 Gew.-% Suspension aminofunktionalisierter Träger in Tetrahydrofuran hergestellt. Zu 10 ml dieser Lösung wurden 260 mg Bernsteinsäureanhydrid gegeben. Nach einer 5- minütigen Behandlung mittels Ultraschall wurde eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Danach wurden die Träger durch mehrfaches Zentrifugieren gereingigt. Die erhaltenen Silica-Träger tragen funktionelle Carboxygruppen (Zetapotential im 0,1 M Acetat-Puffer: -35 mV) auf ihrer Oberfläche und besitzen eine mittlere Partikelgröße von 170 nm.
    • 2.4 Carboxydextran-modifizierte Träger
  • 10 mg aminofunktionalisierte Nanopartikel und 1 mg Carboxydextran (Sigma, >55 cps) wurden zu 1 ml 0,1 M Morpholinoethansulfonsäure-Puffer (MES, pH 5,0) gegeben. Dazu wurden 30 µl einer N-Ethyl-N'-(3- dimethylaminopropyl)-carbodiimid (EDC)-Lösung mit einer Konzentration von 500 µMol/ml zugegeben. Anschließend wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur geschüttelt. Die Träger wurden abwechselnd mit MES- und TBE-Puffer (89 mM Tris-(hydroxymethyl)aminomethan, 89 mM Borsäure, 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure, pH 8,3) gewaschen. Anschließend wurden die gewaschenen Partikel in 1 ml MES- Puffer aufgenommen. Die erhaltenen Silica-Partikel tragen funktionelle Carboxygruppen (Zetapotential im 0,1 M Acetat-Puffer: -25 mV) auf ihrer Oberfläche und weisen eine mittlere Partikelgröße von 160 nM auf. Diese Dextran-Oberfläche ist insbesondere zur Immobilisierung von Proteinen geeignete deren Tertiärstruktur durch Adsorptionsprozesse auf der Trägeroberfläche gestört wird.
    • 2.5 Aminofunktionalisierung von Carboxy-(Dextran)- Trägern
  • Zunächst wurde eine 1 M Ethylendiamin-Lösung in 0,1 M MES-Puffer (pH 5,0) hergestellt. Dazu wurden 500 µg der Carboxy-(Dextran)-modifizierten Träger und 30 µl einer 500 µMol/ml EDC-Lösung in MES-Puffer gegeben. Anschließend wurde drei Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Die Träger wurden danach mehrmals mit MES-Puffer gewaschen. Dabei wurden Träger mit einer mittleren Partikelgröße von 160 nm und einem Zetapotential von +25 mV im 0,1 M Acetat-Puffer erhalten.
  • Zur Variation der Spacerlänge beziehungsweise der Dichte der funktionellen Gruppen können auch andere Amine in analoger Weise eingesetzt werden, beispielsweise 4,7,10-Trioxa-1,13-tridecandiamin (oder höhere Homologe) oder Tris(2-aminoethyl)-amin.
    • 2.6 Nitrilotriessigsäure (NTA)-Oberfläche
  • 10 mg Carboxy-modifizierte Träger wurden zweimal mit 1 ml Acetonitril (MeCN) gewaschen und anschließend in 1 ml MeCN aufgenommen. Dazu wurden 10 µMol Dicyclohexylcarbodiimid und 10 µMol N-Hydroxysuccinimid gegeben. Anschließend wurde zwei Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Danach wurde einmal mit 1 ml Cyclohexan und einmal mit 1 ml MeCN gewaschen. Die Partikel wurden anschließend in 1 ml MeCN aufgenommen. Dazu wurden 4 µMol N,N-Bis- Carboxymethyl-L-Lysin gegeben und drei Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Danach wurde einmal mit 1 ml Acetonitril und zweimal mit 1 ml 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen.
  • Durch diese Umsetzung wird einerseits die Dichte der funktionellen Carboxy-Gruppen erhöht und andererseits können mit dieser Oberfläche Ni2+-Ionen durch Komplexierung gebunden werden. Diese Oberfläche ist dann zur Bindung von His-Tag-modifizierten Proteinen befähigt.
    • 2.7 Thiol-Oberfläche
  • 10 mg Carboxy-modifizierte Träger wurden zweimal mit 1 ml Acetonitril (MeCN) gewaschen und dann in 1 ml MeCN aufgenommen. Dazu wurden 10 µMol Dicyclophexylcarbodiimid und 10 µMol N-Hydroxysuccinimid gegeben und anschließend wurde zwei Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Dann wurde einmal mit 1 ml Cyclohexan und einmal mit 1 ml MeCN gewaschen. Die Träger wurden dann in 1 ml MeCN aufgenommen. Dazu wurden 500 µg Cystein gegeben und drei Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Im Anschluss daran wurde einmal mit 1 ml Acetonitril und zweimal mit 1 ml 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen.
  • Diese Oberfläche ist insbesondere zur Immobilisierung von Proteinen über Disulfid-Brücken geeignet.
    • 2.8 Maleimido-aktivierte Oberfläche
  • 500 µg aminofunktionalisierte Träger wurden in 1 ml 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) resuspendiert. Dazu wurden 1,25 µMol Sulfo-Succinimidyl-4-(N- maleimidomethyl)-cyclohexan-1-carboxylat gegeben und eine Stunde bei Raumtemperatur geschüttelt. Danach wurde einmal mit kaltem 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen und die Träger wurden in 1 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) aufgenommen.
    • 2.9 Iodacetyl-aktivierte Oberfläche
  • 500 µg aminofunktionalisierte Träger wurden in 1 ml 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) resuspendiert. Dazu wurden 1.25 µMol Succinimidyl-(4-iodoacetyl)- aminobenzoat gegeben und eine Stunde bei Raumtemperatur geschüttelt. Danach wurde einmal mit kaltem 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen und die Träger wurden in 1 ml 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) aufgenommen.
  • Diese Oberflächen sind zur Ankopplung von Proteinen geeignet, die freie Thiol-Gruppen tragen.
    • 2.10 Oberfläche mit NH2- und COOH-Gruppen
  • Die Belegung mit funktionellen Gruppen ist in den Beispielen 2.1 bis 2.9 so beschrieben, dass sie quantitativ verläuft. Diese Belegungen lassen sich üblicherweise aber auch durch die Wahl der Reaktionsbedingungen, insbesondere über die Konzentration des Modifikationsmittels, so steuern, dass sie nur teilweise erfolgen. Durch eine entsprechende Wahl der Modifikationsmittel wird erreicht, dass verschiedene funktionelle Gruppen nebeneinander auf der Trägeroberfläche vorliegen.
  • Beispielsweise wird in Beispiel 2.3 die Konzentration an Bernsteinsäureanhydrid verringert. Durch eine geeignete Wahl des Verhältnisses NH2/COOH variiert der isoelektrische Punkt des Trägersystems in einem weiten Bereich, beispielsweise zwischen 8 und 3. Dies ist bei der Umsetzung mit Proteinen ein entscheidender Parameter zur Steuerung der Reaktivität, da sich gleichgeladene Systeme abstoßen.
    • 2.11 Trägeroberflächen mit SH- und NTA-Gruppen
  • Die Reaktion wird wie in den Beispielen 2.6 oder 2.7 durchgeführt, wobei allerdings ein Gemisch der beiden Modifikationsmittel eingesetzt wird. Dadurch werden His-Tag-tragende Proteine in einem ersten Schritt nicht-kovalent ausgerichtet, wobei dieser Zustand durch Ausbildung einer kovalenten Disulfid- Brücke anschließend dauerhaft fixiert wird.
    • 3. Immobilisierung von TNF an Nanopartikeln
  • Die vorstehend hergestellten oberflächenmodifizieretn Nanopartikel wurden zur Immobilisierung von TNF-Molekülen verwendet. Dabei wurden die Cytokine in gerichteter Weise unter Erhalt ihrer Signalfähigkeit an die inerten Träger gekoppelt, so dass bei Verwendung der Nanopartikel eine Wechselwirkung mit einem TNF-Rezeptor möglich und die Signalantwort der Zelle in definierten Zellsystemene messbar war.
    • 3.1 Konstruktion von TNF-Varianten 3.1.1 TNF-Fusionsproteine mit N-terminalen Modifikationen
  • Es wurde das Linker-modifizierte Fusionsprotein CysHisTNF konstruiert, das in der Nähe des N- Terminus über eine reaktive Thiolgruppe verfügt, die beispielsweise mit einer Maleinimido-Gruppe auf der Oberfläche von Nanopartikeln eine kovalente Bindung eingehen kann. Das Protein wurde zusätzlich mit einem Gly-reichen Linker mit einem His-Tag bestehend aus zwei oder mehr Histidinresten versehen, wodurch das Protein einerseits an einem, mit Ni2+ beladene Affinitätsmatrix gebunden und mit Imidazol eluiert werden kann. Der His-Tag erlaubt andererseits eine nicht-kovalente Bindung von CysHisTNF an Metallionenchelatkomplexen, insbesondere Nickel- Nitrilotriessigsäure (NTA)-Gruppen auf der Oberfläche von Nanopartikeln. Die Klonierung des Funktionsproteines erfolgte nach Standardverfahren, beispielsweise unter Verwendung von Verfahren zur site specific-Mutagenese. Das Fusionsprotein wurde anschließend in prokaryontischen Zellen, insbesondere E. coli, exprimiert. Das so hergestellte Fusionsprotein verfügt über eine hohe Bioaktivität.
    • 3.1.2 TNF-Fusionsproteine mit natürlichen Linkern (Multimerisierungsmodulen)
  • Es wurde ein Fusionsprotein mit der Multimerisierungsdomäne aus dem Tenascin-C-Molekül (TNC) konstruiert. Die Multimerisierungsdomäne aus diesem Molekül erlaubt eine gezielte kovalente Trimerisierung des TNF-Fusionsproteins und enthält am N- Terminus zwei Cysteinreste. Die Klonierung dieses Fusionsproteines erfolgte nach Standardverfahren. Das Fusionsprotein wurde unter anderem in prokaryontischen Zellen, insbesondere in E. coli, Säugerzellen und im Baculovirus-Expressionssystem exprimiert.
    • 3.2 Kovalente Immobilisierung von TNF- Fusionsproteinen an oberflächenmodifizierten Trägerpartikeln
  • Die in den Beispielen 3.1.1 und 3.1.2 hergestellten Cytokine wurden mit entsprechend oberflächenmodifizierten Trägern umgesetzt. Dabei wurden die beiden Kopplungskomponenten gemischt und 30 bis 45 Minuten bei Raumtemperatur in einem PBS-Puffersystem inkubiert. Die Abtrennung der Partikel von den löslichen Komponenten erfolgte mittels Zentrifugation. Die an den Nanopartikeln immobilisierten TNF- Proteine wurden dann gewaschen.
    • 3.3 Nachweis der Immobilisierung und der biologischen Aktivität von immobilisiertem TNF
  • Anhand von Bio-Assays sowie ELISA-Tests wurde nachgewiesen, dass eine Immobilisierung der TNF- Moleküle an den Nanopartikeln erfolgte. Die erhaltenen Nanopartikel mit daran immobilisiertem TNF wurden bezüglich ihrer biologischen Aktivität unter Verwendung definierter zellulärer Testsysteme, insbesondere Tumorzelllinien, charakterisiert. Diese Zellsysteme ermöglichen eine sensitive Erfassung einer differentiellen biologischen Aktivität löslicher und Nanopartikel-gekoppelter TNF-Varianten.
  • Insbesondere wurde die cytotoxische Wirkung der erfindungsgemäßen Nanopartikel mit daran immobilisiertem TNF auf KYM-1-Zellen, Colo205-Zellen und L929-Zellen erfasst. Die Wirkung der erfindungsgemäßen Nanopartikel mit daran immobilisiertem TNF wurde mit der Wirkung von in Lösung befindlichem humanem rekombinanten TNF-α als Kontrolle verglichen. Die Tests bezüglich der Wirkung der erfindungsgemäßen Nanopartikel und löslichem TNF auf die vorstehend genannten Tumorzelllinien erfolgte nach Standardverfahren. Dabei wurden die EC50-Werte von immobilisiertem und in Lösung befindlichem TNF ermittelt und verglichen.
  • Die unter Verwendung der Tumorzelllinie KYM 1 erhaltenen Ergebnisse sind in Fig. 1 und Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1 zeigt die EC50-Werte für die TNF-Konjugate im Vergleich zu menschlichem rekombinanten TNF-α. Tabelle 1

  • Der Biotest zur Bestimmung der Wirkung von immobilisierten und nicht-immobilisierten TNF auf die Zielzellen Colo205 wurde nach Standardverfahren durchgeführt. Kontrollansätze wurden dabei mit löslichem TNF mit oder ohne Coinkubation mit dem monoclonalen Antikörper 80M2, der selbst über keine agonistische Aktivität verfügt, durchgeführt. Die Ergebnisse bezüglich der Wirkung der erfindungsgemäßen Nanopartikel auf diese Zielzellen im Vergleich zu der Wirkung von löslichem humanem rekombinanten TNF auf die Zielzellen Colo205 sind in Fig. 2 und Tabelle 2 zusammengefasst. Tabelle 2

  • Die Ergebnisse bezüglich der biologischen Wirkung von erfindungsgemäßen Nanopartikeln mit daran immobilisiertem TNF auf die Zielzellen L929 zu löslichem humanem TNF sind in Fig. 3 und in Tabelle 3 dargestellt. Tabelle 3

  • Die Ergebnisse der durchgeführten biologischen Assays sowie der ELISA-Tests belegen, dass eine Immobilisierung der verwendeten TNF-Varianten an die Nanopartikel erfolgte. Die an dem erfindungsgemäßen Nanopartikel immobilisierten TNF-Moleküle weisen im Vergleich zum löslichen Protein eine veränderte, dem membranständigen TNF ähnliche Bioaktivität auf, wie aus den Fig. 2 und 3 ersichtlich. Die Tumorzelllinie Colo205 ist gegen den cytotoxischen Effekt von löslichem TNF weitgehend resistent, während die Stimulation des TNF-R2-Rezeptors mit membranständigem TNF, der sogenannten Pro-Form von TNF, ebenso wie mit immobilisiertem TNF zur Induktion von Apoptose führt.
    • Beispiel 4
  • TNF- und CysHisTNF-Interaktion mit TNF-Rezeptor 1 und TNF-Rezeptor 2
  • Die nachstehenden Affinitäts-Messungen erfolgten mittels Wellenleiterspektroskopie-Resonanz-Analysen unter Verwendung einer IAsys-Vorrichtung (Thermo- Labsystem Camebridge, Großbritannien). Dabei wurden modifizierte Tumornekrosefaktor-Rezeptoren 1 (TNFR1-Fc) oder Tumornekrosefaktor-Rezeptoren 2 (TNFR2-Fc) über α-Aminogruppen auf eine Carboxymethyldextran-Matrix (CMD-Matrix) immobilisiert. Danach wurden Bindungsstudien durchgeführt. Für die Bindung wurden unterschiedliche Konzentrationen von TNF beziehungsweise Cys-TNF an die Rezeptoren über die Zeit online verfolgt. Nach jeder Bindung erfolgte eine Regeneration, das heißt, der gebundene Ligand wurde von der immobilisierten Matrix abgewaschen. Eine Rezeptor-beladene Matrix stand dadurch für mindestens 10 Bindungen zur Verfügung. Aus den so erhaltenen Rohdaten konnten nun folgende Parameter ermittelt werden:
    • 1. Die Auftragung des Ausmaßes an Bindung von TNF beziehungsweis CysHisTNF (extent) gegen die eingesetzte Konzentration (ligate) resultiert in einer Bindungskurve, die im Sättigungsbereich die maximal mögliche Bindung beschreibt (Bmax).
    • 2. Durch die Auftragung des Quotienten aus dem Ausmaß der Bindung und der TNF beziehungsweise CysHisTNF-Konzentration (extent/ligate) gegen das Ausmaß der Bindung (extent) wird eine Geradengleichung erhalten, deren Steigung der negativen Affinitätskonstanten KD entspricht (Scatchard Plot).
    • 3. Die Auftragung der Assoziationsraten- Konstante (kon) gegen die TNF- beziehungsweise CysHisTNF-Konzentration ist eine weitere Methode, den KD-Wert zu bestimmen und dient zur Bestimmung des unter Punkt 2 ermittelten KD-Wertes. Außerdem entspricht der Schnittpunkt der Geraden mit der Y-Achse der Halbwertzeit t1/2 des Ligand-Rezeptor-Komplexes und ist somit ein Maß der Stabilität des TNF- beziehungsweise CysHisTNF-Rezeptor-Komplexes.
  • Diese drei Auftragsformen wurden für CysHisTNF an immobilisiertem TNFR1-Fc (Fig. 4), CysHisTNF an immobilisiertem TNFR2-Fc (Fig. 5), TNF an immobilisiertem TNFR2-Fc (Fig. 6) und TNF an immobilisiertem TNFR1-Fc (Fig. 7) gewählt. Es wurden mindestens jeweils zwei unabhängige Experimente durchgeführt. Wie in der Tabelle 4 zusammengefasst, zeigt sich, dass TNF und CysHisTNF mit einer ähnlichen Affinität an den modifizierten TNF-R1-Rezeptor binden (KD = 2-5 nM). Auch die Halbwertzeiten dieser Liganden mit TNFR1-Fc mit 8 bis 14 Minuten entsprechen einander. Letzteres ist auch der Fall für die Halbwertzeiten an TNFR2-Fc, die für TNF ca. 8 Minuten und für CysHisTNF ca. 3 Minuten betragen. Lediglich die Affinitätskonstanten von TNF und Cys-HisTNF an modifizierten TNFR2 sind für CysHisTNF ca. eine Größenordnung niedriger (KD = 10 nM für CysHisTNF und KD = 1 nM für TNF).
  • Diese Werte belegen die hochaffine und spezifische Bindung des CysHisTNF an beide bekannten Rezeptoren. Obwohl die Zahlenwerte mit Hilfe von oberflächengekoppelten Rezeptoren (TNFR1-Fc und TNFR2-Fc) erhalten wurden, die künstlich dimerisiert wurden, erlauben sie dennoch Rückschlüsse auf die Situation der Bindung an Rezeptoren einer Zelle, bei der durch den trimeren Liganden eine Trimerisierung der Rezeptoren erfolgt.
  • Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 zusammmengefasst. Tabelle 4

Claims (58)

1. Nanopartikel, umfassend einen Träger mit einer funktionelle Gruppen 1A aufweisenden Oberfläche und an dem Träger immobilisiertem Tumor-Nekrose- Faktor (TNF) mit die funktionellen Gruppen 1A bindenden komplementären funktionellen Gruppen 2A, wobei TNF in Form eines Trimers immobilisiert ist.
2. Nanopartikel nach Anspruch 1, wobei das TNF- Trimer durch kovalente Bindung zwischen den funktionellen Gruppen 1A und 2A gerichtet und unter Beibehaltung seiner biologischen Aktivität am Träger immobilisiert ist.
3. Nanopartikel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die funktionelle Gruppe 1A ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Aminogruppe, Carboxygruppe, Epoxygruppe, Maleinimidogruppe, Alkylketongruppe, Aldehydgruppe, Hydrazingruppe, Hydrazidgruppe, Thiolgruppe und Thioestergruppe.
4. Nanopartikel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die funktionelle Gruppe 1A bindende, komplementäre funktionelle Gruppe 2A ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Aminogruppe, Carboxygruppe, Epoxygruppe, Maleinimidogruppe, Alkylketongruppe, Aldehydgruppe, Hydrazingruppe, Hydrazidgruppe, Thiolgruppe und Thioestergruppe.
5. Nanopartikel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei TNF synthetisches, natürlicherweise vorkommendes oder rekombinant hergestelltes TNF-α oder TNF-β mit Wildtyp-Sequenz oder mit mutierter Sequenz ist.
6. Nanopartikel nach Anspruch 5, wobei TNF chemisch modifiziert vorliegt.
7. Nanopartikel nach Anspruch 5 oder 6, wobei TNF ein natürliches oder synthetisches Multimerisierungsmodul aufweist.
8. Nanopartikel nach Anspruch 7, wobei TNF das Tenascin C-Multimerisierungsmodul aufweist.
9. Nanopartikel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Oberfläche weitere funktionelle Gruppen 1B und TNF weitere die funktionellen Gruppen 1B bindende komplementäre funktionelle Gruppen 2B aufweist.
10. Nanopartikel nach Anspruch 9, wobei zwischen den funktionellen Gruppen 1B und 2B eine nichtkovalente Bindung vorliegt.
11. Nanopartikel nach Anspruch 9 oder 10, wobei die weitere funktionelle Gruppe 1B ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Oligohistidingruppe, Strep-Tag I, Strep-Tag II, Desthiobiotin, Biotin, Chitin, Chitinderivate, Chitinbindedomäne, Metallionenchelatkomplex, Streptavidin, Streptactin, Avidin und Neutravidin.
12. Nanopartikel nach einem der Ansprüche 9 bis 11, wobei die die funktionelle Gruppe 1B bindende, komplementäre funktionelle Gruppe 2B ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Oligohistidingruppe, Strep-Tag I, Strep-Tag II, Desthiobiotin, Biotin, Chitin, Chitinderivate, Chitinbindedomäne, Metallionenchelatkomplex, Streptavidin, Streptactin, Avidin und Neutravidin.
13. Nanopartikel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die funktionelle Gruppe 1A und/oder 1B über Spacer mit der Oberfläche des Nanopartikels verbunden oder Bestandteil eines Spacers ist/sind.
14. Nanopartikel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die funktionelle Gruppe 2A und/oder 2B über Spacer mit TNF verbunden oder Bestandteil eines Spacers ist/sind.
15. Nanopartikel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die funktionelle Gruppe 2A struktureller Bestandteil einer unnatürlichen Aminosäure von TNF ist, insbesondere einer mit einem Spacer derivatisierten Aminosäure.
16. Nanopartikel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die funktionelle TNF-Gruppe 2A und/oder 2B mit einer Ankergruppe des Trägers verbunden ist/sind.
17. Nanopartikel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Metallionenchelatkomplex ein zweiwertiges Kation als Metallkomponente enthält.
18. Nanopartikel nach Anspruch 17, wobei der Metallionenchelatkomplex ein Ni-NTA (Nickel- Nitrilotriessigsäure)-Derivat ist.
19. Nanopartikel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Träger aus einem biologisch verträglichen Material besteht.
20. Nanopartikel nach Anspruch 19, wobei der Träger ein anorganisches Material enthält oder aus diesem besteht.
21. Nanopartikel nach Anspruch 20, wobei das anorganische Trägermaterial Silicium, SiO2, SiO, ein Silikat, Al2O3, SiO2.Al2O3, ZrO2, Fe2O3, Ag2O, Zr2O3, Ta2O5, Zeolith, TiO2, Glas, Indiumzinnoxid, Hydroxylapatit, Au, Fe3O4, ZnS, CdSe oder ein Gemisch davon ist.
22. Nanopartikel nach Anspruch 19, wobei der Träger ein organisches biologisch nicht-abbaubares Material enthält oder aus diesem besteht.
23. Nanopartikel nach Anspruch 22, wobei das Trägermaterial ein Polymer ist, das durch radikalische Polymerisation erzeugt wird.
24. Nanopartikel nach Anspruch 22, wobei das Trägermaterial Polypropylen, Polystyrol, ein Polyacrylat oder ein Gemisch davon ist.
25. Nanopartikel nach Anspruch 19, wobei der Träger ein biologisch abbaubares Material enthält oder aus diesem besteht.
26. Nanopartikel nach Anspruch 25, wobei das Trägermaterial ein Polyester von Polymilchsäure, insbesondere Poly-(D,L-milchsäure-co-glykolsäure) ist.
27. Nanopartikel nach Anspruch 26, wobei der Polyester durch Quervernetzung zusätzlich stabilisiert ist.
28. Nanopartikel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Träger kompakt oder hohl ist und eine Größe von 5 nm bis 500 nm aufweist.
29. Nanopartikel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Träger zusätzliche Funktionalitäten aufweist.
30. Nanopartikel nach Anspruch 29, wobei der Träger eine Fluoreszenzmarkierung, eine UV/Vis-Markierung, eine superparamagnetische Funktion, eine ferromagnetische Funktion und/oder eine radioaktive Markierung aufweist.
31. Nanopartikel nach Anspruch 29 oder 30, wobei der Träger eine zur Therapie und/oder Diagnose geeignete chemische Verbindung aufweist.
32. Nanopartikel nach Anspruch 31, wobei die chemische Verbindung ein Cytostatikum ist.
33. Nanopartikel nach einem der Ansprüche 29 bis 32, wobei der Träger eine chemische Verbindung aufweist, die zur sterischen Stabilisierung und/oder zur Verhinderung einer Konformationsänderung von immobilisiertem TNF und/oder zur Verhinderung der Anlagerung einer weiteren biologisch aktiven Verbindung an den Träger dient.
34. Nanopartikel nach Anspruch 33, wobei die chemische Verbindung ein Polyethylenglykol, ein Oligoethylenglykol, Dextran oder ein Gemisch davon ist.
35. Nanopartikel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das immobilisierte TNF einen Marker aufweist.
36. Nanopartikel nach Anspruch 35, wobei der Marker ein Fluorophor, ein Spin-Label, eine radioaktive Markierung und/oder ein Goldpartikel ist, insbesondere angebracht an Aminosäuren von TNF, vorzugsweise an dessen Seitenketten.
37. Nanopartikel nach Anspruch 36, wobei das Fluorophor N-Methyl-Aza-Tryptophan oder ein Coumarin- Derivat wie DCA (6,7-Dimethoxy-4-Coumaryl) oder NBD (N-β-7-nitro-benzofurazan-L-N-diaminopropionsäure) ist.
38. Nanopartikel nach Anspruch 36, wobei das Fluorophor CyDye oder Alexa ist.
39. Verfahren zur gerichteten Immobilisierung von TNF an einem Nanopartikel unter Beibehaltung seiner biologischen Aktivität, wobei die Oberfläche eines anorganischen oder organischen partikulären Trägers durch Aufbringen von funktionellen Gruppen 1A modifiziert und komplementäre funktionelle Gruppen 2A aufweisende modifizierte TNF-Moleküle mit dieser Oberfläche derart in Kontakt gebracht werden, dass eine kovalente Bindung zwischen den funktionellen Gruppen 1A und 2A dergestalt stattfindet, dass TNF gerichtet und unter Beibehaltung seiner biologischen Aktivität an das Nanopartikel bindet.
40. Verfahren nach Anspruch 39, wobei die funktionellen Gruppen 1A und 2A ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Aminogruppe, Carboxygruppe, Epoxygruppe, Maleinimidogruppe, Alkylketongruppe, Aldehydgruppe, Hydrazingruppe, Hydrazidgruppe, Thiolgruppe und Thioestergruppe.
41. Verfahren nach Anspruch 39 oder 40, wobei TNF als Trimer immobilisiert wird.
42. Verfahren nach Anspruch 41, wobei die Bildung des TNF-Trimers spontan erfolgt.
43. Verfahren nach Anspruch 41, wobei die Bildung des TNF-Trimers durch ein im TNF-Molekül enthaltenes Multimerisierungsmodul bewirkt wird.
44. Verfahren nach Aäspruch 43, wobei das TNF- Molekül das Tenascin-C-Multimerisierungsmodul enthält.
45. Verfahren nach einem der Ansprüche 39 bis 44, wobei die Oberfläche des Trägers durch Aufbringen weiterer funktionellen Gruppen 1B modifiziert wird und die TNF-Moleküle weitere komplementäre funktionelle Gruppen 1B aufweisen, so dass bei Inkontaktbringen der TNF-Moleküle mit der Oberfläche eine nicht-kovalente Bindung zwischen den funktionellen Gruppen 1B und 2B stattfindet.
46. Verfahren nach Anspruch 45, wobei die funktionellen Gruppen 1B und 2B ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Oligohistidingruppe, Strep-Tag I, Strep-Tag II, Desthiobiotin, Biotin, Chitin, Chitinderivate, Chitinbindedomäne, Metallionenchelatkomplex, Streptavidin, Streptactin, Avidin und Neutravidin.
47. Verfahren nach einem der Ansprüche 39 bis 46, wobei die funktionellen Gruppen 1A, 1B, 2A und/oder 2B unter Verwendung eines Spacers mit dem Träger und/oder TNF-Molekül verbunden werden oder Bestandteil des Spacers sind.
48. Verfahren nach einem der Ansprüche 39 bis 47, wobei die Modifizierung der Oberfläche mittels Propfpolymerisation, Silanisierung oder chemischer Derivatisierung erfolgt.
49. Verfahren nach einem der Ansprüche 39 bis 48, wobei die Bedingungen, unter den die Proteine mit den Oberflächen in Kontakt gebracht werden, so ausgewählt werden, dass ein Abbau von TNF minimiert oder verhindert wird.
50. Verfahren nach einem der Ansprüche 39 bis 49, wobei zusätzliche chemische Verbindungen zur sterischen Stabilisierung und/oder zur Verhinderung einer Konformationsänderung des immobilisierten TNF und/oder zur Verhinderung der Anlagerung einer weiteren biologisch aktiven Verbindung und/oder mit biologischer Aktivität auf die Oberfläche aufgebracht werden.
51. Verfahren nach einem der Ansprüche 39 bis 50, wobei die Nanopartikel nach TNF-Immobilisierung unter Verwendung eines Stealth-Verfahrens maskiert werden, um eine ausreichende Biozirkulation zu erreichen.
52. Verfahren nach Anspruch 51, wobei die Nanopartikel in Liposomen verpackt werden.
53. Verfahren zur Identifizierung und/oder Detektion einer eine Interaktion zwischen immobilisierten TNF und dessen Rezeptoren modifizierenden, insbesondere fördernden oder hemmenden Substanz, wobei an einem Nanopartikel nach einem der Ansprüche 1 bis 38 immobilisierter TNF zusammen mit seinen Rezeptoren in Gegenwart oder Abwesenheit der zu testenden Substanz inkubiert und eine Auswirkung der Substanz auf die Interaktion zwischen immobilisiertem TNF und dessen Rezeptoren nachgewiesen wird.
54. Verwendung eines Nanopartikels nach einem der Ansprüche 1 bis 38 zur Identifizierung und/oder Isolierung eines Bindungspartners von immobilisiertem TNF.
55. Verwendung eines Nanopartikels nach einem der Ansprüche 1 bis 38 zur Identifizierung und/oder Isolierung von Hemmstoffen der Interaktion von immobilisiertem TNF mit seinen Bindungspartnern.
56. Verwendung eines Nanopartikels nach einem der Ansprüche 1 bis 38 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Therapie von Tumoren, entzündlichen Erkrankungen oder Erkrankungen des Immunsystems, zur Wundheilung oder zur Modifikation angiogenetischer Prozesse.
57. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Nanopartikel nach einem der Ansprüche 1 bis 38.
58. Diagnostische Zusammensetzung, umfassend ein Nanopartikel nach einem der Ansprüche 1 bis 38.
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