DD211444A3

DD211444A3 - PROCESS FOR THE PRODUCTION OF INFLUENZA VACCINES

Info

Publication number: DD211444A3
Application number: DD24262182A
Authority: DD
Inventors: Horst Glathe; Johannes Malur; Martina Kunze; Gebhard Klenz; Norbert Hehme; Konrad Hahn; Adolf-Friedrich Olechnowitz; Wolf-Dietrich Engel; Christoph Pescheck
Original assignee: Saechsisches Serumwerk
Priority date: 1982-08-19
Filing date: 1982-08-19
Publication date: 1984-07-11

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung der immunogenen Bestandteile des Influenzavirus und dessen Verwendung zur Herstellung von Influenzaimpfstoffen,die aufgrund ihres Reinheitsgrades zur Anwendung sowohl bei Erwachsenen als auch bei Kindern geeignet sind. Das Ziel der Erfindung ist ein im industriellen Massstab einsetzbares Verfahren zur Gewinnung eines inaktivierten Influenzaimpfstoffes, der im wesentlichen nur die immunologisch bedeutsamen Oberflaechenantigene Haemagglutinin und Neuraminidase enthaelt und der durch seine lokale und allgemeine Vertraeglichkeit eine Anwendung in allen Altersgruppen gestattet. Das Wesen der Erfindung ist die Spaltung des nicht inaktivierten und in einem Medium geringer Ionenstaerke suspendierten Influenzavirus in einem Zonalrotor,der mit einem Rohrzuckergradienten beladen ist und der gleichzeitig einen Gradienten eines geeigneten Salzes der Desoxycholsaeure enthaelt. Die Oberflaechenantigene werden aufgrund ihres spezifischen Sedimentationsverhaltens sowohl vom Restvirus als auch von den Lipiden der Virushuelle getrennt und nach der weitgehenden Entfernung des Salzes der Desoxycholsaeure sowie des aus dem Gradienten stammenden Rohrzuckers nach abschliessender Sterilfiltration zu einem Impfstoff weiterverarbeitet.The invention relates to a method for obtaining the immunogenic components of influenza virus and its use for the production of influenza vaccines, which are suitable for use in both adults and children due to their degree of purity. The object of the invention is an industrially applicable method for obtaining an inactivated influenza vaccine which contains substantially only the immunologically important surface antigens haemagglutinin and neuraminidase and which, by its local and general compatibility, allows its use in all age groups. The essence of the invention is the cleavage of the non-inactivated influenza virus suspended in a medium of low ionic strength in a Zonal rotor loaded with a cane sugar gradient and simultaneously containing a gradient of a suitable salt of deoxycholic acid. Owing to their specific sedimentation behavior, the surface antigens are separated from the residual virus as well as from the lipids of the virus hive and, after the substantial removal of the salt of the deoxycholic acid and of the cane sugar resulting from the gradient, after a final sterile filtration to a vaccine.

Description

Title of the invention

Verfahren zur. Herstellung von Influenza-ImpfstoffenProcedure for. Production of influenza vaccines

Application of the invention

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung der immunogenen Bestandteile des Influenzavirus und deren Verwendung zur Herstellung von Influenzaimpfstoffen, die aufgrund ihres Reinheitsgrades zur Anwendung sowohl bei Erwachsenen, als auch bei Kindern geeignet sind.The invention relates to a method for obtaining the immunogenic components of the influenza virus and their use for the production of influenza vaccines, which are suitable for use in both adults and children due to their purity.

Characteristic of the known technical solutions

Bei den bekannten Verfahren zur Herstellung von Influenzaimpfstoff en wird der Erreger der Influenza (Myxovirus influenzae) in der Allantoishö'hle embryonierter Hühnereier zur Vermehrung gebracht.In the known methods for the production of influenza vaccines, the pathogen of influenza (Myxovirus influenzae) is propagated in the allantoic cavity of embryonated chicken eggs.

Dabei werden solche Stämme des Influenzavirus verwendet, die mit den in der Bevölkerung zirkulierenden Varianten eine möglichst enge Beziehung aufweisen. T-Tach einer durch Erfahrung festgelegten Vermehrungsdauer werden die virushaltigen Allantoisflüssigkeiten den embryonierten Eiern entnommen und durch niedertourige Zentrifugation (max. 10' g) von den in ihnen befindlichen zellulären Bestandteilen befreit. Danach wird das Influenzavirus üblicherweise durch Einwirkung von Betapropiolacton oder Formaldehyd in eine nicht mehr vermehrungsfähige Form überführt.In this case, such strains of the influenza virus are used, which have the closest possible relationship with the circulating in the population variants. T-tach of a period of time determined by experience, the virus-containing allantoic fluids are removed from the embryonated eggs and freed from the cellular components contained in them by low-speed centrifugation (max 10 g). Thereafter, the influenza virus is usually converted by the action of Betapropiolacton or formaldehyde in a no longer replicable form.

Das nunmehr in inaktiver Form vorliegende Influenzavirus wird mit physikalischen Verfahren, vorzugsweise mittels Ultrazentrifugation, konzentriert.The influenza virus, now in inactive form, is concentrated by physical means, preferably by ultracentrifugation.

Die Mehrzahl der bekannten Verfahren basiert auf der Zonalzentrifugation im Rohrzuckergradienten unter Verwendung von Rotoren, die einen Betrieb mit kontinuierlichem Durchfluß des zu verarbeitenden Materials gestatten. Dabei wird das Influenzavirus entsprechend seinem spezifischen Sedimentationsverhalten in einem bestimmten Bereich des Gradienten konzentriert und gleichseitig weitgehend von den aus dem Hühnerei stammenden Proteinen getrennt. Das auf diese Weise gereinigte und konzentrierte Virusmaterial kann nunmehr nach Einstellung der Viruskonzentration auf den zur Gewährleistung der Wirksamkeit erforderlichen Mindestwert, dem Zusatz konservierender Substanzen (z. B. Thiomersal) und einer abschließenden Sterilfiltration, direkt zu einem Influenzaimpfstoff verarbeitet werden. Impfstoffe dieser Art, sogenannte Vollvirusimpfstoffe, können, besonders bei Kindern, sowohl örtliche, als auch allgemeine Unverträglichkeitserscheinungen auslösen. Als Ursache derselben wurden bestimmte lipidhaltige Substanzen der äußeren Virushülle erkannt.The majority of the known methods are based on zonal centrifugation in cane sugar gradients using rotors which allow continuous flow operation of the material to be processed. In this case, the influenza virus is concentrated according to its specific sedimentation behavior in a certain region of the gradient and, on the same side, largely separated from the proteins derived from the chicken egg. The virus material purified and concentrated in this way can now be processed directly into an influenza vaccine after the virus concentration has been adjusted to the minimum value required to ensure efficacy, the addition of preserving substances (eg thiomersal) and a final sterile filtration. Vaccines of this type, so-called full virus vaccines, can cause both local and general intolerance symptoms, especially in children. As a cause of certain lipid-containing substances of the outer virus envelope were recognized.

Die bekannten und beschriebenen Verfahren zur Herstellung von Influenzaimpfstoffen, die diese Nachteile nicht aufweisen, beruhen auf der Erkenntnis, daß die für die Auslösung einer Immunantwort verantwortlichen Komponenten des Influenzavirus mit den an der Oberfläche der Viruspartikel in Form von Stäbchen (sog. "Spikes") lokalisierten Glykoproteinen Hämagglutinin (HA) und Eeuraminidase (HA) identisch s ind.The known and described methods for producing influenza vaccines which do not have these disadvantages are based on the finding that the components of the influenza virus responsible for triggering an immune response are in the form of rods (so-called "spikes") on the surface of the virus particles. localized glycoproteins hemagglutinin (HA) and eeuraminidase (HA) identically s ind.

Diese Glykoproteine sind beim intakten Virus durch hydrophobe Endstücke mit' der äußeren lipidhaltigen Membran fest verbunden. Dagegen besitzen die Proteine des Influenzavirus, die sich im Innern der Viruspartikel befinden, für die Auslösung der Immunantwort keine Bedeutung.These glycoproteins are tightly bound to the intact virus by hydrophobic tails with the outer lipid-containing membrane. In contrast, the proteins of the influenza virus, which are located in the interior of the virus particles, have no significance for triggering the immune response.

Das betrifft das mit der Ribonukleinsäure assoziierte Eukleoprotein (NP), das BÄatrixprotein. (M) und die Proteine P1, P2 und P3 des Polymerasekomplexes.This concerns the ribonucleic acid-associated Eucleoprotein (NP), the BÄatrixprotein. (M) and the proteins P1, P2 and P3 of the polymerase complex.

Die bekannten und beschriebenen Methoden zur Gewinnung der Glykoproteine HA und HA zum Zwecke der Impfstoffherstellung bzw. zur Abtrennung der für die Mehrzahl der Nebenreaktionen verantwortlichen Lipide, gehen entweder davon aus, durch die Einwirkung oberflächenaktiver Substanzen das HA und IA unter Erhaltung ihrer Integrität aus der Lipidhü'lle herauszulösen, oder das/gesamte Virus mittels eines Lipidlösungsmittels (z.B. Diaethylaether oder Tri-n-butylphosphat) bzw. einer Kombination eines Lipidlösungsmittels und einer oberflächenaktiven Substanz (z.B. Tween 80) zu spalten. Bei dem zuletzt genannten "Verfahren wird nach der Spaltung durch die Gewinnung der wäßrigen Phase eine Impfstoffpräparation erhalten, die außer den Lipiden der Virushülle alle Virusbestandteile' enthält.The known and described methods for obtaining the glycoproteins HA and HA for the purpose of vaccine production or for separating the responsible for the majority of side reactions lipids, either assume, by the action of surfactants, the HA and IA while maintaining their integrity from the Lipidhü To dissolve out or to cleave the / entire virus by means of a lipid solvent (eg, diethyl ether or tri-n-butyl phosphate) or a combination of a lipid solvent and a surfactant (eg Tween 80). In the latter "method is obtained after the cleavage by the recovery of the aqueous phase, a vaccine preparation containing all virus components except the lipids of the virus envelope.

Dagegen können nach Anwendung von oberflächenaktiven Substanzen die aus der Lipidhülle herausgelösten Spikes vom Restvirus, z.B. durch Ultrazentrifugation, getrennt werden. Angewendet werden anionische (z.B. Salze der Desoxycliolsäure), kationische (z.B. Cetyltrimethylammoniumbromid) und neutrale (z.B. Triton Ii 101) oberflächenaktive Substanzen. Verbindungen der Desoxycholsäure werden in Australien zur Herstellung von Influenzaimpfstoffen.mit hohem Reinheitsgrad und guten immunogenen Eigenschäften angewendet. Bei bekannten Verfahren zur Herstellung von Influenza-Spaltimpfstoffen auf der Grundlage der Behandlung mit Salzen der Desoxycholsäure (W.G. Laver, R.G. Webster,.Virology 69(1976), 511-522; DE OS 1 617 238 vom 18.02.1971) ist das Problem der Abtrennung der Lipide von den zu isolierenden Oberflächenantigenen nur. ungenügend gelost. Die angegebenen Ultrazentrifugationstechniken zur Isolierung des Hämagglutinins und der ITeuraminidase von den übrigen Viruskomponenten über Saccharosegradienten erweisen sich als zeitaufwendig und in der Kapazität begrenzt. Ein Arbeiten im geschlossenen System ist nicht möglich.In contrast, after application of surfactants, the spikes released from the lipid envelope may be affected by the residual virus, e.g. by ultracentrifugation. Anionic (e.g., salts of deoxyclic acid), cationic (e.g., cetyltrimethylammonium bromide), and neutral (e.g., Triton Ii 101) surfactants are employed. Compounds of deoxycholic acid are used in Australia for the production of influenza vaccines with high purity and good immunogenic properties. In known processes for the preparation of influenza split vaccines based on the treatment with salts of deoxycholic acid (WG Laver, RG Webster, Virology 69 (1976), 511-522, DE OS 1 617 238 of 18.02.1971) the problem is the Separation of the lipids from the surface antigens to be isolated only. insufficiently solved. The specified ultracentrifugation techniques for isolating the hemagglutinin and ITuraminidase from the remaining virus components via sucrose gradients are time consuming and limited in capacity. Working in a closed system is not possible.

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Die Lipidentfernung durch Adsorption der immunogen wirksamen Komponenten HA und NA an anorganischen Aluminiumverbindungen (DD PS 146 386 vom 11.02.1981) schließt eine Sterilfiltration der Präparate aus. Durch eine Spaltung in kontinuierlich beschickten Dichtegradienten bei Verwendung von Durchflußzonalrotoren sind diese Nachteile zu umgehen. Bei den bisher beschriebenen Verfahren (DE OS 2 449 530 vom 30.04.1975) werden zur Spaltung inaktivierte Virusantigene und homogene Tensidkonzentrationen im Gradienten benutzt. Die Spaltung führt unter diesen Bedingungen nur zu vergleichsweise niedrigen Ausbeuten an HA und NA.The lipid removal by adsorption of the immunogenic components HA and NA to inorganic aluminum compounds (DD PS 146 386 from 11.02.1981) excludes a sterile filtration of the preparations. By splitting in continuously charged density gradients using Durchflußzonalrotoren these disadvantages are to be avoided. In the methods described so far (DE OS 2 449 530 of Apr. 30, 1975) virus antigens inactivated for cleavage and homogeneous surfactant concentrations in the gradient are used. The cleavage leads under these conditions only to comparatively low yields of HA and NA.

Object of the invention

Ziel der Erfindung ist ein im industriellen Maßstab einsetzbares Verfahren zur Gewinnung eines inaktivierten Influenzaimpfstoffes, der im wesentlichen nur die immunologisch bedeutsamen Oberflächenantigene Hämagglutinin und Neuraminidase enthält und der durch seine lokale und allgemeine Verträglichkeit eine Anwendung in allen Altersgruppen gestattet.The aim of the invention is an industrially applicable method for obtaining an inactivated influenza vaccine containing essentially only the immunologically important surface antigens hemagglutinin and neuraminidase and which permits its use in all age groups due to its local and general tolerability.

Essence of the invention

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Erreichung des genannten Zieles so zu entwickeln, daß eine Produktion im geschlossenen System, insbesondere eine Sterilfiltration des Finalbulks, möglich ist, die für die Auslösung von Uebenreaktionen verantwortlichen Lipide entfernt werden und die Konzentration der zur Spaltung verwendeten oberflächenaktiven Substanzen auf einfache Weise auf nichttoxische Werte'reduziert wird. Erfindungsgemäß wurde gefunden, daß nach Einleiten einer konzentrierten und gereinigten Suspension des nicht inaktivierten Influenzavirus in einem Medium geringer Ionenstärke (z.B. ein 10-15 mM Phosphatpuffer, pH 7,2 bis pH 8) in einem Zonairοtor, der mit einem Rohrzuckergradienten beladen ist und der gleichzeitig einen geeigneten Gradienten eines Salzes der Desoxycholsäure enthält, eine Spaltung der Viruspartikel erfolgt und die Lipide der Hülle, die Oberflächenantigene und das Restvirus entsprechende Banden bilden.The invention has for its object to develop a method for achieving the above objective so that a production in a closed system, in particular a sterile filtration of the Finalbulks is possible, the responsible for the initiation of Uebenreaktionen lipids are removed and the concentration of the cleavage used surface-active substances in a simple manner to non-toxic levels'reduced. According to the invention, it has been found that, after introducing a concentrated and purified suspension of the non-inactivated influenza virus in a medium of low ionic strength (eg a 10-15 mM phosphate buffer, pH 7.2 to pH 8) in a ZonairOtor, which is loaded with a cane sugar gradient and the simultaneously containing a suitable gradient of a salt of deoxycholic acid, cleaving the virus particles, and forming the lipids of the envelope, the surface antigens and the residual virus corresponding bands.

Danach können die Fraktionen, welche die .Oberflächenantigene enthalten, gesammelt werden.Thereafter, the fractions containing the surface antigens can be collected.

Die Lipide der Hülle, die bei den erforderlichen hohen . Tensidkonzentrationen weitgehend von den Viruscores abgelöst werden, bilden eine relativ eng begrenzte Zone im geringer konzentrierten Gradientenbereich und unterliegen der Flotation, wobei auch ein Teil des Tensids dem Gradienten entzogen wird.The lipids of the sheath that are required at the high. Surfactant concentrations are largely detached from the virus cores, form a relatively narrow-defined zone in the low-concentration gradient region and are subject to flotation, with some of the surfactant is removed from the gradient.

Um ein Absinken der Desoxycholat-Konzentration zu verhindern, wird der Tensidgradient so gestaltet, daß bei den höchsten Rohrzuckerkonzentrationen (etwa 50 - 60 % w/w) die Tensidkonzentration auf das 1,2 bis 1,5fache des in der Spaltungszone (ca. 20 bis 40 % w/w) vorhandenen Tensids gesteigert wird.In order to prevent a decrease in the deoxycholate concentration, the surfactant gradient is designed so that at the highest cane sugar concentrations (about 50-60 % w / w), the surfactant concentration to 1.2 to 1.5 times that in the cleavage zone (about 20 up to 40 % w / w) of existing surfactant is increased.

Ferner wurde gefunden, daß eine Gelbildung im Gradienten,-hervorgerufen durch Salze der Desoxycholsäure, vermieden werden kann, wenn der Spaltprozeß im Bereich niedriger Ionenstärke verläuft, lach erfolgter Spaltung kann das Salz der Desoxycholsäure entweder durch Erhöhung der Ionenstärke zur Ausflockung gebracht werden, oder es kann durch Ultrafiltration weitgehend entfernt werden. Die Entfernung des Rohrzuckers, erfolgt durch Ultrafiltration gleichzeitig mit der Entfernung des überschüssigen Flockungsmittels des Desoxycholats bzw. mit der Entfernung des Desoxycholats. Zur Vermeidung von Verlusten an Antigen werden der Lösung mit der Entfernung des Rohrzuckers und des Desoxycholats Stabilisatoren zugesetzt. Das gesamte erfindungsmäßige Verfahren kann im geschlossenen System geführt werden, so daß die Gefahren sekundärer Verunreinigungen weitgehend ausgeschlossen werden.Further, it has been found that gel formation in the gradient, caused by salts of deoxycholic acid, can be avoided when the cleavage process is in the low ionic strength region; after cleavage, the salt of the deoxycholic acid can be flocculated either by increasing the ionic strength or can be largely removed by ultrafiltration. The removal of the cane sugar is carried out by ultrafiltration simultaneously with the removal of the excess flocculant of the deoxycholate or with the removal of the deoxycholate. To avoid losses of antigen, stabilizers are added to the solution with the removal of cane sugar and deoxycholate. The entire process according to the invention can be carried out in a closed system, so that the dangers of secondary impurities are largely excluded.

Embodiment 1

Als Ausgangsmaterial für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet man^NInfluenzavirus, das nach Vermehrung in der Allantoishöhle embryonierter Hühnereier, durch eines der üblichen Verfahren, vorzugsweise durch ültrazentrifugation im Rohrzuckergradienten (9 2: 1Cr g), konzentriert und von begleitenden Proteinen weitgehend befreit wurde. Aus dem in einer 38 - 45 %igen Konzentration von Rohrzucker vorliegenden Viruskonzentrat wird durch Verdünnung mit 10 mM Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7.2 eine Virussuspension hergestellt, deren Rohrzuckerkonzentration ca. 2 % beträgt. Diese Virussuspension wird in einen Zonalrotor einer Zentrifuge eingeführt, der zum kontinuierlichen Betrieb geeignet ist (z.B. der CF 32-Rotor der Pa. Beckman). Dieser Rotor ist mit einem Rohrzuckergradienten, der gleichzeitig einen Uatriumdesoxycholatgra- „ dienten in einer Konzentration von 0,5 bis 2 % w/w enthält, beladen.The starting material used for the method according to the invention is ^N influenza virus, which after multiplication in embryonic chicken eggs is concentrated by one of the customary methods, preferably by ultraviolet centrifugation in cane sugar (9: 2Cr g), and largely freed from accompanying proteins. From the virus concentrate present in a 38-45% concentration of cane sugar, a virus suspension is prepared by dilution with 10 mM phosphate buffer with a pH of 7.2, the cane sugar concentration is about 2%. This virus suspension is introduced into a Zonalrotor a centrifuge, which is suitable for continuous operation (eg, the CF 32 rotor Pa. Beckman). This rotor is loaded with a cane sugar gradient which simultaneously contains a sodium deoxycholate gradient in a concentration of 0.5 to 2% w / w.

Zur Herstellung des Gradienten wird wiederum ausschließlich der oben beschriebene Phosphatpuffer verwendet. Die beschriebene Virussuspension wird nunmehr mittels einer Peristaltikpumpe über den Gradienten gepumpt. Nach Beendigung der Zonalzentrifugation wird der Inhalt des Rotors in Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen, welche die Oberflächenantigene enthalten, werden zur weiteren Verwendung aufbewahrt.For the preparation of the gradient again only the phosphate buffer described above is used. The described virus suspension is now pumped over the gradient by means of a peristaltic pump. After completion of Zonalzentrifugation the contents of the rotor is collected in fractions. The fractions containing the surface antigens are stored for further use.

Zur Verarbeitung zu einem Impfstoff werden die Fraktionen, welche die Oberflächenantigene enthalten, vereinigt. Ss wird nunmehr eine Bestimmung des HA-Gehaltes mit einem der bekannten Verfahren, z.B. der einfachen Radialdiffusion, durchgeführt.For processing into a vaccine, the fractions containing the surface antigens are pooled. Now, a determination of the HA content by one of the known methods, e.g. the simple radial diffusion, performed.

Auf der Grundlage dieser Bestimmung wird mit phosphatgepufferter isotonischer Hatriumchloridlösung so verdünnt, daß eine HA-Konzentration von mindestens 100Vug pro 1,00 ml entsteht. Danach erfolgt eine Diafiltration, unter Verwendung einer phosphatgepufferten isotonischen Uatriumchloridlösung als Dialysierflüssigkeit.Based on this determination, dilute with phosphate-buffered isotonic sodium chloride solution to give an HA concentration of at least 100Vug per 1.00 ml. This is followed by diafiltration using a phosphate buffered isotonic sodium chloride solution as the dialysis fluid.

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Nach der Diafiltration wird, wiederum nach. Bestimmung des HA-Gehaltes, mit phosphatgepufferter Stabilisatorlösung so verdünnt, daß eine HA-Konzentration von mindestens 30/Ug pro 1,00 ml entsteht. .After diafiltration, turn after. Determination of the HA content, diluted with phosphate-buffered stabilizer solution so that an HA concentration of at least 30 / ug per 1.00 ml is formed. ,

Die Konzentrationen an Thiomersal und Formaldehyd dürfen 0,1 g pro 1000,0 ml nicht übersteigen. Die auf diese Weise hergestellte Präparation ist mit dem monovalenten Bulk identisch.The concentrations of thiomersal and formaldehyde must not exceed 0.1 g per 1000.0 ml. The preparation prepared in this way is identical to the monovalent bulk.

Embodiment 2:

Die Gewinnung der Oberflächenantigenfraktionen verläuft analog wie im Beispiel 1 beschrieben. Den gepoolten Fraktionen wird soviel einer gesättigten Natriumchloridlösung zugesetzt, daß eine xlaCl-Konzentration von 1 - 2 molar resultiert. Dadurch wird das Natriumdesoxycholat zur Ausflockung gebracht, lach etwa 12-stündiger Aufbewahrung bei + 5°C wird das Präzipitat mit physikalischen Methoden (Filtration oder niedertourige Zentrifugation) entfernt, wobei die Oberflächenantigene im Überstand verbleiben. Dieser wird einer Diafiltration mit einem Puffer geringer Ionenstärke als Dialysierflüssigkeit unterzogen. Der Prozeß.wird solange fortgesetzt, bis die erreichte .STatriumchloridkonzentration einer isotonischen Lösung entspricht und die Rohrzuckerkonzentration den für den Impfstoff festgelegten Grenzwert nicht übersteigt. Nach Zugabe des Stabilisators und Verdünnung auf die vorgesehene HA-Konzentration entspricht die Präparation ebenfalls dem monovalenten Bulk,The recovery of the surface antigen fractions proceeds analogously as described in Example 1. The pooled fractions are added to a saturated sodium chloride solution so much that an xlaCl concentration of 1 to 2 molar results. This causes the sodium deoxycholate to flocculate, and after about 12 hours of storage at + 5 ° C, the precipitate is removed by physical means (filtration or low-speed centrifugation) leaving the surface antigens in the supernatant. This is subjected to diafiltration with a buffer of low ionic strength as dialysis fluid. The process is continued until the achieved concentration of statrium chloride corresponds to an isotonic solution and the cane sugar concentration does not exceed the limit set for the vaccine. After addition of the stabilizer and dilution to the intended HA concentration, the preparation also corresponds to the monovalent bulk,

Claims

claims:

1. A process for the preparation of an influenza splitting vaccine containing substantially only the surface antigens of the influenza virus, by cleavage with a salt of deoxycholic acid, characterized in that the non-inactivated virus particles pre-purified by known methods, suspended in a buffer with a '' Ionic strength below 15 mM, preferably phosphate buffer 10 to 15 mM and a pH in the range of 7.2 to 8.0, in the Zonalrotor an ultracentrifuge, with a density gradient, consisting of cane sugar solution and a gradient of .ämmmonium- or Aj & ali-Desozycholat in a buffer with an ionic strength below 15 mM, preferably phosphate buffer 10 to 15 mM and a pH in the range of 7 x 2 to 8.0, are split into fractions, whereupon the fraction containing the surface antigens is isolated in a manner known per se is worked up.

2. The method according to item 1, characterized in that the concentration of the salts used for the cleavage of deoxychloric acid 0.5 to 2%, preferably 1%, based on the desoxycholate contained in the gradient.

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3. The method according to points 1 and 2, characterized in that the surfactant concentration in the range of cane sugar concentration of 50 to 60 % w / w to 1.5 times higher than in the range of cane sugar concentration of about 20 to 40 % w / w.

4. The method according to any one of the preceding points, characterized in that the salt used for virus cleavage of Desoxycho! Acid is made by increasing the ionic strength to flocculate and then removed.

5 * Method according to item 4 », characterized in that sodium chloride is used to flocculate the salt of deoxycholic acid.

6. The method according to item 5, characterized in that the concentration of sodium chloride necessary for the precipitation of the deoxycholic salt is brought to the isotonic value by dialysis against phosphate-buffered sodium chloride solution or by dilution.

7. The method according to the items 1-6, characterized in that are added with increasing removal of deoxycholate and cane sugar stabilizers for the prevention of antigen losses.