CN1495197B - G-csf类似物组合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)类似物，含有这些类似物的组合物，及其相关组合物。另一方面，本发明提供编码所述类似物的核酸或相关的核酸，相关的宿主细胞和载体。再一方面，本发明提供用于表现G-CSF及其类似物之三维空间结构的计算机程序和设备。再一方面，本发明提供了用于合理地设计G-CSF类似物及其相关组合物的方法。还有一方面，本发明提供了用所述G-CSF类似物进行治疗的方法。

Description

G-CSF类似物组合物及其制备方法
本申请是申请日为1994年1月25日，申请号为94191031.8，发明名称为“G-CSF类似物组合物及其制备方法”的发明专利申请的分案申请。 
发明领域
本发明涉及粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)类似物，含有该类似物的组合物，以及相关的组合物。另一方面，本发明涉及编码本发明所述类似物的核酸或相关的核酸，相关的宿主细胞和载体。再一方面，本发明涉及用于表达G-CSF及其类似物的三维空间结构的计算机程序和设备。又一方面，本发明涉及合理地设计G-CSF类似物及其相关组合物的方法。再一方面，本发明涉及利用本发明G-CSF类似物的治疗疾病方法。 
发明背景 
血细胞生成受两个系统控制：骨髓微环境内的细胞和生长因子。生长因子也称为集落刺激因子，它们刺激所牵涉到的祖细胞增殖并形成分化血细胞集落。这些生长因子之一是粒细胞集落刺激因子，本文中称之为G-CSF，该因子优先刺激中性白细胞的生长和发育，表明其可能对中性白细胞减少症具有潜在的作用(Welte et al.，PNAS-USA 82：1526-1530(1985)；Souza et al.，Science 232：61-65(1986)  以及Gabrilove，J.Seminars，Hematology26：(2)1-14(1989))。 
在人体中，可在血浆中检测到内源性G-CSF(Jones et al.，Bailliere′s Clinical Hematology 2(1)：83-111(1 989))。 G-CSF是由成纤维细胞、巨噬细胞、T细胞滋养层、内皮细胞以及上皮细胞产生的，并且是由定位于第17染色体上的四个外显子和五个内含子组成的单一拷贝基因的表达产物。该座位转录后产生可按不同方式进行加工的mRNA，从而产生两种形式的G-CSF mRNA，其中一种结构形式编码有177个氨基酸的蛋白质，另一种结构形式则编码有174个氨基酸的蛋白质(Nagata et al.，EMBO J 5：575-581(1986))，并且已经发现由174个氨基酸组成的蛋白质形式具有最大的体内特异性生物学活性。G-CSF具有种间交叉反应性，以致于当以人G-CSF对其他动物如小鼠，犬或猴给药时，可引起中性白细胞持续生成(Moore et al.，PNAS-USA 84：7134-7138(1987))。 
人G-CSF可由许多来源获得并纯化。天然的人G-CSF(nhG-CSF)可从经培养的人肿瘤细胞系的上清液中分离到。重组DNA技术的发展(例如参见美国专利USP 4,810,643(Souza)，列入本文作为参考文献)，使得已经可以大批量工业化生产出可作为商品销售的，作为真核宿主细胞表达产物的糖基化形式的G-CSF，以及作为原核宿主细胞表达产物的非糖基化形式的G-CSF。 
已经发现G-CSF可用于治疗一些增加中性白细胞对其有利的适应症。例如，对于癌症患者是有用的，因为它可用作为选择性刺激中性白细胞产生从而补偿由化疗或放疗引起的造血缺陷的手段。其他适应症包括治疗各种感染疾病和相关症状，如脓毒症(通常是由细菌代谢产物引起)。G-CSF还可单独或与其他化合物如其他细胞因子结合起来用于培养的，例如适于骨髓移植的细胞的生长或扩增。 
有关信号转换，即G-CSF影响细胞代谢的方式，目前还没有彻底弄清楚。G-CSF结合到一种细胞表面受体上，所述表面受体显然可以 引发特定祖细胞内的变化，导致细胞分化。 
已报道过各种经改变的G-CSF。通常，已知在设计药物时，某些改变能给结构带来某些影响。例如，缺失一个半胱氨酸可引起分子伸展开，而该分子在未变改状态时通常是依靠一个二硫桥键折迭的。还有其他已知方法可经加入、缺失或取代氨基酸而改变蛋白质的功能。 
已经有人制备出突变型人重组G-CSF，但是其制备方法并不包括总体结构/功能关系信息。例如，已经报道过对Cys 18的突变和生化修饰。(Kuga et al.，Biochem.Biophy.Res.Comm159：103-111(1989)；Lu et al.，Arch.Biochem.Biophys.268：81-92(1989))。 
在美国专利U.S.P.4,810,643号(发明名称为“多潜能粒细胞集落刺激因子”的制备(“production of pluriprotent Granulocyte Colony-Stimulating Factor”))中，总体上公开了G-CSF的多肽类似物和肽片段。所公开的特定G-CSF类似物包括那些在第17、36、42、64和74位上的半胱氨酸被另一种氨基酸(例如丝氨酸)所替代后的类似物(在174个氨基酸种类或者具有175个氨基酸种类中，额外的氨基酸是N末端蛋氨酸)，以及在第1位(N末端)有丙氨酸的G-CSF。 
发明名称为“经修饰的人G-CSF”的EP 0 335 423中公开报道了对具有hG-CSF活性的多肽的至少一个氨基的修饰。 
发明名称为“新的多肽”的EP 0 272 703中公开报道了在N末端或附近有一个氨基酸被取代或缺失的G-CSF衍生物。 
发明名称为“多肽”的EP 0 459 630中公开报道了天然存在的G-CSF的衍生物，此类衍生物具有天然存在的G-CSF的至少一种生物学 特性以及在浓度为5mg/ml时具有至少35％的溶液稳定性，所述衍生物至少是有天然序列的Cys17由Ser17残基所取代，以及天然序列的Asp27由Ser27残基所取代。 
发明名称为“G-CSF及其突变蛋白质的表达及其应用”的EP 0 256843中公开报道了一种编码G-CSF的经修饰的DNA序列，该序列的N末端被修饰，从而增加了蛋白质在重组宿主细胞中的表达，而并未改变该蛋白质的氨基酸序列。 
名称为“人G-CSF蛋白质表达”的EP 0 243 153中公开报道了通过将至少一种酵母KEX2蛋白酶加工位点失活而修饰的G-CSF，从而增加了用酵母进行重组生产时的产率。 
发明名称为“多肽的位点特异性匀质修饰”的Shaw的美国专利4,904,584公开报道了赖氨酸改变的蛋白质。 
WO/9012874公开报道了半胱氨酸改变的蛋白质变异体。 
名称为“改善活性的重组蛋白质”的澳大利亚专利申请No.AU-A-10948/92公开报道了在G-CSF分子的任一末端加上几个氨基酸，可以达到在原核表达后有助于分子折迭的目的。 
名称为“粒细胞集落刺激因子(G-CSF)突变蛋白”的澳大利亚专利申请No.AU-A-76380/91公开报道了粒细胞集落刺激因子G-CSF的突变蛋白，这些突变型蛋白质是在174个氨基酸的G-CSF的50-56位，以及在有177个氨基酸的G-CSF的第53-59位具有Leu-Gly-His-Ser-Leu-Gly-Ile序列，或/和是在有174个氨基酸的成熟G-CSF的第43，79，156和170位，或者在有177个氨基酸的成熟G-CSF的第46，82，159或173位上至少具有4个组氨酸残基之一。 
名称为“合成的人粒细胞集落刺激因子基因”的GB 2 213 821中公开报道了一种合成的编码G-CSF的核酸序列，该序列中掺入了限制性位点从而有助于在选定区域进行盒诱变，以及在该序列的侧冀加上了限制性位点从而有助于将该基因导入到预期的表达系统中。 
例如，EP 344,796中报道已将G-CSF结晶到某种程度，并且已经推测出G-CSF的大体结构，但仅仅是粗略水平的。(Bazan，Immunology Today 11：350-354(1990)；Parry et al.，J.Molecular Recognition  8：107-110(1988))。迄今为止，尚没有人报道过G-CSF的总体结构，以及对该分子的总体结构和功能进行系统研究，也没有人对G-CSF类似物的系统设计进行必要的研究。因此，需要有一种用于系统设计G-CSF类似物的方法，以及由此得到的组合物。 
发明概述 
目前已经将G-CSF的三维空间结构测定至原子水平。从该三维空间结构出发，现在技术人员能够以相当的可信度预测出在G-CSF分子的组成上发生变化后怎样导致结构的改变。这些结构上的特征可能与供设计和生产-CSF类似物所依据的生物学活性相关。 
虽然其他人已经推测G-CSF的三维空间结构(Bazan，Immunology Today 11：350-354(1990)；Parry et al.，J.MolecularRecognition  8：107-110(1988))，但这种推测对于制备G-CSF类似物的愿望没有任何帮助，这由于推测到的结构不正确(Parry等人，引文同上)，和/或因为推测出的结构没有详细地提供组成部分与结构的相互关系。本发明从原子水平上测出的三维空间结构是至今为止最完全的分析结果，并且为设计和制备G-CSF类似物提供了重要 信息。例如从本发明的三维空间结构分析结果出发，已经测出了精确的疏水和亲水区。 
相对疏水性十分重要，这是因为它直接关系到分子的稳定性。一般来说，存在于水相环境中的生物分子是外部亲水以及内部疏水的；根据热力学第二定律，这种情况是最低能量状态并且为分子提供了稳定性。虽然可能推测出G-CSF的内部核心应是疏水的，并且外部区域应是亲水的，但无法知道特定的疏水或亲水区。根据目前提供的关于疏水区/亲水区的知识，可以以相当的确信度推测G-CSF分子发生那种变化可影响到分子的总体结构。 
一般而言，专业人员可以利用有关疏水区和亲水区的布局的知识来设计总体G-CSF结构未发生变化，但如变化却确实影响生物学活性的类似物(这里所说的“生物学活性”是从最宽意义上指定其功能)。专业人员可以将生物活性与结构联系起来。如果结构不发生变化，并且突变对生物活性没有影响，那么这种突变没有生物学功能。但是如果结构未发生变化而突变影响了生物学活性，那么该残基(或原子)至少对一种生物学功能是必需的。本发明设计了一些操作实例，其中未改变总体结构，但生物学功能发生了变化。 
基于结构与生物学活性的相关性，本发明的一方面涉及G-CSF类似物。这些类似物是与G-CSF氨基酸序列相比具有更多、更少氨基酸残基，或者具有不同的或经修饰过的氨基酸残基的分子。修饰可以是一个或多个氨基酸残基的加入、取代或缺失。修饰可以包括类似物的本身氨基酸加入或取代，例如模拟肽，或者是具有改变部分如变化侧基的氨基酸的加入或取代。作为比较基础的G-CSF可以来源于人、动物或重组核酸技术(但本文公开的操作实例是基于重组生产的174个 氨基酸类型的人G-CSF，它有一个额外的N末端甲二磺酰残基)。该类似物具有不同于天然人G-CSF分子的功能，或者显示有同样功能，或有不同程序的相同功能，例如，可将类似物设计为具有更高或更低的生物活性，具有更长的存放期或者稳定性降低，更易于配制药剂，或者更难于与其他成分结合。这些类似物可能没有造血活性，因而可用作为抗G-CSF效果的拮抗剂(例如，在G-CSF过量产生时使用)。本文中为了方便起见有时将本发明的类似物称作蛋白质或肽，但本文中也考虑到其他类型的分子，例如模拟肽或化学修饰的肽。 
另一方面，本发明涉及含有G-CSF类似物作为活性成分的相关组合物。术语“相关组合物”在本文中是指一旦弄清G-CSF类似物的特性便可获得的组合物(例如用可检测标记物标记的G-CSF类似物，相应的受体或药物组合物)。相关的组合物也可以是G-CSF类似物的化学修饰的变体，例如至少已结合了一个聚乙二醇分子的类似物。 
例如，专业人员可以制备一种结合了可检测标记物的G-CSF类似物，其中标记物例如可以是荧光分子、化学发光分子或放射活性分子。 
另一个实例是利用已知材料，按已知技术配制的药物组合物(例如参见Remington′s Pharmaceutical Science，18th Ed.(1990，Mack Publishing Co.，Easton，Pennsylvania 18042)PP.1435-1712，引入本文作为参考文献)。通常，药物配方是由多种因素，例如给药方式、稳定性、生产方面原因以及其他因素决定的。G-CSF类似物可以经注射给药或者采用吸入法经肺给药。对于本发明的G-CSF类似物组合物，肠道剂量形式也可，因此口服给药有效。可将G-CSF类似物插入到脂质体或其他便于释放药物的微载体中释放，并可将G-CSF配制成凝胶或其他可以持久释放的组合物。虽然优选组 合物是随该组合物将要起的作用不同而不同，但通常对于具有天然G-CSF的至少一种生物学活性的G-CSF类似物而言，优选的药物组合物是那些适于皮下注射，或适于采用吸入法经肺给药的组合物，不过适于每种给药方式的特定配方将依据类似物的特性而定。 
相关组合物的另一个实例是本发明类似物的受体。本文使用的术语“受体”是指与本发明类似物分子选择性结合的部分。例如，抗体或其片段，或“重组抗体”(参见Huse et al.，Science  246：1275(1989))可用作受体。选择性结合并不仅指特异性结合(尽管本文中包括特异性结合受体)，但这种结合发生并非随机过程。受体可存在于细胞表面，或者细胞内或细胞外，并且可起着实现、抑制或定位本发明类似物生物学活性的作用。受体结合也可是与类似物本身间接相关的活性级联反应的激发机制。本文中还考虑了核酸，含有该核酸的载体以及含有编码这些受体之核酸的宿主细胞。 
所述相关组合物的另一个实例是有相连接之化学部分的G-CSF类似物。通常，化学修饰可以改变一种蛋白质的生物活性或抗原性，或者可以改变其他特性，熟练的实践者将考虑这些因素。如上面提到的，这种化学部分的一个实例是聚乙二醇，所述修饰作用包括增加一个或多个亲水或疏水聚合物分子、脂肪酸分子、或多糖分子。化学修饰物的例子包括聚乙二醇、烷基聚乙二醇、DI-聚(氨基酸)、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、吡喃共聚物、乙酸/酰化作用、丙酸、棕榈酸、硬脂酸、葡聚糖、羧甲基纤维素、支链淀粉或琼脂糖(参见，Francis，Focus on Growth Factors  3：4-10(1992年5月)由Mediscript，Mountview Court，Friern  Barnet Lane，London N20 OLD，UK出版)。化学修饰还可包括附加的蛋白质或 其部分、使用细胞毒性剂或抗体。化学修饰还包括使用卵磷脂。 
另一个方面，本发明涉及编码这些类似物的核酸。核酸可以是DNA或RNA或它们的衍生物，并且这种核酸被通常克隆到载体上并表达，所述载体例如是含有合适调节序列的噬菌体或质粒。例如为了诊断或预防目的，可对所述核酸进行标记(例如，使用一种放射活性、化学发光或荧光标记物)。可使核苷酸序列尽可能地完善以适于表达，例如含有适于细菌表达的优选密码子。本文也包括核酸和其互补链以及并不妨碍编码所需类似物的核酸的修饰形式。 
另一方面，本发明涉及含有编码上述本发明类似物之核酸的宿主细胞。所说的宿主细胞可以是真核或原核的，且表达系统可包括涉及与糖基(糖基化作用)结合(或者是抑制)、分子的适当折叠、前导序列或重组表达所遇到的其它因子的加入或缺失有关的额外步骤。 
另一方面，本发明涉及反意义核酸，该核酸具有妨碍或修饰所述核酸序列之表达类型或数量的作用。这些核酸都可以用已知方法制备。 
本发明的另一方面，可将编码本发明类似物的核酸用于基因治疗目的，例如通过将含有类似物编码序列的载体置于接受体中，这样该核酸本身可以在需要该类似物组合物的接受体中表达。首先将该载体量于运载体，例如一种细胞中，然后再将该运载体置于接受体中。所述表达可以在局部定位或者是全身表达。其它的运载体包括非天然的运载体，例如具有介导基因转移到接受体中作用的脂质体或其它微载体或颗粒。 
本发明还提供用于表达(例如视觉展示)G-CSF或其类似物三维空间结构的计算机程序，并进一步提供一种从原子水平上指示G-CSF分子各个构成部分的特性以及这些构成部分在总体结构内的精确位置 的计算机程序。下文中列出了该程序的一个实例。当前有许多适用于表达分子之三维空间结构的计算机程序。通常，这些程序将分子的三维空间结构的座标输入计算机(即，例如G-CSF分子的每个原子沿着X，Y和Z轴的数值分配)，提供表现(例如视觉展示)这些座标的手段，以及改变这些座标的手段和表示一个具有这样经改变的座标的分子的图象。专业人员可以将晶体结构信息(即G-CSF的各个原子在三维空间中定位的座标，其中这种座标从所述G-CSF分子晶体结构分析结果获得)编入这样的程序中，从而获得了用于表达(例如视觉展示)G-CSF三维空间结构的计算机程序。因此本发明还提供一种用于表现G-CSF类似物三维空间结构的计算机程序。优选的是可从Biosym，San Diego，California获得的带有如图5中输入中列出之座标的计算机程序Insight II，version 4。优选的表达方式是在Silicon Graphics 320 VGX计算机上进行的，该计算机带有晶体眼镜(也可从Silicon Graphics购得)，专业人员可利用该晶体眼镜观察G-CSF分子或其类似物的立体结构。另外，本发明的G-CSF结晶学座标和衍射数据也储存在蛋白质数据库(Chemistry Department，Brookhaven National Laboratory，Upton，New York 119723，USA)中。专业人员可以利用这些数据制备表现G-CSF分子或其类似物的三维空间结构的不同计算机程序。因此，本发明另一方面是一种用于表现G-CSF分子之三维空间结构的计算机程序。还提供了用于视觉展示G-CSF分子之三维空间结构的所述计算机程序：并进一步提供了具有改变这些视觉展示之手段的所述程序。进而还提供了用于表现所述计算机程序的设备，尤其是用于视觉展示G-CSF分子或其类似物之三维空间结构的计算机图象的设备，以及用于制备所述计算机程序 和仪器的方法。 
该计算机程序可用于制备G-CSF类似物，因为专业人员可在G-CSF分子上选择特定位点对其进行改动，并且很容易确定这种改变将会给G-CSF分子总体结构带来的影响。所述改动位点的选择将依据G-CSF类似物的所需生物学特性而定。如果随机改变所述的G-CSF分子(r-met-hu-G-CSF)，将有17520种替代可能性，甚至得到更多种具有多种改变、加入或缺失的类似物。通常观察三维空间结构(其中所述结构与该分子的组成有关)，变更位点的选择不再是一种随机过程，而可以合理地确定变更位点。 
如上所述，根据G-CSF三维空间结构的特性(包括原子水平上的每个构成部分的取代)，目前已经获得了有关维持G-CSF分子总体结构所必要之部分的信息。因此可以选择在制备本发明的G-CSF类似物时，是维持G-CSF分子的总体结构，还是(以及如何)改变G-CSF分子的总体结构。一旦已经制备了这样的类似物，就可以检测该类似物的所需特性。 
例如可以力求维持未变改的天然或重组G-CSF分子所具有的总体结构。该总体结构列于图2，3和4中并且将在下文中作详细描述。维持整体结构可以确保受体结合，即具有天然G-CSF之造血能力的类似物的必要特性(如果没有受体结合，该类似物存在也不会出现信号传导)。注意到有一类G-CSF类似物具有天然或重组(未改变的)G-CSF分子的三维核心结构，而又具有不同特性，例如有提高了的选择性刺激中性白细胞的能力。而另一类G-CSF类似物则具有不同的整体结构，该结构降低了G-CSF类似物分子结合到G-CSF受体上的能力，并且与未改变的天然或重组G-CSF相比，具有降低的选择性刺激中性白 细胞的能力。 
例如，目前已知G-CSF分子内部区域内哪部分是疏水的，以及相应地，在G-CSF分子的外部区域上哪部分是亲水的。在不了解总体三维空间结构，尤其是由本发明提供的原子水平三维结构的情况下，专业人员无法预测在疏水内部区域中发生何种变化将导致分子总体结构构型的变化。例如总体结构变化将导致功能变化，如丧失受体结构能力，从而降低了未改变之G-CSF的生物学活性。因此另一类G-CSF类似物是与未变改的天然或重组G-CSF具有相同疏水性的G-CSF类似物。更具体地说，另一类G-CSF类似物的内核心的四个螺旋束内具有相同的疏水部分与(未改变的)天然或重组G-CSF具有的那些疏水部分相同，但组成不同于所述未改变之天然或重组G-CSF。 
另一个实例涉及作为连接G-CSF分子之内部核心(螺旋)的结构的外部环。根据三维空间结构-包括涉及氨基酸残基空间位置的信息-专业人员可以预见特定环中不会导致总体构型的变化的某些改变。因此，本文提供的另一类G-CSF类似物具有改变的外部环但与(未改变的)天然或重组G-CSF具有相同总体结构。更具体地说，本文提供的另一类G-CSF类似物具有改变的外部环，所述环选自存在于螺旋A和B之间的、螺旋B和C之间的、螺旋C和D之间的、螺旋D和A之间的那些环，这些环和螺旋已在本文中认定。更具体地说，可通过使所述环稳定改变所说的环，特别是AB环和/或CD环，从而提高分子的半寿期。所述稳定化作用是将所有或部分所说的环连接到见于G-CSF(或类似物)分子的核中的α螺旋束的一部分上。这种连接可借助于β层、盐桥、二硫键、疏水作用或其它本领域内技术人员熟知的连接方式实现，其中所述连接方式具有稳定所述外部环的作用。例如， 专业人员可以将AB环连接到该分子内部区域的一条螺旋上而使AB或CD环得以稳定。 
也可以改变N末端而不使G-CSF分子的总体结构发生变化，因为N末端并不影响内部螺旋的结构稳定性，尽管优选对外部环进行修饰，但上述总的规则同样适用于N末端。 
另外，这样的外部环可以是进行化学修饰的位点，因为在(未改变的)天然或重组G-CSF中，所述环是相对柔曲的，并不易干扰受体结合。因此，可能存在用于直接结合化学部分(或者借助于用作化学连接工具的另一个化学部分间接联接)的另外空间。所述化学部分可选自各种各样适用于修饰G-CSF分子之一种或多种功能团的部分。例如，外部环可以提供适用于加入具有提高血清半衰期作用之一种或多种聚合物例如聚乙二醇分子加成的位点。聚合物用于提高血清半寿期。聚乙二醇分子可加上，其中对环进行改变使之含有额外的具有反应活性侧基的赖氨酸，从而聚乙二醇部分能与之连接。也可以将其它种类的化学部分结合到一个或多个外部环上，其中包括但并不限于其他生物活性分子，例如受体、其他治疗用蛋白质(例如形成杂合分子的其他造血因子)或细胞毒性剂(如白猴毒素)。这里列出的当然是不完全的；拥有所需化学部分的本领域内熟练技术人员将会有办法使所述需要部分连接到预期的外部环上。因此，另一类G-CSF类似物包括在外部环上至少有一处改变的那些类似物，其中所述改变为增加一个化学部分例如至少一个聚乙二醇分子作好了准备。 
在外部环上发生缺失，例如由适于降解该分子的蛋白质识别的位点的缺失，也可能是有效的。这种缺失的发生为提高具有G-CSF受体结合和信号传导能力(即选择性刺激中性白细胞成熟的能力)的分子 的半寿期提供了另一种手段。因此，另一类本发明G-CSF类似物包括那些在外部环上至少有一处变化的类似物，其中所述变化降低了蛋白质对所述类似物的转换。适于发生这种改变的优选的环是AB环和CD环。通过将外部环上存在的氨基酸残基的一部分缺失(在下文中将详细认定)可以制备一种缩短的G-CSF分子。所述缩短的G-CSF分子在制备方面或者在生物学功能特性上具有其他的优点。 
另一个实例涉及相互靠得很近的氨基酸残基之间的相对电荷。如上所述，G-CSF分子含有非常紧密地挤在一起的四条螺旋束。螺旋上的某些表面面对着其他螺旋。在一条螺旋面对另一螺旋的点(如一个残基)处，彼此面对面的两个氨基酸部分可具有相同的电荷，因此趋向于相互排斥，导致整个分子不稳定。可通过改变一个或两个氨基酸部分的电荷(变成反电荷或中性)而消除这一现象以致于没有排斥。因此，另一类G-CSF类似物包括那些为修饰因表面相互作用例如电荷定位所致之不稳定性而被改变的G-CSF类似物。 
另一方面，本发明涉及设计G-CSF类似物和相关组合物的方法及这些方法的产物。这些方法的终产物可以是上文中定义的G-CSF类似物或相关组合物。例如本文公开的实施例证明(a)G-CSF分子构成成份(即化学部分)的变化对G-CSF结构的影响，以及(b)结构改变对生物学功能的影响。因此，本发明的另一方面基本上是制备G-CSF类似物的方法，该方法包括下列步骤： 
(a)观察传达G-CSF分子三维空间结构的信息，其中该分子的化学成份例如各个氨基酸残基或者各个氨基酸残基的每个原子均与所述结构相互关联； 
(b)根据所述信息选择在G-CSF分子上进行改变的一个位点； 
(c)制备具有所述改变的G-CSF类似物分子； 
(d)检验所述G-CSF类似物分子的所需特性。 
可以利用本文中提供的用于计算机方法计算机程序来制备G-CSF类似物。因此，本发明的另一方面是一种基于计算机来制备G-CSF类似物的方法，包括下列步骤： 
(a)提供G-CSF分子之三维空间结构的计算机表达，其中G-CSF分子的化学成份例如每个氨基酸残基或每个氨基酸残基的每个原子都与所说结构相关； 
(b)根据所说的计算机表达，从G-CSF分子上选择一个进行改变的位点； 
(c)制备一种具有所述改变的G-CSF分子； 
(d)任选检验所述G-CSF分子的所需特性。 
更具体地说，本发明提供一种制备G-CSF类似物的方法，包括下列步骤： 
(a)通过计算机观察G-CSF分子的三维结构，所说的计算机已编制了程序以(1)表达G-CSF分子三维空间结构的座标系，以及(2)为改变所说的G-CSF表达而允许信息输入并对其进行观察； 
(b)在所述G-CSF分子的视觉影象上选定一个进行改变的位点； 
(c)将所述变化的信息输入所述计算机； 
(d)通过所说的计算机观察所述经改变的G-CSF分子的三维空间结构： 
(e)任选重复步骤(a)至(e)； 
(f)制备带有所述变化的G-CSF类似物； 
(g)任选检验所述G-CSF类似物的所需特性。 
另一个方面，本发明涉及使用本发明的G-CSF类似物及其相关组合物的方法，以及单独或与其它造血因子或药物合用在处理造血紊乱症中，以治疗和保护哺乳动物的方法。已考虑的是，设计G-CSF类似物的一个方面是增强或修饰已知未被修饰的G-CSF所具有的特性的目的。 
例如，本发明的类似物可具有增强的或经修饰的活性，所以，如果G-CSF可用于治疗(例如)中性白细胞减少症，那么本发明的组合物或方法也具有同样的用途。 
另一个实例是为了当将其与其它因子联合特定地用于治疗造血功能紊乱时具有更有效的作用而对G-CSF进行修饰。这种联合使用的一个实例是利用一种早期作用造血因子(即在造血过程的早期作用于未分化细胞的因子)以及同时使用或者逐一使用后期作用的造血因子例如G-CSF或其类似物(如在选择性刺激中性白细胞中G-CSF作用于CFU-GM谱系。也可以将本发明方法或组合物用于包含所述造血因子的结合物或“混合物”的治疗中。 
本发明的组合物或方法还可用于治疗白细胞减少、骨髓性白血病、严重的慢性中性白细胞减少症、再生障碍性贫血、糖元贮藏疾病、粘膜炎以及其它骨髓功能障碍。本发明的组合物和方法也可用于化疗或放疗引起的造血缺陷。通过应用本发明的组合物(蛋白质或用于基因治疗的核酸)或方法可以增进例如骨髓移植的成功率，或者将外周血液祖细胞用于移植。本发明的组合物或方法还可用于治疗感染性疾病，例如处理伤口愈合、烧伤治疗、菌血症、败血症、真菌感染、心内膜炎、骨髓炎以及腹部损伤有关的感染、对抗菌素无反应的感染、肺炎以及将本发明组合物或方法用于治疗细菌炎症也是有利的。另外，本 发明的组合物或方法可基于已报道过的促进白血病细胞分化的能力而用于治疗白血病。(Welte et al.，PNAS-USA 82：1526-1530(1985))。其它的用途包括利用本发明的组合物或方法，在有或没有与肿瘤细胞结合的受体(例如抗体)存在下，治疗肿瘤病人。肿瘤治疗的综述性文章可参见Lieshhke and Burgess，N.Engl.J.Med.327：28-34 and 99-106(1992)，两者均引入本文作为参考文献)。 
本发明的组合物和方法还可用作生产其它部分的中间体；例如已有报道G-CSF影响其它造血因子的产生并且借助于本发明的组合物和 
或方法可以提高或改变这种功能(如果已确定的话)。 
与本发明G-CSF类似物如受体相关的组合物可用作抑制G-CSF或类似物活性的拮抗剂。可以获得具有未改变的G-CSF或G-CSF类似物的某些或所有活性的组合物，并且可以加入一个或多个化学部分以改变了G-CSF或类似物的一种或多种特性。利用有关三维空间构象的知识，可以预测所述化学修饰的最佳布局位置，从而获得预期的效果。 
进行化学修饰的一般性目的可以包括改变半寿期(例如降低肾的免疫学或细胞内清除率)，改变生物学活性(例如改变酶催特性，解离生物活性或在有机溶剂中的活性)，降低毒性(例如去除毒性抗原决定基，区域化，以及选择性生物分布)，改变免疫反应性(降低免疫原性，降低抗原性或佐剂作用)，或改变物理特性(例如提高溶解性，改善热稳定性，改善机械稳定性或构型稳定化)(参见Francis，Focus On Growth Factors 3：4-10(May 1992)，由Mediscript，Mountview court，Friern Barnet lane，London N20 OLD，UK出版)。 
下文中的实施例是用于举例描述本发明而不是限制本发明，应该明白对本领域内技术人员而言可对其进行改变或修改，并且所附权利要求拟覆盖所有这样的等同的改变，这些改变均于所要求权利的本发明范围之内。 
附图的详细描述 
图1描述具有一个附加N末端蛋氨酸的有174个氨基酸的G-CSF的氨基酸序列。(Seq.ID NO.：1)(Seq ID No.：2)。 
图2是G-CSF，以及hGH pGH GM-CSF INF-β、IL-2和IL-4的晶体结构的拓扑图。这些图解是基于对所列参考文献的调查结果。所描述的二级结构元件的长度与残基的数目成比例。按照本文中用于G-CSF的方案标记出A，B，C和D螺旋。对于INF-β括弧内指出了螺旋原始标记。 
图3是G-CSF三维空间结构的“带状图”螺旋A是11-39位氨基酸残基(根据上文图1进行编号)，螺旋B是72-91位氨基酸残基，螺旋C是100-123位氨基酸残基，螺旋D是143-173位氨基酸残基。相对短的310螺旋是在45-48位氨基酸残基处，且α螺旋在48-53位氨基酸残基处93-95位残基几乎使一条左手螺旋形成一个转折。 
图4是G-CSF三维空间结构的“桶状”图。在不同的灰色阴影里显示了G-CSF三维空间结构的整个圆柱结构及其定位。数字表示上面图1所说的氨基酸残基位置。 
图5是用于产生G-CSF三维空间结构的计算机辅助的视觉影象的座标目录。下文中列出了这些座标，各栏对应于不同的区域： 
(i)区域1(从左手侧开始)是原子， 
(ii)区域2是指定的原子数， 
(iii)区域3是原子名称(根据周期表标准命名，CB是β碳原子，CG是α碳原子等等)； 
(iv)区域4是残基类型(根据例如Stryer，Biochemistry，3d Ed.，W.H.Freeman and Company，N.Y.1988(在封底中)描述的氨基酸三字母命名)； 
(v)区域5-7是原子的X轴，Y轴，和Z轴的位置； 
(vi)区域8(常为“1.00”)表示在该位置的占有率； 
(vii)区域9表示B因子： 
(viii)区域10表示分子命名。G-CSF的三种分子(命名为a、b、c)一起结晶为一个单位。a、b或c命名表示那个座标是来自于那一个分子。字母后面的数字(1，2或3)表示指定的氨基酸残基的位置，分子A具有指定的10-175位，分子B具有指定210-375位，分子c具有指定的410-575位。如此指定这些位置是为了使在一起形成晶体的三个分子中不会有重迭(“W”代表水)。 
图6是图解显示根据有关结晶过程中涉及的参数进行精制结晶基体的战略。该结晶基体相应于一个24孔组织培养平板的孔中结晶溶液中各种成分(盐、缓冲液和沉淀物)的终浓度。这些浓度是通过将适当体积的母液吸移到微滴板的孔中而计算出的。为了设计该基体，晶体学家选定该成份一个较高或较低浓度。可沿着点行(如A1-A6、B1-B6、C1-C6或D1-D6)或者沿着整个盘(A1-D1)用吸移管吸移这些较高和较低浓度溶液。前一方法可用于检测在有限数量孔中单一成份晶体生长的再现性，而后一方法更适用于起始筛选步骤。以三个平板做为代表描述了提炼结晶基体几个阶段的结 果。孔中阴暗部分增加表明阳性结晶结果，在最终阶段这种阳性结晶是X-射线级晶体，但在起始阶段可能是油状小滴粒状沉淀或小于约0.05毫米大小的微晶体。A部分代表起始筛选的一个参数，其中第一孔(A1)和最后一孔(D6)之间的浓度范围较大，并且孔之间浓度的增加按下式计算：(浓度A1)-(浓度D6))/23)。B部分代表在结晶基体精制的后面阶段A1-D6之间的浓度分布降低，导致每个平板上面形成更多的晶体。C部分代表基体精制的最后阶段，该阶段在平板的大多数孔中发现了优良晶体。 
本发明的详细描述 
本发明产生于对G-CSF三维空间结构的发现。借助提供立体视图的计算机程序显现了这种三维空间结构。通过体视观察已经设计出和制备出G-CSF类似物并且鉴定出结构-功能关系。 
G-CSF的总体三维空间结构
用于确定结构的G-CSF是一种非糖基化的174氨基酸G-CSF，它具有一个易于在细菌中表达的附加的N末端蛋氨酸残基。该G-CSF的DNA和氨基酸序列列于表1中。 
G-CSF的总体三维空间结构占优势的是螺旋结构，175个残基中的103个形成4-α螺旋束。仅有的其他二级结构见于前2条长螺旋之间的环中，其中4残基310螺旋后紧跟着一条6残基α螺旋。如图2中所示，将该总体结构与已报道的其他蛋白质：生长激素(Abdel-Meguid et al.，PNAS-USA 84：6434(1987)和Vos et al.，Science  255：305-312(1992))、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(Diederichs et al.，Science 254：1779-1782(1991)，干扰素-β(Senda et al.，EMBO J.11：3193-3201 (1992))、白细胞介素-2(Mckay Sciend 257：1673-1677(1992))以及白细胞介素-4(Powers et al.，Science 256：1673-1677(1992)，和Smith et al.，J.Mol.Biol.224：899-904(1992))的结构作了比较。尽管它们的氨基酸序列没有相似性，但这些生长因子之间表现有结构相似性。 
目前已知，该结构信息是与G-CSF的生物化学特性相关，并且可总结如下(该序列位置1是在N末端)： 
序列位置      结构描述        结果分析 
1-10          被延伸链        发生缺失未引起生物学活性丢失 
Cys18         部分被遮盖      与DTNB和水杨乙汞发生反应，但 
                              不与吲哚乙酸反应 
34            可供选用的      插入后降低了生物学活性 
              拼接位点 
20-47         螺旋A，第一个   基于中和抗体资料推测的受体结 
(包括首尾)    二硫键以及AB    合区 
              螺旋的一部分 
20，23，24    螺旋A           单个丙氨酸残基突变降低了生物 
                              学活性。推测的受体结合(位点B) 
165-175       羟基末端        缺失降低生物学活性 
(包括首尾) 
为了设计G-CSF类似物，将已从抗体结合研究(参见，Laytonet al.，Biochemistry  266：23815-23823(1991))中发现的这些生物化学信息附加到三维空间结构上。这些G-CSF类似物的设计，制备和检测描述于实施例1中。 
实施例1
该实施例描述晶体G-CSF的制备，通过计算机产生的影象，显现重组人G-CSF的三维空间结构，利用位点特异性诱变或核酸扩增方法、生物学检测法以及用于分析G-CSF类似物的HPLC分析法制备类似物，以及最后测出整体结构/功能关系。列出的所有出版物均引入本文作为参考文献。 
A.自动结晶的应用
对重组人粒细胞集落刺激因子(r-hu-G-CSF)之三维空间结构的需求，以及大批量纯化蛋白质的可获得性，产生了通过不完全的因子取样及籽晶播种而生长晶体的方法。以Jancarik和Kim(J.Appl.Crystallogr  24：409(1991))描述的不完全的因子结晶化方法开始，确定了产生小油滴双折射聚集体的溶液条件。也可将自动化吸移系统的软件和硬件进行修改使之每天产生大约400种不同的结晶条件(Weber，J.Appl Crystallogr  20：366-373(1987))。该方法产生一种结晶溶液，借以生产r-hu-G-CSF晶体。 
采用籽晶播种方法可以改善晶体的大小，再现性和特性，该方法中通过对籽晶溶液进行连续稀释来估测“成核起始单位”的数目。该方法可以再生性地生长2.0mm r-hu-G-CSF晶体。该晶体的空间基团是P21 21 21，具有a＝90 
Figure BYZ000000616560100221
b＝110 
Figure BYZ000000616560100222
和c＝49 
Figure BYZ000000616560100223
的晶格大小，并且他们衍射达到2.0 
Figure BYZ000000616560100224
的分辨率。 
1.总体方法学
为了探求一种新蛋白质的晶体化条件，Carter和Carter(J.Biol.Chem.254：122219-12223(1979))提出了不完全因子晶体化方法。他们提示对大量随机选定的，但通常是大概估测的结晶条 件进行抽样检查，可以将产生蛋白质结晶化的试剂成功地联合使用。这一主意是由Jancarik and Kim(J.Appl.Cystallogar.24：409(1991))提出的。他描述了32种用于起始结晶化试验的溶液，它们覆盖了一系列的pH和盐以及沉淀剂。本文中我们将他们提供的方法延伸到70种溶液的一个扩充实验系列。为了使人的劳动以及制备溶液时产生的差错降低到最低程度，我们将该方法编制了在自动化吸移机上应用的程序。 
按照Weber的连续自动化座标网搜寻(SAGS)方法(J.Cryst.Growth 90：318-324(1988))，可利用该智能系统制备一系剂溶液，利用这些溶液可连续地精化的温度，pH，盐和沉淀剂等结晶化条件。一旦测定出一种溶液可以重复地生长晶体，就开发出了一种可极大地提高晶体特性的籽晶播种技术。如将这些方法结合起来，可在几天内制备成百种衍射特性优良的晶体(晶体衍射率至少约为2.5 
Figure BYZ000000616560100231
较好具有至少低于2 
Figure BYZ000000616560100232
的衍射率，并且更好是具有约1 
Figure BYZ000000616560100233
的衍射率)。 
通常，可用于任何一种人的希望其结晶的蛋白质的晶体化方法都包括下列步骤： 
(a)将所需蛋白质的等分含水样品与(1)一种盐溶液的等分样品合并(其中每份等分样品具有不同的盐浓度)，或者与(ii)一种沉淀剂溶液的等分样品(每份样品具有不同的沉淀剂浓度)合并，其中各合并的等分样品可在一系列pH条件下进行合并； 
(b)观察所述合并之样品中预品质的形成情况，选择所述盐或沉淀剂结合物，以及能有效地产生预晶质形形的所述pH，或者，如果没有产生预晶质形式，则提高所述蛋白质含水等分样品中蛋白质的起始浓度； 
(c)在选定所说的盐或沉淀剂浓度后，在所述选定浓度下用先前未选择的溶液重复步骤(a)； 
(d)重复步骤(b)和步骤(a)，直到获得有所需特性的晶体。 
上述方法还可实现自动化，从而大大地节省时间和劳力。优选的蛋白质起始浓度是在100mg/ml和20mg/ml之间，但是该起始浓度也随不同的蛋白质而变化(下文中对G-CSF分析时使用33mg/ml的起始浓度)。开始分析时优选的盐溶液浓度是0-2.5M(Nacl)。优选的沉淀剂是聚乙二醇8000，但是，其他可用的沉淀剂包括有机溶剂(如乙醇)，具有500-20,000分子量范围的聚乙二醇分子，以及其他本领域已知的沉淀剂。优选的pH范围是pH 4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5以及9.0。预晶质形式包括油状，双折射沉淀，微晶体(＜约0.05mm)，中等晶体(约0.05-0.5mm)以及大晶体(＞约0.5mm)。等待看到晶质结晶所需的时间较好为48小时，但1周的观察时间也是优选的，并且通常是在约一个月后观察到，可以利用不同的蛋白质浓度(通常提高蛋白质浓度)。优选的是利用改进的Accuflex系统来自动地完成结晶。优选的自动化参数如下文所述。 
通常，将浓度在10mg/ml和20mg/ml之间的蛋白质与0-2.5M之间的一系列NaCl溶液合并，并且每种结合方式是在上述浓度范围内完成的(分别完成)。一旦观察到预晶体结构，就在分开的独立试验中使盐浓度和pH范围最佳化，直到获得所需晶体质量。接着，在不同的pH值条件下也将沉淀剂浓度调至最佳。当两者都达到最佳化后，立即执行最适条件以获得所需结果(列于图6)。 
a.自动吸移系统的实施
采用Accuflex吸移系统(ICN Pharmaceuticals，Costa MesaCA)制备滴剂和贮存溶液，所述系统是由个人计算机控制的，该计算机通过一个标准的系列界面输送ASCII码。借助于一个转动的阀门，该吸移器采取六种不同的溶液样品并将这些溶液吸移到一个平板上，可以控制该平板转译在X-Y座标系中。系统的垂直部件操纵一个注射器，该注射器既能分散液体又能收回液体。 
装配在Accuflex上的软件是基于由Cox和Weber(J.Appl.Crystallogr.20：366-373(1987))提议的SAGS方法。该方法包括两个主要结晶参数即pH和沉淀剂浓度的系统变化，其考虑到两个其他参数的变化。虽然是建立这些概念之上，但在设计和实施在自动化栅网搜寻战略中使用的结晶化溶液提取程序时，本文所使用的软件提供了更大的灵活性。由于存在这种灵活性，本发明的软件也能创制更大数目的不同溶液。这对于实施下一节中描述的不完全因子方法是必要的。 
为了改进自动化座标网络搜寻方案的速度和设计，Accuflex吸移系统需要改良的软件和硬件。硬件变化后允许使用两个不同的微滴定盘，(一个盘用于供给液滴，一个盘用于搁置液滴实验)以及一个装有24种附加的缓冲液，盐和沉淀剂溶液的Plexiglas盘。这些附加的溶液扩充了能被观察的结晶状况的座标网络。 
为了使用经改变的硬件，用二条子程序书写该吸移软件；晶体学家可以利用一条主程度、一条子程度，根据其各个成份的浓度设计一种结晶溶液基体，利用第二条子程度可将这些溶液浓度转译为计算机符码，以指令将适当体积的溶液吸移到结晶盘中。利用两个程序中的 一个程度即可产生溶液基体。第一个程序(MRF，available from Amgen.Inc.，Thousand Oaks，CA)是指由晶体学家提供贮存液浓度的目录，以及计算出达到指定的浓度所需吸移的体积。第二种方法是优选的，该方法引入了一个扩展片层程度(Lotus)，该程序可用于制得更多高级的沉淀剂或p H梯度。由该控制程序(SUX，对原存在于Accuflex吸移器中一个程序的改进，可从Amgen，Inc.，Thousand Oaks，CA购买)翻译由上述程序之一产生的浓度，并因而充满了所有的孔。 
b.不完全因子方法的实施
用于制备多种溶液的改良的吸移系统便于改善扩展的不完全因子方法的实施；利用INFAC程序(Carter et al.，J.Cryst.Grouth 90：60-73(1988))可以开发一套具有“随机”成份的新的结晶溶液，该程序产生了含有3个变量中1个因子的96种随机结合物的名单。将立即沉淀的钙和磷酸的结合物除去，留下沉淀剂、盐和缓冲液的70种不同的结合物。利用自动化吸移器可以制备这些结合物并保温一周。检查这些混和物用较低浓度的这些成份再一次制备形成沉淀剂的溶液。重复这一步骤，直到所有的孔清除了沉淀剂。 
c.r-hu-G-CSF的结晶
用几种不同的结晶方案寻找一种产生X-射线级晶体的溶液。这些方案包括使用不完全因子方法，利用连续的自动化网络搜寻系统(SAGS)弄精确清结晶条件，籽晶播种技术的实施以及过夜产生成百个优等晶体的晶体制备方案的研制。除非另有说明，否则r-hu-G-CSF晶体的筛选和生产均利用悬滴蒸气扩散法(Afinsen et al.，physical principles of protein erystallination In： Eisenberg(ed.)，Advances in protein chemistry 41：1-33(1991))。 
初始筛选r-hu-G-CSF的结晶条件使用了Jancarik andKim(J.Appl.crystallogr.24：409(1991))的不完全因子方法，该方法产生了几种导致“预结晶”结果的溶液。这些结果包括双折射沉淀剂、油和微小晶体(＜0.05mm)。然后可用这些预结晶溶液作为系统化筛选的起始点。 
该筛选方法需要研制结晶化基体。这些基体对应于结晶溶液中各成份的浓度，是使用基于扩展片层LotusTM的IBM-PC制备并且是用经改良的Accuflet吸移系统完成的。设计基体使用的战略是当保持其它条件如pH不变，并且使沉淀剂浓度恒定时改变一种结晶条件(例如盐浓度)。在筛选开始时，变化的条件的深度范围大，但继后连续地弄精确该浓度，直到微滴盘中所有孔都产生相同的结晶效果。地这些结果分别作如下记录：晶体，双折射沉淀物，粒状沉淀物，小油滴以及非结晶团块。如果结晶参数的浓度没有产生至少一种沉淀剂，则提高该参数的浓度直到形成一种沉淀剂。在每个盘产生沉淀后，将其静止放置至少两天，然后检查晶体生长。在该最初筛选三天之后，对这些盘每周检查一次。 
根据该筛选方法的结果，鉴定出两种具有相同pH和沉淀剂，但盐不同(NaCl，LiSO4)的产生小晶体(0.1×0.05×0.05mm)的单独溶液。根据这些结果，产生了一系列新的浓度基体，其相对LiSO4而使用不同的MgCl，同时使其它结晶参数保持不变。这一系列实验导致鉴定出一种可在三周内产生衍射级晶体(＞0.5mm)的溶液。为了寻找这种结晶生长溶液(100mM Mes pH5.8，380mM MgCl2，220mM LiSO4和8％PEG 8K)，已经筛选了大约8000种条件，消耗了大约300mg蛋白质。 
晶体的大小是由每滴形成的晶体的数目决定的。通常形成3-5个平均大小为1.0×0.7×0.7mm的晶体。根据是否进行籽晶播种(见下文)获得两种形态学，其具有相同的空间基团(P21 21 21)以及单位晶格大小a＝90.2，b＝110.2，c＝49.5。没有籽晶播种时，r-hu-G-CSF晶体具有一个长的平坦表面和圆的边缘。 
当使用籽晶播种时，在4-6小时内，在该滴中观察到有尖锐表面的晶体(0.05×0.05×0.05mm)。在24小时内，晶体已经生长至0.7×0.7×0.7mm，并且根据该滴中形成的晶体数继续生长至2mm以上。 
d.籽晶播种和成核起始位点的确定
本文提供的用于籽晶播种的方法，在所使用的每个孔中确定了许多成核起始位点(在已确定了最佳晶体生长条件之后)。该方法的优点是“种子”的数目影响晶体的质量，并且因此影响分辨的程度。该籽晶接种还提供了下述优点，即在有籽晶时大约3天内生成G-CSF晶体，在没有籽晶时，该晶体的生长大约需要3周。 
在一系列生长过程之后(见方法部分)，在一夜之间产生了密集的小而完好的晶体“阵雨”(＜0.01×0.01×0.01mm)。结晶条件如上文所述，不同的是以前使用过的吸管头又被重新使用。可以推测，晶体“阵雨”是由在所使用的吸管头中形成的小的成核单位引起的，并且这些小成核单位为晶体提供了成核位点。在标准生产生长条件下，向一个新的滴中加入少量(0.5μl)含有晶体“雨”的微滴，过夜即产生了晶体“阵雨”，利用该方法生产了几盘含有晶体雨的微粒，我 们称之为“晶种原液”。 
对存在于“晶种原液”中的成核起始单位(NIU)的数目进行评估，以试图提高r-hu-G-CSF晶体的重现性和质量。为了确定“晶种原液”中NIU的数目，在96孔微滴板上将微滴的等分样品进行一系列稀释。向每孔中加入50μl含有等体积r-hu-G-CSF(33mg/ml)和晶体生长溶液(如上文所述)制备该微量滴定板。将一种“晶种原液”微滴的样品(3μl)转移至微量滴定板的第一个孔中，将该孔中的溶液混合，然后将3μl转移至该微量滴定板同一排的邻近孔中。用相同的方法制备该微量滴定板中每一排的孔，然后用塑料带将该盘密封。过夜，在微量滴定板各个孔的底部形成了微晶体，各个孔中晶体的数目与原始的“晶种原液”的稀释度相关。为了制备大的单个晶体，将“晶种原液”滴适当地稀释到新鲜CGS中，然后将含有NIU的该溶液等分样品转移到微滴中。 
一旦结晶条件达到最佳化后，即可按生产方法生长晶体，在该方法中将CGS和r-hu-G-CSF(33mg/ml)各3ml混合，制备5个盘(每个盘有24个孔)。该方法包括制备以升为体积单位的精确结晶溶液，将该溶液与蛋白质混合后，将该蛋白质/结晶溶液置于悬滴盘或凝溶盘中，通常该方法在约5天内产生100-300个优质晶体(＞0.5mm)。 
e.实验方法
材料
以具有表1中所述氨基酸序列，比活性为1.0+/-0.6×108U/mg(用细胞有丝分裂检测法测得)，溶于10mM乙酸盐缓冲液，pH4.0中的浓度约为3mg/ml的r-hu-met-G-CSF作为起始 材料以获得晶体结构信息。利用Amicon浓缩器，以75psi和YM10过滤器将该溶液浓缩。通常在4℃时将该溶液浓缩10倍，并贮存几个月。 
起始筛选步骤
以使用悬滴的蒸汽一扩散平衡法获得适用于X-射线分析的晶体。为了进行初步筛选试验，将7μl浓度为33mg/ml的蛋白质溶液(如上制备的)与等体积的孔溶液混合，置于硅化玻璃板上，利用Linbro组织培养平板(Flow Laboratories，McLean，Va)将其悬浮分散在孔溶液上。所有吸移过程都是用Accuflex吸移管完成的，但是，在孔溶液制备后从自动化吸移器上移走这些盘，并用桌面振荡器彻底混合至少10分钟。然后将Linbro盘送回吸移器上，并由该吸移器将孔和蛋白质溶液加入到硅化盖玻片上。然后将盖玻片倒置，用硅化油脂将其密封于1ml孔溶液中。 
该自动化结晶系统的部件如下。基于其各成分的浓度，用PC-DOS计算机系统设计结晶溶液的基体。用Lotus扩散片层(如上文所述)的MRF产生这些基体。这些程序的终产品是一个资料档案。该档案包括用SUX程序吸移适当体积的贮存溶液从而为获得基体中所述浓度所必需的信息。将该SUX程序信息传递给一系列的I/O端口，并用于命令Accuflex吸移系统，相对贮存溶液的阀门位置，待回收溶液的量、以及然后吸移到微滴板的孔中时每个孔的X-Y位置(每个孔的列/排)。将加入信息传递给吸移管，其包括在充填过程中喷射器Z的位置(高度)以及在不同溶液充填的间隔期内该系统停止后清洗喷射器时的排水管位置。将24孔微量滴定板(Linbro或Cryschem)和盖玻片托架置于一个可在X-Y平面上移动的板上。该板的移动可以使 吸移管将喷射器定位，从而将溶液吸移到孔中，它也能够将盖玻片和小瓶定位，并从这些来源提取溶液。在吸移以前，Linbro微量滴定板有一个涂在孔边缘上的油脂薄层。在孔中制备结晶溶液之后以及再将它们转移到盖玻片上之前，从吸移系统中移走微量滴定板，并使溶液在桌面振荡器中混合10分钟。混合后将孔中溶液或者转移至盖玻片上(悬滴方法的情况下)或者转移至孔的中间位置(在定滴方法的情况下)。从小瓶中提取蛋白质并加到含有孔溶液的载玻片微滴上(或加到中间位置上)。用塑料带贴在Cryschem板的顶部，以密封所有的孔。 
生产生长
一旦将结晶条件最佳化后，即可利用一种“生产”方法完成晶体生长。制备一升量的结晶溶液，该溶液含有100mM Mes.pH 5.8，380mM MgCl2，220mM LiSO4，以及8％PEG 8K。利用一个Eppindorf注射器吸移管，向Linbro板的各个孔中吸移1ml的该溶液。将含有50％该溶液和50％G-CSF(33mg/l)的溶液混合并吸移到硅化盖玻片上。这些滴的典型体积为50-100μl之间并且由于这些滴的体积较大，在轻弹载玻片和将滴悬浮于孔中时要加倍小心。 
数据收集
利用X-pLOR(Bruniger，X-PLOR version 3.0，A System for crystallography and NMR，Yale University，New Haven CT)，对着在R-AXIS(Molecular Structure，crop.Houston.TX)影像平板监视器上收集到的2.2 数据精细研究该结构。 
f.研究评价
作为一种有效的重组人治疗剂，已经大批量制备了r-hu-G-CSF，并可得到其用于结构分析的克水平量的产品。当其他目的蛋白质可以使用时，本文中提供的结晶方法也可找到其他用途。该方法可用于已有大量蛋白质(约＞200mg)的任何晶体学项目。本领域内的技术人员将认识到可以对本发明的材料和方法进行修改，并且同样的材料和方法可用于其他蛋白质的结晶。 
B.用于观察G-CSF三维空间结构的计算机程序
虽然本文附图中描述的图像可用于显示G-CSF的三维空间结构，但较好是使用允许立体观察该分子的计算机程序这种体视观察方法或者有时本领域技术人员所指的“虚拟真实性”，使我们可以从各个角度，在很宽的分辨率范围内，从大分子结构到原子水平，观察三维空间结构。利用本文中所说的计算机程序还可以例如通过旋转该分子，改变分子的观察角度。预期程序还对这样一些变化有反映，以便使我们例如缺失、加入，或取代一个或多个原子的影象，包括整个氨基酸残基，或者向已存在的或取代的基团上加上化学部分，并观察结构的变化。 
也可使用其它基于计算机的系统；其元件包括：(a)一处输入信息的工具，例如G-CSF三维空间结构的正交座标或其它的指定数字的座标：(b)用于表达这种座标的工具，例如观察工具，借以使我们可以观察三维空间结构以及观察这种三维空间结构与G-CSF分子组成例如氨基酸组成的关系；(c)可根据需要加有输入信息的工具，该信息可以改变所表达的G-CSF分子的组成，以使这种三维空间结构的图像能展示已变化的组成。 
图5中列出了所使用的优选计算机程序的座标。该优选的程序是Insight II，版本4，从San Diego CA的Biosym购得。对于晶体的粗结构，所观察到的衍射数据的强度(“F-obs”)以及正交座标也寄存于Protein Data Bank，Chemistry Department，Brookhaven National Laboratory Upton，New York 119723，USA，这些文献都引入本文做为参考文献。 
一旦将该座标输入到Insight II程序，就可以很容易在计算机屏幕上显示典型的G-CSF三维空间结构用于显示的优选的计算机系统是Silicon Graphics 320 VGX(San Diego，CA)，为进行体视观察，可以带上一个眼罩(Crystal Eyes，Silicon Graphics)，借以观察G-CSF分子的三维立体结构，这样可以转动该分子并预想分子设计。 
因此，本发明提供了在计算机帮助下设计或制备G-CSF类似物的方法，该方法包括：(a)给所述计算机装备用于显示G-CSF三维空间结构的工具，包括显示所述G-CSF分子的各部分的组成，优选的是显示各个氨基酸的三维空间位置，更优选的是显示G-CSF分子之每个原子的三维空间位置； 
(b)观察所说的展示图； 
(c)在所说展示图上选定一个位点，在该位点处改变所说分子的组成或一种部分的位置；以及 
(d)制备具有所说变化的G-CSF类似物。 
可根据终产物G-CSF类似物的所需结构的特征选择所需变化，在下文中详细描述了完成预期设计时的种种考虑，这些考虑包括疏水氨基酸残基尤其是G-CSF分子螺旋内部之残基的位置和组成，当对这些 残基进行更改时可以改变该分子内核的整个结构并阻止受体结合；还包括外部环结构的位置和组成，但其改变不会影响G-CSF分子整体结构的变化。 
图2-4以不同的方式描述了整体三维空间构型。拓扑图，带状图和桶状图都描述G-CSF的构象。 
图2图解说明对G-CSF或其他分子的比较。虽然这些生长因子在其环和束状几何结构中有不同的局部构象，但它们具有结构的相似性。在所有6个分子中，尽管其氨基酸序列不同，但仍保留了有两个长交叉联接的上-上-下-下的拓扑学结构。 
图3更详细图解描述了重组人G-CSF的二级结构。该带状图描述了螺旋的旋向性及其彼此间的相对位置。 
图4以不同的方式图解描述了重组人G-CSF的构象。该“桶状”图描述了重组人G-CSF的整体结构。 
C.利用M13诱变法制备类似物
该实施例涉及利用有单链噬菌体M13参予的位点特异性诱变技术制备G-CSF类似物，所述诱变采用PCT专利申请No.WO 80/00817公开的方法(Souza等人，1985年2月28日公开，引入本文作为参考)完成。该方法基本上包括利用非诱变序列单链核酸模板，并将该模板连接到一个在其序列中含有所需变化的更小的寡核苷酸上。所采用的杂交条件应允许非相同序列进行杂交，并将留下的序列填平，使之与原始模板相同。其结果是得到一条双链分子，该分子的两条链中有一条含有所需变化。将该经诱变的单链分离出来，并将其本身用作其互补链的模板。这样就产生了一条具有所需变化的双链分子。 
所使用的原始G-CSF核酸序列列于图1中，并且将含有被诱变核 酸的寡核苷酸列于表2中。本文中使用的有关氨基酸和核苷酸的缩写形式都是本领域内常规使用(参见Stryer，Biochemistry，3dEd.，W.H.Freeman and Company，N.Y.，1988，封底)。 
首先将该原始G-CSF核酸序列置于载体M13mp21中。然后从含有原始G-CSF序列的单链噬菌体M13mp21分离DNA，并重新悬浮于水中。对于每一反应，将200ng的该DNA与1.5pmo l磷酸化寡核苷酸(表2)混合并悬于0.1m Tris 0.01M  MgCl2，0.005M DTT，0.1mM ATP，pH 8.0中。经加热到65℃并缓慢地冷却到室温而使DNA退火。 
一旦冷却后，向溶于0.1M Tris，0.025M NaCl，0.01M Mgcl2，0.01M DTT，pH7.5中的1个单位退火DNA中加入各为0.5mM的ATP、dATP、dCTP、dGTP、TTP、以及1个单位T4DNA连接酶和1单位大肠杆菌聚合酶I的Klenow片段。 
现在将该双链闭合环状DNA不经进一步纯化用于转染大肠杆菌。对噬菌斑进行筛选，方法是用硝酸纤维素滤膜将噬菌斑影印移出，然后将该滤膜与末端用P32标记的单链DNA在55-60℃下杂交1小时。杂交完成后，在低于寡聚物熔融温度(对于A-T为2℃，对于G-C为4℃)的0-3℃下洗涤该滤膜，该滤膜选择性地留下放射自显影信号，所说的信号相当于含有突变序列之噬菌体产生的噬菌斑。阳性克隆进一步通过测序得以证实。 
下面列出的是在以M13诱变方法制备各种G-CSF类似物时使用的寡核苷酸。其命名表示原始氨基酸的残基和位置(例如，第17位的赖氨酸)，以及替代氨基酸的残基和位置(例如精氨酸17)。右上角的记号表示涉及一个以上残基的替代，在所标明的位置之间以逗号或分号指示不同残基。对未发生取代的缺失也作如此注释。旁边表 示的是在基于M13的诱变方法中使用的寡聚核苷酸序列；这些寡核苷酸理用合成方法制备的，但制备方法不是关键的，可以使用任何核酸合成方法和/或设备。寡聚物长度也已指明。如上文所述，将这些寡聚物与单链噬菌体载体接触，然后加入单链核苷酸制备完整的G-CSF类似物核酸序列。 
Figure BYZ000000616560100371
Figure BYZ000000616560100381
Figure BYZ000000616560100391
Figure BYZ000000616560100401
D.利用DNA扩增法制备G-CSF类似物
本实施例涉及利用DNA扩增技术制备G-CSF类似法的方法。基本上是将编码每种类似物的DNA作为二个分离的片段扩增，结合在一起，然后再扩增该总序列本身。依据在原始G-CSF DNA上发生所需变化的位置，使用内部引物以引入改变，并产生二个分立的扩增片段。例如，为了扩增所需DNA类似物的5′末端，在该待扩增区域的一个末端使用一个5′侧翼引物(与G-CSF原始DNA上游的质粒序列互补)并且利用一个能够与原始DNA杂交，但掺入了所需改变的内部引物，在另一末端引发扩增。得到的扩增区域覆盖了从5′侧引物直至通过内部引物的整个部分。用同样方法完成3′末端扩增，即利用一个3′侧翼引物(与G-CSF原始DNA下游的质粒序列互补)和一个与准备进行突变之区域互补的内部引物。一旦将两个“半部分”(其大小可能相等也可能不相等；须依据内部引物的位置而定)扩增后，即将两个“半部分”相连接。连接后，即用5′侧翼引物和3′侧翼引物扩增含有所需改变的整个序列。 
如果需要一处以上的改变，则可修改上述方法，以将“改变”引入到内部引物中，或者利用不同的内部引物重复该方法。另外，可将基因扩增方法与用于在核酸序列中制造“改变”的其他方法，如上文中描述的基于噬菌体的诱变技术一起使用。下文中将描述制备具有一个以上“改变”之类似物的方法实例。 
为了制备下文中描述的G-CSF类似物，使用的模板DNA是列于图1的序列再加上某些侧翼引物区域(来自于含有G-CSF编码区的质粒)。这些侧翼区可用作5′和3′侧翼引物并列示如下。扩增反应是在含有10mM Tris-HCl，1.5mM MgCl2，50mM KCl，0.1mg/ml明胶， pH 8.3中，20℃下以40μl总体积完成的。此40μl反应混合物还含有各为0.1mM的各种dNTP，10pmales的各种引物，以及1ng的模板DNA。每个扩增反应都重复15次循环。每次循环包括在94℃进行0.5分钟，在50℃进行0.5分钟，在72℃进行0.75分钟。侧翼引物的长度为20个核苷酸，内部引物的长度为20-25个核苷酸。产生了多拷贝双链DNA，每个DNA编码所需G-CSF类似物的前面部分或者后面部分。 
为了将两个“半部分”结合在一起，将两种反应混合物的各1/40体积合并在一起进行第三个DNA扩增反应。使两部分在内部引物位点处退火，因其带有突变的末端是互补的，并且接着进行一次聚合化循环，从而产生了全长度的DNA序列。一旦这样退火后，即利用5′和3′侧翼引物扩增整个类似物。按上文所述将整个扩增过程重复15次。 
用XbaI和XhoI限制性核酸内切酶切割该完整的、扩增得到的DNA类似物序列，产生了适用于插入一种载体中的粘性末端。将切割后的DNA置于质粒载体中，并用该载体转化大肠杆菌。用50μg/ml的卡那霉素攻击转化体，并在30℃下培养。对余细胞溶胞产物进行聚丙烯凝胶电泳以证实G-CSF类似物的产生。分析从生产分离物中纯化到之质粒的DNA序列，证实所需突变的存在。然后使这些培养物生长，并收集细胞，按下述方法纯化G-CSF类似物。 
下面表3中列出了在基因扩增法中用于制备每种类似物时使用的特异性引物。 
表3 
Figure BYZ000000616560100431
表3(续) 
1.双突变的构建 
为了制备G-CSF类似物Gln12 12→Glu12 12，单独完成两个DNA扩增过程，从而产生两个DNA突变。使用的模板DNA是表1所述序列加上 特定的侧翼区(来自于含有G-CSF编码区的质粒)。下面列出的精确的序列。两DNA扩增反应都是用Perkin Elmer/Cetus DNA热循环仪完成的。40μl反应混合物含有1×PCR缓冲液(Cetus)、各0.2mM4种dXTPs(Cetus)，各50pmoles的各种引物寡核苷酸、2ng G-CSF模板DNA(在质粒载体上)、以及1单位Taq聚合酶(Cetus)。将该扩增过程进行30次循环。每次循环包括在90℃进行1分钟、在50℃进行2分钟、在72℃进行3分钟。 
DNA扩增“A”使用下列寡核苷酸： 
5′CCACTGGCGGTGATACTGAGC 3′(Seq.ID 63)和 
5′AGCAGAAAGCTTTCCGGCAGAGAAGAAGCAGGA 3′(Seq.ID 64) 
DNA扩增“B”使用下列寡核苷酸： 
5′GCCGCAAAGCTTTCTGCTGAAATGTCTGGAAGAGGTTCGTAAAATCCAGGGTGA 3′(Seq.ID 65)和 
5′CTGGAATGCAGAAGCAAATGCCGGCATAGCACCTTCAGTCGGTTGCAGAGCTGGTGCCA 3′(Seq.ID 66) 
从DNA扩增“A”之后获得的109个碱基对双链DNA产物中，切掉含64个碱基对的XbaI-Hind III DNA片段，并且分离出该含有DNA突变Gln12→Glu12的片段。从DNA扩增“B”之后获得的含509个碱基对的双链DNA产物中，切掉含197个碱基对的Hind III-Bsm I DNA片段，并分离出该含有DNA突变Gln 21→Glu21的片段。 
将“A、和“B”片段与一个含4.8kb的Xba I-BsmI DNA质粒载体片段连接在一起。连接混合物由等摩尔的DNA限制性片段、连接缓冲液(25mM Tris-HCl pH7.8，10mM MgCl2，2mM DTT，0.5mM rATP，以及100μg/ml BSA)以及T4 DNA连接酶组成，并将其在14℃保温过夜。然后用Bio Rad Gene Pulsar仪(BioRad， Richmond，CA)以电穿孔方法将连接后的DNA转化到大肠杆菌FM5细胞中。分离出一个克隆，采用DNA测序法证明该质粒构建体含有两个突变位点。该“中间体”载体还缺失了一个193碱基对的BsmI-BsmI DNA片段。从该中间体载体上切割和分离出一个2kb的SstI-BamHI DNA片段，从该质粒载体上切割和分离出一个2.8kbp的SstI-EcoRI DNA片段，从该质粒上切割和分离出一个360bp的BamHI-EcoRI DNA片段，连接这些DNA片段并转化(按上述方法)而构建成最后的质粒载体。对G-CSF基因进行DNA测序，验证最后的构建体。使培养物生长，收获细胞，并按下述方法纯化G-CSF类似物。 
如上所述，将诱变技术结合起来使用，可以产生具有一个或多个突变位点的G-CSF类似物核酸(以及表达产物)。上面举例描述的两个实例使用了基于M13的诱变技术和基于基因扩增的诱变技术。 
E.G-CSF类似物DNA的表达
然后将G-CSF类似物DNA置于质粒载体中并用于转化大肠杆菌FM5菌侏(ATCC 53911)。包含于质粒上并存在于细胞宿主细胞中的本发明的G-CSF类似物DNA可从美国典型培养物保藏中心，Rockville，MD购买，其保藏号列于下文中。 
于30℃，使1升培养物生长在含有10克胰蛋白胨、5克酵母提取物以及5克NaCl的肉汤中，直到在A600处光密度达到0.5，此时将其快速加热到42℃。将培养瓶继续振荡3小时。 
还可以用其他的原核或真核宿主细胞，例如其他的细菌细胞、菌株或菌种、培养的哺乳动物细胞(COS，CHO或其他类型)、昆虫细胞或多细胞器官或有机体，或植物细胞或多细胞器官或有机体，并且熟练的技术人员都知道那些宿主细胞是适用的。也可用合成方法，例如 固相肽合成方法或其他化学制备技术制备。本发明的G-CSF类似物及其相关组合物。对于本领域内技术人员来说，使用其他的克隆和表达系统将是显而易见的。 
F.G-CSF类似物蛋白质的纯化
离心(10,000xg，20分钟，4℃)收集细胞。将细胞团块(通常5克)悬浮于30ml的1mM  DTT中，并使其在有10,000psi的French细胞压榨器中通过三次。将破碎的细胞悬液以10,000xg离心30分钟，除去上清液，将细胞沉淀饼重新悬浮于30-40ml水中。两次以10,000xg离心30分钟，并将沉淀溶于25ml的2％Sarkosyl和50mM Tris pH8中。加入硫酸铜至浓度为40μM。并将该混合物在15-25℃至少振荡15小时。用13.3mM Tris，pH7.7将得到的溶解的蛋白质混合物稀释4倍，除去Sarkosyl，然后将上清加到已用20mM Tris，pH7.7平衡过的DEAE-纤维素(Whatman DE-52)柱上。在上样并用相同缓冲液洗柱后，用20mM Tris/Nacl(根据类似物不同其浓度为35mM至100mM)，pH7.7洗脱类似物。对于大多数类似物，用50％乙酸将来自DEAE柱的洗脱液调pH至5.4，并且必要时可用5mM乙酸钠(pH5.4)进行稀释(获得适当的导电性)。然后将该溶液加到用20mM醋酸钠(pH5.4)平衡过的CM-Sepharose柱上。然后用20mM NaAc，pH5.4洗柱，直到在280nm处吸收值大约为0。然后用下列表4中列出之浓度的乙酸钠/NaCl洗脱G-CSF类似物。将未加到CM-Sepharose柱上的那些类似物的DEAE柱洗脱液直接对10mM NaAc，pH4.0缓冲液透析。然后适当地分离纯化的G-CSF类似物，用于体外分析。如上所示，用于洗脱类似物的盐浓度有所变化。下面，列出了DEAE纤维素柱以及CM-Sepharose 柱使用的盐的浓度； 
表4
Figure BYZ000000616560100471
表4(续)
Figure BYZ000000616560100481
表4(续)
*对于缺失167未得到数据。 
**对于这些类似物，可仅由DEAE纤维素柱进行纯化。 
上面描述了纯化方法，一个熟练的技术人员将会认识到也可用其他方法获得本发明G-CSF类似物。 
G.生物学检测
不管用何种方法产生本发明的G-CSF类似物，都要检测类似物的生物学活性。为了弄清其促细胞分裂程度，进行H3-胸腺嘧啶检测。但是也可用其他生物学检测法了解所需活性。生物学检测例如分析其在鼠WEHI-3B(D+)白血病细胞系中诱导末期分化的能力，也可以指示G-CSF活泼(参见Nicola et al.，Blood  54：614-27(1979))。也可用其他的体外检测法确定生物学活性(参见Nicola， Annu.Rev.Biochem.58：45-47(1989))。通常，生物学活性的检测应提供所需的分析结果，例如生物学活性的增加或降低(与未改变的G-CSF相比)、不同的生物学活性(与未改变的G-CSF相比)、受体亲和性分析、或血清半寿期分析。所列出的这些方法并不完全，本领域内技术人员可以认识到，其他检测法也适用于检测预期的结果。 
按照标准步骤完成3H-胸腺嘧啶检测法。以杀死的雌性Balb C小鼠得到骨髓。将骨髓细胞简单地悬浮、离心、并再悬浮于生长培养基中。将含有10,000个细胞的160μl样品置于96孔微量滴定板的每个孔中。向每个孔中加入纯化的G-CSF类似物样品(如上制备)，并保温68小时。将3H-胸腺嘧啶加到各孔中并继续保温5小时。保温5小时之后，收获细胞、过滤、产彻底浸洗。将滤膜加到含有闪烁液的小瓶中。计数β-射线发射(用LKB Betaplate Scintillation计数器)。将标准品和类似物重复三份，并将实质上落在标准曲线之上或之下的样品进行适当稀释后重新分析。所报道的结果是相对于未改变的重组人G-CSF标准品三份重复测得的类似物的数据的平均值。 
H.HPLC分析
对纯化的类似物样品进行高效液相层析分析。虽然在反相HPLC柱上峰的位置没有明确地指出两种蛋白质之间具有结构相似性，但具有相同滞留时间的类似物在HPLC柱上与未改变的分子具有相同类型的疏水相互作用。这一结果表明具有相似的总体结构。 
在反相(0.46×25cm)Vydac 214TP 54柱(Separations Group，Inc.Hesperia，CA)上分析类似物和未改变的重组人G-CSF样品。根据类似物在该柱中的行为，在20mM乙酸盐和40mM NaCl溶液的缓冲液，pH5.2中制备纯化的G-CSF类似物样品，其终浓度为0.1mg/ml-5mg/ml。以不同的量(依据浓度而定)上样于HPLC柱上，该柱已用含有1％异丙醇、52.8％乙腈和0.38％三氟醋酸(TFA)的水溶液平衡。用每分钟0.86％乙腈和0.002％TFA的梯度洗脱样品。 
I.结果
下文中列出了上述生物学检测和HPLC分析的结果。生物学活性数值为一式三份重复试验结果的平均值，并以对照标准品(未变改的G-CSF)的百分数表示。HPLC峰的相对位置是G-CSF类似物相对于对照标准品(未变改G-CSF)峰的位置。“+”或“-”记号表示类似物的HPLC峰出现在对照标准品峰的前面或其后(以分钟计)。并没有对所有变异体的相对HPLC峰进行分析，仅对下文中列出的那些进行了分析。含有编码本发明类似物之核酸的大肠杆菌宿主细胞也由美国典型培养物收集中心提供登记编号，其制备如上文所述。 
Figure BYZ000000616560100521
Figure BYZ000000616560100531
Figure BYZ000000616560100551
I.结构-功能关系的鉴定
用于设计本发明类似物的第一个步骤是决定，哪种部分对于G-CSF分子的结构完整性是必须的。这可以在氨基酸残基水平上完成，尽管也可以在原子水平上分析。对保持结构完整性所必需的残基的修饰，可以G-CSF分子的整个结构中发生变化。依据期望产生那种类似物，这种变化可能是或不是令人满意的。为了保持类似物与G-CSF受体(如在本章节的下文中使用的，“G-CSF受体”是指在造血细胞中存在的天然G-CSF受体)的G-CSF受体结合，设计本文的操作实例，以保持G-CSF分子的整体结构完整性。由本文提供的研究可推测和证实，G-CSF受体结合至少对于一种如上检测的生物学活性是一个必要步骤。 
如从图中看到的G-CSF(在这里是指重组人met-G-CSF)是呈左手旋转的和总体大小为 
Figure BYZ000000616560100561
的逆平行4-α螺旋束。该螺旋束内的4条螺旋是指螺旋A，B，C和D，已知它们的连接环为AB、BC和CD环。螺旋交叉角为-167.5°至-159.4°范围。螺旋A，B和C是直的，而螺旋D在Gly150和Ser160(重组人met-G-CSF的)处含有两种结构特性。从总体上说，G-CSF分子是由四条螺旋通过外部环按顺序连接起来的分子束。该结构信息与已知的功能信息相互关联。已知可对残基(包括第1位的蛋氨酸)47、23、24、20、21、44、53、113、110、28和114进行修饰，而从实质上影响其生物学活性。 
降低生物学活性的大多数的单个突变集中在由30 
Figure BYZ000000616560100562
分隔开的G-CSF的两个区域周围，并定位于四螺旋束的不同面上。一个区域涉及螺旋A和螺旋D之间的相互作用。这可以通过在未改变的分子中存在的盐桥来进一步证实，结果如下： 
这里列出的距离是指图5中列出的分子A的(图5中有三个G-CSF分子一起形成结晶，并命名为A，B和C)。正如所看到的，在螺旋A和螺旋D之间有一个盐桥连接板，它起着稳定螺旋A结构的作用，因而可影响G-CSF分子的整个结构。 
在螺旋A的疏水面(残基20-37)上存在以残基Glu20、Arg23和Lys24为中心的区域。在20和23位上用未带电的两氨酸残基替代这些残基产生相同的HPLC滞留时间，表明其结构相同。这些位点的变化改变了生物学活性(由本发明检测法测知)。在Lys24替代后改变了生物学活性，但并不象其他两种变化一样具有相同的HPLC滞留时间。 
在其上发生变化会降低生物活性的第二个位点涉及A B螺旋。将47位的谷氨酰胺改变为丙氨酸(上述类似物no.19)会降低生物学活性至0(用胸腺嘧啶摄取法检测)。AB螺旋主要是疏水性的，但在氨基和羧基末端除外；它含有一个310螺旋的转角。在每个末端有两个组氨酸(His44和His46)，并且46位残基处有另一个谷氨酸，它具有与His44形成盐桥的可能性。对该类似物进行的fourier转化的红外分光光谱分析(FTIR)表明，该类似物结构与未改变的重组G-CSF分子相似。检测后证实在与未改变的重组分子使用相同条件时该类似物不产生结晶。 
羧基末端(Gln174，Arg167和Arg170)发生变化后对生物学活性几乎没有影响。相反，将最后的8个残基(167-175位)缺失后会降低生物学活性。这些结果表明，发生这些缺失使整体结构不稳定，从而抑制突变体与G-CSF受体的正确结合(于是，启动信号转导)。 
通常，对于G-CSF内部核心(丢失了外部环的四条内部螺旋束)，疏水的内部残基对于结构完整性是必需的。例如，在螺旋A中，内部疏水基是(带有第1位的甲硫氨酸)Phe 14、Cys 18、Val 22、Ile 25、ILe 32和Leu 36。其它的疏水残基(还是包括第1位的met)是：螺旋B，Ala 72，Leu 76，Leu 79，Leu 83，Tyr 86，Leu 90，Leu 93；螺旋C，Leu 104，Leu 107，Val 111，Ala 114，Ile 118，Met 122；以及螺旋D，Val 154，Val 158，Phe 161，Val 164，Val 168，Leu 172。 
从本发明制得的G-CSF类似物得到的上述生物学活性数据，证明外部环的改变对G-CSF总体结构的干扰是最小的。对于制备类似物，优选的环是AB环和CD环。与螺旋相比，环是相对柔曲的结构。环可能对分子的蛋白水解有所贡献。当分子作用目的是对生物学攻击，即选择性刺激中性白细胞产生反应时，G-CSF在体内质具有相当快的作用。G-CSF的更新速率也是非常快的。由于环具有柔曲性，为蛋白酶提供了可以吸附到该分子上使该分子失活的“可乘之机”。为了阻止蛋白酶的降解作用而对环进行修饰，以至也可能(通过保留未修饰G-CSF的总体结构)不丧失生物学活性。 
这种现象可能不仅限于G-CSF分子，对于列于图2中的具有已知相似总体结构的其他分子也是普遍存在的。例如改变hGH，干扰素B，IL-2，GM-CSF和IL-4的外部环，可能对整体结构只造成很小 改变。GM-CSF分子上的外部环不象G-CSF分子上的环那么柔曲，这表明GM-CSF具有更长的血清寿命，并与其具有较宽的生物学活性相一致。因此，通过从β-片层结构中释放出外部环，可以修饰GM-CSF的外部环，这样可使该环更加柔曲(与G-CSF的环相似)，因而使该分子对蛋白酶降低作用更为敏感(从而提高了更新速率)。 
将其与一条或多条内部螺旋连接而使环稳定，从而导致这些外部环的改变。连接方法是本领域内已知的，如β-片层、盐桥、或二硫键的形成或疏水相互作用，以及其他手段都可利用。也可以缺失一个或多个部分，例如一个或多个氨基酸残基或其部分，以制备截短的分子并从而去除外部环上的某些部分。 
因此，通过改变外部环，较好是AB环(r-hu-met G-CSF的58-72位氨基酸)或CD环(r-hu-met-G-CSF的119-145位氨基酸)，并且优选的是更小的氨基末端(氨基酸1-10位)，可以在不排除G-SSF与G-CSF受体结合的情况下改变其生物学功能。例如，我们可以：(1)通过例如降低蛋白酶作用于G-CSF分子的能力或者对G-CSF分子进行化学修饰，如加上一种或多种聚乙二醇分子或用于口服配方的肠衣(它们具有改变如上所述的G-CSF的某些特性，如提高血清或其他半寿期或降低抗原性的作用)，以增加G-CSF分子的半寿期(或者例如制备一种口服制剂)；(2)制备一种杂合分子，例如将G-CSF与另一种蛋白质的一部分或其整个分子相结合，所述另一种蛋白质为例如另一种细胞激活素或另一种经由G-CSF与G-CSF受体运送机制，通过进入来影响信号转导作用的蛋白质；或者(3)提高生物活性，例如选择性刺激中性白细胞的能力(与未改变的G-CSF分子相比)。可进行的功能修饰不仅限于上面举例的这些。 
从上述数据可观察到的另一个方面是，表面相互作用的稳定化可影响生物学活性。通过将类似物23和4Q进行比较可明显看到这一点。类似物23在其28位上由带电荷的天冬酰胺残基替代了该位上的中性电荷丙氨酸残基，并且这种替代导致其生物学活性提高50％(由已知的胸腺嘧啶摄入法测知)。第28位的天冬酰胺残基与第113位上的天冬酰胺残基具有表面相互作用；两种残基都带负电荷，具有一定程度的不稳定性(由于带同性电荷部分彼此相斥)。但是用中性电荷丙氨酸替代第113位的天冬酰胺时，其生物活性降至0(用本发明的检测系统测得)。这种现象表明第113位的天冬酰胺对于生物活性是关键的，去除第28位的天冬酰胺可以增加第113位天冬酰胺的效能。 
还可以根据制备的上述类似物和G-CSF结构，测出G-CSF受体结合所必需的区域。G-CSF受体结合区定位于第11-57位(在A和AB螺旋之间)残基(第1位是蛋氨酸)以及第100-118位(B和C螺旋之间)残基。我们还可以制备被截短的分子，该分子能结合到G-CSF受体上，并通过改变外部环结构并使受体结合区保持完整而启动选择性刺激中性白细胞的信号转导。 
已经鉴定了产生生物活性和假定的G-CSF受体结合或信号转导所必须的残基。两个明显不同的位点定位于二级结构的两个不同区上。这里所述的位点A”定位于一条螺旋上，该螺旋受连接螺旋束中其他两个成员的盐桥连接的束缚。第二个位点，“位点B”定位于相对更柔曲的螺旋AB上。由于羧基和氨基末端残基的类型和位置不同，AB螺旋对局部pH变化更敏感。这种易弯曲的螺旋的功能对于与G-CSF受体结合时诱导构型配合可能是很重要的。另外，如通过直接 突变和间接比较的蛋白质结构分析，还表明D螺旋的延伸部分是G-CSF受体结合区。如hGH一样，缺失r-hu-met-G-CSF的羧基末端降低了活性(参见，Cunningham and Wells，Science 244：1081-1084(1989))。具有同样结构的细胞激活素，例如IL-6和具有预定的类似的拓扑结构的GM-CSF，还沿着F螺旋的羧基末端集中其生物学活性(参见Bazan，Immunology Today 11：350-354(1990))。 
将G-CSF和hGH之间的G-CSF受体结合决定基的结构和位置进行比较，提示两个分子具有相同的信号转导方式。已从hGH上鉴定出两个相分隔的G-CSF受体结合位点(De Vos et al.，Science  255：306-32(1991))。由hGH螺旋1的暴露面上的残基，螺旋1和2之间以及螺旋4的结合区域构成了这些结合位点之一(称之为“位点I”)。由螺旋1和螺旋3的表面残基形成了第二个结合位点(称为“位点II”)。 
从G-CSF上鉴定出的G-CSF受体结合决定基与hGH上鉴定的决定基具有同样的相对位置。定位于AB螺旋上螺旋A和B间之连接区中的G-CSF受体结合位点(位点A)与已报道的hGH的小片段螺旋(38-47位残基)上定位的位置相同。G-CSF之AB螺旋上的单点突变显著地降低生物学活性(如在本发明检测法中鉴定的)，表明其在G-CSF受体-配位体交界面处具有作用。G-CSF受体的结合使该区域的310螺旋特性不稳定，并且诱导构型变化，这种变化提高了配位体/G-CSF受体复合物的结合能。 
在hGH受体复合物中，螺旋束中的第一条螺旋为使hGH受体二聚化所需的两结合位点提供残基。对G-CSF的相应螺旋(螺旋A)进行突变分析，已鉴定了生物学活性所需的三个残基。在这三个残基中，Glu 20和Arg 24定位于朝向螺旋C的螺旋束的一个表面上，而Arg23 的侧链(在不对称单位内三个分子中的二种分子中)指向朝着螺旋D之螺旋线束的表面。这些生物学上重要的残基侧链的位置表明，与hGH相似，G-CSF沿着螺旋A和螺旋C之间的界面上可能有第二个G-CSF受体结合位点。与hGH分子相反，G-CSF的氨基末端具有有限的生物学作用，因为缺失前11个残基对生物学活性几乎没有影响。 
如上所述(如参见图2)，G-CSF与其他的细胞激活素具有相似的拓扑结构。用前面的生化方法，突变分析以及直接比较hGH受体复合物的特定残基所得出的结构关系表明G-CSF具有两个受体结合位点。位点A位于A和D螺旋的界面处，并包括AB小螺旋中的残基。位点B还包括螺旋A中的残基但位于螺旋A和C间的界面处。保持G-CSF和hGH之间生物学重要残基的结构和相对位置，是信号转导的通用方法的一个指征，该方法中受体被结合在两个位置中。因此，已发现通过改变G-CSF受体结合位点(残基2D-57和145-175)中的任一位点，可以制备具有改变了的G-CSF受体结合区的G-CSF类似物。 
对G-CSF蛋白质三维空间结构以及组成关系的了解可以找到一种用于制备G-CSF类似物的系统化的、合理的方法。上述操作实例已证明，对结构核心内的侧链极性和大小的限制，支配着在整体结构变化以前该分子可以耐受多大的变化。 
序列表 
(1)一般资料： 
(i)申请人：Amgen Inc. 
(ii)发明名称：G-CSF类似物，组合物及其方法 
(iii)序列数：110 
(iv)相应地址： 
(A)ADDRESSEE：Amgen，Inc. 
(B)街道：Amgen Center，1840 DeHavill and Drive 
(C)城市：Thousand Oaks 
(D)州：California 
(E)国家：United States of America 
(F)邮编：91320-1789 
(V)计算机可读形式： 
(A)介质类型：Floppy disk 
(B)计算机：IBM PC兼容 
(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS 
(D)软件：PatentIn Release#1.0，Version#1.25 
(vi)目前的申请资料： 
(A)申请号： 
(B)申请日： 
(C)分类号： 
(viii)代理人资料： 
(A)名称：Pessin，Karol 
(B)登记号：34,899 
(ix)电信资料： 
(A)电话：805/499-5725 
(B)电传：805/499-8011 
(2)SEQ ID  NO：1的资料： 
(i)序列特征： 
(A)长度：565碱基对 
(B)类型：核酸 
(C)链型：单链 
(D)拓扑学：线性 
(ii)分子类型：DNA(基因组) 
(ix)特征： 
(A)名称/关键词：CDS 
(B)位点：30..554 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：1： 
TCTAGAAAAA ACCAAGGAGG TAATAAATA ATG ACT CCA TTA GGT CCT GCT  TCT    53 
                                 Met Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser 
                                   1               5 
TCT CTG CCG CAA AGC TTT CTG CTG AAA TGT CTG GAA CAG GTT CGT AAA    101 
Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys 
      10                  15                  20 
ATC CAG GGT GAC GGT GCT GCA CTG CAA GAA AAA CTG TGC GCT ACT TAC    149 
Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr 
 25                  30                  35                  40 
AAA CTG TGC CAT CCG GAA GAA CTG GTA CTG CTG GGT CAT TCT CTT GGG    197 
Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly 
                 45                  50                  55 
ATC CCG TGG GCT CCG CTG TCT TCT TGC CCA TCT CAA GCT CTT CAG CTG    245 
Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu 
             60                  65                  70 
GCT GGT TGT CTG TCT CAA CTG CAT TCT GGT CTG TTC CTG TAT CAG GGT    293 
Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly 
         75                  80                  85 
CTT CTG CAA GCT CTG GAA GGT ATC TCT CCG GAA CTG GGT CCG ACT CTG    341 
Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu 
      90                 95                  100 
GAC ACT CTG CAG CTA GAT GTA GCT GAC TTT GCT ACT ACT ATT TGG CAA    389 
Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln 
105                 110                 115                 120 
CAG ATG GAA GAG CTC GGT ATG GCA CCA GCT CTG CAA CCG ACT CAA GGT    437 
Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly 
                125                 130                 135 
GCT ATG CCG GCA TTC GCT TCT GCA TTC CAG CGT CGT GCA GGA GGT GTA    485 
Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val 
              140                 145                 150 
CTG GTT GCT TCT CAT CTG CAA TCT TTC CTG GAA GTA TCT TAC CGT GTT    533 
Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val 
         155                 160                 165 
CTG CGT CAT CTG GCT CAG CCG TAATAGAATTC                           565 
Leu Arg His Leu Ala Gln Pro 
    170                 175 
(2)SEQ ID NO：2的资料： 
(i)序列特征： 
(A)长度：175氨基酸 
(B)类型：氨基酸 
(D)拓扑学：线性 
(ii)分子类型：蛋白质 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：2： 
Met Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu 
  1               5                  10                  15 
Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu 
            20                  25                  30 
Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu 
          35                  40                  45 
Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 
      50                  55                  60 
Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His 
 65                  70                  75                  80 
Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile 
                85                  90                  95 
Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala 
             100                 105                 110 
Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala 
         115                 120                 125 
Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala 
    130                  135                  140 
Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser 
145                 150                 155                 160 
Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro 
                  165                 170                 175 
(2)SEQ ID NO：3的资料： 
(i)序列特征： 
(A)长度：24碱基对 
(B)类型：核酸 
(C)链型：单链 
(D)拓扑学：线性 
(ii)分子类型：DNA 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：3： 
CTTTCTGCTG CGTTGTCTGG AACA                      24 
(2)SEQ ID  NO：4的资料： 
(i)序列特征： 
(A)长度：23碱基对 
(B)类型：核酸 
(C)链型：单链 
(D)拓扑学：线性 
(ii)分子类型：DNA 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：4： 
ACAGGTTCGT CGTATCCAGG GTG                       23 
(2)SEQ ID NO：5的资料： 
(i)序列特征： 
(A)长度：23碱基对 
(B)类型：核酸 
(C)链型：单链 
(D)拓扑学：线性 
(ii)分子类型：DNA 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：5： 
CACTGCAAGA ACGTCTGTGC GTC                                        23 
(2)SEQ ID NO：6的资料： 
(i)序列特征： 
(A)长度：23碱基对 
(B)类型：核酸 
(C)链型：单链 
(D)拓扑学：线性 
(ii)分子类型：DNA 
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(B)类型：核酸 
(C)链型：单链 
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CTTGTCCATC TGAAGCTCTT CAG                                        23 
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TCATCTGGCT GCGCCGTAAT AG                                        22 
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CCGTGTTCTG GCTCATCTGG CT                                        22 
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GAAGTATCTT ACGCTGTTCT GCGT                                        24 
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GAAGTATCTT ACTAAGTTCT GCGTC                                        25 
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(A)长度：22碱基对 
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(C)链型：单链 
(D)拓扑学：线性 
(ii)分子类型：DNA 
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CGCTACTTAC GCACTGTGCC AT                                        22 
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(A)长度：22碱基对 
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(D)拓扑学：线性 
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CAAACTGTGC AAGCCGGAAG AG                                        22 
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(A)长度：22碱基对 
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CATCCGG AAG CACTGGTACT GC                                       22 
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(A)长度：23碱基对 
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(C)链型：单链 
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GGAACAGGTT GCTAAAATCC AGG                                        23 
(2)SEQ ID NO：35的资料： 
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(A)长度：25碱基对 
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(C)链型：单链 
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GAACAGGTTC GTGCGATCCA GGGTG                                      25 
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(A)长度：22碱基对 
(B)类型：核酸 
(C)链型：单链 
(D)拓扑学：线性 
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GAAATGTCTG GCACAGGTTC GT                                        22 
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(A)长度：19碱基对 
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(C)链型：单链 
(D)拓扑学：线性 
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TCCAGGGTGC CGGTGCTGC                                        19 
(2)SEQ ID  NO：38的资料： 
(i)序列特征： 
(A)长度：23碱基对 
(B)类型：核酸 
(C)链型：单链 
(D)拓扑学：线性 
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AAGAGCTCGG TGAGGCACCA GCT                                   23 
(2)SEQ ID NO：39的资料： 
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(A)长度：23碱基对 
(B)类型：核酸 
(C)链型：单链 
(D)拓扑学：线性 
(ii)分子类型：DNA 
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CTCAAGGTGC TGAGCCGGCA TTC                      23 
(2)SEQ ID NO：40的资料： 
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(A)长度：20碱基对 
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(C)链型：单链 
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GAGCTCGGTC TGGCACCAGC                         20 
(2)SEQ ID NO：41的资料： 
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(B)类型：核酸 
(C)链型：单链 
(D)拓扑学：线性 
(ii)分子类型：DNA 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：41： 
TCAAGGTGCT CTGCCGGCAT T                       21 
(2)SEQ ID NO：42的资料： 
(i)序列特征： 
(A)长度：23碱基对 
(B)类型：核酸 
(C)链型：单链 
(D)拓扑学：线性 
(ii)分子类型：DNA 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：42： 
TCTGCCGCAA GCCTTTCTGC TGA    23 
(2)SEQ ID NO：43的资料： 
(i)序列特征： 
(A)长度：24碱基对 
(B)类型：核酸 
(C)链型：单链 
(D)拓扑学：线性 
(ii)分子类型：DNA 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：43： 
CTTTCTGCTG GCATGTCTGG AACA    24 
(2)SEQ ID  NO：44的资料： 
(i)序列特征： 
(A)长度：24碱基对 
(B)类型：核酸 
(C)链型：单链 
(D)拓扑学：线性 
(ii)分子类型：DNA 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：44： 
CTATTTGGCA AGCGATGGAA GAGC    24 
(2)SEQ ID NO：45的资料： 
(i)序列特征： 
(A)长度：21碱基对 
(B)类型：核酸 
(C)链型：单链 
(D)拓扑学：线性 
(ii)分子类型：DNA 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：45： 
CAGATGGAAG CGCTCGGTAT G    21 
(2)SEQ ID NO：46的资料： 
(i)序列特征： 
(A)长度：20碱基对 
(B)类型：核酸 
(C)链型：单链 
(D)拓扑学：线性 
(ii)分子类型：DNA 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：46： 
GAGCTCGGTC TGGCACCAGC    20 
(2)SEQ ID NO：47的资料： 
(i)序列特征： 
(A)长度：21碱基对 
(B)类型：核酸 
(C)链型：单链 
(D)拓扑学：线性 
(ii)分子类型：DNA 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：47： 
TCAAGGTGCT CTGCCGGCAT T    21 
(2)SEQ ID NO：48的资料： 
(i)序列特征： 
(A)长度：22碱基对 
(B)类型：核酸 
(C)链型：单链 
(D)拓扑学：线性 
(ii)分子类型：DNA 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：48： 
GAAATGTCTG GCACAGGTTC GT    22 
(2)SEQ ID NO：49的资料： 
(i)序列特征： 
(A)长度：19碱基对 
(B)类型：核酸 
(C)链型：单链 
(D)拓扑学：线性 
(ii)分子类型：DNA 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：49： 
TTCCGGAGCG CACAGTTTG    19 
(2)SEQ ID NO：50的资料： 
(i)序列特征： 
(A)长度：23碱基对 
(B)类型：核酸 
(C)链型：单链 
(D)拓扑学：线性 
(ii)分子类型：DNA 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：50： 
CGAGAATGCC TCGGGTGTCA AAC    23 
(2)SEQ ID NO：51的资料： 
(i)序列特征： 
(A)长度：22碱基对 
(B)类型：核酸 
(C)链型：单链 
(D)拓扑学：线性 
(ii)分子类型：DNA 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：51： 
ATGCCAAATT GCAGTAGCAA AG    22 
(2)SEQ ID NO：52的资料： 
(i)序列特征： 
(A)长度：24碱基对 
(B)类型：核酸 
(C)链型：单链 
(D)拓扑学：线性 
(ii)分子类型：DNA 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：52： 
ACAACGGTTT AACGTCATCG TTTC    24 
(2)SEQ ID NO：53的资料： 
(i)序列特征： 
(A)长度：22碱基对 
(B)类型：核酸 
(C)链型：单链 
(D)拓扑学：线性 
(ii)分子类型：DNA 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：53： 
ATCAGCTACT GCTAGCTGCA GA    22 
(2)SEQ ID NO：54的资料： 
(i)序列特征： 
(A)长度：23碱基对 
(B)类型：核酸 
(C)链型：单链 
(D)拓扑学：线性 
(ii)分子类型：DNA 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：54： 
TCAGTCGATG ACGATCGACG TCT    23 
(2)SEQ ID NO：55的资料： 
(i)序列特征： 
(A)长度：22碱基对 
(B)类型：核酸 
(C)链型：单链 
(D)拓扑学：线性 
(ii)分子类型：DNA 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：55： 
TTACGAACCG CTTCCAGACA TT      22 
(2)SEQ ID NO：56的资料： 
(i)序列特征： 
(A)长度：25碱基对 
(B)类型：核酸 
(C)链型：单链 
(D)拓扑学：线性 
(ii)分子类型：DNA 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：56： 
TAAAATGCTT GGCGAAGGTC TGTAA    25 
(2)SEQ ID NO：57的资料： 
(i)序列特征： 
(A)长度：22碱基对 
(B)类型：核酸 
(C)链型：单链 
(D)拓扑学：线性 
(ii)分子类型：DNA 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：57： 
GTAGCAAATG CAGCTACATC TA       22 
(2)SEQ ID NO：58的资料： 
(i)序列特征： 
(A)长度：25碱基对 
(B)类型：核酸 
(C)链型：单链 
(D)拓扑学：线性 
(ii)分子类型：DNA 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：58： 
CATCATCGTT TACGTCGATG TAGAT    25 
(2)SEQ ID NO：59的资料： 
(i)序列特征： 
(A)长度：20碱基对 
(B)类型：核酸 
(C)链型：单链 
(D)拓扑学：线性 
(ii)分子类型：DNA 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：59： 
CCAAGAGAAG CACCCAGCAG         20 
(2)SEQ ID NO：60的资料： 
(i)序列特征： 
(A)长度：22碱基对 
(B)类型：核酸 
(C)链型：单链 
(D)拓扑学：线性 
(ii)分子类型：DNA 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：60： 
AGGGTTCTCT TCGTGGGTCG TC      22 
(2)SEQ ID NO：61的资料： 
(i)序列特征： 
(A)长度：20碱基对 
(B)类型：核酸 
(C)链型：单链 
(D)拓扑学：线性 
(ii)分子类型：DNA 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：61： 
CACTGGCGGT GATAATGAGC    20 
(2)SEQ ID NO：62的资料： 
(i)序列特征： 
(A)长度：19碱基对 
(B)类型：核酸 
(C)链型：单链 
(D)拓扑学：线性 
(ii)分子类型：DNA 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：62： 
CTAGGCCAGG CATTACTGG    19 
(2)SEQ ID NO：63的资料： 
(i)序列特征： 
(A)长度：21碱基对 
(B)类型：核酸 
(C)链型：单链 
(D)拓扑学：线性 
(ii)分子类型：DNA 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：63： 
CCACTGGCGG TGATACTGAG C    21 
(2)SEQ ID NO：64的资料： 
(i)序列特征： 
(A)长度：33碱基对 
(B)类型：核酸 
(C)链型：单链 
(D)拓扑学：线性 
(ii)分子类型：DNA 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：64： 
AGCAGAAAGC TTTCCGGCAG AGAAGAAGCA GGA    33 
(2)SEQ ID NO：65的资料： 
(i)序列特征： 
(A)长度：54碱基对 
(B)类型：核酸 
(C)链型：单链 
(D)拓扑学：线性 
(ii)分子类型：DNA 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：65： 
GCCGCAAAGC TTTCTGCTGA AATGTCTGGA AGAGGTTCGT AAAATCCAGG 
                                                  GTGA  54 
(2)SEQ ID NO：66的资料： 
(i)序列特征： 
(A)长度：59碱基对 
(B)类型：核酸 
(C)链型：单链 
(D)拓扑学：线性 
(ii)分子类型：DNA 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：66： 
CTGGAATGCA GAAGCAAATG CCGGCATAGC ACCTTCAGTC GGTTGCAGAG 
                                             CTGGTGCCA    59 
(2)SEQ ID NO：67的资料： 
(i)序列特征： 
(A)长度：175氨基酸 
(B)类型：氨基酸 
(D)拓扑学：线性 
(ii)分子类型：蛋白质 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：67： 
Met Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu 
  1               5                  10                  15 
Arg Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu 
               20                  25                  30 
Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu 
           35                  40                  45 
Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 
      50                  55                  60 
Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His 
 65                  70                  75                  80 
Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile 
                    85                  90                  95 
Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala 
              100                 105                 110 
Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala 
         115                 120                 125 
Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala 
    130                  135                  140 
Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser 
145                 150                 155                 160 
Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro 
                  165                  170                  175 
(2)SEQ ID NO：68的资料： 
(i)序列特征： 
(A)长度：175氨基酸 
(B)类型：氨基酸 
(D)拓扑学：线性 
(ii)分子类型：蛋白质 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：68： 
Met Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu 
  1               5                  10                  15 
Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Arg Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu 
               20                  25                  30 
Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu 
          35                  40                  45 
Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 
      50                  55                  60 
Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His 
 65                  70                  75                  80 
Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile 
                    85                  90                  95 
Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala 
              100                 105                 110 
Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala 
          115                  120                  125 
Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala 
    130                 135                 140 
Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser 
145                 150                 155                 160 
Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro 
                  165                 170                 175 
(2)SEQ ID NO：69的资料： 
(i)序列特征： 
(A)长度：175氨基酸 
(B)类型：氨基酸 
(D)拓扑学：线性 
(ii)分子类型：蛋白质 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：69： 
Met Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu 
  1               5                   10                  15 
Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu 
               20                  25                  30 
Gln Glu Arg Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu 
          35                  40                  45 
Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 
      50                  55                  60 
Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His 
 65                  70                  75                  80 
Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile 
                    85                  90                  95 
Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala 
              100                 105                 110 
Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala 
         115                 120                 125 
Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala 
     130                 135                 140 
Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser 
145                 150                 155                 160 
Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro 
                   165                 170                 175 
(2)SEQ ID NO：70的资料： 
(i)序列特征： 
(A)长度：175氨基酸 
(B)类型：氨基酸 
(D)拓扑学：线性 
(ii)分子类型：蛋白质 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：70： 
Met Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu 
   1              5                  10                  15 
Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu 
               20                  25                  30 
Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Arg Leu Cys His Pro Glu Glu Leu 
          35                  40                  45 
Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 
      50                  55                  60 
Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His 
 65                  70                  75                  80 
Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile 
                    85                  90                  95 
Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala 
              100                 105                 110 
Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala 
         115                 120                 125 
Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala 
    130                 135                 140 
Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser 
145                 150                 155                 160 
Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro 
                  165                 170                 175 
(2)SEQ ID NO：71的资料： 
(i)序列特征： 
(A)长度：175氨基酸 
(B)类型：氨基酸 
(D)拓扑学：线性 
(ii)分子类型：蛋白质 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：71： 
Met Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu 
 1                5                  10                  15 
Arg Cys Leu Glu Gln Val Arg Arg Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu 
               20                  25                  30 
Gln Glu Arg Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu 
          35                  40                  45 
Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 
      50                  55                  60 
Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His 
 65                  70                  75                  80 
Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile 
                    85                  90                  95 
Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala 
              100                 105                 110 
Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala 
         115                 120                 125 
Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala 
     130                 135                 140 
Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser 
145                 150                 155                 160 
Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro 
                   165                 170                 175 
(2)SEQ ID NO：72的资料： 
(i)序列特征： 
(A)长度：175氨基酸 
(B)类型：氨基酸 
(D)拓扑学：线性 
(ii)分子类型：蛋白质 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：72： 
Met Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu 
  1               5                  10                  15 
Arg Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu 
               20                  25                  30 
Gln Glu Arg Leu Cys Ala Thr Tyr Arg Leu Cys His Pro Glu Glu Leu 
           35                  40                  45 
Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 
      50                  55                  60 
Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His 
 65                  70                  75                  80 
Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile 
                    85                  90                  95 
Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala 
              100                 105                 110 
Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala 
         115                 120                 125 
Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala 
    130                 135                 140 
Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser 
145                 150                 155                 160 
Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro 
                  165                 170                 175 
(2)SEQ ID NO：73的资料： 
(i)序列特征： 
(A)长度：175氨基酸 
(B)类型：氨基酸 
(D)拓扑学：线性 
(ii)分子类型：蛋白质 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：73： 
Met Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu 
  1               5                  10                  15 
Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Arg Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu 
               20                  25                  30 
Gln Glu Arg Leu Cys Ala Thr Tyr Arg Leu Cys His Pro Glu Glu Leu 
          35                  40                  45 
Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 
      50                  55                  60 
Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His 
 65                  70                  75                  80 
Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile 
                    85                  90                  95 
Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala 
              100                 105                 110 
Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala 
          115                 120                 125 
Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala 
      130                 135                 140 
Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser  
145                 150                 155                 160 
Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His  Leu Ala  Gln Pro 
                 165                 170                 175 
(2)SEQ ID NO：74的资料： 
(i)序列特征： 
(A)长度：175氨基酸 
(B)类型：氨基酸 
(D)拓扑学：线性 
(ii)分子类型：蛋白质 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：74： 
Met Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu 
1                 5                  10                  15 
Arg Cys Leu Glu Gln Val Arg Arg Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu 
                20                  25                  30 
Gln Glu Arg Leu Cys Ala Thr Tyr Arg Leu Cys His Pro Glu Glu Leu 
           35                  40                  45 
Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 
      50                  55                  60 
Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His 
 65                  70                  75                  80 
Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile 
                    85                  90                  95 
Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala 
              100                 105                 110 
Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala 
          115                 120                 125 
Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala 
     130                 135                 140 
Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser 
145                 150                 155                 160 
Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro 
                  165                 170                 175 
(2)SEQ ID NO：75的资料： 
(i)序列特征： 
(A)长度：175氨基酸 
(B)类型：氨基酸 
(D)拓扑学：线性 
(ii)分子类型：蛋白质 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：75： 
Met Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu 
1                 5                  10                  15 
Arg Cys Leu Glu Gln Val Arg Arg Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu 
               20                  25                  30 
Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Arg Leu Cys His Pro Glu Glu Leu 
           35                  40                  45 
Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 
      50                  55                  60 
Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His 
 65                  70                  75                  80 
Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile 
                    85                  90                  95 
Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala 
              100                 105                 110 
Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala 
          115                 120                 125 
Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala 
     130                 135                 140 
Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser 
145                 150                 155                 160 
Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro 
                  165                 170                 175 
(2)SEQ ID NO：76的资料： 
(i)序列特征： 
(A)长度：175氨基酸 
(B)类型：氨基酸 
(D)拓扑学：线性 
(ii)分子类型：蛋白质 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：76： 
Met Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu 
  1               5                 10                  15 
Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu 
               20                  25                  30 
Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu 
           35                  40                  45 
Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 
      50                  55                  60 
Cys Pro Ser Glu Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His 
 65                  70                  75                  80 
Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile 
                    85                  90                  95 
Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala 
              100                 105                 110 
Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala 
         115                 120                 125 
Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala 
     130                 135                 140 
Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser 
145                 150                 155                 160 
Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro 
                  165                 170                 175 
(2)SEQ ID NO：77的资料： 
(i)序列特征： 
(A)长度：175氨基酸 
(B)类型：氨基酸 
(D)拓扑学：线性 
(ii)分子类型：蛋白质 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：77： 
Met Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu 
 1                5                  10                  15 
Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu 
               20                  25                  30 
Gln Glu Lys Leu Ser Ala Thr Tyr Lys Leu Ser His Pro Glu Glu Leu 
          35                  40                  45 
Val Leu Leu Gly Mis Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 
      50                  55                  60 
Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His 
 65                  70                  75                  80 
Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile 
                    85                  90                  95 
Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala 
              100                 105                 110 
Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala 
         115                 120                 125 
Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala 
    130                 135                 140 
Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser 
145                 150                 155                 160 
Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro 
                 165                 170                 175 
(2)SEQ ID NO：78的资料： 
(i)序列特征： 
(A)长度：175氨基酸 
(B)类型：氨基酸 
(D)拓扑学：线性 
(ii)分子类型：蛋白质 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：78： 
Met Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu 
  1               5                  10                  15 
Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Ala Gly Asp Gly Ala Ala Leu 
               20                  25                  30 
Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu 
          35                  40                  45 
Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 
      50                  55                  60 
Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His 
 65                  70                  75                  80 
Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile 
                    85                  90                  95 
Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala 
              100                 105                 110 
Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala 
         115                 120                 125 
Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala 
    130                 135                 140 
Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser 
145                 150                 155                 160 
Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro 
                  165                  170                  175 
(2)SEQ ID NO：79的资料： 
(i)序列特征： 
(A)长度：175氨基酸 
(B)类型：氨基酸 
(D)拓扑学：线性 
(ii)分子类型：蛋白质 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：79： 
Met Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu 
  1               5                  10                  15 
Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu 
               20                  25                  30 
Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu 
          35                  40                  45 
Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 
      50                  55                  60 
Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His 
 65                  70                  75                  80 
Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile 
                    85                  90                  95 
Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala 
              100                 105                 110 
Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala 
          115                 120                 125 
Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala 
     130                 135                 140 
Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser 
145                 150                 155                 160 
Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Ala  Pro 
                  165                  170                  175 
(2)SEQ ID NO：80的资料： 
(i)序列特征： 
(A)长度：175氨基酸 
(B)类型：氨基酸 
(D)拓扑学：线性 
(ii)分子类型：蛋白质 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：80： 
Met Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu 
  1               5                  10                  15 
Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu 
               20                  25                  30 
Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu 
           35                  40                  45 
Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 
       50                  55                  60 
Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His 
 65                  70                  75                  80 
Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile 
                    85                  90                  95 
Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala 
              100                 105                 110 
Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala 
          115                 120                 125 
Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala 
     130                 135                 140 
Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser 
145                 150                 155                 160 
Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Ala His Leu Ala Gln Pro 
                   165                 170                 175 
(2)SEQ ID NO：81的资料： 
(i)序列特征： 
(A)长度：175氨基酸 
(B)类型：氨基酸 
(D)拓扑学：线性 
(ii)分子类型：蛋白质 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：81： 
Met Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu 
  1               5                  10                  15 
Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu 
               20                  25                  30 
Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu 
          35                  40                  45 
Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 
      50                  55                  60 
Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His 
 65                  70                  75                  80 
Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile 
                    85                  90                  95 
Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala 
               100                 105                 110 
Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala 
         115                 120                 125 
Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala 
     130                 135                 140 
Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser 
145                 150                 155                 160 
Phe Leu Glu Val Ser Tyr Ala Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro 
                 165                 170                 175 
(2)SEQ ID NO：82的资料： 
(i)序列特征： 
(A)长度：174氨基酸 
(B)类型：氨基酸 
(D)拓扑学：线性 
(ii)分子类型：蛋白质 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：82： 
Met Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu 
  1               5                  10                  15 
Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu 
               20                  25                  30 
Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu 
          35                  40                  45 
Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 
      50                  55                  60 
Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His 
 65                  70                  75                  80 
Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile 
                    85                  90                  95 
Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala 
              100                 105                 110 
Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala 
          115                 120                 125 
Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala 
      130                 135                 140 
Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser 
145                 150                 155                 160 
Phe Leu Glu Val Ser Tyr Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro 
                  165                 170                 174 
(2)SEQ ID NO：83的资料： 
(i)序列特征： 
(A)长度：175氨基酸 
(B)类型：氨基酸 
(D)拓扑学：线性 
(ii)分子类型：蛋白质 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：83： 
Met Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu 
  1               5                  10                  15 
Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu 
               20                  25                  30 
Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Ala Leu Cys His Pro Glu Glu Leu 
           35                  40                  45 
Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 
      50                  55                  60 
Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His 
 65                  70                  75                  80 
Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile 
                    85                  90                  95 
Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala 
              100                 105                 110 
Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala 
          115                 120                 125 
Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala 
      130                 135                 140 
Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser 
145                 150                 155                 160 
Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro 
                  165                 170                 175 
(2)SEQ ID NO：84的资料： 
(i)序列特征： 
(A)长度：175氨基酸 
(B)类型：氨基酸 
(D)拓扑学：线性 
(ii)分子类型：蛋白质 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：84： 
Met Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu 
1                 5                  10                  15 
Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu 
               20                  25                  30 
Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys Lys Pro Glu Glu Leu 
          35                  40                  45 
Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 
       50                  55                  60 
Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His 
 65                  70                  75                  80 
Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile 
                    85                  90                  95 
Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala 
               100                 105                 110 
Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala 
          115                 120                 125 
Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala 
      130                 135                 140 
Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser 
145                 150                 155                 160 
Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro 
                  165                 170                 175 
(2)SEQ ID NO：85的资料： 
(i)序列特征： 
(A)长度：175氨基酸 
(B)类型：氨基酸 
(D)拓扑学：线性 
(ii)分子类型：蛋白质 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：85： 
Met Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu 
  1               5                  10                  15 
Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu 
               20                  25                  30 
Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Ala Leu 
           35                  40                  45 
Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 
      50                  55                  60 
Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His 
 65                  70                  75                  80 
Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile 
                    85                  90                  95 
Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala 
              100                 105                 110 
Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala 
          115                  120                  125 
Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala 
      130                  135                  140 
Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser 
145                 150                 155                 160 
Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro 
                  165                  170                  175 
(2)SEQ ID NO：86的资料： 
(i)序列特征： 
(A)长度：175氨基酸 
(B)类型：氨基酸 
(D)拓扑学：线性 
(ii)分子类型：蛋白质 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：86： 
Met Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu 
  1               5                  10                  15 
Lys Cys Leu Glu Gln Val Ala Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu 
               20                  25                  30 
Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu 
          35                  40                  45 
Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 
       50                  55                  60 
Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His 
 65                  70                  75                  80 
Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile 
                    85                  90                  95 
Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala 
              100                 105                 110 
Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala 
          115                 120                 125 
Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala 
      130                 135                 140 
Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser 
145                 150                 155                 160 
Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro 
                  165                 170                 175 
(2)SEQ ID NO：87的资料： 
(i)序列特征： 
(A)长度：175氨基酸 
(B)类型：氨基酸 
(D)拓扑学：线性 
(ii)分子类型：蛋白质 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：87： 
Met Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu 
  1               5                  10                  15 
Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Ala Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu 
              20                  25                  30 
Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu 
          35                  40                  45 
Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 
      50                  55                  60 
Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His 
 65                  70                  75                  80 
Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile 
                    85                  90                  95 
Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala 
              100                 105                 110 
Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala 
          115                 120                 125 
Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala 
      130                 135                 140 
Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser 
145                 150                 155                 160 
Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro  
                  165                 170                 175 
(2)SEQ ID NO：88的资料： 
(i)序列特征： 
(A)长度：175氨基酸 
(B)类型：氨基酸 
(D)拓扑学：线性 
(ii)分子类型：蛋白质 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：88： 
Met Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu 
  1               5                  10                  15 
Lys Cys Leu Ala Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu   
               20                  25                  30 
Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu 
          35                  40                  45 
Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 
      50                  55                  60 
Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His 
 65                  70                  75                  80 
Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile 
                    85                  90                  95 
Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala 
              100                 105                 110 
Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala 
         115                 120                 125 
Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala 
      130                 135                 140 
Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser 
145                 150                 155                 160 
Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro 
                  165                 170                 175 
(2)SEQ ID NO：89的资料： 
(i)序列特征： 
(A)长度：175个氨基酸 
(B)类型：氨基酸 
(D)拓扑学：线性 
(ii)分子类型：蛋白质 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：89： 
Met Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu 
  1               5                  10                  15 
Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Ala Gly Ala Ala Leu 
               20                  25                  30 
Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu 
          35                  40                  45 
Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 
      50                  55                  60 
Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His 
 65                  70                  75                  80 
Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile 
                  85                  90                  95 
Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala 
              100                 105                 110 
Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala 
          115                 120                 125 
Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala 
      130                  135                  140 
Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser 
145                 150                 155                 160 
Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro 
                  165                 170                 175 
(2)SEQ ID NO：90的资料： 
(i)序列特征： 
(A)长度：175个氨基酸 
(B)类型：氨基酸 
(D)拓扑学：线性 
(ii)分子类型：蛋白质 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：90： 
Met Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu 
  1               5                  10                  15 
Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu 
               20                  25                  30 
Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu 
          35                  40                  45 
Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 
      50                  55                  60 
Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His 
 65                  70                  75                  80 
Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile 
                    85                  90                  95 
Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala 
              100                 105                 110 
Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Glu Ala 
          115                 120                 125 
Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala 
      130                 135                 140 
Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser 
145                 150                 155                 160 
Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro 
                  165                 170                 175 
(2)SEQ ID NO：91的资料： 
(i)序列特征： 
(A)长度：175个氨基酸 
(B)类型：氨基酸 
(D)拓扑学：线性 
(ii)分子类型：蛋白质 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：91： 
Met Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu 
  1               5                  10                  15 
Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu 
               20                  25                  30 
Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu 
          35                  40                  45 
Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 
     50                  55                  60 
Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His 
 65                  70                  75                  80 
Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile 
                    85                  90                  95 
Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala 
             100                 105                 110 
Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala 
          115                 120                 125 
Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Glu Pro Ala Phe Ala Ser Ala 
      130                 135                 140                  
Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser 
145                 150                 155                 160 
Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro 
                  165                 170                 175 
(2)SEQ ID NO：92的资料： 
(i)序列特征： 
(A)长度：175个氨基酸 
(B)类型：氨基酸 
(D)拓扑学：线性 
(ii)分子类型：蛋白质 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：92： 
Met Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu 
  1               5                  10                  15 
Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu 
               20                  25                  30 
Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu 
          35                  40                  45 
Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 
      50                  55                  60 
Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His 
 65                  70                  75                  80 
Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile 
                    85                  90                  95 
Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala 
              100                 105                 110 
Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Leu Ala 
          115                 120                 125 
Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala 
     130                 135                 140 
Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser 
145                 150                 155                 160 
Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro 
                  165                 170                 175 
(2)SEQ ID NO：93的资料： 
(i)序列特征： 
(A)长度：175个氨基酸 
(B)类型：氨基酸 
(D)拓扑学：线性 
(ii)分子类型：蛋白质 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：93： 
Met Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu 
  1               5                  10                  15 
Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu 
               20                  25                  30 
Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu 
          35                  40                  45 
Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 
      50                  55                  60 
Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His 
 65                  70                  75                  80 
Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile 
                    85                  90                  95 
Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala 
              100                 105                 110 
Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala 
         115                  120                  125 
Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Leu Pro Ala Phe Ala Ser Ala 
     130                 135                 140 
Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser 
145                 150                 155                 160 
Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro 
                  165                 170                 175 
(2)SEQ ID NO：94的资料： 
(i)序列特征： 
(A)长度：175个氨基酸 
(B)类型：氨基酸 
(D)拓扑学：线性 
(ii)分子类型：蛋白质 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：94： 
Met Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu 
  1               5                  10                  15 
Lys Ala Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu 
               20                  25                  30 
Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu 
          35                  40                  45 
Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 
      50                  55                  60 
Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His 
 65                  70                  75                  80 
Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile 
                    85                  90                  95 
Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala 
              100                 105                 110 
Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala 
         115                 120                 125 
Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala 
     130                 135                 140 
Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser 
145                 150                 155                 160 
Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro 
                  165                 170                 175 
(2)SEQ ID NO：95的资料： 
(i)序列特征： 
(A)长度：175个氨基酸 
(B)类型：氨基酸 
(D)拓扑学：线性 
(ii)分子类型：蛋白质 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：95： 
Met Thr Pro Leu Glu Pro Ala Ser Ser Leu Pro Glu Ser Phe Leu Leu 
  1               5                  10                  15 
Lys Cys Leu Glu Glu Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu 
               20                  25                  30 
Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu 
          35                  40                  45 
Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 
      50                  55                  60 
Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His 
 65                  70                  75                  80 
Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile 
                    85                  90                  95 
Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala 
              100                 105                 110 
Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala 
          115                 120                 125 
Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala 
      130                 135                 140 
Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser 
145                 150                 155                 160 
Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro 
                  165                 170                 175 
(2)SEQ ID NO：96的资料： 
(i)序列特征： 
(A)长度：175个氨基酸 
(B)类型：氨基酸 
(D)拓扑学：线性 
(ii)分子类型：蛋白质 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：96： 
Met Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Glu Ser Phe Leu Leu 
  1               5                  10                  15 
Lys Cys Leu Glu Glu Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu 
               20                  25                  30 
Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu 
          35                  40                  45 
Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 
       50                  55                  60 
Cys Pro Ser Glu Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His 
 65                  70                  75                  80 
Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile 
                     85                  90                  95 
Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala 
              100                 105                 110 
Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala 
          115                  120                  125 
Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala 
     130                  135                  140 
Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser 
145                 150                 155                 160 
Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro 
                  165                 170                 175 
(2)SEQ ID NO：97的资料： 
(i)序列特征： 
(A)长度：175个氨基酸 
(B)类型：氨基酸 
(D)拓扑学：线性 
(ii)分子类型：蛋白质 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：97： 
Met Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Gly Phe Leu Leu 
  1               5                  10                  15 
Lys Cys Leu Ala Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu 
               20                  25                  30 
Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu 
          35                  40                  45 
Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 
      50                  55                  60 
Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His 
65                  70                  75                  80 
Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile 
                    85                  90                  95 
Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala 
              100                 105                 110 
Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala 
         115                 120                 125 
Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala 
     130                 135                 140 
Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser 
145                 150                 155                 160 
Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro 
                  165                 170                 175 
(2)SEQ ID NO：98的资料： 
(i)序列特征： 
(A)长度：175个氨基酸 
(B)类型：氨基酸 
(D)拓扑学：线性 
(ii)分子类型：蛋白质 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：98： 
Met Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu 
  1               5                  10                  15 
Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu 
               20                  25                  30 
Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu 
          35                  40                  45 
Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 
      50                  55                  60 
Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His 
 65                  70                  75                  80 
Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile 
                    85                  90                  95 
Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala 
              100                 105                 110 
Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Leu Ala 
          115                 120                 125 
Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Leu Pro Ala Phe Ala Ser Ala 
     130                 135                 140 
Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser 
145                 150                 155                 160 
Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro 
                  165                 170                 175 
(2)SEQ ID NO：99的资料： 
(i)序列特征： 
(A)长度：175个氨基酸 
(B)类型：氨基酸 
(D)拓扑学：线性 
(ii)分子类型：蛋白质 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：99： 
Met Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ala Phe Leu Leu 
  1               5                  10                  15 
Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu 
               20                  25                  30 
Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu 
           35                  40                  45 
Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 
      50                  55                  60 
Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His 
65                  70                  75                  80 
Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile 
                    85                  90                  95 
Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala 
              100                 105                 110 
Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala 
         115                 120                 125 
Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala 
      130                 135                 140 
Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser 
145                 150                 155                 160 
Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro 
                  165                 170                 175 
(2)SEQ ID NO：100的资料： 
(i)序列特征： 
(A)长度：175个氨基酸 
(B)类型：氨基酸 
(D)拓扑学：线性 
(ii)分子类型：蛋白质 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：100： 
Met Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu 
  1               5                  10                  15 
Ala Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu 
               20                  25                  30 
Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu 
          35                  40                  45 
Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 
      50                  55                  60 
Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His 
 65                  70                  75                  80 
Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile 
                    85                  90                  95 
Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala 
              100                 105                 110 
Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala 
         115                 120                 125 
Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala 
     130                 135                 140 
Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser 
145                 150                 155                 160 
Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro 
                  165                 170                 175 
(2)SEQ ID NO：101的资料： 
(i)序列特征： 
(A)长度：175个氨基酸 
(B)类型：氨基酸 
(D)拓扑学：线性 
(ii)分子类型：蛋白质 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：101： 
Met Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu 
  1               5                  10                  15 
Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu 
               20                  25                  30 
Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu 
          35                  40                  45 
Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 
      50                  55                  60 
Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His 
 65                  70                  75                  80 
Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile 
                    85                  90                  95 
Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala 
              100                 105                 110 
Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Ala Met Glu Glu Leu Gly Met Ala 
         115                 120                 125 
Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala 
     130                 135                 140 
Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser 
145                 150                 155                 160 
Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro 
                  165                 170                 175 
(2)SEQ ID NO：102的资料： 
(i)序列特征： 
(A)长度：175个氨基酸 
(B)类型：氨基酸 
(D)拓扑学：线性 
(ii)分子类型：蛋白质 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：102： 
Met Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu 
  1               5                  10                  15 
Lys Cys Leu Glu Ala Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu 
               20                  25                  30 
Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu 
          35                  40                  45 
Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 
      50                  55                  60 
Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His 
 65                  70                  75                  80 
Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile 
                    85                  90                  95 
Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala 
              100                 105                 110 
Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala 
         115                 120                 125 
Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala 
     130                 135                 140 
Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser 
145                 150                 155                 160 
Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro 
                  165                 170                 175 
(2)SEQ ID NO：103的资料： 
(i)序列特征： 
(A)长度：175个氨基酸 
(B)类型：氨基酸 
(D)拓扑学：线性 
(ii)分子类型：蛋白质 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：103： 
Met Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu 
  1               5                  10                  15 
Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu 
               20                  25                  30 
Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys Ala Pro Glu Glu Leu 
          35                  40                  45 
Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 
      50                  55                  60 
Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His 
 65                  70                  75                  80 
Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile 
                    85                  90                  95 
Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala 
              100                 105                 110 
Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala 
         115                 120                 125 
Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala 
     130                 135                 140 
Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser 
145                 150                 155                 160 
Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro 
                  165                 170                 175 
(2)SEQ ID NO：104的资料： 
(i)序列特征： 
(A)长度：175个氨基酸 
(B)类型：氨基酸 
(D)拓扑学：线性 
(ii)分子类型：蛋白质 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：104： 
Met Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu 
  1               5                  10                  15 
Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu 
               20                  25                  30 
Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu 
          35                  40                  45 
Val Leu Leu Gly Ala Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 
      50                  55                  60 
Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His 
 65                  70                  75                  80 
Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile 
                    85                  90                  95 
Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala 
              100                 105                 110 
Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala 
         115                 120                 125 
Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala 
      130                 135                 140 
Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser 
145                 150                 155                 160 
Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro 
                  165                 170                 175 
(2)SEQ ID NO：105的资料： 
(i)序列特征： 
(A)长度：175个氨基酸 
(B)类型：氨基酸 
(D)拓扑学：线性 
(ii)分子类型：蛋白质 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：105： 
Met Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu 
  1               5                  10                  15 
Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu 
               20                  25                  30 
Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu 
           35                  40                  45 
Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 
      50                  55                  60 
Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His 
 65                  70                  75                  80 
Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile 
                    85                  90                  95 
Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Ala Val Ala 
              100                 105                 110 
Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala 
         115                 120                 125 
Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala 
     130                 135                 140 
Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser 
145                 150                 155                 160 
Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro 
                  165                 170                 175 
(2)SEQ ID NO：106的资料： 
(i)序列特征： 
(A)长度：175个氨基酸 
(B)类型：氨基酸 
(D)拓扑学：线性 
(ii)分子类型：蛋白质 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：106： 
Met Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu 
  1               5                  10                  15 
Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu 
               20                  25                  30 
Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu 
          35                  40                  45 
Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 
      50                  55                  60 
Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His 
 65                  70                  75                  80 
Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile 
                    85                  90                  95 
Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala 
              100                 105                 110 
Ala Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala 
         115                 120                 125 
Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Me Pro Ala Phe Ala  Ser Ala 
     130                 135                 140 
Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser 
145                 150                 155                 160 
Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg Mis Leu Ala Gln Pro 
                  165                 170                 175 
(2)SEQ ID NO：107的资料： 
(i)序列特征： 
(A)长度：175个氨基酸 
(B)类型：氨基酸 
(D)拓扑学：线性 
(ii)分子类型：蛋白质 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：107： 
Met Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu 
  1               5                  10                  15 
Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu 
               20                  25                  30 
Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu 
           35                  40                  45 
Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 
       50                  55                  60 
Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His 
 65                  70                  75                  80 
Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile 
                    85                  90                  95 
Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Va lAla 
              100                 105                 110 
Asp Phe Ala Thr Ala Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala 
         115                 120                 125 
Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala 
      130                 135                 140 
Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser 
145                 150                 155                 160 
Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro 
                  165                 170                 175 
(2)SEQ ID NO：108的资料： 
(i)序列特征： 
(A)长度：175个氨基酸 
(B)类型：氨基酸 
(D)拓扑学：线性 
(ii)分子类型：蛋白质 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：108： 
Met Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu 
  1               5                  10                  15 
Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Ala Gly Ala Ala Leu 
               20                  25                  30 
Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu 
          35                  40                  45 
Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 
      50                  55                  60 
Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His 
 65                  70                  75                  80 
Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile 
                    85                  90                  95 
Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Ala Val Ala 
              100                 105                 110 
Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala 
          115                 120                 125 
Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala 
      130                 135                 140 
Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser 
145                 150                 155                 160 
Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg Mis Leu Ala Gln Pro 
                  165                 170                 175 
(2)SEQ ID  NO：109的资料： 
(i)序列特征： 
(A)长度：175个氨基酸 
(B)类型：氨基酸 
(D)拓扑学：线性 
(ii)分子类型：蛋白质 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：109： 
Met Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu 
  1               5                  10                  15 
Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu 
               20                  25                  30 
Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu 
          35                  40                  45 
Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 
      50                  55                  60 
Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His 
 65                  70                  75                  80 
Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile 
                    85                  90                  95 
Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala 
              100                 105                 110 
Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Ala Leu Gly Met Ala 
         115                 120                 125 
Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala 
     130                 135                 140 
Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser 
145                 150                 155                 160 
Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro 
                  165                 170                 175 
(2)SEQ ID NO：110的资料： 
(i)序列特征： 
(A)长度：175个氨基酸 
(B)类型：氨基酸 
(D)拓扑学：线性 
(ii)分子类型：蛋白质 
(xi)序列描述：SEQ ID NO：110： 
Met Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu 
  1               5                  10                  15 
Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu 
               20                  25                  30 
Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu 
          35                  40                  45 
Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 
      50                  55                  60 
Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His 
 65                  70                  75                  80 
Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile 
                    85                  90                  95 
Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala 
              100                 105                 110 
Asp Val Ala Thr Ala Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala 
         115                 120                 125 
Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala 
     130                 135                 140 
Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser 
145                 150                 155                 160 
Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro 
                  165                 170                 175 
Figure IYZ000002481805600031
Figure IYZ000002481805600041
Figure IYZ000002481805600051
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Claims (4)

1.一种G-CSF分子，其任选地带有N末端甲二磺酰残基，其包含：
(a)图4给出的G-CSF内核螺旋A、B、C和D，所述内核螺旋包含SEQ ID NO.2给出的相应氨基酸残基，任选地第18位的半胱氨酸残基被改变为丝氨酸或丙氨酸残基；
(b)在螺旋A和B之间的外环，其包含SEQ ID NO.2给出的相应氨基酸残基；
(c)在螺旋B和C之间的外环，其包含SEQ ID NO.2给出的相应氨基酸残基；
(d)在螺旋D和A之间的外环；和
(e)N末端和C末端，所述N末端与螺旋D相连，所述C末端与螺旋C相连，所述N末端和C末端各包含SEQ ID NO.2的氨基酸120-146部分。
2.一种G-CSF分子，其任选地带有N末端甲二磺酰残基，其包含：
(a)图4给出的G-CSF内核螺旋A、B、C和D，所述内核螺旋包含SEQ ID NO.2给出的相应氨基酸残基，任选地第18位的半胱氨酸残基被改变为丝氨酸或丙氨酸残基；
(b)在螺旋C和D之间的外环，其包含SEQ ID NO.2给出的相应氨基酸残基；
(c)在螺旋B和C之间的外环，其包含SEQ ID NO.2给出的相应氨基酸残基；
(d)在螺旋D和A之间的外环；和
(e)N末端和C末端，所述N末端与螺旋B相连，所述C末端与螺旋A相连，所述N末端和C末端各包含SEQ ID NO.2的氨基酸39-73部分。
3.一种G-CSF分子，其任选地带有N末端甲二磺酰残基，其包含：
(a)图4给出的G-CSF内核螺旋A、B、C和D，所述内核螺旋包含SEQ ID NO.2给出的相应氨基酸残基，任选地第18位的半胱氨酸残基被改变为丝氨酸或丙氨酸残基；
(b)在螺旋A和B之间的外环，其包含SEQ ID NO.2给出的相应氨基酸残基；
(c)在螺旋C和D之间的外环，其包含SEQ ID NO.2给出的相应氨基酸残基；
(d)在螺旋D和A之间的外环；和
(e)N末端和C末端，所述N末端与螺旋C相连，所述C末端与螺旋B相连，所述N末端和C末端各包含SEQ ID NO.2的氨基酸92-101部分。
4.一种药物组合物，其含有权利要求1、2或3的G-CSF分子和药用载体。
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