CN1950376B - 莪术醇衍生物、含该衍生物的组合物及所述衍生物的制药用途 - Google Patents

莪术醇衍生物、含该衍生物的组合物及所述衍生物的制药用途 Download PDF

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CN1950376B CN2005800144098A CN200580014409A CN1950376B CN 1950376 B CN1950376 B CN 1950376B CN 2005800144098 A CN2005800144098 A CN 2005800144098A CN 200580014409 A CN200580014409 A CN 200580014409A CN 1950376 B CN1950376 B CN 1950376B
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Abstract

本发明提供了下式具有下式I结构的莪术醇衍生物或其药学上可接受的盐：
Figure 200580014409.8_AB_0
其中，Y选自＝CHR2，-CH2R2，，-OH或-OR1；R1选自H、R、RCO或HO3S；所述的R选自H；饱和的或不饱和的直链C1-10烃基等；R2选自F；Cl；Br；I；H；-OH；-OR；-HSO3等；条件是R1、R2不同时为H。本发明也提供了含有所述衍生物或其药学上可接受的盐的抗肿瘤或抗病毒的药物组合物。本发明进一步提供了所述衍生物或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗肿瘤或抗病毒的药物中的应用。

Description

莪术醇衍生物、含该衍生物的组合物及所述衍生物的制药用途
技术领域
本发明涉及莪术醇衍生物、含该衍生物的组合物及所述衍生物在制备抗肿瘤、抗病毒药物中的应用。
背景技术
莪术为姜科植物蓬莪术、广西莪术或温莪术(温郁金)的根茎。味苦、辛，性温。能行气破血，消积止痛。主治症瘕痞块、淤血经闭、食积胀痛。其挥发性油用于治疗宫颈癌，已经收入1977年中国药典(第463页)。其有效成分为挥发性油，含量为1％-2.5％，油中主要成分为多种倍半萜类：莪术酮、莪术双酮、新郁金二酮、表莪术醇、莪术烯、莪术醇、异莪术醇、原莪术醇、去氢莪术二酮等二十余种化学成分。而莪术醇和莪二酮是莪术油中治疗癌症主要的有效成分。
莪术醇(Curcumol)，也叫姜黄环氧奥醇、姜黄醇。分子式：C15H24O2，分子量：236.34，[CAS]4871-97-0，熔点141-142，具有以下的结构式：
Figure B2005800144098D00011
莪术醇75mg/Kg皮下注射对小鼠肉瘤37、宫颈癌、艾氏腹水癌EAC均有较高的抑制率。肿瘤明显减小者，可见瘤组织周围纤维细胞明显增多，内有一层淋巴细胞，吞噬细胞包围肿瘤细胞等免疫反应出现。
莪术醇不但有明显的抗肿瘤作用，而且还有免疫、升白、抗血栓、抗菌、保肝、防肾衰竭等作用。同时，无明显的毒性，副作用也比较小。
所以，莪术醇是一种十分有用的天然药物，但是也存在着不少的缺陷：
1、水溶性极差，难于制成合适浓度的稳定的药液。
2、瘤体和局部注射时，疼痛较重。推注过快会出现胸闷、面部潮红、呼吸困难等症状。
3、治疗肿瘤的种类有局限性。
4、毒性比较大。
虽然对早期宫颈癌的治疗总有效率达到70％以上，但是，还存在进一步提高药效的可能。
发明内容
本发明的一个目的是提供稳定性、溶解性好，在脂相和水相中的分配系数更佳、抗肿瘤、抗肿瘤的谱更广、药效更好、毒性小的莪术醇衍生物。
本发明的另一个目的是提供含有所述莪术醇衍生物的药物组合物
本发明的再一个目的是提供所述的莪术醇衍生物在制药中的应用。
本发明是通过如下的构思实现的：一种具有下式I结构的莪术醇衍生物或其药学上可接受的盐：
Figure B2005800144098D00021
其中，Y选自＝CHR2，-CH2R2，＝O，
Figure B2005800144098D00022
-OH或-OR1；
R1选自H、R、RCO或HO3S；
所述的R选自H；饱和的或不饱和的直链C1-10烃基；饱和的或不饱和的带支链的C3-10烃基，或C3-10烃醚，C3-10烃硫醚；饱和的或不饱和的、任选地被一个或多个选自硝基、磺酸基、卤原子和羟基的取代基所取代的C3-8环烃基或C6 -12芳烃基；
Y1NY2、Y1CONY2，其中Y1为H或C1-8，Y2为C1-8；
选自：的杂环，其中P为S，O或N，Z为一个或多个选自H、羟基，饱和的或不饱和的直链C1-6烃基、饱和的或不饱和的带支链的C3-6烃基，n＝1-3；或者
R1为咖啡酸、藤黄酸、异藤黄酸、新藤黄酸或甘草酸的酰基；
R2选自F；Cl；Br；I；H；-OH；-OR；-HSO3；-NO3；RNH-；R’NR”，其中R’和R”可相同或不同，各自选自如所述R所限定的基团；H2NRNH-；
或者R2为选自吡啶基、吡咯基、咪唑基、三氮唑基、四唑基、二噁唑基、二噁二唑基、哌啶基、
条件是R1、R2不同时为H，
当Y为-OH或-OR1时，Y…为单键，
当Y为-CHR2时，所述的衍生物具有通式II：
其中R1，R2的定义同上，
R3选自F；Cl；Br；I；H；-OH；-HSO3；-NO3；-RNH；R’NR”，其中R’和R”可相同或不同，各自选自如所述R所限定的基团；H2NRNH-；
或者R2为选自吡啶基、吡咯基、咪唑基、三氮唑基、四唑基、二噁唑基、二噁二唑基、哌啶基、
在优选的技术方案中，所述的芳烃基优选地选自Ar-、ArCH2-、ArCH2CH2-、CH3ArCH2CH2-，Ar-为苯基，或是被F、Cl、Br、I、硝基、磺酸基或1-3个羟基取代的苯基。当Y为＝CHR2时，R2宜为H；R1宜为HO3S、丙酰基、丁酰基、异丁酰基或苯甲酰基。
在另一个优选的实施方案中，当Y为＝CHR2时，R2为H，R1为HO3S或NaO3S。
最好的莪术醇衍生物或其药学上可接受的盐选自下列化合物：
Figure B2005800144098D00034
Figure B2005800144098D00041
Figure B2005800144098D00051
或者，所述的衍生物或其药学上可接受的盐有下式结构：
Figure B2005800144098D00052
式中各基团的定义如下：
或者，所述的衍生物或其药学上可接受的盐有下式结构：
式中各基团的定义如下：
在本发明的另一个最佳实施方案中，最好的莪术醇衍生物或其药学上可接受的盐选自下列化合物：
Figure B2005800144098D00063
Figure B2005800144098D00071
本发明也提供了一种抗肿瘤或抗病毒的药物组合物，它包含药物有效量的如上所述的莪术醇衍生物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的赋形剂和/或添加剂。
本发明进一步提供了如上所述的莪术醇衍生物或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用。
本发明也提供了如上所述的莪术醇衍生物或其药学上可接受的盐在制备抗病毒药物中的应用，其中所述的病毒选自HIV病毒、流感病毒、肝炎病毒和疱疹病毒。
莪术醇是莪术油中含量比较多的一个组分，对市售的莪术油经过分离提纯后得到纯度比较高(可以达到75％以上，需要时可以达到99％以上)的莪术醇，这种较高纯度的莪术醇用作对其进行结构修饰的反应原料。下面将分类介绍莪术醇衍生物的一般制备方法：
莪术醇的加氢物的制备
将莪术醇溶解于适当的有机溶剂(如甲醇等)中，加入少量的加氢催化剂(钯碳等)，在室温常压强烈搅拌下通入氢气。就可以得到莪术醇8、12位碳碳双键被氢加成了的莪术醇的衍生物。
莪术醇(6C上的羟基)酯化物的制备
莪术醇6C上存在羟基，所以它就具有一般醇的通性，能够以通常的方法来制备莪术醇的酯：如以莪术醇为起始原料，溶解于适当的有机溶剂(如异丙醚、DMF、二氧六环，、甲苯、二氯甲烷、氯仿、乙酸等)中，与羧酸在催化剂(对甲苯磺酸、二甲胺磺酰氯与二甲胺与DMAP复合、二苯胺与DPAT复合、DMAP与DPC复合、有机钛，对甲苯磺酸等)存在下反应；与酰氯在缚酸剂(如吡啶、三乙胺等)的存在下反应；酸酐回流反应，都能生成相应的莪术醇酯，然后，经过分离、纯化处理，得到纯度较高的莪术醇酯。除非另作说明，下列流程中“r.t.”代表“室温”，“reflux”代表“回流”，“or”代表或，“hr”代表“小时”。
1、莪术醇与酰氯的酯化
莪术醇溶解于氯仿中与等摩尔或过量的酰氯在缚酸剂过量的三乙胺存在下，在常温或回流数小时，即可以得到相应的莪术醇酯(下式中R的限定同上)：
Figure B2005800144098D00081
2、莪术醇与酸酐的酯化
莪术醇溶解于羧酸中(一般为乙酸)中与过量的酸酐，回流数小时，即可以得到相应于酸酐的莪术醇酯(下式中R的限定同上)：
Figure B2005800144098D00082
3、莪术醇在有机钛试剂催化剂与有机酸的酯化
莪术醇溶解于二氯甲烷中，在有机钛试剂作催化剂及三甲基氯硅烷为辅助催化剂作用下，等当量的酸酐作脱水剂，几乎等摩尔的羧酸和莪术醇在室温下就可以高收率地生成莪术醇相应的酯(下式中R1为R，R的限定同上，R2OH为莪术醇)：
Figure B2005800144098D00083
4、莪术醇在DMAP与DPC催化下与有机酸的酯化
莪术醇溶解于二氧六环中，与略为过量的羧酸，在DMAP与DPC催化下，70反应约100小时，就可以高收率地生成莪术醇相应的酯(下式中R的限定同上)：
Figure B2005800144098D00091
5、莪术醇在对甲苯磺酸催化下与有机酸的酯化
莪术醇溶解于甲苯中，与过量的羧酸，在对甲苯磺酸催化下，回流分水反应，生成莪术醇相应的酯(下式中R的限定同上)：
Figure B2005800144098D00092
6、莪术醇溶解于适当的有机溶剂(DMF、乙酸乙酯或吡啶等)中，与氯化亚砜反应，经过处理后，再用碱性溶液处理，得到莪术醇的硫酸酯：
Figure B2005800144098D00093
相似的，以上述制备得到的莪术醇的加氢衍生物为原料，同样能进行上述1-6的反应，制备获得相应的莪术醇氢化物的酯。
莪术醇(6C上的羟基)醚化物的制备
莪术醇6C上存在羟基，所以它也就具有一般醇的通性，莪术醇溶于适当的有机溶剂中(如异丙醚、DMF、二氧六环，、甲苯、二氯甲烷、氯仿)能够与硫酸二酯(ROSO2OR)或与碘烷(RI)在碱性的溶液中反应生成相应的醚，然后，经过分离、纯化处理，得到纯度较高的莪术醇醚。
1、莪术醇溶解于异丙醚和二氯甲烷中(下式中R的限定同上)：
Figure B2005800144098D00101
2、莪术醇溶解于异丙醚和二氯甲烷中与碘烷反应(下式中R的限定同上)：
Figure B2005800144098D00102
相似的，以上述制备得到的莪术醇的加氢衍生物为原料，同样能进行上述1-2的反应，制备获得相应的莪术醇氢化物的醚。
莪术醇8C与12C之间存在着双键，它和其它的烯烃化合物一样具有被加成和被氧化的性质。它极易与卤素、卤化氢起加成反应，生成莪术醇的双卤化物、单卤化物；也能被氢、氢化锂铝等还原，生成莪术醇的氢化物，同时也能够被烷基环氧化合物所加成，生成莪术醇的环氧化合物；还可以被高锰酸钾等氧化剂氧化，生成莪术醇的氧化物、双羟基化合物。
经过上述反应得到的莪术醇的卤化物上的卤原子在适当的有机溶剂中，在室温时就极易被RNH、-R’NR”(R’、R”为R，可以不相同)、H2NRNH-，其中R的限定如上所定义，或为杂原子环基团，如吡啶、吡咯、咪唑、三氮唑、四唑、二噁唑、二噁二唑、哌啶(只要分子中含有氮氢键：
Figure B2005800144098D00103
)或其简单的衍生物、
Figure B2005800144098D00111
(邻、间或对位)(其中R的限定如上所定义或为H)取代而生成相应的胺类衍生物。
1、莪术醇与卤素加成物的制备
莪术醇溶解于适当的有机溶剂(如氯仿、甲醇等)中，在室温或低于0℃时，就极易与卤素(X2，X为Cl2、Br2、I2，最佳为Br2)发生加成反应，生成在8C、12C各加一个卤原子的莪术醇的衍生物。
Figure B2005800144098D00112
制备得到的双卤化物，在无水的有机溶剂中，碱性时很容易脱去一个卤化氢，而得到使8C与12C之间的双键得以恢复的单卤化物
Figure B2005800144098D00113
也可以以上述制备得到的莪术醇(6C上的羟基)酯化物、莪术醇的(6C上的羟基)醚化物(R的限定同上，但是不包括带有双键的烯烃类)为起始原料，溶解于适当的有机溶剂(如氯仿、甲醇等)中，在室温或低于0℃时，与卤素发生加成反应，生成在8C、12C各加一个卤原子的莪术醇相应衍生物。相似的制备得到的双卤化物，在无水的有机溶剂中，碱性时很容易脱去一个卤化氢，而得到使8C与12C之间的双键得以恢复的单卤化物：
莪术醇醚衍生物的卤化及卤化氢的脱除：
莪术醇酯化衍生物的卤化及卤化氢的脱除：
Figure B2005800144098D00122
莪术醇硫酸酯衍生物的卤化及卤化氢的脱除：
莪术醇与卤化氢的加成方法与莪术醇与卤素的加成方法相同，只是8C加上一个H，12C加上一个X。
将上述制备得到的溴化物或氯化物溶解在无水甲醇中，加入氟化物(例如NH4F、NaF)室温下反应，就可以得到相应的莪术醇的氟取代物。
R含有双键的莪术醇酯的卤化物的制备方法为：先以莪术醇的卤化物为原料，然后以上述莪术醇酯化的方法来获得。
莪术醇卤化物中卤原子置换产物的制备
将上述制备得到的衍生物(或莪术醇)卤化物(单卤化物或双卤化物)中的一种(主要为溴化物)溶解于适当的无水有机溶剂(乙腈、四氢呋喃等)中，加入干燥过量(一般2-3.5倍摩尔量)的胺类R2-H(在此R2为胺类，包括含氮杂环)在室温下反应3小时以上，产物经过硅胶柱分离；或者经过重结晶来提纯，得到相应的莪术醇胺类衍生物或其盐(R1、R2的限定同上)。
单卤化物(8C与12C之间为双键)的胺化(R1、R2的限定同上)：
Figure B2005800144098D00132
单卤化物(8C与12C之间为单键)的胺化(R1、R2的限定同上)：
Figure B2005800144098D00141
双卤化物的胺化，双卤化物的胺化得到的大部分的是8C与12C恢复了双键的单胺化衍生物(式II)和少量的双胺化物(式III)(R1、R2的限定同上)：
Figure B2005800144098D00142
莪术醇(或上述制备得到的莪术醇衍生物)的单卤化物(8C与12C含双键或单键)溶解于适当的有机溶剂(甲醇、乙醇、丙酮等)，室温与氢氧化钠的水溶液置换反应，其中的卤原子被羟基所取代(R1的限定同上)：
Figure B2005800144098D00143
上述反应得到的12C增加了一个羟基的莪术醇酯衍生物，12C的羟基也能发生酯化和醚化反应，得到相应的莪术醇的衍生物(R1的限定同上)：
Figure B2005800144098D00144
莪术醇的卤化物(主要为溴化物)溶解于适当的溶剂(甲醇水溶液50％-95％等)中，与硝酸银溶液反应，就可以制备得到莪术醇相应的硝酸酯衍生物。
莪术醇中双键被氧化的衍生物的制备
莪术醇在适当的有机溶剂中(丙酮、乙酸、丙酸等)，8C与12C之间的双键很容易被高锰酸钾、双氧水等氧化试剂所氧化而生成莪术醇的双羟基衍生物或莪术醇的酮衍生物。
莪术醇在等摩尔高锰酸钾和中性到碱性的丙酮溶液中氧化，生成莪术醇的双羟基衍生物：
Figure B2005800144098D00151
莪术醇在过量的高锰酸钾乙酸溶液中氧化，生成莪术醇酮衍生物：
Figure B2005800144098D00152
在本反应中生成的衍生物也能酯化和醚化，得到相应的酯或醚。
莪术醇环氧衍生物的制备
将莪术醇溶解于适当的有机溶剂(氯仿、二氯甲烷等)中，在室温下加入间氯过氧苯甲酸反应，然后用5％的氢氧化钠溶液洗涤几次，用无水硫酸钠干燥，真空脱除有机溶剂。再经过硅胶柱分离，得到通式(III)中Z为
Figure B2005800144098D00153
的化合物。
此化合物在微酸性溶液中打开氧环，从而得到通式()中R2为OH、R3为H的化合物。而开环后的化合物，经过酯化(或烷基化)反应(采用方法一莪术醇6C上的羟基酯化、方法二的烷基化反应)即可以得到通式(II)中R3为H，R2为OR1的化合物(其中R1的限定如上所定义)。
附图简述
图1显示了对本发明化合物和莪术醇进行测定，得到的乙型肝炎病毒e抗原样品OD450测定值。
图2显示了对本发明化合物和莪术醇进行测定，得到的与阳性对照相比较，样品HBeAg的降低百分率
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详尽阐述。
制备实施例一莪术醇(6C上的羟基)酯化物的制备
(1)2.48克(95％，0.01摩尔)莪术醇溶解于50毫升氯仿中，加入少量的无水硫酸镁搅拌3小时，过滤除去硫酸镁，再加入少量三乙胺后，在室温下滴加乙酰氯1.06克(98％，0.11摩尔)放置反应24小时。然后倾入碎冰中，用冷水洗涤氯仿溶液直到中性，水相弃之。有机相用无水硫酸镁干燥，真空脱除氯仿。得到淡黄色的产物，以95∶5的60-90石油谜：乙酸乙酯以及200-300目的硅胶柱子分离后得到母体上的羟基被酯化的乙酸酯莪术醇。即式()中的R1为CH3CO的衍生物(1号化合物)1.55克无色至白色的油状物。收率：58％，HPLC：99.5％。
采用美国ThermoFinnigam公司FlashEA1112型元素分析仪分析发现：C73.554％，H 9.308％；分子式(C17H26O3)计算：C 73.344％，H 9.414％。
Finnigan MAT8430质谱仪分析得出产物的分子量为278。
采用BrukerACF-300型核磁共振仪，以CDCl3为溶剂检测，图谱显示有17个碳信号，26个质子信号。
这确证得到的产物是1号化合物。
(2)将2.48克(95％，0.01摩尔)莪术醇溶解于50毫升二氧六环中，加入少量的无水硫酸镁搅拌3小时，过滤除去硫酸镁，加入适量的DMAP与DPC，再加入0.91克CH3CH2COOH(98％，0.012摩尔)在70反应100小时，然后将反应物倾入冰水中，用乙醚或乙酸乙酯等溶剂多次提取此倾析物中的目标产物，弃水相，合并有机相，并无硫酸镁干燥后除去有机溶剂，得到的粗品用硅胶柱分离，得到纯度较高莪术醇丙酸酯无色油状物2.15克。即式(III)中的R1为CH3CH2CO的衍生物，收率82.1％。HPLC：98.8％。
Finnigan MAT8430质谱仪分析得出产物的分子量为292。
采用BrukerACF-300型核磁共振仪，以CDCl3为溶剂检测，图谱显示有18个碳信号，28个质子信号。
(3)将2.48克(95％，0.01摩尔)莪术醇溶解于30毫升乙酐中，加热回流数小时，然后将反应物冷却倾入冰水中，用氢氧化钠溶液中和过量的乙酐，调节水溶液的PH值到7-8，用乙醚或乙酸乙酯等溶剂多次提取倾析物中的目标产物，弃水相，合并有机相，并无硫酸镁干燥后除去有机溶剂，得到的粗品用硅胶柱分离，得到纯度较高莪术醇丙酸酯淡黄色油状物1.8克。即1号化合物，收率64％。HPLC：99.1％。
(4)将2.48克(95％，0.01摩尔)莪术醇溶解于50毫升氯仿中，加入对甲基苯甲酰氯1.9克(97％，0.012摩尔)和5毫升吡啶，加热回流数小时，然后将反应物冷却后倾入冰水中，用乙醚或乙酸乙酯等溶剂多次提取倾析物中的目标产物，弃水相，合并有机相，并无硫酸镁干燥后除去有机溶剂，得到的粗品用硅胶柱分离，得到纯度较高莪术醇对甲基苯甲酸酯白色的油状物2.3克。即通式()中的R1为CH3ArCO的衍生物(如下式XV所示)，收率64.7％。HPLC：99.5％。Finnigan MAT8430质谱仪分析得出产物的分子量为354。
采用BrukerACF-300型核磁共振仪，以CDCl3为溶剂检测，图谱显示有23个碳信号，30个质子信号。
Figure B2005800144098D00171
(5)将1克莪术醇溶解于30毫升的DMF中，再取2毫升氯化亚砜溶解于10毫升DMF中。将氯化亚砜滴加到莪术醇溶液中，控制反应液温度在20-25℃，保持反应3小时。然后将反应物倾入100毫升水中，水解2小时，用60毫升乙醚提取，得到油状的莪术醇硫酸酯，再经过硅胶柱分离得到0.87克产物，HPLC：98.5％。将其溶解于5毫升甲醇，用1N氢氧化钠溶液调节使PH为8。蒸干，残余物用乙酸乙酯处理。得到棕黄色粉末，莪术醇硫酸酯钠盐。此盐易溶于水。即得到通式(III)中的R1为HO3S或NaO3S的衍生物(20号化合物或21号化合物)。
将NaO3S衍生物检测：
以CDCl3为溶剂，磁共振仪检测，图谱显示有15个碳信号，23个质子信号。
质谱仪分析得出产物的分子量为354。
制备实施例二莪术醇(6C上的羟基)烷基化物的制备
在一个带有搅拌、0-50温度计和25毫升恒压滴液漏斗的100毫升三口烧瓶中，加入莪术醇2.45克(0.01摩尔，96％)，异丙醚60毫升，二氯甲烷5毫升，搅拌完全溶解后，加入少量的无水硫酸镁搅拌3小时，过滤除去硫酸镁。取1.55克硫酸二甲酯(0.012摩尔)溶解于加有10毫升干燥过的异丙醚的恒压滴液漏斗中，开启搅拌，控制溶液温度在35，缓慢地滴加硫酸二甲酯溶液。滴加完成后，滴加氢氧化钠溶液(0.025摩尔)继续搅拌反应12小时以上。然后将反应物倾入60克冰水中，用乙醚70毫升分三次提取(30、30、10毫升)，合并乙醚溶液。用水洗涤乙醚，直至中性，再用无水硫酸镁干燥乙醚溶液，过滤除去硫酸钠，室温真空脱除乙醚得到深褐色的固体，用1∶50-100倍200-300目的硅胶，以石油醚∶乙酸乙酯＝95∶5为洗脱液，得到含量：99.2％(HPLC)的6C上的羟基被甲氧基化了的莪术醇衍生物(即通式III中R1为CH3-，R2为H的化合物)1.9克。收率：76％，MP：71-73。
元素分析发现：C 76.935％，H 10.296％。
分子式(C16H26O2)计算：C 76.752％，H 10.467％。
以CDCl3为溶剂，磁共振仪检测，图谱显示有16个碳信号，26个质子信号。
质谱仪分析得出产物的分子量为250。
这说明得到的反应产物就是我们需要的目标物，即6C转化为甲氧基的莪术醇甲醚衍生物。结构式如下
莪术醇甲醚衍生物                   莪术醇硫酸酯钠盐
制备实施例三莪术醇与卤素加成物的制备
(1)将莪术醇2.45克(0.01摩尔，96％)溶解于45毫升甲醇中，加入少量的无水硫酸镁干燥后，过滤除去硫酸镁。保持反应物料在5-10℃和较好的搅拌下缓慢地向莪术醇的甲醇溶液中滴加干燥的液溴0.61毫升(3.15克/毫升，0.012摩尔)。加完溴素后继续搅拌反应5-30分钟，直到溶液基本退色，真空除去甲醇后，得到粗的莪术醇溴化物，可以直接用于实施例六。或将此淡黄色的粗品经过硅胶柱的分离得到比较纯的目标产物，接近无色的很稠的油状物2.81克。收率71％，HPLC：99.2％。即得到式II中R1为H，R2、R3都为溴原子的莪术醇的双溴化物(30号化合物)。
元素分析发现：C 45.630％，H 6.028％。
分子式(C15H24O2Br2)计算：C 45.477％，H 6.107％。
以CDCl3为溶剂，磁共振仪检测，图谱显示有15个碳信号，24个质子信号。
质谱仪分析得出产物的分子量为396。
这说明得到的反应产物就是我们需要的目标物，第30号化合物。
(2)将步骤(1)得到的双溴化物2克(0.005摩尔)溶解于40毫升无水甲醇中，加入少量的无水硫酸镁搅拌干燥过滤除去硫酸镁后，加入干燥过的含氢氧化钠0.21克(95％，0.005摩尔)的甲醇溶液。在室温下放置反应12小时以上，然后将深色的反应物倒入水中，用乙醚分多次提取，用水洗涤乙醚，直到洗液PH值为7左右，无水硫酸镁干燥乙醚后，真空除去溶剂，得到颜色较深的粘稠物，经过硅胶柱分离，可以得到8与12位碳碳原子间脱除了一个溴化氢而形成了双键的莪术醇衍生物。得到了莪术醇的单溴代衍生物(第34号化合物)0.83克，收率53％，HPLC：98.2％，淡黄色油状物(式XI)。R1为H、R2为Br。
元素分析发现：C 57.214％，H 7.650％。
分子式(C15H24O2Br)计算：C 56.967％，H 7.649％。
以CDCl3为溶剂，磁共振仪检测，图谱显示有15个碳信号，24个质子信号。
质谱仪分析得出产物的分子量为316。
这确证得到的反应产物就是第34号化合物。
制备实施例四莪术醇与氢卤酸加成物的制备
将莪术醇2.45克(0.01摩尔，96％)溶解于45毫升甲醇中，加入少量的无水硫酸镁搅干燥后，过滤除去硫酸镁，保持反应物料在5-10℃和较好的搅拌下缓慢地向莪术醇的甲醇溶液中导入干燥的过量的溴化氢(加入溴化氢的摩尔数为莪术醇的1.2倍左右)，加完后继续搅拌反应物1小时左右，得到粗的莪术醇深褐色的一溴化物，将此粗品经过硅胶柱的分离得到比较纯的目标产物莪术醇单溴化物，即得到通式(II)中R3为溴原子R2为H的莪术醇单卤化物(第34号化合物)。
元素分析发现：C 57.965％，H 7.582％。
分子式(C15H25O2Br)计算：C 56.786％，H 7.943％。
以CDCl3为溶剂，磁共振仪检测，图谱显示有15个碳信号，25个质子信号。
质谱仪分析得出产物的分子量为317。
这说明得到的反应产物就是我们需要的目标物。
将上述制备得到的溴化物或氯化物溶解在无水甲醇中，加入氟化物(例如NH4F、NaF)室温下反应，就可以得到相应的莪术醇的氟取代物。
制备实施例五、莪术醇加氢物的制备
(1)将莪术醇2.45克(0.01摩尔，96％)溶解于45毫升甲醇中，加入少量的无水硫酸镁搅拌干燥后过滤除去硫酸镁，加入少量的加氢催化剂(钯碳等)，在室温常压强烈搅拌下通入氢气。通氢反应维持24小时以上，结束加氢反应后，过滤回收钯碳。将滤液室温下真空除去溶剂甲醇，得到淡黄色的油状物，经过硅胶柱分离，即可以得到莪术醇8-12位碳碳双键被氢加成了的接近无色粉末化合物(莪术醇的二氢衍生物)，1.9克，HPLC：98.1％，熔点：75-77℃，即得到通式(II)中R1为H，R2、R3都为H的莪术醇的二氢衍生物(第33号化合物)。
元素分析发现：C 75.832％，H 10.856％。
分子式(C15H26O2)计算：C 75.581％，H 10.994％。
以CDCl3为溶剂，磁共振仪检测，图谱显示有15个碳信号，26个质子信号。
质谱仪分析得出产物的分子量为238。这说明得到的反应产物就是我们需要的目标物。
(2)莪术醇1克(96％，0.004摩尔)溶解于50毫升的无水乙醚中，在常温下，向反应液中滴加氢化铝锂(约0.005摩尔)，加完后继续搅拌3小时，真空除去乙醚，得到淡黄色的粉末，柱子分离，得到白色粉末0.58克，收率61％，HPLC：98％、熔点：78-80℃。即得到通式(II)中R2、R3都为H的莪术醇衍生物(第33号化合物)。
元素分析发现：C 75.832％，H 10.856％。
分子式(C15H26O2)计算：C 75.581％，H 10.994％。
以CDCl3为溶剂，磁共振仪检测，图谱显示有15个碳信号，26个质子信号。
质谱仪分析得出产物的分子量为238。
这说明得到的反应产物就是我们需要的目标物莪术醇的二氢衍生物(第33号化合物)。
制备实施例六莪术醇卤化物中卤原子置换产物的制备
(1)将制备实施例三(1)制备得到的莪术醇溴化物6.0克(66％，0.01摩尔)溶解于80毫升乙腈中，加入少量的无水硫酸镁搅拌干燥三小时后，过滤除去硫酸镁，加入干燥过的正丁胺2.6克(98％，0.033摩尔)在室温下放置24小时以上，室温真空除去溶剂。将此浅黄色的混合物用50毫升水和60毫升乙酸乙酯溶解置于梨形分液漏斗中，用氨水等碱液调节溶液的PH值大于9，充分摇动，水层再用10毫升乙酸乙酯提一次。合并乙酸乙酯，用水洗(20毫升*4)，加水40毫升，用盐酸调节溶液的PH值小于7，充分摇动，最佳为3，弃乙酸乙酯。酸性的水溶液用20毫升的乙醚分3次洗涤，弃乙醚。新的乙酸乙酯60毫升与水相混合，调节PH值大于9，充分摇动，水层再用10毫升乙酸乙酯提一次。乙酸乙酯合并后用水洗(20毫升*4)，然后用无水硫酸镁干燥，常温下真空除去乙酸乙酯，得到淡色的晶体3.2克。经过硅胶柱分离得到相应的莪术醇正丁胺化合物，(或者用丙酮重结晶)得到无色颗粒晶体2.2克。收率71.66％，HPLC：99.8％。熔点：104-106℃。即得到通式(III)中R1为H，R2为CH3CH2CH2CH2NH的衍生物(第13号化合物)。
元素分析发现：C 74.402％，H 10.650％，N 4.62％。
分子式(C19H33O2N)计算：C 74.267％，H 10.749％，N 4.56％。
以CDCl3为溶剂，磁共振仪检测，图谱显示有19个碳信号，33个质子信号。
质谱仪分析得出产物的分子量为307。
这说明得到的反应产物就是第13号化合物。
将上述制备得到的莪术醇正丁胺衍生物溶解于丙酮中，在20-30℃时，搅拌下滴加浓盐酸(或通入HCL气体)，使溶液的PH值为6-7，溶液中迅速就有白色的莪术醇正丁胺衍生物盐酸盐固体析出，过滤洗涤并干燥，即得到高纯度的莪术醇正丁胺衍生物盐酸盐晶体(第14号化合物)。HPLC：99.95％，熔点：127-129℃。
(2)将实施例三(1)制备得到的莪术醇溴化物6.0克(66％，0.01摩尔)溶解于80毫升乙腈中，加入少量的无水硫酸镁搅拌干燥三小时后，过滤除去硫酸镁，加入干燥过的叔丁胺2.6克(98％，0.033摩尔)在室温下放置24小时以上，室温真空除去溶剂。将此浅黄色的混合物用50毫升水和60毫升乙酸乙酯溶解置于梨形分液漏斗中，用氨水等碱液调节溶液的PH值大于9，充分摇动，水层再用10毫升乙酸乙酯提一次。合并乙酸乙酯，用水洗(20毫升*4)，加水40毫升，用盐酸调节溶液的PH值小于7，充分摇动，最佳为3，弃乙酸乙酯。酸性的水溶液用20毫升的乙醚分3次洗涤，弃乙醚。新的乙酸乙酯60毫升与水相混合，调节PH值大于9，充分摇动，水层再用10毫升乙酸乙酯提一次。乙酸乙酯合并后用水洗(20毫升×4)，然后用无水硫酸镁干燥，常温下真空除去乙酸乙酯，得到淡色的晶体3.0克。经过硅胶柱分离得到相应的莪术醇叔丁胺衍生物，无色固体2.0克(第15号化合物)。收率65.4％，HPLC：98.8％。
熔点：79-80℃。即得到通式(III)中R1为H，R2为(CH3)3CNH-的衍生物。
以CDCl3为溶剂，磁共振仪检测，图谱显示有19个碳信号，33个质子信号。
质谱仪分析得出产物的分子量为307。
这说明得到的反应产物就是我们需要的目标物。结构式如下：
Figure B2005800144098D00221
莪术醇叔丁胺衍生物                      莪术醇叔丁胺衍生物盐酸盐
将上述制备得到的莪术醇叔丁胺衍生物溶解于丙酮中，在20-30℃时，搅拌下滴加浓盐酸(或通入HCL气体)，使溶液的PH值为6-7，蒸干丙酮析出白色的莪术醇叔丁胺衍生物盐酸盐粉末固体(第16号化合物)，结构式如上。HPLC：99.95％，熔点：115-116℃。
(3)将实施例三(1)制备得到的莪术醇溴化物6.0克(66％，0.01摩尔)溶解于80毫升乙腈中，加入少量的无水硫酸镁搅拌干燥三小时后，过滤除去硫酸镁，加入对羟基苯胺3.34克(98％，0.03摩尔)在室温下放置24小时以上，室温真空除去溶剂。将此深色的混合物用50毫升水和100毫升乙酸乙酯溶解置于梨形分液漏斗中，用氨水等碱液调节溶液的PH值大于9，充分摇动，水层再用10毫升乙酸乙酯提一次。合并乙酸乙酯，用PH值8-9的水洗(20毫升*4)，然后加水40毫升，用盐酸调节溶液的PH值小于7，充分摇动，最佳为3，弃乙酸乙酯。酸性的水溶液用20毫升的乙醚分3次洗涤，弃乙醚。新的乙酸乙酯100毫升与酸性水相混合，调节PH值大于8-9，充分摇动，水层再用10毫升乙酸乙酯提一次。乙酸乙酯合并后用水洗(20毫升*4)，有机相然后用无水硫酸镁干燥，常温下真空除去乙酸乙酯，得到淡黄色的固体3.8克。经过硅胶柱分离得到相应的莪术醇的对羟苯胺化合物(或者经过重结晶)，得到白色晶体2.3克。收率67.1％，HPLC：99.2％。熔点：108-110℃。即得到通式(III)中R1为H，R2为HOArNH-的衍生物(第5号化合物)。结构式如下：
莪术醇的对羟苯胺衍生物                  莪术醇对羟苯胺盐酸盐
将上述制备得到的莪术醇对羟基苯胺衍生物溶解于丙酮中，在40-50℃时，搅拌下滴加浓盐酸(或通入HCL气体)，使溶液的PH值为5-6，放置后析出淡黄色的莪术醇胺化物盐酸盐晶体。将此晶体在水中用活性炭脱色重结晶，即得到类白色的高纯度的莪术醇对羟苯胺盐酸盐晶体(第6号化合物，结构式如上)，HPLC：99.89％，熔点：147.5-149.5℃。将此盐酸盐检测：
以CDCl3为溶剂，磁共振仪检测，图谱显示有21个碳信号，30个质子信号。
质谱仪分析得出产物的分子量为379.5。
这说明得到的反应产物就是我们需要的目标物。
(4)将实施例三(1)制备得到的莪术醇溴化物6.0克(66％，0.01摩尔)溶解于80毫升乙腈中，加入少量的无水硫酸镁搅拌干燥三小时后，过滤除去硫酸镁，加入对无水哌嗪2.90克(98％，0.031摩尔)在室温下放置24小时以上，室温真空除去溶剂。将此淡黄色的混合物用50毫升水和100毫升乙酸乙酯溶解置于梨形分液漏斗中，充分摇动，水层再用10毫升乙酸乙酯提一次。合并乙酸乙酯，用水洗(20毫升*4)，然后加水40毫升，用盐酸调节溶液的PH值为3，弃乙酸乙酯。酸性的水溶液用20毫升的乙醚分3次洗涤，弃乙醚。新的乙酸乙酯100毫升与酸性水相混合，调节PH值大于9，充分摇动，水层用10毫升乙酸乙酯再提一次。乙酸乙酯合并后用水洗(20毫升*4)，有机相然后用无水硫酸镁干燥，常温下真空除去乙酸乙酯，得到白色的固体3.1克。经过硅胶柱分离得到相应的莪术醇的哌嗪衍生物(或者经过重结晶)，得到白色晶体2.3克。收率71.8％，HPLC：99.2％。熔点：128-130℃。即得到通式(III)中R1为H，R2为的衍生物(第7号化合物)。
以CDCl3为溶剂，磁共振仪检测，图谱显示有19个碳信号，32个质子信号。
质谱仪分析得出产物的分子量为320。
这确证得到的反应产物是第7号化合物。
将上述制备得到的莪术醇哌嗪衍生物溶解于丙酮中，在40-50℃时，搅拌下滴加浓盐酸(或通入HCL气体)，使溶液的PH值为5-6，放置后析出白色的莪术醇胺化物盐酸盐晶体。将此晶体在水中用活性炭脱色重结晶，即得到类白色的高纯度的莪术醇哌嗪盐酸盐晶体(第8号化合物)，HPLC：99.89％，熔点：150-152℃。
相似地，采用上述方法，用乙胺与莪术醇的双卤化物反应，得到米色的粉末晶体，莪术醇乙胺衍生物，即得到通式(III)中R1为H，R2为CH3CH2NH的衍生物，熔点：92--94℃。收率：76％。
(5)将实施例三(1)制备得到的莪术醇溴化物6.0克(66％，0.01摩尔)溶解于40毫升的甲醇水溶液(甲醇∶水＝90∶10)中。在室温下，10小时内滴加30％的氢氧化钠水溶液1.5克，再放置反应24小时以上，调节溶液的PH到中性，加入40毫升水，用50毫升乙酸乙酯多次提取，合并乙醚用水洗涤多次。然后用少量的无水硫酸钠干燥，真空除去溶剂，得到深褐色的粘稠的油状物1.4克，经过硅胶柱的分离，得到莪术醇的二羟基衍生物，浅色晶体0.87克，收率；65％，熔点：163-165℃，HPLC：98.3％。即得到通式(II)中R3、R2为OH的化合物(第32号化合物，莪术醇双羟基化合物)。
元素分析发现：C 66.873％，H 9.458％。
分子式(C15H26O4)计算：C 66.636％，H 9.693％。
以CDCl3为溶剂，磁共振仪检测，图谱显示有15个碳信号，26个质子信号。
质谱仪分析得出产物的分子量为270。
这说明得到的反应产物就是我们需要的目标物。结构式如下：
Figure B2005800144098D00251
莪术醇双羟基化合物                   莪术醇的双硝酸酯衍生物
(6)将实施例三(1)制备得到的莪术醇溴化物6.0克(66％，0.01摩尔)溶解于60毫升甲醇中，向此溶液中滴加含有3.6克(99％、0.02摩尔)硝酸银10毫升的水溶液，常温下放置过夜，就有大量的类白色絮状沉淀析出，加60毫升水和乙醚(1∶1)，分两次提取，水相回收溴化银，乙醚相用40毫升分两次洗涤，用无水硫酸钠干燥，真空除去溶剂，就可以得到莪术醇的双硝酸酯衍生物，即分别得到通式()R3、R2被NO3置换了的系列衍生物。结构式如上(第31号化合物，莪术醇的双硝酸酯衍生物)。
制备实施例七莪术醇中双键被氧化的衍生物的制备
(1)、将莪术醇2.45克(0.01摩尔，96％)溶解于40毫升乙腈中，用溶解了1.6克高锰酸钾(98％，0.01摩尔)的水溶液，在常温下放置，直到溶液的紫红色完全褪去，然后真空除去乙腈，用1∶1的乙酸乙酯-水100毫升提取，弃水相，乙酸乙酯用水洗涤两次，然后用无水硫酸钠干燥，除去溶剂后得到深色的固体，经过硅胶柱分离得到类白色晶体2.1克，收率，77.7％，熔点：163-165℃，HPLC：98.8％。即得到通式(II)中R1为H、R2、R3为OH的化合物(莪术醇双羟基化合物)，此类化合物在水中溶解度较大。
元素分析发现：C 66.873％，H 9.458％。
分子式(C15H26O4)计算：C 66.636％，H 9.693％。
以CDCl3为溶剂，磁共振仪检测，图谱显示有15个碳信号，26个质子信号。
质谱仪分析得出产物的分子量为270。
这说明得到的反应产物就是我们需要的目标物。
得到的莪术醇双羟基衍生物经过烷基化、或酯化得到通式(II)中R5、R6都为R1O的莪术醇衍生物，R1的限定如上所定义。
(2)将莪术醇2.45克(0.01摩尔，96％)溶解40毫升乙酸中，加入溶有4克的高锰酸钾的水溶液，加热汇流数小时后，真空除去有机溶剂后，用100毫升的50％的乙酸乙酯和水提取，乙酸乙酯用水洗涤多次后，用无水硫酸钠干燥，真空除去溶剂，得到深色的固体，硅胶柱分离得到白色的莪术醇酮衍生物1.45克，收率：61％，HPLC：98％，熔点：138-140℃。即通式(III)中Z为O的第31号化合物。
元素分析发现：C 70.865％，H 9.102％。
分子式(C14H22O3)计算：C 70.560％，H 9.305％。
以CDCl3为溶剂，磁共振仪检测，图谱显示有14个碳信号，22个质子信号。
质谱仪分析得出产物的分子量为238。
这说明得到的反应产物就是我们需要的目标物。结构式如下：
Figure B2005800144098D00261
制备实施例八 莪术醇环氧衍生物的制备
将莪术醇1克(96％，0.004摩尔)溶解于100毫升氯仿中，在室温下加入间氯过氧苯甲酸2克(98％，0.011摩尔)，15-20℃反应8小时，然后用5％的氢氧化钠溶液洗涤几次，
再用水洗涤到中性，用无水硫酸钠干燥，真空脱除溶剂。再经过硅胶柱分离，得到通式()中Z为的莪术醇的环氧衍生物(第48号化合物)。得到白色粉末0.504克，收率：50％，HPLC：98.5％。熔点：130-132℃。
元素分析发现：C 70.865％，H 9.102％。
分子式(C15H24O3)计算：C 71.035％，H 9.046％。
以CDCl3为溶剂，磁共振仪检测，图谱显示有15个碳信号，24个质子信号。
质谱仪分析得出产物的分子量为252。
这说明得到的反应产物就是我们需要的目标物。结构式如下：
Figure B2005800144098D00271
此化合物在微酸性溶液中打开氧环，从而得到通式(II)中R2为OH、R3为H的化合物。而开环后的化合物，经过酯化(或烷基化)反应(采用方法一莪术醇6C上的羟基酯化、方法二的烷基化反应)即可以得到通式(II)中R3为H，R2为OR1的化合物(其中R1的限定如上所定义)。
试验实施例
实施例一化合物体外肿瘤细胞抑制率的检测
1.试验化合物
1-49个新化合物和莪术醇E共50个。
2、材料
(1)MTT以0.01mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)溶解MTT，调节浓度到4mg/ml，过滤除菌，贮存于4℃的冰箱中。
(2)MTT裂解液的配制80g的十二烷基磺酸钠溶解在200ml的DMF中，水浴加温使之溶解，加入200ml蒸馏水，用1∶1的80％乙酸和1N的HCl调节PH到4.7。
(3)使用的肿瘤细胞株
U-937         人组织细胞淋巴瘤
A-549         人肺腺癌细胞
Bel-7402      人肝癌细胞
MCF-7         人乳腺腺癌细胞
Hela          人宫颈癌细胞
HL-60         人早幼粒白血病细胞
SMMC-7721     人肝癌细胞
LLC           小鼠Lewis肺癌
3、操作方法
(1)单细胞悬液接种于96孔板(×3)(用PRMI-1640基础培养基将细胞稀释到3×104个/ml，每孔加入200ug稀释好的细胞)，37℃，5％的CO2，饱和湿度下培养24小时。每组4个平行样。
(2)除去培养基，取新配制培养基按表中浓度制备(15个化合物)抗癌药物溶液，每孔加入200ug，培养48小时。
(3)每孔加入2mg/ml的MTT20ug，孵化4小时。
(4)吸出孔中培养液，快速翻转培养板甩去培养液，加入DMSO150ug/孔，室温下震荡10分钟。
(5)用酶联检测仪测OD值(λ＝570nm)。
(6)按下式分别计算细胞生长抑制率(inhibition rate IR)。
IR(％)＝[1-(实验组平均OD值/对照组平均OD值)]×100％
实验结果如附表一所示。实验结果表明，所有的化合物对hela的抑制率都大于50％。
重复三次同样的试验过程，结果见下表一、二、三。
表一化合物体外抗肿瘤生物活性测试筛选结果
续上表
  12   80.3   60.32   43.08   54.89   32.03   60.21   83.78   -10.89
  13   51.10   7.59   33.16   54.67   3.71   0.12   66.32   0.24
  14   82.88   8.09   32.00   56.30   6.14   2.45   75.46   -10.57
  15   57.32   17.43   32.98   65.32   -2.50   8.23   70.02   -11.83
  16   82.56   6.01   1.23   54.89   -2.50   2.31   68.99   1.13
  17   87.18   4.68   -12.36   53.89   10.16   92.33   91.58   7.27
  18   70.30   -2.24   13.58   57.89   13.39   4.26   60.32   4.18
  19   50.97   2.51   4.32   12.6   23.01   54.03   55.67   -15.52
  20   89.23   12.50   7.89   18.9   18.08   91.35   94.23   8.97
  21   92.04   26.42   5.36   87.56   -7.26   93.12   91.69   10.47
  12   80.3   60.32   43.08   54.89   32.03   60.21   83.78   -10.89
  22   60.32   19.23   12.80   88.32   44.39   21.01   63.20   -6.01
  23   81.60   -7.41   13.54   32.56   18.69   12.50   55.33   12.1
  24   63.78   3.12   1.23   8.26   -1.59   2.63   54.62   4.83
  25   86.94   13.68   5.68   9.53   0.24   -2.63   81.88   4.18
  26   55.32   -3.24   3.45   43.21   0.97   -0.23   51.00   11.77
  27   52.98   15.01   4.65   23.78   25.94   3.19   62.31   -10.89
  28   59.32   1.23   -2.24   32.15   -3.78   2.98   58.75   0.24
  29   25.32   3.89   2.51   37.85   4.26   42.12   56.98   -10.12
  30   13.25   4.36   12.40   36.15   1.03   13.20   53.87   -1.83
  31   -0.68   8.65   0.23   16.75   -1.96   16.50   57.98   1.13
  32   65.32   -12.5   4.23   65.12   79.96   14.00   84.33   7.27
  33   44.34   16.32   14.32   45.3   -7.44   1.32   60.89   4.18
  34   35.23   2.31   1.11   1.23   -5.25   2.96   50.64   -18.52
  35   7.36   3.89   3.65   3.89   5.23   3.12   59.88   8.97
  36   6.98   9.21   0.22   -1.23   15.39   1.03   62.13   11.56
  37   23.56   32.03   15.32   23.10   -2.32   56.23   63.75   1.21
  38   19.30   3.71   13.56   11.32   -8.7   12.35   58.69   10.47
  39   12.68   6.14   3.87   12.84   -0.33   3.16   58.75   -3.24
  40   4.36   -2.50   13.2   27.35   11.65   8.88   64.26   4.21
续上表
  41   8.65   -2.50   16.78   36.45   4.42   6.78   50.32   30.96
  42   -12.5   10.16   2.15   34.21   6.86   2.73   55.64   9.99
  43   16.32   13.39   9.15   43.21   -10.12   2.56   62.13   -2.06
  44   35.64   23.01   -6.54   25.55   -10.53   3.71   55.14   23.35
  45   32.19   2.10   3.01   26.78   -10.73   6.14   59.45   2.74
  46   16.32   3.12   4.55   19.88   -0.86   -2.60   53.12   -12.99
  47   86.47   -12.0   2.88   65.12   -1.43   10.32   83.66   -13.24
  48   90.92   7.84   16.40   61.23   20.59   60.80   86.77   -8.04
  49   78.65   5.36   2.69   0.65   -11.3   55.35   79.8   -0.15
  E   28.01   -0.57   4.79   55.64   -11.5   1.32   86.75   -3.04
表二(复筛)化合物体外抗肿瘤生物活性测试筛选结果
续上表
  25   82.36   14.23   2.03   8.12   8.32   1.23   75.55   1.02
  26   54.23   -3.12   -3.45   41.21   -0.97   -0.23   56.55   -11.77
  27   50.98   5.23   2.31   14.36   20.36   5.969   60.21   -10.00
  28   51.23   2.31   -0.45   19.98   -1.02   4.32   60.45   1.23
  29   12.32   1.23   3.21   30.12   5.68   42.79   50.17   -1.95
  30   13.10   4.01   9.84   30.56   4.56   4.12   56.89   -4.65
  31   -12.61   4.82   8.42   14.87   -4.56   2.78   55.49   1.25
  32   67.23   -12.5   4.23   65.02   82.59   13.41   80.12   7.05
  33   43.21   14.32   14.89   39.30   -1.56   7.68   59.80   3.12
  34   23.56   9.23   0.59   4.56   0.95   3.14   51.89   -11.22
  35   0.23   2.77   6.78   9.87   4.32   3.99   64.01   8.23
  36   5.32   1.20   0.02   -2.31   14.08   2.01   65.23   11.56
  37   32.10   34.01   12.31   5.61   -8.36   50.12   62.17   0.32
  38   13.00   0.96   -9.78   10.98   1.23   11.45   60.11   1.96
  25   82.36   14.23   2.03   8.12   8.32   1.23   75.55   1.02
  39   10.32   321   13.56   19.73   -0.98   9.58   60.99   -4.57
  40   1.02   -12.37   25.43   14.38   -11.36   12.96   64.12   1.95
  41   -1.02   -7.89   1.23   31.28   3.12   1.86   51.23   23.65
  42   -1.03   3.12   14.36   30.12   0.79   3.14   54.03   1.79
  43   12.30   11.24   -4.98   41.94   -8.98   2.00   59.66   -11.23
  44   23.56   20.33   0.23   24.11   -7.89   5.37   50.01   17.565
  45   12.32   0.32   5.02   20.73   -11.23   1.23   53.12   1.32
  46   8.65   3.78   4.65   14.98   -0.45   -4.56   49.56   -17.56
  47   85.39   -7.85   2.35   60.49   -3.25   1.96   80.79   -14.00
  48   91.23   9.48   10.23   62.38   12.11   50.23   80.79   -4.32
  49   75.23   4.23   14.02   1.56   -1.78   57.89   75.65   0.12
  E   14.321   -11.32   9.87   50.23   -12.30   1.23   70.12   -8.90
表三(复筛)化合物体外抗肿瘤生物活性测试筛选结果
实施例二化合物体外抗肿瘤IC50的实验
1.被试验的化合物
5-14、17、20、21、E共15个化合物以5-FU为阳性对照。
2、材料
(1)MTT以0.01mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)溶解MTT，调节浓度到4mg/ml，过滤除菌，贮存于4℃的冰箱中。
(2)MTT裂解液的配制80g的十二烷基磺酸钠溶解在200ml的DMF中，水浴加温使之溶解，加入200ml蒸馏水，用1∶1的80％乙酸和1N的HCl调节PH到4.7。
(3)使用的肿瘤细胞株
U-937        人组织细胞淋巴瘤
A-549        人肺腺癌细胞
Bel-7402     人肝癌细胞
MCF-7        人乳腺腺癌细胞
Hela         人宫颈癌细胞
HL-60        人早幼粒白血病细胞
SMMC-7721    人肝癌细胞
LLC        小鼠Lewis肺癌
3、操作方法
(1)单细胞悬液接种于96孔板(用PRMI-1640基础培养基将细胞稀释到3*104个/ml，每孔加入200ug稀释好的细胞)，37℃，5％的CO2，饱和湿度下培养24小时。每组4个平行样。
(2)除去培养基，取新配置培养基按系列浓度制备(50个化合物)抗癌药物溶液，每孔加入200ug，培养48小时。
(3)每孔加入2mg/ml的MTT20ug，孵化4小时。
(4)吸出孔中培养液，快速翻转培养板甩去培养液，加入DMSO150ug/孔，室温下震荡10分钟。
(5)用酶联检测仪测OD值(λ＝570nm)。
(6)绘制细胞活力曲线图，求出IC50。
实验结果
实验结果如下表四所示，实验数据表明，所有的化合物对hela和U-937的IC50比E和阳性5-FU对照接近或小，证明很多新化合物的活性比母核莪术醇和阳性5-FU强。化合物5、6对所选的8种肿瘤细胞都有很强的抑制作用，是广谱的抗肿瘤化合物。化合物7、8除了对hela和U-937有很好的活性外，对U-937、HL-60活性也很好。
表四药用化合物筛选生物活性测试报告(IC50)
实施例三化合物抗动物体内肿瘤活性实验
化合物抗小鼠移植肉瘤S-180活性实验
1、筛选的化合物
我们选取了其中的第6号化合物(莪术醇对羟苯胺盐酸盐)、第8号化合物(莪术醇哌嗪酸盐)、第21号化合物(莪术醇硫酸酯钠盐)等三个化合物。
2、材料
(1)体重18-22g昆明鼠为实验鼠；
(2)用注射用水(其中化合物6溶解是需要加入1％的表面活性剂)将三个化合物分别配制成100mg/ml的溶液备用。5-FU、喜树碱为阳性对照物对小鼠的用药量为30mg/kg、1mg/kg；
(3)0.9％的生理盐水；
(4)接种的肿瘤株为；
肉瘤S-180
3、给药方式
静脉注射。
4、实验方法
参照中华人民共和国药政管理局《新药(西药)临床前指导原则》和徐叔云等主编的《药物实验方法学》中相关的方法。取20-22kg昆明小鼠120只，雄性，正常饲养3天无异常，常规腋下小鼠肉瘤S-180，4小时后称重，随机分组10只/组，共12组。第一组给生理盐水0.3毫升，为阴性对照组；第二组给5-FU0.6mg/只，为阳性对照组；第三组给羟基喜树碱0.02mg/只，为阳性对照组。第四、五、六组注射浓度10％的化合物6，分别为0.4ml/只、0.2ml/只、0.1ml/只；第七、八、九组注射浓度10％的化合物8，分别为0.4ml/只、0.2ml/只、0.1ml/只；第十、十一、十二组注射浓度10％的化合物20，分别为0.4ml/只、0.2ml/只、0.1ml/只；接种次日开始给药，隔日连续给药，1次/天，共六次。末次给药后次日称重处死，剥取肿瘤称后称体重和瘤重，按公式：[(对照组平均瘤重-实验组平均瘤重)/对照组平均瘤重]×100％。计算肿瘤抑制率，并对数据进行统计学处理。上述实验在相同条件下重复三次。
实验结果见下表五；实验结果表明：对于小鼠肉瘤S-180，化合物6在三个不同的浓度下，都有较好的抑制效果；化合物8只有在浓度达到40mg/kg，才有抑制效果；而化合物21几乎无抑制效果。
表五(第一次)化合物抗小鼠移植肉瘤S-180活性实验结果(X±SD，n＝10)
  组别 剂量(mg/kg)  平均体重(g)给药前 平均体重(g)给药后 瘤重(g)   抑制率(％)
  一 生理盐水   20.3   22.1   2.50±0.32
  二 5-FU   30   19.5   22.9   0.72±0.23   71.2
  三 羟基喜树碱   1   20.6   20.8   0.87±0.28   65.2
  四 化合物6   40   19.9   22.0   0.62±0.34   75.2
  五   20   20.3   22.9   0.79±0.21   68.4
  六   10   19.6   22.3   1.1±0.31   56
  组别 剂量(mg/kg)  平均体重(g)给药前 平均体重(g)给药后 瘤重(g)   抑制率(％)
  七 化合物8   40   20.3   23.0   1.3±0.24   48
  八   20   19.6   21.8   2.0±0.40   20
  九   10   19.9   22.5   2.1±0.42   16
  十 化合物21   40   20.6   23.1   2.3±0.31   8
  十一   20   19.9   22.5   2.4±0.43   4
  十二   10   20.1   22.6   2.6±0.23   -
表五(第二次重复)化合物抗小鼠移植肉瘤S-180活性实验结果(X±SD，n＝10)
  组别   剂量(mg/kg)   平均体重(g)给药前   平均体重(g)给药后 瘤重(g)   抑制率(％)
  一 生理盐水   20.5   22.1   2.60±0.32
  二 5-FU   30   19.2   21.9   0.79±0.33   69.6
  三 羟基喜树碱   1   20.0   20.8   0.92±0.38   64.6
  四 化合物6   40   19.5   22.0   0.71±0.44   72.7
  五   20   20.7   21.9   0.82±0.32   68.8
  六   10   20.6   22.3   1.1±0.31   57.7
  七 化合物8   40   20.7   23.0   1.4±0.37   46.1
  八   20   20.6   21.8   2.2±0.29   15.4
  九   10   21.0   23.5   2.2±0.31   15.4
  十 化合物21   40   20.1   23.1   2.4±0.36   7.6
  十一   20   19.6   22.2   2.5±0.38   3.8
  十二   10   20.4   22.6   2.5±0.42   3.8
化合物抗小鼠移植肝癌H22活性实验
重复化合物抗小鼠移植肉瘤S-180活性实验操作，但是接种的肿瘤株为肝癌H22，上述实验在相同条件下重复三次。
实验结果见下表六。实验结果表明：对于小鼠移植肝癌H22，第6号化合物在三个不同的浓度下，都有较好的抑制效果；第8号化合物只有在浓度达到40mg/kg，才有一定的抑制效果；而第21号化合物几乎无抑制效果。
表六(第一次)化合物抗小鼠肝癌H22活性实验结果(X±SD，n＝10)
  组别 剂量(mg/kg)  平均体重(g)给药前  平均体重(g)给药后 瘤重(g)   抑制率(％)
  一   生理盐水   19.6   22.2   3.02±0.30
  二   5-FU   30   20.3   22.3   1.21±0.31   60.0
  三   羟基喜树碱   1   20.3   20.5   1.12±0.28   63.9
  四   化合物6   40   19.9   22.1   1.15±0.31   61.9
  五   20   21.2   22.2   1.60±0.29   47.0
六 10 20.6 22.0 2.8±0.37 7.0
  七   化合物8   40   20.8   22.4   1.9±0.36   37.1
  八   20   21.0   21.9   2.9±0.39   4.0
  九   10   21.4   22.3   3.02±0.33   -
  十   化合物21   40   20.5   22.1   2.9±0.31   4.0
  十一   20   19.2   22.0   3.03±0.41   -
  十二   10   20.3   22.1   3.00±0.29   -
表六(第二次)化合物抗小鼠肝癌H22活性实验结果(X±SD，n＝10)
  组别   剂量(mg/kg)   平均体重(g)给药前   平均体重(g)给药后 瘤重(g)   抑制率(％)
  一   生理盐水   21.2   22.2   3.02±0.30
  二   5-FU   30   19.6   21.3   1.19±0.31   60.5
  三   羟基喜树碱   1   20.3   20.2   1.00±0.28   66.9
  四   化合物6   40   20.8   22.4   1.21±0.31   60.3
  五   20   20.3   22.0   1.58±0.29   47.7
  六   10   20.1   21.0   2.6±0.37   13.9
  七   化合物8   40   20.4   21.4   1.93±0.36   36.1
  八   20   21.8   21.9   2.9±0.39   4.0
  九   10   21.0   22.3   3.10±0.33   -
  十   化合物21   40   20.5   22.1   3.0±0.31   1.0
  十一 20 20.3 22.0 3.02±0.41   -
  十二   10   19.2   22.1   3.03±0.29   -
附表六(第三次)化合物抗小鼠肝癌H22活性实验结果(X±SD，n＝10)
  组别  剂量(mg/kg)   平均体重(g)给药前   平均体重(g)给药后 瘤重(g)   抑制率(％)
  一   生理盐水   20.2   22.0   3.02±0.30
  二   5-FU   30   19.9   20.3   1.08±0.31   64.2
  三   羟基喜树碱   1   21.3   22.2   1.05±0.28   65.3
  四   化合物6   40   19.8   21.4   1.30±0.31   56.9
  五   20   19.3   20.0   1.63±0.29   46.0
  组别  剂量(mg/kg)   平均体重(g)给药前   平均体重(g)给药后 瘤重(g)   抑制率(％)
  六   10   20.5   21.2   2.8±0.37   7.3
  七   化合物8   40   21.4   21.9   2.01±0.36   33.4
  八   20   19.8   20.9   2.8±0.39   7.3
  九   10   19.0   20.3   2.95±0.33   2.3
  十   化合物21   40   19.5   20.1   3.0±0.31   1.0
  十一   20   19.3   21.0   3.01±0.41   -
  十二   10   20.2   22.1   3.02±0.29   -
化合物抗小鼠移植宫颈癌U14活性实验
重复化合物抗小鼠移植肉瘤S-180活性实验操作，但是
(1)接种的肿瘤株为小鼠宫颈癌U14；
(2)所用小鼠都为雌鼠。
上述实验在相同条件下重复三次
实验结果见下表七。实验结果表明：对于小鼠移植宫颈癌U14，化合物6、8、21在三个不同的浓度下，都有较好的抑制效果；当给药浓度为20mg/kg以上时，对于小鼠移植宫颈癌U14的抑制率都达到50％以上，当给药浓度为40mg/kg时，对于小鼠移植宫颈癌U14的抑制率都达到60％以上，而化合物6、21更是达到70％以上。
表七(第一次)化合物抗小鼠宫颈癌U14活性实验结果(X±SD，n＝10)
  组别   剂量(mg/kg)   平均体重(g)给药前   平均体重(g)给药后 瘤重(g)   抑制率(％)
  一   生理盐水   19.2   22.0   3.51±0.30
  二   5-FU   30   20.9   21.3   2.10±0.31   40.2
  三   羟基喜树碱   1   20.3   22.2   1.90±0.28   45.8
  四   化合物6   40   19.1   21.4   0.96±0.31   72.6
五 20 20.3 21.0 1.23±0.29 65.0
  组别   剂量(mg/kg)   平均体重(g)给药前   平均体重(g)给药后 瘤重(g)   抑制率(％)
  六   10   21.5   22.2   2.2±0.37   37.3
  七   化合物8   40   21.0   21.9   1.15±0.36   67.2
  八   20   19.2   20.9   1.60±0.39   54.4
  九   10   19.9   20.9   2.26±0.33   35.6
  十   化合物21   40   19.6   21.1   0.99±0.31   71.8
  十一   20   19.9   21.0   1.52±0.41   56.7
  十二   10   20.6   22.1   1.68±0.29   52.1
表七(第二次)化合物抗小鼠宫颈癌U14活性实验结果(X±SD，n＝10)
  组别   剂量(mg/kg)   平均体重(g)给药前   平均体重(g)给药后 瘤重(g)   抑制率(％)
  一   生理盐水   19.8   22.6   3.40±0.30
  二   5-FU   30   20.0   21.3   1.95±0.31   42.6
  三   羟基喜树碱   1   20.6   22.3   1.82±0.28   46.5
  四   化合物6   40   19.9   21.6   0.90±0.31   73.5
  五   20   20.3   21.6   1.20±0.29   64.7
  六   10   21.5   22.0   2.3±0.37   32.3
  七   化合物8   40   20.3   21.2   1.20±0.36   64.7
  八   20   19.6   20.9   1.51±0.39   55.6
九 10 20.9 21.9 2.08±0.33 38.8
  十   化合物21   40   19.8   21.0   0.89±0.31   73.8
  十一   20   19.9   21.1   1.46±0.41   57.1
  组别   剂量(mg/kg)   平均体重(g)给药前   平均体重(g)给药后 瘤重(g)   抑制率(％)
  十二   10   20.6   22.5   1.59±0.29   53.2
表七(第三次)化合物抗小鼠宫颈癌U14活性实验结果(X±SD，n＝10)
  组别  剂量(mg/kg)   平均体重(g)给药前   平均体重(g)给药后 瘤重(g)   抑制率(％)
  一   生理盐水   19.2   22.2   3.62±0.30
  二   5-FU   30   20.5   21.0   2.10±0.31   42.0
  三   羟基喜树碱   1   20.1   21.3   1.96±0.28   45.6
  四   化合物6   40   20.1   21.6   1.01±0.31   72.1
  五   20   19.3   21.6   1.32±0.29   63.5
  六   10   20.1   22.1   2.32±0.37   35.9
  七   化合物8   40   20.2   21.3   1.25±0.36   65.5
  八   20   19.9   21.9   1.65±0.39   54.4
  九   10   20.1   21.5   2.14±0.33   40.1
  十   化合物21   40   19.1   20.1   0.95±0.31   73.7
  十一   20   19.7   21.0   1.51±0.41   58.3
  十二   10   20.6   22.0   1.64±0.29   54.7
化合物抗小鼠移植肺癌Lewis活性实验
重复化合物抗小鼠移植肉瘤S-180活性实验操作，但是
(1)接种的肿瘤株为小鼠肺癌Lewis；
(2)化合物为6，8和21不再做活性实验；
(3)实验鼠为六组。
上述实验在相同条件下重复三次
实验结果见下表八。实验结果表明：对于移植小鼠肺癌Lewis，化合物6在三个不同的浓度下，都有一定的的抑制效果；分别为：51.6％、44.8％、29.4％。当给药浓度为40mg/kg时，对于小鼠肺癌Lewis的抑制率与阳性对照的喜树碱相当，与5-FU相近。
表八(第一次)化合物抗小鼠肺癌Lewis活性实验结果(X±SD，n＝10)
  组别   剂量(mg/kg)   平均体重(g)给药前   平均体重(g)给药后 瘤重(g)   抑制率(％)
  一   生理盐水   20.1   23.2   2.98±0.30
  二   5-FU   30   19.5   21.0   1.34±0.31   55.0
  三   羟基喜树碱   1   19.8   21.0   1.50±0.28   49.7
  四   化合物6   40   20.3   21.6   1.44±0.31   51.7
  五   20   19.6   21.1   1.71±0.29   42.6
  六   10   20.2   22.1   2.10±0.37   29.5
表八(第二次)化合物抗小鼠肺癌Lewis活性实验结果(X±SD，n＝10)
  组别  剂量(mg/kg)  平均体重(g)给药前  平均体重(g)给药后 瘤重(g)   抑制率(％)
  一   生理盐水   20.3   22.6   2.41±0.30
  二   5-FU   30   19.8   21.5   1.10±0.31   54.3
  三   羟基喜树碱   1   19.1   21.0   1.20±0.28   50.2
  四   化合物6   40   19.3   20.6   1.19±0.31   50.6
  五   20   19.2   21.8   1.34±0.29   44.4
六 10 20.9 22.9 1.80±0.37 25.3
表八(第三次)化合物抗小鼠肺癌Lewis活性实验结果(X±SD，n＝10)
  组别   剂量(mg/kg)  平均体重(g)给药前  平均体重(g)给药后 瘤重(g)   抑制率(％)
  一   生理盐水   21.0   24.6   2.70±0.30
  二   5-FU   30   21.3   23.5   1.25±0.31   53.7
  三   羟基喜树碱   1   19.9   21.5   1.30±0.28   51.9
  四   化合物6   40   21.3   24.6   1.28±0.31   52.6
  五   20   21.9   24.8   1.42±0.29   47.4
  六   10   20.6   22.9   1.80±0.37   33.3
实施例四体外抗HIV-1蛋白酶(HIV-1 PR)活性筛选
测试原理：HIV-1蛋白酶在最佳反应条件和反应体系中可将荧光标记底物切开，检测酶反应产物中荧光强度来反映酶的活性。在反应体系中加入样品可用于筛选该酶的抑制剂。
测试材料和方法：
1.HIV-1 PR：外购，-85℃保存。
2.样品处理：样品临用前溶于DMSO配成适当浓度，并用双蒸水作5倍稀释，各5个稀释度。
3.阳性对照药：印地那韦(indinavir)，由葛兰素公司提供。
4.测试方法：样品稀释后加入含有荧光标记底物反应缓冲液中，并加入基因工程靶酶，在最佳反应条件下孵育，用FLUO star Galaxy荧光仪测定荧光值。
测试结果：
表九样品抗HIV-1蛋白酶初筛报告
测试样品在不同浓度下的抑制率及IC50
样品名   50(μg/ml)   10(μg/ml)   2.0(μg/ml)   0.40(μg/ml)   0.08(μg/ml)   IC50(μg/ml)
  化合物2   12.66   12.20   2.98   8.64   4.13   -
  化合物3   5.55   12.06   9.64   13.48   4.98   -
  化合物5   1.01   11.22   10.30   9.00   4.38   -
样品名   50(μg/ml)   10(μg/ml)   2.0(μg/ml)   0.40(μg/ml)   0.08(μg/ml)   IC50(μg/ml)
  化合物6   7.07   13.15   2.99   1.7   0.89   -
  化合物7   1.43   3.51   4.31   6.32   14.06   -
  化合物8   1.40   0.62   5.27   2.64   9.74   -
  化合物17   9.94   6.15   -6.00   10.71   3.78   -
  化合物20   12.68   9.46   10.57   7.44   8.76   -
  化合物21   5.47   10.16   5.86   14.77   8.74   -
  化合物23   1.39   11.23   13.69   11.14   11.88   -
  化合物24   -0.63   2.57   11.62   13.48   3.32   -
  化合物33   9.14   1.30   10.63   11.41   13.21   -
  化合物47   0.56   1.78   12.94   12.32   6.89   -
  10nM
  92.1
注：表中“-”表示样品在初始浓度物抑制HTV-1 Pr活性；
“*”表示样品自身有荧光，干扰检测系统，测定结果不准确。
实验结果表明：以200ug/ml浓度筛选，发现各个化合物均无活性。
实施例五体外抗HIV-1逆转录酶(HIV-1 RT)活性筛选
测试原理：将HIV-1逆转录酶作用的模版包被在酶标版上，在最适酶反应条件和反应体系中，HIV-1 RT可将含有Biotin-dUTP底物加到反应模版上，用链亲合素标记的辣根过氧化物酶检测酶反应物中Biotin-dUTP掺入量来反映酶的活性。在反应体系中加入样品可用于筛选该酶的抑制剂。
测试材料和方法：
1.HIV-1 RT：外购。
2.样品处理：样品临用前溶于DMSO配成适当浓度，并用双蒸水作5倍稀释，各5个稀释度。
3.阳性对照药：奈韦拉平(NVP)，由常州三厂生产。
4.测试方法：样品稀释后加入含有Biotin-dUTP合基因工程靶酶的反应Buffer中，在最佳反应条件下孵育，以亲合素标记歌德辣根过氧化物酶系统显色，测定OD450值。
表十样品抗HIV-1逆转录酶初筛报告
  编号   初始浓度   IC<sub>50</sub>   编号   初始浓度   IC<sub>50</sub>
  化合物2   原液的1/150   *   化合物20   200μg/ml   -
  化合物3   原液的1/150   *   化合物21   200μg/ml   -
  化合物5   200μg/ml   -   化合物23   200μg/ml   -
  化合物6   200μg/ml   -   化合物24   200μg/ml   -
  化合物7   200μg/ml   -   化合物33   200μg/ml   -
  化合物8   200μg/ml   -   化合物47   200μg/ml   -
  化合物17   200μg/ml   -   NVP   10μg/ml   0.21μg/ml
注：表中“-”表示样品在初始浓度无抑制HIV-1 RT的活性。
*表示样品在初始浓度有抑制HIV-1 RT的活性。
实验结果表明：第2、3号化合物在浓度为120ug/ml时，抑制率为60％，新化合物抗HIV-1逆转录酶，只是有活性，但是效果并不佳。
实施例六体外抗HIV-1整合酶(HIV-1IN)活性筛选
测试原理：用合成的30个寡核苷酸作供体底物，用合成的20个寡核苷酸作为靶底物，在96孔板包被供体底物加入纯化的HIV-1整合酶，进行ELISA反应，检测靶DNA的链转移的产物，以生物素标记的碱性磷酸酶系统显色，酶标仪测定OD值。在反应体系中加入样品可用于筛选该酶的抑制剂。
测试材料和方法：
1.HIV-1 IN：外购。
2.样品处理：样品11个，临用前溶于水或DMSO配成适当浓度，再作5倍稀释，4个稀释度。原液两个液体样品用DMSO稀释100倍后再作5倍稀释，4个稀释度。阳性对照药：S-y，上海有机所提供。
3.供体底物和靶底物：上海生工合成。
4.测试方法：样品稀释后加入供体底物包被96孔板中，并加入含有基因工程靶酶和biotin-靶底物的反应Buffer中，在最佳反应条件下孵育，以生物素标记的碱性磷酸酶系统显色，测定405nm吸收值OD值。
测试结果：
表十一样品抗HIV-1整合酶初筛报告
编号   初始浓度(μg/ml)   IC<sub>50</sub>(μg/ml) 编号   初始浓度(μg/ml)   IC<sub>50</sub>(μg/ml)
  化合物2   1/1000(原液)   35.681   化合物20   100   39.820
  化合物3   1/1000(原液)   35.983   化合物21   100   -
  化合物5   100   -   化合物23   100   -
  化合物6   100   -   化合物24   100   -
  化合物7   100   -   化合物33   100   -
  化合物8   100   -   化合物47   100   -
  化合物17   100   -   -
  S-y   0.545
注：表中“-”表示样品在初始浓度抑制HIV-1 IN活性的百分率小于50％。
实验结果表明：第20号化合物对HIV-1整合酶(HIV-1 IN)有比较好的抑制作用，IC50为39.820ug/ml。
实施例七抗流感甲、乙型病毒活性筛选
测试原理：以MDCK(狗肾)细胞为病毒宿主，测定样品抑制病毒引起细胞病变程度(CPE)。
测试材料和方法：
1.病毒株：流感甲型病毒(济防90-15)，流感乙型病毒(济防97-13)，在鸡胚尿囊腔内培养传代(2003.8)，-80℃保存。
2.样品处理：样品溶于DMSO，再用培养液配成适宜初始浓度，用培养液作3倍稀释，各8个稀释度。
3.阳性对照药：病毒唑(RBV)，浙江康裕药业有限公司(批号960501)。
4.测试方法：MDCK细胞接种96孔培养板，置5％CO2，37℃培养24小时。MDCK细胞分别加入流感甲型病毒10-3(60倍TCID50)、流感乙型病毒10-2(30倍TCID50)，37℃吸附2小时后倾去病毒液，分别加入不同稀释度药物。设病毒对照和细胞对照，37℃培养36小时，观察结果，记录CPE，计算各样品抗流感病毒半数抑制浓度(IC50)。
测试结果：
表十二抗流感甲、乙型病毒初筛报告
注：(1)表中“-”表示样品在最大无毒剂量无抗流感甲、乙型病毒活性。
(2)TC50：药物半数有毒浓度；IC50：药物对病毒半数抑制浓度；SI：选择指数，SI＝TC50/IC50。
实验结果表明：第20号化合物有活性，但是，活性不是很强。
实施例八抗疱疹病毒的药物筛选
材料和方法
实验样品：第3-8、14、17、19、20、21、43化合物和莪术醇E，分别用PBS或无水乙醇配制成母液浓度，0.45um滤器过滤除菌，置于4℃避光保存备用。
病毒和细胞：口膜疱疹病毒(VSV)，293，BHK细胞由中国科学院武汉病毒所肝炎及基因治疗组液氮保存。细胞在CO2培养箱中37℃培养，培养液为DMEM培养基加10％胎牛血清(Gibico公司)
病毒制备及滴度测定：VSV感染BHK细胞增殖病毒，2～3天后离心去沉淀，收集细胞上清，用TCID50法测病毒滴度，-80℃避光保存备用。
药物筛选：将293细胞计数，按1.5×104/孔接种于96孔板中37℃ CO2培养过夜，将实验样品按一定浓度加入到细胞中，并用MOI＝5×10-3的VSV感染细胞，同时设阴性阳性对照。感染后12、24小时观察细胞的病变情况，并用数码相机照相。
实验结果：样品感染24小时后细胞病变及细胞状态见下表十三，
表十三样品抗疱症病毒初步筛选实验结果
Figure B2005800144098D00491
部分感染12小时后细胞病变及细胞状态：由于样品的使用浓度较高(200μg/ml)，对细胞的毒性较大，我们降低样品浓度(50μg/ml)进行筛选实验，结果见下表十四。
初筛样品感染12、24小时后细胞病变及细胞状态
第一轮初筛后，结果初步显示13个样品中，21号具有一定的抗VSV的活性。进一步采用不同的实验浓度，对第21号化合物进行药物筛选实验，实验结果如下：
实验结果表明：第21号化合物在浓度为200μg/ml时具有一定的抗VSV的活性。
实施例九抗乙肝病毒的筛选
1材料和方法
1.1实验样品
样品编号6，16，14，2，3，24，17，20，33，莪术醇，25，47，21，分别用PBS或无水乙醇配制成母液浓度，0.45um滤器过滤除菌，置于4避光保存备用。
1.2病毒和细胞
HBV重组杆状病毒(vAcGFPHBVc)，sf9、HepG2细胞由中国科学院武汉病毒所肝炎及基因治疗组液氮保存。细胞在CO2培养箱(FORMA公司)37培养，培养液为DMEM培养基加10％胎牛血清(Gibico公司)
1.3病毒制备及滴度测定
vAcGFPHBVc感染sf9细胞增殖病毒，3天后离心去沉淀，收集细胞上清，用TCID50法测vAcGFPHBVc病毒滴度，-80避光保存备用。
1.4乙型肝炎病毒e抗原的检测(ELISA方法)：过程简述如下：
1.将反应板及试剂置于37平衡30分钟，待测样品置于室温平衡30分钟；
2.每孔加入待测样品50ul，设阴阳性对照各2孔，每孔加入阴性对照(或阳性对照)各1滴，并设空白对照1孔；
3.每孔加入酶结合物1滴(空白对照除外)，混匀，封板，置于37孵育30分钟；
4.洗板机洗板：洗涤5次后拍干；
5.每孔加入显色剂A液、B液各一滴，混匀，封板，置于37孵育15分钟；
6.每孔加入终止液1滴，混匀；
7.酶标仪读数，取波长450nm，空白孔校零。
乙型肝炎病毒e抗原诊断试剂盒购自上海实业科华生物技术有限公司。
1.5药物筛选
将HepG2细胞计数，按1.5×104/孔接种于96孔板中37CO2培养过夜，将验样品按一定浓度加入到细胞中37孵浴24小时后，用MOI＝100的vAcGFPHB转导处理的HepG2细胞，同时设阴性阳性对照。感染后4天后观察细胞的生长情并用乙型肝炎病毒e抗原诊断试剂盒测定上清中的乙型肝炎病毒e抗原。
2实验结果
2.1乙型肝炎病毒e抗原的检测结果
第一轮初筛后，排除药品对细胞的影响，结果初步显示13个样品中，化合物6，16，2号具有抗HBV的活性。
  编号   样品浓度(μg/ml)   细胞状态   HBeAg的OD<sub>450</sub>   (阳性值-测定值)/阳性值×100％
  6   200   正常   0.126   93.42723
  16   200   正常   0.502   73.81325
  14   200   差   0.053   97.23516
  2   200   正常   0.607   68.33594
  3   200   正常   2.61   -36.1502
  24   200   正常   2.387   -24.5179
  17   200   差   0.073   96.19197
  20   200   正常   2.201   -14.8148
  33   200   差   0.068   96.45279
  莪术醇   200   正常   2.654   -38.4455
  25   200   差   2.527   -31.8206
  47   200   差   0.365   80.95983
  21   200   生长迟缓   0.137   92.85342
  +   正常   1.917
  -   正常   0.057
附图1显示了乙型肝炎病毒e抗原样品OD450测定值，其中横坐标代表试验样品编号，它们各自与本发明化合物的对应关系如下所示：
图中编号：1，2，3，4，5，6，7，A，B，C，D，E，F，
化合物编号6，16，14，2，3，24，17，20，33，莪术醇，25，47，21，
POSITIVE代表阳性对照
NEGATIVE代表阴性对照
附图2显示了与阳性对照相比较，样品HbeAg的降低百分率，图中各编号的含义与图1中的相同。

Claims (14)

1.一种具有下式I结构的莪术醇衍生物或其药学上可接受的盐：
其中，Y选自＝CHR2或-CH2R2；
R1选自H、R、RCO或HO3S；
所述的R选自饱和的或不饱和的直链C1-10烃基；饱和的或不饱和的带支链的C3-10烃基；饱和的或不饱和的、任选地被一个或多个选自硝基、磺酸基、卤原子和羟基的取代基所取代的C6-12芳烃基；
R2选自F；Cl；Br；I；H；-OH；-HSO3；-NO3；RNH-；R’NR”，其中R’和R”可相同或不同，各自选自如所述R所限定的基团；
或者R2选自
条件是R1、R2不同时为H，
当Y为＝CH2时，R1不为CH3、CH3CH2、CH3CO、
当Y为-CH2R2时，所述的衍生物具有通式II：
其中R1，R2的定义同上，
R3选自F；Cl；Br；I；H；-OH；-HSO3；-NO3；-RNH；R’NR”，其中R’和R”可相同或不同，各自选自如所述R所限定的基团；
条件是R1，R2和R3不同时为H。
2.根据权利要求1所述的莪术醇衍生物基或其药学上可接受的盐，其中所述的芳烃基选自Ar-、ArCH2-、ArCH2CH2-、CH3ArCH2CH2-，Ar-为苯基，或是被F、Cl、Br、I、硝基、磺酸基或1-3个羟基取代的苯基。
3.根据权利要求1所述的莪术醇衍生物或其药学上可接受的盐，其中Y为＝CHR2，所述的衍生物具有下式III结构：
其中R1和R2的定义与权利要求1中的相同。
4.根据权利要求3所述的莪术醇衍生物或其药学上可接受的盐，其中R2为H。
5.根据权利要求3所述的莪术醇衍生物或其药学上可接受的盐，其中R1为HO3S、丙酰基、丁酰基、异丁酰基或苯甲酰基。
6.根据权利要求3所述的莪术醇衍生物或其药学上可接受的盐，其中R2为H，R1为HO3S、丙酰基、丁酰基、异丁酰基或苯甲酰基。
7.一种莪术醇衍生物或其药学上可接受的盐，其中所述的衍生物或其药学上可接受的盐选自下列化合物：
其中R2为H，R1为HO3S或NaO3S。
8.一种莪术醇衍生物或其药学上可接受的盐，其中所述的衍生物或其药学上可接受的盐选自下列化合物：
Figure F2005800144098C00031
Figure F2005800144098C00032
9.一种莪术醇衍生物或其药学上可接受的盐，其中所述的衍生物或其药学上可接受的盐选自下列化合物：
Figure F2005800144098C00042
式中各基团的定义如下：
Figure F2005800144098C00043
Figure F2005800144098C00051
10.一种莪术醇衍生物或其药学上可接受的盐，其中所述的衍生物或其药学上可接受的盐选自下列化合物：
Figure F2005800144098C00053
11.一种抗肿瘤或抗病毒的药物组合物，它包含药物有效量的如权利要求1-10任一所述的莪术醇衍生物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的赋形剂和/或添加剂。
12.如权利要求1-10任一所述的莪术醇衍生物或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用。
13.如权利要求1-10任一所述的莪术醇衍生物或其药学上可接受的盐在制备抗病毒药物中的应用。
14.根据权利要求13所述的应用，其中所述的病毒选自HIV病毒、流感病毒、疱疹病毒和乙肝病毒。
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