CN118914326A - 一种用于检测h1n1流感病毒的电化学传感器及其制备与检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及电化学分析检测技术领域，尤其涉及一种用于检测H1N1流感病毒的电化学传感器及其制备与检测方法。一种用于检测H1N1流感病毒的电化学传感器，包括电极、CoFe2O4‑Au@Pt纳米复合材料、生物识别元件以及信号转换器。电极用于与H1N1流感病毒中的HA蛋白接触并产生电化学反应。CoFe2O4‑Au@Pt纳米复合材料作为电极修饰材料来修饰电极。生物识别元件包括DNA适配体，其用于特异性识别HA蛋白。信号转换器用于将生物识别元件与HA蛋白之间的相互作用转换成电信号输出。本发明中的CoFe2O4‑Au@Pt纳米复合材料一方面与‑HS键修饰的DNA适配体共价结合形成Pt‑S键；另一方面通过Au NPs和Pt NPs双金属协同作用，提高材料的电催化活性，促进电子的转移速率，由此提高传感器的灵敏度。
Description
技术领域
本发明涉及电化学分析检测技术领域，具体为一种用于检测H1N1流感病毒的电化学传感器及其制备与检测方法。
背景技术
近几十年来，流感大流行对人类生命健康的威胁大大增加，世界上大多数国家都制定了相关的防疫计划。这些流感病毒属于正粘病毒科的单链RNA病毒，在鸟类、人类和一些哺乳动物中季节性大流行。流感病毒有两种表面糖蛋白，包括血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)，用于流感病毒的分类(甲型、乙型和丙型流感病毒)和发病机制。甲型流感病毒根据这两种蛋白划分为亚型，共有18种不同的HA亚型和11种不同的NA亚型。特别是甲型流感引起的H1N1和H3N3亚型，是三种流感类型中毒性最强的人类病原体，可引起严重的流行病。因此，对流感病毒的快速、准确的检测是及时就医治疗和控制其大规模传播的有效手段。
目前流感病毒的检测主要采用采用病毒培养、血清学检测、快速流感诊断检测(RIDTs)和反转录聚合酶链反应(RT-PCR)四种方法。其中，前者在医院中使用最为普遍。然而，除了昂贵的大型设备之外，还需要几天的时间。血清学测定依赖于抗体-病毒抗原相互作用，并且抗体的制备相对耗时、劳动密集且昂贵。此外，多项研究报告称，季节性人类流感HA抗体无法检测到某些变异流感病毒，这可能会导致假阴性诊断。RIDT是一种酶促免疫层析方法，由于仅需要10-15分钟，已在临床中广泛用于治疗决策。虽然它们的操作简单且快速，但只有当患者样本具有高病毒颗粒(104～106)时才能实现其合理的性能。这种有限的灵敏度(～80％)可能会导致常见的假阴性诊断，需要通过疾病控制和预防中心(CDC)推荐的其他分子检测(例如RT-PCR)进一步确定。目前，PCR仍然是最流行的核酸扩增方法，已广泛应用于医院流感病毒的诊断。该检测方法极具有极高的敏感度和特异性，可以将靶核酸序列(基因)呈指数级扩增，直到达到可检测的水平。然而，PCR需要精确的热循环仪和训练有素的人员。此外，反应可能需要超过2-3小时，对于临床甲型流感病毒治疗来说，这个时间是缓慢的。
电化学传感器作为一种常见的检测手段，其被广泛应用于食品、医药、化工、发酵工业、环境监测等领域，随着电化学传感器的发展，商业化电化学传感器的数量也逐渐增加。但是现有的电化学传感器存在灵敏度低、检测误差大、稳定性差等缺点，导致其在对H1N1病毒进行检测时容易出现误差而导致检测结果不准确的情况发生。
发明内容
为了解决现有技术中电化学传感器灵敏度低、检测误差大的技术问题，本发明提供一种用于检测H1N1流感病毒的电化学传感器。
为达到以上目的，本发明采用的技术方案为：一种用于检测H1N1流感病毒的电化学传感器，其包括电极、CoFe2O4-Au@Pt纳米复合材料、生物识别元件以及信号转化器；所述电极用于与所述H1N1流感病毒中的HA蛋白接触，引起电化学反应；所述CoFe2O4-Au@Pt纳米复合材料作为电极修饰材料来修饰所述电极；CoFe2O4-Au@Pt纳米复合材料通过在所述CoFe2O4-APTES溶液中加入Au@Pt NPs，再机械搅拌一段时间并清洗干燥制得；所述生物识别元件包括DNA适配体，所述DNA适配体用于特异性识别所述H1N1流感病毒中的HA蛋白，所述DNA适配体的核苷酸序列HS-C6-5-GGCCTACCGTAGTGTGCGTGGGCACATGTTCGCGCCACCGTGCTACAAC-3；所述DNA适配体与所述CoFe2O4-Au@Pt纳米复合材料混合制得CoFe2O4-Au@Pt-aptamer；所述CoFe2O4-Au@Pt纳米复合材料与所述DNA适配体连接形成Pt-S键，用于将所述DNA适配体固定于所述电极的表面。当向所述电极中滴加需要检测的H1N1流感病毒的HA蛋白后，所述CoFe2O4-Au@Pt-aptamer中的所述DNA适配体能够与所述HA蛋白特异性结合，从而实现将所述HA蛋白固定于所述电极上；所述信号转换器用于将所述生物识别元件与所述H1N1流感病毒中的HA蛋白之间的相互作用转换成电信号输出。
作为上述方案的进一步改进，所述Au@Pt NPs的制备过程如下：将0.5mL、浓度为1％wt的HAuCl4溶液加入到50mL的水溶液中，并将水溶液加热搅拌至沸腾；然后迅速加入0.8mL、浓度为1％wt的柠檬酸钠，再继续加热水溶液直至溶液呈酒红色时，继续加入0.1M的抗坏血酸和1.25mL、浓度为1％wt的H2PtCl6，再加热25min后，溶液最终变成深灰色，则制得所述Au@Pt NPs。
作为上述方案的进一步改进，所述Au@Pt NPs的最大掺入量为90mL。
作为上述方案的进一步改进，所述电极为磁性玻碳电极。
作为上述方案的进一步改进，所述CoFe2O4-APTES溶液的制备方法如下：将CoFe2O4纳米颗粒溶于乙醇中，然后加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，机械搅拌一段时间后，得到CoFe2O4-APTES溶液。
作为上述方案的进一步改进，所述3-氨丙基三乙氧基硅烷的浓度为0.5％～4％。
作为上述方案的进一步改进，所述CoFe2O4纳米颗粒的制备方法如下：在乙二醇中依次加入FeCl3·H2O、CoCl2·6H2O、尿素和柠檬酸钠，对该混合液进行超声并使其充分溶解，得到反应液一；将反应液一置于聚四氟乙烯内衬中，并密封于反应釜中在200℃下反应10h，待反应釜冷却至室温后，用磁铁回收所述反应液一的固体，并依次用无水乙醇和去离子水进行清洗，清洗后再对固体进行烘干，即制得球形结构的所述CoFe2O4纳米颗粒。
作为上述方案的进一步改进，所述电化学传感器对HA蛋白的检测浓度范围为1pg/mL～1μg/mL。
一种用于检测H1N1流感病毒的电化学传感器的制备方法，其包括以下步骤：将所述CoFe2O4-Au@Pt纳米复合材料在PBS缓冲液中清洗多次，清洗完成后将其重新悬浮于250μL的PBS缓冲液中；在向250μL的PBS缓冲液中加入20μL的所述DNA适配体，得到混合液二，将混合液二在室温下孵育一段时间；去除混合液二中的上清液，再用磁铁收集混合液二中的固体，并用PBS缓冲液清洗收集后的混合液二中的固体，在将清洗后的固体重新悬浮于250μL的PBS缓冲液中，即制得所述CoFe2O4-Au@Pt-aptamer；向所述CoFe2O4-Au@Pt-aptamer中加入1％BSA的PBS缓冲液中，孵育30min；然后再用含有1％Tween20的PBS缓冲液对孵育后的固体进行清洗，清洗后用磁铁富集，再将磁铁收集到的固体重新悬浮于250μL的PBS缓冲液中，即制得所述CoFe2O4-Au@Pt-aptamer-BSA；取6μL制备好的所述CoFe2O4-Au@Pt-aptamer-BSA滴加在干净的电极上，然后加入不同浓度的HA蛋白，通过所述CoFe2O4-Au@Pt-aptamer-BSA与HA蛋白的特异性结合来实现对HA蛋白的浓度进行检测。
一种用于检测H1N1流感病毒的检测方法，其采用上述的用于检测H1N1流感病毒的电化学传感器进行检测。
一种用于检测H1N1流感病毒的检测方法，其包括以下步骤：通过制备的所述电化学传感器与一系列已知浓度的HA蛋白进行分别孵育，然后通过差分脉冲伏安法测出这一系列浓度下的HA蛋白的电流值；通过不同浓度的HA蛋白对应的电流值来绘制标准工作曲线，得到标准曲线为Y＝-1.486X+29.149，其中X为已知浓度的HA蛋白的浓度的对数，Y为不同浓度HA蛋白的电流值；将未知浓度的HA蛋白与所述电化学传感器进行孵育，然后通过电化学检测法测得该浓度下的HA蛋白的电流值，再通过标准工作曲线来计算出未知浓度的HA蛋白的浓度。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明构建一种基于CoFe2O4-Au@Pt纳米复合材料的电化学传感器，用于测定不同浓度的H1N1-HA蛋白。CoFe2O4-Au@Pt纳米复合材料，其优异的磁性能在外加磁铁下可实现生物分子的快速分离与富集，并且可牢固的修饰在电极上，从而实现对电极表面的电子信号进行放大操作。此外，CoFe2O4-Au@Pt纳米复合材料中的Au NPs和Pt NPs双金属协同效果，能够增大有效的电化学活性面积提高了材料的电催化活性，促进了电子的转移速率，并最终提高了传感器的灵敏度。且CoFe2O4-Au@Pt纳米复合材料中掺杂有Au@Pt NPs，能够提供更多的结合位点，并与-HS修饰的DNA适配体连接形成Pt-S键，实现对DNA适配体的有效固定。
(2)使用磁性玻碳电极有利于将CoFe2O4-Au@Pt-aptamer-BSA磁浓缩在电极表面，从而放大电化学信号。最后，利用无标记电化学伏安法检测HA蛋白，通过与HA蛋白形成的复合物引起电极表面的电子信号发生变化，即可对HA蛋白进行快速检测。由于本发明的电化学传感器的具有优异的电子传递能力，使得其具有更宽的检测范围，可对浓度为1pg/mL-1μg HA的灵敏检测。
(3)构建这种无标记的基于CoFe2O4-Au@Pt纳米复合材料的电化学传感器，可利用差分脉冲伏安法灵敏性检测H1N1蛋白，最低检测限为0.945pg/mL，整个检测过程仅需几分钟。同时，这种电化学传感器的构建方法可批量化生产，并在三周内仍然保持检测活性和高特异性。
(4)本发明制备出来的电化学传感器具有良好的抗干扰性、稳定性和重复性。
附图说明
图1为本发明中不同浓度的ATPES添加至CoFe2O4后的电位图。
图2为本发明中Au@Pt NPs在透射显微镜中在高倍下的高分辨透射图。
图3为本发明CoFe2O4-Au@Pt纳米复合材料在透射显微镜中在高倍下的高分辨透射图。
图4为本发明CoFe2O4-Au@Pt纳米复合材料在透射显微镜中在低倍下的高分辨透射图。
图5为本发明中CoFe2O4-Au@Pt纳米复合材料的元素分布图以及Au、Pt元素掺杂含量比例。
图6为本发明制备电化学传感器的示意图。
图7为本发明制备出来的电化学传感器检测一系列已知浓度的HA蛋白的DPV曲线图。
图8为通过本发明制备出来的电化学传感器检测一系列已知浓度的HA蛋白的电流和浓度的标准曲线图。
图9为通过本发明制备的电化学传感器并采用循环伏安法对一些中间产物的电信号进行检测的电信号图。
图10为通过本发明制备的电化学传感器并采用电化学阻抗谱法对一些中间产物的电信号进行检测的电信号图。
图11为本发明制备的电化学传感器在不同pH电解液中的电信号图。
图12为对本发明制备出来的电化学传感器的进行稳定性测试得到的结果的图。
图13为对本发明制备出来的电化学传感器的进行再现性测试得到的结果的图。
具体实施方式
下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
在本发明的描述中，需要说明的是，对于方位词，如有术语“中心”、“横向”、“纵向”、“长度”、“宽度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”、“顺时针”、“逆时针”等指示方位和位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于叙述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定方位构造和操作，不能理解为限制本发明的具体保护范围。本发明的说明书和权利要求书中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。本发明的说明书和权利要求书中的术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
本发明的一个实施例提供的一种用于检测H1N1流感病毒的电化学传感器，包括电极、CoFe2O4-Au@Pt纳米复合材料、生物识别元件以及信号转换器。
电极用于与H1N1流感病毒中的HA蛋白接触，并产生电化学反应。
CoFe2O4-Au@Pt纳米复合材料作为电极修饰材料来修饰电极。CoFe2O4-Au@Pt纳米复合材料通过在CoFe2O4-APTES溶液中加入Au@Pt NPs，机械搅拌4h后再清洗，清洗后在60℃下真空干燥制得。
生物识别元件包括DNA适配体，DNA适配体用于特异性识别H1N1流感病毒中的HA蛋白，DNA适配体的核苷酸序列HS-C6-5-GGCCTACCGTAGTGTGCGTGGGCACATGTTCGCGCCACCGTGCTACAAC-3。DNA适配体与CoFe2O4-Au@Pt纳米复合材料混合制得CoFe2O4-Au@Pt-aptamer。CoFe2O4-Au@Pt纳米复合材料中的Au@Pt NPs能够提供更多地结合位点，并与-HS修饰的DNA适配体连接形成Pt-S键，用于将DNA适配体固定于电极的表面。本实施例中的DNA适配体可特异性识别结合H1N1流感病毒中的HA蛋白，同时本实施例中的DN A适配体是在适配体的序列上修饰醇硫基得到，其可通过Pt-S共价结合固定在CoFe2O4-Au@Pt纳米复合材料上，最终修饰在CoFe2O4-Au@Pt-aptamer上并通过CoFe2O4-Au@Pt-aptamer修饰在电极上，由此实现检测HA蛋白。当向电极中滴加需要检测的H1N1流感病毒的HA蛋白后，CoFe2O4-Au@Pt-aptamer中的DNA适配体能够与HA蛋白特异性结合，从而实现将HA蛋白固定于电极上，从而能够实现对HA蛋白进行有效的检测。
CoFe2O4-Au@Pt纳米复合材料其具有优异的磁性能，在外部磁铁作用下可实现生物分子的快速分离与富集，并且可以牢固修饰在磁性玻碳电极上，放大电极表面的电子信号，由此提高制备出来的电化学传感器的灵敏度。
信号转换器用于将生物识别元件与H1N1流感病毒中的HA蛋白之间的相互作用转换成电信号输出。
在本实施例中，电极可为磁性玻碳电极。使用磁性玻碳电极有利于将CoFe2O4-Au@Pt-aptamer磁浓缩在电极的表面，从而实现放大电化学信号，由此提高电化学传感器在检测过程中的灵敏度以及准确度。
在本实施例中，CoFe2O4-Au@Pt纳米复合材料的具体制备过程如下：取0.1gCoFe2O4-ATPES，再加入90mL的Au@Pt NPs，机械搅拌4h并进行清洗，清洗后于60℃进行真空干燥，即可得到CoFe2O4-Au@Pt纳米复合材料。
在本实施例中，Au@Pt NPs的制备过程如下：将0.5mL、浓度为1％wt的HAuCl4溶液加入到50mL的水溶液中，并将水溶液加热搅拌至沸腾；然后迅速加入0.8mL、浓度为1％wt的柠檬酸钠，再继续加热几分钟后，溶液发生浅黄色-灰色-黑色-紫色-酒红色的变化，表明AuNPs的形成。再向水溶液中继续加入0.1M的抗坏血酸和1.25mL、浓度为1％wt的H2PtCl6，再加热25min后，溶液最终变成深灰色，则制得Au@Pt NPs。制备出来的Au@PtNPs一方面能够提供足够数量的活性位点，这些活性位点能够与特定的-HS(醇硫)修饰的DNA适配体共价结合形成Pt-S键；另一方面其自身的Au NPs和Pt NPs双金属协同作用，提高了材料的电催化活性，促进电子的转移速率，并最终提高电化学传感器的灵敏度。
Au@Pt NPs的最大掺入量为90mL。在实际制备CoFe2O4-Au@Pt纳米复合材料的过程中，因Au@Pt NPs是深灰色溶液，将Au@Pt NPs加入到CoFe2O4-ATPES中搅拌使其充分结合后，在外加磁铁下掺杂Au@Pt NPs的CoFe2O4会与溶液分离出来，如果上清液变为澄清，则Au@PtNPs完全掺入CoFe2O4中。这时，可以继续加入Au@Pt NPs并搅拌，磁铁分离直到上清液不再澄清，即掺杂量达到最大。当磁铁分离直到上清液不在澄清时，Au@Pt NPs的掺杂量为90mL。通过掺杂最多的Au@Pt NPs能够引入更多的结合位点，从而实现对DNA适配体最大化固定。
在本实施例中，CoFe2O4-APTES溶液的制备方法如下：将CoFe2O4纳米颗粒溶于乙醇中，然后加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，机械搅拌6h后，得到CoFe2O4-APTES溶液。
其中，3-氨丙基三乙氧基硅烷的化学简称为APTES。
在CoFe2O4-APTES溶液的制备过程中，3-氨丙基三乙氧基硅烷的浓度为0.5％～4％。
因此需要通过做一系列实验，每组实验中添加不同浓度的3-氨丙基三乙氧基硅烷，然后选择最大氨基化的一组CoFe2O4-APTES溶液进行后续操作。
筛选最大氨基化的实验操作如下：
(1)将0.5％～4％的ATPES分成七个浓度梯度，具体分为0.5％ATPES、1％ATPES、1.5％ATPES、2.5％ATPES、3％ATPES、3.5％ATPES、4％ATPES，再加上一个0％APTES。
(2)将1g的CoFe2O4溶于100mL乙醇中，并配置八份相同的溶液；
(3)将步骤(1)中不同浓度的ATPES分别加入步骤(2)的溶液中，并进行机械搅拌6h，然后通过Zeta电位分析仪对这八份溶液的Zeta电位进行检测，检测结果如图1所示。通过观察图1可知，当ATPES的浓度为3％时，制备出来的CoFe2O4-APTES的Zeta电位最大，Zeta电位最大，则说明此时的CoFe2O4-APTES已经最大氨基化。
在本实施例中通过在CoFe2O4中添加ATPES来实现CoFe2O4最大胺基化，而最大氨基化说明此时的CoFe2O4的ZeTa为最大正电位。而Au@Pt NPs是通过柠檬酸钠和抗坏血酸还原合成的，表面电荷带负电。因此，Au@Pt NPs可通过静电吸附掺入CoFe2O4-ATPES中。
在本实施例中，CoFe2O4纳米颗粒的制备方法如下：在70mL乙二醇中依次加入1.51gFeCl3·H2O、0.63gCoCl2·6H2O、4.2g尿素和0.16g柠檬酸钠，对该混合液进行超声并使其充分溶解，得到反应液一，其为棕色溶液；
将反应液一置于聚四氟乙烯内衬中，并密封于高压反应釜中在200℃下反应10h，待反应釜冷却至室温后，用磁铁回收反应液一的固体，并依次用无水乙醇和去离子水进行清洗，清洗后再对固体放入60℃的干燥箱中烘干，即制得球形结构的CoFe2O4纳米颗粒。
将制备出来的Au@Pt NPs、CoFe2O4-Au@Pt纳米复合材料分别放置于透射显微镜下观察。其中，图2为Au@Pt NPs在高倍下的高分辨透射图。图3为CoFe2O4-Au@Pt纳米复合材料在高倍下的高分别透射图。图4为CoFe2O4-Au@Pt纳米复合材料在低倍下的高分别透射图。图5为CoFe2O4-Au@Pt纳米复合材料的元素分布图以及Au、Pt元素掺杂含量比例。
从图2中可看出，制备出来的Au@Pt NPs分散均匀，平均晶粒尺寸约为15nm，呈海胆状。一个颗粒中心圆球物质就是Au NPs，圆球外源绿花瓣状物质则是Pt NPs，由此可证明制备出来的为Au@Pt NPs。
从图3中可看出制备出来的CoFe2O4-Au@Pt纳米复合材料中的CoFe2O4纳米颗粒呈球形，且分散均匀，平均晶粒尺寸约为150nm，吸附在CoFe2O4上的深色小球则是Au@Pt。
实施例2
一种用于检测H1N1流感病毒的电化学传感器的制备方法，其包括以下步骤：
(1)取250μL、浓度为3mg/mL实施例1制备的CoFe2O4-Au@Pt纳米复合材料，在浓度为0.01mol/L，pH为7.2的PBS缓冲液中清洗三次，清洗完成后将其重新悬浮于250μL的PBS缓冲液中。
(2)在向250μL的PBS缓冲液中加入20μL的DNA适配体，得到混合液二，将混合液二在室温下孵育3h。去除混合液二中的上清液，再用磁铁收集混合液二中的固体，并用PBS缓冲液清洗两次，清洗两次的目的是去除未结合的生物分子。再收集后的混合液二中的固体并重新悬浮于250μL的PBS缓冲液中，即制得CoFe2O4-Au@Pt-aptamer。
(3)向CoFe2O4-Au@Pt-aptamer中加入1％BSA的PBS缓冲液中，孵育30min。这一操作的目的是阻断非特异性游离位点。然后再用含有1％Tween20的PBS缓冲液对孵育后的固体进行清洗，清洗后用磁铁富集，再将磁铁收集到的固体重新悬浮于250μL的PBS缓冲液中，并在4℃下保存，即制得CoFe2O4-Au@Pt-aptamer-BSA。
(4)取6μL制备好的CoFe2O4-Au@Pt-aptamer-BSA滴加在干净的电极上，然后加入不同浓度的HA蛋白，通过CoFe2O4-Au@Pt-aptamer-BSA与HA蛋白的特异性结合来实现对HA蛋白的浓度进行检测。
其中BSA又称绝缘子蛋白，中文名为牛血清蛋白。是购买的药品。BSA作为封闭剂在生物检测试验中很常用，其原理是通过非特异性吸附作用，在本专利使用的磁性纳米颗粒CoFe2O4表面形成一层稳定的蛋白质层，能够填补和覆盖磁性纳米颗粒CoFe2O4没有吸附DNA适配体的空白位置，避免所要检测的HA蛋白非特异性吸附到磁性纳米颗粒CoFe2O4，从而影响检测结果。
在本实施例中，可参照图6来理解电化学传感器的制备过程。
在这一过程中，我们需要验证制备出来的电化学传感器的一些性能，因此我们需要对制备出来的电化学传感器进行验证。验证操作如下：
按照电化学传感器的制备方法中的步骤(1)至步骤(4)制备出CoFe2O4-Au@Pt-aptamer。然后将制备出来的CoFe2O4-Au@Pt-aptamer滴加在干净的磁性玻碳电极上，使得功能化磁性材料与电极牢固结构。
配置一系列已知浓度的HA蛋白，HA蛋白的浓度范围为1pg/mL-1μg/mL，将这些已知浓度的HA蛋白分别滴加到电极中，然后通过DPV法对已知浓度的HA蛋白的电信号进行测量，得到一系列浓度的HA蛋白的DPV曲线图，请参照图7。通过对这一系列已知浓度的HA蛋白的电流和浓度来绘制标准曲线，得到的标准曲线如图8所示。
通过图7可知，本实施例制备出来的电化学传感器能够对HA蛋白的浓度在1pg/mL-1μg/mL进行灵敏检测，由此得以验证制备出来的电化学传感器的灵敏度。
通过图8可知，标准曲线为Y＝-1.486X+29.149，其中Y为电流值，X为HA蛋白浓度的对数。且图8中标准曲线中R2＝0.988，其中R2表示线性拟合程度，R2越接近1说明标准曲线的拟合程度就越好。且R2＝0.988表明本实施例制备出来的电化学传感器在不同浓度的HA蛋白下响应的电流值具有良好的线性关系。
电化学检测一般是从高浓度到低浓度的一个检测，最终目的是得到可对H1N1中HA蛋白的最低检测浓度。本实施例中通过用DPV法检测，通过图7可知，随着HA蛋白浓度的降低，DPV峰值电流逐渐升高，再结合图8可知，最终电流值于浓度的对数成为线性关系，并依此计算最低检测限，通过检测不同浓度的HA蛋白所得到的电化学信号并根据最低检测限的经验计算公式最低检测限LOD＝3σ/S灵敏度(S)是该线性拟合方程的斜率，σ是信噪比(空白样品的标准偏差)。具体的，H1N1流感病毒中的HA蛋白未加入之前的信号是背景信号，加入不同浓度的HA蛋白之后信号随之变化，通过对不同通读信号变化差值计算检测限。由此可计算出本实施例制备出来的电化学传感器对HA蛋白的最低浓度检测值为0.945pg/mL。检测限越低，说明制备出来的化学传感器对HA蛋白的检测灵敏度越高。由此可证明制备出来的电化学传感器的灵敏度高。
此外，在制备出本实施例的电化学传感器前，我们还对电化学传感器的组装过程进行彻底的调查，通过循环伏安法(CV)和电化学阻抗谱法(EIS)来表征制备的电化学传感器的每一步修饰过程。具体的，我们在制备电化学传感器时，对中间产物CoFe2O4、CoFe2O4-Au@Pt纳米复合材料、CoFe2O4-Au@Pt-aptamer以及CoFe2O4-Au@Pt-aptamer-BSA的电信号也做了一系列实验。
通过循环伏安法对上述产物的电信号进行检测得到如图9的结果。通过电化学阻抗谱法上述产物的电信号进行检测得到如图10的结果。
通过图9，利用CV来描述电极表面的伏安曲线，在每个功能化步骤上都有明确的氧化还原峰。其中MGCE/CoFe2O4-Au@Pt的峰值电流明显高于MGCE/CoFe2O4，这是由于Au@Pt纳米颗粒具有良好的电化学活性，加速了溶液中电子在电极表面的转移。随着DNA适配体的加入，电子的转移受到阻碍，导致电极的氧化还原电流明显降低。此外，由于绝缘蛋白分子BSA的存在，电极与电解质表面的电子传输进一步被阻碍，导致电极的氧化还原电流持续降低。总的来说，这些峰值电流的降低和电位的移动表明电化学传感器的成功构建。
如图10，电化学传感器的表征也通过EIS验证。EIS在100kHz和0.01Hz之间测量，高频部分的半圆对应于电极界面的电子转移电阻。相对于MGCE/CoFe2O4，MGCE/CoFe2O4-Au@Pt表现出可忽略的电子转移电阻。随着DNA适配体的加入，在电极表面会形成[Fe(CN6)]3-/4-氧化还原分子的阻碍层，导致电子转移电阻升高。最终BSA的加入进一步阻碍了电子的转移。CV和EIS的结果基本一致，表明了电化学传感器的成功制备和对H1N1流感病毒中的HA蛋白的可行性。
在电化学传感器制备好并用于使用前，还需要对其使用过程中的一些参数进行优化实验。
一、优化制备出来的传感器在不同pH值下的电解液下检测HA蛋白的性能。
在对HA蛋白的浓度进行检测前，我们需要配置好电解液，检测时需要将带有HA蛋白的电极浸入电解液中来进行实验。在生物检测中常用的电解液是用0.1M的PBS作为溶剂，计算好5mM计算好5mM[Fe(CN6)]3-/4-和0.1M KCl所要用的固体量，加入盛有0.1M PBS的容量瓶中制成。
制备多个有相同浓度的HA蛋白的电化学传感器，并配置不同pH值的电解液，将每个传感器的电极分别放置在不同pH值的电解液中，然后通过DPV法检测该浓度下HA蛋白所对应的电流值。得到的结果如图11所示。
通过图11可知当电解液的pH值为7.2时，电流信号最强，由此说明制备出来的电化学传感器在pH值为7.2时其检测信号最佳。
二、对唾液样品中HA蛋白的回收率进行优化实验
唾液样本是通过加标法在唾液中加入一定浓度的HA蛋白，再通过DPV法对唾液样本中的HA浓度进行检测，最终测试的电流值是根据HA蛋白在标准曲线方程中计算得到的。得到结果如下表所示。
通过上表可知，本实施例制备出来的电化学传感器的唾液样本中的回收率在90％以上，电化学传感器的检测性能最佳。
此外，在电化学传感器进行使用前，我们还对电化学传感器的稳定性和再现性进行测试实验。
对制备出来的电化学传感器的稳定性进行测试实验的操作如下：通过将所制备的传感器在4℃冰箱中保存30天，并在第1、3、5、7、14、21和30天对HA(1ng/mL)蛋白测试来评估传感器的稳定性。得到的测试结果如图12。测试结果表明，传感器在第14天保留了初始值的94.15％；在第30天仍保留了初始值的78.08％。尽管其电流响应有所下降，但传感器的稳定性处于可接受的范围之内。因此可说明制备出来的电化学传感器的稳定性很好。
对制备出来的电化学传感器的再现性进行测试，操作如下：使用六根同批次电极修饰MGCE/CoFe2O4-Au@Pt/ssDNA2/BSA来检测浓度为1ng/mL的HA蛋白，不同电极得到的测试结果如图13所示。通过图13可知，6根不同电极所测得的结构基本一致，相对标准偏差(RSD)仅为1.68％，这表明所制备的传感器具有高重现性。
实施例3
一种用于检测H1N1流感病毒的检测方法，其采用如实施例1和实施例2的用于检测H1N1流感并的电化学传感器进行检测。
一种用于检测H1N1流感病毒的检测方法，其包括以下步骤：
制备出一系列已知浓度的HA蛋白并进行分别孵育，然后通过差分脉冲伏安法测出这一系列浓度下的HA蛋白的电流值；
通过不同浓度的HA蛋白对应的电流值来绘制标准工作曲线，得到标准曲线为Y＝-1.486X+29.149，其中X为已知浓度的HA蛋白的浓度的对数，Y为不同浓度HA蛋白的电流值；
将未知浓度的HA蛋白与电化学传感器进行孵育，然后通过电化学检测法测得该浓度下的HA蛋白的电流值，再通过标准工作曲线来计算出未知浓度的HA蛋白的浓度。
电化学检测法包括循环伏安法(CV)、电化学阻抗谱法(EIS)和差分脉冲伏安法(DPV)。CV的扫描速度为100mV s-1。EIS测试是在0.1Hz至100kHz的频率范围内施加小于10mV幅度的输入电压。当电位增幅5mV，脉冲幅度50mV，脉冲宽度0.05s时，DPV的扫描电位范围为-0.2～0.6V。
实施例4
一种试剂盒，其包括实施例1的电化学传感器。
以上描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明的范围内。本发明要求的保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
Claims (10)
1.一种用于检测H1N1流感病毒的电化学传感器，其特征在于，其包括：
电极，其用于与所述H1N1流感病毒中的HA蛋白接触，引起电化学反应；
CoFe2O4-Au@Pt纳米复合材料，其作为电极修饰材料来修饰所述电极；CoFe2O4-Au@Pt纳米复合材料通过在所述CoFe2O4-APTES溶液中加入Au@Pt NPs，再机械搅拌一段时间并清洗干燥制得；
生物识别元件，所述生物识别元件包括DNA适配体，所述DNA适配体用于特异性识别所述H1N1流感病毒中的HA蛋白，所述DNA适配体的核苷酸序列HS-C6-5-GGCCTACCGT AGTGTGCGTGGGCACATGTTCGCGCCACCGTGCTACAAC-3；所述DNA适配体与所述Co Fe2O4-Au@Pt纳米复合材料混合制得CoFe2O4-Au@Pt-aptamer；所述CoFe2O4-Au@Pt纳米复合材料与所述DNA适配体连接形成Pt-S键，用于将所述DNA适配体固定于所述电极的表面；当向所述电极中滴加需要检测的H1N1流感病毒的HA蛋白后，所述CoFe2O4-Au@Pt-aptamer中的所述DNA适配体能够与所述HA蛋白特异性结合，从而实现将所述HA蛋白固定于所述电极上；
信号转换器，其用于将所述生物识别元件与所述H1N1流感病毒中的HA蛋白之间的相互作用转换成电信号输出。
2.如权利要求1所述的用于检测H1N1流感病毒的电化学传感器，其特征在于，所述Au@Pt NPs的制备过程如下：将0.5mL、浓度为1％wt的HAuCl4溶液加入到50mL的水溶液中，并将水溶液加热搅拌至沸腾；然后迅速加入0.8mL、浓度为1％wt的柠檬酸钠，再继续加热水溶液直至溶液呈酒红色时，继续加入0.1M的抗坏血酸和1.25mL、浓度为1％wt的H2PtCl6，再加热25min后，溶液最终变成深灰色，则制得所述Au@Pt NPs。
3.如权利要求1所述的用于检测H1N1流感病毒的电化学传感器，其特征在于，所述Au@Pt NPs的最大掺入量为90mL；
和/或，所述电极为磁性玻碳电极。
4.如权利要求1所述的用于检测H1N1流感病毒的电化学传感器，其特征在于，所述CoFe2O4-APTES溶液的制备方法如下：将CoFe2O4纳米颗粒溶于乙醇中，然后加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，机械搅拌一段时间后，得到CoFe2O4-APTES溶液。
5.如权利要求1所述的用于检测H1N1流感病毒的电化学传感器，其特征在于，所述3-氨丙基三乙氧基硅烷的浓度为0.5％～4％。
6.如权利要求1所述的用于检测H1N1流感病毒的电化学传感器，其特征在于，所述CoFe2O4纳米颗粒的制备方法如下：在乙二醇中依次加入FeCl3·H2O、CoCl2·6H2O、尿素和柠檬酸钠，对该混合液进行超声并使其充分溶解，得到反应液一；
将反应液一置于聚四氟乙烯内衬中，并密封于反应釜中在200℃下反应10h，待反应釜冷却至室温后，用磁铁回收所述反应液一的固体，并依次用无水乙醇和去离子水进行清洗，清洗后再对固体进行烘干，即制得球形结构的所述CoFe2O4纳米颗粒。
7.如权利要求4所述的用于检测H1N1流感病毒的电化学传感器，其特征在于，所述电化学传感器对HA蛋白的检测浓度范围为1pg/mL～1μg/mL。
8.一种用于检测H1N1流感病毒的电化学传感器的制备方法，其特征在于，其包括以下步骤：
将如权利要求1所述的用于检测H1N1流感病毒的电化学传感器中的所述CoFe2O4-Au@Pt纳米复合材料在PBS缓冲液中清洗多次，清洗完成后将其重新悬浮于250μL的PBS缓冲液中；在向250μL的PBS缓冲液中加入20μL的所述DNA适配体，得到混合液二，将混合液二在室温下孵育一段时间；去除混合液二中的上清液，再用磁铁收集混合液二中的固体，并用PBS缓冲液清洗收集后的混合液二中的固体，在将清洗后的固体重新悬浮于250μL的PBS缓冲液中，即制得所述CoFe2O4-Au@Pt-aptamer；
向所述CoFe2O4-Au@Pt-aptamer中加入1％BSA的PBS缓冲液中，孵育30min；然后再用含有1％Tween20的PBS缓冲液对孵育后的固体进行清洗，清洗后用磁铁富集，再将磁铁收集到的固体重新悬浮于250μL的PBS缓冲液中，即制得所述CoFe2O4-Au@Pt-aptamer-BSA；
取6μL制备好的所述CoFe2O4-Au@Pt-aptamer-BSA滴加在干净的电极上，然后加入不同浓度的HA蛋白，通过所述CoFe2O4-Au@Pt-aptamer-BSA与HA蛋白的特异性结合来实现对HA蛋白的浓度进行检测。
9.一种用于检测H1N1流感病毒的检测方法，其特征在于，其采用如权利要求1所述的用于检测H1N1流感病毒的电化学传感器进行检测。
10.一种如权利要求3所述的用于检测H1N1流感病毒的检测方法，其特征在于，其包括以下步骤：
通过制备的所述电化学传感器与一系列已知浓度的HA蛋白进行分别孵育，然后通过差分脉冲伏安法测出这一系列浓度下的HA蛋白的电流值；
通过不同浓度的HA蛋白对应的电流值来绘制标准工作曲线，得到标准曲线为Y＝-1.486X+29.149，其中X为已知浓度的HA蛋白的浓度的对数，Y为不同浓度HA蛋白的电流值；
将未知浓度的HA蛋白与所述电化学传感器进行孵育，然后通过电化学检测法测得该浓度下的HA蛋白的电流值，再通过标准工作曲线来计算出未知浓度的HA蛋白的浓度。
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