CZ20013709A3

CZ20013709A3 - Analog interleukinu 5, fragment nukleové kyseliny, vektor, buňka, přípravky a pouľití

Info

Publication number: CZ20013709A3
Application number: CZ20013709A
Authority: CZ
Inventors: Steen Klysner
Original assignee: Pharmexa A/S
Priority date: 1999-04-23
Filing date: 2000-04-19
Publication date: 2002-11-13
Also published as: EA200101125A1; TR200103046T2; MXPA01010625A; AU4100800A; NO20015021D0; KR20020084841A; US7285273B1; HUP0200958A2; IL145786A0; JP2002543098A; NO20015021L; EP1173573A1; CN1355846A; WO2000065058A1; HUP0200958A3; CA2370391A1; AU777952B2; HRP20010824A2; EE200100552A; US6746669B1

Description

Analog interleukinu 5 (IL5), který pochází z IL5 polypeptidu zvířete, do kterého je zavedena modifikace, která má za následek, že imunizace zvířete analogem indukuje produkci protilátek proti IL5 polypeptidu a kde se modifikace týká substituce aúnebo inzerce a/nebo delece aminokyseliny kterékoliv z kliček 1 až 3 nebo C-konce helixu D IL5, kde uvedené kličky a helix D odpovídají těm, které jsou znázorněny na obr. 3 pro lidský a myší IL5. Řešení je využitelné pro zlepšení léčby a prevence chorobných stavů charakterizovaných zvýšenou hladinou eosinofilních leukocytů, tj. chorobných stavů jako je astma a další chronická alergická onemocnění. Je poskytnut způsob downregulace interleukinu 5 (IL5) umožněním produkce protilátek proti 115, a tím snížení stupně aktivity eosinoftlů. řešení také poskytuje způsoby výroby modifikovaného IL5, modifikovaný IL5, fragmenty nukleové kyseliny kódující modifikovaný IL5, vektory obsahující tyto fragmenty a jimi transformované hostitelské buňky a buněčné linie, způsob identifikace IL5 analogů, přípravky obsahující modifikovaný IL5 nebo nukleové kyseliny kódující IL5 analogy.

··

4 · 4 · · · ··

444 4 · · · · ·

Analog interleukinu 5, fragment buňka, přípravky a použití

....... Ww-M

Gfe>

nukleové kyseliny, vektor,

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká zlepšení terapie a prevence chorobných .stavů charakterizovaných zvýšenou hladinou eosinofilních leukocytů, tj . chorobných stavů, jako je například astma a další chronická alergická onemocněni. Konkrétněji předkládaný vynález poskytuje způsob snižování počtu receptorů (down-regulace) interleukinu 5 (IL5) umožněním produkce protilátek proti IL5, a tím snížení stupně aktivity eosinofilů. Vynález také poskytuje způsoby výroby modifikovaného IL5 použitelného v tomto způsobu, a také samotného modifikovaného IL5. Předkládaný vynález se také týká fragmentů ngkleové kyseliny kódující modifikovaný IL5, vektorů obsahujících tyto fragmenty nukleové kyseliny a hostitelských buněk a buněčných linii jimi transformovaných. Vynález také poskytuje způsob identifikace IL5 analogů, které jsou použitelné ve způsobu podle vynálezu, a dále přípravky obsahující modifikovaný IL5 nebo obsahující nukleové kyseliny kódující analogy IL5.

Dosavadní stav techniky

Astma je běžná nemoc dýchacích cest, postihující přibližně 10% populace. Současná léčba je primárně založena na podávání steroidů a představuje cenu na trhu přesahující dobře miliardu dolarů. Zatím z neznámých důvodů se v průběhu posledních dvou dekád na celém světě zvýšila incidence a morbidita astmatiků. V současnosti poskytuje zlepšené

porozumění imunologickým mechanismům zapojeným do astmatických stavů spojené s bouřlivým rozvojem biotechnologie novou základnu pro rozvoj alternativních a snad lepších léčebných strategií.

Bylo prokázáno, že obecným charakteristickým rysem patogeneze astmatu a dalších chronických alergických onemocnění je zvýšený počet eosinofilů, obzvláště v bronchiál.ní sliznici plic. Po aktivaci eosinofily sekretují velký počet mediátorů, které jsou aktivně zapojeny do zánětlivé reakce dýchacích cest. V aktivaci eosinofilů má důležitou úlohu interleukin 5 (IL5).

IL5 je cytokin zjištěný u mnoha druhů savců a mezi jinými byly klonovány jak humánní tak myší gen pro IL5 (Tanabe et al., 1987, Campbell et al., 1988). humánní gen se skládá ze čtyř exonů s třemi introny umístěnými na chromozomu 5 a kóduje prekurzor s 134 aminokyselinovými zbytky, včetně 19 aminokyselin N-koncové vedoucí sekvence, která má aminokyselinovou sekvenci uvedenou v sekv. id. č. 62. Posttranslační štěpení dává vznik zralému proteinu se 115 aminokyselinovými zbytky (sekv. id. č. 1) . myší gen IL5 (mIL5) podobně kóduje prekurzor se 133 aminokyselinovými zbytky s vedoucí sekvencí s 20 aminokyselinami, která má aminokyselinovou sekvenci uvedenou v sekv. id. č. 64. Opracovaný zralý mIL5 je tedy dlouhý 113 aminokyselinových zbytků (sekv. id. č. 12), postrádá dva N-koncové aminokyselinové zbytky v porovnání s humánním IL5. aminokyselinové sekvence hIL5 a mTL5 jsou ze 70 % totožné ve srovnání se 77 % identity na úrovni nukleotidů kódujících úseků (Azuma et,l., 1986). Větší podobnost byla publikována mezi humánními primáty, 99% identita byla publikována pro kódující úseky humánní nukleotidové sekvence a nukleotidové sekvence opice Rhesus (Villinger et al., 1995).

·· ··· • · • · · · • · ·· • · · · * a ·

Humánní aminokyselinová sekvence má dvě potenciální místa N-glykosylace a myší sekvence tři. Bylo prokázáno, že humánní IL5 je jak N-glykosylovaný, tak také O-glykosylovaný, a to v pozici Thr 3. Studie hIL5 prokázaly, že glykosylace není pro biologickou aktivitu nezbytná dokonce i když se zdá, že je stabilita ovlivněna deglykosylací (Tominaga et al., 1990, Kodama et al., 1993).

Struktura IL5

Aktivní IL5 je homodimer a rentgenovou krystalografií byla zjištěna trojrozměrná struktura rekombinantního hIL5 (Milburn et al., 1993). 2 monomery jsou organizovány antiparalelně a kovalentně vázány dvěma meziřetězcovými disulfidovými můstky (44-87' a 87-44'), zapojují tedy všechny 4 cysteiny 2 monomerů.

Sekundární struktura monomerů se skládá ze 4 a-helixů (A-D) přerušených 3 spojovacími úseky (kličky) včetně dvou krátkých úseků se strukturou β-listů. Tento svazek 4a helixů je znám jako společný sklad cytokinů , který byl také publikován pro IL-2, IL-4, GM-CSF a M-CSF. Ale ty všechny jsou monomery a struktura homodimeru, kde D-helíx doplňuje motiv 4a helixů protilehlého monomeru je unikátní pro IL5.

Bylo prokázáno, že nativní monomery samotné jsou biologicky inaktivní (přehledy viz Callard & Gearing, 1994, Takutsu et al., 1997). Nicméně je možné vytvořit modifikovaný rekombinantní biologicky aktivní monomer zavedením dalších 8 aminokyselinových zbytků do kličky 3, spojujících helixy C a D. To umožní, že helix D doplní strukturu 4 helixů v jednom polypeptidovém řetězci, a tedy umožní, že monomer interaguje se svým receptorem (Dickason & Huston, 1996, Dickason et al., 1996).

♦ · ···· • · • · · · • · ·

Receptor IL5 se primárně vyskytuje na eosinofilech a je složen z α-řetězce a β-řetězce. α-řetězec receptorů je specifický pro IL5 a β-řetězec, který zajišťuje vysokou afinitu vazby a signální transdukci, je sdílen s heterodimerovými receptory pro IL-3 a GM-CSF. Sdílení receptorové složky by mohlo být důvodem pro zkříženou kompetici pozorovanou mezi IL5. IL-3 a GM-CSF (přehled viz Lopez et al., 1992). Ale nedávno bylo prokázáno, že regulace IL5R je odlišná od regulace IL-3R a GM-CSFR, což dále ukazuje vysoce specializovanou úlohu IL5 v regulaci eosinofilní reakce (Wang et al., 1998).

Zdá se, že C-koncová část IL5 je důležitá jak pro vazbu k IL5R, tak pro biologickou aktivitu, protože odstranění více než dvou C-koncových aminokyselinových zbytků má za následek pokles jak afinity vazby k IL5R, tak biologické aktivity v biologických testech pro IL5 (Proudfoot et al., 1996). Bylo zjištěno, že pro vazbu k receptorů jsou důležité také další zbytky, jako je například Glul2, který je zapojen do vazby k β-řetězci, zatímco zbytky Arg90 a Glul09 jsou zapojen do vazby k α-řetězci receptorů. Obecně se zdá, že vazba k IL5R nastává v úsecích překrývajících se helixů A a D, kde helix D je primárně odpovědný za vazbu ke specifickému α-řetšzci IL5R (Graber et al., 1995, Takastsu et al., 1997).

Homologie IL5's s jinými proteiny

Tyto dva motivy 4-helixové domény pozorované v homodimeru mají nápadně podobnou sekundární a terciární strukturu ve srovnání k cytokinovým skladem nalezeným u GMCSF a M-CSF, IL-2, IL-4 a humánní a prasečím růstovým hormonem (Milburn et al., 1993). Ale i když je nápadná podobnost také pozorována v organizaci intronů a exonů a • · poloze cysteinů (Tanabe et al., 1987, Cambell et al., 1988), což svědčí pro fylogenetický vztah s IL-2, IL-4 a GM-CSF, nebyla pozorována významná homologie s žádným z těchto cytokinů nebo dalšími cytokiny z aminokyselinové sekvence.

Biologická aktivita IL5

IL5 je hlavně sekretován plně diferencovanými buňkami Th2, žírnými buňkami a eosinofily (Cousins et al., 1994, Takutsu et al., 1997). Bylo prokázáno, že působí na eosinofily, basofily, cytotoxické T lymfocyty a na myší B lymfocyty (Callard & Gearing, 1994, Takutsu et al., 1997). účinky IL5 na humánní B lymfocyty jsou ještě předmětem polemiky. Bylo prokázáno zvýšení syntézy imunoglobulinů za určitých okolností a vazba celé řadě humánních B buněčných linií. Dokonce i když byla v humánních B lymfocytech zjištěna mRNA pro hIL5R, skutečná přítomnost receptoru na těchto buňkách ještě musí být ověřena (Baumann & Paul, 1997, Huston et al., 1996).

Účinky IL5 na eosinofily zahrnují chemotaxi, zvýšenou adhezi k endotelovým buňkám, aktivaci a konečnou diferenciaci buněk. Dále bylo prokázáno, že IL5 předchází apoptóze zralých eosinofilů (Yamaguchi et al., 1991). Tato zjištění přispěla k současné představě, že IL5 je nejdůležitější cytokin pro diferenciaci eosinofilů (Corrigan & Kay, 1996, Karlen et al., 1998).

Fyziologicky se uvažuje, že IL5 a s ním spojená aktivace eosinofilů slouží ochranné úloze proti hlístovým infekcím a možná proti určitým nádorům, protože tato onemocnění jsou typicky doprovázena eosinofilií periferní krve (Takutsu et al., 1997, Sanderson et al., 1992). Je to ale poněkud spekulativní, protože ve dvou studiích tito autoři • · · • · · · · · • · · · · · » · ·

I · · · · ι · l · <

9 9 9 9

99

9 · • · 9 9

9 9

9 9999 neprokázali žádný účinek kromě snížení počtu receptorů eosinofilů po podávání protilátky proti IL5 na imunitu (např. hladiny IgE) proti Nippostrongylus braziliensis nebo Schistosoma mansoni u myší infikovaných těmito parazity (Sher et al., 1990, Coffman et al., 1989).

IL5 transgenní zvířata a „knock-out zvířata

Studie na transgenních myších exprimujících IL5 nebo „knock-out myších bez genu pro IL5 podaly další znalosti o fyziologické úloze IL5.

Bylo publikováno několik IL5 transgenních myší:

Bylo publikováno, že transgenní myši exprimující gen IL5 v T iymfocytech měly zvýšený počet bílých krvinek charakterizovaný expanzí B220+ B lymfocytů a významnou eosinofilií. To bylo doprovázeno masivním buněčným exsudátem do břišní dutiny, kde z buněk převládaly eosinofily a infiltrací eosinofilů v téměř všech orgánových systémech (Lee et al., 1997a).

Pro další transgenní myši exprimující gen IL5 pod kontrolou metalothioninového promotoru bylo charakteristické zvýšení sérových hladin IgM a IgA, masivní eosinofilie v periferní krvi a mnoha dalších orgánech doprovázená expanzí zřetelné CD5+ B lymfocytové populace, která tvořila autoprotilátky (Tominaga et al., 1991).

Třetí studie se týkala transgenních myší konstitutivně exprimujících IL5 v plicích. U těchto zvířat se vyvinuly patofyziologické změny podobné změnám u humánního astmatu, včetně eosinofilní invaze peribronchiálních prostorů, hypertrofie epitelu a zvýšené produkce hlenu. Kromě toho byl pozorován rozvoj nadměrné vnímavosti dýchacích cest v nepřítomnosti antigenů (Lee et al., 1997b).

··**

Byly také studovány myši s nefunkčním IL5 (tzv. „knockout myši). Tyto myši (C57BL/6) nemají žádné zjevné příznaky nemoci a jsou fertilní. Hladiny imunoglobulinů a specifické protilátkové reakce na DNP-OVA byly normální. Jsou vytvářeny bazální hladiny eosinofilů, ale jsou 2-3 krát nižší než u kontrolních zvířat, což ukazuje, že eosinofily mohou být vytvářeny při úplné absenci IL5. Když byly tyto myši infikovány Mesocestoides corti, normálně pozorovaná eosinofilie byla odstraněna, a tato absence eosinofilie nepůsobila na infekci červy tvořenou tímto parazitem (Kopf et al., 1996).

Ve studii autorů Foster et al. (1996) byl zkoumán účinek IL5 „knock-out na běžný model atopického zánětu dýchacích cest. Senzitizace a aerosolový podnět myší ovalbuminem má normálně za následek eosinofilii v dýchacích cestách, hyperreaktivitu dýchacích cest na β-methacholin a rozsáhlé poškození plic, což je analogické změnám pozorovaným u astmatu. U myší s deficitem IL5 eosinofilie, hyperreaktivita dýchacích cest a poškození plic nenastaly. Když byla exprese IL5 u těchto myší obnovena, byla aero-alergenem indukovaná eosinofilie a dysfunkce dýchacích cest znovu navrácena.

Patofyziologická úloha IL5

Astma postihuje přibližně 10 % populace na celém světě a z doposud neznámých důvodů se v posledních dvou dekádách incidence a morbidita zvyšují (Ortega & Busse, 1997). Je to chronické onemocnění dýchacích cest charakterizované opakující se a obvykle reverzibilní obstrukcí proudění vzduchu, zánětem a nadměrnou vnímavostí (Moxam a Costello, 1990). To tvoří symptomy sípání a dušnosti, které mohou být ve vážných případech fatální.

• Φ ♦ φ φφφφ «· ·· • « · ♦ « φ · • φ φ • φ · •· φφφφ

Pokusy se zvířaty uvedené výše používající transgenní myši konstitutivně exprimující IL5 v plicích (Lee et al., 1997a) a knock-out myši s deficitem IL5 (Foster et al., 1996) výrazně podporují úlohu IL5 v patogeneze astmatu. Další důkazy toto podporující mohou být odvozeny z několika studií s astmatiky. Eosinofilie byla identifikována v tekutině bronchoalveolární laváže (BAL) a v biopsiích bronchiální sliznice pacientů s astmatem a koreluje se závažností nemoci, u pacientů s astmatem bylo v tekutině BAL identifikováno několik produktů eosinofilů a počty eosinofilů v periferní krvi korelují se závažností astmatu (Ortega & Busse 1997) .

Bylo zjištěno, že sérová koncentrace IL5 byla zvýšena (střední hodnota koncentrace 150 pg/ml) u 15 z 29 pacientů s chronickým vážným astmatem ve srovnání s kontrolními osobami (Alexander et al., 1994).

V další studii zahrnující jak neatopické, tak atopické astmatiky, bylo zjištěno, že zvýšená produkce IL5 pomocnými T lymfocyty způsobovala eosinofilní zánět u atopického i neatopického astmatu (Moři et al., 1997).

Další výsledky také ukazují, že IL5 má nespornou úlohu u dalších atopických onemocnění. Nedávno bylo prokázáno, že alergenem indukované systémové epizody u osob s alergickou rýmou korelují spíše s alergenem indukovanou syntézou IL5 než IgE (Ohashi et al., 1998). Korelace atopických reakcí byla také prokázána ve studii autorů Barata et al. (1998), kde byla prokázána významná exprese IL5 T lymfocyty v pozdní fázi kožní reakce.

Tyto a další výsledky vedly několik autorů, jako

Corrigan & Kay (1996), Danzig & Cuss (1997) k identifikaci a doporučení IL5 jako primárního cíle v rozvoji lepší léčby astmatu a atopických onemocnění zahrnujících eosinofilní zánět. Chronická hypereosinofilie poškozující tkáň indukovaná ·· ·· • · · · • · · • · · • · · • · ·· · · parazitární infekcí, topická plicní eosinofilie a hypereosinofilní syndrom jsou příklady dalších patogenních chorobných stavů, které by mohly být ovlivněny snížením počtu receptorů IL5.

Demonstrace úlohy IL5 in vivo

V několika studiích s modely astmatu u hlodavců bylo ukázáno, že léčení monoklonálními protilátkami proti IL5 (anti-IL5 mAb) mělo za následek inhibici eosinofilie závislou na dávce ve srovnání s neošetřenými kontrolami (Nagai et al., 1993a & b, Chand et al., 1992, Coeffier et al., 1994, Kung et al., 1995, Underwood et al., 1996). Ve studii autorů Nagai et al. (1993a) byl také pozorován účinek léčby senzibilizovaných Balb/c myší rozpustným a receptorem IL5.

V jedné studii s myšmi Balb/c (Hamelmann et al., 1997) a čtyřmi studiemi s morčaty bylo dále ukázáno, že anti-IL5 mAb inhibují hyperreaktivitu dýchacích cest vyvolanou různými látkami u zvířat senzibilizovaných antigenem (Mauser et al., 1993, Akutsu et al., 1995, van Oosterhout et al., 1995 & 1993). V některých studiích byly také prospěšné účinky (srovnej tabulku 1) léčby ant.i-IL5 mAb pozorovány mikroskopicky (Mauser et al., 1993, Akutsu et al., 1995, Kung et al., 1995). Což je důležité, ve studii autorů Kung et al. (1995) byla pozorována redukce plicního zánětu u B6D2F1 myší, když byla podávána anti-IL5 mAb hodiny před antigenním podnětem, a také když byla podávána až pět dnů po antigenním podnětu, což ukazuje, že účinek anti-IL5 mAb může být u zánětu dýchacích cest jak profylaktický, tak terapeutický. Ale tento účinek nebyl pozorován autory Underwood et al·., když byla anti-IL5 mAb podávána morčatům dvě hodiny po antigenním podnětu (Underwood et al., 1996).

• · · · · ···· «· ·· ···

Ve studii používající model astmatu u opic publikovali autoři Mauser et al. (1995) inhibici hyperreaktivity dýchacích cest po antigenním podnětu, když potkaní anti-myšíIL5 mAb byla podávána 1 hodinu před antigenním podnětem. Kromě toho bylo 75% snížení počtu eosinofilů v brorichoalveolární laváži (BAL) u zvířat ošetřených protilátkou ve srovnání s neošetřenými kontrolami. Vliv na eosinofilii a nadměrná vnímavost na anti-IL5 mAb byla pozorována až tři měsíce po léčení (Mauser et al., 1995). Co se týče alergické nadměrné vnímavosti, výsledky ze studie autorů Nagai et al. (1993a a 1993b) nedokazují žádnou redukci nadměrné vnímavosti ve spojení se snížením počtu eosinofilů v BAL.

Všechny anti-IL5 mAb pokusy in vivo doposud zmíněné byly prováděny s potkaními-anti-myšími monoklonálními protilátkami. Egan et al. (1995) publikovali pokusy s použitím humanizovaných potkaních-anti-humánních IL5 monoklonálních protilátek, nazvaných Sch 55700. Tyto mAbs inhibovaly eosinofilii v plicní laváži o 75 % v dávce 0,3 mg/kg, když byly podávány senzibilizovaným opicím. Když byla podávána Sch 55700 v dávce 1 mg/kg alergickým myším, byla také pozorována inhibice eosinofilie dýchacích cest.

Léčení astmatu v současnosti a v budoucnu

Současná léčba astmatu je prováděna, jak bylo uvedeno, kortikosteroidy, které jsou díky svému protizánětlivému účinku jedny z nejsilnějších léků. Kromě nich se prokázaly u pacientů s astmatem nejprospěšnějšími β₂ agonisté a methylxantinové deriváty, které všechny způsobují bronchodilaci a kromoglykan sodný, který „stabilizuje žírné ··

9

9 • 9 9

9

999 ·

9 9 9

9 9

9999 99

9 9 9 9

999 9· 9999 buňky, a tím zabraňuje uvolňování mediátoru (Ortega & Busse 1997).

Budoucí léčba astmatu může obsahovat anti-IL5 mAbs, jak bylo diskutováno výše. Firma Celltech ve spolupráci s firmou Schering Plough mají anti-IL5 mAb ve fázi I klinických astmatu. Ale léčba monoklonálními Především rozvoj a humanizovanou mAb) zkoušek pro léčení protilátkami s sebou nese řadu nedostatků, produkční náklady pro bezpečnou mAb (např.

jsou velmi vysoké, což má za následek drahý terapeutický produkt pro konečného uživatele. Za druhé mAbs mají z hlediska pacienta nevýhodnou vlastnost, jsou podávány v relativně krátkých intervalech. Za třetí mAbs projevují přirozenou úzkou specifičnost proti jednomu epitopu antigenu. A, konečně, mAbs (dokonce i humanizované) jsou imunogenní, vedou ke stále rychlejší inaktivaci podávaných protilátek, jak léčení časem pokračuje.

Bylo také navrhováno použití antisense IL5 oligonukleotidů pro antisense terapii firmou Hybridon pro léčení astmatu, alergií a zánětů. Ale antisense technologie se prokázala technicky obtížná a ve skutečnosti ještě nebyl podán konečný důkaz uskutečnitelnosti antisense terapie u lidí.

Konečně WO 97/45498 (Bresagen Limited/Medvet Science) navrhuje použití modifikovaných a různých forem IL5 molekul schopných antagonizovat aktivitu IL5 při zmírnění, zeslabení nebo jiném snížení aberantních účinků vyvolaných nativními nebo mutantními formami IL5. Bylo publikováno, že antagonizující účinek je výsledkem různých forem IL5 vazby k a řetězci IL5R o nízké afinitě, ale ne k receptorům o vysoké afinitě, tímto způsobem varianty kompetují s IL5 o vazbu k jeho receptorům bez projevů fyziologických účinků 1L5.

44 »4 4

4 4

4 4 4

4 4

4444

44

4 4 4

4 4

4 4 4 · ·

4 4 4 4 4

444 4

4 4

4 444

4 4

4 444

Další atopicka onemocnění zahrnující eosinofilní zánět jsou léčena buď symptomatickými léky uvedenými u léčba astmatu nebo imunitní terapií (IT) s použitím hyposensitizace s alergenovými extrakty. Je známo, že tento typ léčení je účinný u alergií na jeden nebo několik antigenů, zatímco není vhodný pro léčení mnohonásobné alergie. Kromě toho u obvyklé IT je časové období pro dosažení klinického zlepšení u pacientů reagujících na léčbu velmi dlouhé.

Tedy navzdory existujícím a možným budoucím léčbám chronických alergických onemocnění, jako je například astma, existuje nesporná potřeba alternativních způsobů léčby a zmírňování těchto a dalších chronických alergických onemocnění.

Podstata vynálezu

Předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout novou léčbu chronických alergických stavů (jako je například astma) charakterizovaných eosinofilií. Dalším předmětem je vývoj autovakcíny proti IL5, aby se dosáhlo nové léčby astmatu a dalších patologických stavů zahrnujících chronický zánět dýchacích cest.

Cytokin IL5 pocházející z T lymfocytů má, jak bylo uvedeno výše, hlavní úlohu v řízení eosinofilní reakce, ovlivňuje jak produkci, tak i lokalizaci a aktivaci eosinofilů. Protože nebylo publikováno, že IL5 má jinou centrální úlohu v rozvoji protektivní imunitní reakce, je tento konkrétní cytokin dle mínění původců atraktivní terapeutický cíl pro léčbu astmatu.

Obecným cílem předkládaného vynálezu je snížení patogenních hladin eosinofilů v dýchacích cestách pacienta «· ♦ • · • ·

4

4444 • 4

44 • 4 4 • ·

4 • 4 ·

4444 44

444 4 * ·

444 4 4 « 4 s astmatem down-regulací hladin IL5. protože eosinofily závisí na IL5. co se týče atrakce a aktivace. Výsledkem sníženého počtu eosinofilů ve sliznici dýchacích cest by bylo současné snížení zánětu v dýchacích cestách odpovídající klinickému zlepšení pacienta s astmatem.

Potenciální účinek tohoto přístupu již byl prokázán ve studiích s použitím anti-IL5 monoklonálních protilátek ve zvířecích modelech zánětu dýchacích cest (srovnej úvod k příkladům).

Předkládaný vynález ale dotahuje výsledky získané pasivní imunizací o jeden krok dále s použitím vyvolání aktivní imunitní reakce způsobem autovakcinace. Dle nej lepší znalosti původce, tento přístup ještě nebyl doposud navržen.

Výhodou léčby astmatiků IL5 autovakcínou ve srovnání se současnou léčbou kortikosteroidy apod., je redukce a/nebo eliminace vedlejších účinků a nejpravděpodobněji lepší účinek, co se týče trvání. Ve srovnání s anti-IL5 mAbs se očekává, že účinek indukované polyklonální Ab reakce je lepší než pasivně injikované monoklonální imunoglobuliny, protože polyklonální reakce je specifičtější. očekává se také zlepšení, co se týče aplikačního režimu (protože účinné autovakcíny popsané v tomto textu typicky vyžadují maximálně 2-6 podávání ročně).

Ve srovnání s hyposenzibilizací poskytuje předkládaný vynález lákavý aspekt, protože je nespecifický, což je obzvláště relevantní při jednání s mnohanásobně alergickými pacienty.

Tudíž ve svém nejširším a nejobecnějším rozsahu se předkládaný vynález týká způsobu in vivo down-regulace aktivity interleukinu 5 (IL5) u zvířete i člověka, tento

4· • ♦ · 4 · • · • ·

4·· *· ·*« 4 • · · • 4 4·· • · · • · * • 4 ·4· • 4 ·· « · · • · * · · · ·

4· ···· způsob obsahuje prezentaci imunitnímu systému zvířete imunologicky účinného množství

- alespoň jednoho IL5 polypeptidů nebo jeho subsekvence, který byl formulován tak, ze imunizace zvířete IL5 polypeptidm nebo jeho subsekvencí indukuje produkci protilátek proti IL5 polypeptidů, a/nebo

- alespoň jednoho IL5 analogu, do kterého je zavedena alespoň jedna modifikace v IL5 aminokyselinové sekvenci, což má za následek, že imunizace zvířete analogem indukuje produkci protilátek proti IL5 polypeptidů.

Nejpřitažlivější aspekt tohoto přístupu je to, že např. astma může být kontrolováno periodickou, ale nepříliš častou imunizací, na rozdíl od terapeutického postupu, který vyžaduje podávání anti-IL5 nebo molekul majících s nimi analogickou vazebnou afinitu k IL5. Očekává se, že 1 až 4 roční injekce imunogenního přípravku podle vynálezu budou postačující pro vznik požadovaného účinku, zatímco podávání jiných inhibitorů IL5 aktivity vyžaduje aplikaci denně nebo alespoň týdně.

Vynález se také týká analogů IL5, a také fragmentů nukleové kyseliny kódujících jejich podskupinu. Součástí vynálezu jsou také imunogenní přípravky obsahující analogy nebo fragmenty nukleové kyseliny.

Vynález se také týká způsobu identifikace analogů IL5 a také způsobu výroby přípravku obsahujícího analogy IL5.

·« ·»♦· • · ·

9 9 •999 99 • · 9 9 9 9 9

9 999 9 9 · • 9 9 · 9 · · • · 9 9 9 9

999 99 9999

Popis obrázků

Obr. 1: aminokyselinová sekvence zralého humánního IL5 (sekv. íd. č. 1) . Je zahrnuta porovnaná myší sekvence (sekv. íd. č. 12), ale jsou zobrazeny pouze pozice, které se liší od humánní sekvence. Dvě označují chybějící N-koncové zbytky myšího IL5. Pozice N-glykosylace jsou označeny dvojitým podtržením, O-glykosylované threoniny humánního IL5 jsou uvedeny kurzívou a cysteiny tučně.

Obr. 2: dimerní a monomerní struktury humánního IL5.

A: dimerní struktura hIL5. Struktura byla získána pouze pro zbytky 5-112, což znamená, že místo O-glykosylace v Thr3 není zahrnuto.

B: stejná struktura jako v A, s přiřazením helixů (A-D a A’-D').

C: monomer hIL5 s aminokyselinovými zbytky odlišnými od mIL5 ukázanými světle šedě.

Obr. 3: porovnané aminokyselinové sekvence (sekv. id. č. 1 a 12) zralého humánního IL5 (hIL5) a myšího IL5 (mIL5) s označením úseků vhodnými pro substituci. 4 α-helixy A-D jsou obklopeny rámečky s plnou čarou, β-listy jsou dvojitě podtrženy a pozice dvou cysteinů jsou označeny Identické zbytky v těchto dvou sekvencích jsou označeny a neidentické zbytky jsou označeny Klička 1 se překlenuje mezi helixy A a B, klička 2 se překlenuje mezi helixy B a C a klička 3 se překlenuje mezi kličkami C a D. Aminokyselinové sekvence pro substituci peptidy obsahujícími cizorodý T_Hepitop jsou označeny tučně: jedna taková sekvence je

94 «9 9

4 9 · 9 ·

9 9 •«•9 9·

4*4*

9* · 9 ··

9 9 • · 9

499

9« *4

4 4 9

9 ·

4 9 ·

9 9

9994 obklopena rámečkem z tečkované čáry díky zbytkům překrývajícím se se zbytky substituovanými v odlišném konstruktu. Aminokyselinové sekvence 10 konstruktů (5 pochází z humánního a 5 pochází z myšího IL5) jsou uvedeny v sekv. id. č. 2 až 11 a 13 až 22.

Obr. 4: výsledky testu ELISA imunizace DNA testováním dvou mIL5 autovakcín DNA.

Myši byly DNA očkovány s nahou plazmidovou DNA kódující buď ovalbumin, mIL5wt, mIL5.1 nebo mIL5.5. Séra získaná 77. den byla testována na reaktivitu proti ovalbuminu a myšímu IL5. Polystyrénové mikrotitrační destičky (Maxisorp, Nunc) byly potaženy ovalbuminem (1 pg/jamka, Sigma) nebo purifikovaným rekombinantním myším IL5 (0,1 pg/jamka, E1320). Reaktivita naředěných sér přidávaných do jamek byla vizualizována s použitím kozí anti-myší sekundární protilátky. Odečty odběrů krve před testem v OD490 byly subtrahovány od odečtů testovaných vzorků v OD490 a výsledné hodnoty byly prezentovány pro každou jednotlivou myš jako sloupce. Odečty odběrů krve před testem v OD490 (ředění 1:25) byly v rozmezí od 0,025 do 0,034. Křížky označují mrtvá zvířata.

Obr. 5: Schematické znázornění konstruktů autovakcín na základě myšího IL5.

Horní obrázek představuje myší monomer IL5 divokého typu s helixy A-C, kličkami 1 až 3 a pohyblivým C-koncovým úsekem. Ostatní obrázky představují odlišné konstrukty autovakcín mající vnitřní substituce epitopů P2 a P30 tetanového toxoidu v různých pozicích. Specifické konstrukty jsou detailně uvedeny v příkladech.

• 1 • A A···

A · ·

9 9

9911 11 ·· ♦»»· • · • ···

1· 911

Definice

V následujícím textu je definována a detailně vysvětlena řada termínů použitých v přítomném popisu a patentových nárocích, aby se objasnily cíle a souvislosti vynálezu.

Termíny T lymfocyt a T buňka jsou používány zaměnitelně pro lymfocyty pocházející z thymu, které jsou zodpovědné za různé imunitní reakce zprostředkované buňkami a také za pomocnou aktivitu v humorální imunitní reakci. Podobně jsou použity termíny B lymfocyt a B buňka zaměnitelně pro lymfocyty produkující protilátky.

Termín IL5 polypeptid v tomto textu označuje polypeptidy mající aminokyselinovou sekvenci výše diskutovaných IL5 proteinů pocházejících z člověka a myši (nebo jejich zkrácených variant, které sdílí podstatné množství epitopu B lymfocyt s intaktním IL5), ale tímto termínem jsou také obsaženy polypeptidy mající aminokyselinovou sekvenci totožnou s xeno-analogy těchto dvou proteinů izolovanými z dalších živočišných druhů. V mezích termínu jsou také zahrnuty neglykosylované formy IL5. které jsou připravovány v prokaryotickém systému, jako jsou formy mající různý charakter glykosylace díky použití např. Kvasinek nebo dalších jiných než savčích eukaryotických expresních systémů. Je ale nutné poznamenat, že používáním termínu IL5 polypeptid je zamýšleno, že uvažovaný polypeptid je normálně neimunogenní, když je prezentován léčenému zvířeti. Jinými slovy IL5 polypeptid je autoprotein nebo je to xenoanalog takového autoproteinu, který nedává normálně vzniknout imunitní reakci proti IL5 u zkoumaného zvířete.

Termín IL5 analog označuje IL5 polypeptid, ve kterém byly provedeny změny primární struktury. Tato změna může být např. ve formě fúze IL5 polypeptidu ke vhodnému fúznímu »· φ φ φφ φφ • φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φφφ φφφφ φφ φφ φφφφ

φφ φφφ

S φ

φ φφφφ partnerovi (tj. změna primární struktury zahrnující výlučně C-koncové a/nebo N-koncové přidání aminokyselinových zbytků) a/nebo může být ve formě inzercí a/nebo delecí a/nebo substitucí v IL5 polypeptidové aminokyselinové sekvenci. Termín také zahrnuje jsou derivované IL5 molekuly, srovnej diskusi níže o modifikacích IL5.

Je nutné poznamenat, že použití u člověka např. psího analogu humánního IL5 jako vakcíny může být chápáno tak, že se vytvoří požadovaná imunita proti IL5. Takové použití xenoanalogu pro imunizaci je také považováno za IL5 analog tak, jak je definován výše.

Používání zkratky IL5 v tomto textu se týká aminokyselinové sekvence zralého IL5 divokého typu (v tomto textu také označován IL5m a IL5wt). Zralý humánní IL5 je označován hIL5, hIL5m nebo hIL5wt a myší zralý IL5 je označován mIL5, mIL5m nebo mIL5wt. V případech, kdy DNA konstrukt obsahuje informaci kódující vedoucí sekvenci nebo

jinou látku, to je Je zamýšleno	normálně jasné z kontextu.
, že termín polypeptid	v	přítomném
kontextu znamená	oba krátké peptidy o	2	až	10
aminokyselinových	zbytcích, oligopeptidy o	11	až	100
aminokyselinových	zbytcích a polypeptidy o	více	než	100
aminokyselinových	zbytcích. Kromě toho je také	zamýšleno,	že

tento termín obsahuje proteiny, tj. Funkční biomolekuly obsahující alespoň jeden polypeptid, když obsahuje alespoň dva polypeptidy, tyto mohou tvořit komplexy, mohou být kovalentně spojeny nebo mohou být spojeny nekovalentně. Polypeptid(y) v proteinu mohou být glykosylovány a/nebo lipidovány a/nebo obsahují prostetické skupiny.

Termín subsekvence znamená jakýkoliv nepřetržitý úsek alespoň 3 aminokyselin nebo případně alespoň 3 nukleotidů, pocházející přímo z přirozeně se vyskytující IL5 ·· «· « · · ·

• · · « 4 aminokyselinové sekvence nebo sekvence nukleové kyseliny, v daném pořadí.

Je zamýšleno, že termín zvíře v daném kontextu obecně označuje druhy živočichů (výhodně savců), jako je například Homo sapiens, Canis domesticus, apod. a ne jenom jedno jediné zvíře. Ale termín také označuje populaci takového živočišného druhu, protože je důležité, že všichni jedinci imunizovaní podle způsobu vynálezu obsahují v podstatě stejný IL5. což umožňuje imunizaci zvířat stejným imunogenem(imunogeny). Jestliže například v různých lidských populacích existují genetické varianty IL5. může být nutné použít v těchto různých populacích odlišné imunogeny, aby bylo možné uniknout autotoleranci na IL5 v každé populaci. Odborníkovi je jasné, že zvíře v daném kontextu je živoucí bytost, která má imunitní systém. Je výhodné, když zvíře je obratlovec, jako je například savec.

Termínem down-regulace IL5 aktivity in vivo je v tomto textu míněno snížení počtu interakcí mezi IL5 a jeho receptory v živém organizmu (nebo mezi IL5 a jinými možnými biologicky důležitými vazebnými partnery této molekuly). Down-regulace může být dosažena několika mechanismy: z nich je nej jednodušší jednoduchá interference s vazbou protiiátKy v aktivním místě IL5. Ale v rozsahu předkládaného vynálezu je také to, že vazba protilátky má za následek odstranění IL5 buňkami se scavengerovými („uklízecími) receptory (jako jsou například makrofágy a další fagocytující buňky).

Výraz prezentuje... imunitnímu systému označuje to, že imunitní systém zvířete je vystaven řízenému imunogennímu podnětu. Jak bude jasné z popisu uvedeného níže, toto podněcování imunitního systému může být prováděno celou řadou způsobů, z nichž je nejdůležitější vakcinace polypeptidem obsahujícím farmakologické vakcíny (tj . Vakcínu, která je • 4 4 • · • 4

4 • 444 • 4 •

4 •

• 4

4« ··*«4 4 · • 4 · ·4

4 4 4

4 4 • 4 ·

4 «4

4·

4444 podáván pro léčbu nebo zmírnění stále pokračující nemoci) nebo očkování farmakologickou vakcínou nukleovou kyselinou. Dosaženým důležitým výsledkem je, že imunokompetentní buňky zvířete jsou konfrontovány s antigenem imunologicky účinně, zatímco přesný způsob, jak tento výsledek dosáhnout, je pro vynálezeckou myšlenku předkládaného vynálezu méně důležitý.

Termín imunogenně účinné množství ma svug význam v oboru, tj indukovat imunitní patogenními agens, imunogenem.

označuje množství imunogenu reakci, která se významně které sdílí imunologické obvyklý schopné zabývá rysy s

Používání výrazu, že IL5 byl modifikován, se v tomto textu míní chemická modifikace polypeptidu, který vytváří hlavní řetězec IL5. Takovou modifikací může např. být derivatizace (např. alkylace, acylace, esterifikace apod.) určitých aminokyselinových zbytků v IL5 sekvenci, ale jak vyplyne z popisu níže, výhodné modifikace zahrnují změny (nebo přidávání k) primární struktury IL5 aminokyselinové sekvence.

Pojmem autotolerance k IL5 se rozumí, že i když IL5 je autoprotein v populaci, která má být očkována, normální jedinci v populaci nevyvíjejí imunitní reakci proti IL5. ačkoliv nemůže být vyloučeno, že příležitostní jedinci ve zvířecí populaci by mohli být schopni tvořit protilátky proti nativnímu IL5. např. jako část autoimunitní poruchy. Kdykoliv bude zvíře normálně autotolerantní pouze ke svému vlastnímu IL5. ale nemůže být vyloučeno, že analogy IL5 pocházející z jiných druhů zvířat nebo z populace mající odlišný IL5 fenotyp by také mohly být tolerovány uvedeným zvířetem.

Termíny cizorodý epitop T lymfocytů (nebo: cizorodý T lymfocytární epitop) je peptid, který je schopný vázat MHC molekulu a který stimuluje T lymfocyty v živočišných druzích.

·· »· • · · · £ · · • · ·

• · · · · • · · · ···· «·

Výhodné cizorodé epitopy T lymfocytu podle vynálezu jsou všeobecné (nebo tzv. „promiskuitní) epitopy, t j. epitopy které vážou podstatnou část konkrétní třídy MHC molekul v živočišných druzích nebo populaci. Je znám pouze velmi omezený počet těchto všeobecných epitopů T lymfocytu a budou diskutovány detailně níže. Je nutné poznamenat, že aby imunogeny, které jsou použity podle předkládaného vynálezu, byly účinné co největší frakce populace zvířat, jak je jen možné, může být nezbytné 1) vložit několik cizorodých epitopů T lymfocytu do stejného IL5 analogu nebo 2) připravit několik analogů IL5. kde každý analog má vložen odlišný všeobecný epitop. Je také nutné poznamenat, že pojem cizorodých epitopů T lymfocytu také obsahuje použití kryptických epitopů T lymfocytu, tj. Epitopů, které pocházejí z autoproteinu a které projevují imunogenní chování pouze tehdy, když existují v izolované formě bez toho, aby byli částí zkoumaného autoproteinu.

Termín cizorodý epitop pomocného T lymfocytu (cizorodý T_H epitop) je cizorodý epitop T lymfocytu, který se váže na molekulu MHC třídy II a může být předložen na povrchu buňky prezentující antigen (APC) navázané k molekule MHC třídy II.

Termín funkční část (bio)molekuly v daném kontextu znamená část molekuly, která je zodpovědná za alespoň jeden biochemický nebo fyziologický účinek projevovaný molekulou. V oboru je známo, že mnoho enzymů a jiných efektorových molekul mají aktivní místo, které je zodpovědné za účinky projevované zkoumanou molekulou. další části molekuly mohou sloužit účelům stabilizace nebo zvýšeni rozpustnosti a mohou tudíž být vynechány, jestliže tento účel není relevantní pro určité provedení předkládaného vynálezu, například je možné použít určité další cytokiny jako modifikující skupinu v IL5 • · • · ·« (srovnej detailní diskusi níže) a v takovém případě může být otázka stability irelevantní, protože kondenzace k IL5 poskytuje nezbytnou stabilitu.

Termín adjuvans má svůj obvyklý význam v oboru vakcinační technologie, tj. Znamená předmětnou látku nebo přípravek, který 1) není sám o sobě schopný vyvolat specifickou imunitní reakci proti imunogenuu vakcíny, ale který je 2) nicméně schopný zesílit imunitní reakci proti imunogenuu. Nebo jinými slovy, vakcinace adjuvans samotným neposkytuje imunitní reakci proti imunogenu, vakcinace imunogenem může nebo nemusí vyvolat imunitní reakci proti imunogenu, ale kombinace vakcinace imunogenem a adjuvans indukuje imunitní reakci proti imunogenu, která je silnější, než reakce indukovaná imunogenem samotným.

Termínem cílení molekuly je v daném kontextu označována situace, kdy se molekula po zavedení do zvířete objeví přednostně v určité tkáni(tkáních) nebo je přednostně sdružována s určitými buňkami nebo buněčnými typy. účinek může být uskutečněn řadou způsobů včetně formulace molekuly do přípravku usnadňujícího cílení nebo zavedením skupiny usnadňující cílení do molekuly. Tyto otázky budou diskutovány detailně níže.

Termín stimulace imunitního systému znamená, že předmětná látka nebo přípravek projevují obecný, nespecifický imunostimulační účinek. Počet adjuvancií a předpokládaných adjuvancií (jako jsou například určité cytokiny) sdílejí schopnost stimulovat imunitní systém. Výsledkem použití imunostimulačního agens je zvýšená pohotovost imunitního systému znamenající, že simultánní nebo následná imunizace imunogenem indukuje významně účinnější imunitní reakci ve srovnání s použitím izolovaného imunogenu.

·· · · · ·

Výhodná provedení down-regulace IL5 aktivity

Je výhodné, když IL5 polypeptid použitý jako imunogen ve způsobu podle vynálezu je modifikovaná molekula, kde je v IL5 aminokyselinové sekvenci přítomná alespoň jeden změna, protože šance na získání důležitého úniku autotoleranci na IL5 je tímto způsobem výrazně usnadněna. Je nutné poznamenat, že to nevylučuje možnost použití takto modifikovaného IL5 ve formulacích, které dále usnadňují únik autotoleranci na IL5, např. formulace obsahující určitá adjuvancia diskutovaná detailně níže.

Bylo prokázáno (v Dalum I et al., 1996, J. Imunol. 157, 4796-4804), že potenciálně autoreaktivní B lymfocyty rozpoznávající autoproteiny jsou u normálních jedinců fyziologicky přítomné. Ale aby v těchto B lymfocytech byla indukována skutečná tvorba protilátek reagujících s relevantními autoproteiny, je potřebné přispění T pomocných lymfocytů produkujících cytokiny (T_H buňky nebo T_H lymfocyty). Normálně tato pomoc není poskytnuta, protože T lymfocyty obecně nerozpoznávají epitopy T lymfocytů pocházející z autoproteinů, když jsou předkládány buňkami prezentujícími antigen (APC). Ale po zajištění prvku cizorodosti autoproteinu (tj. Zavedení imunologicky významné modifikace) T lymfocyty rozpoznávající cizorodý prvek jsou aktivovány po rozpoznáváni cizorodého epitopu na APC (jako je například původně mononukleární buňka). Polyklonální B lymfocyty (které jsou také specializované APC) schopné rozpoznání autoepitopů na modifikovaném autoproteinu také internalizuji antigen a pak prezentují jeho cizorodý epitop(y) T lymfocytů a aktivované T lymfocyty pak poskytují cytokinovou pomoc těmto autoreaktivním polyklonálním B lymfocytům. Protože protilátky vytvořené těmito polyklonálními B lymfocyty jsou reaktivní s odlišnými epitopy modifikovaného polypeptidů, včetně těch, • 4 • · · · 4 · 4 · • · · · 4444 4 • 4 444 4 444

4 · · · 4 4 • 444 44 44 444 které jsou také přítomné na nativním polypeptidu, je indukována protilátka zkříženě reagující s nemodifikovaným autoproteinem. Závěrem, T lymfocyty mohou být vedeny k tomu, že jednají tak, jako kdyby populace polyklonálních B lymfocytů rozpoznávala úplně cizorodý antigen, zatímco ve skutečnosti je pro hostitele cizorodý pouze vložený epitop(epitopy). Tímto způsobem jsou indukovány ' protilátky schopné zkřížené reakce s nemodifikovanými autoantigeny.

V oboru je známo několik způsobů, jak modifikovat peptidový autoantigen, aby se dosáhlo úniku autotoleranci. Tudíž podle vynálezu modifikace může zahrnovat, že

- je zaveden alespoň jeden cizorodý epitop T lymfocytů a/nebo

- je zavedena alespoň jedna první skupina, která provádí cílení modifikované molekuly k buňce prezentující antigen (APC), a/nebo

- je zavedena alespoň jedna druhá skupina, která stimuluje imunitní systém a/nebo

- je zavedena alespoň jedna třetí skupina, která optimalizuje prezentaci modifikovaného IL5 polypeptidu imunitnímu systému.

Ale všechny tyto modifikace by měly být prováděny při udržování podstatné frakce původních epitopů B lymfocytů na IL5. protože je takto zesíleno rozpoznávání nativní molekuly B lymfocytem.

V jednom výhodném provedení jsou kovalentně nebo nekovalentně zavedeny postranní skupiny (ve formě cizorodých epitopů T lymfocytů nebo výše uvedené první, druhé a třetí skupiny). To znamená, že úseky aminokyselinových zbytků pocházející z IL5 jsou derivovány beze změny primární aminokyselinové sekvence nebo alespoň bez zavedení změn v peptidových vazbách mezi jednotlivými aminokyselinami v řetězci.

• · · · · · · • · · · · · · · • · · ···· · • · · · · · • · ··· ·· ··· ·

Alternativní a výhodné provedení používá substituci a/nebo deleci a/nebo inzerci a/nebo adice aminokyselin (což může být prováděno rekombinantními technikami nebo peptidovou syntézou, modifikace, které se týkají delších úseků aminokyselin mohou dát vznik fúzním polypeptidům). Jedna obzvláště výhodná verze tohoto provedení je technika popsaná ve WO 95/05849, která popisuje způsob down-regulace autoproteinů imunizací analogy autoproteinů, kde byl velký počet aminokyselinových sekvencí substituován odpovídajícím počtem aminokyselinových sekvencí, z nichž každá obsahovala cizorodý imunodominantní epitop T lymfocytů, zatímco byla současné udržena obecná terciární struktura autoproteinů v analogu. Pro účely předkládaného vynálezu je ale postačující, jestliže modifikace (ať už to je inzerce, adice, delece nebo substituce aminokyseliny) založila cizorodý epitop T lymfocytů a současně uchovala podstatný počet epitopů B lymfocytů v IL5. Ale aby bylo dosaženo maximální účinnosti indukované imunitní reakce, je výhodné, že je udržována v modifikované molekule obecná terciární struktura IL5.

Následující vzorec popisuje IL5 konstrukty obecně spadající do rozsahu vynálezu:

(MODJs! (IL5_el)_ni (MOD₂)_s2 (IL5_e2)_n2.. (MOD_X) _sx (IL5_ex)_nx (I) kde IL5_ei“IL5_ex je x epitopů B lymfocytů obsahujících subsekvence IL5. které jsou nezávisle identické nebo neidentické a které mohou obsahovat nebo neobsahují cizorodé postranní skupiny, x je celé číslo ú 3, nl-nx jsou x celá čísla 0 (alespoň jedno je ú 1), MODi~MOD_x jsou x modifikace zavedené mezi zachované epitopy B lymfocytů a Si~s_x jsou x celá čísla 0 (alespoň jedno je ú 1, jestliže v IL5_e • · • · ···· ·· ·· • · * · · · · • · ··· · · ♦ • · · · · · ♦ • · · · · · • · ·«· ·· ···· sekvenci nejsou zavedeny žádné postranní skupiny). Tedy za daných obecných funkčních omezení imunogenicity konstruktů, vynález umožňuje všechny druhy permutací původní IL5 sekvence a všechny druhy modifikací. Tedy ve vynálezu jsou zahrnuty modifikované IL5 získané části IL5 sekvence, která např. Projevuje vedlejší účinky in vivo nebo vynecháním části, která by mohla založit nežádoucí imunologické reakce.

Udržování podstatné frakce epitopů B lymfocytu nebo dokonce obecné terciární struktury proteinu, který je podroben modifikaci tak, jak bylo v tomto textu popsáno, může být dosaženo několika způsoby. Jedním z nich je jednoduše připravit polyklonální antisérum namířené proti IL5 (např. antisérum připraven v králíkovi) a poté použití tohoto antiséra jako testované reagencie (např. V kompetitivním testu ELISA) proti modifikovaným proteinům, které jsou vytvářeny. Modifikované verze (analogy), které reagují do stejné míry s antisérem jako IL5, musejí mít stejnou obecnou terciární strukturu jako IL5, zatímco analogy projevující omezenou (ale ještě významnou a specifickou) reaktivitu s tímto antisérem si zachovávají podstatnou část původních epitopů B lymfocytu.

Alternativně může být připravena a použita jako testovací panel selekce monoklonálních protilátek reagujících s rozdílnými epitopy IL5. Tento postup výhodně umožní 1) mapování epitopů IL5 a 2) mapování epitopů, které jsou udržovány v připravených analozích.

Ovšem třetím přístupem by bylo rozložit trojrozměrnou strukturu IL5 nebo jeho biologicky aktivní zkrácené varianty (srovnej výše) a srovnat ji s rozloženou trojrozměrnou strukturou připravených analogů. Trojrozměrná struktura může být rozložena prostřednictvím studií rentgenové difrakce a NMR spektroskopií. Další informace týkající se terciární struktury mohou být do určité míry získány ze studií cirkulárního dichroismu, které mají výhodu, že vyžadují polypeptid pouze v čisté formě (zatímco rentgenová difrakce vyžaduje obstarání krystalizovaného polypeptidu a NMR vyžaduje obstarání isotopových variant polypeptidu), aby byla poskytnuta použitelná informace o terciární struktuře dané molekuly. Ale nakonec rentgenová difrakce a/nebo NMR jsou nezbytné pro zisk směrodatných dat, protože cirkulární dichroismus může poskytnout pouze nepřímý důkaz správné trojrozměrné struktury prostřednictvím informace sekundárních strukturních prvků.

Jedno výhodné provedení vynálezu používá mnohonásobné prezentace epitopů B lymfocytu IL5 (tj. Vzorec I, kde alespoň jeden epitop B lymfocytu je přítomný ve dvou pozicích). Tohoto účinku může být dosaženo různými způsoby, např. jednoduchou přípravou fúzních polypeptidů obsahujících strukturu (IL5)_m, kde m je celé číslo 2, a pak zavedením modifikací diskutovaných v tomto textu do alespoň jedné IL5 sekvence nebo alternativně vložením mezi alespoň dvě IL5 aminokyselinové sekvence. Je výhodné, že zavedené modifikace zahrnují alespoň jeden duplikát epitopu B lymfocytu a/nebo zavedení haptenu.

Jak bylo uvedeno výše, zavedení cizorodého epitopu T lymfocytu může být uskutečněno zavedením inzerce, adice, delece nebo substituce alespoň jedné aminokyseliny. Ovšem normální bude zavedení více než jedné změny do aminokyselinové sekvence (např. Inzerce nebo substituce kompletního epitopu T lymfocytu), ale je důležité dosáhnout, aby IL5 analog, když je zpracováván buňkou prezentující antigen (APC), založil takový cizorodý imunodominantní epitop T lymfocytu, který bude předložen molekule MHC třídy II na povrchu APC. Tedy, jestliže IL5 aminokyselinová sekvence ve ···· • · · vhodných pozicích obsahuje množství aminokyselinových zbytků, které mohou být také zjištěny v cizorodém T_H epitopu, pak zavedení cizorodého T_H epitopu může být uskutečněno poskytnutím zbylých aminokyselin cizorodého epitopu pomocí inzerce, adice, delece a substituce aminokyseliny. Jinými slovy, není nutné zavést inzercí nebo substitucí kompletní T_Hepitop.

Je výhodné, když je počet aminokyselinových inzercí, delecí, substitucí nebo adicí alespoň 2, například 3, 4, 5,

6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 a 25 inzercí, substitucí, adicí nebo delecí. Dále je výhodné, když počet aminokyselinových inzercí, substitucí, adicí nebo delecí nepřesahuje 150, je například nejvíce 100, nejvíce 90, nejvíce 80 a nejvíce 70. Je obzvláště výhodné, když počet substitucí, inzercí, delecí nebo adicí nepřesáhne 60 a konkrétně by počet neměl přesáhnout 50 nebo dokonce 40. Nej výhodnější je počet ne více než 30. Co se týče adicí aminokyselin, je nutné poznamenat, že počet adicí, když je výsledný konstrukt ve formě fúzního polypeptidu, je často značně vyšší než 150.

Výhodná provedení vynálezu zahrnují modifikace zavedením alespoň jednoho cizorodého imunodominantního T_K epitopu. Je nutné porozumět, že otázka imunitní dominance T_H epitopu závisí na zkoumaném živočišném druhu. Termín imunodominance používaný v tomto textu se jednoduše týká epitopů, které u očkovaného jedince vyvolají významnou imunitní reakci, ale je známým faktem, že T_H epitop, který je imunodominantní u jednoho jedince, není nutně imunodominantní u dalšího jedince stejného živočišného druhu, dokonce i když může být schopný vazby MHC-II molekuly u posledně uvedeného jedince.

Dalším důležitým bodem je otázka MHC restrikce T_Hepitopů. Obecně přirozeně se vyskytující T_H epitopy jsou MHC • · · · · · * · ·· «·· · ·· •» 99 9 9 omezeny, t j. určitý peptid tvořící T_H epitop se účinně váže pouze k podskupině molekul MHC třídy II. To má dále ten účinek, že ve většině případů použití jednoho specifického T_Hepitopu má za následek složku vakcíny, která je účinná pouze ve frakci populace a v závislosti na velikosti této frakce, může být nezbytné zahrnout více T_H epitopů do stejné molekuly nebo alternativně připravit vakcínu s mnoha složkami, kde složky jsou IL5 varianty, které se od sebe liší povahou zavedeného T_H epitopu.

Jestliže MHC restrikce použitých T lymfocytů je zcela neznámá (například v situaci, kdy má očkované zvíře nedostatečně definovaný MHC přípravek), frakce populace zvířat pokrytá specifickým vakcinačním přípravkem může být určena pomocí následujícího vzorce:

populace

kde pi je četnost jedinců v populaci reagujících na i-tý cizorodý epitop T lymfocytů přítomný ve vakcinačním přípraveku a n je celkový počet cizorodých epitopů T lymfocytů ve vakcinačním přípravku. Tudíž vakcinační přípravek obsahující 3 cizorodé epitopy T lymfocytů mající četnosti reakce v populaci 0,8, 0,7 a 0,6, v daném pořadí, by dal

- 0,2 x 0,3 x 0,4 = 0,976 tj . u 97,6 % populace se statisticky vyvine MHC-II zprostředkovaná reakce na vakcínu.

Výše uvedený vzorec nelze použít v situacích, kdy je více nebo méně přesně znám typ MHC restrikce použitých peptidů. Jestliže se například určitý peptid váže pouze na humánní molekuly MHC-II kódované HLA-DR alelami DR1, DR3, DR5 a DR7, pak použití tohoto peptidů spolu s dalšími peptidy, které se vážou na zbylé molekuly MHC-II kódované HLA-DR alelami dovrší 100% pokrytí ve zkoumané populaci. Podobně, jestliže se druhý peptid váže pouze na DR3 a DR5, přidání tohoto peptidu nezvýší pokrytí všech. Jestliže je kalkulace reakce populace založena pouze na MHC restrikci epitopů T lymfocytu ve vakcíně, frakce populace pokryté specifickým vakcinačním přípravkem může být určena pomocí následujícího vzorce:

f.popude ^(III) /-I kde <f>j je suma frekvencí alelických haplotypů v populaci, které kódují MHC molekuly, které vážou jakýkoliv epitop T lymfocytu ve vakcíně a které patří k j-tému ze 3 známých HLA lokusů (DP, DR a DQ), v praxi je nejdříve určeno, které MHC molekuly rozpoznají každý epitop T lymfocytu ve vakcíně a proto jsou tyto MHC molekuly uvedeny typem (DP, DR a DQ) pak jsou jednotlivé frekvence odlišných uvedených alelických haplotypů pro každý typ sumarizovány, a tím poskytují (/>_lr Φ2 a Φ3·

Může nastat situace, kdy hodnota p± ve vzorci II překročí odpovídající teoretickou hodnotu ^Ι-ΠΟ-ν,)² _(IV) /«i kde Vj je suma frekvencí alelických haplotypů v populaci, které kódují MHC molekuly, které vážou í-tý epitop T lymfocytu ve vakcíně a které patří k j-tému ze 3 známých HLA lokusů (DP, DR a DQ) . To znamená, že v 1-7Tí, populace je četnost reagujících osob freziduáiní-i = (Ρί~^ϊ) / (1-^i) · Tudíž, vzorec III může být upraven tak, že vzniká vzorec V:

• ♦ Μ» · • * · • · * · ·

-ι-Πο-ρ/Μι-ΐίο

·· ··*· (V) kde termín 1-frezíduáiní-i se rovná nule, jestliže je negativní. Je nutné poznamenat, že vzorec V vyžaduje, aby všechny epitopy byly haplotypy mapované proti identickým sadám haplotypů.

Tudíž při selekci epitopů T lymfocytu, které mají být zavedeny do IL5 analogu, je důležité obsáhnout znalost všech epitopů, které jsou k dispozici: 1) četnost osob v populaci odpovídajících na každý epitop, 2) MHC restrikční data a 3) frekvenci relevantních haplotypů v populaci.

Existuje velký počet přirozeně se vyskytujících všeobecných epitopů T lymfocytu, které jsou aktivní u velké části jedinců živočišného druhu nebo populace zvířat a ty jsou výhodně zavedeny do vakcíny, a tím snižují potřebu velmi vysokého počtu odlišných analogů IL5 v téže vakcíně.

Všeobecný epitop může být podle vynálezu přirozeně se vyskytující humánní epitop T lymfocytu, jako jsou například epitopy tetanického toxoidu (např. Epitopy P2 a P30), epitop difterického toxoidu, hemaglutinin viru chřipky (HA) a CS antigen P. Falciparum.

V průběhu let byl identifikován velký počet dalších všeobecných epitopů T lymfocytu. Byly identifikovány zejména peptidy schopné vázat velký podíl HLA-DR molekul kódovaných odlišnými HLA-DR alelami a všechny z nich jsou možné epitopy T lymfocytu pro zavedení do analogů IL5 použitých podle předkládaného vynálezu. (Srovnej také epitopy diskutované v následujících odkazech, které jsou tímto všechny zahrnuty do odkazů v tomto textu: WO 98/23635 (Frazer IH et al., přidělená University Queensland), Southwood S et. al., 1998, J. Imunol., 160, 3363-3373, Sinigaglia F et al., 1988, • · «•«4 ·· ·· • · · 4

4 «

4·44

4 4

Nátuře, 336, 778-780, Chicz RM et al., 1993, J. Exp. Med., 178, 27-47, Hammer J et al., 1993, Cell, 74, 197-203 a Falk K et al., 1994, Immunogenetics, 39, 230-242). Poslední odkaz se také zabývá HLA-DQ a -DP ligandy. Všechny epitopy uvedené v těchto 5 odkazech jsou relevantní jako uvažované přírodní epitopy pro použití v předkládaném vynálezu, jakož i epitopy, které s nimi sdílejí společné motivy.

Alternativně epitopem může být každý syntetický epitop T lymfocytu, který je schopný vázat velkou část molekul MHC třídy II. V tomto kontextu „panpeptidy DR epitopu (PADRE) popsané ve WO 95/07707 a v odpovídajícím článku Alexander J et al., 1994, Immunity, 1, 751-761 (oba popisy jsou zahrnuty formou odkazu v tomto textu) jsou zajímavé uvažované epitopy pro použití podle předkládaného vynálezu. Je nutné poznamenat, že nejúčinnější peptidy PADRE popsané v těchto článcích nesou D-aminokyseliny na C-a N-koncích, aby se zlepšila stabilita při podávání. Ale předkládaný vynález primárně usiluje o zavedení relevantních epitopů jako části modifikovaného IL5. které by pak následně byly rozloženy enzymaticky v lyzozomech APC, aby se umožnila následná prezentace molekule MHC-II, a tudíž není prospěšné zavést D-aminokyseliny do epitopů použitých v předkládaném vynálezu.

Jeden obzvláště výhodný PADRE peptid je peptid mající aminokyselinovou sekvenci AKFVAAWTLKAAA (sekv. id. č. 65) nebo jeho imunologicky účinnou subsekvenci. Tento a další epitopy, kterým chybí stejná MHC restrikce, jsou výhodné epitopy T lymfocytu, které by měly být přítomny v analozích IL5 použitých ve vynálezeckém způsobu. Tyto super-všeobecné epitopy by umožnily nejjednodušší provedení vynálezu, kde pouze jeden jediný modifikovaný IL5 je předložen imunitnímu systému očkovaného zvířete.

• 4 44 44 44·· • · 4 4 4 4 ·

4 4 4 4 44· • 9 · 4 4 • 4 4 4 44 ·· *·· • 4 44 • 4 4 4

4 4 • ·4 • 44 •4 4444

Jak bylo uvedeno výše, modifikace IL5 může také zahrnout zavedení první skupiny, která cílí modifikovaný IL5 k APC nebo B lymfocytů. Například, první skupina může být specifický vazebný partner pro specifický povrchový antigen B lymfocytů nebo pro specifický povrchový antigen APC. V oboru je známo mnoho takových specifických povrchových antigenů. Například, skupina může být sacharid, pro který je receptor na B lymfocytů nebo na APC (např. mannan nebo mannóza) . Alternativně, druhá skupina může být hapten. Jako první skupina může být také použit protilátkový fragment, který specificky rozpoznává povrchovou molekulu na APC nebo lymfocytech (povrchové molekuly mohou např. Být FCy receptor makrofágů a monocytů, jako je například FCyRI nebo alternativně každý další specifický povrchový markér, jako je například CD40 nebo CTLA-4). Je nutné poznamenat, že všechny tyto příklady cílících molekul mohou být také použity jako část adjuvans, srovnej níže.

Jako alternativa nebo doplněk cílení modifikovaného IL5 polypeptidu k určitému buněčnému typu, aby se dosáhlo zesílené imunitní reakce, je možné zvýšit stupeň odpovídavosti imunitního systému zahrnutím výše uvedené druhé skupiny, která stimuluje imunitní systém. Typické příklady takových druhých skupin jsou cytokiny a proteiny tepelného šoku nebo molekulární chaperony, a také jejich účinné části.

Vhodné cytokiny pro použití podle vynálezu jsou ty, které normálně také působí jako adjuvancia ve vakcinačním přípravku, t j. například interferon y (IFN-y), Flt3L, interleukin 1 (IL-1), interleukin 2 (IL-2), interleukin 4 (IL-4), interleukin . 6 (IL-6), interleukin 12 (IL-12), interleukin 13 (IL-13) , interleukin 15 (IL-15). a faktor stimulující kolonie granulocytů a makrofágů (GM-CSF), alternativně, funkční část molekuly cytokinu může dostačovat > ··

A · A

A A

A A ···· • A

AAAA ·* ·Α » · A · · • · · A • A A A A · 4 • AAAA 1

BAAA AA AA AAA

A* AAAA jako druhá skupina. Co se týče použití těchto cytokinů jako adjuvancií, srovnej diskusi níže. Je nutné poznamenat, že použití obou IL-4 a IL-13 by mělo být prováděno velmi opatrně, jestli vůbec, protože obě molekuly jsou známy jako klíčové efektorové molekuly v patofyziologii atopie a astmatu.

Podle vynálezu mohou být vhodnými proteiny tepelného šoku nebo molekulární chaperony použitými jako druhá skupina HSP70, HSP90, HSC70, GRP94 (také známý jako gp96, srovnej Wearsch PA et al. 1998, Biochemistry, 37, 5709-19) a CRT (kalretikulin).

Alternativně může být druhá skupina toxin, jako je například listeriolycin (LLO), lipid A a tepelně labilní enterotoxin. Zajímavou možností je také celá řada mykobakteriálních derivátů, jako je například MDP (muramyldipeptid) a diestery trehalózy TDM a TDE.

Také možnost zavedení třetí skupiny, která zesiluje prezentaci modifikovaného IL5 imunitnímu systému, je důležité provedení vynálezu. V oboru bylo ukázáno několik příkladů tohoto principu. Například je známo, že palmitoylová lipidační kotva v proteinu OspA Borrelia burgdorferi může být použita tak, že poskytne autoadjuvační polypeptidy (srovnej např. WO 96/40718). Zdá se, že lipidované proteiny vytvářejí struktury podobné micelám s jádrem, které tvoří lipidační části kotvy polypeptidů a zbylé části molekuly z nich vyčnívají, což má za následek mnohonásobnou prezentaci antigenních determinant. Tudíž použití tohoto a příbuzných postupů s použitím různých lipidačních kotev (např. myristylové skupiny, farnesylové skupin, geranyl-geranylové skupiny, GPI-kotvy a N-acylové skupiny diglyceridu) jsou výhodná provedení vynálezu, obzvláště proto že poskytnutí této lipidační kotvy v rekombinantně vytvořeném proteinu je • 4 ··*♦

4 • · · · • 4 4 ·

4 · • 4 ·

4 4 •44· ·« ·· ·4· • 9 44 ♦ 4 4 4 • 4 4 · ·

4 9

4* ·494 zcela jasné a vyžaduje pouze použití např. Přirozeně se vyskytující signální sekvence jako fúzního partnera pro modifikovaný IL5 polypeptid. Další možností je použití C3d fragmentu faktoru komplementu C3 nebo samotného C3 (srovnej Dempsey et al., 1996, Science, 271, 348-350 a Lou & Kohler,

1998, Nátuře Biotechnologi, 16, 458-462).

za

2) je

Alternativní provedení vynálezu, které má také následek výhodnou prezentaci mnohočetných (např. alespoň kopií důležitých epitopových úseků IL5 imunitnímu systému, kovalentní nebo nekovalentní vazba IL5. jeho subsekvence nebo variant k molekulám určitých nosičů. mohou být použity například polymery, např. Sacharidy, jako je například dextran (srovnej např. Lees A et al., 1994, Vaccine, 12, 1160-1166, Lees A et al., 1990, J Imunol., 145, 3594-3600), ale použitelné alternativy jsou také mannóza a mannan. Úplné membránové proteiny např. Z E. coli a dalších bakterií jsou také použitelní konjugační partneři. Tradiční nosičské molekuly, jako je například hemokyanin z mořské přílipky (KLH) , tetanický toxoid, difterický toxoid a albumin bovinního séra (BSA) jsou také výhodní a použitelní konjugační partneři.

Má se za to, že určité oblasti nativního IL5 jsou obzvláště vhodné pro tvoření modifikací. Předpovídá se, že modifikace v alespoň jedné kličce 1 až 3 nebo v aminokyselinových zbytcích C-koncové části helixů D (uvedené kličky a uvedený helix D odpovídají těm ukázaným na obr. 3 pro humánní a myší IL5) budou s největší pravděpodobností vytvářet požadované konstrukty a vakcinační výsledky. Důvody pro tyto vybrané úseky jsou a) konzervace známých a predikovaných epitopů B lymfocytu, b) konzervace terciární a kvartérní struktury apod., srovnej také diskusi v úvodu k příkladům. V každém případě, jak je diskutováno výše, je • 9 ·· ♦ · ♦ * « ♦ * * · * • · · «· ··*· ·» «» ·♦ ·»»· » · » » » · · • « · · · ··· »» ··· · ·» • » » « · · ·«·· ·· ·· ··· zcela snadné provádět screening a nastavení modifikovaných IL5 molekul, které byly všechny podrobeny zavedení epitopů T lymfocytu v různých polohách.

Protože nej výhodnější provedení předkládaného vynálezu se týkají down-regulace humánního IL5. je proto výhodné, že IL5 polypeptid diskutovaný výše je humánní IL5 polypeptid. V tomto provedení, je obzvláště výhodné, že humánní IL5 polypeptid byl modifikován substitucí alespoň jedné aminokyselinové sekvence v sekv. id. č. 1 alespoň jednou aminokyselinovou sekvencí stejné nebo odlišné délky a obsahující cizorodý T_H epitop, kde substituované aminokyselinové zbytky jsou vybrány ze skupiny, kterou tvoří zbytky 87 až 90, zbytky 32 až 43, zbytky 59 až 64, zbytky 86 až 91 a zbytky 110 až 113. Zdůvodnění těchto konstruktů je detailně diskutováno v příkladech.

Formulace IL5 a modifikovaných IL5 polypeptidů

Při prezentaci IL5 polypeptidu nebo modifikovaného IL5 polypeptidu imunitnímu systému zvířete jeho podáváním zvířeti, formulace polypeptidu sleduje principy v oboru obecně přijímané.

Přípravě vakcín, které obsahují peptidové sekvence jako účinné složky, se v oboru obecně dobře rozumí, jak doloženo příklady z patentů Spojených Států č. 4 608 251, 4 601 903, 4 599 231, 4 599 230, 4 596 792 a 4 578 770, všechny zahrnuty formou odkazu v tomto textu. Typicky jsou takové vakcíny připraveny jako injikovatelné, buď jako tekuté roztoky nebo suspenze, mohou také být připraveny pevné formy vhodné pro vytvoření roztoku nebo suspenze v tekutině před injekcí. Přípravek může být také emulgován. Aktivní imunogenní složka je často smíchána s excipienty, které jsou farmaceuticky

·« ·· ♦ © © © © © · «© ··©· přijatelné a kompatibilní s účinnou složkou. Vhodnými excipienty jsou například voda, fyziologický roztok, dextróza, glycerol, ethanol apod. a jejich kombinace. Kromě toho, je-li žádoucí, vakcína může obsahovat menší množství pomocných látek, jako jsou například smáčedla nebo emulgátory, pH pufry nebo adjuvancia, která zesilují účinnost vakcín, srovnej detailní diskusi o adjuvanciích níže.

Vakcíny jsou obvykle podávány parenterálně injekcí, například buď subkutánně, intrakutánně, intradermálně, subdermálně nebo intramuskulárně. Další formulace, které jsou vhodné pro další způsoby podávání obsahují čípky a v některých případech formulace pro perorální, bukální, sublingvální, intraperitoneální, intravaginální, anální, epidurální, spinální a intrakraniální podávání. Co se týče čípků, mohou obsahovat tradiční pojivá a nosiče například polyalkalenglykoly nebo triglyceridy, takové čípky mohou být vytvořeny ze směsí obsahujících účinnou složku v rozmezí 0,5 % až 10 %, výhodně 1 až 2 %. Perorální formulace obsahují normálně používané excipienty, jako jsou například mannit, laktóza, škrob, stearát horečnatý, sacharin sodný, celulóza, uhličitan hořečnatý apod. Farmaceutického stupně čistoty. Tyto přípravky mají formy, jako jsou roztoky, suspenze, tablety, pilulky, tobolky, formulace nebo prášky s prodlouženým uvolňováním a obsahují 10 až 95 % účinné složky, výhodně 25 až 70 %. Co se týče perorálních formulací, toxin cholery je zajímavý formulační partner (a také možný konjugační partner).

Polypeptidy mohou být formulovány do vakcíny jako neutrální formy nebo soli. Farmaceuticky přijatelné soli zahrnují kyselé adiční soli (vytvořené s volnými aminoskupinami peptidů) a které jsou tvořeny s anorganickými kyselinami, jako je například chlorovodíková nebo fosforečná • 4 ·« 4

4 4 • 4

9999 99 ·999 •

4 4 4 4 • 4 4

4 4

49·

4 • 4 • « ·

► 4444 kyselina, nebo takovými organickými kyselinami, jako je octová, oxalová, vinná, s volnými karboxylovými mandlová apod. skupinami mohou z anorganických baží, jako je například sodík, amonium, vápník nebo hydroxid železitý, a

Soli vytvořené také pocházet draslík, takových organických baží, jako je isopropylamin, 2-ethylaminoethanol, histidin, prokain apod.

trimethylamin,

Vakcíny jsou podávány způsobem kompatibilním s lékovou formulací a v takovém množství, jaké je terapeuticky účinné a imunogenní. Podávané množství závisí na léčeném pacientovi, včetně např. Kapacity imunitního systému jednotlivce vyvinout imunitní reakci a stupni požadované protekce. Vhodné rozmezí dávka je řádově několik set mikrogramů účinné složky na vakcinaci s výhodným rozmezím přibližně od 0,1 pg do 2000 pg (třebaže vyšší množství v rozmezí 1 až 10 mg jsou také předpokládána), jako je například v rozmezí přibližně od 0,5 pg k 1000 pg, výhodně v rozmezí od 1 pg do 500 pg a obzvláště v rozmezí přibližně od 10 pg do 100 pg. Vhodné režimy pro počáteční podávání a upomínací dávky jsou také variabilní, ale je pro ně typické počáteční podávání následované dodatečnými inokulacemi nebo dalším podáváním.

Způsob aplikace se může široce odlišovat. Je použitelná každá obvyklá metoda pro podávání vakcíny. Tyto metody zahrnují perorální aplikaci na pevné fyziologicky přijatelné bázi nebo ve fyziologicky přijatelné disperzi parenterálně, injekcí nebo podobně. Dávka vakcíny závisí na způsobu podávání a mění se podle věku očkované osoby a formulace antigenu.

Některé polypeptidy vakcíny jsou dostatečně imunogenní ve vakcíně, ale pro jiné další bude imunitní reakce zesílena, jestliže vakcína dále obsahuje adjuvans.

φ φ * φ φ φφφ φ φ φ φ φ φ φφ φφφ φ

φ φ φ φ φ φ φ φφφ φφφφ φφ

Φ· φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ

φ φ

φφφφ

Jsou známy různé metody, jak pro vakcínu dosáhnout adjuvantní účinek. Obecné principy a metody jsou detailně uvedeny v The Theory and Practical Application of Adjuvants, 1995, Duncan E.S. Stewart-Tull (vyd.), John Wiley & Sons Ltd, ISBN 0-471-95170-6, a také v Vaccines: New Generation Imunological Adjuvants, 1995, Gregoriadis G et al. (vyd.), Plenům Press, New York, ISBN 0-306-45283-9, obě publikace jsou tímto zahrnuty formou odkazu v tomto textu.

Je obzvláště výhodné použít adjuvans, u kterého může být prokázáno, že usnadňuje únik autotoleranci k autoantigenům, to je ve skutečnosti esenciální v případech, kdy je použit jako účinná složka autovakcíny nemodifikovaný IL5. Neomezující příklady vhodných adjuvancií jsou vybrány ze skupiny, kterou tvoří imunitně cílící adjuvans, imunitně modulující adjuvans, jako je například toxin, cytokin a mykobakteriální derivát, olejový přípravek, polymer, adjuvans tvořící micely, saponin, imunostimulační komplexní matrix (ISCOM matrix), částice, DDA, hlinitá adjuvancia, DNA adjuvancia, y-inulin a opouzdřovací adjuvans. Obecně je nutné poznamenat, že výše uvedené popisy, které se týkají sloučenin a přípravků použitelných jako první, druhá a třetí skupina v analozích, se také týkají mutatis mutandis jejich použití v adjuvans vakcíny podle vynálezu.

Aplikace adjuvancií zahrnuje použití činidel, jako je například hydroxid nebo fosfát hlinitý (alum), obecně používaných jako 0,05 až 0,1 procentní roztok v pufrovaném fyziologickém roztoku, směs se syntetickými polymery sacharidů (např. Carbopol®) používanou jako 0,25 procentní roztok, agregaci proteinu ve vakcíně zahříváním při teplotách v rozmezí od 70 °C do 101°C po dobu 30 sekund až 2 minuty, v daném pořadí, a je také možná agregace prostřednictvím zkříženě vázajících činidel. Může také být použita agregace ·· ·· ·♦ ··*♦ ·· ·· ···· · · · · · 0 · • · · · * ··· · · · · · « · · · · · *»»· »« 99 «9· 99 9999 reaktivací s pepsinem ošetřenými protilátkami (Fab fragmenty) k albuminu, směsí bakteriálních buněk, jako je například C. Parvum nebo endotoxiny nebo lipopolysaccharidovými složkami gramnegativních bakterií, emulzí ve fyziologicky přijatelném oleji vehikula, jako je například mono-oleát manitu. (Aracel A) nebo emulze s 20 procentním roztokem perfluorovaných uhlovodíků (Fluosol-DA) použitým jako bloková substituce. Je také výhodná směs s oleji, jako je například skvalen a IFA.

Podle vynálezu DDA (dimethyldioktadecylamoniumbromid) je zajímavý kandidát adjuvans, jako je DNA a γ-inulin, ale také Freundovo kompletní a nekompletní adjuvans, a také saponiny z quillaja, jako je například QuilA a QS21, jsou zajímavá, jako je RIBI. Další možností jsou monofosforyllipid A (MPL), výše uvedené C3 a C3d a muramyldipeptid (MDP).

Je také známo, že lipozomové formulace mohou propůjčit adjuvantní účinky, a tudíž podle vynálezu jsou výhodná lipozomová adjuvancia.

Také adjuvancia typu imunostimulační komplexní matrix (ISCOM® matrix) jsou výhodným výběrem podle vynálezu, obzvláště protože bylo ukázáno, že tento typ adjuvans je schopen up-regulace (zvýšení počtu receptorů) exprese APC MHC třídy II. matrix ISCOM© se skládá z (volitelně

frakcionovaných)	saponinů	(triterpenoidů)	z	Quillaja
saponaría,	cholesterolu a	fosfolipidu. Když	je	přimíšen
imunogenní	protein,	výsledná	částicová formulace	je	to, co je
známo jako	ISCOM	částice,	kde saponin tvoří	60	až 70 %

(hmotnostních), cholesterol a fosfolipid 10 až 15 % (hmotnostních) a protein 10 až 15 % (hmotnostních). Detaily týkající se přípravku a použití imunostimulačních komplexů mohou být zjištěny např. Ve výše uvedených příručkách zabývajících se adjuvancii, ale také práci Morein B et al., 1995, Clin. Imunother., 3, 461-475, a také Barr IG a Mitchell ·>· · Φ • *

ΦΦΦ «« 44 • 4 φ 4 • · 4 • 4 4 • · ·

4·· · »4 ♦ · Φ

4· ΦΦΦ

44 • Φ · Φ • 4 Φ

Φ 4 4 4 • 44

44Φ4

GF, 1996, Imunol. and Cell Biol., 74, 8-25 (oba zahrnuty formou odkazu v tomto textu) poskytují použitelné instrukce pro přípravu kompletních imunostimulačních komplexů.

Další vysoce zajímavá (a tedy výhodná) možnost dosažení adjuvantního účinku je použití techniky popsané v práci Gosselin et al., 1992 (která je tímto zahrnuta formou odkazu v tomto textu). Stručně, prezentace relevantního antigenu, jako je například antigen podle předkládaného vynálezu, může být zesílena konjugací antigenu k protilátkám (nebo fragmentům vázajícím antigen) proti Fcy monocytech/makrofázích. Bylo prokázáno, že protilátkovým receptorům na zejména konjugáty mezi antigenem a anti-Fcyf imunogeničnost pro účely očkování.

zesiiuii

Další možnosti se týkají použití cílících a imunomodulačních látek (i.a. cytokinů) uvedených výše jako uvažovaných látek pro první a druhé skupiny v modifikovaných verzích IL5. V tomto spojení jsou možností také syntetické induktory cytokinů, jako jsou póly I:C.

Vhodné mykobakteriální deriváty jsou vybrány ze skupiny, kterou tvoří muramyldipeptid, kompletní Freundovo adjuvans, RIBI a diester trehalózy, jako je například TDM a TDE.

Vhodná imunitně cílící adjuvancia jsou vybrána ze skupiny, kterou tvoří CD40 ligand a CD40 protilátky nebo její specifické vazebné fragmenty (srovnej diskusi výše), mannóza, Fab fragment a CTLA-4.

Vhodný polymerová adjuvancia jsou vybrána ze skupiny, kterou tvoří sacharid, jako je například dextran, PEG, škrob, mannan a mannóza, plastický polymer jako takový a latex jako jsou například latexové perličky.

Ještě další zajímavý způsob modulace imunitní reakce je zahrnutí IL5 imunogenu (volitelně dohromady s adjuvancii a *« ·· 99 ·«»«»· ·« »· • · » · 9 9 9 9 9 9 9 • ♦ » · · · ·· 9 · ·

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

9999 99 99 999 99 9999 farmaceutickypřijatelnými nosiči a vehikuly) do virtuální lymfatické uzliny (VLN) (patentované léčebné zařízení vyvinuté firmou ImunoTherapy, lne., 360 Lexington Avenue, New York, NY 10017-6501). VLN (tenké tubulární zařízení) napodobuje strukturu a funkci lymfatické uzliny. Vložení VLN do kůže vytvoří místo sterilního zánětu s náhlým vzestupem koncentrace cytokinů a chemokinů. T a B lymfocyty, jakož i APC rychle odpovídají na signalizaci nebezpečí, míří do zánětlivého místa a akumulují se v porézní matrix VLN. Bylo ukázáno, že dávka antigenu nutná pro vyvolání imunitní reakce na antigen je redukována při použití VLN a že imunitní protekce získaná vakcinací s použitím VLN předčí obvyklou imunizaci s použitím Ribi jako adjuvans. Technologie je i.a. Stručně popsána v práci Gelber C et al., 1998, Elicitation of Robust Cellular and Humoral Immune Responses to Smáli Amounts of Immunogens Using A Novel Medical Device Designated the Virtual Lymph Node, v: From the Laboratory to the Clinic, Book of Abstracts, 12.-15. říjen 1998, Seascape Resort, Aptos, California.

Očekává se, že vakcína by byla podávána alespoň jednou, jako je například alespoň 1, 2, 3, 4, 5, 6a 12 krát ročně. Konkrétněji se očekává podávání jedinci, který to potřebuje, 1 až 12 krát ročně, jako je například 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 nebo 12 krát ročně. Již dříve bylo ukázáno, že paměťová imunita indukovaná použitím výhodných autovakcín podle vynálezu není permanentní a proto imunitní systém potřebuje být periodicky podněcován analogy.

Díky genetickým odchylkám mohou různí jedinci reagovat imunitními reakcemi odlišné síly na stejný polypeptid. Tedy vakcína podle vynálezu může obsahovat několik odlišných polypeptidů, aby se zvýšila imunitní reakce, srovnej také diskusi výše týkající se výběru cizorodého epitopu T

44

4 4 4 4 · 4 4

4* 4*4« • · • ··♦

44

4 4 4

4 4 »44

444 44 4444 lymfocytů pro zavedení. Vakcína může obsahovat dva nebo více polypeptidy, přičemž všechny polypeptidy jsou, jak je definováno výše.

Vakcína může dále obsahovat 3 až 20 odlišných modifikovaných nebo nemodifikovaných polypeptidů, jako například 3 až 10 odlišných polypeptidů. Ale normálně hledaný počet polypeptidů bude udržován na minimu, jako například 1 nebo 2 polypeptidy.

Očkování nukleovou kyselinou

Jako alternativa ke klasickému podávání vakcíny založené na peptidů nabízí technologie vakcinace nukleovou kyselinou (také známa jako imunizace nukleovou kyselinou, genetická imunizace a genová imunizace) velký počet přitažlivých vlastností.

Za prvé, na rozdíl od postupu s tradiční vakcínou, vakcinace nukleovou kyselinou nevyžaduje zdroje spotřebovávající produkci imunogenního agens ve velkém měřítku (např. Ve formě průmyslové fermentace mikroorganizmů produkujících modifikovaný IL5). Kromě toho není zapotřebí přístrojová purifikace a schémata skládání (refolding) imunogenu. A nakonec, protože vakcinace nukleovou kyselinou spoléhá na biochemický aparát očkovaného jedince pro vytváření expresního produktu zavedené nukleové kyseliny, očekává se, že nastane optimální posttranslační zpracování expresního produktu, což je v případě autovakcinace obzvláště důležité, protože, jak bylo uvedeno výše, může být zachována významná frakce původních IL5 epitopů B lymfocytů v modifikované molekule, a protože epitopy B principu mohou být tvořeny částí kterékoliv (např. Sacharid, lipid, protein apod.) lymfocytů v (bio)molekuly Tudíž, nativní ·· *· ···♦ ·· • · · · · · · · · · · • · · · · ·«· 9 · · ·«**·· 9 9 « · · « · · * 9 9 9 9 9

9999 99 »· ··· 99 9999 glykosylace a typy lipidace imunogenu mohou být velmi dobře důležité pro celkovou imunogeničnost, a očekává se, že je to zajištěno tím, že imunogen je produkován hostitelem.

Proto výhodné provedení vynálezu obsahuje prezentaci modifikovaného IL5 imunitnímu systému zavedením nukleové kyseliny(kyselin) kódující modifikovaný IL5 do buněk zvířete, a tím získání in vivo exprese zavedené nukleové kyseliny(kyselin) buňkami.

V tomto provedení je zavedená nukleová kyselina výhodně DNA, která může být ve formě nahé DNA, DNA formulované s nabitými nebo nenabitými lipidy, DNA formulované v lipozomech, DNA obsažené ve virovém vektoru, DNA formulované s proteinem nebo polypeptidem usnadňujícím transfekci, DNA formulované s cílícím proteinem nebo polypeptidem, DNA formulované s vápníkovými precipitačními činidly, DNA kondenzované k molekule inertního nosiče, DNA opouzdřené v polymeru, např. V PLGA (srovnej mikroopouzdřovací technologii popsanou ve WO 98/31398) nebo v chitinu či chitosanu a DNA formulované s adjuvans. V tomto kontextu je nutné poznamenat, že prakticky všechny důvody týkající se použití adjuvancií v tradiční vakcinační formulaci lze aplikovat pro formulace DNA vakcín. Proto tedy všechny popisy v tomto textu, které se týkají použití adjuvancií v kontextu vakcín založených na polypeptidech lze aplikovat mutatis mutandis na jejich použití v technologii vakcinace nukleovou kyselinou.

Co se týče způsobů podávání a aplikačních schémat vakcín založených na polypeptidech, které byly detailně popsány výše, jsou také použitelné pro vakcíny s nukleovou kyselinou podle vynálezu a všech diskuse uvedené výše týkající se způsobů podávání a aplikačních schémat pro polypeptidy lze aplikovat mutatis mutandis na nukleové kyseliny. Mělo by být

ΦΦΦ φ φ φφφ φ φ φ φ φ φ φ · · «φφφ φ φφφ φφ φ φφφ • ΦΦΦ Φ· φφ φφφ φφ φφφφ přidáno, že vakcíny s nukleovou kyselinou mohou být vhodně podávány intravenózně a intraarteriálně. Kromě toho je v oboru známo, že vakcíny s nukleovou kyselinou mohou být podávány s použitím takzvané „genové pistole (biobalistické metody), a tudíž také tento a ekvivalentní způsoby podávání j sou považovány za část předkládaného vynálezu. Konečně bylo také publikováno použití VLN pro podávání nukleových kyselin za vzniku dobrých výsledků, a proto je tento konkrétní způsob podávání zejména výhodný.

Kromě toho nukleová kyselina(kyseliny) použitá jako imunizační agens může obsahovat úseky kódující první, druhou a/nebo třetí skupinu, např. Ve formě imunomodulační látky popsané výše, jako jsou například cytokiny diskutované jako použitelná adjuvancia. Výhodná verze tohoto provedení zahrnuje kódující úsek analogu a kódující úsek imunomodulátoru v odlišných čtecích rámcích nebo alespoň pod kontrolou různých promotorů. Tímto se zabrání tomu, že analog nebo epitop je vytvořen jako fúzní partner k imunomodulátoru. Alternativně, mohou být použity dva rozdílné nukleotidové fragmenty, ale to je méně výhodné oproti výhodě zajištěné koexprese, když jsou oba kódující úseky zahrnuty v téže molekule.

V souladu s tím se vynález také týká přípravku pro indukci produkce protilátek proti IL5. Přípravek obsahuje fragment nukleové kyseliny nebo vektor podle vynálezu (srovnej diskusi o vektorech níže) a

- farmaceuticky a imunologicky přijatelné vehikulum a/nebo nosič a/nebo adjuvans, jak bylo diskutováno výše.

Za normálních okolností je nukleová kyselina kódující

IL5 variantu zavedena ve formě vektoru, přičemž exprese je pod kontrolou virového promotoru. Pro detailnější diskusi o • · · · · · • · · · · · · vektorech a DNA fragmentech podle vynálezu srovnej diskusi níže. Jsou také k dispozici detailní popisy týkající se formulace a použití vakcín s nukleovou kyselinou, srovnej Donnelly JJ et al, 1997, Annu. Rev. Imunol., 15, 617-648 a

Donnelly JJ et al., 1997, Life Sciences, 60, 163-172. Oba tyto odkazy jsou zahrnuty formou odkazu v tomto textu.

Živé vakcíny

Třetí alternativa pro prezentaci modifikovaného IL5 imunitnímu systému je použití technologie živé vakcíny. Při živém očkování je prezentace imunitnímu systému je prováděna podáváním zvířeti nepatogenních mikroorganizmů, které byly transformovány fragmentem nukleové kyseliny kódujícím modifikovaný IL5 nebo vektorem zavádějícím tento fragment nukleové kyseliny. Nepatogenní mikroorganizmus může být kterýkoliv vhodný oslabený bakteriální kmen (oslabbený pasáží nebo pomocí odstranění patogenních expresních produktů technologií rekombínantní DNA), např. Mycobakterie bovis BCG, nepatogenní Streptococcus spp., E. coli, Salmonella spp., Vibrio cholerae, Shigella, apod. Přehledy týkající se přípravy živých vakcín podle současného stavu techniky lze nalézt např. v publikacích Saliou P, 1995, Rev. Prát., 45, 1492-1496 a Walker PD, 1992, Vaccine, 10, 977-990, oba zahrnuty formou odkazu v tomto textu. Pro detaily o fragmentech nukleové kyseliny a vektorech použitých v těchto živých vakcínách srovnej diskusi níže.

Jako alternativa živých bakteriálních vakcín, fragment nukleové kyseliny podle vynálezu diskutovaný níže může být zaveden do nevirulentního virového vakcinačního vektoru, jako je například kmen vakcinie nebo kterýkoliv další vhodný virus neštovic.

• · • · ···· · · · · ··· · · · · · · · · ··· ·· · ··· ···· ·· ·· ··· ·· ····

Normálně je nepatogenní mikroorganizmus nebo virus podáván zvířeti pouze jednou, ale v určitých případech může být nutné podávat v průběhu života mikroorganizmus více než jednou, aby byla udržována protektivní imunita. Dokonce se předpokládá, že imunizační schémata, jako jsou ta uvedena detailně výše pro vakcinaci polypeptidem, budou použitelná při použití živé nebo virové vakcíny.

Alternativně, živá nebo virová vakcinace je spojena s předešlou nebo následnou vakcinací polypeptidem a/nebo nukleovou kyselinou. Například je možné provádět primární imunizaci živou nebo virovou vakcínou, po které následuje posilovači imunizace s použitím postupu s polypeptidem nebo nukleovou kyselinou.

Mikroorganizmus nebo virus může být transformován nukleovou kyselinou(kyselinami) obsahující úseky kódující první, druhou a/nebo třetí skupinu, např. Ve formě imunomodulační látky popsané výše, jako jsou například cytokiny diskutované jako použitelná adjuvancia. Výhodná verze tohoto provedení zahrnuje kódující úsek analogu a kódující úsek imunomodulátoru v odlišných čtecích rámcích nebo alespoň pod kontrolou různých promotorů. Tímto se zabrání tomu, že analog nebo epitopy jsou vytvořeny jako fúzní partnery k imunomodulátoru. Alternativně, mohou být použity dva rozdílné nukleotidové fragmenty jako transformační přípravky. Ovšem když je první a/nebo druhá a/nebo třetí skupina ve stejném čtecím rámci, mohou poskytnout expresní produkt, analog podle vynálezu, a takové provedení je obzvláště výhodné podle předkládaného vynálezu.

Použití způsobu podle vynálezu při léčení nemocí

Jak je zřejmé z diskusí uvedených výše, způsobu podle vynálezu umožňuje kontrolu charakterizovaných eosinofilií. V tomto kontextu je klíčovým cílem vynálezeckého způsobu astma, ale také další chronické alergické stavy, jako například mnohočetná alergie a alergická rhinitis, jsou vhodný cíle pro léčení/zmírnění příznaků. Proto důležité provedení způsobu podle vynálezu down-regulace IL5 aktivity obsahuje léčbu a/nebo prevenci a/nebo zmírnění příznaků astmatu nebo dalších chronických alergických stavů charakterizovaných eosinofilií, tento způsob obsahuje down-regulaci IL5 aktivity podle způsobu podle vynálezu do takové míry, že počet významně redukován.

poskytnutí onemocnění eosinofilů je

V daném kontextu je taková významná redukce počtu eosinofilů alespoň 20% srovnání s počtem eosinofilů před léčením, ale předpokládají se vyšší procenta, jako je například alespoň 30 %, alespoň 40 60 %, alespoň 70 %, alespoň 80 %

Redukce může být systémová nebo častěji lokální, V plicích.

%, alespoň 50 %, alespoň a dokonce alespoň 90 %.

nap ř.

Počty eosinofilů jsou zjišťovány metodami v oboru známými, typicky s použitím mikroskopického vyšetření vhodného vzorku (jako je například tekutina z BAL) a počítání počtu eosinofilů manuálně v mikroskopu. Alternativně může být počet eosinofilů počítán s použitím metody průtokové cytometrie nebo jakékoliv jiné vhodné cytometrické metody schopné odlišit eosinofily.

• 4 ·· ·· ···· ·· 44 • 4 4 4 444 4444

4 4 4444 4 4 4

444 44 4 444 ·44· 44 44 4·4 4· 4444

Peptidy, polypeptidy a přípravky podle vynálezu

Jak je zjevné z výše uvedeného, předkládaný vynález je založen na myšlence imunizace jedinců proti IL5 antigenu, aby se nepřímo dosáhlo redukce počtu eosinofilů. Výhodný způsob, jak dosáhnout této imunizace je použití modifikovaných verzí IL5. a takto poskytnout molekuly, které doposud nebyly v oboru popsány.

Má se za to, že modifikované IL5 molekuly diskutované v tomto textu jsou hlavním předmětem vynálezu, a tudíž důležitá část vynálezu se týká IL5 analogu, který pochází ze zvířecího IL5. přičemž je zavedena modifikace, která má za následek to, že imunizace zvířete analogem indukuje produkci protilátek zkříženě reagujících s nemodifikovaným IL5 polypeptidem. Výhodně je povaha modifikace přizpůsobena typům modifikací popsaných výše při diskusi o různých provedeních způsobu podle vynálezu při použitím modifikovaného IL5. Proto každý popis předložený v tomto textu týkající se modifikované IL5 molekuly je relevantní pro účel popsání analogů IL5 podle vynálezu a každý takový popis lze aplikovat mutatis mutandis pro popis těchto analogů.

Je nutné poznamenat, že výhodné modifikované IL5 molekuly obsahují modifikace, které mají za následek polypeptid mající sekvence identické alespoň ze 70 % s IL5 nebo s jeho subsekvencí dlouhou alespoň 10 aminokyselin. Jsou výhodné sekvence více identické, např. alespoň ze 75 % nebo dokonce alespoň z 80 % nebo z 85 %. Identita sekvencí pro proteiny a nukleové kyseliny může být vypočtena jako (N_ref Ndifl * 100/Nrefr kde N_dif je celkový počet neidentických zbytků ve dvou sekvencích při porovnávání a kde N_ref je počet zbytků v jedné sekvenci. Proto DNA sekvence AGTCAGTC má sekvenci identickou ze 75 % se sekvence AATCAATC (N_dif -2 a N_ref = 8) .

• ·· · • · • · · ·

Vynález se také týká přípravků použitelných při provádění způsobu podle vynálezu. Proto se vynález také týká imunogenního přípravku obsahujícího imunogenně účinné množství IL5 polypeptidu, který je autoprotein pro zvíře, uvedený IL5 polypeptid je formulován společně s imunologicky přijatelným adjuvans tak, aby se dosáhlo úniku autotoleranci zvířete na IL5 polypeptid, přípravek dále obsahuje farmaceuticky a imunologicky přijatelné vehikulum a/nebo nosič. Jinými slovy, tato část vynálezu se týká formulace přirozeně se vyskytujících IL5 polypeptidů, které byly popsány ve spojení s provedeními způsobu podle vynálezu.

Vynález se také týká imunogenního přípravku obsahujícího imunologicky účinné množství IL5 analogu definovaného výše, uvedený přípravek dále obsahující farmaceuticky a imunologicky přijatelné ředidlo a/nebo vehikulem a/nebo nosič a/nebo excipient a volitelně adjuvans. Jinými slovy, tato část vynálezu se týká formulace modifikovaného IL5 v podstatě tak, jak bylo popsáno v tomto textu výše. Výběr adjuvancií, nosičů a vehikul je v souladu s tím, co bylo diskutováno výše při odkazech na formulace modifikovaného a nemodifikovaného IL5 pro použití ve vynálezeckém způsobu down-regulace IL5.

Polypeptidy jsou připraven podle metod v oboru známých. Delší polypeptidy jsou normálně připravovány pomocí rekombinantní genové technologie včetně zavedení sekvence nukleové kyseliny kódující IL5 analog do vhodného vektoru, transformace vhodné hostitelské buňky vektorem, exprese sekvence nukleové kyseliny, opětného získání expresního produktu z hostitelských buněk nebo jejich tkáňového supernatantu a následné purifikace a volitelné další modifikace, např. opětného skládání nebo derivatizace.

Kratší peptidy jsou výhodně připraveny pomocí známých technik syntézy peptidu na pevné nebo tekuté fázi. Ale • · ·· ···· nedávné pokroky této technologie poskytly možnost produkce kompletních polypeptidů a proteinů těmito prostředky, a tudíž je také v rozsahu předkládaného vynálezu připravit dlouhé konstrukty syntetickými prostředky.

Fragmenty nukleove kyseliny a vektory podle vynálezu

Z výše uvedeného popisu se uznává, že modifikované IL5 polypeptidy mohou být. připraveny prostředky rekombinantní genové technologie, ale také prostředky chemické syntézy nebo semisyntézy: tyto dvě druhé uvedené možnosti jsou obzvláště spočívá v kondenzaci například KLH, difterický a neproteinovým molekulám, polymery a ovšem také, když postranních řetězců nebo řetězci pocházejícímu z IL5 relevantní, když modifikace k proteinovým nosičům (jako je toxoid, tetanický toxoid a BSA) jako jsou například sacharidové modifikace zahrnuje adici postranních skupin k peptidovému polypeptidu.

Pro účely rekombinantní genové technologie a ovšem také pro účely imunizace nukleovou kyselinou jsou fragmenty nukleové kyseliny kódující modifikovaný IL5 důležité chemické produkty. Proto se důležitá část vynálezu týká fragmentu nukleové kyseliny, který kóduje IL5 analog, t j . Polypeptid pocházející z IL5. který obsahuje buď přírodní IL5 sekvenci, ke které byl přidán nebo vložen fúzní partner nebo výhodně polypeptid pocházející z IL5. do kterého byl zaveden cizorodý epitop T lymfocytu pomocí inzerce a/nebo adice, výhodně pomocí substituce a/nebo delece. Fragmenty nukleové kyseliny podle vynálezu jsou buď DNA nebo RNA fragmenty.

Fragmenty nukleové kyseliny podle vynálezu jsou normálně vloženy do vhodných vektorů za vzniku klonovacích nebo expresních vektorů nesoucích fragmenty nukleové kyseliny ·· ·· ·· ···· 44 44 • 4 4 · 444 « · · 4

4 4 4 · 4 4 « 4 4

444 44 4 444

4444 44 44 444 «4 4444 podle vynálezu, tyto nové vektory jsou také částí vynálezu. Detaily týkající se konstrukce těchto vektorů podle vynálezu budou diskutovány v kontextu transformovaných buněk a mikroorganizmů níže. Vektory mohou být, v závislosti na účelu a typu aplikace, ve formě plazmidů, fágů, kosmidů, minichromozomů nebo viru, ale také nahá DNA, která je exprimována pouze přechodně v určitých buňkách, je důležitý vektor. Výhodné klonovací a expresní vektory podle vynálezu jsou schopné autonomní replikace, a tím umožní vysoké počty kopií pro účely vysokého stupně exprese nebo vysokého stupně replikace pro následné klonování.

Obecný profil vektoru podle vynálezu obsahuje následující charakteristické rysy ve směru 5'- 3' a v operativní vazbě: promotor pro řízení exprese fragmentu nukleové kyseliny podle vynálezu, volitelně sekvenci nukleové kyseliny kódující vedoucí peptid umožňující sekreci (do extracelulárního prostoru nebo, kde použitelné, do periplazmy) nebo integraci polypeptidového fragmentu do membrány, fragment nukleové kyseliny podle vynálezu a volitelně sekvenci nukleové kyseliny kódující terminátor. Při zacházení s expresními vektory v producentských kmenech nebo buněčných liniích je pro účely genetické stability transformované buňky výhodné, když je vektor po zavedení do hostitelské buňky integrován do genomu hostitelské buňky. Na rozdíl od toho při zacházení s vektory, které budou použity pro provádění in vivo exprese ve zvířeti (tj. Při použití vektoru pro DNA očkování) je z bezpečnostních důvodů výhodné, když vektor není schopen integrace do genomu hostitelské buňky, typicky jsou použity nahá DNA nebo neintegrující virové vektory, jejichž výběr je odborníkovi znám.

Vektory podle vynálezu jsou použity pro transformaci hostitelských buněk, aby tvořily modifikovaný IL5 polypeptid ·· ·· φφ ···· ·· φφ φφφφ φφφ φφφφ • ΦΦ · ♦ ··· φφ φ φφφ φφ φ φφφ φφφφ φφ φφ Φ·Φ ·Φ φφφφ podle vynálezu. Tyto transformované buňky, které jsou také částí vynálezu, mohou být pěstované buňky nebo buněčné linie použité pro propagaci fragmentů nukleové kyseliny a vektorů podle vynálezu nebo použité pro rekombinantní produkci modifikovaných IL5 polypeptidů podle vynálezu. Alternativně transformované buňky mohou být vhodné kmeny pro živou vakcínu, kam fragmenty nukleové kyseliny (jedna jediná nebo mnohočetné kopie) byly vložen tak, aby se provedla sekrece nebo integrace do bakteriální membrány nebo buněčné stěny modifikovaného IL5.

Výhodné transformované buňky podle vynálezu jsou mikroorganizmy, jako jsou například bakterie (jako je například druh Escherichia [např. E. coli], Bacillus [např. Bacillus subtilis], Salmonella nebo Mycobakterie [výhodně nepatogenní, např. M. Bovis BCG]), kvasinky (jako je například Saccharomyces cerevisiae} a protozoa. Alternativně transformované buňky pocházejí z mnohobuněčných organizmů, jako jsou například houby, hmyzí buňky, rostlinné buňky nebo savčí buňky. Nejvýhodnější jsou buňky pocházející z člověka, srovnej diskusi o buněčných liniích a vektorech níže. Bylo ukázáno, že nedávné výsledky jsou slibné, co se týče použití komerčně dostupné buněčné linie Drosophila melanogaster (Schneider 2 (S2)buněčná linie a vektorový systém k dispozici od firmy Invitrogen) pro rekombinantní produkci analogů IL5 podle vynálezu, a tudíž tento expresní systém je obzvláště výhodný.

Pro účely klonování a/nebo optimalizované exprese je výhodné, že transformovaná buňka je schopna replikace fragmentu nukleové kyseliny podle vynálezu. Buňky exprimující nukleový fragment jsou výhodná použitelná provedení vynálezu, mohou být použity pro přípravu modifikovaného IL5 v malém • 4 44 44 4444 44 44

4*44 4«· 4444

4 4 4 4 4 4 4 4 4

444 44 4 444

4444 44 44 444 ·4 4444 nebo větším měřítku nebo, v případě nepatogenních bakterií, jako součásti vakcíny v živé vakcíně.

Při produkci modifikovaného IL5 podle vynálezu pomocí transformovaných buněk je pohodlné, ačkoliv není nutné, když je buď expresní produkt exportován do kultivačního média nebo nesen na povrch transformované buňky.

Když byla identifikována účinná producentská buňka, je výhodné na jejím základě založit stabilní buněčnou linii, která nese vektor podle vynálezu a která exprimuje fragment nukleové kyseliny kódující modifikovaný IL5. Výhodně, tato stabilní buněčná linie sekretuje nebo nese IL5 analog podle vynálezu, a tím usnadňuje jeho purifikaci.

Obecně, plazmidové vektory obsahující replikon a kontrolní sekvence, které pocházejí z živočišných druhů kompatibilních s hostitelskou buňkou, jsou použity ve spojení s hostiteli. Vektor obyčejně nese místo replikace, a také markerové sekvence, které jsou schopné poskytnout fenotypovou selekci v transformovaných buňkách. Například E. coli je typicky transformovaná s použitím pBR322, plazmidu pocházejícího z druhu E. coli (viz např. Bolivar et al., 1977). Plazmid pBR322 obsahuje geny pro rezistenci na ampicilin a tetracyklin, a tedy poskytuje snadný prostředek pro identifikaci transformovaných buněk. Plazmid pBR nebo jiný mikrobiální plazmid nebo fág musí také obsahovat nebo být modifikován tak, aby obsahoval, promotory, které mohou být použity prokaryotickým mikroorganizmem pro expresi.

Promotory nejčastěji používané v prokaryotických rekombinantních DNA konstruktech obsahují B laktamázu (penicilinázu) a laktózové promotorové systémy (Chang et al., 1978, Itakura et al., 1977, Goeddel et al., 1979) a tryptofanový (trp) promotorový systém (Goeddel et al. , 1979,

EP-A-0 036 776) . I když tyto jsou nejčastěji používané, byly

44 ·· 4444 ·· ·· • 444 444 4444 • · 4 4 ·*·· · « φ

444 4 4 · · · 4 •444 44 44 444 «4 4444 objeveny a používány další mikrobiální promotory a byly publikovány detaily týkající se jejich nukleotidové sekvence, což umožňuje zkušeným odborníkům ligovat je funkčně s plazmidovými vektory (Siebwenlist et al., 1980). Určité geny z prokaryot mohou být exprimovány účinně v E. coli z jejich vlastních promotorových sekvencí, což vylučuje potřebu přidávání dalšího promotoru umělými prostředky.

Kromě prokaryot mohou také být použity eukaryotické mikroby, jako jsou například kvasinkové kultury a zde by měl být promotor schopen řízení exprese. Nej častěji používaný eukaryotický mikroorganizmus je Saccharomyces cerevisiase nebo běžné pekařské droždí, ačkoliv obecně je k dispozici velký počet dalších kmenů. Pro expresi v Saccharomyces je obecně používán například plazmid YRp7 (Stinchcomb et al., 1979, Kingsman et al., 1979, Tschemper et al., 1980). Tento plazmid již obsahuje trpí gen, který poskytuje selekční markér pro mutantní kmen kvasinek, který nemá schopnost růstu v tryptofanu, například kmen ATCC č. 44076 nebo PEP4-1 (Jones, 1977). Přítomnost trpí léze jako charakteristiky kvasinkového genomu hostitelské buňky pak poskytuje účinné prostředí pro detekci transformace růstem v nepřítomnosti tryptofanu.

Vhodné promotorové sekvence v kvasinkových vektorech obsahují promotory pro 3-fosfoglycerátkinázu (Hitzman et al., 1980) nebo další glykolytické enzymy (Hess et al., 1968, Holland et al·., 1978), jako je například enoláza, giyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenáza, hexokináza, pyruvátdekarboxyláza, fosfofruktokináza, glukóza-6-fosfátisomeráza, 3-fosfoglycerátmutáza, pyruvátkináza, triosefosfátisomeráza, fosfoglukózoisomeráza a glukokináza. Při konstrukci vhodných expresních plazmidů jsou terminační sekvence spojené s těmito geny také ligovány do expresního vektoru ve směru 3' od • · Β· ·· · · 9 · ·Β ·· • · · · Β · · Β · Β · • · « · ···· · Β · • · · · * Β Β fc Β ···· ·· ·· ··· ·Β ···« sekvence, kterou je žádoucí exprimovat, aby byla zajištěna polyadenylace mRNA a terminace.

Jiné promotory, které mají další výhodu transkripce řízené růstovými podmínkami, jsou úsek promotoru pro alkoholdehydrogenázu 2, izocytochrom C, kyselou fosfatázu, degradační enzymy spojené s dusíkovým metabolizmem a výše uvedená glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenáza a enzymy zodpovědné pro využití maltózy a galaktózy. Je vhodný každý plazmidový vektor obsahující promotor kompatibilní s kvasinkami, počátek replikace a terminační sekvence.

Kromě mikroorganizmů mohou být také použity jako příjemci kultury buněk pocházejících z mnohobuněčných organizmů. V principu je zpracovatelná každá taková buněčná kultura, ať už z tkáňové kultury od obratlovce nebo bezobratlého živočicha. Ale největší zájem je o buňky obratlovců a propagace buněk obratlovců v kultuře (tkáňová kultura) se v současnosti stala rutinním postupem (Tissue Culture, 1973). Příklady těchto použitelných hostitelských buněčných linií jsou buňky VĚRO a HeLa, buněčné linie z vaječníků čínského křečka (CHO) a buňky W138, BHK, COS293, Spodoptera frugiperda (SF) (komerčně dostupné jako kompletní expresní systémy od i.a. Firmy Protein Sciences, 1000 Reseach Parkway, Meriden, CT 06450, U.S.A. a od firmy Invitrogen) a buněčné linie MDCK. V předkládaném vynálezu je obzvláště výhodná buněčná linie S₂ k dispozici od firmy Invitrogen, PO Box 2312, 9704 CH Groningen, Holandsko.

Expresní vektory pro tyto buňky obyčejně obsahují (je-li nutné) počátek replikace, promotor lokalizovaný před exprimovaným genem, spolu s kterýmkoliv nezbytným ribozomálním vazebným místem, místy sestřihu RNA, polyadenylačním místem a sekvencí terminátoru transkripce.

*· ·« ·♦ »· «·«· · · * Α 4 « « • · Α ··*>·· ·1 ϊ * · ··· · ··· · · • · · ·· · · · « ···· ·· ·· ·«» «« «·«·

Pro použití v savčích buňkách jsou kontrolní funkce expresních vektorů často poskytnuty virovým materiálem. Například obecně používané promotory pocházejí z polyoma, adenovirus 2 a nejčastěji z opičího viru 40 (SV40). Časné a pozdní promotory SV40 viru jsou obzvláště užitečné, protože oba lze snadno získat z viru jako fragment, který také obsahuje počátek replikace SV40 viru (Fiers et al., 1978). Mohou být také použity menší nebo větší SV40 fragmenty za předpokladu, že je zahrnuta sekvence o velikosti přibližně 250 bp šířící se z místa HindlII k místu BglI lokalizovanému ve virovém počátku replikace. Dále je také možné a často žádoucí, použít promotorové nebo kontrolní sekvence normálně sdružené s požadovanou genovou sekvencí, za předpokladu, že tyto kontrolní sekvence jsou kompatibilní s hostitelskými buněčnými systémy.

Počátek replikace může být zajištěn buď konstrukcí vektoru obsahujícího exogenní počátek, jako například může pocházet z SV40 nebo jiných virů (např. Polyoma, adeno, VSV, BPV) nebo může být zajištěn chromozomálním mechanismem replikace hostitelské buňky. Jestliže je vektor integrován do chromozomu hostitelské buňky, je tento často postačující.

Identifikace použitelných analogů IL5

Odborníkovi je jasné, že ne všechny varianty nebo modifikace nativního IL5 budou mít schopnost vyvolat tvorbu protilátek u zvířete, které zkříženě reagují s nativní formou. Není ale obtížné sestavit účinný standardní screening modifikovaných IL5 molekul, které splní minimální požadavky na imunologickou reaktivitu diskutovanou v tomto textu. Proto se další část vynálezu týká způsobu identifikace modifikovaného IL5 polypeptidu, který je schopen indukovat protilátky proti nemodifikovanému IL5 u živočišného druhu, * · 9

9» 1* ** 9 * · ♦ · ♦ »9 • 9 9 9 · ··# 9 9 9

999 9 999 9 9

99 99 9 999

9999 99 99 999 99 9999 kde je nemodifikovaný IL5 polypeptid autoprotein, tento způsob obsahuje

- přípravu peptidovou syntézou nebo prostředky molekulární biologie sady vzájemně rozdílných modifikovaných IL5 polypeptidu, kde aminokyseliny byly přidány, vloženy, odstraněny nebo substituovány v aminokyselinové sekvenci IL5 polypeptidu živočišného druhu, a tím založit aminokyselinové sekvence v sadě, které obsahují epitopy T lymfocytu, které jsou cizorodé pro živočišný druh nebo přípravu sady fragmentů nukleové kyseliny kódující sadu vzájemné rozdílných modifikovaných IL5 polypeptidů,

- testování členů sady na jejich schopnost indukovat produkci protilátek proti nemodifikovanému IL5 živočišným druhem, a

- identifikaci a volitelně izolaci člena(členů) sady, který významně indukuje produkci protilátek proti nemodifikovanému IL5 v živočišném druhu nebo identifikaci a volitelně izolaci polypeptidových expresních produktů kódovaných členy sady fragmentů nukleové kyseliny, které významně indukují produkci protilátek proti nemodifikovanému IL5 polypeptidu v živočišném druhu.

V tomto kontextu sada modifikovaných IL5 polypeptidů je modifikovaných IL5 polypeptidů, které byly vybrány např. na základě kritérií diskutovaných výše (např. V kombinace se studiemi cirkulárního dichroismu, NMR spekter a/nebo typu rentgenové difrakce). Sada se může skládat z pouze několika členů, ale předpokládá se, sada může obsahovat několik set členů. Podobně sada fragmentů nukleové kyseliny je kolekce neidentických fragmentů nukleové kyseliny, každý fragment kóduje modifikovaný IL5 polypeptid vybraný stejným způsobem.

vzájemně rozdílných kolekce neidentických ·· ·· ·· ···· ·· ·· ···· ··· · · · · • · · · · · · · · · · • · · ·· · ··· ···· ·· ·· ··· ·· ····

Test členů sady může být nakonec prováděn in vivo, ale může být použit velký počet in vitro testů, které zúží počet modifikovaných molekul, které budou sloužit účelu vynálezu.

Protože cílem zavedení cizorodých epitopů T lymfocytů je podporovat reakci B lymfocytů pomocí T lymfocytů, je bezpodmínečně nutné, aby byla modifikovaným IL5 indukována proliferace T lymfocytů. Proliferace T lymfocytů může být testována standardizovanými proliferačními testy in vitro. Stručně, od pacienta je získán vzorek bohatý na T lymfocyty a je pak udržován v kultuře. Pěstované T lymfocyty jsou uvedeny do kontaktu s APC pacienta, které již dříve nabraly modifikovanou molekulu a zpracovaly ji pro prezentaci epitopům T lymfocytů. Proliferace T lymfocytů je monitorována a srovnána s vhodnou kontrolou (např. S T lymfocyty v kultuře v kontaktu s APC, které zpracovaly intaktní nativní IL5). Alternativně, proliferace může být hodnocena na základě určování koncentrace relevantních cytokinů uvolňovaných T lymfocyty jako reakce na jejich rozpoznávání cizorodých T lymfocytů.

Je-li vysoce pravděpodobné, alespoň jeden modifikovaný IL5 ze sady je schopen indukovat produkci protilátky proti IL5. je možné připravit imunogenní přípravek obsahující alespoň jeden modifikovaný IL5 polypeptid, který je schopen indukovat protilátky proti nemodifikovanému IL5 u živočišného druhu, kde nemodifikovaný IL5 polypeptid je autoprotein, způsob obsahuje smíchání člena(členů) sady, který významně indukuje produkci protilátek v živočišném druhu, který reaguje s IL5. s farmaceuticky a imunologicky přijatelným nosičem a/nebo vehikulem a/nebo ředidlem a/nebo excipientem, volitelně v kombinaci s alespoň jedním farmaceuticky a imunologicky přijatelným adjuvans.

··· · · · · · · · · • · · ····· ·· · • · · · · · · · · ···· ·· ·· ··· ·· ····

Podobně je také možné připravit imunogenní přípravek, který jako imunogen obsahuje fragment nukleové kyseliny kódující imunogenní IL5 analog, srovnej diskusi o vakcinaci nukleovou kyselinou výše.

Výše uvedené aspekty vynálezu jsou obyčejně prováděny výchozí přípravou velkého počtu vzájemně rozdílných sekvencí nukleové kyseliny nebo vektorů podle vynálezu, jejich zavedení do vhodných expresních vektorů, transformace vhodných hostitelských buněk vektory a exprese sekvencí nukleové kyseliny podle vynálezu. Tyto kroky pak mohou být následovány izolací expresních produktů. Je výhodné, když jsou sekvence nukleové kyseliny a/nebo vektory připraveny metodami používajícími techniku molekulární amplifikace, jako je například PCR, nebo syntézou nukleových kyselin.

Příklady provedení vynálezu

Návrh vakcíny

Uvažované příklady IL5 autovakcíny jsou konstruovány podle koncepce AutoVac™ (popsáno detailně ve WO 95/05849) substitucí známých všeobecných epitopů T lymfocytů proteinu humánního IL5 divokého typu. Substituce jsou peptidové substituce, kde vložený peptid může být stejně nebo rozdílně dlouhý, než odstraněný peptid v sekvenci divokého typu.

Pro počáteční průkaz koncepce in vivo testováním a screeningem bylo rozhodnuto připravit konstrukty myší IL5 sekvence. Jako příklad jsou použity jako substituující peptidy epitopy tetanického toxoidu P2 (sekv. id. č. 23) a P30 (sekv. id. č. 24), ale podle předkládaného vynálezu by mohl být použit každý další vhodný peptid obsahující nebo vytvářející všeobecný T_H epitop.

• 4 « · •« ·· ···· ·· • · · · · · » φ

4 4 4444 4 4 ·

4444 44 44 444 4· 4444

Je nutné zdůraznit, že velikost molekuly (115 zbytků) ve srovnání s velikostí substitucí (15 nebo 21 zbytků pro P2 a P30, v daném pořadí) silně omezuje možná místa strukturních nedestruktivních inzercí. Protože disulfidové můstky jsou pro dimerizaci důležité, ale ne nutné, jsou některé varianty vytvořeny v párech +/- eliminace cysteinů.

V konstrukci uvažovaných molekul byly brány do úvahy dva základní parametry. Zaprvé, zkoušela se zachovat maximální část trojrozměrné struktury divokého typu hIL5. a tím uchovat nativní repertoár epitopů B lymfocytu. To je podporováno autory Dickason et al., (1994), kteří prokázali, že IL5 epitopy B lymfocytu známé jako neutralizační jsou konformační. Uchování terciární struktury je dosaženo zavedením modifikací v strukturně neutrálních místech, jako jsou například kličky nebo oddělené segmenty. Fakt, že Nkoncový helix A spolu s helixy B a C jsou schopny se skládat do kvartérní struktury s druhou molekulou, ukazuje, že tyto 3 helixy vytvářejí stabilně sestavenou strukturní kostru.

Zadruhé byla brána do úvahy biologická aktivita ve vztahu ke koncepci vakcíny. Obecně je výhodný inaktivní konstrukt se zřetelem ke snížení předpokládaných toxických účinků molekul a obecně pro vyhodnocení imunitní reakce. Na druhé straně, optimální neutralizační protilátky by teoreticky měly projevit specifičnost pro část IL5. která interaguje s IL5R. To se nejpravděpodobněji dosáhne imunizací aktivní variantou. Konečně, není nemožné, že biologický účinek IL5 na imunitní systém může působit jako zesilovač imunitní reakce, tedy zlepšuje obecný účinek. Ale na základě předešlých zkušeností původce s dalšími molekulami lze očekávat, že většina teoreticky možných aktivních konstruktů bude mít nízkou nebo žádnou aktivitu.

Tedy, všechny navrhované varianty jsou potenciálně aktivní ale mohou být, je-li to žádoucí, relativně snadno inaktivovány zabráněním vytvoření aktivního dimeru nebo alteracemi v úsecích A- a D-helixů, které jsou zapojeny do receptorové vazby/aktivace.

Souhrnem, výše uvedené úvahy o zachování struktury a biologické aktivitě definují jako cílové úseky kteroukoliv z kliček 1 až 3, a také C-koncovou flexibilní oblast.

Klička 3 je vybrána jako primární cílová oblast, protože je strukturně oddělena od předpokládané trojšroubovicové kostry. Protože je dále možné vytvořit biologicky aktivní monomer, elongací kličky 3 (Dickason, 1996), obsahuje tato oblast možnosti pro vytvoření všech typů variant: monomer/dimer a aktivní/inaktivní.

Klička 1 je druhá oblast obsahující nešroubovicový úsek délky vhodné pro substituce. Varianty z tohoto úseku jsou teoreticky aktivní pouze tehdy, když jsou schopné dimerizace, ale protože délka kličky divokého typu ji činí spíše flexibilní, je racionální očekávat správné složení proteinu po substituci.

Varianty obsahující substituce v oblasti kličky 2 budou také aktivní pouze jako dimery. Oblast, která může být substituována, je krátká ve srovnání s inzerty a má centrální polohu v předpokládané strukturní kostře, což jsou dvě charakteristické vlastnosti kličky 2, které by mohly zabránit správnému složení proteinu po substituci. Ne druhé straně, klička 2 je situována naproti k oblasti interagující s IL5R, což má za následek očekávanou optimální prezentaci neutralizačních epitopů divokého typu, jestliže je modifikovaný protein správně složen.

• ·

Nakonec, jsou navrhovány inzerty v C-koncovém flexibilním úseku po helixu D. Z hlediska proteinové struktury tato koncepce vypadá docela bezpečně, ale je pravděpodobné, že modifikace v dimerizaci, tak biologickou modifikovaný protein dimerizován) protože C-koncová část je lokalizována v oblasti jak vazby receptorů, tak ve styčné tomto úseku ovlivní aktivitu (jestliže jak je ploše dimeru.

Aminokyselinové sekvence 10 variant původně konstruovaných podle výše uvedených úvah jsou uvedeny jako sekv. id. č. 2 až 11 a 13 až 22. Další varianty konstruované později jsou uvedeny v sekv. id. č. 27 až 59 (včetně DNA sekvencí nukleových kyselin a aminokyselinových sekvencí).

Je nutné poznamenat, že všechny inzerty kromě těch podle příkladu 2 jsou připraveny tak, aby obsahovaly hraniční aminokyselinové zbytky, které jsou zachovány z hIL5 do mIL5. aby podporovaly proces úspěšného přenosu pozitivních konstruktů z myší na člověka.

V následujících příkladech jsou pozice pro substituce označované podle čísel aminokyselinových zbytků v myší sekvenci, odpovídající humánní pozice jsou dány v závorkách.

Příklad 1

Varianty s P2 substituujícím pozice v kličce 3 při zachování Cys84 (86)

Epitop P2 (sekv. id. č. 23) je substituován v kličce 3 při zabránění eliminaci Cys89(86). Tyto varianty (sekv. id. č. 2 a 28 (humánní), kde aminokyseliny 87-90 nebo 88-91 jsou substituovány, a sekv. id. č. 13 a 46 (myší), kde aminokyseliny 85-88 nebo 86-89 jsou substituovány) jsou ·· ·· ·· ···· ·· ·· • · ♦ a · » · ···· • · · · · · · · · · · • · ··· · · · · · · ··· ·· · · · · ·>·· ·· 99 999 99 9999 potenciálně aktivní jako monomery (díky elongaci kličky 3) a jako dimery. Sekv. id. č. 28 a 46 jsou také označeny hIL5.1 a mIL5.1, v daném pořadí.

Příklad 2

Varianty s P2 substituujícím pozice v kličce 1 při zachování Cys42 (44)

Epitop P2 (sekv. id. č. 23) je substituován v kličce 1 při zabránění eliminaci Cys42(44). Tyto varianty (sekv. id. č. 3 a 36 (humánní), kde aminokyseliny 32-43 nebo 33-43 jsou substituovány, a sekv. id. č. 14 a 56 (myší) , kde aminokyseliny 30-41 nebo 31-41 jsou substituovány) jsou potenciálně aktivní pouze jako dimery. Sekv. id. č. 36 a 56 jsou také označeny hIL5.5 a mIL5.5, v daném pořadí.

Příklad 3

Varianty s P2 substituujícím pozice v kličce 2

Epitop P2 (sekv. id. č. 23) je substituován v kličce 2. Tyto varianty (sekv. id. č. 4 a 34 (humánní) , kde aminokyseliny 59-64 jsou substituovány, a sekv. id. č.15 a 50 (myší), kde aminokyseliny 57-62 jsou substituovány) jsou potenciálně aktivní pouze jako dimery. Sekv. id. č. 34 a 50 jsou také označeny hIL5.4 a mIL5.4, v daném pořadí.

Příklad 4

Varianty s P2 substituujícím pozice v kličce 3 při eliminaci

Cys84 (86)

4 4 4 ·· 4 · 4 · ·· 4 4

4 4 4 4·· 4*4*

4 4 4444 4 4 4

444 44 4 444

4444 44 44 4·4 44 4444

Epitop Ρ2 (sekv. id. č. 23) je substituován v kličce 3 při eliminaci Cys84(86). Tyto varianty (sekv. id. č. 5 a 38 (humánní), kde aminokyseliny 86-91 jsou substituovány, a sekv. id. č. 16 a 54 (myší), kde aminokyseliny 84-89 jsou substituovány) jsou v principu podobné jako varianty typu č.

(sekv. id. č. 2 a 28 a 13 a 46), ale vytvoření monomerních produktů bylo usnadněno inhibicí tvorby disulfidových můstků a upravením délky kličky 3. Sekv. id. č. 38 a 54 jsou také označeny hIL5.6 a mIL5.6, v daném pořadí.

Příklad 5

Varianty s P2 substituujícím pozice 108-111 (110-113) v

C-koncové oblasti

Epitop P2 (sekv. id. č. 23) je substituován v C-koncové oblasti následující po helixu D. Tyto varianty (sekv. id. č. 6 a 17) jsou potenciálně aktivní pouze jako dimer.

Příklad 6

Varianty s P30 substituujícím pozice v kličce 3 při zachování Cys84 (36)

Epitop P30 (sekv. id. č. 24) je substituován v kličce 3 při zabránění eliminaci Cys84(86). Tyto varianty (sekv. id. č. 7 a 40 (humánní), kde aminokyseliny 88-91 nebo 87-90 jsou substituovány, a sekv. id. č. 18 a 58 (myší) , kde aminokyseliny 85-88 nebo 86-89 jsou substituovány) jsou potenciálně aktivní jako monomery (díky elongaci kličky 3) a jako dimery. Sekv. id. č. 40 a 58 jsou také označeny hIL5.7 a mIL5.7, v daném pořadí.

·· ·· • · ·

·· ····

Příklad 7

Varianty s P30 substituujícím pozice v kličce 1 při zachování Cys42 (44)

Epitop P30 (sekv. id. č. 24) je substituován v kličce 1, při zabránění eliminaci Cys42(44). Tyto varianty (sekv. id. č. 8 a 30 (humánní), kde aminokyseliny 32-43 jsou substituovány, a sekv. id. č. 19 a 48 (myší) , kde aminokyseliny 30-41 jsou substituovány) jsou potenciálně aktivní pouze jako dimery. Sekv. id. č. 30 a 48 jsou také označeny hIL5.2 a mIL5.2, v daném pořadí.

Příklad 8

Varianty s P30 substituujícím pozice v kličce 2

Epitop P30 (sekv. id. č. 24) je substituován v kličce 2. Tyto varianty (sekv. id. č. 9 a 20, kde aminokyseliny 59-64 a 57-62 jsou substituovány, v daném pořadí) jsou potenciálně aktivní pouze jako dimery.

Příklad 9

Varianty s P30 substituujícím pozice v C-koncové oblasti

Epitop P30 (sekv. id. č. 24) je substituován v C-koncové oblasti následující po helixu D. Tyto varianty (sekv. id. č. 10 a 21, kde aminokyseliny 110-113 a 108-111 jsou substituovány, v daném pořadí) jsou potenciálně aktivní pouze jako dimery.

·· 44 44 ···· 44 44 • 444 4 4 4 4 4 4 4 ·· · · 4 · · · 4 4 ·

444 44 4 444 • 444 44 44 4·· 44 4444

Příklad 10

Varianty s P2 substituujícím pozice 84-89 (86-91) a P30 substituujícím pozice 110-113

Epitop P2 (sekv. id. č. 23) je substituován v kličce 3 při eliminaci Cys84(86) a epitop P30 (sekv. id. č. 24) je substituován v C-koncové oblasti následující po helixu D. Pouze tyto varianty (sekv. id. č. 11 a 22) jsou spolu s variantami typu č. 12 jediné obsahující oba epitopy a jsou potenciálně aktivní monomery.

Příklad 11

Varianty s P30 substituujícím pozice v kličce 3 při eliminaci Cys84 (86)

Epitop P2 (sekv. id. č. 24) je substituován v kličce 3 při eliminaci Cys84(86). Tyto varianty (sekv. id. č. 42 (humánní), kde aminokyseliny 86-91 jsou substituovány, a sekv. id. č. 58 (myší), kde aminokyseliny 84-89 jsou substituovány) jsou v principu podobné jako varianty typu č. 6, ale vytvoření monomerních produktů bylo usnadněno inhibici tvorby disulfidového můstku a upravením délky kličky 3. Sekv.

id. č. 42 a 58 pořadí.	j sou	také označeny	hIL5.12	a	mIL5.12,	v daném
Příklad 12
Varianty s P2 a	P30	substituuj ícími	pozice	v	kličce 3
P2 (sekv.	id.	č. 23) a P30	(sekv.	id	. č. 24)	epitopy

jsou substituovány v kličce 3 při zachování Cys84(86). Tyto varianty (sekv. id. č. 44 a 60, kde aminokyseliny 88-91 a 8699 99 • 9 9 9

9· 9

9 9

9999 »· ·· • · · · • · · ·· »0··

9999 99 jsou substituovány, v daném pořadí) obsahují oba epitopy a jsou potenciálně aktivní monomery. Sekv. Id. č. 44 a 60 jsou také označeny hIL5.13 a mIL5.13, v daném pořadí.

Příklad 13

Výběr expresního systému

Rekombinantní IL5 byl exprimován v celé řadě odlišných expresních systémů včetně kvasinek, hmyzích buněk a buněk CHO (Tavernier et al., 1989).

Podle předkládaného vynálezu je jedním vhodným expresním systémem E. coli, na základě předešlých studií publikujících použití tohoto hostitele pro produkci hIL5 (Proudfoot et al., 1990, Graber et al., 1993). Rekombinantní protein je exprimován jako inkluzní tělíska, která jsou konvertována na biologicky aktivní dimer po purifikací a opětném složení (např. S použitím obecně použitelné metody opětného složení popsané v patentu Spojených Států č. 5 739 281). Rychlost a jednoduchost exprese v E. coli umožňuje okamžitý počátek produkce proteinu, když jsou hotové genetické konstrukty, a tedy usnadnění rychlé tvorby materiálu pro stanovení in vivo důkazu koncepce IL5 autovakcíny.

Jestliže je z některého důvodu zjištěno, že proveditelnost je příliš špatná (např. příliš nízký výtěžek opětného složení, nestabilita produktů nebo zlepšené farmakokinetické parametry ve vztahu ke glykosylaci apod.), může být v dalším rozvoji uvažováno o produkci autovakcíny v kvasinkách.

Nedávno byly získány slibné výsledky s použitím expresního systému Drosophila melanogaster s použitím S₂buněk (k dispozici od firmy Invitrogen) a v současnosti íl »· ·« »*»« ·* 44 • · · · 4 · 4 4 4 4 4 • 4 4 4 4444 4 4 4

444 44 4 444

4444 44 44 ·»· 44 4444 provedení pro expresi produkována buňkami S₂IL5 konstrukty. Bylo buněk a pořadí. Sondergaarda představuje tento systém výhodné analogů IL5 podle vynálezu.

IL5 varianta proteinu byla Orosophila trvale exprimujícími testováno několik různých transfekčních metod a byly vybrány Ca₂PO₄ a Lipofectin. Byly použity dva odlišné subklony S₂byly transfekovány Ca₂PO₄ a Lipofectinem, v daném Tyto dva klony byly získány z ATCC a Larse z Univerzity v Kodani, v daném pořadí.

S použitím obou metod byly vybrány vhodné stabilní linie exprimující mIL5 a mIL5.1 proteiny v rozmezí 2-10 mg/1. Materiál a metody

S₂ buňky byly pěstovány a udržovány v Schneiderově médiu (Sigma) obsahujícím 5 až 10 % fetálního telecího séra (FCS), 0,1 Pluronic F68 (Sigma), penicilin/streptomycin (Life Technologies), pěstovány v třepacích baňkách v 25°C a 120 rpm.

Transfekce Lipofectinem byly prováděny ve 250 ml nebo 1 1 třepacích baňkách. S₂ buňky byly rozděleny po 2,5-3 x 10⁶/ml do 50 ml Excell 420 (JRH Biosciences) bez antibiotik a pěstovány přes noc ve 250 ml třepacích baňkách. Příští ráno byly připraveny reagencie Lipofectinu: zkumavka 1) 300-1200 μg plazmidové DNA obsahující zkoumaný gen, plus 15-60 μg pCoHYGRO hygromycinového selekčního plazmidů (20:1 poměr plazmidů) v 15-45 ml séra a médiu bez doplňku, zkumavka 2) 1 ml Lipofectinu v 5 ml séra a médiu bez doplňku. Po 1 hodině při teplotě místnosti byly zkumavky 1 a 2 smíchány a ponechány po dobu 15 minut při teplotě místnosti před pozvolným přidáním k S₂ buňkám. Po pěstování buněk přes noc bylo přidáno nové plně doplněné médium plus 150-300 μg/ml Hygromycinu.

ΊΟ «© 99 >©

4 9 9 4 9 9 9 9 9 9

9 4 * » · 99 4 4 4

9 4 4 4 4 4 4 4 4 4

4 4 9 4 4 4 4 4

4444 49 94 444 44 4444

Linie s tranzientní a trvalou expresí byly indukovány buď s 500 μΜ síranu měďnatého nebo 10 μΜ chloridu kademnatého po dobu 48-72 hodin v médiu Ex-cell 420 bez séra (JRH Biosciences).

Výsledky

Pomocí Ca₂PO₄ bylo vytvořeno 33 stabilních linií a pomocí Lipofectinu 23. Výtěžky exprese kolísaly od nedetekovatelných až do 11 mg/1. Následující tabulka shrnuje několik linií použitých pro produkci proteinu.

Shrnutí výsledků exprese mIL5 z nej lepších S₂ buněčných transfekcí

Plazmid Konstrukt S₂ buňky Metoda transfekce Výtěžek

p612	IL5/Hisl5/mIL5wt	ATCC	Ca₂PO₄	3,5 mg/1
p767	Bip/Hisl5/mIL5wt	LS	Lipofectin	11 mg/1
p613	IL5/Hisl5/mIL5.1	ATCC	Ca₂PO₄	2,6 mg/1
p768	Bip/Hisl5/mIL5.1	ATCC	Ca₂PO₄	0*
p619	IL5/Hisl5/mIL5.5	LS	Lipofectin	0*

* expresní plazmid obsahoval mutace sekvence.

S₂ buňky mohou být tedy transfekovány buď precipitací s fosforečnanem vápenatým nebo Lipofectinem. Díky rozdílu ve stupni exprese mezi plazmidy p612 a p767 se zdá, že signální peptid Bip je účinnější vedoucí sekvence než endogenní mIL5 vedoucí sekvence v S₂ buňkách.

Příklad 14

Screening a selekce modifikovaných molekul

Po expresi je rekombinantní protein purifikován a posouzen. Charakterizace uvažovaných autovakcín zahrnuje • · • · • · ··· · · · ··· ···· ·· ·· ··· ·· ···· analytickou chromatografií, izoelektrické zaostření (IEF), SDS-PAGE, analýz kompozice aminokyselin, N-koncovou sekvenační analýzu, hmotnostní spektrometrii, analýzu rozptylu laserového záření pod nízkým úhlem, standardní spektroskopii a cirkulární dichroismus do takové míry, že přesně dokumentují relevantní parametry definující zamýšlený proteinový produkt.

Proteiny značené His byly až donedávna purifikovány s použitím dvoustupňového postupu. Ale výtěžek a čistota po konečném kroku s chelátem nebyly tak vysoké, jak bylo očekáváno. Nový jednostupňový postup purifikace zNázevnal 3 hlavní dosažené výhody: vyšší výtěžek, vyšší výkonnost a vyšší čistotu konečného produktu. Byly také stanoveny podmínky štěpení pro odstranění značky His.

Dvoustupňový purifikační postup pro IL5:

Exprese proteinu byla indukována přidáním kovových iontů k médiu. Tyto kovové ionty musely být odstraněny před aplikací protein na chelátovou kolonu. Tak bylo přidáno celkem 20 mM EDTA ke komplexu kovových iontů a supernatant byl pak filtrován nad kolonou SP-sepharose pro zachycení proteinu. Po promytí, aby se odstranil nenavázaný protein, byl vázaný protein eluován stupňovým gradientem NaCI. Tento krok slouží dvěma účelům: jako koncentrační krok redukující objem faktorem 30 a výměna pufru.

Relevantní frakce (jak byly zjištěny pomocí SDS-PAGE) jsou sloučeny a dále purifikovány na koloně s cheláty kovu.

Protein byl nanese na Ni²⁺-nabitou chelátovou kolonu a nenavázaný protein byl odmyt. Vázáný protein pak byl eluován s použitím imidazolového gradientu. Všechny frakce, kolonou proteklé pufry a proteklý roztok EDTA, pak byly zkontrolovány pomocí SDS-PAGE a metodou bodového přenosu („dot-blot).

Relevantní frakce (jak byly zjištěny pomocí SDS-PAGE a „dot-blot) jsou sloučeny a dialyzovány dvakrát proti 10 násobku objemu PBS, pH upraveno na 6,9.

Po filtraci byla dialyzovaná látka koncentrována dokud nebylo dosaženo vhodné koncentrace (výhodně 1 mg/ml). Nakonec byl protein rozdělen do alikvotů a uložen v -20°C.

Byl použit následující specifický protokol:

1) získaný supernatant byl stočen v 2500 x g po dobu 15 minut (jestliže se objevila infekce, byla zapotřebí centrifugace ve 22000 x g po dobu 30 minut. Supernatant pak byl filtrován s použitím 0,45 μιη filtru, pak následovalo použití 0,22 μη filtru (někdy bylo nezbytné filtrovat nejdříve přes 5 μιη filtr) . Supernatant pak byl smíchán v poměru 1:1 s pufrem A (viz krok 2) obsahující 4 0mM EDTA, což mělo za následek konečné složení pufru 0,2M NaH₂PO₄, 10% glycerol, 20mM EDTA, pH 6,0.

2) filtrovaný supernatant pak byl nanesen na SPSepharose kolonu ekvilibrovanou pufrem A. Na 80 ml kolonu může být naneseno celkem 1-2 1 (v závislosti na koncentraci proteinu, výše uvedené platí pro 1-10 mg IL5/1). Průtok během aplikace: 1-2 ml/min (obvykle přes noc), proteklý pufr byl sbírán a uložen pro pozdější analýzu. Po aplikaci byla kolona promyta 2-3 objemy kolony (CV) pufru A, dokud nebylo dosaženo stabilní bazální hodnoty. Vázáný protein byl eluován s použitím stupňového gradientu: 0-100-500-1000mM NaCl, byly sbírány frakce po 10 ml, průtok byl 10 ml/min. Purifikace byla prováděna v 5°C.

Kolona byla čištěna 2 CV IM NaOH, průtokem 5 ml/min po každém běhu a opět ekvilibrována pufrem A.

Pufr A: 0,2M NaH₂PO₄, 10% glycerol, pH 6,0

Pufr B: 0,2M NaH2PO4, 1M NaCl, 40mM imidazol, 10% glycerol, pH 6, 0.

Pro divoký typ i varianty byl použit stejný postup.

Všechny frakce, výchozí látka a proteklý pufr byly testovány metodou „dot-blot a SDS-PAGE. Frakce obsahující IL5 byly sloučeny a dále purifikovány s použitím chelátové kolony.

Jednostupňový purifikační postup pro IL5:

Supernatant byl nanesen přímo na 70 ml chelátovou kolonu nabitou ZnCl2. Po odstranění nenavázané látky promytím byl navázaný protein (IL5 a kontaminující složky) eluován s použitím gradientu imidazolu. Tato metoda má plně výhodu značky His za poskytnutí jednostupňového purifikačního postupu s konečným produktem o vysokém stupni čistoty (>95%). Relevantní frakce (jak byly zjištěny pomocí SDS-PAGE a dotblot) jsou sloučeny a dialyzovány dvakrát proti 10 násobku objemu PBS, pH upraveno na 6,9 a koncentrace NaCl upravena na 400 mM.

Specifický protokol obsahoval tyto kroky:

1) supernatant byl filtrován přes 0,45 pm filtr, aby se odstranily nečistoty, a byl naředěn v poměru 1:1 pufrem A.

Chelátová kolona Fast Flow o objemu 70 ml byla promyta 5 CV vody, a pak nabita 10 CV lOmM ZnCl2, pH 7. Po ekvilibraci 5 CV pufru A, byl nanesen vzorek s použitím pumpy (průtok 10 ml/minutu) . Proteklý pufr byl sbírán a uložen pro pozdější analýzu. Vázaný protein byl eluován s použitím imidazolového gradientu od 0 do 250mM imidazolu více než 30 CV. Nakonec byla kolona opláchnuta 5 CV pufru C.

·· ·· ·* ···· ·· ·· • · · · · · · ···· • · · · · · ··· ···· ·· ·· ··· ·· ····

Byly sbírány frakce 10 ml. Pufry:

A:	20mM NaH₂PO₄,	0,5M NaCl,	10%	glycerol,	pH 7.
B:	20mM NaH₂PO₄,	0,5M NaCl,	10%	glycerol,	pH 7, 0,25M imidazol
C:	2 0mM NaH₂PO₄,	0,5M NaCl,	0, IM	I EDTA, pH	7,0.
	Všechny frakce, proteklé	pufry a	výchozí látka byly

testovány SDS-PAGE.

2) nejčistší frakce (jak byly zjištěny pomocí SDS-PAGE) obsahující IL5 byly sloučeny (50 μΐ bylo uloženo pro pozdější analýzu) a dialyzovány dvakrát proti 10 násobku objemu PBS, pH upraveno na 6,9, v 6°C, MW 12-14 kD. Dialyzát byl filtrován přes 0,22 μιη filtr (50 μΐ bylo uloženo pro pozdější analýzu) a byla měřena A₂₈₀ s použitím dialyzačního pufru (filtrován přes 0,45 μιη) jako referenční hodnoty. Byl měřen objem před a po dialýze a vzorky byly uloženy pro pozdější analýzu SDS-PAGE (po kroku 3).

3) NaCl byl přidán k dialyzovanému proteinu, dokud nebylo dosaženo celkové koncentrace 400 mM a byl pak koncentrován s použitím buď přístroje Amicon (pro objemy větší něž 50 ml) nebo koncentračního zařízení Vivaspin (pro 10 až 50 ml). V obou případech byla membrána saturována 10 ml pufru PBS před tím, než byl nanesen vzorek. Vzorek by měl být koncentrován dokud nebylo dosaženo výhodné koncentrace 1 mg/ml (jak měřeno A₂₈q) . Dialyzovaný koncentrovaný vzorek byl filtrován přes 0,22 μιη filtr a značen s E-nr. A₂₈o byla měřena s použitím proteklého pufru jako referenční hodnoty.

Všechny vzorky z dialýzy a koncentračního kroku byly analyzovány SDS-PAGE a obarveny modří Coomassie. Purifikovaný protein byl uložen zmražený v alikvotech a byl vyplněn list papíru popisující vzorek a vložen do pořadače IL5-protein.

4 ♦ 4

Výše popsaný postup poskytl protein o čistotě přibližně 90 až 95 %, ještě obsahující značku His.

Při sekvencování měl IL5wt a varianta IL5.1 očekávanou N-koncovou sekvenci zahrnující značku His.

Purifikační postup zmíněný výše byl realizován v následujícím specifickém nastavení:

1) sloučené frakce z kolona SP-sepharose byly filtrovány přes 0,45 μιη filtr, aby se odstranily nečistoty.

Chelátová kolona 5 ml HiTrap (nutné použít pouze určené kolony) byla promyta 15 ml vody (s použitím injekční stříkačky), a pak nabita 15 ml O,1M NiSO₄ a promyta 15 ml vody. Kolona byla připojena k systému Akta ekvilibrovanému 23 CV pufru A. Vzorek byl nanesen s použitím buď kličky nebo pumpy - v závislosti na objemu (průtok 4 ml/min), proteklý pufr byl sbírán a uložen pro pozdější analýzu. Navázaný protein byl eluován s použitím imidazolového gradientu od 0 do 500 mM imidazolu více než 20 CV. Frakce 5 ml byly sbírány. Nakonec byla kolona opláchnuta s použitím 5 CV pufru B2.

Pufr A: 0,2M NaH₂PO₄, 0,5M NaCI, 10% glycerol, pH 5,0 pufr Bl: 0,2M NaH₂PO₄, 0,5M NaCI, 0,5M imidazol, 10% glycerol, pH 5,0

Pufr B2: 50mM acetát sodný, 0,5M NaCI, 0,lM EDTA, 10% glycerol, pH 4,5

Všechny frakce, proteklý pufr a výchozí látka byly testovány dot-blot, všechny relevantní frakce byly testovány SDS-PAGE.

2) nejčistší frakce (jak byly zjištěny pomocí SDS-PAGE) obsahující IL5 byly sloučeny (50 μΐ bylo uloženo pro pozdější analýzu) a dialyzovány dvakrát proti 10 násobku objemu PBS, pH upraveno na 6,9, v 6°C, MW 12-14 kD. Dialyzát byl filtrován přes 0,22 μιη filtr (50 μΐ bylo uloženo pro pozdější ·· 4 4 4 4 ···· ·· ·· • 44« 444 · 4 4 ♦

4 · 4 4 4 4 4 4 4

444 44 4 444

4444 44 44 444 44 4444 analýzu) a byla měřena A₂8o s použitím dialyzačního pufru jako referenční hodnoty. Byl měřen objem před a po díalýze a vzorky byly uloženy pro pozdější analýzu SDS-PAGE (po kroku

3) .

3) po přidání dodatečné NaCl až do konečné koncentrace 400 mM, byl dialyzovaný protein koncentrován s použitím buď přístroje Amicon (pro objemy větší něž 50 ml) nebo koncentračního zařízení Vivaspin (pro 10 až 50 ml) . V obou případech byla membrána saturována 10 ml pufru PBS před tím, než byl nanesen vzorek. Vzorek by měl být koncentrován dokud nebylo dosaženo výhodné koncentrace 1 mg/ml (jak měřeno A₂so) · Dialyzovaný koncentrovaný vzorek byl filtrován přes 0,22 gm filtr a značen s E-nr.

Všechny vzorky z dialýzy a koncentračního kroku byly analyzovány SDS-PAGE a obarveny modří Coomassie. Purifikovaný protein byl uložen zmražený v alikvotech.

Další purifikační postupy, které byly hodnoceny:

Purifikace s chelátem Zn²⁺: Eluce proteinu s použitím stoupajícího imidazolového gradientu se ukázala být velmi účinnou, protože se protein wt váže silně na kolonu. Drosophila supernatant může být nanesen přímo a po promytí může být IL5wt eluován imidazolem. Kolona byla nabita 10 CV 10 mM ZnCl₂ a promyta vodou. pH vazby a eluční pufry musí mít pH vyšší než 6,5, protože jinak ZnCl₂ precipituje.

Con A afinitní chromatografie je ve výzkumu. Možnost použití glykosylace vyskytující se na IL5 jako afinitní značky a eluce s použitím monosacharidového analogu by byla zajímavá, protože by mohla být použita také pro konstrukty neznačené His.

*· 99 99 9999 »» 99

9 9 9 9 9 · 9 9 9 9

9 9 9 9 9 99 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

9999 99 99 999 99 9999

Odstranění značky His:

Odstranění 15 aa značky His (sekv. id. č. 25) bylo prováděno podle instrukcí dodavatele (Unizyme):

Purifikovaný a dialyzovaný/koncentrovaný IL5 značený His byl zbaven značení His postupným přidáním dvou enzymů, DAP1 a glutamincyklotransferázy. DAP1 odstranil dvě aminokyseliny z volného N-konce.

Enzym potřebuje být nejdříve aktivován:

μΐ HT-DAP1 (10 U/ml) bylo smícháno s 9 μΐ 20mM cysteamin-HCl. Po 5 minutách inkubace při teplotě místnosti bylo přidáno celkem 108 μΐ HP-GCT (100 U/ml) a 54 μΐ pufru TAGZyme. Tato směs musí být použita během 15 minut.

Tato dávka naštěpí 1 mg proteinu značeného His.

Protein značený His byl smíchán se 150 μΐ aktivovaného enzymu a inkubován ve 37°C po dobu 120 minut. Vzorky byly odebírány pro analýzu SDS-PAGE (10 μΐ) po 0, 10, 30, 60 a 120 minutách. Vzorky byly položeny do ledu, aby se zastavilo štěpení.

Pufry:

1. pufr TAGZyme: 20mM NaPO₄ pufr, pH 7,5, 150mM NaCl

2. 20mM cysteamin-HCl

Naštěpený protein (jak bylo určeno z analýzy SDS-PAGE nebo N-koncovým sekvencováním) byl nanesen na 1 ml Nichelátovou kolonu ekvilibrovanou PBS. Bylo sbíráno vše.

Proteklý pufr z aplikace byl uložen pro pozdější analýzu. Kolona byla eluována přidáním 3 CV PBS, byly sbírány frakce 0,5 ml. Kolona byl opláchnuta promytím 2 CV 0,5M imidazolu a frakce byly uloženy pro analýzu.

Všechny frakce byly testovány SDS-PAGE a frakce obsahující IL5 byly sloučeny a A₂go byla měřena s použitím PBS jako referenční hodnoty. Nakonec byl protein koncentrován • · ·· ·· ··♦· ·· ··

9 9 9 9 9 9 · « · · ·· 9 · 9 9 99 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

9999 99 99 999 99 9999 dvěma enzymy, najednou dvě s použitím koncentračního zařízení Vivaspin dokud nebylo dosaženo koncentrace 1 mg/ml.

Odstranění značky His bylo prováděno v pokusech v malém měřítku (0,1-1 mg) a měřítko nebylo zvětšováno. Je nutné pozNázevnat, že odstranění značky vyžaduje odblokovaný a nemodifikovaný N-konec.

Protein značený His byl inkubován s dipeptidylaminopeptidázou, která odstranila aminokyseliny a cyklotransferázou glutamové kyseliny, která katalýzuje konverzi glutamové kyseliny na pyroglutamovou kyselinu. Tato konverze dále blokuje degradaci dipeptidylaminopeptidázy. Štěpená směs pak byla filtrována přes chelátovou kolonu, která by měla zadržet enzymy (které jsou značeny Hisged), kontaminující proteiny vazbou ke koloně a nedegradovaný nebo částečně degradovaný protein. Protein zbavený značení prochází kolonou a byl sbírán v proteklém pufru. Po druhém štěpení s enzymem, který odstranil pyroglutamovou kyselinu, byl protein opět filtrován přes chelátovou kolonu, aby se odstranil druhý enzym. Očekává se, že v tomto konečném stadiu je nutné protein opět koncentrovat.

Obecná zjištění:

pí UniHis-IL5wt bylo 9,5 a optimální hodnota pH pro protein byla 6,5 až 7,0 (nebylo důkladně zkoumáno). Koncentrace NaCl 400 mM stabilizuje protein během koncentrace.

Příklad 15

In vitro screening

Primární in vitro screening je ve formě enzymatického imunotestu (ELISA): kompetitivní ELISA pro divoký typ IL5 • · relevantních epitopů B konstruktech před jejich poskytuje zjištění přítomnosti lymfocytů v modifikovaných IL5 zavedením do zvířat.

Pro měření titrů autoprotilátek v séru očkovaných zvířat může být použit obvyklý test ELISA. Protilátky (jak monospecifické, tak monoklonální) proti humánnímu, a také proti myšímu IL5 jsou komerčně dostupné od firmy R&D Systems, 614 McKinley Plače NE, Minneapolis, MN 55413, USA.

Biologická aktivita produktu a/nebo neutralizační kapacita indukovaných autoprotilátek může být testována v IL5 biologickém testu. Dříve publikované příklady takových biologických testů jsou: vyhodnocení IL5 indukované proliferace TFl buněk (pro humánní IL5) a vyhodnocení IL5 indukované proliferace BCL1 buněk nebo B13 B lymfocytů (pro myší IL5) (Callard & Gearing 1994, Dickason et al., 1994).

Účinek autovakcíny na vnímavost dýchacích cest může být také testován v in vitro testu, kdy byly očkovaným myším odstraněny trachey a umístěny na háček v kyvetě pro orgány. Byla měřena tenze trachey po histaminovém podnětu (van Oosterhout et al., 1995).

Proto, aby bylo možno zjistit biologickou aktivitu vzorků rekombinantního mIL5 (a mIL5 AutoVac) proteinu, byl zaveden buněčný test biologické aktivity pro myší IL5. Test je založen na schopnosti lymfomové linie BCL1 pocházející z lymfocytů B proliferovat v reakci na mIL5 přidaný do kultivačního média. Dva odlišné BCL1 klony byly získány z ATCC, BCL1 klon 5Blb (ATCC CRL-1669) a BCLl klon CW13.20.3B3 (ATCC TIB-197).

V typickém experimentu BCLl proliferace byly buňky naneseny na misky do kompletního RPMI média doplněného fetálním telecím sérem (FCS) na mikrotitrační destičky a inkubovány se sériovým ředěním myšího IL5. Proliferace BCLl buněk byla měřena inkorporací thymidinu značeného tritiem.

44 ·4 4 44· 44 4 4

4 4 * 444 4 4 4 4

444 44 444 44 4

44 44 4 444

4444 44 44 4·4 ·» 4444

Několik optimalizačních experimentů bylo prováděno s použitím sériového ředění zakoupeného rekombinantního mIL5 (R&D Systems) pro stimulaci. Variabilní parametry zahrnují: inkubační intervaly, ³H-thymidin pulzní intervaly, počet buněk nanesených na misku na jamku, koncentrace fetálního telecího séra (FCS) a koncentrace přidávaného mIL5. Bylo dosaženo na dávce závislé proliferace BCL1 buněk, přičemž maximální proliferace byla přibližně 3 krát vyšší než pozadí (BCL1 buňky bez přidaného mIL5).

Test BCL1 byl použit pro určení biologické aktivity následujících vzorků exprimovaných S₂ buňkami Drosophila a purifikových tak, jak bylo popsáno výše: HIS-mIL5wt materiál (E1320) , HIS-mIL5wt materiál (E1422), HIS-mIL5.1 materiál (E1396) a S₂ preparát pozadí (E0016). Proliferace v reakci na jeden HIS-mIL5wt (E1320) preparát byla významně vyšší než proliferace v reakci na „S₂ preparát pozadí, zatímco varianta mIL5.1 a jeden preparát divokého typu (E1422) byly určeny jako biologicky inaktivní.

Stále pokračující práce zahrnuje inhibici BCL1 proliferace s anti-mIL5 a pro optimalizační studie byla použita anti-mIL5 monoklonální protilátka TRFK5. Cílem . bylo použít tento test pro určení schopnosti anti-mIL5 antiséra z imunizovaných myší inhibovat biologickou aktivitu mIL5.

Příklad 16

In vivo modely

Pro měření účinku autovakcíny in vivo existují známé zvířecí modely astmatu. Normálně je zvíře senzibilizováno sloučeninou (alergen/antigen) a po podnětu sloučeninou ve formě aerosolu je měřena bronchokonstrikce (vodivost ·· BB BB ···♦ ·β ·Β

Β · Β · · Β · · · Β « • · · Β Β Β Β β β · · • · · · Β ΒΒΒ·

ΒΒΒΒ ·· ·· ΒΒΒ «· ·>·· dýchacích cest) s použitím tělesného pletysmografu. Jsou také zjišťovány počty eosinofilů v tekutině BAL.

Několik studií zkoumajících účinek anti-IL5 mAb byly úspěšně prováděny na myších. Proti použití myšího modelu je fakt, že IL5 působí jako růstový faktor pro B lymfocyty, což poskytuje možnost interference s myší protilátkovou reakcí. Ale jak bylo ukázáno ve studii s použitím IL5 knock-out myší, protilátková reakce závislá na T lymfocytech proti ovalbuminu, a také rozvoj cytotoxických T lymfocytů se jevily normální (Kopf et al., 1996). Protože myš je také nejpraktičtější a nejekonomičtější model ve srovnání s morčaty nebo opicemi, bude použit model astmatu/ přecitlivělosti dýchacích cest myší Bal/c senzibilizovaných ovalbuminem, jak byl použit autory Hamelman et al. (1997).

Jestliže se ale účinek IL5 na B lymfocyty v myším modelu ukáže problematickým, budou použity jiné vhodné zvířecí modely v oboru známé.

Příklad 17

Příprava DNA konstruktů kódujících myší IL5 a jeho varianty

Konstrukce varianty v pcDNA3.1+:

Inzerce epitopů P2 a P30 do mIL5 divokého typu byla provedena SOE-PCR s překrývajícími se primery obsahujícími sekvence epitopů. Gen mIL5 divokého typu obsahující vedoucí sekvenci (sekv. id. č. 63), klonovaný do pcDNA3.1+ s kanonickou Kozákovou sekvencí (za získání plazmidu p815), byl použit jako templát pro reakce PCR. Výsledné fragmenty byly štěpeny s Nhel a Notl, purifikovány a klonovány do p815 byly použity jako templát pro PCR.

•4 ····

4

4··

44

4 4 4

4 4

4'4 44

4 4 fl

444« 44 ···

4444

Drosophila

Klonování variant do pMT Drosophila vektoru s BiP vedoucí sekvencí a značkou UNI-His:

mIL5 divokého typu byl klonován do série pMT Drosophila expresních vektorů (Invitrogen) vytvořením PCR fragmentu s mIL5 specifickými primery obsahujícími vhodná restrikční místa a, kromě toho, obsahujícími sekvence kódující sekvenci podobnou Kozákově, následovanou BiP vedoucí sekvencí, následovanou sekvencí kódující značku UNI-His (sekv. id. č. 25) fúzovanou k 5' konci sekvence kódující zralý mIL5. Jako templát byla použita cDNA sekvence mIL5 divokého typu. Výsledný fragment byl štěpen EcoRI a Notl a byl pak klonován do vektoru pMT/V5-HisA (Invitrogen). Výsledný plazmid (p818) byl použit pro klonování variant obsahujících epitop do pMT. Ty byly klonovány štěpením variant vytvořených v pcDNA3.1+ se Sací a Notl a klonováním výsledných fragmentů do p818.

Klonování variant do pAC5:

mIL5 divokého typu a varianty mIL5 byly klonovány do pAC5 konstitutivního Drosophila expresního vektoru štěpením variant v pMT s EcoRI a Notl a klonováním výsledných fragmentů do vektoru pAC5.l/V5-HisA (Invitrogen).

Příklad 18

Příprava DNA konstruktů kódujících humánní IL5 a jeho varianty

Bylo uvažováno pět linií plazmidů obsahujících nemodifikovaný IL5 a všechny nebo některé z devíti IL5 variant. Linie zahrnují: 1) humánní IL5 pro DNA vakcinaci ve vektoru pCI vhodném pro expresi v humánních buňkách, 2) humánní IL5 s BiP vedoucí sekvencí a 15 aa značkou His (sekv.

• 4 ·44 ·

4

4 4 4

44

4 4 4 4

4 4 4

44 • 4 4

4

444 44 4 > 4 4

4444 44 44 #4· ·· 4444 id. č. 25, získaná od firmy UNIZYME v Hcrsholm, Dánsko, značka je v tomto textu nazvána UNI nebo značka UNIHis) ve vektor pMT/V5/HIS pro indukovatelnou expresi v Drosophila, 3) jako v bodu 2, ale bez značky His, 4) jako v bodu 3, ale s myším IL5 a 5) humánní IL5 s DAPI vedoucí sekvencí a 15 aa značka HIS ve vektoru pVL1393 pro expresi v bakulovirovém systému.

Plazmidy pro DNA vakcinaci ve vektoru pCI:

Název	Ref. č.	Kmen č.	Epitop
hIL5 (pCI)	p888	MR č. 1237	žádný
hIL5.1 (pCI)	p889	MR č. 1238	P2, klička 3
hIL5.2 (pCI)	p890	MR č. 1239	P30, klička 1
hIL5.3 (pCI)	p891	MR č. 1240	P30, klička 2
hIL5.4 (pCI)	p892	MR č. 1241	P2, klička 2
hIL5.5 (pCI)	p893	MR č. 1242	P2, klička 1
hIL5.6 (pCI)	p894	MR č. 1243	P2, klička 3
hIL5.7 (pCI)	p895	MR č. 1244	P30, klička 3
hIL5.12 (pCI)	p896	MR č. 1245	P30, klička 3
hIL5.13 (pCI)	p897	MR č. 1246	P2 a P30, klička 3
Plazmidy pro	expresi	humánního IL5 v Drosophila se značkou
UNI-His a BiP	vedoucí	sekvencí v pMT/V5/HIS
Název		Ref. č. Kmen	č. Epitop

hIL5m-UNI-BiP (pMT/V5-HisA)	p899	MR č.	1247 žádný
hIL5.lm-UNI-BiP (pMT/V5-HisA)	p900	MR č.	1248 P2, klička 3
hIL5.2m-UNI-BiP (pMT/V5-HisA)	p901	MR č.	1249 P30, klička 1
hIL5.3m-UNI-BiP (pMT/V5-HisA)	p929	MR č.	1277 P30, klička 2

·· *« ·♦ ···· ·· *· ···· ··· * · · · • 11 11111 11 1

9 11 9 111

1911 11 19 li· 11 1111

hIL5.4m-UNI-BiP	(pMT/V5-HisA)	p902	MR	č.	1250	P2,	klička 2
hIL5.5m-UNI-BiP	(pMT/V5-HisA)	p903	MR	č.	1251	P2,	klička 1
hIL5.6m-UNI-BiP	(pMT/V5-HisA)	p904	MR	č.	1252	P2,	klička 3
hIL5.7m-UNI-BiP	(pMT/V5-HisA)	p905	MR	č.	1253	P30,	klička 3
hIL5.12m-UNI-BiP	(pMT/V5-HisA)	p906	MR	č.	1254	P30,	klička 3
hIL5.13m-UNI-BiP	(pMT/V5-HisA)	p907	MR	č.	1255	P2	a P30,

klička 3

Plazmidy pro expresi humánního IL5 v Drosophila s BiP vedoucí sekvencí, ale bez značky UNI-His v pMT/V5/HIS:

Název	Ref. č.	Kmen	č.	Epitop
hIL5m-BiP (pMT/V5-HisA)	p908	MR č.	1256	žádný
hIL5.1m-BiP (pMT/V5-HisA)	p909	MR č.	1257	P2, klička 3
hIL5.2m-BiP (pMT/V5-HisA)	p921	MR č.	1269	P30, klička 1
hIL5.3m-BiP (pMT/V5-HisA)	p922	MR č.	1270	P30, klička 2
hIL5.4m-BiP (pMT/V5-HisA)	p923	MR č.	1271	P2, klička 2
hIL5.5m-BiP (pMT/V5-HisA)	p924	MR č.	1272	P2, klička 1
hIL5.6m-BiP (pMTlV5-HisA)	p925	MR č.	1273	P2, klička 3
hIL5.7m-BiP (pMT/V5-HisA)	p926	MR č.	1274	P30, klička 3
hIL5.12m-BiP (pMT/V5-HisA)	p927	MR č.	1275	P30, klička 3
hIL5.13m-BiP (pMT/V5-HisA)	p928	MR č.	1276	P2 a P30, klička 3

Plazmidy sekvencí,	pro expresi myšího IL5 v Drosophila s ale bez 15 aa značky His v pMT/V5/HIS:	BiP vedoucí
Název	Ref.	č. Kmen č.	Epitop
mIL5m-BiP	(pMT/V5-HisA) p918	MR č. 1266	žádný
mIL5.1m-BiP (pMT/V5-HisA) p919	MR č. 1267	P2, klička 3

00 ·»·· ·· 00 0 0 0 0 «00 · « « 0

0« · · ··« · · « «····· ···· 0 • 0 0 00 0 «0« «·«· 0« 00 000 0« ···· mIL5.2m-BiP (pMT/V5-HisA) p920

MR č. 1268 P30, klička 1

Plazmidy pro expresi humánního IL-5 v bakulovirovém systému se značkou UNI-His a DAP1 vedoucí sekvencí pVL1393 v pVLl393:

Název Ref. č. Kmen č. Epitop hIL5m-UNI-DAPl (pVL1393) p916 MR č. 1264 žádný hIL5.lm-UNI-DAPl (pVL1393) p917 MR č. 1265 P2, klička 3

Příklad 19

DNA imunizační studie

Vytvoření vektorů kódujících mIL5wt, mIL5.1 a mIL5.5 s Kozákovými sekvencemi pro pokusy s DNA vakcinací

DNA fragmenty kódující mIL5wt, mIL5.1 a mIL5.5 zahrnující přírodní vedoucí sekvenci (sekv. id. č. 63) byly vloženy do pcDNA3.1, a tak poskytly nové plazmidy p521, 522 a p523. Aby se zvýšila exprese cDNA v savčích buňkách, byly Kozákovy kanonické sekvence vloženy v protisměru od kódujících sekvencí s použitím technologie PCR. PCR reakce byly prováděny s použitím p521, p522 a p523 jako templátů a přímý primer kódující Kozákovu sekvenci hned v protisměru od mIL5 vedoucího startovacího kodonu. Purifikované PCR produkty byly klonovány do vektoru pcDNA3.1+ s použitím restrikčních endonukleáz BamHI a Notl. Výsledné plazmidy p815, p816 a p817, v daném pořadí, byly ověřeny DNA sekvencováním. Všechny další plazmidy použité pro pokusy s DNA vakcinací byly konstruovány s použitím p521 plazmidu jako výchozí látky.

• φ ♦« ·· Φφφφ φφ ·* • · · · φφφ φφφφ φ φ · φ φφφ* φ · φ φφφ φφ φ φφφ φφφφ φφ φφ φφφ φφ φφφφ

In vitro translace DNA vakcinačních plazmidů s použitím soupravy Promega

Komerční souprava používající králičí retikulocytový extrakt k vytvoření in vitro translatovaného proteinového produktu plazmidové DNA, byl dříve úspěšně používán v laboratoři původců ke sledování proteinové exprese z pcDNA plazmidů kódujícího např. cDNA ovalbuminu. DNA vakcinační plazmidy s myším IL5 byly přidány k reagenciím ze soupravy podle standardního postupu. Ale několik pokusů detekovat exprimovaný mIL5 materiál na autoradiogramech selhalo, i když pozitivní kontroly fungovaly. Výsledky z transfekcí COS buněk a DNA vakcinace ukázaly, že byly exprimovány genové produkty, takže původci tyto technické problémy dále nezkoumali.

Přechodná transfekce COS buněk DNA vakcinačními plazmidy pro určení stupně exprese

Aby bylo možné sledovat účinnost transfekce/exprese plazmidů použitých pro DNA vakcinační pokusy, byl zaveden test přechodné transfekce s použitím COS buněk. COS buňky byly ošetřeny trypsinem a naneseny do DMEM média doplněného 10% FCS v kultivačních lahvích T25. Buňky byly transfekovány 2. den s použitím soupravy Dotap (Roche Diagnostics) a sklízeny 5. den. Tkáňový supernatant, lyzát z celých buněk a preparáty bohaté na membrány byly testovány metodou Western blotování, aby se detekoval anti-mIL5 reaktivní expresní produkt. Anti-mIL5 reaktivní produkt v buněčných preparátech se shodně pohyboval jako 2 až 3 oddělené pásy o velikosti 21 až 28 kD při SDS-PAGE, zatímco molekulová hmotnost (MW) mIL5 monomeru použitého jako standard (exprimovaný v bakuloviru, R&D Systems) je pouze 15 až 18 kD. Při použití nedenaturačních podmínek tvořily látky o velikosti 21 až 28 kD dimery, takže původci mají za to, že látka byla mIL5, ·· ·9 99 9999 9« 49 • 9*9 999 «999

9 9 9··· · 9 4 ··· «9 9 499 •••9 99 99 9*9 9« 9999 možná v několika odlišně glykosylovaných formách. Výsledky DNA vakcinace (viz niže) jasně podporuji tento závěr.

DNA vakcinace myší s použitím myších konstruktů IL5 AutoVac

Byla prováděna DNA vakcinační studie, aby se vyšetřilo, zda protilátkové reakce specifické pro myší IL5 mohou být indukovány imunizací myší nahou plazmidovou DNA kódující 8 odlišných myší IL5 mutant. Protože dříve bylo publikováno, že IL5 má úlohu v diferenciaci B buněk , bylo nezbytné prokázat, že anti-mIL5 autoprotilátky mohou být tvořeny v myších a tolerance B buněk na mIL5 může být porušena.

Obecné dispozice DNA vakcinačních pokusů používají buď myši C3H/Hen (H-2^k) nebo myši Balb/cA (H-2^d) , 6 až 8 týdnů staré, rozdělené do skupin po 5 myších. Ve dnech 0, 14, 28,

42, 62 a 76 byla myším podána anestezie používající hypnorm/dormicum s.c. a byla jim podána injekce s expresními plazmidy kódujícími ovalbumin (kontroly), mIL5wt (divoký typ) nebo testované mIL5 varianty. DNA materiál byl připraven s použitím souprav bez endonukleáz Endofree GigaPrep (Qiagen) a rozpuštěn v koncentraci 1 pg/ml v 0,15M NaCl nebo 0,15M NaCl obsahující 0,1% roztok přípravku bupivacain. 100 μΐ látky bylo injikováno i.d. každé myši do dolní části hřbetu rozděleno do dvou injekčních míst. Předběžné vzorky krve byly získány minus 2. den a vzorky krve v testu byly získávány v týdnech 3, 5, 8 a 11. Séra byla izolována centrifugaci a uložena v -20°C až do testování metodou ELISA na reaktivitu proti purifikovanému ovalbuminu a proteinům mIL5.

Typický výsledek DNA vakcinačního pokusu je ukázán na obr. 4. Podle obecných dispozic popsaných výše bylo 40 myší Balb/cA imunizováno kontrolním plazmidem s ovalbuminem, plazmidem kódujícím mIL5wt nebo plazmidy kódující mIL5 AutoVac varianty mIL5.1 nebo mIL5.5. V tomto experimentu 9 z 9 myší imunizovaných plazmidem kódujícím ovalbumin vytvořilo • 4 «444

44 • 4 4

4* »444 4

4 4 4

4 4 · 4

4 4 « >444 44 «

4 4 • 444 «

4 4 4

4444 protilátky proti ovalbuminu, zatímco u myší, které dostaly DNA kódující mIL5 divokého typu nebo mIL5 variantu, nebyla indukována žádná reakce proti ovalbuminu. Injekce plazmidů kódujícího mIL5wt nevyvolala anti-mIL5 reakci, zatímco tolerance B buněk na mIL5 byla porušena u 4 z 10 myší imunizovaných plazmidem mIL5.1 a u 7 z 9 myší imunizovaných plazmidovou DNA kódující mIL5.5.

Podstatný výsledek celých sérií DNA vakcinačních pokusů je shrnut v tabulce uvedené níže. Počet reagujících jedinců v imunizační skupině byl odlišný mezi různými konstrukty mIL5 AutoVac a byl závislý na kmenu myší. Konstrukt mIL5.2 AutoVac byl zřetelně lepší než další varianty, byl schopen indukovat anti-mIL5 protilátkovou reakci u obou kmenů myší s penetrancí 100 %. Tento plazmid (p820) také měl nejvyšší stupeň exprese v COS transfekčním testu.

Dalším příkladem ke zdůraznění byla jasná MHC restrikce pozorovaná při použití plazmidové DNA kódující mIL5.4 jako imunogenu. Zatímco pouze 1/10 myší C3H/Hen odpovídá na DNA vakcínu, reagovalo 9 z 10 myší Balb/cA. Opačný jev (i když ne tak zřetelný) byl pozorován u konstruktu mIL5.6. DNA vakcína mIL5.2 se ale zdála být imunogenní všeobecně.

OVAwt-pVax mIL5wt-	mIL5.1- pcDNA	mIL5.2- pcDNA	mIL5.9- pcDNA
	pcDNA
Balb/cA	28/28	0/28	4/10	9/10	9/10
C3H/Hen	29/29	0/30	3/10	10/10	1/10
	mIL5.5	mIL5.6-	mIL5.7-	mIL5.12-	mIL5.13-
	pcDNA	pcDNA	pcDNA	pcDNA	pcDNA
Balb/cA	7/9	0/10	2/10	0/10	0/10*
C3H/Hen	5/10	6/10	2/10	2/10	2/10*

	4 «4 • 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 • 444 4« 89	ť* 444 44 44 • · · 4 4 4 • 4 444 «4 * 44* 44*4 4 4 4 4 4 · · 44 444 44 4444
Souhrn	výsledků DNA vakcinace 280 myší.	6 myší zemřelo
v průběhu	pokusu	z důvodů nesouvisejících	s účinky DNA
očkování.	Počet	reagujících jedinců (s	vysokými nebo

středními anti-mIL5 titry) je ukázán ve vztahu k celkovému počtu myší v každé imunizační skupině. *) vzorky krve získány v den 55. Všechny další vzorky krve byly získány v den 77.

Další vlastností stojící za zmínku byla tendence mIL5 variant s cizorodým epitopem pomocného T lymfocytů vloženým do mIL5 kličky 1 k tomu, že byly silnější DNA vakcinační imunogeny, než varianty s epitopem pomocného T lymfocytů vloženým v kličce 3. To by mohlo být způsobeno relativně vysokým stupněm exprese. Jediná testovaná varianta kličky 2, mIL5.4-pcDNA, byl silným imunogenem pouze pro kmen Balb/cA, jak bylo uvedeno výše.

Další charakterizace protilátkových reakcí indukovaných DNA očkováním

Experimenty s testem ELISA byly nastaveny tak, aby se určilo, zda by mohly být protilátky specifické pro vložený epitop pomocného T lymfocytů detekovány u anti-mIL5 pozitivních myší. V každé imunizační skupině byla sloučena séra z anti-mIL5 pozitivních myší a testována na reaktivitu proti P2 nebo P30 peptidům, které byly imobilizovány na AquaBind mikrotitrační destičky. Antiséra indukovaná DNA vakcinací proti mIL5.2 u obou myších kmenů nepochybně obsahovala reaktivitu proti vloženému P30, zatímco žádná další antiséra nebyla s P2 nebo P30 reaktivní. To bylo pravděpodobně spojeno s vyššími protilátkovými titry a penetrancí, což bylo obecně pozorováno u mIL5.2 DNA vakcinačního konstruktu. Je nutné se zmínit, že s použitím tohoto nastavení testu ELISA byli původci schopni detekovat anti-P2 reaktivitu v antiséru indukovanou proti mIL5.1.

• 9

9 9

9

9999

9 9

9

999· •

9999 9 9 9 999 9 9

9

999

Pozitivní anti-mIL5 sloučené antisérum z DNA očkovaných myší bylo také testováno v kompetitivním testu ELISA na svou schopnost inhibovat interakci mezi rozpustným nativním myším IL5 a monoklonálními protilátkami TRFK4 nebo TRFKS, což jsou obě neutralizační protilátky. Sériová ředění anti-mIL5 sloučených antisér byla preinkubována s rozpustným nativním mIL5 a vzorek byl přidán k ELISA destičkám potaženým záchytnou protilátkou TRFKS. Navázaný myší IL5 (který nebyl absorbován antiséry) byl dále vizualizován s použitím vrstvy biotinylovaného TRFK4, a pak streptavidinu značeného křenovou peroxidázou. Ne všechna anti-mIL5 pozitivní antiséra indukovaná DNA vakcinaci mohla inhibovat interakci mezi rozpustným mIL5 a TRFK4 nebo TRFK5. Antisérum s nej vyšší TRFK9/5 inhibiční schopností bylo z myší C3H/Hen imunizovaných DNA kódující mIL5.2. Nebylo testováno, zda pozorované rozdíly v inhibici byly přímo úměrné titračním rozdílům nebo byly spojeny s jemnou specifičností různých antisér. Nejpravděpodobněji to byla kombinace těchto dvou faktorů.

Zvířecí model eosinofilie u myší imunizovaných mIL5 AutoVac DNA

DNA očkovaných myší bylo vybráno pro testování ve zvířecím modelu eosinofilie: 10 myší Balb/cA imunizovaných DNA mIL5wt, 10 myší Balb/cA imunizovaných DNA mIL5.2, 10 myší C3H/Hen imunizovaných DNA mIL5wt a 10 myší C3H/Hen každé z těchto myší byl podáván režim s ovalbuminem, aby se byly senzibilizovány imunizovaných DNA mIL5.2 senzibilizačni/podnětový indukovala eosinofilie. subkutánními injekcemi ovalbuminu (OVA)

Myši 50 pg fyziologickém roztoku smíchaném v poměru 1:1 s Adjuphos jednou týdně po tři týdny. Čtyři dny po poslední OVA senzibilizaci byly myši podněcovány intranazálně s 12,5 μς

0,9% • · ·· · · • · ·· • · · • ·

OVA v 0,9% fyziologickém roztoku každý druhý den do celkového počtu 3 podnětů. Tekutina z bronchoalveolární laváže (BALF) byla sbírána jeden den po poslední senzibilizaci kanylací trachey a promytím lumina dýchacích cest s 1 ml PBS.

Přibližně 30 000-60 000 buněk BALF bylo stočeno na podložních sklíčkách v 1500 rpm po dobu 20 minut. Sklíčka byla usušena přes noc a barvena 2,5 minuty s May-Grunwaldovým barvivém (Sigma), promývána 4 minuty ve fyziologickém roztoku pufrovaném trisem, barvena 20-30 minut s Geimsovým barvivém (1:20 s ddHžO, Sigma) a krátce opláchnuta ddH₂O. Obarvená sklíčka byla sušena přes noc a typy buněk byly identifikovány s použitím světelného mikroskopu. Na každém sklíčku bylo počítáno přibližně 100 až 200 buněk a pro každou myš byla počítána 3 sklíčka. Počty eosinofilů byly vyjádřeny jako počet eosinofilů na 100 počítaných buněk. U myší C3H/Hen očkovaných DNA mIL5.2 byla indukce plicní eosinofilie významně down-regulována ve srovnání se skupinou očkovanou DNA mIL5wt divokého typu (mIL5.2 DNA: 14,6 ± 8,9 eosinofilů na 100 buněk, mIL5wt DNA: 51,1 ± 9,9 eosinofilů na 100 buněk). Ale u kmene Balb/cA nebyl žádný významný rozdíl v počtech eosinofilů mezi imunizačními skupinami (mIL5.2 DNA: 23,3 ± 6,8 eosinofilů na 100 buněk, mIL5wt DNA: 27,7 ± 9,3 eosinofilů na 100 buněk). Možné vysvětlení je, že myši Balb/cA jsou na model pouze slabě citlivé. To bylo podporováno daty z testu anti-ovalbumin ELISA, ukazujícími, že jeden týden před odběrem BALF byly anti-ovalbuminové titry v séru myší Balb/cA nižší než v séru myší C3H/Hen. Bylo publikováno, že podkmen Balb/cJ je citlivý v modelu OVA senzibilizace/podnět.

• · · · · · · ·· · · · · · · • · · · · ·

Příklad 20

Studie vakcinace proteinem

Myši Balb/c J byly imunizovány myším IL5 (mIL5) proteinem a podrobeny modelu s intranazálním podáním ovalbuminu, který indukuje eosinofily v plicích ošetřených myší. Oba UniHis-mIL5 a UniHis-mIL5.1 proteiny indukovaly protilátky, které zkříženě reagovaly s mIL-5 tvořeným v buňkách sf9 od firmy R&D Systems. Model eosinofilie indukoval vysoké počty eosinofilů v OVA kontrolní skupině a UniHis-mIL5.1 skupině, zatímco počty eosinofilů byly redukovány jak v PBS skupině, tak v UniHis-mIL5 skupině. Tento výsledek vedl původce k tomu, že měli za to, že mohly být sloučeny.

Materiál a metody

UniHis-mIL-5 E1320 a E01397

UniHis-mIL-5.1 E01337 a E01396

Imunizace

6-8 týdnů staré samice myší Balb/c J (M&B) byly imunizovány buď s 1) ničím, 2) PBS, 3) UniHis-mIL5 nebo 4) UniHis-mIL5.1 v kompletním Freundově adjuvans (CFA, Sigma) a upomínány 3 krát v intervalech tří týdnů antigenem v nekompletním Freundově adjuvans (IFA, Sigma). Séra byla sbírána a testována testem ELISA 10 dnů po každé upomínací dávce.

Testy ELISA

Ant.i-UniHis-mIL5 ELISA

Séra byly získána 32. den (krevní vzorek 1) a 54. den (krevní vzorek 2) po 2 a 3 imunizacích, v daném pořadí.

Polystyrénové mikrotitrační destičky (Maxisorp, Nunc) byly potaženy purifikovaným HIS-mIL5wt (0,1 gg/jamku, E1320). Reaktivity naředěných sér přidávaných do jamek byly vizualizovány s použitím kozí anti-myší sekundární protilátky. Hodnoty odečítání OD490 kontrolních sér z myší imunizovaných PBS ve Freundově adjuvans byly subtrahovány od hodnot odečítání OD490 testovaných vzorků.

Anti-mIL5 ELISA

Séra byla získána 75. den (krevní vzorek 3) . Polystyrénové mikrotitrační destičky (Maxisorp, Nunc) byly potaženy se zakoupeným mIL5 (0,1 gg/jamku, R&D kat. č. 405ML) . Reaktivity 1:1000 naředěných sér přidávaných do jamek byly vizualizovány s použitím kozí anti-myší sekundární protilátky. Reaktivita TRFK5 (2 gg/ml) byla vizualizována s použitím králičí anti-potkaní sekundární protilátky.

Kompetitivní ELISA

Ředění antisér byla preinkubována s rozpustným IL5 po dobu 1 hodiny a přidána na polystyrénové mikrotitrační destičky (Maxisorp, Nunc) , které byly potaženy se záchytnou protilátkou TRFK5. Navázaný mIL5 byl vizualizován s použitím biotinylované TRFK4 a kozí anti-myší sekundární protilátky značené HRP.

Anti-P2 ELISA

Sloučená antiséra z HIS-mIL5wt, HIS-mIL5.1 nebo PBS imunizovaných myší byla testována na reaktivitu proti P2 peptidů v testu ELISA. Specializované mikrotitrační destičky (AguaBind, M&E Biotech) byly potaženy s 0,5 gg/jamku syntetického P2 peptidů. Reaktivity naředěných sér přidávaných do jamek byly vizualizovány s použitím kozí antimyší sekundární protilátky značené HRP (1:2000, Dako).

Anti-UniHis ELISA

Sloučená antiséra z HIS-mIL5wt, HIS-mIL5.1 nebo PBS imunizovaných myší byla testována na reaktivitu proti peptidu se značkou HIS (UNIZYME) v testu ELISA. Specializované mikrotitrační destičky (AquaBínd, M&E Biotech) byly potaženy s 0,5 pg/jamku syntetického peptidu se značkou HIS. Reaktivity naředěných sér přidávaných do jamek byly vizualizovány s použitím kozí anti-myší sekundární protilátky značené HRP (1:2000, Dako).

Anti-S₂ protein pozadí ELISA

Sloučená antiséra z HIS-mIL5wt, HIS-mIL5.1 nebo PBS imunizovaných myší byla testována na reaktivitu proti preparátu S₂ pozadí v testu ELISA. Polystyrénové mikrotitrační destičky (Maxisorp, Nunc) byly potaženy s 0,1 pg/jamku preparátu S₂ pozadí. Reaktivity naředěných sér přidávaných do jamek byly vizualizovány s použitím kozí antimyší sekundární protilátky značené HRP (1:2000, Dako).

Anti-BSA ELISA

Sloučená antiséra z HIS-mIL5wt, HIS-mIL5.1 nebo PBS imunizovaných myší byla testována na reaktivitu proti BSA v testu ELISA. Polystyrénové mikrotitrační destičky (Maxisorp, Nunc) byly potaženy s 10 pg/jamku BSA (Intergen). Reaktivity naředěných sér přidávaných do jamek byly vizualizovány s použitím kozí anti-myší sekundární protilátky značené HRP (1:2000, Dako).

Model eosinofilie

Myši Balb/c J byly senzibilizovány subkutánními injekcemi 50 μρ ovalbuminu (OVA) v 0,9% fyziologickém roztoku smíchaném v poměru 1:1 s Adjuphos jako alumovým adjuvanciem.

• · « *

44 4

4« • 444 · · · ···

4 4 4 4444 4 4

OVA imunizace byly opakovány jednou týdně po dobu čtyř týdnů. Jeden týden po poslední OVA senzibilizaci byly myši podněcovány s 12,5 pg OVA v 0,9% fyziologickém roztoku intranazálně každý druhý den do celkového počtu 3 podnětů. Tekutina z bronchoalveolární laváže (BALF) byla sbírána jeden den po poslední senzibilizaci kanylací trachey a promytím lumina dýchacích cest s 1 ml 0,9% fyziologického roztoku nebo PBS.

BAL značení

Přibližně 30 000-60 000 buněk BALF bylo stočeno na podložních sklíčkách v 1500 rpm po dobu 20 minut. Sklíčka byla usušena přes noc a barvena 2,5 minuty s May-Grunwaldovým barvivém (Sigma), promývána 4 minuty v TBS, barvena 20-30 minut s Geimsovým barvivém (1:20 s ddH₂O, Sigma) a krátce opláchnuta ddH₂O. Obarvená sklíčka byla sušena přes noc a typy buněk byly identifikovány s použitím světelného mikroskopu. Na každém sklíčku bylo počítáno přibližně 100 až 200 buněk a pro každou myš byla počítána 3 sklíčka.

Výsledky

Detekce anti-mIL5 protilátek

Byla prováděna série experimentů ELISA, aby se zkoumalo, zda protilátkové reakce specifické pro myší IL5 byly indukovány u myší imunizovaných s proteiny HIS-mIL5wt a HIS-mIL5.1. Zaprvé bylo zjišťováno, zda protilátky proti HIS-mIL5wt imunizačnímu matriálu byly vyvolány testováním ředění antisér z jednotlivých myší na destičkách ELISA potažených s materiálem HIS-mIL5wt. Bylo zjištěno, že již v prvním krevním vzorku vyvinuly všechny myši protilátkovou reakci s vysokými titry proti HIS-mIL5wt (E1320, exprimován • · • · ··· ·

Drosophila S₂ buňkami a purifikován), která byla odhadem přibližně z 95 % čistá.

Tento výsledek není pevným potvrzením toho, že antiséra zkříženě reagují s myším IL5. Při těchto dispozicích mohla být také detekován reaktivita proti nečistotám z Drosophila S₂ buněk, S₂ médiu (které obsahuje např. BSA z fetálního telecího séra, značku HIS, a také denaturované mIL5 epitopy B lymfocytu). Aby se prokázalo, že indukované protilátky obsahují reaktivity proti nativnímu myšímu IL5, byla séra testována na destičkách ELISA potažených s mIL5 zakoupeným od firmy R&D Systems. Tato látka (R&D kat. č. 405-ML) je biologicky aktivní, neobsahuje žádnou značku HIS, je exprimována v systému bakuloviru Sf21, je také velmi čistá (97 %) a může být zakoupena bez proteinového nosiče (BSA). Sloučená séra z obou imunizačních skupin reagovala s destičkami ELISA potaženými zakoupeným mIL5, zatímco séra z myší imunizovaných PBS nereagovala. To bylo ukázáno při testování sér z krevních vzorků 3 získaných 75. den, 11 dnů po 4. imunizaci, ale také séra z krevního vzorku 1 a 2 reagovala se zakoupeným mIL5 při podobném nastavení testu. Aby se vyloučily signály ze zkřížené reakce s nosičem BSA, byly experimenty opakovány pro krevná vzorky 1 a 2 s použitím verzí bez nosiče zakoupeného mIL5 a pufrů ELISA bez BSA a stále byly pozorovány vysoké reakce anti-mIL5.

Aby se dále potvrdilo, že indukovaná antiséra zkříženě reagují s nativním mIL5, byl sestaven kompetitivní test ELISA. Tento test ELISA testoval schopnost odlišných antisér inhíbovat interakci mezi rozpustným nativním myším IL5 a monoklonálními protilátkami TRFK4 nebo TRFK5, které jsou obě neutralizační protilátky. Sériová ředění sloučených antisér byla preinkubována s rozpustným nativním mIL5 a vzorky byly přidán na destičky ELISA potažené záchytnou protilátkou TRFK5. Navázaný myší IL5 (který nebyl absorbován antiséry) ·· «φ 44 4444 44 ··

4444 4 · · 4444 • 4 4 4 4 · 4 4 4 4 4 • • 444 4 444 · · ····· ···· ···· ·· ·· ··· ·« ···· byl dále vizualizován s použitím vrstvy biotinylované TRFK4, a pak streptavidinem značeným křenovou peroxidázou. Jako kontroly bylo zahrnuto anti-mIL5 pozitivní a anti-mIL5 negativní antisérum z DNA očkovaných myší. Bylo prokázáno, že antiséra myší imunizovaných jak HIS-mIL5wt, tak HIS-mIL5.1 mohou inhibovat interakci mezi rozpustným mIL5 a TRFK4 nebo TRFK5.

mIL5 myší

Na základě výše uvedeného bylo uzavřeno, že specifické autoprotilátky byly indukovány u imunizovaných buď s HIS-mIL5wt nebo HIS-mIL5.1 proteinovými přípravky (u 100 % testovaných myší). Jinými slovy, tolerance B lymfocytů na mIL5 může být porušena při použití rekombinantních verzí značených HIS jak divokého typu, tak myšího IL5 AutoVac. Pravděpodobné vysvětlení pozorování, že tolerance B lymfocytů je porušena k protein divokého typu je, že značka HIS u těchto myší funguje jako cizorodý imunogenní epitop pomocného T lymfocytů. Dalším vysvětlením by mohlo být, že kompletního Freundova adjuvans ruší toleranci B lymfocytů na mIL5. Tyto hypotézy mohou být testovány s použitím antigenů neznačených HIS a/nebo s alternativním méně silným adjuvans, jako je například AdjuPhos.

Další charakterizace protilátkových reakcí u myší imunizovaných s proteiny mIL5 AutoVac

ELISA experimenty byly nastaveny tak, aby určily, zda protilátky specifické pro vložený epitop pomocného T lymfocytů mohou být detekovány v sérech myší imunizovaných proteinem mIL5. Pro každou imunizační skupinu byla sloučena antiséra (krevní vzorek 2) a testována na reaktivitu proti syntetickému P2 peptidu, který byl imobilizován na mikrotitračních destičkách AquaBind. Antisérum anti-HISmIL5.1 obsahovalo reaktivitu proti vloženému P2 peptidu, • · « · • · · « · ·· · ·

• · · zatímco ani anti-HIS-mIL5wt nebo anti-PBS/CFA s peptidem nereagovalo.

Bylo také testováno, zda antiséra anti-HIS-mlLwt a antiHIS-mIL5.1 obsahovala reaktivitu proti 15-merní značce HIS (UNIZYME značka HIS, sekv. id. č. 25), která byla fúzována k N-koncové části jak divokého typu, tak proteinů mIL5 AutoVac. Peptid byl syntetizován a kovalentně imobilizován na mikrotitrační destičky AquaBind a sloučená antiséra z každé imunizační skupiny (krevní vzorky 1, 2 a 3) byla testována na reaktivitu proti navázanému peptidu. Antiséra ze všech myší imunizovaných proteinem reagovala se syntetickým peptidem se značkou HIS.

Bylo také testováno, zda antiséra anti-HIS-mIL5wt a anti-HIS-mIL5.1 byla reaktivní se složkami S₂ Drosophila buněk nebo kultivačního média. Destičky ELISA potažené BSA (hlavní složka média) nebo preparátem S₂ pozadí (vytvořeným podrobením kultivačního supernatantu z Her2 exprimujících Drosophila S₂ buněk purifikačnímu schématu podobnému mIL5 purifikačnímu postupu). Výsledky těchto analýz prokázaly, že zatímco anti-BSA reakce byly velmi nízké, reakce s materiálem S₂ pozadí byly výrazné.

Počty eosinofilů v BALF

Aby se určilo, zda protilátky anti-IL5 u očkovaných myší mohou down-regulovat in vivo aktivitu IL5, indukovali původci eosinofilii závislou na IL5 v plicích očkovaných myší. Eosinofily byly indukovány podněcováním senzibilizovaných myší intranazálně s OVA. Vysoké počty eosinofilů byly indukovány u kontrolních OVA myší a myší očkovaných s UniHismIL5.1, ale ne u myší očkovaných Uni-His-mIL5 nebo PBS. Neshoda počtu eosinofilů mezi kontrolními skupinami (OVA a PBS) a experimentálními skupinami (UniHis-mIL5 a UniHismlLS.l), a pozitivní výsledky od DNA očkovaných myší uvedené • · ·· · · · · ·Β ·· • · · * · « · · • · Β Β ΒΒΒ· · · · • «••·· ···· · ····· ···· «··· ·· ·· ··· ·· ···· výše vedly původce k tomu, že skupiny mohly být zaměněny. Ale žádné pokusy k průkazu záměny nepodpořily tuto interpretaci. Očkování proteiny byly opakovány v identickém nastavení, aby se tato neshoda objasnila.

Diskuse

Schopnost obou proteinů UniHis-mIL5 a UniHis-mIL5.1 indukovat protilátky, které zkříženě reagují s myším IL5 divokého typu byla jasně prokázána. Zdali schopnost proteinu UniHis-mIL5 obejít imunologickou toleranci byla způsobena značkou UniHis nebo z některého dalšího důvodu (např. CFA adjuvans) zbývá ověřit. Je překvapivé pozorovat, že pouze konstrukt UniHis-mIL5 byl schopen down-regulovat endogenní in vivo aktivitu mIL5 v modelu eosinofilie. Tato neschopnost antiséra vytvořeného při vakcinaci proteinem UniHis-mIL5.1 inhibovat eosinofilii a jeho schopnost inhibovat eosinofilii prostřednictvím DNA očkování svědčí pro to, že se v tomto pokuse mohla objevit technická chyba. To by také podporovalo neobvyklé zjištění, že vakcinace PBS inhibovala eosinofilii. Nejpravděpodobnější vysvětlení je, že tyto dvě skupiny (PBS a UniHis-mIL5.1) byly prohozeny.

Seznam literatury

Akutsu I. Et al., 1995, Immunol. Lett., 45, 109-116.

Alexander	A.	G.	Et al., 1994, Thorax,	49(12), 1231-1233.
Azuma C. 9158.	Et	al.	, 1986, Nucleic Acid	Res. 1986,	14(22), 9149-
Barata L. 222-230.	T.	Et	al., 1998, J. Alergy	and Clin.	Immunol, 101,
Baumann M	.A.	Et	al., 1997, Methods, 11, 88-97

44

4 4 4

4 4

4

4 · 44 4 444 ···· · · · · · · · «4 «444

100

Callard R.E. & Gearing A.J.H., ’IL-5’, Cytokine Facts Book

1994, Academie Press.

Campbell H.D. Et al., 1988, Eur. J. Biochem., 174, 345-352. Chand N. Et al., 1992, Eur. J. Immunol., 211, 121-123.

Coeffier E. Et al., 1994, Br. J. Pharmacol., 113(3), 749-56.

Coffman R.L. Et al., 1989, Science, 245, 308-310.

Corrigan C.J. & Kay A.B., 1996, Eur. Resp. J., 9, suppl. 22, 72s-78s.

Cousins D.J. 150, S50-S53.	Et	al.,	1994,	Am. J. Resp.	Crit.	Care. Med
Danzig M. Et	al. ,	1997	, Aler	gy, 52(8), 787	-794.
Dickason R.R.	Et	al.,	1994,	Cytokine, 6(6)	, 647-656.
Dickason R.R.	Et	al.,	1996a,	Nátuře, 379,	652-655,
Dickason R.R.	Et	al.,	1996b,	J. Mol. Med.,	74(9) ,	535-546
Egan R.W. Et	al.,	1995	, Int.	Arch. Alergy	Immunol	., 107, 32

322.

Foster P.S. Et al., 1996, J. Exp. Med., 183, 195-201.

Graber P. Et al., 1993, Eur. J. Biochem., 212(3), 751-755.

Graber P. Et al., 1995, J. Biol. Chem., 270(26), 15762-15769.

Hamelmann E. Et al., 1997, Am. J. Crit. Care Med., 155(3), 819-825.

Huston M.M. Et al., 1996, J. Immunol., 156(4), 1392-1401.

Karlen S. Et al., 1998, Int. Rev. Immunol., 16(3-4), 227-247.

Kodama S. Et al., 1993, Eur. J. Biochem., 211(3), 903-908.

Kopf M. Et al., 1996, Immunity, 4, 15-24.

Kung T.T. Et al., 1995, Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol., 13, 360-365.

Lee N.A. Et al·., 1997a, J. Immunol., 158, 1332-1344.

φφ φ φ φ

φ φ

φφφφ φφ • φ φ φ φ

φ φφ φφφφ φ · • · φ φ φφφ

101

Lee J.J. Et al., 1997b, J. Exp. Med. 1997b, 185(12), 21432156.

Lopez A.F. Et al., 1992, Immunology Toden, 13, 495-500.

Mauser P.J. Et al., 1993, Am. Rev. Respir. Dis., 148, 16231627.

Mauser P.J. Et al., 1995, Am. J. Respir. Crit. Care Med., 152 (2), 467-472.

Milburn M.V. Et al., 1993, Nátuře, 363, 172-176.

Moři A. Et al., 1997, J. Alergy Clin. Immunol., 100(6) Pt 2, S56-64.

Moxham J. & Costello J.F., 'Respirátory diseases', kap. 14, Textbook of Medicine, Churchill Livingstone 1990, Ed. Souhami R.L. and Moxham J.

Nagai H. Et al., 1993a, Ann. N.Y. Acad.Sci., 91-96.

Nagai H. Et al., 1993b, Life Sciences, 53, PL 243-247.

Ohashi Y. Et al., 1998, Scand. J. Immunol, 47, 596-602.

Ortega D. & Busse W.W., 'Asthma, Pathogenesis and treatmenť, kap. 28, Alergy, W.B. Saunders Company 1997, Ed. Kaplan A.P. Proudfoot A.E. Et al., 1990, Biochem J., 270(2), 357-361.

Proudfoot A.E. Et al., 1996, J. Protein Chem., 15(5), 491499.

Rose K. Et al., 1992, Biochem J, 286(Pt 3), 825-828.

Sanderson C.J., 1992, Blood, 79(12), 3101-3109.

Sher A. Et al., 1990, J. Immunol., 145, 3911-3916.

Takatsu K. Et al., Interleukin-5, Growth Factors and Cytokines in Health and Disease 1997, díl 2A, JAI Press lne., vyd. Leroith D. & Bondy C.

Tanabe T. Et al., 1987, J. Biol. Chem., 262, 16580-16584.

Tavernier J. Et al., 1989, DNA, 8(7), 491-501.

4 ·4 * ·

44 • 444 444 4444

4 4 4 4 444 4 4 4

444 4 444 4 4

444 44 4 444

4444 44 44 ·44 44 4444

102

Tominaga A. Et al., 1990, J. Immunol., 144(4), 1345-1352. Tominaga A. Et al., 1991, J. Exp. Med., 173(2), 429-437.

Underwood D.C. 154, 850-857.	Et al.	ř	1996,	Am. J. Resp.	Crit.	Care Med.,
van Oosterhout 548-552.	A.J.M.	Et	al. ,	1993, Am. Rev	. Resp.	Dis., 147,
van Oosterhout	A.J.M.	Et	al.,	1995, Am. J.	Respir.	Crit. Care

Med., 151, 177-183.

Villinger F. Et al., 1995, J. Immunol., 155, 3946-3954.

Wang P. Et al., 1998, J. Immunol., 160, 4427-4432.

Yamaguchi Y. Et al.

1991, Blood, 78 (10), o r- λ '•vr-z'-» z54z-zo4/.

• 4 « 4 « • · 4 4 «4 4 · 4 4

4· 4 · • 444 *4 44

9 4 44·

9 • ·4·

44

9 9 4 • 4 4 • 44 4

4 4

4444

103

SEZNAM SEKVENCI <210> 1 <211> 115 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<221> Disulfid <222> (44) <223> Meziřetězcová disulfidová vazba k Cys-86 ze sekv. id. č. : 1 <220>

<221> Disulfid <222> (86) <223> Meziřetězcová disulfidová vazba k Cys-44 ze sekv. id.

č. : 1 <400> 1

Ile 1

Pro

Thr

Glu

Ile 5

Pro

Thr

Ser

Ala

Leu 10

Val

Lys

Glu

Thr

Leu 15

Ala

Leu

Ser

Thr 20

His

Arg

Thr

Leu

Leu 25

Ile

Ala

Asn

Glu

Thr 30

Leu

Arg

Ile

Pro

Val 35

Pro

Val

His

Lys

Asn 40

His

Gin

Leu

Cys

Thr 45

Glu

Ile

Phe

Gin 50

Gly

Ile

Gly

Thr

Leu 55

Glu

Ser

Gin

Thr

Val 60

Gin

Gly

Thr

Val 65

Glu

Arg

Leu

phe

Lys 70

Asn

Leu

Ser

Leu

Ile 75

Lys

Tyr

Ile

Asp 80

Gly

Gin

Lys

Lys 85

Cys

Gly

Glu

Arg Arg Arg 90

Val

Asn

Gin 95

Phe

Leu

Asp

Tyr

Leu 100

Gin

Glu

Phe

Leu

Gly 105

Val

Met

Asn

Thr

Glu 110

Trp

Ile

Glu

Ser 115

<210> 2 <211> 126 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: humánní IL5 modifikovaný substitucí s epitopem P2 tetanického toxoidu

4

4 4

4

4 • 4

444 4 • 4 • 4 4 4

4 · · 4 · 4

4444 *·

4444

4 · 4

4 444 4

4 4 4 4

4 4 4

4··

104 <220>

<221> Mutagen <222> (32)..(46) <223> Epitop P2 tetanického toxoidu (sekv. id. č.: 23) <220>

<221> Podobná <222> (1)..(86) <223> Identická se zbytky 1-86 ze sekv. id. č.: 1 <220>

<221> Podobná <222> (102)..(126) <223> Identická se zbytky 91-115 ze sekv. id. č.: 1 <400> 2

Ile

Pro

Thr

Glu

Ile

Pro

Thr

Ser

Ala

Leu

Val

Lys

Glu

Thr

Leu

Ala

1

5

10

15

Leu

Ser

Thr

His

Arg

Thr

Leu

Ile

Ala

Asn

Glu

Thr

Leu

Arg

20

25

30

Ile Pro

Val

Pro

Val

His

Lys

Asn

His

Gin

Leu

Cys

Thr

Glu

Ile

35

40

45

Phe

Gin

Gly

Ile

Gly

Thr

Leu

Glu

Ser

Gin

Thr

Val

Gin

Gly

Thr

50

55

60

Val

Glu

Arg

Leu

Phe

Lys

Asn

Leu

Ser

Leu

Ile

Lys

Tyr

Ile

Asp

65

70

75

80

Gly

Gin

Lys

Cys

Gin

Tyr

Ile

Lys

Ala

Asn

Ser

Lys

Phe

Ile

85

90

95

Gly

Ile

Thr

Glu

Leu

Arg Arg

Val

Asn

Gin

Phe

Leu

Asp

Tyr

Leu

Gin

100

105

-

110

Glu

Phe

Leu

Gly

Val

Met

Asn

Thr

Glu

Trp

Ile

Xlé

Glu

Ser

115

120

125

<210> 3 <211> 118 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: humánní IL5 modifikovaný substitucí s epitopem P2 tetanického toxoidu <220>

<221> Mutagen <222> (32)..(46) ·· • *« · » ·© © · · • · © « • · ► « · · ©

105 <223> Epitop P2 tetanického toxoidu (sekv. id. č.: 23) <220>

<221> Podobná <222> (1) . . (31) <223> Identická se zbytky 1-31 ze sekv. id. č.: 1 <220>

<221> Podobná <222> (47)..(118) <223> Identická se zbytky 44-115 ze sekv. id. č.: 1 <400> 3

Ile Pro Thr Glu Ile Pro Thr Ser Ala Leu Val Lys Glu Thr Leu Ala

1

5

10

15

Leu

Ser

Thr

His Arg

Thr

Leu

Ile

Ala

Asn

Glu

Thr

Leu

Gin

20

25

30

Tyr

Ile

Lys

Ala

Asn

► Ser

Lys

Phe

Ile

Gly

Ile

Thr

Glu

Leu

Cys

Thr

35

40

45

Glu

GlU

Ile

Phe

Gin

Gly

Ile

Gly

Thr

Leu

Glu

Ser

Gin

Thr

Val

Gin

50

55

60

Gly

Thr

Val

Glu

Arg

Leu

Phe

Lys

Asn

Leu

Ser

Leu

Ile

Lys

65

70

75

80

Tyr

Ile

Asp

Gly

Gin

Lys

Cys

Gly

Glu

Arg

Val

85

90

95

Asn

Gin

Phe

Leu

Asp

Tyr

Leu

Gin

Glu

Phe

Leu

Gly

Val

Met

Asn

Thr

100

105

110

Glu Trp Ile Ile Glu Ser 115 <210> 4 <211> 124 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>

<221> Mutagen <222> (59).. (73) <223> Epitop P2 tetanického toxoidu (sekv. id. č.: 23) <220>

<221> Podobná • · « · • · · © · · · © « © ·©·· ♦· • « ·♦·· ♦ · · • ♦ ··· © · · « · · « · ·♦ · ·· ·· • © · © © « · • · © • « © ·· ····

106 <222> (1).. (58) <223> Identická se zbytky 1-58 ze sekv. id. č.: 1 <220>

<221> Podobná <222> (74)..(124) <223> Identická se zbytky 65-115 ze sekv. id. č.: 1 <400> 4

Ile 1

Pro Thr

Glu

Ile 5

Pro Thr Ser Ala

Leu Val Lys Glu Thr Leu

Ala

10

15

Leu

Ser

Thr

His

Arg

Thr

Leu

Ile

Ala

Asn

Glu

Thr

Leu

Arg

20

25

30

Ile

Pro

Val

Pro

Val

His

Lys

Asn

His

Gin

Leu

Cys

Thr

Glu

Ile

35

40

45

Phe

Gin

Gly

Ile

GÍy

Thr

Leu

Glu

Ser

Gin

Tyr

Ile

Lys

Ala

Asn

50

55

60

Ser

Lys

.Phe

Ile

Gly

Ile

Thr

Glu

Leu

Val

Glu

Arg

Leu

Phe

Lys

Asn

65

70

75

80

Leu

Ser

Leu

Ile

4 Lys

► Lys

Tyr

Ile

Asp

Gly

Gin

Lys

Cys

Gly

85

90

95

Glu

Arg

Val

Asn

Gin

Phe

Leu

Asp

Tyr

Leu

Gin

Glu

Phe

100

105

110

Leu

Gly

Val

Met

Asn

Thr

Glu

Trp

Ile

Glu

Ser

115

120

<210> 5 <211> 124 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>

<221> Mutagen <222> (86)..(100) <223> Epitop P2 tetanického toxoidu (sekv. id. č.: 23) <220>

<221> Podobná <222> (1)..(85) <223> Identická se zbytky 1-85 ze sekv. id. č.: 1 <220>

• 4

4444

4·

4« 444«

4444 44

4 · • 4 444

4 4 4

4 9·

444 • 4 • 4 • 4 • 4

107 <221> Podobná <222> (101)..(124) <223> Identická se zbytky 90-115 ze sekv. id. č.: 1 <400> 5

Ile Pro 1

Thr Glu

Ile Pro 5

Thr Thr

Ser Ala Leu Val Lys 10

Glu Thr Leu Ala

Ser

Thr 20

Glu

15

Leu

His

Arg

Leu

Leu 25

Ile Ala

Asn

Thr 30

Leu

Arg

Ile

Pro

Val 35

Pro

Val

His

Lys

Asn 40

His

Gin

Leu

Cys

Thr 45

Glu

Ile

Phe

Gin 50

Gly

Ile

Gly

Thr

Leu 55

Glu

Ser

Gin

Thr

Val 60

Gin

Gly

Thr

Val 65

Glu

Arg

Leu

Phe

Lys 70

Asn

Leu

Ser

Leu

Ile 75

Lys

Tyr

Ile

Asp BO

Gly

Gin

Lys

Lys 85

Gin

Tyr

Ile

L-ys

Ala 90

Asn

Ser

T.o« —j —

Phe

Ile 95

Gly

Ile

Thr

Glu

Leu 100

Arg

Val

Asn

Gin

Phe 105

Leu

Asp

Tyr

Leu

Gin 110

Glu

Phe

Leu

Gly

Val 115

Met

Asn

Thr

Glu

Trp 120

Ile

Glu

Ser

<210> 6 <211> 126 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>

<221> Mutagen <222> (110)..(124) <223> Epitop P2 tetanického toxoidu (sekv. id. č.: 23) <220>

<221> Podobná <222> (1)..(109) <223> Identická se zbytky 1-109 ze sekv. id. č.: 1 <220>

<221> Podobná <222> (125)..(126) <223> Identická se zbytky 114-115 ze sekv. id. č.: 1 ·· φφ φφ *♦·· φφ ·«

ΦΦΦΦ Φ Φ Φ » 1 I · φφφ φφφφφ φφ · φφ φφφ φ φφφ φ φ φφφ φφ φ φφφ φφφφ φφ φφ φφφ ·· φφφφ

108 <400> β

Ile

Pro

Thr

Glu

Ile

Pro

Thr

Ser

Ala

Leu

Val

Lys

Glu

Thr

Leu

Ala

1

5

10

15

Leu

Ser

Thr

His

Arg

Thr

Leu

Ile

Ala

Asn

Glu

Thr

Leu

Arg

20

25

30

Ile

Pro

Val

Pro

Val

His

Lys

Asn

His

Gin

Leu

Cys

Thr

Glu

Ile

35

40

45

Phe

Gin

Gly

Ile

Gly

Thr

Leu

Glu

Ser

Gin

Thr

Val

Gin

Gly

Thr

50

55

60

Val

Glu

Arg

Leu

Phe

Lys

Asn

Leu

Sex

Leu

Ile

Lys

Tyr

Ile

Asp

65

70

75

80

Gly

Gin

Lys

Cys

Gly

Glu

GlU

Arg

Val

Asn

Gin

Phe

85

90

95

Leu

Asp

Tyr

Leu

Gin

Glu

Phe

Leu

Gly

Val

Met

Asn

Thr

Gin

Tyr

Ile

100

105

110

Lys

Ala

Asn

Ser

Lys

Phe

Ile

Gly

Ile

Thr

Glu

Leu

Glu

Ser

115

120

125

<210> 7 <211> 132 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: humánní IL5 modifikovaný substitucí s epitopem P30 tetanického toxoidu <220>

<221> Mutagen <222> (87)..(107) <223> Epitop P30 tetanického toxoidu (sekv. id. č.: 24) <220>

<221> Podobná <222> (108)..(132) <223> Identická se zbytky 91-115 ze sekv. id. č.: 1

9 <400> 7 ·· »· « · · ·

9 9 » *

9 » ···· »· • » ··· • · · • 9 99 9

9 9

9 · · 9 • ♦ • · ♦ * • ·

9999

109

Ile Pro 1

Thr

Glu Ile 5

Pro

Thr Ser Ala Leu Val Lys Glu 10

Thr

Leu 15

Ala

Leu

Ser

Thr

His

Arg

Thr

Leu

Ile

Ala

Asn

Glu

Thr

Leu

Arg

20

25

30

Ile

Pro

Val

Pro

Val

His

Lys

Asn

His

Gin

Leu

Cys

Thr

Glu

Ile

35

40

45

Phe

Gin

Gly

Ile

Gly

Thr

Leu

Glu

Ser

Gin

Thr

Val

Gin

Gly

Thr

50

55

60

Val

Glu

Arg

Leu

Phe

Lys

Asn

Leu

Ser

Leu

Ile

Lys

Tyr

Xle

Asp

65

70

75

80

Gly

Gin

Lys

Cys

Phe

Asn

Phe

Thr

Val

Ser

Phe

Trp

Leu

85

90

95

Arg

Val

Pro

Lys

Val

Ser

Ala

Ser

His

Leu

Glu

Arg Arg

Val

Asn

Gin

100

105

110

Phe

Leu

Asp

Tyr

Leu

Gin

Glu

Phe

Leu

Gly Val

Met

Asn

Thr

Glu

Trp

115

120

125

Ile Ile Glu Ser 130 <210> 8 <211> 124 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>

<221> Mutagen <222> (32) . . (52) <223> Epitop P30 tetanického toxoidu (sekv. id. č.: 24) <220>

<221> Podobná <222> (1)..(31) <223> Identická se zbytky 1-31 ze sekv. id. č.: 1 <220>

<221> Podobná <222> (53)..(124) <223> Identická se zbytky 44-115 ze sekv. id. č.: 1 ·· ·· »» ·»»· ·· ·· • · 4 · · * · 9 φ · Φ • · * · · ♦«· · · 3 »··««» ···· · • · · « » · · · · «·«» 09 ·· *90 00 9000 <400> 8

110

Ile Pro Thr Glu Ile

Pro Thr

Ser Ala Leu Val Lys 10

Glu

Thr

Leu 15

Ala

1

5

Leu

Ser

Thr

His

Arg

Thr

Leu

Ile

Ala

Asn

Glu

Thr

Leu

Phe

20

25

30

Asn

Phe

Thr

Val

Ser

Phe

Trp

Leu

Arg

Val

Pro

Lys

Val

Ser

Ala

35

40

45

Ser

His

Leu

Glu

Cys

Thr

Glu

Ile

Phe

Gin

Gly

Ile

Gly

Thr

Leu

50

55

60

Glu

Ser

Gin

Thr

Val

Gin

Gly

Thr

Val

Glu

Arg

Leu

Phe

Lys

Asn

65

70

75

80

Leu

Ser

Leu

Ile

Lys

Tyr

Ile

Asp

Gly

Gin

Lys

Cys

Gly

85

90

95

Glu

Arg

Val

Asn

Gin

Phe

Leu

Asp

Tyr

Leu

Gin

Glu

Phe

100

105

110

Leu

Gly

Val

Met

Asn

Thr

Glu

Trp

Ile

Glu

Ser

115 120 <210> 9 <211> 130 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>

<221> Mutagen <222> (59)..(79) <223> Epitop P30 tetanického toxoidu (sekv. id. č.: 24) <220>

<221> Podobná <222> (1)..(58) <223> Identická se zbytky 1-58 ze sekv. id. č.: 1 <220>

<221> Podobná <222> (80) . . (130) <223> Identická se zbytky 65-115 ze sekv. id. č. : 1 <400> 9 ·« ·« • e · « • · <

• · « • · « ···· ·· ··*·

9 9

9 999

9 9

999

9 9

9

9999

111

Ile 1

Pro

Thr

Clu

Ile 5

Pro

Thr

Ser

Ala

Leu 10

Val

Lys

Glu

Thr

Leu 15

Ala

Leu

Ser

Thr 20

His

Arg

Thr

Leu

Leu 25

Ile

Ala

Asn

Glu

Thr 30

Leu

Arg

Ile

Pro

Val 35

Pro

Val

His

Lys

Asn 40

His

Gin

Leu

Cys

Thr 45

Glu

Ile

Phe

Gin 50

Gly

Ile

Gly

Thr

Leu 55

Glu

Ser

Gin

Phe

Asn 60

Asn

Phe

Thr

Val

Ser 63

Phe

Trp

Leu

Arg

Val 70

Pro

Lys

Val

Ser

Ala 75

Ser

His

Leu

Glu

Val 80

Glu

Arg

Leu

Phe

Lys 85

Asn

Leu

Ser

Leu

Ile 90

Lys

Tyr

Ile

Asp 95

Gly

Gin

Lys

Lys 100

Cys

Gly

Glu

Arg Arg Arg 105

Val

Asn

Gin 110

Phe

Leu

Asp

Tyr

Leu 115

Gin

Glu

Phe

Leu

Gly 120

Val

Met

Asn

Thr

Glu 125

Trp

Ile

Glu Ser 130 <210> 10 <211> 132 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>

<221> Mutagen <222> (110)..(130) <223> Epitop P30 tetanického toxoidu (sekv. id. č.: 24) <220>

<221> Podobná <222> (1).. (129) <223> Identická se zbytky 1-129 ze sekv. id. č.: 1 <220>

<221> Podobná <222> (131) .. (132) <223> Identická se zbytky 114-115 ze sekv. id. č.: 1 • · · <400> 10 ·· ·· » · · • ·

112

Ile 1

Pro

Thr

Glu

Ile 5

Pro

Thr

Ser

Ala

Leu 10

Val

Lys

Glu

Thr

Leu 15

Ala

Leu

Ser

Thr 20

His

Arg

Thr

Leu

Leu 25

Iie

Ala

Asn

Glu

Thr 30

Leu

Arg

Ile

Pro

Val 35

Pro

Val

His

Lys

Asn 40

His

Gin

Leu

cys

Thr 45

Glu

Ile

Phe

Gin 50

Gly

Ile

Gly

Thr

Leu 55

Glu

Ser

Gin

Thr

Val 60

Gin

Gly

Thr

Val 65

Glu

Arg

Leu

Phe

Lys 70

Asn

Leu

Ser

Leu

Ile 75

Lys

Tyr

Ile

Asp 80

Gly

Gin

Lys

Lys 85

Cys

Gly

Glu

Arg 90

Arg

Val

Asn

Gin 95

Phe

Leu

Asp

Tyr

Leu 100

Gin

Glu

Phe

Leu

Gly 105

Val

Met

Asn

Thr

Phe 110

Asn

Phe

Thr

Val

Ser

Phe

Trp

Leu

Arg

Val

Pro

Lys

Val

'Sex

Ala

Ser

His

115 120 125

Leu Glu Glu Ser 130 <210> 11 <211> 41 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: humánní IL5 modifikovaný substitucí s epitopy P2 a P30 tetanického toxoidu <220>

<221> Mutagen <222> (119)..(139) <223> Epitop P30 tetanického toxoidu (sekv. id. č.: 24) <220>

• · • · · · · ·

	113	·* ·· • · · · • · · • · · · • · · • · · · · ·
<221>	Podobná
<222>	(101)..(118)
<223>	Identická se zbytky 92-109	ze sekv. id. č.: 1
<220>
<221>	Podobná
<222>	(140).. (141)
<223>	Identická se zbytky 114-115	ze sekv. id. č.:

<400> 11

Ile

Pro

Thr

Glu

Ile

Pro

Thr

Ser

Ala

Leu

Val

Lys

Glu

Thr

Leu

Ala

1

5

10

15

Leu

Ser

Thr

His

Arg

Thr

Leu

Ile

Ala

Asn

Glu

Thr

Leu

Arg

20

25

30

Ile

Pro

Val

Pro

Val

His

Lys

Asn

His

Gin

Leu

Cys

Thr

Glu

Ile

35

40

45

Phe

Gin

Gly

Ile

Gly

Thr

Leu

GlU

Ser

Gin

Thr

Val

Gin

Gly

Thr

50

55

60

Val

Glu

Arg

Leu

Phe

Lys

Asn

Leu

Ser

Leu

Ile

Lys

Tyr

Ile

Asp

65

70

75

80

Gly

Gin

Lys

Gin

Tyr

Ile

Lys

Ala

Asn

Ser

Lys

Phe

Ile

Gly

85

90

95

Ile

Thr

Glu

Leu

Arg

Val

Asn

Gin

Phe

Leu

Asp

Tyr

Leu

Gin

Glu

Phe

100

105

110

Leu

Gly

Val

Met

Asn

Thr

Phe

Asn

Phe

Thr

Val

Ser

Phe

Trp

Leu

115

120

125

Arg

Val

Pro

Lys

Val

Ser

Ala

Ser

His

Leu

Glu

Ser

130

135

140

<210> 12 <211> 113 <212> PRT <213> Mus musculus <220>

<221> Disulfid <222> (42) <223> Meziřetězcová disulfidová vazba k Cys-84 ze sekv. id. č. : 12 <220>

<221> Disulfid <222> (84) <223> Meziřetězcová disulfidová vazba k Cys-42 ze sekv. id.

č. : 12 <400> 12

114

Met 1

Glu

Ile

Pro

Met 5

Ser

Thr

Val

Lys 10

Glu

Thr

Leu

Ala

Leu 15

Leu

Ser

Ala

His

Arg 20

Ála

Leu

Thr

Ser 25

Asn

Glu

Thr

Met

Arg 30

Leu

Pro

Val

Pro

Thr 35

His

Lys

Asn

His

Gin 40

Leu

Cys

Ile

Gly

Glu 45

Ile

Phe

Gin

Gly

Leu 50

Asp

Ile

Leu

Lys

Asp 55

Gin

Thr

Val

Arg

Gly 60

Gly

Thr

Val

Met

Arg 65

Leu

Phe

Gin

Asn

Leu 70

Ser

Leu

Ile

Lys

Lys 75

Tyr

Ile

Asp

Arg

Gin 80

Glu

Lys

Cys

Gly 85

Glu

Arg

Arg 90

Thr

Arg

Gin

Phe

Leu 95

Asp

Tyr

Leu

Gin

Glu 100

Phe

Leu

Gly

Ser

Met 105

Asn

Thr

Ala

Ile 110

Ile

Glu

Gly <210> 13 <211> 124 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: myši IL5 modifikovaný substituci s epitopem P2 tetanického toxoidu <220>

<221> Mutagen <222> (85)..(99) <223> Epitop P2 tetanického toxoidu (sekv. id. č.: 23) <220>

<221> Podobná <222> (1)..(84) <223> Identická se zbytky 1-84 ze sekv. id. č.: 12 <220>

<221> Podobná <222> (100) .. (124) <223> Identická se zbytky 89-113 ze sekv. id. č.: 12 <400> 13 • ·· · ······ · · · · · ··· · · · ··· ···· ·· ·· ··· ·· ····

115

Met

Glu

Xle

Pro

Met

Ser

Thr

Val

Lys

Glu

Thr

Leu

Ala

Leu

1

5

10

15

Ser

Ala

His

Arg

Ala

Leu

Thr

Ser

Asn

Glu

Thr

Met

Arg

Leu

Pro

20

25

30

Val

Pro

Thr

His

Lys

Asn

His

Gin

Leu

Cys

Ile

Gly

Glu

Ile

Phe

Gin

35

40

45

Gly

Leu

Asp

Ile

Leu

Lys

Asp

Gin

Thr

Val

Arg

Gly Gly

Thr

Val

Met

50

55

60

Arg

Leu

Phe

Gin

Asn

Leu

Ser

Leu

Ile

Lys

Tyr

Ile

Asp

Arg

Gin

65

70

75

80

Glu

Lys

Cys

Gin

Tyr

ILe

Lys

Ala

Asn

Ser

Lys

Phe

Ile

Gly

Ile

85

90

95

Thr

Glu

Leu

Arg

Thr

Arg

Gin

Phe

Leu

Asp

Tyr

Leu

Gin

Glu

Phe

100

105

110

Leu

Gly

Ser

Met

Asn

Thr

Ala

Ile

Glu

Gly

115

120

<210> 14 <211> 116 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: myší IL5 modifikovaný substitucí s epitopem P2 tetanického toxoidu <220>

<221> Mutagen <222> (30) .. (44) <223> Epitop P2 tetanického toxoidu (sekv. id. č.: 23) <220>

<221> Podobná <222> (1)..(29) <223> Identická se zbytky 1-29 ze sekv. id. č.: 12 <220>

<221> Podobná <222> (45)..(116) <223> Identická se zbytky 42-113 ze sekv. id. č. : 12 <400> 14

116

Met 1

Glu

Ile

Pro

Met Ser Thr Val Val Lys Glu Thr Leu Ala Leu Leu

5

10

15

Ser

Ala

His

Arg

Ala

Leu

Thr

Ser

Asn

Glu

Thr

Met Gin

Tyr

Ile

20

25

30

Lys

Ala

Asn 35

Ser

Lys

Phe

Ile

Gly 40

Ile

Thr

Glu

Leu

Cys 45

Ile

Gly

Glu

Ile

Phe 50

Gin

Gly

Leu

Asp

Ile 55

Leu

Lys

Asp

Gin

Thr 60

Val

Arg

Gly

Thr 65

Val

Met

Arg

Leu

Phe 70

Gin

Asn

Leu

Ser

Leu 75

Ile

Lys

Tyr

Ile 8C

Asp

Arg

Gin

Glu

Lys 85

Lys

Cys

Gly

Glu

Glu 90

Arg

Arg Arg

Thr

Arg 95

Gin

Phe

Leu

Asp

Tyr

Leu

Gin

Glu

Phe

Leu

Gly

Ser

Met

Asn

Thr

Ala

100 105 no

Ile Ile Glu Gly · 115 <210> 15 <211> 122 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>

<221> Mutagen <222> (57)..(71) <223> Epitop P2 tetanického toxoidu (sekv. id. č.: 23) <220>

<221> Podobná <222> (1) . . (56) <223> Identická se zbytky 1-56 ze sekv. id. č.: 12 <220>

<221> Podobná <222> (72) .. (122) <223> Identická se zbytky 63-113 ze sekv. id. č.: 12 « · <400> 15

117

Met 1

Glu Ile

Pro

Met Ser Thr Val Val Lys Glu Thr Leu Ala Leu

Leu

5

10

15

Ser

Ala

His

Arg

Ala

Leu

Thr

Ser

Asn

Glu

Thr

Met

Arg

Leu

Pro

20

25

30

Val

Pro

Thr

His

Lys

Asn

His

Gin

Leu

Cys

Ile

Gly

Glu

Ile

Phe

Gin

35

40

45

Gly

Leu

Asp

Ile

Leu

Lys

Asp

Gin

Tyr

Ile

Lys

Ala

Asn

Ser

Lys

50

55

60

Phe

Ile

Gly

Xle

Thr

Glu

Leu

Val

Met

Arg

Leu

Phe

Gin

Asn

Leu

Ser

65

70

75

80

Leu

Ile

Lys

Tyr

Ile

Asp

Arg

Gin

Glu

Lys

Cys

Gly

Glu

85

90

95

Arg

Thr

Arg

Gin

Phe

Leu

Asp

Tyr

Leu

Gin

Glu

Phe

Leu

Gly

100

105

110

Ser

Met

Asn

Thr

Ala

Ile

Glu

Gly

115

120

<210> 16 <211> 122 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>

<221> Mutagen <222> (84)..(98) <223> Epitop P2 tetanického toxoidu (sekv. id. č.: 23) <220>

<221> Podobná <222> (1). . (83) <223> Identická se zbytky 1-83 ze sekv. id. č.: 12 <220>

<221> Podobná <222> (99) .. (122) <223> Identická se zbytky 90-113 ze sekv. id. č. : 12 <400> 16

118

Met 1

Glu

Ile Pro Met 5

Ser Thr Val Val Lys Glu Thr Leu Ala Leu

Leu

10

15

Ser

Ale

His

Arg

Ala

Leu

Thr

Ser

Asn

Glu

Thr

Met

Arg

Leu

Pro

20

25

30

Val

Pro

Thr

His

Lys

Asn

His

Gin

Leu

Cys

Ile

Gly

Glu

Ile

Phe

Gin

35

40

45

Gly

Leu

Asp

Ile

Leu

Lys

Asp

Gin

Thr

Val

Arg

Gly Gly

Thr

Val

Met

50

55

60

Arg

Leu

Phe

Gin

Asn

Leu

Ser

Leu

Ile

Lys

Tyr

Ile

Asp Arg

Gin

65

70

75

80

Glu

Lys

Gin

Tyr

Ile

Lys

Ala

Asn

Ser

Lys

Phe

Ile

Gly

Ile

Thr

85

90

95

Glu

Leu

Arg

Thr

Arg

Gin

Phe

Leu

Asp

Tyr

Leu

Gin

Glu

Phe

Leu

Gly

100

105

110

Ser

Met

Asn

Thr

Ala

Ile

Glu

Gly

115 120 <210> 17 <211> 124 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>

<221> Mutagen <222> (108) .. (122) <223> Epitop P2 tetanického toxoidu (sekv. id. č.: 23) <220>

<221> Podobná <222> (1)..(107) <223> Identická se zbytky 1-107 ze sekv. id. č.: 12 <220>

<221> Podobná <222> (123) .. (124) <223> Identická se zbytky 112-113 ze sekv. id. č.: 12 <400> 17

119

Met

Glu

Ile

Pro

Met

Ser

Thr

Val

Lys

Glu

Thr

Leu

Ala

Leu

1

5

10

15

Ser

řla

His

Arg

Ala

Leu

Thr

Ser

Asn

Glu

Thr

Met

Arg

Leu

Pro

20

25

30

Val

Pro

Thr

His

Lys

Asn

His

Gin

Leu

Cys

Ile

Gly

Glu

Ile

Phe

Gin

35

40

45

Gly

Leu

Asp

Ile

Leu

Lys

Asp

Gin

Thr

Val

Arg

Gly

Thr

Val

Met

50

55

60

Arg

Leu

Phe

Gin

Asn

Leu

Ser

Leu

Ile

Lys

Tyr

Ile

Asp Arg

Gin

65

70

75

80

Glu

Lys

Cys

Gly

Glu

Arg

Thr

Arg

Gin

Phe

Leu

Asp

85

90

95

Tyr

Leu

Gin

Glu

Phe

Leu

Gly

Ser

Met

Asn

Thr

Gin

Tyr

Ile

Lys

Ala

100

105

110

Asn

Ser

Lys

Phe

Ile

Giy

Ile

Thr

Glu

Leu

Glu

Gly

115

120

<210> 18 <211> 130 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: myší IL5 modifikovaný substitucí s epitopem P30 tetanického toxoidu <220>

<221> Mutagen <222> (85)..(105) <223> Epitop P2 tetanického toxoidu (sekv. id. č.: 24) <220>

<221> Podobná <222> (106)..(130) <223> Identická se zbytky 89-113 ze sekv. id. č.: 12 • 4

120

<400> 18

Met 1

Glu

Ile

Pro

Met 5

Ser

Thr

Val

Lys 10

Glu

Thr

Leu

Ala

Leu 15

Leu

Ser

Ala

His

Arg 20

Ala

Leu

Thr

Ser 25

Asn

Glu

Thr

Met

Arg 30

Leu

Pro

Val

Pro

Thr 35

His

Lys

Asn

His

Gin 40

Leu

Cys

Ile

Gly

Glu 45

Ile

Phe

Gin

Gly

Leu 50

Asp

Ile

Leu

Lys

Asp 55

Gin

Thr

Val

Arg

Gly 60

Gly

Thr

Val

Met

Arg 65

Leu

Phe

Gin

Asn

Leu 70

Ser

Leu

Ile

Lys

Lys 75

Tyr

Ile

Asp

Arg

Gin 80

Glu

Lys

Cys

Phe 85

Asn

Phe

Thr

Val 90

Ser

Phe

Trp

Leu

Arg 95

Val

Pro

Lys

Val

Ser 100

Ala

Ser

His

Leu

Glu 105

Arg Arg

Thr

Arg

Gin 110

Phe

Leu

Asp

Tyr

Leu 115

Gin

Glu

Phe

Leu

Gly 120

Ser

Met

Asn

Thr

Ala 125

Ala

Ile

Glu Gly	•
130

<210> 19 <211> 122 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>

<221> Mutagen <222> (30)..(50) <223> Epitop P30 tetanického toxoidu (sekv. id. č.: 24) <220>

<221> Podobná <222> (51)..(122) <223> Identická se zbytky 42-113 ze sekv. id. č.: 12 <400> 19 «!·· *·»* *·«* «·· ·* ····

121

Met Glu 1

Ile Pro Met Ser Thr Val Val Lys

Glu

Thr Leu Ala Leu 15

Leu

• 5

10

Ser

Ala

His

Arg

Ala

Leu

Thr

Ser

Asn

Glu

Thr

Met

Phe

Asn

20

25

30

Phe

Thr

Val

Ser

Phe

Trp

Leu

Arg

Val

Pro

Lys

Val

Ser

Ala

Ser

His

35

40

45

Leu

Glu

Cys

Ile

Gly

Glu

Ile

Phe

Gin

Gly

Leu

Asp

Ile

Leu

Lys

Asp

50

55

60

Gin

Thr

Val

Arg

Gly

Thr

Val

Met

Arg

Leu

Phe

Gin

Asn

Leu

Ser

65

70

75

80

Leu

Ile

Lys

Tyr

Ile

Asp

Arg

Gin

Glu

Lys

Cys

Gly

Glu

85

90

95

Arg

Thr

Arg

Gin

Phe

Leu

Asp

Tyr

Leu

Gin

Glu

Phe

Leu

Gly

100

105

110

Ser

Met

Asn

Thr

Ala

Ile

Glu

Gly

115

120

<210> 20 <211> 128 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>

<221> Mutagen <222> (57)..(77) <223> Epitop P30 tetanického toxoidu (sekv. id. č.: 24) <220>

<221> Podobná <222> (1)..(56) <223> Identická se zbytky 1-56 ze sekv. id. č.: 12 <220>

<221> Podobná <222> (78)..(128) <223> Identická se zbytky 63-113 ze sekv. id. č.: 12 • · ©«©· <400> 20 ♦ * · • · © · · • © · • · © © · · · ·

·©

122

Met 1

Glu

Ile

Pro

Met 5

Ser

Thr

Val

Lys 10

Glu

Thr

Leu

Ala

Leu 15

Leu

Ser

?la

His

Arg 20

Ala

Leu

Thr

Ser 25

Asn

Glu

Thr

Met

Arg 30

Leu

Pro

Val

Pro

Thr 35

His

Lys

Asn

His

Gin 40

Leu

Cys

Ile

Gly

Glu 45

Ile

Phe

Gin

Gly

Leu 50

Asp

Ile

Leu

Lys

Asp 55

Gin

Phe

Asn

Phe 60

Thr

Val

Ser

Phe

Trp 65

Leu

Arg

Val

Pro

Lys 70

Val

Ser

Ala

Ser

His 75

Leu

Glu

Val

Met

Arg 80

Leu

Phe

Gin

Asn

Leu 85

Ser

Leu

Ile

Lys

Lys 90

Tyr

Ile

Asp Arg’ Gin 95

Glu

Lys

Cys

Gly 100

Glu

Arg

Arg 105

Thr

Arg

Gin

Phe

Leu 110

Asp

Tyr

Leu

Gin

GlU 115

Phe

Leu

Gly

Ser

Met 120

Asn

Thr

Ala

Ile 125

Ile

Glu

Gly

<210> 21 <211> 130 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>

<221> Mutagen <222> (108)..(128) <223> Epitop P30 tetanického toxoidu (sekv. id. č.: 24) <220>

<221> Podobná <222> (1)..(107) <223> Identická se zbytky 1-107 ze sekv. id. č. : 12 <220>

<221> Podobná <222> (129)..(130) <223> Identická se zbytky 112-113 ze sekv. id. č.: 12

φ · φφφφ φ

« • φ ·· φφ ♦ · · φ φ φ · φφφ φ φ · φφφφ φφ φ' φ

φ •

φ • ΦΦΦ

123

<400> 21

Met 1

Glu

Ile

Pro

Met 5

Ser

Thr

Val

Lys 10

Glu

Thr

Leu

Ala

Leu 15

Leu

Ser

Ala

His

Arg 20

Ala

Leu

Thr

Ser 25

Asn

Glu

Thr

Met

Arg 30

Leu

Pro

Val

Pro

Thr 35

His

Lys

Asn

His

Gin 40

Leu

cys

Ile

Gly

Glu 45

Ile

Phe

Gin

Gly

Leu 50

Asp

Ile

Leu

Lys

Asp 55

Gin

Thr

Val

Arg

Gly 60

Gly

Thr

Val

Met

Arg 65

Leu

Phe

Gin

Asn

Leu 70

Ser

Leu

Ile

Lys

Lys 75

Tyr

Ile

Asp

Arg

Gin 80

Glu

Lys

Cys

Gly 85

Glu

Arg

Arg 90

Thr

Arg

Gin

Phe

Leu 95

Asp

Tyr

Leu

Gin

Glu 100

Phe

Leu

Gly

Ser

Met 105

Asn

Thr

Phe

Asn

Asn 110

Phe

Thr

Val

Ser

Phe 115

Trp

Leu

Arg

Val

Pro 120

Lys

Val

Ser

Ala

Ser 125

His

Leu

Glu

Glu Gly 130 <210> 22 <211> 139 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: myší IL5 modifikovaný substitucí s epitopy P2 a P30 tetanického toxoidu <220>

<221> Mutagen <222> (84) .. (98) <223> Epitop P2 tetanického toxoidu (sekv. id. č.: 23) <220>

<221> Mutagen <222> (117) .. (137) <223> Epitop P30 tetanického toxoidu (sekv. id. č.: 24) <220>

<221> Podobná <222> (1)..(83) <223> Identická se zbytky 1-83 ze sekv. id. č.: 12 • 4 »4

4 4 4 4

4 4 4 · »

444 ··

4 4 ·

4 4

4444

124 <220>

<221> Podobná <222> (99)..(116) <223> Identická se zbytky 90-109 ze sekv. id. č.: 12 <220>

<221> Podobná <222> (138)..(139) <223> Identická se zbytky 112-113 ze sekv. id. č.: 12 <400> 22

Met Glu 1

Ile

Pro

Met 5

Ser Thr

Val Val

Lys 10

Glu

Thr

Leu

Ala

Leu 15

Leu

Ser

Ala

His

Arg

Ala

Leu

Thr

Ser

Asn

Glu

Thr

Met

Arg

Leu

Pro

20

25

30

Val

Pro

Thr

His

Lys

Asn

His

Gin

Leu

Cys

Ile

Gly

Glu

Ile

Phe

Gin

35

40

45

Gly

Leu

Asp

Ile

Leu

Lys

Asp

Gin

Thr

Val

Arg

Gly Gly

Thr

Val

Met

50

55

60

Arg

Leu

Phe

Gin

Asn

Leu

Ser

Leu

Ile

Lys

Tyr

Ile

Asp

Arg

Gin

65

70

75

80

Glu

Lys

Gin

Tyr

Ile

Lys

Ala

Asn

Ser

Lys

Phe

Ile

Gly

Ile

Thr

» 85

90

95

Glu

Leu

Arg

Thr

Arg

Gin

Phe

Leu

Asp

Tyr

Leu

Gin

Glu

Phe

Leu

Gly

100

105

110

Ser

Met

Asn

Thr

Phe

Asn

Phe

Thr

Val

Ser

Phe

Trp

Leu

Arg

Val

115

120

125

Pro

Lys

Val

Ser

Ala

Ser

His

Leu

Glu

Gly

130

135

<210>	23
<211>	15
<212>	PRT
<213>	Clostridium tetani
<400>	23

Gin Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu 1 5 10 15 <210> 24 <211> 21 <212> PRT <213> Clostridium tetani

··♦· ·· ···· ©« © © © • · ··© • · · ♦ ♦ · ·

125 <400> 24

Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser 15 10 15

Ala Ser His Leu Glu 20 <210> 25 <211> 45 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<221> CDS <222> (1)..(45) <220>

<223> Popis umělé sekvence: DNA kódující značku His <400> 25

atg

aaa

cac

caa

cac

caa

cat

caa

cat

caa

cat

caa

cat

caa

Met

Lys

His

Gin

His

Gin

His

Gin

His

Gin

His

Gin

His

Gin

1

5

10

15

<210> 26 <211> 15 <212> PRT <213> Umělá sekvence
<400>	26
Met Lys His Gin His Gin His Gin His Gin His Gin His Gin Gin
1	5 10 15

<210> 27 <211> 381 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: humánní IL5 modifikovaný substitucí s epitopem tetanického toxoidu <220>

126 <221> CDS <222> (1)..(381) <220>

<221> Mutace <222> (262)..(306) <223> Epitop P2 tetanického toxoidu <220>

<221> různé <222> (1)..(261) <223> DNA kódující aminokyseliny 1-87 humánního IL5 <220>

<221> různé <222> (307) . . (378) <223> DNA kódující aminokyseliny 92-115 humánního IL5 <400> 27

atc ccc

aca gaa Thr Glu

att Ile 5

ccc Pro

aca agt gca ttg gtg aaa gag acc

ttg Leu 15

gca Ala

48

Ile 1

Pro

Thr

Ser

Ala

Leu Val 10

Lys

Glu Thr

ctg

ctt

tet

act

cat

ega

act

ctg

ata

gcc

aat

gag

act

ctc

cgg

96

Leu

Ser

Thr

His

Arg

Thr

Leu

Ile

Ala

Asn

Glu

Thr

Leu

Arg

20

25

30

att

cct

gtt

cct

gta

cat

aaa

aat

cac

caa

ctg

tgc

act

gaa

atc

144

Ile

Pro

Val

Pro

Val

His

Lys

Asn

His

Gin

Leu

Cys

Thr

Glu

Ile

35

40

45

ttt

cag

gga

ata

ggc

aca

ctc

gag

agt

caa

act

gtg

caa

ggg

ggt

act

192

Phe

Gin

Gly

Ile

Gly

Thr

Leu

Glu

Ser

Gin

Thr

Val

Gin

Gly

Thr

50

55

60

gtg

gaa

aga

cta

ttc

aaa

aac

ttg

tcc

tta

ata

aag

aaa

tac

atc

gat

240

Val

Glu

Arg

Leu

Phe

Lys

Asn

Leu

Ser

Leu

Ile

Lys

Tyr

Ile

Asp

65

70

75

80

ggc

caa

aaa

aag

tgt

gga

cag

tac

atc

aag

gcc

aac

tcc

aag

ttc

288

Gly

Gin

Lys

cys

Gly

Gin

Tyr

Ile

Lys

Ala

Asn

ser

Lys

Phe

Θ5

90

95

atc

ggc

atc

acc

gag

ctg

aga

gta

aac

caa

ttc

cta

gac

tat

ctg

cag

336

Ile

Gly

Ile

Thr

Glu

Leu

Arg

Val

Asn

Gin

Phe

Leu

Asp

Tyr

Leu

Gin

100

105

110

gag

ttt

ctt

ggt

gta

atg

aac

acc

gag

tgg

ata

gaa

agt

tga

381

Glu

Phe

Leu

Gly

Val

Met

Asn

Thr

Glu

Trp

Ile

Glu

Ser

115

120

125

<210> 28 <211> 126 <212> PRT ♦

• · 4 ♦ 4 4« ♦ 4 4 ♦ • · 4 ♦ · 4

4 ·

44*4 »·

4 4

127 <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: humánní IL5 modifikovaný substitucí s epitopem tetanického toxoidu <400> 28

Ile 1

Pro Thr

Glu

Ile Pro Thr Ser Ala Leu Val Lys Glu Thr Leu

Ala

5

10

15

Leu

Ser

Thr

His

Arg

Thr

Leu

Ile

Ala

Asn

Glu

Thr

Leu

Arg

20

25

30

Ile

Pro

Val

Pro

Val

His

Lys

Asn

His

Gin

Leu

Cys

Thr

Glu

Ile

35

40

45

Phe

Gin

Gly

Ile

Gly

Thr

Leu

Glu

Ser

Gin

Thr

Val

Gin

Gly

Thr

50

55

60

Val

Glu

Arg

Leu

Phe

Lys

Asn

Leu

Ser

Leu

Ile

Ly3

Lys

Tyr

Ile

Asp

65

70

75

80

Gly

Gin

Lys

Cys

Gly

Gin

Tyr

Ile

Lys

Ala

Asn

Ser

Lys

Phe

85

90

95

Ile

Gly

Ile

Thr

Glu

Leu

Arg

Val

Asn

Gin

Phe

Leu

Asp

Tyr

Leu

Gin

100

105

110

Glu

Phe

Leu

Gly

Val

Met

Asn

Thr

Glu

Trp

Ile

Glu

Ser

115

120

125

<210> 29 <211> 375 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<221> CDS <222> (1)..(375) <220>

<221> Mutace <222> (94)..(156) <223> Epitop P30 tetanického toxoidu <220>

<221> různé <222> (1)..(93)

99

9 9 9

9 « · ·

9 9

9999 »· ·*

9 · 9

9 9

9 9 9 · 9

9999 99 ·**·

9 9 • · 999

9 9 9

9 9

9 99

128 <223> DNA kódující aminokyseliny 1-31 humánního IL5 <220>

<221> různé <222> (157)..(372) <223> DNA kódující aminokyseliny 44-115 humánního IL5 <400> 29

atc Xle 1

ccc aca gaa

att ccc Ile Pro 5

aca agt gca ttg gtg aaa

cag acc Glu Thr

ttg Leu 15

gca Ala

48

Pro

Thr Glu

Thr Ser

Ala

Leu Val 10

Lys

ctg

ctt

tet

aet

cat

ega

aet

ctg

ata

gcc

aat

gag

aet

ctc

ttc

96

Leu

Ser

Thr

His

Arg

Thr

Leu

Ile

Ala

Asn

Glu

Thr

Leu

Phe

20

25

30

aac

ttc

acc

gtg

agc

ttc

tgg

ctg

ege

gtg

cct

aag

gtg

agc

gcc

144

Asn

Phe

Thr

Val

Ser

Phe

Trp

Leu

Arg

Val

Pro

Lys

Val

Ser

Ala

35

40

45

agc

cac

ctg

gag

tgc

aet

gaa

atc

ttt

cag

gga

ata

ggc

aca

ctc

192

Ser

His

Leu

Glu

Cys

Thr

Glu

Ile

Phe

Gin

Gly

Ile

Gly

Thr

Leu

50

55

60

gag

agt

caa

aet

gtg

caa

ggg

ggt

aet

gtg

gaa

aga

cta

ttc

aaa

aac

240

Glu

Ser

Gin

Thr

Val

Gin

Gly

Thr

Val

Glu

Arg

Leu

Phe

Lys

Asn

65

70

75

80

ttg

tcc

tta

ata

aag

aaa

tac

atc

gat

ggc

caa

aaa

aag

tgt

gga

288

Leu

Ser

Leu

Ile

Lys

Tyr

Ile

Asp

Gly

Gin

Lys

Cys

Gly

85

90

95

gaa

aga

cgg

aga

gta

aac

caa

ttc

cta

gac

tat

ctg

cag

gag

ttt

336

Glu

Arg

Arg Arg

Val

Asn

Gin

Phe

Leu

Asp

Tyr

Lsu

Gin

Glu

Phe

100

105

110

ctt

ggt

gta

atg

aac

acc

gag

tgg

ata

gaa

agt

tga

375

Leu

Gly

Val

Met

Asn

Thr

Glu

Trp

Ile

Glu

Ser

115 120 <210> 30 <211> 124 <212> PRT <213> Umělá sekvence <223> Popis umělé sekvence: humánní IL5 modifikovaný substitucí s epitopem tetanického toxoidu • 0 ·

I 0 4

I · 0

I 0 ·

0000

0

00« <400> 30 «0 »»

0 0 0 · 0 0 0 ·

0 * 0 * • 000 0000

129

Ile 1

Pro

Thr

Glu

Ile . 5

Pro

Thr

Ser

Ala

Leu 10

Val

Lys

Glu

Leu

Ser

Thr 20

His

Arg

Thr

Leu

Leu 25

Ile

Ala

Asn

Glu

Asn

Phe 35

Thr

Val

Ser

Phe

Trp 40

Leu

Arg

Val

Pro

Lys 45

Ser

His 50

Leu

Glu

cys

Thr

Glu 55

Glu

Ile

Phe

Gin

Gly 60

Ile

Glu 65

Ser

Gin

Thr

Val

Gin 70

Gly

Thr

Val

Glu 75

Arg

Leu

Ser

Leu

Ile

Lys 85

Lys

Tyr

Ile

Asp

Gly 90

Gin

Lys

Glu

Arg

Arg 100

Arg

Val

Asn

Gin

Phe 105

Leu

Asp

Tyr

Leu

Gly

Val 115

Met

Asn

Thr

Glu

Trp 120

Ile

Glu

Ser

Thr	Leu 15	Ala
Thr	Leu	Phe
30
Val	Ser	Ala
Gly	Thr	Leu
Phe	Lys	Asn
		80
Lys	Cvs	Gly
	95
Gin	Glu	Phe
110

<210> 31 <211> 393 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<221> CDS <222> (1)..(393) <220>

<221> Mutace <222> (175)..(237) <223> Epitop P30 tetanického toxoidu <220>

<221> různé <222> (1)..(174) <223> DNA kódující aminokyseliny 1-58 humánního IL5 <220>

<221> různé <222> (238)..(390) • & · 4 * ·

ΦΦ ·

·

4

4 ·»

4* 4

4 4

4 4 · ·

4444 »4 * 4 4

4 4 44

4 4 4

4 4

Φ·4

4 *

Φ

ΦΦ« 4

130 <223> DNA kódující aminokyseliny 65-115 humánního IL5 <400> 31

atc ccc

a ca Thr

gaa Glu

att Ile c

ccc Pro

aca Thr

agt gca

ttg Leu 10

gtg Val

aaa gag acc ttg gca

48

Ile 1

Pro

Ser

Ala

Lys

Glu

Thr

Leu i c

Ala

ctg

ctt

tet

act

cat

ega

act

ctg

ata

gcc

aat

gag

act

ctc

cgg

96

Leu

Ser

Thr 20

His

Arg

Thr

Leu

Leu 25

Ile

Ala

Asn

Glu

Thr 30

Leu

Arg

att

cct

gtt

cct

gta

cat

aaa

aat

cac

caa

ctg

tgc

act

gaa

atc

144

Ile

Pro

Val 35

Pro

Val

His

Lys

Asn 40

His

Gin

Leu

Cys

Thr 45

Glu

Ile

ttt

cag

gga

ata

ggc

aca

ctc

gag

agt

caa

ttc

aac

ttc

acc

gtg

192

Phe

Gin 50

Gly

Ile

Gly

Thr

Leu 55

Glu

Ser

Gin

Phe

Asn 60

Asn

Phe

Thr

Val

agc

ttc

tgg

ctg

ege

gtg

cct

aag

gtg

agc

gcc

agc

cac

ctg

gag

gtg

240

Ser 65

Phe

Trp

Leu

Arg

Val 70

Pro

Lys

Val

Ser

Ala 75

Ser

His

Leu

Glu

Val 80

gaa

aga

cta

ttc

aaa

aac

ttg

tcc

tta

eta

aag

aaa

tac

atc

gat

ggc

288

Glu

Arg

Leu

Phe

Lys 65

Asn

Leu

Ser

Leu

Ile 90

Lys

Tyr

Ile

Asp 95

Gly

caa

aaa

aag

tgt

gga

gaa

aga

cgg

aga

gta

aac

caa

ttc

cta

336

Gin

Lys

Lys 100

Cys

Gly

Glu

Arg Arg Arg 105

Val

Asn

Gin 110

Phe

Leu

gac

tat

ctg

cag

gag

ttt

ctt

ggt

gta

atg

aac

ace

gag

tgg

ata

384

Asp

Tyr

Leu

Gin

Glu

Phe

Leu

Gly

Val

Met

Asn

Thr

Glu

Trp

Ile

115 120 125 gaa agt tga 393

Glu Ser

130

<210> <211> <212> <213> <223>	32 130 PRT Umělá sekvence Popis umělé sekvence: substitucí s epitopem	humánní IL5 tetanického	modifikovaný toxoidu
<400>	32

Ile Pro 1	Thr Glu Ile Pro Thr Ser Ala Leu Val Lys Glu Thr Leu Ala
' 5	10	15
Leu Leu	Ser Thr His Arg Thr	Leu Leu Ile Ala Asn	Glu Thr Leu Arg
	20	25	30

·» »·»♦ • » ······ ·»·· · ·»«·· ···* »··· »· »· »·« »· ·«»·

131

Ile

Pro

Val 35

Pro

Val

His

Lys

Asn 40

His

Gin

Leu

Cys

Thr 45

Glu

Ile

Phe

Gin 50

Gly

Ile

Gly

Thr

Leu 55

Glu

Ser

Gin

Phe

Asn 60

Asn

Phe

Thr

Val

Ser 65

Phe

Trp

Leu

Arg

Val 70

Pro

Lys

Val

Ser

Ala 75

Ser

His

Leu

Glu

Val 80

Glu

Arg

Leu

Phe

Lys 85

Asn

Leu

Ser

Leu

Ile 90

Lys

Tyr

Ile

Asp 95

Gly

Gin

Lys

Lys 100

cys

Gly

Glu

Arg 105

Arg

Val

Asn

Gin 110

Phe

Leu

Asp

Tyr

Leu 115

Gin

G-lu

Phe

Leu

Gly 120

Val

Met

Asn

Thr

Glu 125

Trp

Ile

Glu

Ser 130

<210> 33 <211> 375 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<221> CDS <222> (1)..(375) <220>

<221> Mutace <222> (175)..(219) <223> Epitop P2 tetanického toxoidu <220>

<221> různé <222> (220)..(372) <223> DNA kódující aminokyseliny 65-115 humánního IL5 •·4« 44 <400> 33 *· ··»· • 4 · • 4 4 4 4 • 4 4 · • 9 ·

444

• 4

4444

132

atc

: ccc

; aca

gaa

att

ccc

aca

agt

gca

ttg

gtg

aaa

gag

acc

ttg

gca

48

Ile

: Pro

' Thr

Glu

Ile

Pro

Thr

Ser

Ala

Leu

Val

Lys

Glu

Thr

Leu

Ala

1

5

10

15

ctg

ctt

tet

act

cat

ega

act

ctg

ata

gcc

aat

gag

act

ctc

cgg

96

Leu

Sex

Thr

His

Arg

Thr

Leu

Ile

Ala

Asn

Glu

Thr

Leu

Arg

20

25

30

att

cct

gtt

cct

gta

cat

aaa

aat

cac

caa

ctg

tgc

act

gaa

atc

144

Ile

Pro

Val

Pro

Val

His

Lys

Asn

His

Gin

Leu

Cys

Thr

Glu

Ile

35

40

45

ttt

cag

gga

ata

ggc

aca

ctc

gag

agt

caa

cag

tac

atc

aag

gcc

aac

192

Phe

Gin

Gly

Ile

Gly

Thr

Leu

Glu

Ser

Gin

Tyr

Ile

Lys

Ala

Asn

50

55

60

tcc

aag

ttc

atc

ggc

atc

acc

gag

ctg

gtg

gaa

aga

cta

ttc

aaa

aac

240

Ser

Lys

Phe

Ile

Gly

Ile

Thr

Glu

Leu

Val

Glu

Arg

Leu

Phe

Lys

Asn

65

70

75

80

ttg

tcc

tta

ata

aag

aaa

tac

atc

gat

ggc

caa

aaa

aag

tgt

gga

288

Leu

Ser

Leu

Ile

Lys

Tyr

Ile

Asp

Gly

Gin

Lys

Cys

Gly

85.

90

95

gaa

aga

cgg

aga

gta

aac

caa

ttc

cta

gac

tat

ctg

cag

gag

ttt

336

Glu

Arg

Val

Asn

Gin

Phe

Leu

Asp

Tyr

Leu

Gin

Glu

Phe

100

105

110

ctt

ggt

gta

atg

Bac

acc

gag

tgg

ata

gaa

agt

tga

375

Leu

Gly

Val

Met

Asn

Thr

Glu

Trp

Ile

Glu

Ser

115

120

<210> 34 <211> 124 <212> PRT <213> Umělá sekvence <223> Popis umělé sekvence: humánní IL5 modifikovaný substitucí s epitopem tetanického toxoidu <400> 34 • 4 4© © 4 « · « • © a

4«

44©· ·© ©· ·»©4 © · « • · 4 * · • 4 4

4 4 ·· 4·© ·· 4· © © © © «4 ©

133

Ile Pro 1

Thr Glu Ile Pro Thr Ser Ala Leu Val Lys Glu Thr Leu

Ala

5

10

15

Leu

Ser

Thr

His

Arg

Thr

Leu

Ile

Ala

Asn

Glu

Thr

Leu

Arg

20

25

30

Ile

Pro

Val

Pro

Val

His

Lys

Asn

His

Gin

Leu

Cys

Thr

Glu

Ile

35

40

45

Phe

Gin

Gly

Ile

Gly

Thr

Leu

Glu

Ser

Gin

Tyr

Ile

Lys

Ala

Asn

50

55

60

Ser

Lys

Phe

Ile

Gly

Ile

Thr

Glu

Leu

Val

Glu

Arg

Leu

Phe

Lys

Asn

65

70

75

80

Leu

Ser

Leu

Ile

Lys

Tyr

Ile

Asp

Gly

Gin

Lys

Cys

Gly

65

90

95

Glu

Arg Arg Arg

Val

Asn

Gin

Phe

Leu

Asp

Tyr

Leu

Gin

Glu

Phe

100

105

110

Leu

Gly

Val

Met

Asn

Thr

Glu

Trp

Ile

Glu

Ser

115

120

<210> 35 <211> 357 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<221> CDS <222> (1)..(357) <220>

<221> Mutace <222> (94) . .(138) <223> Epitop $2 tetanického toxoidu <220>

<221> různé <222> (|)..(93) <223> DNA kódující aminokyseliny 1-31 humánního IL5 <220>

<221> různé

9··· • 9

999 • ·

9 * 9

9

9« 99

9 9 9

9 9 • 9 9 • 9 ·

9*99 99 •

*9 9

9

999 • ·

9999

134 <222> (139)..(354) <223> DNA kódující aminokyseliny 44-115 humánního IL5 <400> 35

atc Ile 1

ccc aca gaa att

ccc aca agt gca ttg gtg aaa gag acc ttg gca

48

Pro

Thr Glu Ile 5

Pro Thr Ser Ala

Leu 10

Val

Lys

Glu

Thx Leu Ala 15

ctg

ctt

tet

act

cat

ega

act

ctg

ata

gcc

aat

gag

act

ctc

cag

96

Leu

Ser

Thr

His

Arg

Thr

Leu

Ile

Ala

Asn

Glu

Thr

Leu

Gin

20

25

30

tac

atc

aag

gcc

aac

tcc

aag

ttc

atc

ggc

atc

acc

gag

ctg

tgc

act

144

Tyr

Ile

Lys

Ala

Asn

Ser

Lys

Phe

Ile

Gly

Ile

Thr

Glu

Leu

Cys

Thr

35

40

45

gaa

atc

ttt

cag

gga

ata

ggc

aca

ctc

gag

agt

caa

act

gtg

caa

192

Glu

Ile

Phe

Gin

Gly

Ile

Gly

Thx

Leu

Glu

Ser

Gin

Thr

Val

Gin

50

55

60

-

ggg

ggt

act

gtg

gaa

aga

cta

ttc

aaa

aac

ttg

tcc

tta

ata

aag

aaa

240

Gly

Thr

Val

Glu

Arg

Leu

Phe

Lys

Asn

Leu

Ser

Leu

Ile

Lys

65

70

75

60

tac

atc

gat

ggc

caa

aaa

aag

tgt

gga

gaa

aga

cgg

aga

gta

288

Tyr

Ile

Asp

Gly

Gin

Lys

Cys

Gly

Glu

Arg Arg Arg

Val

85

90

95

aac

caa

ttc

cta

gac

tat

ctg

cag

gag

ttt

ctt

ggt

gta

atg

aac

acc

336

Asn

Gin

Phe

Leu

Asp

Tyr

Leu

Gin

Glu

Phe

Leu

Gly

Val

Met

Asn

Thr

100

105

110

gag

tgg

ata

gaa

agt

tga

357

Glu Trp Ile Ile Glu Ser 115 <210> 36 <211> 118 <212> PRT <213> Umělá sekvence <223> Popis umělé sekvence: humánní IL5 modifikovaný substitucí s epitopem tetanického toxoidu ·· ·· ·· ···· • · · • · ··· • · · • 4 *·· • · <400> 36 «< ·· • · · · • · · • · · • · • · • · ·· ····

135

Ile 1

Pro

Thr

Glu

Ile ' 5

Pro

Thr

Ser

Ala

Leu 10

Val

Lys

Glu

Thr

Leu 15

Ala

Leu

Ser

Thr 20

His

Arg

Thr

Leu

Leu 25

Ile

Ala.

Asn

Glu

Thr 30

Leu

Gin

Tyr

Ile

Lys 35

Ala

Asn

Ser

Lys

Phe 40

Ile

Gly

Ile

Thr

Glu 45

Leu

Cys

Thr

Glu

Glu 50

Ile

Phe

Gin

Gly

Ile 55

Gly

Thr

Leu

Glu

Ser 60

Gin

Thr

Val

Gin

Gly 65

Gly

Thr

Val

Glu

Arg 70

Leu

Phe

Lys

Asn

Leu 75

Ser

Leu

Ile

Lys

Lys 80

Tyr

Ile

Asp

Gly

Gin 85

Lys

Cys

Gly 90

Glu

Arg

Arg 95

Val

Asn

Gin

Phe

Leu 100

Asp

Tyr

Leu

Gin

Glu 105

Phe

Leu

Gly

Val

Met 110

Asn

Thr

Glu

Trp

Ile 115

Ile

Glu

Ser

<210> 3l <211> 375 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<221> CDS <222> (1)..(375) <220>

<221> Mutace <222> (256)..(3^00) <223> Epitop £2 tetanického toxoidu <220>

<221> různé <222> (|)..(255) <223> DNA kódující aminokyseliny 1-85 humánního IL5 <220>

<221> různé <222> (301)..(372) <223> DNA kódující aminokyseliny 92-115 humánního IL5 • · • · · · • · • · · • · ···

136 <4C0> 3T

atc Ile 1

ccc Pro

aca Thr

gaa Glu

att Ile 5

ccc Pro

aca Thr

agt Ser

gca Ala

ttg Leu 10

gtg Val

aaa Lys

gag Glu

acc Thr

ttg Leu 15'

gca Ala

48

ctg

ctt

tet

act

cat

ega

act

ctg

ata

gcc

aat

gag

act

ctc

cgg

95

Leu

Ser

Thr

His.

Arg

Thr

Leu

Ile

Ala

Asn

Glu

Thr

Leu

Arg

20

25

30

att

cct

gtt

cct

gta

cat

aaa

aat

cac

caa

ctg

tgc

act

gaa

atc

144

Ile

Pro

Val

Pro

Val

His

Lys

Asn

His

Gin

Leu

cys

Thr

Glu

Ile

35

40

45

ttt

cag

gga

ata

ggc

aca

ctc

gag

agt

caa

act

gtg

caa

ggg

ggt

act

192

Phe

Gin

Gly

Ile

Gly

Thr

Leu

Glu

Ser

Gin

Thr

Val

Gin

Gly

Thr

50

55

60

gtg

gaa

aga

cta

ttc

aaa

aac

ttg

tcc

tta

ata

aag

aaa

tac

atc

gat

240

Val

Glu

Arg

Leu

Phe

Lys

Asn

Leu

Ser

Leu

Ile

Lys

Tyr

Ile

Asp

65

70

75

80

ggc

caa

aaa

aag

cag

tac

atc

aag

gcc

aac

tcc

aag

ttc

atc

ggc

288

Gly

Gin

Lys

Gin

Tyr

Ile

Lys

Ala

Asn

Ser

Lys

Phe

Ile

Gly

85

90

95

atc

acc

gag

ctg

aga

gta

aac

caa

ttc

cta

gac

tat

ctg

cag

gag

ttt

336

Ile

Thr

Glu

Leu

Arg

Val

Asn

Gin

Phe

Leu

Asp

Tyr

Leu

Gin

Glu

Phe

100

105

110

ctt

ggt

gta

atg

aac

acc

gag

tgg

ata

gaa

agt

tga

375

Leu

Gly

Val

Met

Asn

Thr

Glu

Trp

Ile

Glu

Ser

115

120

<210> 38 <211> 124 <212> PRT <213> Umělá sekvence <223> Popis umělé sekvence: humánní IL5 modifikovaný substitucí s epitopem tetanického toxoidu

<400> 38

Ile 1

Pro

Thr

Glu

Ile 5

Pro

Thr

Ser

Ala

Leu 10

Val

Lys

Glu

Thr

Leu 15

Ala

Leu

Ser

Thr 20

His

Arg

Thr

Leu

Leu 25

Ile

Ala

Asn

Glu

Thr 30

Leu

Arg

Ile

Pro

Val 35

Pro

Val

His

Lys

Asn 40

His

Gin

Leu

Cys

Thr 45

Glu

Ile

• ·

137

Phe	Gin	Gly	Ile	Gly	Thr	Leu	Glu	Ser	Gin	Thr	Val
	50					55					60
Val	Glu	Arg	Leu	Phe	Lys	Asn	Leu	Ser	Leu	Ile	Lys
.65					70					75
Gly	Gin	Lys	Lys	Lys	Gin	Tyr	Ile	Lys	Ala	Asn	Ser
				Θ5					SO
Ile	Thr	Glu	Leu	Arg	Val	Asn	Gin	Phe	Leu	Asp	Tyr
			100					105
Leu	Gly	Val	Met	Asn	Thr	Glu	Trp	Ile	Ile	Glu	Ser
		115					120

Gin	Gly	Gly	Thr
Lys	Tyr	Ile	Asp 80
Lys	Phe	Ile S5	Gly
Leu	Gin 110	Glu	Phe

<210> 39 <211> 399 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<221> CDS <222> (1)..(399) <220>

<221> Mutace <222> (262).. (i3<) <223> Epitop |30 tetanického toxoidu <220>

<221> různé <222> (,1) . . (261) <223> DNA kódující aminokyseliny 1-87 humánního IL5 <220>

<221> různé <222> (325)..(396) <223> DNA kódující aminokyseliny 92-115 humánního IL5 <400> 39

138

atc ccc aca

gaa Glu

att Ile 5

ccc aca Pro Thr

agt gca ttg gtg aaa gag acc ttg gca

48

Ile Pro 1

Thr

Ser

Ala

Leu Val 10

Lys Glu

Thr

Leu 15

Ala

ctg

ctt

tet

act

cat

ega

act

ctg

ata

gcc

aat

gag

act

ctc

cgg

96

Leu

Ser

Thr

His

Arg

Thr

Leu

Ile

Ala

Asn

Glu

Thr

Leu

Arg

20

25

30

att

cct

gtt

cct

gta

cat

aaa

aat

cac

caa

ctg

tgc

act

gaa

atc

144

Ile

Pro

Val

Pro

Val

His

Lys

Asn

His

Gin

Leu

cys

Thr

Glu

Ile

35

40

45

ttt

cag

gga

ata

ggc

aca

ctc

gag

agt

caa

act

gtg

caa

ggg

ggt

act

192

Phe

Gin

Gly

Ile

Gly

Thr

Leu

Glu

Ser

Gin

Thr

Val

Gin

Gly

Thr

50

55

60

gtg

gaa

aga

cta

ttc

aaa

aac

ttg

tcc

tta

ata

aag

aaa

tac

atc

gat

240

Val

Glu

Arg

Leu

Phe

Lys

Asn

Leu

Ser

Leu

Ile

Lys

Tyr

Ile

Asp

65

70

75

80

ggc

caa

aaa

aag

tg t

gga

ttc

sse

aac

ttc

ěCC

gtg

age

tte

tgg

288

Gly

Gin

Lys

Cys

Gly

Phe

Asn

Phe

Thr

Val

Ser

Phe

Trp

85

90

95

ctg

cgc

gtg

cct

aag

gtg

age

gcc

age

cac

ctg

gag

aga

gta

aac

caa

336

Leu

Arg

Val

Pro

Lys

Val

Ser

Ala

Ser

His

Leu

Glu

Arg

Val

Asn

Gin

100

105

110

ttc

cta

gac

tat

ctg

cag

gag

ttt

ctt

ggt

gta

atg

aac

acc

gag

tgg

384

Phe

Leu

Asp

Tyr

Leu

Gin

Glu

Phe

Leu

Gly

Val

Met

Asn

Thr

Glu

Trp

115 120 125 ata ata gaa agt tga 399

Ile Ile Glu Ser

130 <210> 40 <211> 132 <212> PRT <213> Umělá sekvence <223> Popis umělé sekvence: humánní IL5 modifikovaný substitucí s epitopem tetanického toxoidu • 4 44··

4 • 4·· • 4 4444

139

<400> 40

Ile 1

Pro

Thr

Glu

Ile 5

Pro

Thr

Ser

Ala

Leu 10

Val

Lys

Glu

Thr

Leu 15

Ala

Leu

Ser

Thr 20

His

Arg

Thr

Leu

Leu 25

Ile

Ala

Asn

Glu

Thr 30

Leu

A.rg

Ile

Pro

Val 35

Pro

Val

His

Lys

Asn 40

His

Gin

Leu

Cys

Thr 45

Glu

Ile

Phe

Gin 50

Gly

Ile

Gly

Thr

Leu 55

Glu

Ser

Gin

Thr

Val 60

Gin

Gly

Thr

Val 65

Glu

Arg

Leu

Phe

Lys 70

Asn

Leu

Ser

Leu

Ile 75

Lys

Tyr

Ile

Asp 80

Gly

Gin

Lys

Lys 85

Cys

Gly

Phe

Asn

Asn 90

Phe

Thr

Val

Ser

Phe 95

Trp

Leu

Arg

Val

Pro 100

Lys

Val

Ser

Ala

Ser 105

His

Leu

Glu

Arg

Val 110

Asn

Gin

Phe

Leu

Asp 115

Tyr

Leu

Gin

Glu

Phe 120

Leu

Gly

Val

Met

Asn 125

Thr

Glu

Trp

Ile Ile Glu Ser 130 <210> 41 <211> 393 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<221> CDS <222> (1)..(393) <220>

<221> Mutace <222> (256) . . (318) <223> Epitop P30 tetanického toxoidu <220>

<221> různé <222> (1)..(255) <223> DNA kódující aminokyseliny 1-85 humánního IL5 <220>

<221> různé • · • · ©

• · ··· © ♦ · © · · · · ··

140 <222> (319)..(390) <223> DNA kódující aminokyseliny 92-115 humánního IL5

:400> 41

atc

ccc

aca

gaa

att

ccc

aca

agt

gca

ttg

gtg

aaa

gag

acc

ttg

gca

48

Ile

Pro

Thr

Glu

Ile

Pro

Thr

Ser

Ala

Leu

Val

Lys

Glu

Thr

Leu

Ala

1

5

10

15

ctg

ctt

tet

act

cat

ega

act

ctg

ata

gcc

aat

gag

act

ctc

cgg

96

Leu

Ser

Thr

His

Arg

Thr

Leu

Ile

Ala

Asn

Glu

Thr

Leu

Arg

20

25

30

att

cct

gtt

cct

gta

cat

aaa

aat

cac

caa

ctg

tgc

act

gaa

atc

144

Ile

Pro

Val

Pro

Val

His

Lys

Asn

His

Gin

Leu

Cys

Thr

Glu

Ile

35

40

45

ttt

cag

gga

ata

ggc

aca

ctc

gag

agt

caa

act

gtg

caa

ggg

ggt

act

192

Phe

Gin

Gly

Ile

Gly

Thr

Leu

Glu

Ser

Gin

Thr

Val

Gin

Gly

Glv

Thr

50

55

60

gtg

gaa

aga

eta

ttc

aaa

aac

ttg

tcc

tta

ata

aag

aaa

tac

atc

gat

240

Val

Glu

Arg

Leu

Phe

Lys

Asn

Leu

Ser

Leu

Ile

Lys

Tyr

Ile

Asp

65

70

75

80

ggc

caa

aaa

aag

ttc

aac

ttc

aec

gtg

age

ttc

tgg

ctg

ege

288

Gly

Gin

Lys

Phe

Asn

Phe

Thr

Val

Ser

Phe

Trp

Leu

Arg

85

90

95

gtg

cct

aag

gtg

age

gcc

age

cac

ctg

gag

aga

gta

aac

caa

ttc

eta

336

Val

Pro

Lys

val

Ser

Ala

Ser

His

Leu

Glu

Arg

Val

Asn

Gin

Phe

Leu

100

105

110

gac tat ctg

cag

gag

ttt

ctt

ggt

gta

ata

aac

acc

gag

tgg

ata

384

Asp Tyr Leu i

Gin

Glu

Phe

Leu

Gly

Val

Met

Asn

Thr

Glu

Trp

Ile

115 120 125 gaa agt tga 393

Glu Ser

130 <210> 42 <211> 130 <212> PRT <213> Umělá sekvence <223> Popis umělé sekvence: humánní IL5 modifikovaný substitucí s epitopem tetanického toxoidu ···»

141 <400> 42

Ile 1	Pro	Thr	Glu	Ile Pro 5	Thr	Ser	Ala	Leu 10	Val	Lys
Leu	Leu	Ser	Thr 20	His» Arg	Thr	Leu	Leu 25	Ile	Ala	ϊι« Λ
Ile	Pro	Val 35	Pro	Val His	Lys	Asn 40	His	Gin	Leu	Cys
Phe	Gin 50	Gly	Ile	Gly Thr	Leu 55	Glu	Ser	Gin	Thr	Val 60
Val 65	.Glu	Arg	Leu	Phe Lys 70	Asn	Leu	Ser	Leu	Ile 75	Lys
Gly	Gin	Lys	Lys	Lys Phe 85	Asn	Asn	Phe	Thr 90	Val	Ser
Val	Pro	lys	Val 100	Ser Ala	Ser	His	Leu 105	Glu	Arg	Val
Asp	Tyr	Leu 115	Gin	Glu Phe	Leu	Gly 120	Val	Met	Asn	Thr
Glu	Ser 130

Glu	Thr	Leu 15	Ala
Glu	Thr 30	Leu	Arg
Thr 45	Glu	Glu	Ile
Gin	Gly	Gly	Thr
Lys	Tyr	Ile	Asp 80
Phe	Trp	Leu 95	Arg
Asn	Gin 110	Phe	Leu
Glu	Trp	Ile	Ile

125 <210> 43 <211> 444 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: humánní IL5 modifikovaný substitucí s epitopy tetanického toxoidu <220>

<221> CDS <222> (1)..(444) <220>

<221> Mutace <222> (262)..(306) <223> Epitop P2 tetanického toxoidu <220>

<221> Mutace <222> (307)..(369) <223> Epitop P30 tetanického toxoidu <220>

• Φ φφφφ φ φ φφφφ φ φ •· φφφφ

142 <221> různé <222> (1) . . (261) <223> DNA kódující aminokyseliny 1-87 humánního IL5 <220>

<221> různé <222> (370)..(441) <223> DNA kódující aminokyseliny 92-115 humánního IL5 <400> 43

atc ccc

aca gaa att »ccc aca agt gca

ttg gtg aaa gag acc ttg

gca Ala

48

Ile 1

Pro

Thr Glu Ile 5

Pro

Thr

Ser

Ala

Leu 10

Val Lys

Glu

Thr

Leu 15

ctg

ctt

tet

act

cat

ega

act

ctg

ata

gcc

aat

gag

act

ctc

cgg

96

Leu

Ser

Thr

His

Arg

Thr

Leu

Ile

Ala

Asn

Glu

Thr

Leu

Arg

20

25

30

att

cct

gtt

cct

gta

cat

aaa

aat

cac

caa

ctg

tgc

act

gaa

atc

144

Ile

řro

Val

Pro

Val

His

Lys

Asn

His

Gin

Leu

Cys

Thr

Glu

Ile

35

40

45

ttt

cag

gga

ata

ggc

aca

ctc

gag

agt

caa

act

gtg

caa

ggg

ggt

act

192

Phe

Gin

Gly Ile

Gly

Thr

Leu

Glu

Sex

Gin

Thr

Val

Gin

Gly

Thr

50

55

60

gtg

gaa

aga

cta

ttc

aaa

aac

ttg

tcc

tta

ata

aag

aaa

tac

atc

gat

240

Val

Glu

Arg

Leu

Phe

Lys

Asn

Leu

Ser

Leu

Ile

Lys

Tyr

Ile

Asp

65

70

75

80

ggc

caa

aaa

aag

tgt

gga

cag

tac

atc

aag

gcc

aac

tcc

aag

ttc

288

Gly

Gin

Lys

Cys

Gly

Gin

Tyr

Ile

Lys

Ala

Asn

Ser

Lys

Phe

85

90

95

atc

ggc

atc

acc

gag

ctg

ttc

aac

ttc

acc

gtg.

age

ttc

tgg

ctg

336

Ile

Gly

Ile

Thr

Glu

Leu

Phe

Asn

Phe

Thr

Val

Ser

Phe

Trp

Leu

100

105

110

cgc

gtg

cct

aag

gtg

age

gcc

age

cac

ctg

gag

aga

gta

aac

caa

ttc

384

Arg

Val

Pro

Lys

Val

Ser

Ala

Ser

His

Leu

Glu

Arg

Val

Asn

Gin

Phe

115

120

125

cta

gac

tat

ctg

cag

gag

ttt

ctt

ggt

gta

a tg

aac

acc

gag

tgg

ata

432

Leu

Asp

Tyr

Leu

Gin

Glu

Phe

Leu

Gly

Val

Met

Asn

Thr

Glu

Trp

Ile

130 135 140 ata gaa agt tga 444

Ile Glu Ser

145 <210> 44 <211> 147 <212> PRT <213> Umělá sekvence

444«

444

444 4

· * • 4 4··«

143 <223> Popis umělé sekvence: humánní IL5 modifikovaný substitucí s epitopy tetanického toxoidu <400> 44

Ile 1

Pro

Thr

Glu

Ile 5

Pro

Thr

Ser

Ala

Leu 10

Val

Lys

Glu

Thr

Leu 15

Ala

Leu

Ser

Thr 20

His

Arg

Thr

Leu

Leu 25

Ile

Ala

Asn

Glu

Thr 30

Leu

Arg

Ile

Pro

Val 35

Pro

VÁ1

His

Lys

Asn 40

His

Gin

Leu

Cys

Thr 45

Glu

Ile

Phe

Gin Gly 50 '

Ile

Gly

Thr

Leu 55

Glu

Ser

Gin

Thr

Val 60

Gin

Gly

Thr

Val 65

Glu

Arg

Leu

Phe

4 Lys 70

Asn

Leu

Ser

Leu

Ile 75

Lys

Tyr

Ile

Asp 80

Gly

Gin

Lys

Lys 85

Cys

Gly

Gin

Tyr

Ile 90

Lys

Ala

Asn

Ser

Lys 95

Phe

Ile

Gly

Ile

Thr 100

Glu

Leu

Phe

Asn

Asn 105

Phe

Thr

Val

Ser

Phe 110

Trp

Leu

Arg

Val

Pro 115

Lys

Val

Ser

Ala

Ser 120

His

Leu

Glu

Arg

Val 125

Asn

Gin

Phe

Leu

Asp 130

Tyr

Leu

Gin

Glu

Phe 135

Leu

Gly

Val

Met

Asn 140

Thr

Glu

Trp

Ile

Ile Glu Sex 145 <210> 45 <211> 375 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: myší IL5 modifikovaný substitucí s epitopem tetanického toxoidu <220>

<221> CDS <222> (1)..(375) <220>

<221> Mutace <222> (256)..(300) <223> Epitop P2 tetanického toxoidu <220>

<221> různé ·· ¥»·*

144 <222> (1). .(255) <223> DNA kódující aminokyseliny 1-85 myšího IL5 <220>

<221> různé <222> (301)..(375) <223> DNA kódující aminokyseliny 90-113 myšího IL5 <400> 45

atg gag

att Ile

ccc atg

age aca gtg gtg aaa gag acc ttg aca

cag Gin 15

ctg Leu

48

Met 1

Glu

Pro

Met 5

Ser

Thr Val

Val Lys 10

Glu

Thr

Leu

Thr

tcc

gct

cac

ega

g=t

ctg

ttg

aca

age

aat

gag

acg

atg

agg

ctt

cct

96

Ser

Ala

His

Arg

Ala

Leu

Thr

Ser

Asn

Glu

Thr

Met

Arg

Leu

Pro

20

25

30

gtc

cct

aet

cat

aaa

aat

cac

cag

eta

tgc

att

gga

gag

atc

ttt

cag

144

Val

Pro

Thr

His

Ly_?

Asn

His

Gin

Leu

Cys

Ile

Gly

Glu

Ile

Phe

Gin

35

40

45

ggg

eta

gac

ata

ctg

aag

aat

caa

aet

gtc

cgt

ggg

ggt

acc

gtg

gaa

192

Gly

Leu

Asp

Ile

Leu

Lys

Asn

Gin

Thr

Val

Arg

Gly

Thr

Val

Glu

50

55

60

atg

eta

ttc

caa

aac

ctg

tea

tta

ata

aag

aaa

tac

atc

gat

aga

caa

240

Met

Leu

Phe

Gin

Asn

Leu

Ser

Leu

Ile

Lys

Tyr

Ile

Asp

Arg

Gin

65

70

75

80

aaa

gag

aag

tgt

ggc

cag

tac

atc

aaa

gct

aac

tec

aaa

ttc

atc

ggt

288

Lys

Glu

Lys

Cys

Gly

Gin

Tyr

Ile

Lys

Ala

Asn

Ser

Lys

Phe

Ile

Gly

85

90

95

atc

acc

gag

etg

agg

acg

agg

cag

ttc

ctg

gat

tat

ctg

cag

gag

ttc

336

Ile

Thr

Glu

Leu

Arg

Thr

Arg

Gin

Phe

Leu

Asp

Tyr

Leu

Gin

Glu

Phe

100

105

110

ctt

ggt

gtg

atg

agt

aca

gag

tgg

gca

atg

gaa

ggc

taa

375

Leu

Gly

Val

Met

Ser

Thr

Glu

Trp

Ala

Met

Glu

Gly

115

120

<210> 46 <211> 124 <212> PRT <213> Umělá sekvence <223> Popis umělé sekvence: myší IL5 modifikovaný substitucí s epitopem tetanického toxoidu

4«

4444 44 • ♦

4 44

4« 4444

145

<400> 46

Met

Glu

Ile

Pro

Met

Ser

Thr

Val

Lys

Glu

Thr

Leu

Thr

Gin

Leu

1

5

10

15

Ser

Ala

His

Arg

Ala

Leu

Thr

Ser

Asn

Glu

Thr

Met

Arg

Leu

Pro

20

25

30

Val

Pro

Thr

His

Lys

Asn

His

Gin

Leu

Cys

Ile

Gly

Glu

Ile

Phe

Gin

35

40

45

Gly

Leu

Asp

Ile

Leu

Lys

Asn

Gin

Thr

Val

Arg

Gly

Thr

Val

Glu

50

55

60

Met

Leu

Phe

Gin

Asn

Leu

Ser

Leu

Ile

Lys

Tyr

Ile

Asp

Arg

Gin

65

70

75

80

Lys

Glu

Lys

Cys

Gly

Gin

Tyr

Ile

Lys

Ala

Asn

Ser

Lys

Phe

Ile

Gly

85

90

95

Ile

Thr

Glu

Leu

Arg

Thr

Arg

Gin

Phe

Leu

Asp

Tyr

Leu

Gin

Glu

Phe

100

105

110

Leu

Gly

Val

Met

Ser

Thr

Glu

Trp

Ala

Met

Glu

Gly

115

120

<210> 47 <211> 369 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<221> CDS <223> (1)..(369) <220>

<221> Mutace <222> (88)..(150) <223> Epitop P30 tetanického toxoidu <220>

<221> různé <222> (1) . . (87) <223> DNA kódující aminokyseliny 1-29 myšího IL5 <220>

<221> různé <222> (151)..(366) • · ·· · · · · · · ·· ·· • ··· ···· ·· · · · · · · · · · • · · · · · · · · · · ··· · · * · · · ···· ·· ·· ··· ·· ····

146 <223> DNA kódující aminokyseliny 42-113 myšího IL5 <400> 47

atg Met 1

gag Glu

att Ile

ccc Pro

atg age aca gtg

gtg aaa gag acc ttg aca

cag Gin 15

ctg Leu

Met Ser 5

Thr Val

Val

Lys 10

Glu

Thr

Leu

Thr

tcc

gct

cac

ega

gct

ctg

ttg

aca

age

aat

gag

a cg

atg

ttc

aac

Ser

Ala

His

Arg

Ala

Leu

Thr

Ser

Asn

Glu

Thr

Met

Phe

Asn

20

25

30

ttc

acc

gtg

age

ttc

tgg

ctg

ege

gtg

ccc

aag

gtg

age

gcc

age

cac

Phe

Thr

Val

Ser

Phe

Trp

Leu

Arg

Val

Pro

Lys

Val

Ser

Ala

Ser

His

40 45

ctg gag tgc att gga

gag atc ttt cag ggg cta gac

ata ctg aag aat

192

Leu Glu Cys

Ile

Gly

Glu Ile 55

Phe Gin

Gly

Leu

Asp 60

Ile

Leu

Lys

Asn

50

caa

act

gtc

cgt

ggg

ggt

acc

gtg

gaa

atg

cta

ttc

caa

aac

ctg

tea

240

Gin

Thr

Val

Arg

Gly

Thr

Val

Glu

Met

Leu

Phe

Gin

Asn

Leu

Ser

65

70

75

80

tta

ata

aag

aaa

tac

atc

gat

aga

caa

aaa

gag

aag

tgt

ggc

gag

288

Leu

Ile

Lys

Tyr

Ile

Asp

Arg

Gin

Lys

Glu

Lys

Cys

Gly

Glu

85

90

95

aga

cgg

agg

acg

agg

cag

ttc

ctg

gat

tat

ctg

cag

gag

ttc

ctt

ggt

336

Arg

Thr

Arg

Gin

Phe

Leu

Asp

Tyr

Leu

Gin

Glu

Phe

Leu

Gly

100

105

110

gtg

atg

agt

aca

gag

tgg

gca

atg

gaa

ggc

taa

369

Val

Met

Ser

Thr

Glu

Trp

Ala

Met

Glu

Gly

115 120 <210> 48 <211> 122 <212> PRT <213> Umělá sekvence <223> Popis umělé sekvence: myší IL5 modifikovaný substitucí s epitopem tetanického toxoidu • 4 <400> 48

444 4444

4 4 4444 4 4 4

444 4 444 4 4

147

Met -Glu 1

Ile Pro Met Ser Thr Val Val Lys Glu Thr Leu Thr Gin

Leu

5

10

15

Ser

Ala

His

Arg

Ala

Leu

Thr

Ser

Asn

Glu

Thr

Met

Phe

Asn’

Asn

20

25

30

Phe

Thr

Val

Ser

Phe

Trp

Leu

Arg

Val

Pro

Lys

Val

Ser

Ala

Ser

His

35

40

45

Leu

Glu

Cys

Ile

Gly

Glu

Ile

Phe

Gin

Gly

Leu

Asp

Ile

Leu

Lys

Asn

50

55

60

Gin

Thr

Val

Arg

Gly

Thr

Val

Glu

Met

Leu

Phe

Gin

Asn

Leu

Ser

65

70

75

80

Leu

Ile

Lys

Tyr

Ile

Asp Arg

Gin

Lys

Glu

Lys

Cys

Gly

Glu

85

90

95

Arg Arg Arg

Thr

Arg

Gin

Phe

Leu

Asp

Tyr

Leu

Gin

Glu

Phe

Leu

Gly

100

105

110

Val

Met

Ser

Thr

Glu

Trp

Ala

Met

Glu

Gly

115

120

<210> 49 <211> 387 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<221> CDS <222> (1)..(387) <220>

<221> Mutace <222> (169)..(231) <223> Epitop P2 tetanického toxoidu <220>

<221> různé <222> (1)..(168) <223> DNA kódující aminokyseliny 1-56 myšího IL5 <220>

<221> různé <222> (232) .. (384) <223> DNA kódující aminokyseliny 63-113 myšího IL5

44

4 4 4 • · 4 • 4 <400> 49

148

atg Met 1

gag att ccc

atg age aca gtg gtg

aaa gag acc ttg aca cag ctg Lys Glu Thr Leu Thr Gin Leu

46

Glu

Ile

Pro

Met 5

Ser

Thr

Val

10

15

tcc.

. gct

cac

ega

gct

ctg

ttg

aca

age

aat

gag

acg

atg

agg

ctt

cct

96

Ser

Ala

His

Arg

Ala

Leu

Thr

Ser

Asn

Glu

Thr

Met

Arg

Leu

Pro

20

25

30

gtc

cct

act

cat

aaa

aat

cac

cag

cta

tgc

att

gga

gag

atc

ttt

cag

144

Val

Pro

Thr

His

Lys

Asn

His

Gin

Leu

Cys

Ile

Gly

Glu

Ile

Phe

Gin

35

40

45

ggg

cta

gac

ata

ctg

aag

aat

caa

ttc

aac

ttc

acc

gtg

age

ttc

192

Gly

Leu

Asp

Ile

Leu

Lys

Asn

Gin

Phe

Asn

Phe

Thr

Val

Ser

Phe

50

55

60

tgg

ctg

egc

gtg

ccc

aag

gtg

age

gcc

age

cac

ctg

gag

gtg

gaa

atg

240

Trp

Leu

Arg

Val

Pro

Lys

Val

Ser

Ala

Ser

His

Leu

Glu

Val

Glu

Met

65

70

75

80

cta

ttc

caa

aac

ctg

tea

tta

ata

aag

aaa

tac

atc

gat

aga

caa

aaa

288

Leu

Phe

Gin

Asn

Leu

Ser

Leu

Ile

Lys

Tyr

Ile

Asp

Arg

Gin

Lys

85

90

95

gag

aag

tgt

ggc

gag

aga

cgg

agg

acg

agg

cag

ttc

ctg

gat

tat

336

Glu

Lys

Cys

Gly

Glu

Arg

Thr

Arg

Gin

Phe

Leu

Asp

Tyr

100

105

110

ctg

cag

gag

ttc

ctt

ggt

gtg

atg

agt

aca

gag

tgg

gca

atg

gaa

ggc

3B4

Leu

Gin

Glu

Phe

Leu

Gly

Val

Met

Ser

Thr

Glu

Trp

Ala

Met

Glu

Gly

115

120

125

taa 387 <210> 50 <211> 128 <212> PRT <213> Umělá sekvence <223> Popis umělé sekvence: myší IL5 modifikovaný substitucí s epitopem tetanického toxoidu • · • · · · <400> 50

149

Met 1

Glu

Ile

Pro

Met 5

Ser

Thr

Val

Lys 10

Glu

Thr

Leu

Thr

Gin 15

Leu

ser

Ala

His

Arg 20

Ala

Leu

Thr

Ser 25

Asn

Glu

Thr

Met

Arg 30

Leu

Pro

Val

Pro

Thr 35

His

Lys

Asn

His

Gin 40

Leu

Cys

Ile

Gly

Glu 45

Ile

Phe

Gin

Gly

Leu 50

Asp

Ile

Leu

Lys

Asn 55

Gin

Phe

Asn

Phe 60

Thr

Val

Ser

Phe

Trp 65

Leu

Arg

Val

Pro

► Lys 70

Val

Ser

Ala

Ser

His 75

Leu

Glu

Val

Glu

Met 80

Leu

Phe

Gin

Asn

Leu 85

Ser

Leu

Ile

Lys

Lys 90

Tyr

Ile

Asp

Arg

Gin 95

Lys

Glu

Lys

Cys

Gly 100

Glu

Arg

Arg 105

Thr

Arg

Gin

Phe

Leu 110

Asp

Tyr

Leu

Gin

Glu 115

Phe

Leu

Gly

Val

Met 120

Ser

Thr

Glu

Trp

Ala 125

Met

Glu

Gly

<210> 51 <211> 351 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<221> CDS <222> (1)..(351) <220>

<221> Mutace <222> (88) . . (132) <223> Epitop P2 tetanického toxoidu <220>

<221> různé <222> (133) .. (348) ·

• · · · ·· • 4 4 · · ·

4 4 · 4 4 ·

4 4 4 4 4

4 4 4 4

444 44 4444

150 <223> DNA kódující aminokyseliny 42-113 myšího IL5 <400> 51

atg Met 1

gag att ccc atg

age aca gtg gtg aaa gag acc ttg aca

cag Gin 15

ctg Leu

48

Glu

Ile

Pro

Met 5

Ser Thr Val Val Lys 10

Glu

Thr

Leu

Thr

tcc

gct

cac

ega

gct

ctg

ttg

aca

age

aat

gag

a cg

atg

cag

tac

atc

S6

Ser

Ala

His

Arg

Ala

Leu

Thr

Ser

Asn

Glu

Thr

Met

Gin

Tyr

Ile

20

25

30

aaa

gct

aac

tcc

aaa

ttc

atc

ggt

atc

acc

gag

ctg

tgc

att

gga

gag

144

Lys

Ala

Asn

Ser

Lys

Phe

Ile

Gly

Ile

Thr

Glu

Leu

Cys

Ile

Gly

Glu

35

40

45

atc

ttt

cag

ggg

cta

gac

a ta

ctg

aag

aat

caa

act

gtc

cgt

ggg

ggt

192

Ile

Phe

Gin

Gly

Leu

Asp

Ile

Leu

Lys

Asn

Gin

Thr

Val

Arg

Gly

50

55

60

acc

gťg

gaa

atg

ct$

ttc

caa

aac

ctg

tea

tta

ata

aag

aaa

tac

atc

240

Thr

Val

Glu

Met

Leu

Phe

Gin

Asn

Leu

Ser

Leu

Ile

Lys

Tyr

Ile

65

70

75

80

gat

aga

caa

aaa

gag

aag

tgt

ggc

gag

aga

cgg

agg

a cg

agg

cag

288

Asp

Arg

Gin

Lys

Glu

Lys

Cys

Gly

GlU

Glu

Arg

Arg Arg

Thr

Arg

Gin

85

SO

95

ttc

ctg

gat

tat

ctg

cag

gag

ttc

ctt

ggt

gtg

atg

agt

aca

gag

tgg

336

Phe

Leu

Asp

Tyr

Leu

Gin

Glu

Phe

Leu

Gly

Val

Met

Ser

Thr

Glu

Trp

100

105

110

gca atg gaa ggc taa 351

Ala Met Glu Gly

115 <210> 52 <211> 116 <212> PRT <213> Umělá sekvence <223> Popis umělé sekvence: myší IL5 modifikovaný substitucí s epitopem tetanického toxoidu ·· · · <400> 52 ·· ·· • » ·

151

Met Glu Ile Pro Met Ser Thr Val Val Lys Glu Thr Leu Thr Gin Leu
1	5	10	15
Ser Ala His	Arg Ala	Leu Leu Thr Ser Asn Glu	Thr Met Gin Tyr Ile
	20	25	30
Lys Ala Asn	Ser Lys	Phe Ile Gly Ile Thr Glu	Leu Cys Ile Gly Glu
35		40	45
Xle Phe Gin	Gly Leu	Asp Ile Leu Lys Asn Gin	Thr Val Arg Gly Gly
50		55	60
Thr Val Glu	Met Leu	Phe Gin Asn Leu Sex Leu	Ile Lys Lys Tyr Ile
65		70 75	80
Asp Arg Gin	Lys Glu	Lys Cys Gly Glu Glu Arg Arg Arg Thr Arg Gin
	85	90	95
Phe Leu Asp	Tyr Leu	Gin Glu Phe Leu Gly Val	Met Ser Thr Glu Trp
	100	105	110

Ala Met Glu Gly 115 <210> 53 <211> 369 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<221> CDS <222> (1)..(369) <220>

<221> Mutace <222> (250)..(294) <223> Epitop P2 tetanického toxoidu <220>

<221> různé <222> (1)..(249) <223> DNA kódující aminokyseliny 1-83 myšího IL5 <220>

<221> různé <222> (295.) . . (366) ♦ · · ·· ·· ·· • · · · · «

99

9 9 9 • 9 9

9 9

99 9 9

152 <223> DNA kódující aminokyseliny 90-113 myšího IL5 <400> 53

a tg Met 1

gag att ccc atg agc

aca gtg gtg aaa gag acc ttg aea

cag Gin 15

ctg Leu

48

Glu

Xle

Pro

Met Ser 5

Thr

Val Val Lys 10

Glu

Thr Leu

Thr

tcc

gct

cac

ega

gct

ctg

ttg

aca

agc

aat

gag

a cg

atg

agg

ctt

cct

96

Ser

Ala

His

Arg

Ala

Leu

Thr

Ser

Asn

Glu

Thr

Met

Arg

Leu

Pro

20

25

30

gtc

cct

act

cat

aaa

aat

cac

cag

cta

tgc

att

gga

gag

atc

ttt

cag

144

Val

Pro

Thr

His

Lys

Asn

His

Gin

Leu

Cys

Ile

Gly

Glu

Ile

Phe

Gin

35

40

45

ggg

cta

gac

ata

ctg

aag

aat

caa

act

gtc

cgt

ggg

ggt

acc

gtg

gaa

192

Gly

Leu

Asp

Ile

Leu

Lys

Asn

Gin

Thr

Val

Arg

Gly

Thr

Val

Glu

50

55

60

atg

cta

ttc

caa

aac

ctg

tea

tta

ata

aag

aaa

tac

atc

gat

aga

caa

240

Met

Leu

Phe

Gin

Asn

Leu

Ser

Leu

Ile

Lys

Tyr

Ile

Asp

Gin

65

70

75

80

aaa gag aag

cag tac atc aag gcc aac

tcc aag ttc atc ggc atc acc

288

Lys

Glu

Lys

Gin Tyr 85

Ile Lys

Ala Asn

Ser 90

Lys

Phe

Ile

Gly

Ile 95

Thr

gag

ctg

agg

acg

agg

cag

ttc

ctg

gat

tat

ctg

cag

gag

ttc

ctt

ggt

336

Glu

Leu

Arg

Thr

Arg

Gin

Phe

Leu

Asp

Tyr

Leu

Gin

Glu

Phe

Leu

Gly

100

105

110

gtg	atg	agt	aca	gag	tgg	gca	atg	gaa	ggc taa	369
Val	Met	Ser	Thr	Glu	Trp	Ala	Met	Glu	Gly
		115					120

<210> 54 <211> 122 <212> PRT <213> Umělá sekvence <223> Popis umělé sekvence: myší IL5 modifikovaný substitucí s epitopem tetanického toxoidu • * ··· · <400> 54 • · · · ·· ··♦· • ♦ · · 9 9 9 '9

9 9 9 9 9 9 9 · ·· · · · · · · « • 9 9 9 9 9 9

99 9 99 9 9 9 99

153

Met 1

Glu Ile

Pro Met 5

Ser

Thr

Val Val

Lys Glu Thr Leu Thr Gin

Leu

10

15

Ser Ala

His

Arg

Ala

Leu

Thr

Ser

Asn

Glu

Thr

Met

Arg

Leu

Pro

20

25

30

Val Pro

Thr

His

Lys

Asn

His

Gin

Leu

Cys

Ile

Gly

Glu

Ile

Phe

Gin

35

40

45

Gly Leu Asp

Ile

Leu

Lys

Asn

Gin

Thr

Val

Arg

Gly

Thr

Val·

Glu

50

55

60

Met

Leu

Phe

Gin

Asn

Leu

Ser

Leu

Ile

Lys

Tyr

Ile

Asp

Arg

Gin

65

70

75

80

Lys

Glu

Lys

Gin

Tyr

Ile

Lys

Ala

Asn

Ser

Lys

Phe

Ile

Gly

Ile

Thr

85

90

95

Glu

Leu

Arg

Thr

Arg

Gin

Phe

Leu

Asp

Tyr

Leu

Gin

Glu

Phe

Leu

Gly

100

105

110

Val

Met

Ser

Thr

Glu

Trp

Ala

Met

Glu

Gly

115

120

<210> 55 <211> 393 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<221> CDS <222> (1)..(393) <220>

<221> Mutace <222> (256)..(318) <223> Epitop P30 tetanického toxoidu <220>

<221> různé <222> (1) . . (255) <223> DNA kódující aminokyseliny 1-85 myšího IL5 <220>

<221> různé <222> (319)..(390) <223> DNA kódující aminokyseliny 90-113 myšího IL5 . ·· •· ·»«« <400> 55 ·· ··

4 4 · · · · · • · 4 4 4 • 4 4 ·

4449 99

4· ·

4 • 4

4 4

4

154

atg gag Met GlU 1

att Ile

ccc atg

age aca Ser Thr

gtg gtg aaa gag acc ttg

aca cag Thr Gin 15

ctg Leu

48

Pro

Me£ 5

Val Val

Lys 10

Glu

Thr

Leu

tcc

gct

cac

ega

gct

ctg

ttg

aca

age

aat

gag

a cg

atg

agg

ctt

cct

96

Ser

Ala

His

Arg

Ala

Leu

Thr

Ser

Asn

Glu

Thr

Met

Arg

Leu

Pro

20

25

30

gtc

cct

act

cat

aaa

aat

cac

cag

cta

tgc

att

gga

gag

atc

ttt

cag

144

Val

Pro

Thr

His

Lys

Asn

His

Gin

Leu

Cys

Ile

Gly

Glu

Ile

Phe

Gin

35

40

45

ggg

cta

gac

ata

ctg

aag

aat

caa

act

gtc

cgt

ggg

ggt

acc

gtg

gaa

192

Gly

Leu

Asp

Ile

Leu

Lys

Asn

Gin

Thr

Val

Arg

Gly

Thr

Val

Glu

50

55

60

atg

cta

ttc

caa

aac

ctg

tea

tta

ata

aag

aaa

tac

atc

gat

aga

caa

240

Met

Leu

Phe

Gin

Asn

Leu

Ser

Leu

Ile

Lys

Tyr

Ile

Asp Arg

Gin

65

70

75

80

aaa

gag

aag

tgt

ggc

ttc

aac

ttc

acc

gtg

age

ttc

tgg

ctg

ege

288

Lys

Glu

Lys

Cys

Gly

Phe

Asn

Phe

Thr

Val

Ser

Phe

Trp

Leu

Arg

Θ5

SO

95

gtg

ccc

aag

gtg

age

gcc

age

cac

Ctg

gag

agg

a cg

agg

cag

ttc

ctg

336

Val

Pro

Lys

Val

Ser

Ala

Ser

His

Leu

Glu

Arg

Thr

Arg

Gin

Phe

Leu

100

105

110

gat

tat

ctg

cag

gag

ttc

ctt

ggt

gtg

atg

agt

aca

gag

tgg

gca

atg

384

Asp

Tyr

Leu

Gin

Glu

Phe

Leu

Gly

Val

Met

Ser

Thr

Glu

Trp

Ala

Met

115 120 125 gaa ggc taa 393

Glu Gly

130 <210> 56 <211> 130 <212> PRT <213> Umělá sekvence <223> Popis umělé sekvence: myší IL5 modifikovaný substitucí s epitopem tetanického toxoidu <400> 56 ·· ·· ·Β ···· ·· ·· • · · · · Β · · Β · · • · · · · · · · · Β Β

Β Β · · Β Β · · · Β ·

ΒΒΒ · Β Β · · ·

ΒΒΒΒ ΒΒ ·· ΒΒΒ ΒΒ ΒΒΒΒ

155

Met 1

Glu

Ile

Pro

Met 5·

Ser Thr

Val

Lys Glu Thr Leu Thr Gin

Leu

10

15

Ser

Ala

His

Arg

Ala

Leu

Thr

Ser

Asn

Glu

Thr

Met

Arg

Leu

Pro

20

25

30

Val

Pro

Thr

His

Lys

Ajn

His

Gin

Leu

Cys

Ile

Gly

Glu

Ile

Phe

Gin

35

40

45

Gly

Leu

Asp

Ile

Leu

Lys

Asn

Gin

Thr

Val

Arg

Gly

Thr

Val

Glu

50

55

60

Met

Leu

Phe

Gin

Asn

Leu

Ser

Leu

Ile

Lys

Tyr

Ile

Asp

Arg

Gin

65

70

75

80

Lys

Glu. Lys

Cys

Gly

Phe

Asn

Phe

Thr

Val

Ser

Phe

Trp

Leu

Arg

• 85

90

95

Val

Pro

Lys

Val

Ser

Ala

Ser

His

Leu

Glu

Arg

Thr

Arg

Gin

Phe

Leu

100

105

110

Asp

Tyr

Leu

Gin

Glu

Phe

Leu

Gly

Val

Met

Ser

Thr

Glu

Trp

Ala

Met

115

120

125

Glu Gly 130 <210> 57 <211> 387 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<221> CDS <222> (1) .. (387) <220>

<221> Mutace <222> (250)..(312) <223> Epitop P30 tetanického toxoidu <220>

<221> různé <222> (1)..(249) <223> DNA kódující aminokyseliny 1-83 myšího IL5

9999

99 • · Φ · • · Φ ΦΦΦ

ΦΦΦ ΦΦΦΦ ΦΦ

Φ Φ Φ

Φ Φ

ΦΦ Φ

Φ Φ Φ Φ «4 Φ

ΦΦΦ Φ Φ Φ Φ Φ ·

ΦΦ ΦΦΦΦ

156 <220>

<221> různé <222> (313).. (384) <223> DNA kódující aminokyseliny 90-113 myšího IL5 <400> 57

atg gag att

ccc atg age

aca gtg gtg aaa gag acc ttg aca

cag Gin 15

ctg Leu

48

Met Glu 1

Ile

Pro Met 5

Ser

Thr

Val Val

Lys 10

Glu

Thr

Leu

Thr

tcc

gct

cac

ega

gct

ctg

ttg

aca

age

aat

gag

acg

atg

agg

ctt

cct

96

Ser

Ala

His

Arg

Ala

Leu

Thr

Ser

Asn

Glu

Thr

Met

Arg

Leu

Pro

20

25

30

gtc

cct

act

cat

aaa

aat

cac

cag

cta

tgc

att

gga

gag

atc

ttt

cag

144

Val

Pro

Thr

His

Lys »Asn

His

Gin

Leu

Cys

Ile

Gly

Glu

Ile

Phe

Gin

35

40

45

ggg

cta

gac

ata

ctg

aag

aat

caa

act

gtc

cgt

ggg

ggt

acc

gtg

gaa

192

Gly

Leu

Asp

Ile

Leu

Lys

Asn

Gin

Thr

Val

Arg

Gly

Thr

Val

Glu

50

55

60

atg

cta

ttc

caa

aac

ctg

tea

tta

ata

aag

aaa.

tac

atc

gat

aga

caa

240

Met

Leu

Phe

Gin

Asn

Leu

Ser

Leu

Ile

Lys

Tyr

Ile

Asp

Arg

Gin

65

-

70

75

80

aaa

gag

aag

ttc

aac

ttc

acc

gtg

age

ttc

tgg

ctg

cgc

gtg

ccc

288

Lys

Glu

Lys

Phe

Asn

Phe

Thr

Val

Ser

Phe

Trp

Leu

Arg

Val

Pro

85

90

95

aag

gtg

age

gcc

age

cac

ctg

gag

agg

acg

agg

cag

ttc

ctg

gat

tat

336

Lys

Val

Ser

Ala

Ser

His

Leu

Glu

Arg

Thr

Arg

Gin

Phe

Leu

Asp

Tyr

100

105

110

ctg

cag

gag

ttc

ctt

ggt

gtg

atg

agt

aca

gag

tgg

gca

atg

gaa

ggc

384

Leu

Gin

Glu

Phe

Leu

Gly

Val

Met

Ser

Thr

Glu

Trp

Ala

Met

Glu

Gly

115

120

125

tas 387 <210> 58 <211> 128 <212> PRT <213> Umělá sekvence <223> Popis umělé sekvence: myší IL5 modifikovaný substitucí s epitopem tetanického toxoidu •4 *44· • 4

444 <400> 58

44

4 4 4

4 4

4 4 4

4 4

4444 44 •

4 4

4· 444

4· 44

4 · 4 • 4 4

4 4 4

4 4

4444

157

Met

Glu

Ile

Pro

Met

Ser

Thr

Val

Lys

Glu

Thr

Leu

Thr

Gin

Leu

1

5

10

15

Ser

Ala

His

Arg

Ala

Leu

Thr

Ser

Asn

Glu

Thr

Met

Arg

Leu

Pro

20

25

30

Val

Pro

Thr

His

Lys

Asn

His

Gin

Leu

Cys

Ile

Gly

Glu

Ile

Phe

Gin

40 45

Gly

Leu 50

Asp

Ile

Leu

Lys

Asn 55

Gin

Thr

Val

Arg

Gly 60

Gly

Thr

Val

Glu

Met 65

Leu

Phe

Gin

Asn

Leu 70

Ser

Leu

Ile

Lys

Lys 75

Tyr

Ile

Asp

Arg

Gin 80

Lys

Glu

Lys

Phe

Asn 85

Asn

Phe

Thr

Val

Ser 90

Phe

Trp

Leu

Arg

Val 95

Pro

Lys

Val

Ser

Ala 100

Ser

His

Leu

Glu

Arg 105

Thr

Arg

Gin

Phe

Leu 110

Asp

Tyr

Leu

Gin

Glu

Phe

Leu

Gly

Val

Met

Ser

Thr

Glu

Trp

Ala

Met

Glu

Gly

115 120 125 <210> 59 <211> 438 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: myší IL5 modifikovaný substitucí s epitopy tetanického toxoidu <220>

<221> CDS <222> (1)..(438) <220>

<221> Mutace <222> (256)..(300) <223> Epitop P2 tetanického toxoidu <220>

<221> Mutace <222> (301)..(363) <223> Epitop P30 tetanického toxoidu <220>

AA AAAA

A A A

A AAAA

A A A

A A AAA

A Α Α·

A A A A

A A A • A A A

AAA ••♦A AA

AA AA

A A A A

A A A

AAA A AAA

AA AAAA

158 <221> různé <222> (1)..(255) <223> DNA kódující aminokyseliny 1-85 myšího IL5 <220>

<221> různé <222> (364)..(435) <223> DNA kódující aminokyseliny 90-113 myšího IL5 <400> 59

atg gag att

ccc Pro

atg Met 5

age Ser

aca Thr

gtg gtg aaa gag acc ttg aca

cag Gin 15

ctg Leu

Met 1

Glu Ile

Val

Lys Glu 10

Thr Leu Thr

tcc

gct

cac

ega

gct

ctg

ttg

aca

age

aat

gag

acg

atg

agg

ctt

cct

Ser

Ala

His

Arg

Ala

Leu

Thr

Ser

Asn

Glu

Thr

Met

Arg

Leu

Pro

25 30

gtc cct

act Thr 35

cat His

aaa Lys

aat Asn

cac cag

eta Leu

tgc att

gga gag atc ttt

cag Gin

144

Val

Pro

His

Gin 40

Cys

Ile

Gly

Glu 45

Ile

Phe

ggg

eta

gac

ata

ctg

aag

aat

caa

act

gtc

cgt

ggg

ggt

acc

gtg

gaa

192

Gly

Leu

Asp

Ile

Leu

Lys

Asn

Gin

Thr

Val

Arg

Gly

Thr

Val

Glu

50

55

60

atg

eta

ttc

caa

aac

ctg

tea

tta

ata

aag

aaa

tac

atc

gat

aga

caa

240

Met

Leu

Phe

Gin

Asn

Leu

Ser

Leu

Ile

Lys

Tyr

Ile

Asp

Arg

Gin

65

70

75

80

aaa

gag

aag

tgt

ggc

cag

tac

atc

aag

gcc

aac

tcc

aag

ttc

atc

ggc

288

Lys

Glu

Lys

Cys

Gly

Gin

Tyr

Ile

Lys

Ala

Asn

Ser

Lys

Phe

Ile

Gly

85

90

95

atc

acc

gag

ctg

ttc

aac

ttc

acc

gtg

age

ttc

tgg

ctg

ege

gtg

336

Ile

Thr

Glu

Leu

Phe

Asn

Phe

Thr

Val

Ser

Phe

Trp

Leu

Arg

Val

100

105

110

ccc

aag

gtg

age

* gcc

age

cac

ctg

gag

agg

acg

agg

cag

ttc

ctg

gat

384

Pro

Lys

Val

Ser

Ala

Ser

His

Leu

Glu

Arg

Thr

Arg

Gin

Phe

Leu

Asp

115

120

125

tat

ctg

cag

gag

ttc

ctt

ggt

gtg

atg

agt

aca

gag

tgg

gca

atg

gaa

432

Tyr

Leu

Gin

Glu

Phe

Leu

Gly

Val

Met

Ser

Thr

Glu

Trp

Ala

Met

Glu

130

135

140

ggc taa 438

Gly

145 <210> 60 <211> 145 <212> PRT <213> Umělá sekvence ·« ·»©· ·© © © • ·· · ©· • · © · • © • · • · © · • ©4 ·© ·© © < · · • · * • · © « • © · ·© ··©·

159 <223> Popis umělé sekvence: myší IL5 modifikovaný substitucí s epitopy tetanického toxoidu <400> 60

Met 1

Glu

Ile

Pro

Met 5

Ser

Thr

Val

Lys 10

Glu

Thr

Leu

Thr

Gin 15

Leu

Ser

Ala

His

Arg 20

Ala

Leu

Thr

Ser 25

Asn

Glu

Thr

Met

Arg 30

Leu

Pro

Val

Pro

Thr 35

His

Lys

Asn

His

Gin 40

Leu

Cys

Ile

Gly

Glu 45

Ile

Phe

Gin

Gly

Leu 50

Asp

Ile

Leu

Lys

Asn 55

Gin

Thr

Val

Arg

Gly 60

Gly

Thr

Val

Glu

Met 65

Leu

Phe

Gin

Asn

Leu 70

Ser

Leu

Ile

Lys

Lys 75

Tyr

Ile

Asp

Arg

Gin 80

Lys

Glu

Lys

Cys

Gly 85

Gin

Tyr

Ile

Lys

Ala 90

Asn

Ser

Lys

Phe

Ile 95

Gly

Ile

Thr

Glu

Leu 100

Phe

Asn

Phe

Thr 105

Val

Ser

Phe

Trp

Leu 110

Arg

Val

Pro Lys Val

Ser

Ala Ser

His

Leu Glu Arg Thr Arg Gin Phe Leu Asp

115

120

125

Tyr

Leu

Gin

Glu

Phe

Leu

Gly

Val

Met Ser

Thr Glu

Trp

Ala

Met Glu

130

135

140

Gly

145 <210> 61 <211> 57 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222> (1)..(57) <223> DNA kódující přírodní vedoucí sekvenci humánního IL5 «

*♦ • f *

<400> 61

··

9 ·

160

atg agg atg

ctt Leu

ctg cat

ttg Leu

agt Ser

ttg Leu

ctg gct ctt Leu Ala Leu 10

gga qct Gly Ala

gcc Ala 15

tac Tyr

48

Met Arg 1

Met

Leu 5

His

gtg

tat

gcc

57

Val

Tyr

Ála

<210> 62 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 62

Met Arg Met Leu Leu His Leu Ser Leu Leu Ala Leu Gly Ala Ala Tyr 15 10 15

Val Tyr Ala <210> 63 <211> 60 <212> DNA <213> Mus musculus <220>

<221> CDS <222> (1)..(60) <223> DNA kódující přírodní vedoucí sekvenci myšího IL5 <400> 63

atg aga agg

atg ctt

ctg cac ttg

agt Ser

gtt Val 10

ctg act

ctc age tgt

gtc Val

48

Met 1

Arg Arg

Met

Leu 5

Leu

His

Leu

Thr

Leu

Ser Cys 15

tgg

gcc

act

gcc

60

Trp

Ala

Thr

Ala

<210> 64 <211> 19 <212> PRT <213> Mus musculus

4* ·*» · · 4 • · · «4 · · • · 4

4444 • 4 4·44 • · · • 4 444

4 · «4 4

4« 44«

94 · · ·

4 4 • 4 4 4

4 4 •4 9449

161 <400> 64

Met Arg Arg Met Leu Leu His Leu Ser Val Leu Thr Leu Ser Cys Val 15 10 15

Trp Ala Thr Ala 20 <210> 65 <211> 13 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: Všeobecný epitop pomocného T lymfocytu <400> 65

Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala 1-5 10 • ·

162 £(οΘ

PATENTOVÉ ·· » ·

Claims

» · • · ·

NÁROKY

1. Analog interleukinu 5 (IL5), který pochází z IL5 polypeptidu zvířete, do kterého je zavedena modifikace, která má za následek, že imunizace zvířete analogem indukuje produkci protilátek proti IL5 polypeptidů a kde se modifikace týká substituce a/nebo inzerce a/nebo delece aminokyseliny kterékoliv z kliček 1 až 3 nebo C-konce helixu D IL5, kde uvedené kličky a helix D odpovídají těm, které jsou znázorněny na obr. 3 pro lidský a myší IL5.
2. Analog interleukinu 5podle nároku 1, v němž modifikace má za následek, že je zachována podstatná frakce IL5 epitopů B buněk a že

- je zaveden alespoň jeden cizorodý epitop pomocného T lymfocytu (T_H epitop) a/nebo

- je zavedena alespoň jedna první skupina, která provádí cílení modifikované molekuly k buňce prezentující antigen (APC) nebo B lymfocytu a/nebo

- je zavedena alespoň jedna druhá skupina, která stimuluje imunitní systém a/nebo

- je zavedena alespoň jedna třetí skupina, která optimalizuje prezentaci modifikovaného IL5 polypeptidů imunitnímu systému.
3. Analog interleukinu 5 podle nároku 2, v němž modifikace zahrnuje zavedení cizorodého T_H epitopu a/nebo první a/nebo druhé a/nebo třetí skupiny jako postranní skupiny navázáním kovalentní nebo nekovalentní vazbou k vhodným chemickým skupinám v IL5 nebo jeho subsekvenci.

• ·

163 • · · • · · ··· · · • · • · · · • · · ··
4. Analog interleukinu 5 podle nároku 3, v němž modifikace zahrnuje substituci a/nebo deleci a/nebo inzerci a/nebo adici aminokyseliny.
5. Analog interleukinu 5 podle nároku 3 nebo 4, v němž modifikace má za následek poskytnutí fúzního polypeptidu.
6. Analog interleukinu 5 podle nároku 4 nebo 5, v němž zavedení substituce a/nebo delece a/nebo inzerce a/nebo adice aminokyseliny má za následek podstatnou konzervaci celkové terciární struktury IL5.
7. Analog interleukinu 5 podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, v němž modifikace zahrnuje duplikaci alespoň jednoho IL5 epitopu B buňky a/nebo zavedení haptenu.
8. Analog interleukinu 5 podle kteréhokoliv z nároků 2 až 7, v němž cizorodý T_H epitop je u zvířete imunodominantní.
9. Analog interleukinu 5 podle kteréhokoliv z nároků 2 až 8, v němž cizorodý T_H epitop je promiskuitní.
10. Analog interleukinu 5 podle nároku 9, v němž alespoň jeden cizorodý T_H je vybrán ze skupiny, kterou tvoří přírodní promiskuitní T_H epitop a syntetická sekvence vazebného peptidu MHC-II.
11. Analog interleukinu 5 podle nároku 10, v němž přírodní T_Hepitop je vybrán ze skupiny, kterou tvoří epitop tetanického toxoidu, jako je P2 nebo P30, epitop difterického toxoidu, epitop hemaglutininu viru chřipky a CS epitop P. falciparum.

• · • ·· ·· ·· ·· ·» · · · · · · · • · · · · ·· · • ··· · · · · · · · • · ···· · · ·

164 ...............
12. Analog interleukinu 5 podle kteréhokoliv z nároků 2 až

11, v němž první skupina je v podstatě specifický vazebný partner pro specifický povrchový antigen B lymfocytů nebo pro specifický povrchový antigen APC, jako je hapten nebo sacharid, pro který je receptor na B lymfocytů nebo APC.
13. Analog interleukinu 5 podle kteréhokoliv z nároků 2 až

12, v němž druhá skupina je vybrána ze skupiny, kterou tvoří cytokin, hormon a protein tepelného šoku.
14. Analog interleukinu 5 podle nároku 13, v němž cytokin je vybrán ze skupiny, kterou tvoří interferon γ (IFN-γ), Flt3L, interleukin 1 (IL-1), interleukin 2 (IL-2), interleukin 4 (IL-4), interleukin 6 (IL-6), interleukin 12 (IL-12), interleukin 13 (IL-13), interleukin 15 (IL-15) a faktor stimulující kolonie granulocytů a makrofágů (GM-CSF) nebo jejich účinné části a protein tepelného šoku je vybrán ze skupiny, kterou tvoří HSP70, HSP90, HSC70, GRP94 a kalretikulin (CRT) nebo jejich účinné části.
15. Analog interleukinu 5 podle kteréhokoliv z nároků 2 až 14, v němž třetí skupina je lipidové povahy, jako je palmitoylová skupina, myristylová skupina, farnesylová skupina, geranyl-geranylová skupina, GPI kotva a Nacyldiglyceridová skupina.
16. Analog interleukinu 5 podle kteréhokoliv z předcházejících nároků,kde modifikace spočívá v tom, že subsekvence IL5 polypeptidu je modifikována v alespoň jedné kličce 1 až 3 nebo v aminokyselinových zbytcích u C-konce helixů D.

165 z

IL5 ·· φφ φφ ·· ·· φφφφ φφφ· φ φ φφ φ φ φ φ φφ φφφ φ · φφφφ φφφ φφ φφ φ φ φφφφ
17. Analog interleukinu předcházejících nároků, kde polypeptid.

IL5 podle polypeptid kteréhokoliv je humánní
18. Analog interleukinu 5 podle nároku 17, v němž humánní IL5 polypeptid byl modifikován substitucí alespoň jedné aminokyselinové sekvence v sekv. id. č. 1 alespoň jednou aminokyselinovou sekvencí stejné nebo odlišné délky, a tím vznikl cizorodý T_H epitop, přičemž substituované aminokyselinové zbytky jsou vybrány ze skupiny, kterou tvoří zbytky 87 až 90, zbytky 88 až 91, zbytky 32 až 43, zbytky 33 až 43, zbytky 59 až 64, zbytky 86 až 91 a zbytky 110 až 113.
19. Imunogenní přípravek vyznačující se tím, že obsahuje imunogenně účinné množství IL5 polypeptidů autologního pro zvíře, přičemž IL5 polypeptid je formulován společně s imunologicky přijatelným adjuvans tak, aby porušil autotoleranci zvířete k IL5 polypeptidů, přičemž přípravek dále obsahuje farmaceuticky a imunologicky přijatelný nosič a/nebo vehikulum, imunogenně účinné množství IL5 analogu podle kteréholiv z nároků 1 až 18, přičemž přípravek dále obsahuje farmaceuticky a imunologicky přijatelný nosič a/nebo vehikulem a volitelně adjuvans.
20. Imunogenní přípravek podle nároku 19 vyznačující se tím, že adjuvans je vybráno ze skupiny, kterou tvoří imunitně cílící adjuvans; imunitně modulující adjuvans, jako je toxin, cytokin a mykobakteriální derivát; olejový přípravek; polymer; adjuvans tvořící micely; saponin; imunostimulační komplexní matrice (ISCOM matrice);

0«