CN1211279A - 用于治疗和诊断乳腺癌的组合物和方法 - Google Patents
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Abstract
本文公开了用于乳腺癌的检测与治疗的组合物和方法。所提供的化合物包括优先在乳腺肿瘤组织中表达的核苷酸序列,以及由这些核苷酸序列编码的多肽。本发明也提供了包含这些化合物的疫苗和药物组合物,它们可以用于,例如,预防与治疗乳腺癌。所说的多肽也可以用于产生在诊断和监测患者中乳腺癌的发展上有用的抗体。
Description
技术领域
本发明总的来说涉及乳腺癌的检测和治疗方法。更具体地说本发明涉及优先在乳腺癌组织中表达的核苷酸序列和由这些核苷酸序列编码的多肽。所说的核苷酸序列与多肽可以用于预防和治疗乳腺癌的疫苗和药物组合物中。这些多肽也可以用于产生化合物(如抗体)，所说的化合物在诊断和检测患者乳腺癌的发展中是有用的。
发明背景
乳腺癌在美国和整个世界对妇女来说是一个重要的健康问题。尽管这种疾病的检测和治疗已经有了很大的进展，但是对于妇女来说，在与癌症有关的死亡中，乳腺癌仍然是第二大原因，在美国每年受此影响的妇女超过180,000。在北美，目前长期患有乳腺癌的妇女占1/8。
目前还没有任何预防或者治疗乳腺癌的疫苗或者其它普遍成功的方法。目前这种疾病的治疗依赖于早期诊断(通过常规乳腺的荧光屏检查方法)和积极治疗，所说的积极治疗包括各种治疗(如外科，放疗，化疗以及激素治疗)的一种或多种。通常根据各种预后参数(包括特异性肿瘤标记物的分析)选择特定乳腺癌的治疗过程。例如参见，Porter-Jordan和Lippman，乳腺癌8:73-100(1994)。然而，已确立的标记物的使用常常导致难以解释的结果，并且观察到的乳腺癌患者的死亡率较高的结果表明需要改进这种疾病的治疗，诊断和预防。
因此，本领域有必要改进治疗和诊断乳腺癌的方法。本发明满足了这些需要，另外本发明还具有其它相关的优点。
发明概述
简言之，本发明提供了用于诊断和治疗乳腺癌的组合物和方法。在一个方面，本发明提供了分离的DNA分子，所说的DNA分子包含：(a)相对于正常组织，优先在乳腺癌组织中表达的核苷酸序列；(b)这种序列的变体，其在不超过20％(优选的是不超过5％)的核苷酸位置上含有一个或多个核苷酸取代，缺失，插入和/或修饰，这样保留了由此核苷酸序列编码的多肽的抗原和/或免疫原性质；或(c)编码多肽表位的核苷酸序列，所说的多肽由至少上述序列的一种编码。在一个实施方案中，所说的分离的DNA分子包含如SEQ ID NO:1所示的人内源性逆转录病毒序列。在其它的实施方案中，所说的分离的DNA分子包含如SEQ ID NO:3-SEQ ID NO:77或SEQID NOS:142、143、146-152、154-166、168-176、178-192、194-198、200-204、206、207、209-214、216、218、219、221-227之任一所示的核苷酸序列。
在相关实施方案中，分离的DNA分子编码多肽的表位，其中所说的多肽由下列核苷酸序列编码：(a)在严格的杂交条件下，与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3-SEQ ID NO:77或SEQ ID NOS:142、143、146-152、154-166、168-176、178-192、194-198、200-204、206、207、209-214、216、218、219、221-227之任一所示的序列杂交；(b)与SEQID NO:1或SEQ ID NO:3-SEQ ID NO:77或SEQ ID NOS:142、143、146-152、154-166、168-176、178-192、194-198、200-204、206、207、209-214、216、218、219、221-227之任一所示的序列具有至少80％的相同性；其中相当于所说的核苷酸序列的RNA在人乳腺癌组织中较在正常的乳腺组织中，以更高的水平表达。
在另一个实施方案中，本发明提供了编码多肽表位的分离的DNA分子，所说的多肽由下列核苷酸序列编码：(a)由SEQ ID NO:141序列转录的核苷酸序列；或者(b)这种核苷酸序列的变体，其只是在20％的核苷酸位置上含有一个或多个核苷酸取代，缺失，插入和/或修饰，这样保留了由此核苷酸序列编码的多肽的抗原和/或免疫原性质。本发明也提供了含有与以上所述的DNA分子互补之核苷酸序列的分离的DNA和RNA分子。
在相关方面，本发明提供了包含如上所述DNA分子的重组表达载体和由此表达载体转化或转染的宿主细胞。
在另一方面，本发明也提供了含有由如上所述DNA分子编码的氨基酸序列的多肽，与这种多肽结合的单克隆抗体。
在又一方面，本发明提供了确定患者存在乳腺癌的方法。在一个实施方案中，此方法包括在生物样品中检测如上所述的多肽。在另一个实施方案中，此方法包括在生物样品中检测编码如上所述多肽的RNA分子。在又一个实施方案中，此方法包括(a)使用如上所述的多肽对患者进行皮内注射；和(b)检测患者皮肤上的免疫反应，并由此检测患者乳腺癌的存在。在另外的实施方案中，本发明提供了检测如上所述患者是否存在乳腺癌的方法，其中所说的多肽由下列核苷酸序列编码：SEQ ID NO.:78-86,SEQID NOS:144、145、153、167、177、193、199、205、208、215、217、220及在严格条件下与它们杂交的序列。
在相关方面，本发明提供了对确定乳腺癌有用的诊断试剂盒。所说的诊断试剂盒一般包含一种或多种如上所述的单克隆抗体，或者一种或多种与多肽(这种多肽由下列核苷酸序列编码：SEQ ID NOS:78-86、SEQ IDNOS:144、145、153、167、177、193、199、205、208、215、217、220)结合的单克隆抗体和检测试剂。
在相关方面，所说的诊断试剂盒包含第一个聚合酶链反应引物和第二个聚合酶链反应引物，这两个引物都包含如上所述的RNA分子或者编码多肽的RNA分子(所说的多肽由下列核苷酸序列编码：SEQ ID NOS:78-86、SEQ ID NOS:144、145、153、167、177、193、199、205、208、215、217、220)的至少大约10个邻接的核苷酸。
在另一个相关方面，所说的诊断试剂盒包含至少一个寡核苷酸探针，所说的探针包含如上所述的DNA分子或者选自下组的DNA分子(SEQ IDNOS:78-86、SEQ ID NOS:144、145、153、167、177、193、199、205、208、215、217、220)的大约15个邻接的核苷酸。
在另一个相关方面，本发明提供了监测患者乳腺癌发展的方法。在一个实施方案中，此方法包括：(a)在生物样品中，在第一个时间点上检测如上所述的多肽的量；(b)在随后的时间点上重复步骤(a)；和(c)比较步骤(a)和(b)测得的多肽的量，由此监测患者乳腺癌的进展。在另一个实施方案中，此方法包括：在生物样品中，在第一个时间点上检测编码如上所述多肽的RNA分子的量；(b)在随后的时间点上重复步骤(a)；和(c)比较步骤(a)和(b)测得的RNA分子的量，由此监测患者乳腺癌的进展。在又一个实施方案，本发明提供了监测如上所述患者乳腺癌进展的方法，其中所说的多肽由下列核苷酸序列编码：SEQ ID NO.:78-86、SEQ ID NOS:144、145、153、167、177、193、199、205、208、215、217、220和在严格条件下与它们杂交的序列。
在其它方面，本发明提供了药物组合物(其包含如上所述的多肽和与之组合在一起的生理上可接受的载体)和疫苗(其包含如上所述的多肽和与之组合在一起的免疫应答增强子或佐剂)。在另一方面，本发明提供了包含由下列核苷酸序列编码的多肽的药物组合物和疫苗：SEQ ID NO.:78-86、SEQ ID NOS:144、145、153、167、177、193、199、205、208、215、217、220和在严格条件下与它们杂交的序列。
在相关方面，本发明提供了抑制患者乳腺癌发展的方法，这种方法包括向患者施用如上所述药物组合物或疫苗。
参照下列详细描述和附图，本发明的这些和其它方面将显而易见。本文公开的所有参考文献，如同每一篇分别引用，其全部内容本文一并参考。
附图的简要描述
图1显示的是经凝胶电泳分离的差示PCR产物，所说的PCR产物是从由正常乳腺组织制备的cDNA(1和2道)和由同一患者的乳房肿瘤组织制备的cDNA(3和4道)获得的。
图2是比较乳腺癌组织(1道)和正常乳腺组织中B18Ag1mRNA水平的northern印迹。
图3是乳腺癌组织中B18Ag1mRNA的水平与各种正常的及非乳腺癌组织中的B18Ag1mRNA水平比较，所得的值是通过RNase保护测定获得的。
图4是基因组克隆图谱，其显示出由Xbal限制酶切消化末端获得的附加的逆转录病毒序列(如SEQ ID NO:3-SEQ ID NO:10所示)相对于B18Ag1的位置。
图5A和5B显示测序方案，基因组的组构和预测的包含B18Ag1的逆转录病毒元件的开放读框。
图6显示典型的乳房肿瘤特异性cDNA B18Ag1的核苷酸序列。
图7显示典型的乳房肿瘤特异性cDNA B17Ag1的核苷酸序列。
图8显示典型的乳房肿瘤特异性cDNA B17Ag2的核苷酸序列。
图9显示典型的乳房肿瘤特异性cDNA B13Ag2a的核苷酸序列。
图10显示典型的乳房肿瘤特异性cDNA B13Ag1b的核苷酸序列。
图11显示典型的乳房肿瘤特异性cDNA B13Ag1a的核苷酸序列。
图12显示典型的乳房肿瘤特异性cDNA B11Ag1的核苷酸序列。
图13显示典型的乳房肿瘤特异性cDNA B3CA3c的核苷酸序列。
图14显示典型的乳房肿瘤特异性cDNA B9CG1的核苷酸序列。
图15显示典型的乳房肿瘤特异性cDNA B9CG3的核苷酸序列。
图16显示典型的乳房肿瘤特异性cDNA B2CA2的核苷酸序列。
图17显示典型的乳房肿瘤特异性cDNA B3CA1的核苷酸序列。
图18显示典型的乳房肿瘤特异性cDNA B3CA2的核苷酸序列。
图19显示典型的乳房肿瘤特异性cDNA B3CA3的核苷酸序列。
图20显示典型的乳房肿瘤特异性cDNA B4CA1的核苷酸序列。
图21A描述在乳腺癌组织(1-8道)和正常的乳腺组织(9-13道)和H2O(14道)中的乳腺癌基因的RT-PCR分析。
图21B描述了在前列腺肿瘤(1,2道)、结肠肿瘤(3道)、肺肿瘤(4道)、正常的前列腺(5道)、正常的结肠(6道)、正常的肾(7道)、正常的肝(8道)、正常的肺(9道)、正常的卵巢(10,18道)、正常的胰腺(11,12道)、正常的骨胳肌(13道)、正常的皮肤(14道)、正常的胃(15道)、正常的睾丸(16道)、正常的小肠(17道)、HBL-100(19道)、MCF-12A(20道)、乳腺癌(21-23道)、H2O(24道)、结肠肿瘤(25道)的乳腺癌基因的RT-PCR分析。
发明的详细描述
如上所述，本发明通常针对于诊断，检测和治疗乳腺癌的组合物和方法。本文描述的组合物包括多肽，核酸序列和抗体。一般来说，本发明的多肽包含至少蛋白质的一部分，所说的蛋白质在人乳腺癌组织中较在正常的人乳腺组织中表达水平要更高(即在肿瘤组织中编码所说多肽的RNA水平至少高出2倍)。本文将这种多肽称为乳房肿瘤特异性多肽，编码这种多肽的cDNA分子称为乳腺癌特异性cDNAs。本发明的核酸序列通常包括DNA或者RNA序列，所说的DNA或者RNA序列编码上述多肽的全部或部分，或者是与这种序列互补的序列。抗体通常是能够与上述多肽的一部分结合的免疫系统的蛋白质或者它的片段。可以通过细胞培养技术产生抗体(包括产生如本文所述的单克隆抗体)，或者通过将抗体基因转染到合适的细菌或者哺乳动物细胞中，以便产生重组抗体。
在本发明的范围内，多肽包括(但不限于)由人内源性逆转录病毒序列编码的多肽(和它的表位，如称为B18Ag1的序列(图5和SEQ ID NO:1))。另外，由含有B18Ag1的逆转录病毒基因组之内的其它序列(SEQ ID NO:141)编码的多肽也包括在本发明的范围内。所说的序列包括(但不限于)SEQ IDNO:3-SEQ ID NO:10所示的序列。如Werner等所述(病毒学174:225-238(1990)),B18Ag1与内源性人逆转录病毒元件的gag p30基因具有同源性，另外，其与大约三十个其它的逆转录病毒gag基因具有同源性。如下文详细讨论的，本发明也包括大量的其它乳腺癌特异性多肽，如那些由下列核苷酸序列编码的多肽：SEQ ID NO:11-SEQ ID NO:77和SEQID NOS:142、143、146-152、154-166、168-176、178-192、194-198、200-204、206、207、209-214、216、218、219、221-227。本文所用的术语＂多肽＂包括任何长度的氨基酸链，其中包括含有本文所引用的序列的全长蛋白质。包含蛋白质(含有本文所述的序列)表位的多肽可以完全由所述的表位组成或者可以含有其它的序列。所述的其它序列可以来源于该种天然蛋白质或者可以是异源的，这种序列可以(但不是必需)具有免疫原或者抗原特性。
本文所用的＂表位＂是可以被B细胞和/或T细胞表面抗原受体识别(即特异结合)的多肽的一部分。通常可以使用公知的技术鉴定表位，如Paul在“基础免疫学”(第三版，243-247,Raven出版社，1993)及其中所引用的参考文献中描述的技术。这样的技术包括从天然多肽中筛选能够与抗原特异性抗血清和/或T细胞系或克隆进行反应的多肽。多肽的表位是能够以与全长多肽反应性(如在ELISA和/或T细胞反应性测定中测定的反应性)相似的水平与这种抗血清和/或T细胞反应的部分。通常可以使用本领域普通技术人员公知的方法完成这种筛选，如Harlow和Lane在“抗体”(实验手册，冷泉港实验室，1988)中所描述的方法。也可以通过计算机分析预测B细胞和T细胞表位。包含优先在肿瘤组织中表达的多肽之表位的多肽(含有或不含有其它的氨基酸序列)也属于本发明的范围内。
本发明的组合物和方法也包括上述多肽的变体和编码这些多肽的核酸序列。本文所使用的多肽＂变体＂是与天然多肽在取代和/或修饰方面不同的多肽，最终保留了所说多肽的抗原和/或免疫原特性。通常可以通过修饰一个上述多肽序列并评价修饰的多肽与上述的抗血清和/或T细胞的反应性来鉴定这种变体。核酸变体可以含有一个或多个取代，缺失，插入和/或修饰，最终保留了这种编码多肽的抗原和/或免疫原特性。本文描述的优选的多肽变体是指在不超过20％的核苷酸位置上含有核苷酸取代，缺失，插入和/或修饰的变体。
优选的是变体含有保守取代。＂保守取代＂是指其中的氨基酸由另一个性质相似的氨基酸取代，这样，肽化学领域的技术人员可以预料到这种多肽二级结构和亲水特性实质上没有变化。一般来说，下列氨基酸组为保守变化：(1)ala、pro、gly、glu、asp、gln、asn、ser、thr；(2)cys、ser、tyr、thr；(3)val、ile、leu、met、ala、phe；(4)lys、arg、his；和(5)phe、tyr、trp、his。
例如也可以通过使对此多肽的免疫原或者抗原特性，二级结构和亲水性影响不大的氨基酸进行缺失或添加来修饰变体。例如，可以将多肽在蛋白质的N末端与信号(或前导)序列缀合，所说的信号序列在共翻译或翻译后指导此蛋白质的转移。也可以将此多肽与接头或其它序列缀合，这些序列有利于此多肽的合成，纯化或鉴定(例如poly-His)，或者可以增强此多肽与固相支持物的结合。例如，可以将多肽与免疫球蛋白Fc区缀合。
一般来说，可以使用多种技术中的任何一种制备编码本文所述多肽全部或部分的核苷酸序列。例如，在相应mRNAs的乳腺癌特异性表达的基础上使用差示PCR克隆编码这种多肽的cDNA分子。此技术能够比较由正常和乳腺癌组织中制备的RNA模板获得的扩增产物。可以使用(dT)12AG引物经RNA逆转录制备cDNA。使用随机引物扩增所得的cDNA后，从银染色的凝胶上切除相当于肿瘤RNA特异扩增产物的带，并将其亚克隆到合适的载体，如T-载体(Novagen,Madison,WI)。可以使用SEQ ID NO:87-125所示的随机引物由上面制备的cDNA扩增编码本文公开的乳腺癌特异性多肽全部或部分的核苷酸序列。
另外，可以从人基因组DNA或者乳腺癌cDNA经聚合酶链反应扩增编码本文所述的多肽的基因(或它的一部分)。对于这一方法，可以基于SEQ IDNO:1中提供的序列设计B18Ag1序列特异性引物，也可以购买或合成这种引物。一对用于由乳腺癌cDNA扩增的合适的引物是(5′ATG GCT ATTTTC GGG GGC TGA CA)(SEQ ID NO.:126)和(5′CCG GTA TCT CCTCGT GGG TAT T)(SEQ ID NO.:127)。然后，使用公知的技术(例如Sambrook等所述(分子克隆，实验手册，冷泉港实验室，冷泉港，NY(1989))可以将B18Ag1的扩增部分用于分离来源于人基因组DNA文库或来源于乳腺癌cDNA文库的全长基因。在B18Ag1逆转录病毒基因组中的其它序列可以是类似地通过使用B18Ag1特异性序列作为探针通过筛选人基因组文库制备的序列。然后，通过克隆相应的cDNAs，预测开放读框以及将相应的cDNAs克隆到含有病毒启动子(例如T7)的载体中，确定SEQ ID NO:141所示的逆转录病毒基因组中的翻译成蛋白质的核苷酸。可以使用本领域技术人员公知的技术在翻译反应中使用所得的构建体，以便鉴定翻译成表达蛋白的核苷酸序列。同样，可以以SEQ ID NO:11-SEQ ID NO:86和SEQID NO:142-SEQ ID NO:226所示的核苷酸序列为基础设计本文描述的其它乳腺癌特异多肽的特异引物。
可以很容易地由所说的DNA序列制备由上述DNA序列编码的重组多肽。例如，可以使用市售的滤膜首先浓缩合适的宿主/载体系统的上清液，所说的宿主/载体系统向培养基中分泌重组蛋白质或多肽。浓缩后将浓缩物加入到合适的纯化基质(如亲和基质或者离子交换树脂中)。最后，为了进一步纯化重组多肽，可以使用一个或多个反相HPLC步骤。
一般来说，可以使用任何本领域普通技术人员公知的表达载体来表达本发明的重组多肽。可以在由表达载体转化或转染的任何合适的宿主细胞中进行表达，所示的表达载体包含编码重组多肽的DNA分子。合适的宿主细胞包括原核细胞，酵母和高等真核细胞。优选地，所用的宿主细胞为大肠杆菌，酵母或者哺乳动物细胞系(如COS或者CHO)。
也可以使用这些技术制备含有表位的多肽或天然多肽变体。例如，通常可以使用标准诱变技术(如寡核苷酸定点特异诱变)制备天然多肽的变体，并且可以除去DNA序列部分以便可以制备截短的多肽。也可以使用本领域普通技术人员公知的技术通过合成方法产生少于大约100个氨基酸(通常少于50个氨基酸)的部分和其它变体。例如，可以使用任何市售的固相技术合成这种多肽，如Merrifield固相合成方法，其中的氨基酸依次加入到延长的氨基酸链中。参见Merrifield，美国化学协会杂志85:2149-2146(1963)。可以从供应商(如应用生物系统公司，Foster城，CA)购买用于多肽自动合成的设备，并且按照厂商的说明进行操作。
在特定的实施方案中，本发明的多肽包含由具有下列任一序列的DNA分子编码的氨基酸序列：SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3-SEQ ID NO:77或SEQ ID NO:142、143、146-152、154-166、168-176、178-192、194-198、200-204、206、207、209-214、216、218、219、221-227；由DNA分子编码的多肽的变体，所说的DNA分子在不多于20％的核苷酸位置上含有一个或多个核苷酸取代，缺失，插入和/或修饰；和上述多肽的表位。本发明的多肽也包括由能够与下列DNA分子之一在严格的条件下杂交的DNA序列编码的多肽(和它的表位)：SEQ ID NO:1或SEQID NO:3-SEQ ID NO:77或SEQ ID NOS:142、143、146-152、154-166、168-176、178-192、194-198、200-204、206、207、209-214、216、218、219、221-227，其中所说的DNA序列在全部序列上与所示的序列具有至少80％的等同性，相当于此核苷酸序列的RNA在人乳腺癌组织中较在正常的乳腺组织中表达水平更高。本文所用的＂严格条件＂是指在6X SSC,0.2％SDS溶液中预洗涤；65℃下在6X SSC,0.2％SDS中过夜杂交；之后，65℃下在1X SSC,0.1％SDS中洗涤两次，每次30分钟；然后再于65℃下1X SSC,0.1％SDS中洗涤两次，每次30分钟。按照本发明的DNA分子包括编码上述任何多肽的分子。
在另一方面，本发明提供了抗体。可以通过本领域普通技术人员公知的众多技术中的任何一种来制备这种抗体。例如参见Harlow和Lane，抗体，实验手册，冷泉港实验室，1988。在这一技术中，首先将包含多肽的免疫原注射到众多哺乳动物(如小鼠、大鼠、兔、绵羊和山羊)的任何一种中。在这一步骤中，本发明的多肽可以在没有任何修饰的情况下作为免疫原。另外，特别是对于比较短的多肽，如果此多肽与载体蛋白(如牛血清白蛋白和匙孔血蓝蛋白)结合，可以诱导高级免疫反应。将所说的免疫原注射到动物宿主中，优选的是按照预定的方案，并配合一次或多次加强免疫，同时定期对这些动物取血。然后，从这种抗血清中纯化此多肽特异的多克隆抗体，例如，使用与合适的固相支持物结合的多肽通过亲和层析进行纯化。
例如，可以使用Kohler和Milstein的技术(欧洲免疫学杂志6:511-519(1976))和其改进技术制备所说的兴趣抗原多肽的特异单克隆抗体。简言之，这些方法包括制备能够产生具有所需要的特异性之抗体(即可以与兴趣多肽反应)的无限增殖细胞系。例如可以从脾细胞产生这种细胞系，所说的脾细胞由按照如上所说方法免疫的动物中获得。然后，例如通过将这些脾细胞与骨髓瘤细胞融合伴侣(优选的骨髓瘤细胞融合伴侣与所说的免疫动物是同系的)融合来使之无限增殖。可以使用各种融合技术。例如，可以将脾细胞和骨髓瘤细胞与非离子去污剂结合几分钟，然后将它们以低密度接种在支持杂交细胞生长而不支持骨髓瘤细胞生长的选择培养基上。优选的选择技术使用HAT(次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸苷)选择。培养足够长的时间(通常1-2周)后，观察杂合体集落。选择单集落，并检测它们的培养物上清液与所说的多肽的结合活性。具有高反应性和特异性的杂交瘤是优选的。
可以从正在生长的杂交瘤集落的上清液中分离单克隆抗体。此外，可以使用各种技术提高产率，如可以将杂交瘤细胞系注射到合适的脊椎动物宿主(如小鼠)的腹腔中。然后从腹水或者血液中收获单克隆抗体。可以通过常规技术从此抗体中除去污染物，如层析、凝胶过滤、沉淀和抽提。本发明的多肽可以用于纯化方法中，例如用于亲和层析步骤中。
例如可以在检测患者乳腺癌的方法中使用抗体。这种方法包括使用抗体检测合适的生物样品中是否存在本文所述的乳腺癌特异性多肽。本文所说的“合适的生物样品”包括患者的肿瘤或正常组织的活检、乳房切除术、血液、淋巴结、血清或尿样、或者其它组织的匀浆、或者它们的提取物。
对于本领域普通技术人员来说，使用抗体检测样品中的多肽标记物可以有很多测定方法。例如参见Harlow和Lane，抗体，实验手册，冷泉港实验室，1988。例如，可以以Western印迹方式进行测定，其中对由所说的生物样品中获得的蛋白质制剂进行凝胶电泳，转移到合适的膜上，并使之与所说的抗体反应。然后可以使用下文描述的合适检测试剂检测此膜中抗体的存在。
在另一个实施方案中，所说的测定方法包括使用固定在固相支持物上的抗体与所说的多肽结合，并将其从样品的其余部分分离出来。然后可以使用含有报道基团的次级抗体或试剂检测结合的多肽。另外，可以使用竞争性测定，即将多肽用报道基团标记，并在所说的抗体与样品温育后，使之与固定的抗体结合。样品中的组分抑制所说的标记多肽与抗体结合的程度表明了这种样品与固定的抗体的反应性，结果表明了样品中多肽的浓度。
所说的固相支持物可以是本领域普通技术人员公知的任何可以与抗体结合的物质。例如，固相支持物可以是微量滴定板的试验孔或者硝酸纤维素滤膜或者其它合适的膜。另外，这种支持物可以是小珠、或者圆片(如玻璃)、玻璃纤维、胶乳或者塑料材料(如聚苯乙烯或者聚氯乙烯)。这种支持物也可以是磁性颗粒或者纤维光学传感器，如美国专利5,359,681所公开的那些物质。
可以使用本领域技术人员公知的各种技术将这种抗体固定在所说的固相支持物上，这些技术在专利和科学文献中已经充分描述。在本发明中，术语“固定”是指非共价结合(如吸附)和共价结合(这种结合可以通过抗原与支持物的功能基团直接连接，或者通过交联剂连接)。通过吸附作用与微量滴定板的孔或者膜进行固定是优选的。在这种情况下，可以通过使合适缓冲液中的抗体与固相支持物接触一段合适的时间来完成吸附。接触的时间取决于温度，但一般为大约1小时至1天。一般来说，将塑料微量滴定板(如聚苯乙烯或者聚氯乙烯)的孔与大约10ng至大约1μg(优选的是大约100-200ng)的抗体接触足以固定足量的多肽。
通常也可以通过使支持物首先与双官能试剂反应来使抗体与固相支持物共价结合，所说的双官能试剂既能够与支持物反应，又能够与抗体的官能基团(如羟基或者氨基基团)反应。例如，可以使用苯醌或者通过将支持物上的醛基团与结合伴侣的胺和活性氢缩合来使所说的抗体与具有合适聚合物涂层的支持物共价结合(例如参见Pierce，免疫技术目录和手册(1991)A12-A13)。
在某些实施方案中，检测样品中多肽的测定方法是双-抗体夹层测定。可以通过首先将已经固定在固相支持物(一般是微量滴定板的孔)上的抗体与所说的生物样品结合，这样可以使样品中的多肽与固定的抗体结合。然后从固定的多肽-抗体复合物中除去没有结合的样品，并加入能够与多肽上的不同位点结合的次级抗体(含有报道基团)。然后使用适合特异报道基团的方法测定与固相支持物结合的次级抗体的量。
更具体地说，一旦抗体如上所述固定在支持物上，一般来说就封阻了支持物上其余的蛋白质结合位点。可以使用本领域普通技术人员公知的任何合适的封阻试剂(如牛血清白蛋白或者吐温20TM(Sigma化学公司，St.Louis,MO))。然后将固定的抗体与样品一起温育，使多肽可以与该抗体结合。在温育前，可以用合适的稀释剂(如磷酸盐缓冲盐水(PBS))稀释样品。一般来说，合适的接触时间(即温育时间)是足以检测到样品中存在多肽的时间，所说的样品来源于乳腺癌患者个体。优选的接触时间是足以使结合水平达到结合多肽与未结合多肽平衡时的结合水平的至少95％。本领域普通技术人员知道可以通过测定一段时间的结合水平来很容易地确定达到平衡时所需要的时间。在室温下，温育大约30分钟一般是足够的。
然后可以通过用合适的缓冲液(如含有0.1％吐温20TM的PBS)洗涤固相支持物来除去未结合的样品。然后向固相支持物中加入含有报道基团的次级抗体。优选的报道基团包括酶(如辣根过氧化物酶)、底物、辅因子、抑制剂、染料、放射性核素、发光基团、荧光基团和生物素。可以使用本领域普通技术人员公知的标准方法使抗体与报道基团缀合。
然后将次级抗体与固定抗体-多肽复合物温育一段时间，所说的时间足以检测到结合的多肽。通常可以通过测定在一段时间内结合的水平来确定合适的时间。然后除去未结合的次级抗体，并使用报道基团测定结合的次级抗体。测定报道基团的方法取决于报道基团的性质。对于放射性基团，闪烁计数或者放射自显影方法通常是合适的。分光镜方法可以用于检测染料、发光基团和荧光基团。可以使用与不同报道基团(一般为放射性或者荧光基团或者酶)结合的亲和素测定生物素。通常可以通过加入底物(通常在特定时期)来检测酶报道基团，之后对反应产物进行分光镜或其它分析。
为了确定是否存在乳腺癌，通常把从仍然结合到固相支持物的报道基团检测到的信号和对应于从非肿瘤组织中得到的预先测定的截断值的信号相比较。在一个优选的实施方案中，截断值是将固定的抗体和无乳腺癌的患者样品一起培养而获得的平均信号值。一般来说，当产生信号样品的值大于预先测定的截断值三个标准偏差时，可以认为此样品对乳腺癌是阳性的。在交替的优选的实施方案中，使用收集器(Receiver)操纵基因曲线，按照Sackett等的方法(临床流行病学：临床医药基础科学，p.106-7(LittleBrown和Co.,1985))确定截断值。简言之，在这一实施方案中，可以从一个样品的真阳性率(即，敏感性)和假阳性率(100％特异性)作图确定截断值，所说的真、假阳性率和诊断试验结果的每个可能的截断值相对应。在图中最靠近左上角样品的截断值(即，包围最大的区域的值)是最精确的截断值，样品产生的信号比通过这种方法确定的截断值高时，可以认为此样品是阳性的。另外，截断值可以转移到图的左边，使得假阳性率最小；或转移到右边，使假阴性率最小。一般来说，如果样品产生的信号比通过这种方法确定的截断值高时，可以认为此样品对乳腺癌是阳性的。
在相关实施方案中，以流通或者带状检验方式进行测定，其中的抗体固定到膜(如硝酸纤维素)上。在流通检验中，当样品通过膜时，样品中的多肽结合到固定的抗体上。其次，当含有次级抗体的溶液流经膜时，标记的次级抗体就结合到抗体-多肽复合物上。然后可以按照如上所述进行结合的次级抗体的检测。在带状检验方式中，将膜的一端(结合抗体的端)浸没在含有样品的溶液中。样品沿着膜迁移，穿过含有次级抗体的区域，迁移到固定抗体的区域。在固定抗体区域的次级抗体的浓度表明存在乳腺癌。一般地，在那个位点的次级抗体的浓度产生了肉眼可见的带型(例如一条线)，这种带型的缺乏表明结果为阴性。一般来说，当生物样品含有一定量的在双抗体夹层测定(上述讨论的形式)中能足以产生阳性信号的多肽时，选择固定到膜上的抗体的量是以产生视觉上能辨认的带型为依据的。固定到膜上的抗体的量优选的为大约25ng-1μg，更优选的为大约50ng-1μg。通常可以使用少量的生物样品进行这种检测。
也可以通过评价生物样品(例如活组织检查、乳房切除术和/或患者的血液样品)中的编码本文所述的乳腺癌特异性多肽的mRNA水平与预测的截断值的相关性确定是否存在乳腺癌。可以使用任何一种本领域普通技术人员公知的方法(例如原位杂交和聚合酶链反应扩增)进行这种评价。例如，聚合酶链反应可以用来从cDNA扩增序列，所说的cDNA是由上述的任一种生物样品分离的RNA制备的。可以在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:11-SEQ ID NO:86和SEQ ID NO:142-SEQ ID NO:226之任一所提供的序列的基础上设计在这种扩增中使用的序列特异性引物，也可以购买或者合成。本文所提及的B18Ag1的合适的引物为B18Ag1-2(5′ATG GCT ATTTTC GGG GGC TGA CA)(SEQ ID NO.:126)和B18Ag1-3(5′CCG GTATCT CCT CGT GGG TAT T)(SEQ ID NO.:127)。然后可以通过凝胶电泳分离PCR反应产物，并按照本领域普通技术人员公知的方法目测检验。通常在由匹配的两种组织(来自相同个体的肿瘤和非肿瘤组织)或不匹配的两种组织(来自不同个体的肿瘤和非肿瘤组织)获得的样品上进行扩增。优选地，在一些跨越两个数量级的cDNA稀释液上进行扩增反应。和非肿瘤样品的同一稀释液相比，如果肿瘤样品的一些稀释液在表达上增加2倍或更多，就可以认为此样品为阳性的。
使用琼脂糖和溴化乙锭染色(在确定基因特异性时是重要的)的常规RT-PCR方案由于对它们进行定量所需要的时间和精力(即，饱和和/或滴定曲线的建立)及它们样品生产量等原因，不能有助于诊断试剂盒的发展。通过研究产生一种方法，例如实时RT-PCR来解决这一问题，所说的实时RT-PCR可以在单个的试管中进行测定，反之，也可以经改变用于96孔平板形式。可以从ABI/Perkin Elmer得到能完成这种方法的仪器。另外，其它的高生产量测定中，使用标记的探针(例如地高辛配基)和针对所说探针的标记(例如酶、荧光、放射性)的抗体，这种测定也可以用于96孔平板测定研究。
在另一种确定患者是否患有乳腺癌的方法中，可以在皮肤试验中，使用本文所述的一种或多种乳腺癌特异性多肽。本文所使用的＂皮肤试验＂是一种直接针对于病人进行的测定方法，对所说的病人进行真皮内注射一种或多种多肽来测定超敏(DTH)反应(如肿胀，变红或皮炎)。可以使用能够使多肽(或多种多肽)和病人的皮肤细胞接触的任何器械，例如结核菌素注射器或者1毫升注射器。优选地在注射至少48小时(更优选的为48-72小时)后测定反应。
DTH反应是一种细胞介导的免疫反应，以前接受过试验抗原(即所用的多肽的免疫原性部分或者它的变体)的患者发生较多这种反应。可以使用直尺进行视觉测量。一般来说，一个反应直径超过大约0.5cm(优选的直径超过5.0cm)，那么此反应为阳性反应，表明病人具有乳腺癌。
本文所描述的用于皮肤试验的乳腺癌特异性多肽优选地配制成含有至少一种多肽和生理上可接受的载体(如水、盐水、醇或者缓冲液)的药物组合物。这种组合物一般含有一种或多种以上多肽，所说的多肽的量的范围为在0.1ml的总体积中有大约1μg-100μg，优选的是10μg-50μg。优选地，在这种药物组合物中使用的载体是具有合适的防腐剂的盐水溶液，如苯酚和/或吐温80TM。
在本发明的其它方面，可以通过进行一段时间的上述任何一种测定分析和评价反应水平的变化(即，检测的多肽或mRNA的量，或在皮肤试验时检测到的免疫应答的程度)来监测处理的乳腺癌的发展和/或反应。例如，可以每一个月或两个月进行一次测定，这样测定1至2年。一般来说，在那些反应水平随时间增加的患者中，乳腺癌有所发展。相反，当检测的信号仍保持不变或随时间减少时，乳腺癌没有发展。
在本发明的其它方面，本文所描述的化合物可以用于乳腺癌的免疫治疗。在这些方面，优选地将化合物(可以是多肽、抗体或者核酸分子)加入到药物组合物或疫苗中。药物组合物包括一种或多种这些化合物或生理上可接受的载体。疫苗可以包含一种或多种多肽和免疫应答增强子，例如佐剂或脂质体(在其中加入化合物)。另外，药物组合物和疫苗可以含有分送系统，例如美国专利4,897,268和5,075,109公开的可被生物降解的中心体。在本发明中的药物组合物和疫苗也可以含有其它的化合物(包括一种或多种分离的多肽)。
另外，疫苗可以含有编码上述一种或多种多肽的DNA，因此在原位产生多肽。在这种疫苗中，DNA可以存在于任何一种本领域普通技术人员公知的分送系统中，包括核酸表达系统、细菌和病毒表达系统。合适的核酸表达系统包含用于在患者中表达的必需DNA序列(如合适的启动子与终止信号)。细菌分送系统包括施用能在其细胞表面表达多肽免疫原部分的细菌(如结核菌)。在一个优选的实施方案中，可以使用病毒表达系统(例如牛痘或者其它的痘病毒、逆转录病毒或者腺病毒)引入DNA，所说的病毒表达系统可以包括使用非病原(缺损的)复制感受态病毒。把DNA加入到这种表达系统中的技术是本领域普通技术人员公知的。所说的DNA也可以是＂裸露＂的DNA，例如Ulmer等(科学259:1745-1749(1993))和Cohen等(科学259:1691-1692(1993))描述过的。通过把DNA涂到可被生物降解的珠(使DNA有效地运输到细胞中)上可以增加裸露DNA的摄取。
在本发明的药物组合物中可以使用本领域普通技术人员公知的任何合适的载体，载体的类型将随着施用的方式不同而异。对于肠胃外施用(如皮下注射)，优选的载体含有水、盐水、醇、脂肪、蜡或者缓冲液。对于口服施用，可以使用上述的任何一种载体或固体载体，如甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖和碳酸镁。可被生物降解的中心体(例如聚乳酸盐聚羟乙酸盐)也可以作为本发明药物组合物的载体。
在本发明的疫苗中可以使用任何一种佐剂，以便非特异性地增强免疫反应。大部分佐剂含有用来保护抗原使之免受迅速分解代谢的物质，例如氢氧化铝或者矿物油和免疫应答刺激剂(例如脂质A、Bortadella pertussis或者结核分枝杆菌衍生蛋白)。合适的佐剂是市售的，例如弗氏不完全佐剂和完全佐剂(Difco实验室，底特律，MI)、Merck佐剂65(Merck和Rahway,NJ公司)、明矾、可被生物降解的中心体、单磷酰基脂质A和quil A。也可以把细胞因子(如GM-CSF或白介素-2、7或12)作为佐剂。
上述药物组合物和疫苗也可以用于，例如治疗患者的乳腺癌。本文所使用的＂患者＂指任何温血动物，优选的是指人。患者可以患有也可以没有乳腺癌。因此，上述药物组合物和疫苗可以用于防止乳腺癌的发展或治疗患有乳腺癌的患者。为了防止乳腺癌的发展，可以把含有本文描述的一种或多种多肽的药物组合物或疫苗施用给患者。另外，也可以施用编码多肽的裸DNA或者质粒或者病毒载体。为了治疗乳腺癌，所说的药物组合物或疫苗也可以包含一种或多种多肽、抗体或与编码本文所述的多肽的DNA互补的核苷酸序列(例如反义RNA或者反义脱氧核糖核酸寡核苷酸)。
施用的方式、频率和剂量将根据个体的不同而异。一般来说，可以通过注射(例如皮内、肌内、静脉内或皮下)、鼻内(例如抽吸)或口服施用药物组合物或疫苗。1-10种剂量可以施用52周的疗程。优选地施用6种剂量，间隔为1个月，此后可以阶段性地进行加强接种。也可以根据患者个体的不同而改变施用方案。合适的剂量为当施用上述的化合物后能够提高抗肿瘤免疫反应的化合物的量。可以通过测定患者的抗肿瘤抗体或通过疫苗产生的能够体外杀死患者肿瘤细胞的溶细胞的效应细胞来监测反应。这种疫苗也应该可以引起免疫反应，和未接种的患者相比，在接种的患者中，这种免疫反应能产生改进的临床结果(例如更快地缓解、完全或部分或更长的存活)。一般来说，对于含有一种或多种多肽的药物组合物和疫苗来说，存在于每一个剂量中的多肽的量大约为100μg-5mg。合适的剂量的多少将因患者而异，但一般从大约0.1ml-5ml。
本发明提供下列实施例来具体说明本发明，但并不限制本发明。实施例实施例1使用差示RT-PCR制备乳腺癌特异cDNAs
这一实施例具体说明了使用差示筛选制备编码乳腺癌特异多肽的cDNA分子。A．B18 Ag1cDNA的制备和mRNA表达的鉴定
制备患有乳腺癌患者的乳腺癌和正常组织的组织样品，所说的乳腺癌是由患者取样，经病理学检查确认的。从样品中提取正常RNA和肿瘤RNA，并分离mRNA，然后使用(dT)12AG(SEQ ID NO.:130)锚定的3’引物将mRNA转化成为cDNA。然后使用随机选择的引物(CTTCAACCTC)(SEQ ID NO:103)进行差示PCR。扩增条件是含有1.5mM MgCl2、20pmol引物、500pmol dNTP和1个单位的Taq DNA聚合酶(Perkin-Elmer,Branchburg,NJ)的标准缓冲液。使用94℃变性30秒、42℃退火1分钟、72℃延伸30秒进行40个扩增循环。获得含有76种扩增产物的RNA指纹。尽管乳腺癌组织的RNA指纹与正常的乳腺组织的有98％多的等同性，但是多次观察到特异性的肿瘤RNA指纹模式的带。从银染色的凝胶中切除此带，亚克隆到T载体(Novagen,Madison,WI)中，并进行测序。
称作B18Ag1的cDNA序列如SEQ ID NO:1所示。GENBANK和EMBL的数据库检索表明最早克隆的B18Ag1片段与内源性人逆转录病毒元件S71具有77％的等同性，S71是与猿肉瘤病毒(SSV)同源的截短逆转录病毒单元。S71在3’末端含有不完全的gag基因(pol基因的一部分)和类LTR结构(参见Werner等，病毒学174:225-238(1990))。B18Ag1在相当于P30(gag)的基因座区与SSV也具有64％的等同性。B18Ag1含有三个分离的且不完全的读框，其中包含与感染哺乳动物的各种逆转录病毒gag蛋白具有大量同源性的区域。此外，与S71的同源区不正好在gag基因内部，但横越包含LTR的几个kb序列。
使用计算机分析路线合成B18Ag1特异PCR引物。RT-PCR扩增(94℃,30秒；60℃→42℃,30秒；72℃,30秒；40个循环)确认B18Ag1是以相对很高的水平存在于患者乳腺癌组织中的真实mRNA序列。扩增所用的引物为B18Agl-1(CTG CCT GAG CCA CAA ATG)(SEQID NO.:128)和B18Ag1-4(CCG GAG GAG GAA GCT AGA GGAATA)(SEQ ID NO.:129)，镁浓度为3.5mM,pH为8.5；B18Ag1-2(ATGGCT ATT TTC GGG GCC TGA CA)(SEQ ID NO.:126)和B18Ag1-3(CCG GTA TCT CCT CGT GGT TATT)(SEQ ID NO.:127)，镁浓度为2mM,pH为9.5。相同的实验表明此患者正常的乳腺组织中表达水平极低，已经到了不存在表达的程度(参见图1)。然后使用RT-PCR实验表明B18Ag1 mRNA存在于9个其它的乳腺癌样品(巴西和美国患者)中，但在每个乳腺癌患者的正常乳腺组织中没有，或含量极低。RT-PCR分析还表明在各种正常的组织(包括淋巴结、心肌和肝脏)中不存在B18Ag1转录物，在PBMC和肺组织中的含量相对较低。如图2所示，Northern印迹分析确认了B18Ag1 mRNA存在于乳腺癌样品中，而不存在于正常的乳腺组织中。
RNase保护测定也确认了B18Ag1在乳腺癌组织中的差异表达。图3显示出B18Ag1 mRNA在各种组织类型中的水平，此结果是在4个不同的RNase保护测定中确定的。1-12道是各种正常的乳腺组织样品；13-25道是各种乳腺癌样品；26-27道是正常的前列腺样品；28-29道是前列腺肿瘤样品；30-32道是结肠肿瘤样品；33道是正常的主动脉；34道是正常的小肠；35道是正常的皮肤；36道是正常的淋巴结；37道是正常的卵巢；38道是正常的肝；39道是正常的骨胳肌；40道是第一个正常的胃部样品；41道是第二个正常的胃部样品；42道是正常的肺；43道是正常的肾；44道是正常的胰腺。在每个测定中包含一个已知的β-肌动蛋白信息丰度的阳性对照RNA并相对于此阳性对照将不同的测定结果规范化，有利于实验间的比较。
RT-PCR和Southern印迹分析表明B18Ag1基因座以单拷贝的内源逆转录病毒元件存在于人基因组的DNA中。使用最初的B18Ag1序列作为探针分离了大约为12-18kb的基因组克隆。通过XbaⅠ消化也分离了4个其它的亚克隆。由这些克隆XbaⅠ消化的末端(如图4所示)获得的其它逆转录病毒序列如SEQ ID NO:3-SEQ ID NO:10所示，其中SEQ ID NO:3是图4中10序列的位置；SEQ ID NO:4是11-29序列的位置；SEQ IDNO:5是3序列的位置；SEQ ID NO:6是6序列的位置；SEQ ID NO:7是12序列的位置；SEQ ID NO:8是13序列的位置；SEQ ID NO:9是14序列的位置和SEQ ID NO:10是11-22序列的位置。
随后的研究表明12-18kb的基因组克隆含有大约7.75kb的逆转录病毒元件，如图5A和5B所示。此逆转录病毒单元的序列如SEQ ID NO:141所示。图5A顶端带有编号的直线是指逆转录病毒基因组克隆有义链序列。此线下面的方框表明选择的限制酶切位点的位置。箭头描述出用于对此克隆逆转录病毒元件进行测序的不同重叠克隆。箭头的方向表示单程亚克隆序列相当于有意义或者反意义链。图5B是含有B18Ag1的逆转录病毒元件的示意图，其描述了此元件中病毒基因的组构。代表推测的读框的空白方框(从甲硫氨酸开始)遍布整个元件中。方框左边所示的是6个可能的读框，其中1-3读框相当于读框的有意义链。
使用SEQ ID NO:1的cDNA作为探针获得更长的cDNA(SEQ ID NO:227)，与SEQ ID NO:141所示的基因组序列相比，此cDNA含有最小的核苷酸差异(不到1％)。B．编码其它乳腺癌特异多肽的cDNA分子的制备
如上所述制备正常的RNA和肿瘤RNA，分离mRNA，并使用(dT)12AG锚定的3’引物将mRNA转化成为cDNA。然后使用随机选择的引物SEQ ID NO:87-125进行差示PCR。扩增条件如上所述，将观察到的肿瘤RNA指纹模式的特异带从银染色的凝胶中切除下来，亚克隆到T载体(Novagen,Madison,WI)或pCRⅡ载体(Invitrogen,San Diego,CA)中并对其进行测序。所得的序列如SEQ ID NO:11-SEQ ID NO:86所示。在分离的79个序列中，发现67个是新的(SEQ ID NO:11-77)(也参见图6-20)。随后的研究鉴定了另外84个序列(SEQ ID NO:142-226)，其中72个看来是新的(SEQ ID NOS:142、143、146-152、154-166、168-176、178-192、194-198、200-204、206、207、209-214、216、218、219、221-227)。根据发明人的丰富知识，迄今为止，前面鉴定的序列没有任何一个被证明在人乳腺癌组织中较在正常乳腺组织中的表达水平高。
表Ⅰ显示出存在于正常乳腺组织(BNⅠ-BN7栏)、乳腺癌样品(BTⅠ-BT12栏)、正常的前列腺、肾、肝、肺、皮肤、小肠、胃、心肌、淋巴结、胰腺、骨胳肌、卵巢和主动脉中的典型乳腺癌特异转录物的水平，这些结果都是通过RT-PCR分析确定的。使用0-3等级的信息丰度，0指没有检测到信息，3的信息水平相当于对照信息(甘油醛3-磷酸脱氢酶)。有些地方没有数据表明对该组织没有进行特异抗原存在与否的检测。
表1
| 克隆 | BN1 | BN2 | BN3 | BN3 | BN4 | BN5 | BN6 | BN7 | BT1 | BT2 | BT3 | BT4 | BT5 | BT6 | BT7 | BT8 | BT9 | BT10 | BT11 | BT12 |
| B2CA1 | ||||||||||||||||||||
| B2CA2 | 1 | 1 | 3 | |||||||||||||||||
| B3CA1 | 1 | 0 | 2 | |||||||||||||||||
| B3CA3c | 3 | 3 | 3 | |||||||||||||||||
| B3CA3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | ||||||||||||||
| B4CA1 | 1 | 1 | 2 | |||||||||||||||||
| B9CG1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 2 | |||||||||||||
| B9CG3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 2 | |||||||||||||
| B11AG1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |||||||
| B13AG1a | 0 | 0 | 2 | 3 | ||||||||||||||||
| B13AG1b | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | |||||||
| B13AG2 | 0 | 1 | 0 | 1 | 2 | 1 | 2 | 3 | 3 | 3 | 2 | |||||||||
| B15AG1 | 0 | 1 | 0 | 0 | 1 | 2 | 3 | 2 | 2 | 3 | 3 | 3 | 0 | |||||||
| B17AG1 | 2 | |||||||||||||||||||
| B18AG1a | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 3 | 3 | 2 | 3 | 3 | 3 | 2 | 3 | 3 | |||||
| B16AC1-3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |||||||
| B12CA1 | 0 | 1 | 2 | 2 | 2 | 2 | 1 | 2 | 0 | 3 | 0 | 2 | 2 | |||||||
| B12CA2 | 1 | 1 | 2 | 1 | 2 | 3 | 3 | 2 | 2 | 3 | 0 | 2 | 2 | |||||||
| B13CA1-36 | 0 | 0 | 0 | 0 | 2 | 1 | 1 | 1 | 0 | 2 | 1 | 3 | 2 | |||||||
| B13CA1-37 | 0 | 1 | 2 | 2 | 1 | 3 | 2 | 3 | 0 | 2 | 1 | 3 | 2 | |||||||
| B14CA1 | 0 | 0 | 1 | 0 | 0 | 2 | 2 | 3 | 0 | 2 | 1 | 2 | 2 | |||||||
| B16CA1 | 0 | 0 | 1 | 0 | 1 | 2 | 2 | 2 | 1 | 2 | 2 | 2 | 2 | |||||||
| B16GC2a | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | ||||||||||||
| B22GA2 | 0 | 1 | 1 | 0 | 1 | 2 | 1 | 0 | ||||||||||||
| B34GA1 | 1 | 0 | 1 | 2 | 1 | 3 | 3 | 1 | 1 | 1 | 1 |
表1(续)
实施例2从人基因组DNA制备B18Ag1 DNA
| 克隆 | 前列腺 | 肾 | 肝 | 肺 | 皮肤 | 小肠 | 胃 | 心肌 | 淋巴结 | 胰腺 | 骨胳肌 | 卵巢 | 主动脉 |
| B2CA1 | |||||||||||||
| B2CA2 | |||||||||||||
| B3CA1 | |||||||||||||
| B3CA3c | |||||||||||||
| B3CA3 | 0 | 0 | 0 | 0 | |||||||||
| B4CA1 | |||||||||||||
| B9CG1 | 1 | 0 | 0 | 0 | |||||||||
| B9CG3 | 1 | 0 | 0 | 0 | |||||||||
| B11AG1 | |||||||||||||
| B13AG1a | 0 | 0 | 0 | 0 | |||||||||
| B13AG1b | |||||||||||||
| B13AG2 | |||||||||||||
| B15AG1 | 0 | 3 | 0 | 0 | |||||||||
| B17AG1 | 0 | 0 | 0 | ||||||||||
| B18AG1a | 0 | 0 | 0 | 1 | 0 | 0 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | ||
| B16AC1-3 | |||||||||||||
| B12CA1 | |||||||||||||
| B12CA2 | |||||||||||||
| B13CA1-36 | |||||||||||||
| B13CA1-37 | |||||||||||||
| B14CA1 | |||||||||||||
| B16CA1 | |||||||||||||
| B16GC2a | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | ||||||
| B22GA2 | 0 | 0 | 0 | 1 | 0 | 0 | 0 | ||||||
| B34GA1 | 1 | 1 | 2 | 2 | 1 | 2 |
这一实施例具体说明了通过扩增从人基因组的DNA制备B18Ag1DNA。
可以使用20pmol的B18Ag1特异引物、500pmol dNTPs和1个单位的Taq DNA聚合酶(Perkin Elmer,Branchburg,NJ)，通过下列扩增参数由250ng人基因组DNA制备B18Ag1 DNA:94℃变性30秒；由60℃降至42℃退火30秒(每两个循环增加2℃)；72℃延伸30秒。最后的增量(42℃退火温度)应该使循环25次。使用计算机分析选择引物。合成的引物为B18Ag1-1、B18Ag1-2、B18Ag1-3和B18Ag1-4。可以使用的引物对为1+3、1+4、2+3和2+4。
凝胶电泳后，可以将对应于B18Ag1DNA的带切割下来，并克隆到合适的载体中。实施例3从乳腺癌cDNA中制备B18Ag1DNA
这一实施例具体说明了通过扩增由人乳腺癌cDNA制备B18Ag1DNA。
从由人乳腺癌组织制备的RNA在含有下列成分的反应混合物中合成第一条cDNA:500ng poly A+RNA、200pmol的引物(T)12AG(即TTTTTT TTT TTT AG)(SEQ ID NO:130)、1X第一条链逆转录酶缓冲液、6.7mMDTT、500mmol dNTPs、1个单位的AMV或MMLV逆转录酶(来源于任何供应商，如Gibco-BRL(Grand Island,NY))，总体积为30μl。第一条链合成后，将cDNA稀释大约25倍，取1μl用于如实施例2中所描述的扩增。当有些引物对能够形成异源转录物群体时，引物B18Ag1-2(5′ATG GCT ATT TTC GGG GGC TGA CA)(SEQ ID NO:126)和B18Ag1-3(5′CCG GTA TCT CCT CGT GGG TAT T)(SEQ ID NO:127)产生单一的151bp的扩增产物。实施例4B18Ag1的B细胞和T细胞表位的鉴定
这一实施例具体说明了B18Ag1表位的鉴定。
可以使用各种计算机算法筛选B18Ag1序列。为了确定B细胞表位，使用Hopp(临床生物学研究报告172B:367-77(1985))、或Cease等(实验医学杂志164:1779-84(1986))或者Spouge等(免疫学杂志138:204-12(1987))的方法筛选序列的疏水和亲水值。可以使用诸如AMPHI(如Margalit等，免疫学杂志138:2213(1987))的程序或Rothbard和Taylor的方法(如EMBOJ.7:93(1988))预测另外的Ⅱ类MHC(抗体或者B细胞)表位。
一旦使用这些技术鉴定了这些肽(长度为15-20个氨基酸)，就可以使用自动肽合成设备(可以向生产商购买，例如应用生物系统公司，Foster城，CA)和技术(如Merrifield合成技术)合成每个肽。合成后，这些肽可以用于筛选正常或乳腺癌患者的血清以确定乳腺癌患者是否具有与这些肽反应的抗体。在乳腺癌患者中存在这种抗体将证实正在讨论的特异B细胞表位的免疫原性。也可以检验这些肽在体内免疫动物(小鼠、大鼠、兔、chimps等等)后产生血清或体液免疫的能力。这种免疫后，肽-特异抗血清的产生进一步证实了所讨论的特异B-细胞表位的免疫原性。
为了鉴定T细胞表位，可以使用不同的计算机算法(这些算法在鉴定能够与HLAⅠ类MHC分子结合的B18Ag1序列的8-10个氨基酸基元中是有用的)筛选B18Ag1序列。(例如参见Rammensee等，免疫遗传学41:178-228(1995))。合成后，可以使用标准结合测定方法(例如Sette等，免疫学杂志153:5586-92(1994))检验这些肽与Ⅰ类MHC结合的能力，更重要的是检验这些肽在体外刺激患者或者正常外周单核细胞后产生抗原反应性细胞毒性T细胞的能力，例如使用Bakker等(癌症研究55:5330-34(1995))、Visseren等(免疫学杂志154:3991-98(1995))、Kawakami等(免疫学杂志154:3961-68(1995))和Kast等(免疫学杂志152:3904-12(1994))的方法进行检验。体外肽刺激后，体外成功地产生能够杀死自体固有的(含有同样的Ⅰ类MHC分子)肿瘤细胞的T细胞进一步证明了B18Ag1抗原的免疫原性。此外，这种肽在体内免疫含有表达特定的人MHCⅠ类单元型的转基因的小鼠后，可以使用它们产生鼠肽和B18Ag1反应性细胞毒性T细胞(Vitiello等，实验医学杂志173:1007-15(1991)。
下面是代表性的预料B18Ag1 B-细胞和T-细胞表位，根据预料的HLAⅠ类MHC结合抗原进行分类：预测的Th基元(B细胞表位)(SEQ ID NOS.:131-133)
SSGGRTFDDFHRYLLVGI
QGAAQKPINLSKXIEVVQGHDE
SPGVFLEHLQEAYRIYTPFDLSA预料的HLA A2.1基元(T细胞表位)(SEQ ID NOS.:134-140)
YLLVGIQGA
GAAQKPINL
NLSKXIEVV
EVVQGHDES
HLQEAYRIY
NLAFVAQAA
FVAQAAPDS实施例5鉴定通过差示PCR发现的乳腺癌基因
使用RT-PCR确定由差示PCR发现的乳腺癌基因的特异性与灵敏性。这种方法在不使用大量RNA的情况下就能快速半定量地评价乳腺癌基因mRNA的表达。使用基因特异引物，在各种组织中检测mRNA表达水平，所说的组织包括8个乳腺肿瘤、5个正常的乳腺、2个前列腺肿瘤、2个结肠肿瘤、1个肺肿瘤、14个其它的正常成年人组织(包括正常的前列腺、结肠、肾、肝、肺、卵巢、胰腺、骨胳肌、皮肤、胃和睾丸)。
为了确保RT-PCR的半定量特性，以β-肌动蛋白作为所检验的每种组织的内部对照。制备第一条cDNAs链的系列稀释溶液，使用β-肌动蛋白特异引物进行RT-PCR测定。选择能够使β-肌动蛋白模板实现线性范围扩增的稀释溶液，此稀释溶液能足以反映出原拷贝数差异的敏感度。使用此条件测定每种组织中的每个逆转录反应的β-肌动蛋白水平。通过DNase处理和确保阴性结果(当使用的第一条cDNA链是在没有加入逆转录酶的情况下制备的)来最大限度地减少DNA污染。
使用基因特异引物确定各种组织中的mRNA表达水平。到目前为止，已经通过RT-PCR成功地检验了32个基因，其中的三个对乳腺癌表现出很好的特异性和灵敏度。图21A和21B描述了这三个基因的结果：B15AG-1(SEQ ID NO:27)、B31GAlb(SEQ ID NO:148)和B38GA2a(SEQ IDNO:157)。
从上文的描述应该理解，虽然为了具体说明本发明，本文描述了本发明的特定实施方案，但是在不背离本发明的宗旨和范围的前提下可以对本发明进行各种改进。
序列表(1)一般信息：
(ⅰ)申请人：Corixa公司
(ⅱ)发明名称：用于乳腺癌的治疗和诊断的组合物和方法
(ⅲ)序列数：227
(ⅳ)通讯地址：
(A)收信人：SEED和BERRY LLP
(B)街道：哥伦比亚中心6300，第五大街701
(C)城市：Seattle
(D)州：华盛顿
(E)国家：美国
(F)ZIP:98104-7092(ⅴ)计算机可读形式：
(A)介质类型：软盘
(B)计算机：IBM PC兼容机
(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
(D)软件：PatentIn Release#1.0,#1.30版(ⅵ)当前申请的数据：
(A)申请号：
(B)申请日：1997年1月10日
(C)分类号：(ⅷ)律师/代理人信息：
(A)姓名：Maki,David J.
(B)注册号：31.392
(C)参考/证书号：210121.419PC(ⅸ)电讯信息：
(A)电话：(206)622 4900
(B)传真：(206)682 6031(2)SEQ ID NO:1的信息：
(ⅰ)序列特征：
(A)长度：363个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型
(ⅸ)特征：
(A)名称/关键词：CDS
(B)位置：1..363
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:1:TTA GAG ACC CAA TTG GGA CCT AAT TGG GAC CCA AAT TTC TCA AGT GGA 48Leu Glu Thr Gln Leu Gly Pro Asn Trp Asp Pro Asn Phe Ser Ser Gly1 5 10 15GGG AGA ACT TTT GAC GAT TTC CAC CGG TAT CTC CTC GTG GGT ATT CAG 96Gly Arg Thr Phe Asp Asp Phe His Arg Tyr Leu Leu Val Gly Ile Gln
20 25 30GGA GCT GCC CAG AAA CCT ATA AAC TTG TCT AAG GCG ATT GAA GTC GTC 144Gly Ala Ala Gln Lys Pro Ile Asn Leu Ser Lys Ala Ile Glu Val Val
35 40 45CAG GGG CAT GAT GAG TCA CCA GGA GTG TTT TTA GAG CAC CTC CAG GAG 192Gln Gly His Asp Glu Ser Pro Gly Val Phe Leu Glu His Leu Gln Glu
50 55 60GCT TAT CGG ATT TAC ACC CCT TTT GAC CTG GCA GCC CCC GAA AAT AGC 240Ala Tyr Arg Ile Tyr Thr Pro Phe Asp Leu Ala Ala Pro Glu Asn Ser65 70 75 80CAT GCT CTT AAT TTG GCA TTT GTG GCT CAG GCA GCC CCA GAT AGT AAA 288His Ala Leu Asn Leu Ala Phe Val Ala Gln Ala Ala Pro Asp Ser Lys
85 90 95AGG AAA CTC CAA AAA CTA GAG GGA TTT TGC TGG AAT GAA TAC CAG TCA 336Arg Lys Leu Gln Lys Leu Glu Gly Phe Cys Trp Asn Glu Tyr Gln Ser
100 105 110GCT TTT AGA GAT AGC CTA AAA GGT TTT 363Ala Phe Arg Asp Ser Leu Lys Gly Phe
115 120(2)SEQ ID NO:2的信息：
(ⅰ)序列特征：
(A)长度：121个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线型
(ⅱ)分子类型：蛋白质
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:2:Leu Glu Thr Gln Leu Gly Pro Asn Trp Asp Pro Asn Phe Ser Ser Gly1 5 10 15Gly Arg Thr Phe Asp Asp Phe His Arg Tyr Leu Leu Val Gly Ile Gln
20 25 30Gly Ala Ala Gln Lys Pro Ile Asn Leu Ser Lys Ala Ile Glu Val Val
35 40 45Gln Gly His Asp Glu Ser Pro Gly Val Phe Leu Glu His Leu Gln Glu
50 55 60Ala Tyr Arg Ile Tyr Thr Pro Phe Asp Leu Ala Ala Pro Glu Asn Ser65 70 75 80His Ala Leu Ash Leu Ala Phe Val Ala Gln Ala Ala Pro Asp Ser Lys
85 90 95Arg Lys Leu Gln Lys Leu Glu Gly Phe Cys Trp Asn Glu Tyr Gln Ser
100 105 110Ala Phe Arg Asp Ser Leu Lys Gly Phe
115 120(2)SEQ ID NO:3的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：1101个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
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(ⅰ)序列特征：
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(ⅰ)序列特征：
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(ⅰ)序列特征：
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(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:40:TCTGTCCACA CCAATCTTAG AAGCTCTGAA AAGAATTTGT CTTTAAATAT CTTTTAATAG 60TAACATGTAT TTTATGGACC AAATTGACAT TTTCGACTGT TTTTTCCAAA AAAGTCAGGT 120GAATTTCAGC ACACTGAGTT GGGAATTTCT TATCCCAGAA GACCAACCAA TTTCATATTT 180ATTTAAGATT GATTCCATAC TCCGTTTTCA AGGAGAATCC CTGCAGTCTC CTTAAAGGTA 240GAACAAATAC TTCCTATTTT TTTTTCACCA TTGTGGGATT GGACTTTAAG AGGTGACTCT 300AAAAAAACAG AGAACAAATA TGTCTCAGTT GTATTAAGCA CGGACCCATA TTATCATATT 360CACTTAAAAA AATGATTTCC TGTGCACCTT TTGGCAACTT CTCTTTTCAA TGTAGGGAAA 420AACTTAGTCA CCCTGAAAAC CCACAAAATA AATAAAACTT GTAGATGTGG ACAGA 475(2)SEQ ID NO:41的信息：
(ⅰ)序列特征：
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(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:41:TAAGAGGGTA CATCGGGTAA GAACGTAGGC ACATCTAGAG CTTAGAGAAG TCTGGGGTAG 60GAAAAAAATC TAAGTATTTA TAAGGGTATA GGTAACATTT AAAAGTAGGG CTAGCTGACA 120TTATTTAGAA AGAACACATA CGGAGAGATA AGGGCAAAGG ACTAAGACCA GAGGAACACT 180AATATTTAGT GATCACTTCC ATTCTTGGTA AAAATAGTAA CTTTTAAGTT AGCTTCAAGG 240AAGATTTTTG GCCATGATTA GTTGTCAAAA GTTAGTTCTC TTGGGTTTAT ATTACTAATT 300TTGTTTTAAG ATCCTTGTTA GTGCTTTAAT AAAGTCATGT TATATCAAAC GCTCTAAAAC 360ATTGTAGCAT GTTAAATGTC ACAATATACT TACCATTTGT TGTATATGGC TGTACCCTCT 420CTA 423(2)SEQ ID NO:42的信息：
(ⅰ)序列特征：
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(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:42:TCTCCTAGGC TAATGTGTGT GTTTCTGTAA AAGTAAAAAG TTAAAAATTT TAAAAATAGA 60AAAAAGCTTA TAGAATAAGA ATATGAAGAA AGAAAATATT TTTGTACATT TGCACAATGA 120GTTTATGTTT TAAGCTAAGT GTTATTACAA AAGAGCCAAA AAGGTTTTAA AAATTAAAAC 180GTTTGTAAAG TTACAGTACC CTTATGTTAA TTTATAATTG AAGAAAGAAA AACTTTTTTT 240TATAAATGTA GTGTAGCCTA AGCATACAGT ATTTATAAAG TCTGGCAGTG TTCAATAATG 300TCCTAGGCCT TCACATTCAC TCACTGACTC ACCCAGAGCA ACTTCCAGTC CTGTAAGCTC 360CATTCGTGGT AAGTGCCCTA TACAGGTGCA CCATTTATTT TACAGTATTT TTACTGTACC 420TTCTCTATGT TTCCATATGT TTCGATATAC AAATACCACT GGTTACTATN GCCCNACAGG 480TAATTCCAGT AACACGGCCT GTATACGTCT GGTANCCCTA GNGAAGA 527(2)SEQ ID NO:43的信息：
(ⅰ)序列特征：
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(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:43:TCTTCAACCT CGTAGGACAA CTCTCATATG CCTGGGCACT ATTTTTAGGT TACTACCTTG 60GCTGCCCTTC TTTAAGAAAA AAAAAAGAAG AAAAAAGAAC TTTTCCACAA GTTTCTCTTC 120CTCTAGTTGG AAAATTAGAG AAATCATGTT TTTAATTTTG TGTTATTTCA GATCACAAAT 180TCAAACACTT GTAAACATTA AGCTTCTGTT CAATCCCCTG GGAAGAGGAT TCATTCTGAT 240ATTTACGGTT CAAAAGAAGT TGTAATATTG TGCTTGGAAC ACAGAGAACC AGTTATTAAC 300TTCCTACTAC TATTATATAA TAAATAATAA C 331(2)SEQ ID NO:44的信息：
(ⅰ)序列特征：
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(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:44:GGCTTAGTAG TTGCCAGGCA AAATARCGTT GATTCTCCTC AGGAGCCACC CCCAACACCC 60CTGTTTGCTT CTAGACCTAT ACCTAGACTA AAGTCCCAGC AGACCCCTAG AGGTGAGGTT 120CAGAGTGACC CTTGAGGAGA TGTGCTACAC TAGAAAAGAA CTGCTTGAGT TTTCTAATTT 180ATATAAGCAG AAATCTGGAG AAGAGTCATA GGAATGGATA TTAAGGGTGT GAGATAATGG 240CGGAAGGAAT ATAGAGTTGG ATCAGGCTGG ACTTATTGAT TTGAACCCAC TAAGTAGAGA 300TTCTGCTTTT GATGTTGCAG CTCAGGGAGT TAAAAAAGGT TTTAATGGTT CTAATAGTTT 360ATTTGCTTGG TTAGCTGAAA TATGGATAAA AGATGGCCCA CTGTGAGCAA GCTGGAAATG 420CCTGATCTCT CTCAGTTTAA TGTAGAGGAA GGGATCCAAA AGTTTAGGGA GANTTGGATG 480CTGGRAKTGG ATTGGTCACT TTGRGACCTA CCCWTCCCAG CTGGGAGGGT CCAGAAGATA 540CACCCTTGAC CAACGCTTTG CGAAATGGAT TTGTGATGGC GGCAACTACT AA 592(2)SEQ ID NO:45的信息：
(ⅰ)序列特征：
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(B)类型：核酸
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(D)拓扑结构：线型
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:45:GGCTTAGTAG TTGCCATTGC GAGTGCTTGC TCAACGAGCG TTGAACATGG CGGATTGTCT 60AGATTCAACG GATTTGAGTT TTACCAGCAA AGCGAACCAA GCGCGGCCCA GAGAATTATG 120GGTTGGTTGG CTTTGAAAAG ATGGAAATCC TGTAGGCCTA GTCAGAAAAG CCTTCTTGCA 180GAACAGTTGG TTCTCGGGCG AACGCTCATC AAGATGCCCA TTGGAAAGGC TAGCGTGTAT 240TTGGGAGAGC CTGATAGCGT GTCTTCTGAT GATGTTTGTG CTTGGACAGT GACAAAAGAT 300ATGCAAAGCA AGTCCGAACT AGACGTCAAG CTTCGTGAGC AAATTATTGT AGACTCCTAC 360TTATACTGTG AGGAATGATA GCCAAGGGTG GGGACTTTAA GACTAAGGTG GTTTGTACTT 420GCGCCGATGA TCCCAGGCAG AAAGAMCTGA TCGCTAGTTT TATACGGGCA ACTACTAAGC 480CGAATTCCAG CACACTGGCG GCCGTTACTA ATTGGATCCG ANCTCGGTAC CAGCTTGATG 540CATASCTTGA GTTWTCTATA NTGTCNC 567(2)SEQ ID NO:46的信息：
(ⅰ)序列特征：
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(B)类型：核酸
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(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:46:GAGCGAAAGA CCGAGGGCAG NGNNTANGNG CGANGAAGCG GAGAGGGCCA AAAAGCAACC 60GCTTTCCCCG GGGGGTGCCG ATTCATTAAG GCAGGTGGAG GACAGGTTTC CCGATGGAAG 120GCGGCAGGGG CGCAAGCAAT TAATGTGAGT AGGCCATTCA TTAGCACCCG GGCTTAACAT 180TTAAGCTTCG GGTTGGTATG TGGTGGGAAT TGTGAGCGGA TAACAATTTC ACACAGGAAA 240CAGCTATGAC CATGATTACG CCAAGCTATT TAGGTGACAT TATAGAATAA CTCAAGTTAT 300GCATCAAGCT TGGTACCGAG TTCGGATCCA CTAGTAACGG CCGCCAGTGT GTGGAATTCG 360GCTTAGTAGT TGCCGACCAT GGAGTGCTAC CTAGGCTAGA ATACCTGAGY TCCTCCCTAG 420CCTCACTCAC ATTAAATTGT ATCTTTTCTA CATTAGATGT CCTCAGCGCC TTATTTCTGC 480TGGACWATCG ATAAATTAAT CCTGATAGGA TGATAGCAGC AGATTAATTA CTGAGAGTAT 540GTTAATGTGT CATCCCTCCT ATATAACGTA TTTGCATTTT AATGGAGCAA TTCTGGAGAT 600AATCCCTGAA GGCAAAGGAA TGAATCTTGA GGGTGAGAAA GCCAGAATCA GTGTCCAGCT 660GCAGTTGTGG GAGAAGGTGA TATTATGTAT GTCTCAGAAG TGACACCATA TGGGCAACTA 720CTAAGCCCGA ATTCCAGCAC ACTGGCGGGC GTTACTAATG GATCCGAGCT CGGTACCAAG 780CTTGATGCAT AGCTTGAGTA TCTATAGTGT CACTAAATAG CCTGGCGTTA TCATGGTCAT 840AGCTGTTTCC TGTGTGAAAT TGTTATCCGC TCCCAATTCC CCCCACCATA CGAGCCGGAA 900CATAAAGT 908(2)SEQ ID NO:47的信息：
(ⅰ)序列特征：
(A)长度：480个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:47:TGCCAACAAG GAAAGTTTTA AATTTCCCCT TGAGGATTCT TGGTGATCAT CAAATTCAGT 60GGTTTTTAAG GTTGTTTTCT GTCAAATAAC TCTAACTTTA AGCCAAACAG TATATGGAAG 120CACAGATAKA ATATTACACA GATAAAAGAG GAGTTGATCT AAAGTARAGA TAGTTGGGGG 180CTTTAATTTC TGGAACCTAG GTCTCCCCAT CTTCTTCTGT GCTGAGGAAC TTCTTGGAAG 240CGGGGATTCT AAAGTTCTTT GGAAGACAGT TTGAAAACCA CCATGTTGTT CTCAGTACCT 300TTATTTTTAA AAAGTAGGTG AACATTTTGA GAGAGAAAAG GGCTTGGTTG AGATGAAGTC 360CCCCCCCCCC CTTTTTTTTT TTTTAGCTGA AATAGATACC CTATGTTNAA RGAARGGATT 420ATTATTTACC ATGCCAYTAR SCACATGCTC TTTGATGGGC NYCTCCSTAC CCTCCTTAAG 480(2)SEQ ID NO:48的信息：
(ⅰ)序列特征：
(A)长度：591个碱基对
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(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:48:AAGAGGGTAC CGAGTGGAAT TTCCGCTTCA CTAGTCTGGT GTGGCTAGTC GGTTTCGTGG 60TGGCCAACAT TACGAACTTC CAACTCAACC GTTCTTGGAC GTTCAAGCGG GAGTACCGGC 120GAGGATGGTG GCGTGAATTC TGGCCTTTCT TTGCCGTGGG ATCGGTAGCC GCCATCATCG 180GTATGTTTAT CAAGATCTTC TTTACTAACC CGACCTCTCC GATTTACCTG CCCGAGCCGT 240GGTTTAACGA GGGGAGGGGG ATCCAGTCAC GCGAGTACTG GTCCCAGATC TTCGCCATCG 300TCGTGACAAT GCCTATCAAC TTCGTCGTCA ATAAGTTGTG GACCTTCCGA ACGGTGAAGC 360ACTCCGAAAA CGTCCGGTGG CTGCTGTGCG GTGACTCCCA AAATCTTGAT AACAACAAGG 420TAACCGAATC GCGCTAAGGA ACCCCGGCAT CTCGGGTACT CTGCATATGC GTACCCCTTA 480AGCCGAATTC CAGCACACTG GCGGCCGTTA CTAATTGGAT CCGAACTCCG TAACCAAGCC 540TGATGCGTAA CTTGAGTTAT TCTATAGTGT CCCTAAAATA ACCTGGCGTT A 591(2)SEQ ID NO:49的信息：
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(C)链型：单链
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(ⅰ)序列特征：
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(B)类型：核酸
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(ⅰ)序列特征：
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(B)类型：核酸
(C)链型：单链
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(ⅰ)序列特征：
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(B)类型：核酸
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(ⅰ)序列特征：
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(B)类型：核酸
(C)链型：单链
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(ⅰ)序列特征：
(A)长度：300个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
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(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:64:GCACTGAGAG GAACTTCCAA TACTATGTTG AATAGGAGTG GTGAGAGAGG GCATCCTTGT 60CTTGTGCCGG TTTTCAAAGG GAATGCTTCC AGCTTTTGCC CATTCAGTAT AATATTAAAG 120AATGTTTTAC CATTTTCTGT CTTGCCTGTT TTTCTGTGTT TTTGTTGGTC TCTTCATTCT 180CCATTTTTAG GCCTTTACAT GTTAGGAATA TATTTCTTTT AATGATACTT CACCTTTGGT 240ATCTTTTGTG AGACTCTACT CATAGTGTGA TAAGCACTGG GTTGGTAAGG CAAGAGGAGC 300(2)SEQ ID NO:65的信息：
(ⅰ)序列特征：
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(B)类型：核酸
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(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:65:GCTCCTCTTG CCTTACCAAC TCACCCAGTA TGTCAGCAAT TTTATCRGCT TTACCTACGA 60AACAGCCTGT ATCCAAACAC TTAACACACT CACCTGAAAA GTTCAGGCAA CAATCGCCTT 120CTCATGGGTC TCTCTGCTCC AGTTCTGAAC CTTTCTCTTT TCCTAGAACA TGCATTTARG 180TCGATAGAAG TTCCTCTCAG TGC 203(2)SEQ ID NO:66的信息：
(ⅰ)序列特征：
(A)长度：344个碱基对
(B)类型：核酸
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(D)拓扑结构：线型
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:66:TACGGGGACC CCTGCATTGA GAAAGCGAGA CTCACTCTGA AGCTGAAATG CTGTTGCCCT 60TGCAGTGCTG GTAGCAGGAG TTCTGTGCTT TGTGGGCTAA GGCTCCTGGA TGACCCCTGA 120CATGGAGAAG GCAGAGTTGT GTGCCCCTTC TCATGGCCTC GTCAAGGCAT CATGGACTGC 180CACACACAAA ATGCCGTTTT TATTAACGAC ATGAAATTGA AGGAGAGAAC ACAATTCACT 240GATGTGGCTC GTAACCATGG ATATGGTCAC ATACAGAGGT GTGATTATGT AAAGGTTAAT 300TCCACCCACC TCATGTGGAA ACTAGCCTCA ATGCAGGGGT CCCA 344(2)SEQ ID NO:67的信息：
(ⅰ)序列特征：
(A)长度：157个碱基对
(B)类型：核酸
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(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:67:GCACTGAGAG GAACTTCGTA GGGAGGTTGA ACTGGCTGCT GAGGAGGGGG AACAACAGGG 60TAACCAGACT GATAGCCATT GGATGGATAA TATGGTGGTT GAGGAGGGAC ACTACTTATA 120GCAGAGGGTT GTGTATAGCC TGAGGAGGCA TCACCCG 157(2)SEQ ID NO:68的信息：
(ⅰ)序列特征：
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(B)类型：核酸
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(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:68:GCACTGAGAG GAACTTCTAG AAAGTGAAAG TCTAGACATA AAATAAAATA AAAATTTAAA 60ACTCAGGAGA GACAGCCCAG CACGGTGGCT CACGCCTGTA ATCCCAGAAC TTTGGGAGCC 120TGAGGAGGCA TCACCCG 137(2)SEQ ID NO:69的信息：
(ⅰ)序列特征：
(A)长度：137个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
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(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:69:CGGGTGATGC CTCCTCAGGC TGTATTTTGA AGACTATCGA CTGGACTTCT TATCAACTGA 60AGAATCCGTT AAAAATACCA GTTGTATTAT TTCTACCTGT CAAAATCCAT TTCAAATGTT 120GAAGTTCCTC TCAGTGC 137(2)SEQ ID NO:70的信息：
(ⅰ)序列特征：
(A)长度：220个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:70:AGCATGTTGA GCCCACACAC GCAATCTGAA TGAGTGTGCA CCTCAAGTAA ATGTCTACAC 60GCTGCCTGGT CTGACATGGC ACACCATCNC GTGGAGGGCA CASCTCTGCT CNGCCTACWA 120CGAGGGCANT CTCATWGACA GGTTCCACCC ACCAAACTGC AAGAGGCTCA NNAAGTACTR 180CCAGGGTMYA SGGACMASGG TGGGAYTYCA YCACWCATCT 220(2)SEQ ID NO:71的信息：
(ⅰ)序列特征：
(A)长度：353个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:71:CGTTAGGGTC TCTATCCACT GCTAAACCAT ACACCTGGGT AAACAGGGAC CATTTAACAT 60TCCCANCTAA ATATGCCAAG TGACTTCACA TGTTTATCTT AAAGATGTCC AAAACGCAAC 120TGATTTTCTC CCCTAAACCT GTGATGGTGG GATGATTAAN CCTGAGTGGT CTACAGCAAG 180TTAAGTGCAA GGTGCTAAAT GAANGTGACC TGAGATACAG CATCTACAAG GCAGTACCTC 240TCAACNCAGG GCAACTTTGC TTCTCANAGG GCATTTAGCA GTGTCTGAAG TAATTTCTGT 300ATTACAACTC ACGGGGCGGG GGGTGAATAT CTANTGGANA GNAGACCCTA ACG 353(2)SEQ ID NO:72的信息：
(ⅰ)序列特征：
(A)长度：343个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:72:GCACTGAGAG GAACTTCCAA TACYATKATC AGAGTGAACA RGCARCCYAC AGAACAGGAG 60AAAATGTTYG CAATCTCTCC ATCTGACAAA AGGCTAATAT CCAGAWTCTA AWAGGAACTT 120AAACAAATTT ATGAGAAAAG AACARACAAC CTCAWCAAAA AGTGGGTGAA GGAWATGCTS 180AAARGAAGAC ATYTATTCAG CCAGTAAACA YATGAAAAAA AGGCTCATSA TCACTGAWCA 240TTAGAGAAAT GCAAATCAAA ACCACAATGA GATACCATCT YAYRCCAGTT AGAAYGGTGA 300TCATTAAAAR STCAGGAAAC AACAGATGCT GGACAAGGTG TCA 343(2)SEQ ID NO:73的信息：
(ⅰ)序列特征：
(A)长度：321个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:73:GCACTGAGAG GAACTTCAGA GAGAGAGAGA GAGTTCCACC CTGTACTTGG GGAGAGAAAC 60AGAAGGTGAG AAAGTCTTTG GTTCTGAAGC AGCTTCTAAG ATCTTTTCAT TTGCTTCATT 120TCAAAGTTCC CATGCTGCCA AAGTGCCATC CTTTGGGGTA CTGTTTTCTG AGCTCCAGTG 180ATAACTCATT TATACAAGGG AGATACCCAG AAAAAAAGTG AGCAAATCTT AAAAAGGTGG 240CTTGAGTTCA GCCTTAAATA CCATCTTGAA ATGACACAGA GAAAGAANGA TGTTGGGTGG 300GAGTGGATAG AGACCCTAAC G 321(2)SEQ ID NO:74的信息：
(ⅰ)序列特征：
(A)长度：321个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:74:GCACTGAGAG GAACTTCAGA GAGAGAGAGA GAGTTCCACC CTGTACTTGG GGAGAGAAAC 60AGAAGGTGAG AAAGTCTTTG GTTCTGAAGC AGCTTCTAAG ATCTTTTCAT TTGCTTCATT 120TCAAAGTTCC CATGCTGCCA AAGTGCCATC CTTTGGGGTA CTGTTTTCTG AGCTCCAGTG 180ATAACTCATT TATACAAGGG AGATACCCAG AAAAAAAGTG AGCAAATCTT AAAAAGGTGG 240CTTGAGTTCA GYCTTAAATA CCATCTTGAA ATGAMACAGA GAAAGAAGGA TGTTGGGTGG 300GAGTGGATAG AGACCCTAAC G 321(2)SEQ ID NO:75的信息：
(ⅰ)序列特征：
(A)长度：317个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:75:GCACTGAGAG GAACTTCCAC ATGCACTGAG AAATGCATGT TCACAAGGAC TGAAGTCTGG 60AACTCAGTTT CTCAGTTCCA ATCCTGATTC AGGTGTTTAC CAGCTACACA ACCTTAAGCA 120AGTCAGATAA CCTTAGCTTC CTCATATGCA AAATGAGAAT GAAAAGTACT CATCGCTGAA 180TTGTTTTGAG GATTAGAAAA ACATCTGGCA TGCAGTAGAA ATTCAATTAG TATTGATTTT 240CATTCTTCTA AATTAAACAA ATAGGATTTT TAGTGGTGGA ACTTCAGACA CCAGAAATGG 300GAGTGGATAG AGACCCT 317(2)SEQ ID NO:76的信息：
(ⅰ)序列特征：
(A)长度：244个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:76:CGTTAGGGTC TCTATCCACT CCCACTACTG ATCAAACTCT ATTTATTTAA TTATTTTTAT 60CATACTTTAA GTTCTGGGAT ACACGTGCAG CATGCGCAGG TTTGTTGCAT AGGTATACAC 120TTGCCATGGT GGTTTGCTGC ACCCATCAGT CCATCATCTA CATTAGGTAT TTCTCCTAAT 180GCTATCCCTC CCCTAGCCCC TTACACCCCC AACAGGCTCT AGTGTGTGAA GTTCCTCTCA 240GTGC 244(2)SEQ ID NO:77的信息：
(ⅰ)序列特征：
(A)长度：254个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:77:CGTTAGGGTC TCTATCCACT GAAATCTGAA GCACAGGAGG AAGAGAAGCA GTYCTAGTGA 60GATGGCAAGT TCWTTTACCA CACTCTTTAA CATTTYGTTT AGTTTTAACC TTTATTTATG 120GATAATAAAG GTTAATATTA ATAATGATTT ATTTTAAGGC ATTCCCRAAT TTGCATAATT 180CTCCTTTTGG AGATACCCTT TTATCTCCAG TGCAAGTCTG GATCAAAGTG ATASAMAGAA 240GTTCCTCTCA GTGC 254(2)SEQ ID NO:78的信息：
(ⅰ)序列特征：
(A)长度：355个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:78:TTCGATACAG GCAAACATGA ACTGCAGGAG GGTGGTGACG ATCATGATGT TGCCGATGGT 60CCGGATGGNC ACGAAGACGC ACTGGANCAC GTGCTTACGT CCTTTTGCTC TGTTGATGGC 120CCTGAGGGGA CGCAGGACCC TTATGACCCT CAGAATCTTC ACAACGGGAG ATGGCACTGG 180ATTGANTCCC ANTGACACCA GAGACACCCC AACCACCAGN ATATCANTAT ATTGATGTAG 240TTCCTGTAGA NGGCCCCCTT GTGGAGGAAA GCTCCATNAG TTGGTCATCT TCAACAGGAT 300CTCAACAGTT TCCGATGGCT GTGATGGGCA TAGTCATANT TAACCNTGTN TCGAA 355(2)SEQ ID NO:79的信息：
(ⅰ)序列特征：
(A)长度：406个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:79:TAAGAGGGTA CCAGCAGAAA GGTTAGTATC ATCAGATAGC ATCTTATACG AGTAATATGC 60CTGCTATTTG AAGTGTAATT GAGAAGGAAA ATTTTAGCGT GCTCACTGAC CTGCCTGTAG 120CCCCAGTGAC AGCTAGGATG TGCATTCTCC AGCCATCAAG AGACTGAGTC AAGTTGTTCC 180TTAAGTCAGA ACAGCAGACT CAGCTCTGAC ATTCTGATTC GAATGACACT GTTCAGGAAT 240CGGAATCCTG TCGATTAGAC TGGACAGCTT GTGGCAAGTG AATTTGCCTG TAACAAGCCA 300GATTTTTTAA AATTTATATT GTAAATAATG TGTGTGTGTG TGTGTGTATA TATATATATA 360TGTACAGTTA TCTAAGTTAA TTTAAAAGTT GTTTGGTACC CTCTTA 406(2)SEQ ID NO:80的信息：
(ⅰ)序列特征：
(A)长度：327个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:80:TTTTTTTTTT TTTACTCGGC TCAGTCTAAT CCTTTTTGTA GTCACTCATA GGCCAGACTT 60AGGGCTAGGA TGATGATTAA TAAGAGGGAT GACATAACTA TTAGTGGCAG GTTAGTTGTT 120TGTAGGGCTC ATGGTAGGGG TAAAAGGAGG GCAATTTCTA GATCAAATAA TAAGAAGGTA 180ATAGCTACTA AGAAGAATTT TATGGAGAAA GGGACGCGGG CGGGGGATAT AGGGTCGAAG 240CCGCACTCGT AAGGGGTGGA TTTTTCTATG TAGCCGTTGA GTTGTGGTAG TCAAAATGTA 300ATAATTATTA GTAGTAAGCC TAGGAGA 327(2)SEQ ID NO:81的信息：
(ⅰ)序列特征：
(A)长度：318个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:81:TAGTCTATGC GGTTGATTCG GCAATCCATT ATTTGCTGGA TTTTGTCATG TGTTTTGCCA 60ATTGCATTCA TAATTTATTA TGCATTTATG CTTGTATCTC CTAAGTCATG GTATATAATC 120CATGCTTTTT ATGTTTTGTC TGACATAAAC TCTTATCAGA GCCCTTTGCA CACAGGGATT 180CAATAAATAT TAACACAGTC TACATTTATT TGGTGAATAT TGCATATCTG CTGTACTGAA 240AGCACATTAA GTAACAAAGG CAAGTGAGAA GAATGAAAAG CACTACTCAC AACAGTTATC 300ATGATTGCGC ATAGACTA 318(2)SEQ ID NO:82的信息：
(ⅰ)序列特征：
(A)长度：338个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:82:TCTTCAACCT CTACTCCCAC TAATAGCTTT TTGATGACTT CTAGCAAGCC TCGCTAACCT 60CGCCTTACCC CCCACTATTA ACCTACTGGG AGAACTCTCT GTGCTAGTAA CCACGTTCTC 120CTGATCAAAT ATCACTCTCC TACTTACAGG ACTCAACATA CTAGTCACAG CCCTATACTC 180CCTCTACATA TTTACCACAA CACAATGGGG CTCACTCACC CACCACATTA ACAACATAAA 240ACCCTCATTC ACACGAGAAA ACACCCTCAT GTTCATACAC CTATCCCCCA TTCTCCTCCT 300ATCCCTCAAC CCCGACATCA TTACCGGGTT TTCCTCTT 338(2)SEQ ID NO:83的信息：
(ⅰ)序列特征：
(A)长度：111个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:83:AGCCATTTAC CACCCATCCA CAAAAAAAAA AAAAAAAAAG AAAAATATCA AGGAATAAAA 60ATAGACTTTG AACAAAAAGG AACATTTGCT GGCCTGAGGA GGCATCACCC G 111(2)SEQ ID NO:84的信息：
(ⅰ)序列特征：
(A)长度：224个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:84:TCGGGTGATG CCTCCTCAGG CCAAGAAGAT AAAGCTTCAG ACCCCTAACA CATTTCCAAA 60AAGGAAGAAA GGAGAAAAAA GGGCATCATC CCCGTTCCGA AGGGTCAGGG AGGAGGAAAT 120TGAGGTGGAT TCACGAGTTG CGGACAACTC CTTTGATGCC AAGCGAGGTG CAGCCGGAGA 180CTGGGGAGAG CGAGCCAATC AGGTTTTGAA GTTCCTCTCA GTGC 224(2)SEQ ID NO:85的信息：
(ⅰ)序列特征：
(A)长度：348个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型
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Ser Ser Gly Gly Arg Thr Phe Asp Asp Phe His Arg Tyr Leu Leu Val
1 5 10 15
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(ⅰ)序列特征：
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(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:132:
Gln Gly Ala Ala Gln Lys Pro Ile Asn Leu Ser Lys Xaa Ile Glu Val
1 5 10 15
Val Gln Gly His Asp Glu
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(ⅰ)序列特征：
(A)长度：23个氨基酸
(B)类型：氨基酸
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Ser Pro Gly Val Phe Leu Glu His Leu Gln Glu Ala Tyr Arg Ile Tyr
1 5 10 15
Thr Pro Phe Asp Leu Ser Ala
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Tyr Leu Leu Val Gly Ile Gln Gly Ala
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(ⅰ)序列特征：
(A)长度：9个氨基酸
(B)类型：氨基酸
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Gly Ala Ala Gln Lys Pro Ile Asn Leu
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(A)长度：9个氨基酸
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Asn Leu Ser Lys Xaa Ile Glu Val Val
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(B)类型：氨基酸
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(A)长度：9个氨基酸
(B)类型：氨基酸
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Asn Leu Ala Phe Val Ala Gln Ala Ala
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(ⅰ)序列特征：
(A)长度：9个氨基酸
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(A)长度：9388个碱基对
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(ⅰ)序列特征：
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(D)拓扑结构：线型
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:178:TAGCATGTTG AGCCCAGACA CCTGTGTTTC TGGGAGCTCT GGCAGTGGCG GATTCATAGG 60CACTTGGGCT GCACTTTGAA TGACACACTT GGCTTTATTA GATTCACTAG TTTTTAAAAA 120ATTGTTGTTC GTTTCTTTTC ATTAAAGGTT TAATCAGACA GATCAGACAG CATAATTTTG 180TATTTAATGA CAGAAACGTT GGTACATTTC TTCATGAATG AGCTTGCATT CTGAAGCAAG 240AGCCTACAAA AGGCACTTGT TATAAATGAA AGTTCTGGCT CTAGAGGCCA GTACTCTGGA 300GTTTCAGAGC AGCCAGTGAT TGTTCCAGTC AGTGATGCCT AGTTATATAG AGGAGGAGTA 360CACTGTGCAC TCTTCTAGGT GTAAGGGTAT GCAACTTTGG ATCTTAAAAT TCTGTACACA 420TACACACTTT ATATATATGT ATGTATGTAT GAAAACATGA AATTAGTTTG TCAAATATGT 480GTGTGTTTAG TATTTTAGCT TAGTGCAACT ATTTCCACAT TATTTATTAA ATTGATCTAA 540GACACTTTCT TGTTGACACC TTGAATATTA ATGTTCAAGG GTGCAATGTG TATTCCTTTA 600GATTGTTAAA GCTTAATTAC TATGATTTGT AGTAAATTAA CTTTTAAAAT GTATTTGAGC 660CCTTCTGTAG TGTCGTAGGG CTCTTACAGG GTGGGAAAGA TTTTAATTTT CCAGTTGCTA 720ATTGAACAGT ATGGCCTCAT TATATATTTT GATTTATAGG AGTTTGTGTC TGGGCTCAAC 780ATGCTA 786(2)SEQ ID NO:179的信息：
(ⅰ)序列特征：
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(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:179:TAGCATGTTG AGCCCAGACA CTGGTTACAA GACCAGACCT GCTTCCTCCA TATGTAAACA 60GCTTTTAAAA AGCCAGTGAA CCTTTTTAAT ACTTTGGCAA CCTTCTTTCA CAGGCAAAGA 120ACACCCCCAT CCGCCCCTTG TTTGGAGTGC AGAGTTTGGC TTTGGTTCTT TGCCTTGCCT 180GGAGTATACT TCTAATTCCT GTTGTCCTGC ACAAGCTGAA TACCGAGCTA CCCACCGCCA 240CCCAGGCCAG GTTTCCACTC ATTTATTACT TTATGTTTCT GTTCCATTGC TGGTCCACAG 300AAATAAGTTT TCCTTTGGAG GAATGTGATT ATACCCCTTT AATTTCCTCC TTTTGCTTTT 360TTTTAATATC ATTGGTATGT GTTTGGCCCA GAGGAAACTG AAATTCACCA TCATCTTGAC 420TGGCAATCCC ATTACCATGC TTTTTTTAAA AAACGTAATT TTTCTTGCCT TACATTGGCA 480GAGTAGCCCT TCCTGGCTAC TGGCTTAATG TAGTCACTCA GTTTCTAGGT GGCATTAGGC 540ATGAGACCTG AAGCACAGAC TGTCTTACCA CAAAAGGTGA CAAGATCTCA AACCTTAGCC 600AAAGGGCTAT GTCAGGTTTC AATGCTATCT GCTTCTGTTC CTGCTCACTG TTCTGGATTT 660TGTCCTTCTT CATCCCTAGC ACCAGAATTT CCCAGTCTCC CTCCCTACCT TCCCTTGTTT 720TAATTCTAAT CTATCAGCAA AATAACTTTT CAAATGTTTT AACCGGTATC TCCATGTGTC 780TGGGCTCAAC ATGCTA 796(2)SEQ ID NO:180的信息：
(ⅰ)序列特征：
(A)长度：488个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:180:GGATGTGCTG CAAGGCGATT AAGTTGGGTA ACGCCAGGGT TTTCCCAGTC ACGACGTTGT 60AAAACGACGG CCAGTGAATT GTAATACGAC TCACTATAGG GCGAATTGGG CCCGACGTCG 120CATGCTCCCG GCCGCCATGG CCGCGGGATA GCATGTTGAG CCCAGACACC TGCAGGTCAT 180TTGGAGAGAT TTTTCACGTT ACCAGCTTGA TGGTCTTTTT CAGGAGGAGA GACACTGAGC 240ACTCCCAAGG TGAGGTTGAA GATTTCCTCT AGATAGCCGG ATAAGAAGAC TAGGAGGGAT 300GCCTAGAAAA TGATTAGCAT GCAAATTTCT ACCTGCCATT TCAGAACTGT GTGTCAGCCC 360ACATTCAGCT GCTTCTTGTG AACTGAAAAG AGAGAGGTAT TGAGACTTTT CTGATGGCCG 420CTCTAACATT GTAACACAGT AATCTGTGTG TGTGTGGGTG TGTGTGTGTG TCTGGGCTCA 480ACATGCTA 488(2)SEQ ID NO:181的信息：
(ⅰ)序列特征：
(A)长度：317个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:181:TAGCATGTTG AGCCCAGACA CGGCGACGGT ACCTGATGAG TGGGGTGATG GCACCTGTGA 60AAAGGAGGAA CGTCATCCCC CATGATATTG GGGACCCAGA TGATGAACCA TGGCTCCGCG 120TCAATGCATA TTTAATCCAT GATACTGCTG ATTGGAAGGA CCTGAACCTG AAGTTTGTGC 180TGCAGGTTTA TCGGGACTAT TACCTCACGG GTGATCAAAA CTTCCTGAAG GACATGTGGC 240CTGTGTGTCT AGTAAGGGAT GCACATGCAG TGGCCAGTGT GCCAGGGGTA TGGTTGGTGT 300CTGGGCTCAA CATGCTA 317(2)SEQ ID NO:182的信息：
(ⅰ)序列特征：
(A)长度：507个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:182:TAGCATGTTG AGCCCAGACA CTGGCTGTTA GCCAAATCCT CTCTCAGCTG CTCCCTGTGG 60TTTGGTGACT CAGGATTACA GAGGCATCCT GTTTCAGGGA ACAAAAAGAT TTTAGCTGCC 120AGCAGAGAGC ACCACATACA TTAGAATGGT AAGGACTGCC ACCTCCTTCA AGAACAGGAG 180TGAGGGTGGT GGTGAATGGG AATGGAAGCC TGCATTCCCT GATGCATTTG TGCTCTCTCA 240AATCCTGTCT TAGTCTTAGG AAAGGAAGTA AAGTTTCAAG GACGGTTCCG AACTGCTTTT 300TGTGTCTGGG CTCAACATGC TATCCCGCGG CCATGGCGGC CGGGAGCATG CGACGTCGGG 360CCCAATTCGC CCTATAGTGA GTCGTATTAC AATTCACTGG CCGTCGTTTT ACAACGTCGT 420GACTGGGAAA ACCCTGGCGT TACCCAACTT AATCGCCTTG CAGCACATCC CCCTTTCCCA 480GCTGGCGTAA TANCGAAAAG GCCCGCA 507(2)SEQ ID NO:183的信息：
(ⅰ)序列特征：
(A)长度：227个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:183:GATTTACGCT GCAACACTGT GGAGGTAGCC CTGGAGCAAG GCAGGCATGG ATGCTTCTGC 60AATCCCCAAA TGGAGCCTGG TATTTCAGCC AGGAATCTGA GCAGAGCCCC CTCTAATTGT 120AGCAATGATA AGTTATTCTC TTTGTTCTTC AACCTTCCAA TAGCCTTGAG CTTCCAGGGG 180AGTGTCGTTA ATCATTACAG CCTGGTCTCC ACAGTGTTGC AGCGTAA 227(2)SEQ ID NO:184的信息：
(ⅰ)序列特征：
(A)长度：225个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:184:TTACGCTGCA ACACTGTGGA GCAGATTAAC ATCAGACTTT TCTATCAACA TGACTGGGGT 60TACTAAAAAG ACAACAAATC AATGGCTTCA AAAGTCTAAG GAATAATTTC GATACTTCAA 120CTTTATAAAA CCTGACAAAA CTATCAATCA AGCATAAAGA CAGATGAAGA ACATTTCCAG 180ATTTTGGCCA ATCAGATATT TTACCTCCAC AGTGTTGCAG CGTAA 225(2)SEQ ID NO:185的信息：
(ⅰ)序列特征：
(A)长度：597个碱基对
(B)类型：核酸
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(ⅰ)序列特征：
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(ⅰ)序列特征：
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(B)类型：核酸
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(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:198:GTATCGACGT AGTGGTCTCC CAAGCAGTGG GAAGAAAACG TGAACCAATT AAAATGTATC 60AGATACCCCA AAGAAAGGCG CTTGAGTAAA GATTCCAAGT GGGTCACAAT CTCAGATCTT 120AAAATTCAGG CTGTCAAAGA GATTTGCTAT GAGGTTGCTC TCAATGACTT CAGGCACAGT 180CGGCAGGAGA TTGAAGCCCT GGCCATTGTC AAGATGAAGG AGCTTTGTGC CATGTATGGC 240AAGAAAGACC CCAATGAGCG GGACTCCTGG AGACCACTAC GTCGATAC 288(2)SEQ ID NO:199的信息：
(ⅰ)序列特征：
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(ⅰ)序列特征：
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(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:200:AGTGACATTA CGACGCTGGC CATCTTGAAT CCTAGGGCAT GAAGTTGCCC CAAAGTTCAG 60CACTTGGTTA AGCCTGATCC CTCTGGTTTA TCACAAAGAA TAGGATGGGA TAAAGAAAGT 120GGACACTTAA ATAAGCTATA AATTATATGG TCCTTGTCTA GCAGGAGACA ACTGCACAGG 180TATACTACCA GCGTCGTAAT GTCACTA 207(2)SEQ ID NO:201的信息：
(ⅰ)序列特征：
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(B)类型：核酸
(C)链型：单链
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(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:201:TGGGCACCTT CAATATCTAT TAAAAGCACA AATACTGAAG AACACACCAA GACTATCAAT 60GAGGTTACAT CTGGAGTCCT CGATATATCA GGAAAAAATG AAGTGAACAT TCACAGAGTT 120TTACTTCTTT GGGAACTCAA ATGCTAGAAA AGAAAAGGGT GCCCTCTTTC TCTGGCTTCC 180TGGTCCTATC CAGCGTCGTA ATGTCACTA 209(2)SEQ ID NO:202的信息：
(ⅰ)序列特征：
(A)长度：349个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
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(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:202:NTACGCTGCA ACACTGTGGA GCCACTGGTT TTTATTCCCG GCAGGTTATC CAGCAAACAG 60TCACTGAACA CACCGAAGAC CGTGGTATGG TAACCGTTCA CAGTAATCGT TCCAGTCGTC 120TGCGGGACCC CGACGAGCGT CACTGGGTAC AGACCAGATT CAGCCGGAAG AGAAAGCGCC 180GCAGGGAGAG ACTCGAACTC CACTCCGCTG GTGAGCAGCC CCATGTTTTC AACTCGAAGT 240TCAAACGGCA TTGGGTTATA TACCATCAGC TGAACTTCAC ACACATCTCC TTGAACCCAC 300TGGAAATCTA TTTTCTTGTT CCGCTCTTCT CCACAGTGTT GCAGCGTAA 349(2)SEQ ID NO:203的信息：
(ⅰ)序列特征：
(A)长度：241个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:203:TGCTCCTCTT GCCTTACCAA CCCAAAGCCC ACTGTGAAAT ATGAAGTGAA TGACAAAATT 60CAGTTTTCAA CGCAATATAG TATAGTTTAT CTGATTCTTT TGATCTCCAG GACACTTTAA 120ACAACTGCTA CCACCACCAC CAACCTAGGG ATTTAGGATT CTCCACAGAC CAGAAATTAT 180TTCTCCTTTG AGTTTCAGGC TCCTCTGGGA CTCCTGTTCA TCAATGGGTG GTAAATGGCT 240A 241(2)SEQ ID NO:204的信息：
(ⅰ)序列特征：
(A)长度：248个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:204:TAGCCATTTA CCACCCATCT GCAAACCSWG ACMWWCARGR CYWGWACKYA GGCGATTTGA 60AGTACTGGTA ATGCTCTGAT CATGTTAGTT ACATAAGTGT GGTCAGTTTA CAAAAATTCA 120CAGAACTAAA TACTCAATGC TATGTGTTCA TGTCTGTGTT TATGTGTGTG TAATGTTTCA 180ATTAAGTTTT TTTAAAAAAA AGAGATGATT TCCAAATAAG AAAGCCGTGT TGGTAAGGCA 240AGAGGAGC 248(2)SEQ ID NO：的信息：205
(ⅰ)序列特征：
(A)长度：505个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:205:TACGCTGCAA CACTGTGGAG CCATTCATAC AGGTCCCTAA TTAAGGAACA AGTGATTATG 60CTACCTTTGC ACGGTTAGGG TACCGCGGCC GTTAAACATG TGTCACTGGG CAGGCGGTGC 120CTCTAATACT GGTGATGCTA GAGGTGATGT TTTTGGTAAA CAGGCGGGGT AAGATTTGCC 180GAGTTCCTTT TACTTTTTTT AACCTTTCCT TATGAGCATG CCTGTGTTGG GTTGACAGTG 240GGGGTAATAA TGACTTGTTG GTTGATTGTA GATATTGGGC TGTTAATTGT CAGTTCAGTG 300TTTTAATCTG ACGCAGGCTT ATGCGGAGGA GAATGTTTTC ATGTTACTTA TACTAACATT 360AGTTCTTCTA TAGGGTGATA GATTGGTCCA ATTGGGTGTG AGGAGTTCAG TTATATGTTT 420GGGATTTTTT AGGTAGTGGG TGTTGANCTT GAACGCTTTC TTAATTGGTG GCTGCTTTTA 480RGCCTACTAT GGGTGGTAAA TGGCT 505(2)SEQ ID NO:206的信息：
(ⅰ)序列特征：
(A)长度：179个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:206:TAGACTGACT CATGTCCCCT ACCAAAGCCC ATGTAAGGAG CTGAGTTCTT AAAGACTGAA 60GACAGACTAT TCTCTGGAGA AAAATAAAAT GGAAATTGTA CTTTAAAAAA AAAAAAAATC 120GGCCGGGCAT GGTAGCACAC ACCTGTAATC CCAGCTACTA GGGGACATGA GTCAGTCTA 179(2)SEQ ID NO:207的信息：
(ⅰ)序列特征：
(A)长度：176个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:207:AGACTGACTC ATGTCCCCTA CCCCACCTTC TGCTGTGCTG CCGTGTTCCT AACAGGTCAC 60AGACTGGTAC TGGTCAGTGG CCTGGGGGTT GGGGACCTCT ATTATATGGG ATACAAATTT 120AGGAGTTGGA ATTGACACGA TTTAGTGACT GATGGGATAT GGGTGGTAAA TGGCTA 176(2)SEQ ID NO:208的信息：
(ⅰ)序列特征：
(A)长度：196个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:208:AGACTGACTC ATGTCCCCTA TTTAACAGGG TCTCTAGTGC TGTGAAAAAA AAAAATGCTG 60AACATTGCAT ATAACTTATA TTGTAAGAAA TACTGTACAA TGACTTTATT GCATCTGGGT 120AGCTGTAAGG CATGAAGGAT GCCAAGAAGT TTAAGGAATA TGGGTGGTAA ATGGCTAGGG 180GACATGAGTC AGTCTA 196(2)SEQ ID NO:209的信息：
(ⅰ)序列特征：
(A)长度：345个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:209:GACGCTTGGC CACTTGACAC CTTTTATTTT TTAAGGATTC TTAAGTCATT TANGTNACTT 60TGTAAGTTTT TCCTGTGCCC CCATAAGAAT GATAGCTTTA AAAATTATGC TGGGGTAGCA 120AAGAAGATAC TTCTAGCTTT AGAATGTGTA GGTATAGCCA GGATTCTTGT GAGGAGGGGT 180GATTTAGAGC AAATTTCTTA TTCTCCTTGC CTCATCTGTA ACATGGGGAT AATAATAGAA 240CTGGCTTGAC AAGGTTGGAA TTAGTATTAC ATGGTAAATA CATGTAAAAT GTTTAGAATG 300GTGCCAAGTA TCTAGGAAGT ACTTGGGCAT GGGTGGTAAA TGGCT 345(2)SEQ ID NO:210的信息：
(ⅰ)序列特征：
(A)长度：178个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:210:GACGCTTGGC CACTTGACAC TAGAGTAGGG TTTGGCCAAC TTTTTCTATA AAGGACCAGA 60GAGTAAATAT TTCAGGCTTT GTGGGTTGTG CAGTCTCTCT TGCAACTACT CAGCTCTGCC 120ATTGTAGCAT AGAAATCAGC CATAGACAGG ACAGAAATGA ATGGGTGGTA AATGGCTA 178(2)SEQ ID NO:211的信息：
(ⅰ)序列特征：
(A)长度：454个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:211:TGGGCACCTT CAATATCTAT CCAGCGCATC TAAATTCGCT TTTTTCTTGA TTAAAAATTT 60CACCACTTGC TGTTTTTGCT CATGTATACC AAGTAGCAGT GGTGTGAGGC CATGCTTGTT 120TTTTGATTCG ATATCAGCAC CGTATAAGAG CAGTGCTTTG GCCATTAATT TATCTTCATT 180GTAGACAGCA TAGTGTAGAG TGGTATCTCC ATACTCATCT GGAATATTTG GATCAGTGCC 240ATGTTCCAGC AACATTAACG CACATTCATC TTCCTGGCAT TGTACGGCCT TTGTCAGAGC 300TGTCCTCTTT TTGTTGTCAA GGACATTAAG TTGACATCGT CTGTCCAGCA CGAGTTTTAC 360TACTTCTGAA TTCCCATTGG CAGAGGCCAG ATGTAGAGCA GTCCTCTTTT GCTTGTCCCT 420CTTGTTCACA TCAGTGTCCC TGAGCATAAC GGAA 454(2)SEQ ID NO:212的信息：
(ⅰ)序列特征：
(A)长度：337个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:212:TCCGTTATGC CACCCAGAAA ACCTACTGGA GTTACTTATT AACATCAAGG CTGGAACCTA 60TTTGCCTCAG TCCTATCTGA TTCATGAGCA CATGGTTATT ACTGATCGCA TTGAAAACAT 120TGATCACCTG GGTTTCTTTA TTTATCGACT GTGTCATGAC AAGGAAACTT ACAAACTGCA 180ACGCAGAGAA ACTATTAAAG GTATTCAGAA ACGTGAAGCC AGCAATTGTT TCGCAATTCG 240GCATTTTGAA AACAAATTTG CCGTGGAAAC TTTAATTTGT TCTTGAACAG TCAAGAAAAA 300CATTATTGAG GAAAATTAAT ATCACAGCAT AACGGAA 337(2)SEQ ID NO:213的信息：
(ⅰ)序列特征：
(A)长度：715个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:213:TCGGGTGATG CCTCCTCAGG CATCTTCCAT CCATCTCTTC AAGATTAGCT GTCCCAAATG 60TTTTTCCTTC TCTTCTTTAC TGATAAATTT GGACTCCTTC TTGACACTGA TGACAGCTTT 120AGTATCCTTC TTGTCACCTT GCAGACTTTA AACATAAAAA TACTCATTGG TTTTAAAAGG 180AAAAAAGTAT ACATTAGCAC TATTAAGCTT GGCCTTGAAA CATTTTCTAT CTTTTATTAA 240ATGTCGGTTA GCTGAACAGA ATTCATTTTA CAATGCAGAG TGAGAAAAGA AGGGAGCTAT 300ATGCATTTGA GAATGCAAGC ATTGTCAAAT AAACATTTTA AATGCTTTCT TAAAGTGAGC 360ACATACAGAA ATACATTAAG ATATTAGAAA GTGTTTTTGC TTGTGTACTA CTAATTAGGG 420AAGCACCTTG TATAGTTCCT CTTCTAAAAT TGAAGTAGAT TTTAAAAACC CATGTAATTT 480AATTGAGCTC TCAGTTCAGA TTTTAGGAGA ATTTTAACAG GGATTTGGTT TTGTCTAAAT 540TTTGTCAATT TNTTTAGTTA ATCTGTATAA TTTTATAAAT GTCAAACTGT ATTTAGTCCG 600TTTTCATGCT GCTATGAAAG AAATACCCAN GACAGGGTTA TTTATAAANG GAAAGANGTT 660AATTTGACTC CCAGTTCACA GGCCTGAGGA NGNATCNCCC GAAATCCTTA TTGCG 715(2)SEQ ID NO:214的信息：
(ⅰ)序列特征：
(A)长度：345个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:214:GGTAANGNGC ATACNTCGGT GCTCCGGCCG CCGGAGTCGG GGGATTCGGG TGATGCCTCC 60TCAGGCCCAC TTGGGCCTGC TTTTCCCAAA TGGCAGCTCC TCTGGACATG CCATTCCTTC 120TCCCACCTGC CTGATTCTTC ATATGTTGGG TGTCCCTGTT TTTCTGGTGC TATTTCCTGA 180CTGCTGTTCA GCTGCCACTG TCCTGCAAAG CCTGCCTTTT TAAATGCCTC ACCATTCCTT 240CATTTGTTTC TTAAATATGG GAAGTGAAAG TGCCACCTGA GGCCGGGCAC AGTGGCTCAC 300GCCTGTAATC CCAGCACTTT GGGAGCCTGA GGAGGCATCA CCCGA 345(2)SEQ ID NO:215的信息：
(ⅰ)序列特征：
(A)长度：429个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线型
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Claims (43)
1．一种分离的DNA分子，该分子包含：
(a)选自下组的核苷酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3-SEQ IDNO:77和SEQ ID NO:142、143、146-152、154-166、168-176、178-192、194-198、200-204、206、207、209-214、216、218、219、221-227；
(b)所说核苷酸序列的变体，其含有在不超过20％的核苷酸位置上的一个或多个核苷酸取代、缺失、插入和/或修饰，以便由该核苷酸序列编码的多肽的抗原和/或免疫原性的性质得以保持；或
(c)编码多肽之表位的核苷酸序列，所说的多肽是由至少一种选自下组的序列编码的：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3-SEQ ID NO:77和SEQID NO:142、143、146-152、154-166、168-176、178-192、194-198、200-204、206、207、209-214、216、218、219、221-227。
2．一种编码多肽之表位的分离的DNA分子，其中所说的多肽由具有以下性质的核苷酸序列编码：
(a)在严格条件下与选自下组的序列杂交：SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:3-SEQ ID NO:77和SEQ ID NO:142、143、146-152、154-166、168-176、178-192、194-198、200-204、206、207、209-214、216、218、219、221-227；和
(b)与选自下组的序列至少80％相同：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3-SEQ ID NO:77和SEQ ID NO:142、143、146-152、154-166、168-176、178-192、194-198、200-204、206、207、209-214、216、218、219、221-227；并且，其中相应于所说的核苷酸序列的RNA在人乳腺肿瘤组织中以比在正常乳腺组织更高的水平表达。
3．一种编码多肽之表位的分离的DNA分子，其中所说的多肽由以下序列编码：
(a)从SEQ ID NO:141转录的核苷酸序列；或
(b)所说的核苷酸序列的变体，其含有在不超过20％的核苷酸位置上的一个或多个核苷酸取代、缺失、插入和/或修饰，以便由该核苷酸序列编码的多肽的抗原和/或免疫原性的性质得以保持。
4．一种包含互补于按照权利要求1-3之任一的DNA分子核苷酸序列的分离的DNA或RNA分子。
5．一种包含按照权利要求1-3之任一的DNA分子的重组表达载体。
6．一种由按照权利要求5的表达载体转化或转染的宿主细胞。
7．一种包含由按照权利要求1-3之任一的DNA分子编码的氨基酸序列的多肽。
8．按照权利要求7的多肽，其中所说的多肽包含由至少一种选自下组的核苷酸序列编码的氨基酸序列的表位：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3-SEQ ID NO:77和SEQ ID NO:142、143、146-152、154-166、168-176、178-192、194-198、200-204、206、207、209-214、216、218、219、221-227。
9．一种与按照权利要求7的多肽结合的单克隆抗体。
10．一种用于确定患者中乳腺癌存在的方法，该方法包括在生物样品内检测按照权利要求7的至少一种多肽，并且由此确定患者中乳腺癌的存在。
11．一种用于确定患者中乳腺癌存在的方法，该方法包括在生物样品内检测由选自下组的核苷酸序列和在严格条件下与它们杂交的序列编码的至少一种多肽：SEQ ID NO:78-86和SEQ ID NO:144、145、153、167、177、193、199、205、208、215、217、220。
12．权利要求10或11的方法，其中所说的生物样品是乳腺肿瘤的一部分。
13．权利要求10的方法，其中所说的检测步骤包括使生物样品与按照权利要求9的单克隆抗体接触。
14．权利要求11的方法，其中所说的检测步骤包括使生物样品与一种单克隆抗体接触，该单克隆抗体结合到由选自下组的核苷酸序列和在严格条件下与它们杂交的序列编码的多肽上：SEQ ID NO:78-86和SEQ IDNO:144、145、153、167、177、193、199、205、208、215、217、220。
15．一种用于确定患者中乳腺癌存在的方法，该方法包括在生物样品内检测编码至少一种按照权利要求7的多肽的RNA分子，并且由此确定患者中乳腺癌的存在。
16．一种用于确定患者中乳腺癌存在的方法，该方法包括在生物样品内检测至少一种编码由选自下组的核苷酸序列和在严格条件下与它们杂交的序列编码之多肽的RNA分子，并且由此确定患者中乳腺癌的存在：SEQID NO:78-86和SEQ ID NO:144、145、153、167、177、193、199、205、208、215、217、220。
17．权利要求15或16的方法，其中所说的生物样品是乳腺肿瘤的一部分。
18．权利要求15的方法，其中所说的检测步骤包括：
(a)从生物样品内的RNA分子制备cDNA；和
(b)特异性地扩增能够编码按照权利要求7的多肽的至少一部分的cDNA分子，并且由此确定患者中乳腺癌的存在。
19．权利要求16的方法，其中所说的检测步骤包括：
(a)从生物样品内的RNA分子制备cDNA；和
(b)特异性地扩增能够编码由选自下组的核苷酸序列和在严格条件下与它们杂交的序列编码之多肽的至少一部分的cDNA分子，并且由此确定患者中乳腺癌的存在：SEQ ID NO:78-86和SEQ ID NO:144、145、153、167、177、193、199、205、208、215、217、220。
20．按照权利要求7的多肽用于检测患者中乳腺癌存在的方法中。
21．由选自下组的核苷酸序列和在严格条件下与它们杂交的序列编码的多肽用于检测患者中乳腺癌存在的方法中：SEQ ID NO:78-86和SEQID NO:144、145、153、167、177、193、199、205、208、215、217、220。
22．一种用于监测患者中乳腺癌发展的方法，该方法包括：
(a)在生物样品中检测至少一种按照权利要求7的多肽在第一时间点时的量；
(b)在后续的时间点重复步骤(a)；和
(c)比较在步骤(a)和(b)中检测到的多肽的量，并且由此监测患者中乳腺癌的发展。
23．一种用于监测患者中乳腺癌发展的方法，该方法包括：
(a)在生物样品中检测至少一种由选自下组的核苷酸序列和在严格条件下与它们杂交的序列编码的多肽在第一时间点时的量：SEQ ID NO:78-86和SEQ ID NO:144、145、153、167、177、193、199、205、208、215、217、220；
(b)在后续的时间点重复步骤(a)；和
(c)比较在步骤(a)和(b)中检测到的多肽的量，并且由此监测患者中乳腺癌的发展。
24．权利要求22或23的方法，其中所说的生物样品是乳腺肿瘤的一部分。
25．权利要求22的方法，其中所说的检测步骤使生物样品的一部分与按照权利要求9的单克隆抗体接触。
26．权利要求23的方法，其中所说的检测步骤包括使生物样品与一种单克隆抗体接触，该单克隆抗体结合到由选自下组的核苷酸序列和在严格条件下与它们杂交的序列编码的多肽上：SEQ ID NO:78-86和SEQ IDNO:144、145、153、167、177、193、199、205、208、215、217、220。
27．权利要求20或22的方法，其中所说的多肽包含由至少一种选自下组的核苷酸序列编码的氨基酸序列的表位：SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:3-SEQ ID NO:77和SEQ ID NO:142、143、146-152、154-166、168-176、178-192、194-198、200-204、206、207、209-214、216、218、219、221-227。
28．一种用于监测患者中乳腺癌发展的方法，该方法包括：
(a)在生物样品中检测至少一种编码按照权利要求7的多肽的RNA分子在第一时间点时的量；
(b)在后续的时间点重复步骤(a)；和
(c)比较在步骤(a)和(b)中检测到的RNA分子的量，并且由此监测患者中乳腺癌的发展。
29．权利要求28的方法，其中所说的检测步骤包括：
(a)从生物样品中内的RNA分子制备cDNA；和
(b)特异性地扩增能够编码按照权利要求7的多肽的至少一部分的cDNA分子。
30．一种用于监测患者中乳腺癌发展的方法，该方法包括：
(a)在生物样品中检测至少一种RNA分子在第一时间点时的量，所说的RNA分子编码由选自下组的核苷酸序列和在严格条件下与它们杂交的序列编码的多肽：SEQ ID NO:78-86和SEQ ID NO:144、145、153、167、177、193、199、205、208、215、217、220；
(b)在后续的时间点重复步骤(a)；和
(c)比较在步骤(a)和(b)中检测到的RNA分子的量，并且由此监测患者中乳腺癌的发展。
31．一种药物组合物，该组合物包含一种按照权利要求7的多肽和一种生理上可接受的载体。
32．一种用于抑制乳腺癌发展的药物组合物，该组合物包含一种多肽和一种生理上可接受的载体，所说的多肽是由选自下组的核苷酸序列和在严格条件下与它们杂交的序列编码的：SEQ ID NO:78-86和SEQ ID NO:144、145、153、167、177、193、199、205、208、215、217、220。
33．一种疫苗，该疫苗包含按照权利要求7的多肽和免疫应答增强子。
34．一种疫苗，该疫苗包含按照权利要求1-3之任一的DNA分子。
35．一种疫苗，该疫苗包括含有按照权利要求1-3之任一的DNA分子的重组表达载体。
36．一种用于抑制乳腺癌发展的疫苗，该疫苗包含一种多肽和一种免疫应答增强子，所说的多肽是由选自下组的核苷酸序列和在严格条件下与它们杂交的序列编码的：SEQ ID NO:78-86和SEQ ID NO:144、145、153、167、177、193、199、205、208、215、217、220。
37．一种诊断试剂盒，该试剂盒包含：
(a)一种或多种按照权利要求9的单克隆抗体；和
(b)一种检测试剂。
38．一种诊断试剂盒，该试剂盒包含：
(a)一种或多种单克隆抗体，这些单克隆抗体结合到由选自下组的核苷酸序列编码的多肽上：SEQ ID NO:78-86和SEQ ID NO:144、145、153、167、177、193、199、205、208、215、217、220；和
(b)一种检测试剂。
39．权利要求37或38之任一的试剂盒，其中所说的单克隆抗体是固定化在固相支持物上的。
40．一种诊断试剂盒，该试剂盒包含第一聚合酶链反应引物和第二聚合酶链反应引物，该第一和第二引物各自包含至少约10个按照权利要求4的RNA分子的邻接核苷酸。
41．一种诊断试剂盒，该试剂盒包含第一聚合酶链反应引物和第二聚合酶链反应引物，该第一和第二引物各自包含至少约10个编码由选自下组的核苷酸序列编码之多肽的RNA分子的邻接核苷酸：SEQ ID NO:78-86和SEQ ID NO:144、145、153、167、177、193、199、205、208、215、217、220。
42．一种诊断试剂盒，该试剂盒包含至少一种寡核苷酸探针，该寡核苷酸探针含有至少约15个按照权利要求4的DNA分子的邻接核苷酸。
43．一种诊断试剂盒，该试剂盒包含至少一种寡核苷酸探针，该寡核苷酸探针含有至少约15个选自下组的DNA序列的邻接核苷酸：SEQ ID NO:78-86和SEQ ID NO:144、145、153、167、177、193、199、205、208、215、217、220。
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