CN118414350A - 纯化具有igg fc结构域的融合蛋白的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及：一种纯化具有IgG Fc结构域的融合蛋白的方法，包括对含有具有IgG Fc结构域的融合蛋白的原料进行多模态色谱纯化步骤，从而得到内毒素小于0.05EU/mg或尺寸排阻HPLC纯度为98％以上的具有IgG Fc结构域的融合蛋白；一种纯化具有IgG Fc结构域的融合蛋白的方法，该方法不使用阴离子交换色谱，包括下列步骤：a)培养用于产生具有IgG Fc结构域的融合蛋白的细胞，b)从步骤a)中培养的细胞中回收蛋白质，c)通过初级色谱纯化步骤b)中回收的蛋白质，和d)通过多模态色谱和阳离子交换色谱纯化步骤c)中初级色谱纯化的蛋白质；以及包含通过该方法纯化的具有IgG Fc结构域的融合蛋白的组合物。

Description

纯化具有IGG FC结构域的融合蛋白的方法
技术领域
本发明涉及：一种纯化具有IgG Fc结构域的融合蛋白的方法，其中将含有具有IgGFc结构域的融合蛋白的原料进行多模态色谱纯化步骤以获得内毒素＜0.05EU/mg或尺寸排阻HPLC纯度为98％或更高的具有IgG Fc结构域的融合蛋白；一种纯化具有IgG Fc结构域的融合蛋白的方法，该方法包括：a)培养产生具有IgG Fc结构域的融合蛋白的细胞，b)从步骤a)中培养的细胞中回收蛋白质，c)通过初级色谱纯化步骤b)中回收的蛋白质，d)通过多模态色谱(multimodal chromatography)和阳离子交换色谱纯化步骤c)中初级色谱纯化的蛋白质，其中不使用阴离子交换色谱；通过该方法纯化的具有IgG Fc结构域的融合蛋白；以及含有所述融合蛋白的组合物。
背景技术
人免疫球蛋白G(IgG)的Fc结构域是通过与发挥蛋白质功能的结构域融合而在蛋白质药物中显示持续性的因子。因此目前市售的许多蛋白质药物都是以Fc融合蛋白的形式开发的。
血管内皮生长因子(VEGF)是增加血管生成和血管通透性的重要因子。特别地，VEGF在肿瘤中过度表达，异常促进血管生成和肿瘤增殖(Oncogene((2004))23，1745-1753)。据报道，除了肿瘤发生外，异常血管生成还与其他疾病有重要关系。VEGF相关机制中的异常血管生成与湿性黄斑变性、糖尿病性视网膜病变、视网膜静脉阻塞性黄斑水肿等眼科疾病有关(J.Korean Med.Assoc.(2014),57(7),614-623)。
对于眼科疾病的治疗，使用哌加他尼(pegaptanib)(RNA适配体)、雷珠单抗(ranibizumab)(单克隆IgG抗体片段(Fab))、贝伐单抗(bevacizumab)(单克隆IgG抗体)，而阿柏西普(aflibercept)(VEGFR1和VEGFR2与IgG1 Fc融合)于2011年在美国获批作为湿性黄斑变性治疗药物(Biol.Ther.(2012)2(3)1-22,Drug Design,Development and Therapy(2013)3(7),711-722)。
技术问题
本发明人开发了通过进行多模态色谱纯化步骤来纯化具有IgG Fc结构域的融合蛋白的有效方法。
技术方案
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种纯化具有IgG Fc结构域的融合蛋白的方法，其中对含有具有IgG Fc结构域的融合蛋白的原料进行多模态色谱纯化步骤，以获得内毒素＜0.05EU/mg或尺寸排阻HPLC纯度为98％或更高的具有IgG Fc结构域的融合蛋白。
根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种纯化具有IgG Fc结构域的融合蛋白的方法，所述方法包括：a)培养产生具有IgG Fc结构域的融合蛋白的细胞；b)从步骤a)中培养的细胞中回收蛋白质；c)通过初级色谱纯化步骤b)中回收的蛋白质；d)通过多模态色谱和阳离子交换色谱纯化步骤c)中初级色谱纯化的蛋白质，其中不使用阴离子交换色谱。根据本发明的又一个方面，本发明提供了通过上述方法纯化的具有IgG Fc结构域的融合蛋白以及含有该融合蛋白的组合物。
有益效果
使用本发明的纯化方法可以提供具有IgG Fc结构域的融合蛋白的有效的大规模生产方法和供应。
附图说明
图1显示了通过使用MabSelect SuRe树脂以结合和洗脱模式对从CHO细胞培养物获得的具有IgG Fc结构域的融合蛋白(特别是阿柏西普)进行蛋白A色谱而获得的色谱图。
图2显示了在图1中的纯化步骤(蛋白质A色谱法)之后，使用Capto Adhere树脂以结合和洗脱模式对从CHO细胞培养物中获得的具有IgG Fc结构域的融合蛋白(特别是阿柏西普)进行多模态色谱而获得的色谱图。
图3显示了在图1和2中的纯化步骤(蛋白A亲和色谱和多模态色谱)之后，通过使用Capto S树脂以结合和洗脱模式对从CHO细胞培养物中获得的具有IgG Fc结构域的融合蛋白(特别是阿柏西普)进行阳离子交换色谱所获得的色谱图。
图4显示了图3的纯化步骤(Capto S阳离子交换色谱)中纯化并洗脱级分的等电聚焦分析结果。泳道1代表内参1，泳道2代表内参2。泳道3代表以阳离子交换色谱(CEX)洗脱体积为3Cv收集的样品的分析结果，以及泳道4、5、6、7、8代表以每泳道增加0.5CV的CEX洗脱体积收集的样品的分析结果。
图5显示了在图1和2中的纯化步骤(蛋白A亲和色谱和多模态色谱)之后，通过使用SP-550C树脂以结合和洗脱模式对从CHO细胞培养物中获得的具有IgG Fc结构域的融合蛋白(特别是阿柏西普)进行阳离子交换色谱所获得的色谱图。
图6显示了图5的纯化步骤(SP-550C阳离子交换色谱)中纯化并洗脱级分的等电聚焦分析结果。泳道1代表以4CV CEX洗脱体积收集的样品的分析结果，泳道2和3分别代表以8Cv和10CV CEX洗脱体积收集的样品的分析结果。
图7显示了阳离子交换色谱得到的盐梯度洗脱色谱图。
图8显示了阳离子交换色谱得到的盐梯度洗脱级分的等电聚焦分析结果。在盐梯度洗脱中，由于异构体的清除，目标蛋白的产量降低。
图9显示了通过使用Capto Q树脂以流通模式对通过CHO细胞培养获得的具有IgGFc结构域的融合蛋白(特别是阿柏西普)进行阴离子色谱分析，以便与Capto Adhere树脂多模态色谱进行比较评估而获得的色谱图。
图10显示了通过使用Capto Adhere树脂以结合和洗脱模式对CHO细胞培养获得的具有IgG Fc结构域的融合蛋白(特别是阿柏西普)进行多模态色谱分析，以便与Capto Q树脂阴离子交换色谱分析进行比较评估而获得的色谱图。
图11显示了对阴离子色谱和多模态色谱之间进行比较评估的同一样品在纯化后的宿主细胞蛋白(HCP)分析结果。
图12显示了本发明纯化的阿柏西普和市售阿柏西普的甲硫氨酸残基的氧化分析结果。
图13显示了本发明纯化的阿柏西普和市售阿柏西普的组氨酸残基的氧化分析结果。
图14显示了本发明纯化的阿柏西普与市售阿柏西普各氨基酸残基的脱酰胺分析结果。
图15显示了本发明纯化的阿柏西普和市售阿柏西普各氨基酸残基的脱水分析结果。
最佳实施方式
在下文中，将详细描述本发明。本发明所公开的各说明及实施方案亦可适用于包含共同事项的其他说明及实施方案。此外，本发明所公开的各要素的所有组合均属于本发明的范围。此外，本发明所记载的文献亦可通过引用并入本文。此外，本发明的范围并不受以下具体说明所限制。
本发明的一个方面提供了一种纯化具有IgG Fc结构域的融合蛋白的方法，其中对含有具有IgG Fc结构域的融合蛋白的原料进行多模态色谱纯化步骤，以获得内毒素＜0.05EU/mg或尺寸排阻HPLC纯度为98％或更高的具有IgG Fc结构域的融合蛋白。
本文所用的术语“具有IgG Fc结构域的融合蛋白”是指含有IgG Fc结构域的融合蛋白。含有具有IgG Fc结构域的融合蛋白的原料可利用动物细胞系通过细胞培养产生，但不限于此。
在一个实施方案中，本发明的融合蛋白可以是血管内皮生长因子(VEGF)拮抗剂，但不限于此。
在一个实施方案中，本发明的融合蛋白可以含有IgG Fc结构域和VEGF受体-1和-2，但不限于此。
在一个实施方案中，VEGF受体-1和-2可以是VEGF受体-1和-2的细胞外结构域，但不限于此。
在一个实施方案中，VEGF受体可以是人类VEGF受体，但不限于此。
在一个实施方案中，本发明的融合蛋白可以是阿柏西普，但不限于此。
本文所用的术语“IgG Fc”是指Fc区，其是免疫球蛋白IgG的恒定区。显然，任何具有缺失、修饰、取代、保守取代或添加一些氨基酸的氨基酸序列的蛋白质都可以用于本发明，只要该蛋白质具有与免疫球蛋白IgG的Fc区相同或相等的活性即可。
免疫球蛋白IgG Fc可以由IgG的CH1、CH2、CH3和CH4结构域组成，并且可以包括铰链区。
此外，本发明的免疫球蛋白IgG Fc区包括突变体的氨基酸序列以及天然免疫球蛋白IgG Fc区的序列。氨基酸序列突变体是指由于天然氨基酸序列中至少一个氨基酸残基的缺失、插入、非保守或保守取代、或其组合，而具有与天然氨基酸序列不同的序列的突变体。
在一个实施方案中，本发明的IgG Fc可以是人IgG Fc。
在一个实施方案中，本发明的IgG Fc可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc结构域，具体可以是IgG1的Fc结构域，但不限于此。
本发明中，“含有具有IgG Fc结构域的融合蛋白的原料”可以包括未纯化的细胞、其培养物、通过细胞培养获得的其裂解物等，并且可以包括具有IgG Fc结构域的融合蛋白，但不限于此。
纯化具有IgG Fc结构域的融合蛋白的方法包括多模态色谱纯化步骤。
下文中使用的术语“色谱法”是指通过将混合物通过介质来分离混合物的组分的任何过程，其中混合物的组分以不同的速率通过介质。色谱的例子可以包括柱色谱、平面色谱、薄层色谱、气相色谱、液相色谱、快速蛋白质液相色谱(FPLC)、高效液相色谱(HPLC)、离子交换色谱(阳离子交换色谱、阴离子交换色谱)、尺寸排阻色谱、多模态色谱、疏水相互作用色谱等。
在本发明的纯化方法的每个步骤中，描述了示例性的色谱方法或装置，并且这些可应用于上述所有类型的色谱。
本发明各步骤中的色谱可包括进样阶段、平衡阶段、洗涤阶段和洗脱阶段。具体而言，可以改变各阶段的顺序进行，可以在各阶段之前、之后或之间添加附加阶段(例如，平衡阶段或洗涤阶段)，并且一个阶段可以包括另一个阶段。例如，可在进样阶段之前进一步添加平衡阶段，并且洗涤阶段可包括在平衡阶段中，或者平衡阶段可包括在洗涤阶段中。本发明的平衡阶段可为使平衡缓冲液通过柱来平衡树脂的阶段；本发明的洗涤阶段可为用缓冲液洗涤柱以去除吸附在树脂上的杂质的阶段；并且洗脱阶段可为洗脱和/或回收目标蛋白的阶段。
举例来说，本发明的色谱中的缓冲液可含有选自氨丁三醇、磷酸钠、醋酸钠、柠檬酸和醋酸中的至少一种，但不限于此；所述缓冲液可用于平衡阶段、洗涤阶段和洗脱阶段。
在一个实施方案中，本发明的洗脱阶段可以采用盐梯度、pH梯度或它们的组合。
在一个实施方案中，本发明的洗脱阶段可以以结合和洗脱模式进行。
在一个实施方案中，本发明的洗脱阶段可以不采用流通模式。
本文使用的术语“流通”是指通过色谱法收集流通液的模式，本文使用的术语“结合和洗脱”是指目标蛋白通过混合模式相互作用与附着在树脂上的配体结合，并利用缓冲液组成、pH等的组成从树脂中释放分子的模式。流通模式可以是在特定条件下仅去除与柱树脂结合的物质的模式，而结合和洗脱模式可以是在特定条件下去除未与柱树脂结合的物质并回收未与柱树脂结合的其他物质的模式。
在本发明的具有IgG Fc结构域的抗体和融合蛋白的纯化中，采用结合洗脱模式的多模式色谱(multimode chromatography)纯化融合蛋白，而不是采用通常使用的通过阴离子交换色谱或多模态色谱收集流通液的流通模式，从而与采用阴离子交换色谱和/或多模式色谱的流通模式相比，可以有效去除宿主细胞蛋白、内毒素、病毒、蛋白A浸出液等。此外，采用本发明的纯化方法，仅通过简单的三步色谱纯化工艺，便可以得到高纯度的融合蛋白，可以有效纯化等电点在pH 6-8范围内的具有IgG Fc结构域的融合蛋白(特别是阿柏西普)。
本文使用的术语“多模态色谱(multimodal chromatography)”是指利用固定相和目标蛋白之间的至少一种相互作用来分离目标蛋白的色谱。相互作用的示例可以包括针对蛋白质大小、电荷、疏水性和/或亲水性的特定相互作用。多模态色谱可以与混合模式色谱互换使用。本发明的多模态色谱包括物理多模态色谱和化学多模态色谱。
本发明的多模态色谱法可以包括平衡阶段、进样阶段、洗涤阶段和洗脱阶段。
在一个实施方案中，本发明的多模态色谱的各个阶段中使用的缓冲液可以含有选自氨丁三醇、磷酸钠和醋酸钠中的至少一种，但不限于此。
在一个实施方案中，本发明的多模态色谱的平衡阶段可以包括使1至10个柱体积(CV)、2至8Cv、4至6Cv或5CV的缓冲液以100至200cm/hr、110至190cm/hr、120至180cm/hr、130至170cm/hr、140至160cm/hr或150cm/hr的流速通过该柱，但不限于此。
在一个实施方案中，本发明的多模态色谱的平衡阶段可以在约pH 6-8下进行，具体地在pH 7下进行，但不限于此。
在一个实施方案中，本发明的多模态色谱的平衡阶段中使用的缓冲液可以具有约pH 6-8，具体地pH 7，但不限于此。
在一个实施方案中，本发明的多模态色谱的平衡阶段中使用的缓冲液可以含有氨丁三醇、磷酸钠或它们的组合，但不限于此。
在一个实施方案中，在本发明的多模态色谱的洗涤阶段中，1至10个柱体积(CV)、2至8CV、4至6CV或5CV的缓冲液可以通过柱，但不限于此。
在一个实施方案中，在本发明的多模态色谱的洗脱阶段中，1至10个柱体积(CV)、3至9个CV、5至8个CV或7个CV的缓冲液可以通过柱，但不限于此。
在一个实施方案中，本发明的多模态色谱的洗脱阶段可以在约pH 3-7、约pH 4-6、并且具体地约pH 5下进行，但不限于此。
在一个实施方案中，洗脱阶段所用的缓冲液可以具有约pH 3-7、约pH 4-6，并且具体地约pH 5，但不限于此。
本文使用的术语“约”可以出现在特定数值之前。本文使用的术语“约”不仅包括该术语之后所列举的确切数字，还包括接近或几乎等于该数字的范围。考虑到数字所处的上下文，可以确定任何数字是否接近或几乎等于所列举的特定数字。例如，术语“约”可以指数值的-10％至+10％的范围。作为另一个示例，术语“约”可以指给定数值的-5％至+5％的范围。但是，该术语不限于此。
在一个实施方案中，本发明的多模态色谱的洗脱阶段中使用的缓冲液可以含有磷酸钠、醋酸钠或其组合，但不限于此。
在一个实施方案中，本发明的多模态色谱的洗脱阶段可以采用盐梯度、pH梯度或它们的组合，具体地采用pH梯度。
在一个实施方案中，本发明的多模态色谱的洗脱阶段可以以结合和洗脱模式进行。
在一个实施方案中，本发明的多模态色谱的洗脱阶段可以不采用流通模式。
举例来说，本发明的多模态色谱所采用的树脂可以是选自Capto adhereTM、CaptoMMCTM、Capto MMC ImpResTM、Capto adhere ImpResTM、Nuvia aPrime 4A、Capto Core400TM和Capto Core 700TM中的至少一种，而多模态配体可以具体为Capto adhere，更具体地为N-苄基-N-甲基乙醇胺，但不限于此。
在一个实施方案中，本发明的多模态色谱中使用的多模态配体可以包括具有离子结合、氢键结合和疏水结合的多模态功能的材料。
在本发明的一个实施方案中，通过使5CV的平衡缓冲液以150cm/hr的流速流过柱子来平衡树脂。使用pH约为7的氨丁三醇和/或磷酸钠缓冲液作为平衡缓冲液。此后，注入获得的深度过滤回收溶液，并用5CV的平衡缓冲液清洗柱子。通过将7CV的洗脱缓冲液流过柱子来洗脱并回收目标蛋白。使用pH约为5的磷酸钠和/或醋酸钠缓冲液作为洗脱缓冲液(实施例5)。
本发明的纯化方法还可以包括阳离子交换色谱纯化步骤。
在一个实施方案中，本发明的纯化方法可以包括在多模态色谱纯化步骤之前、之后或与多模态色谱纯化步骤同时进行的阳离子交换色谱纯化步骤。具体地，本发明的纯化方法可以包括在多模态色谱纯化步骤之后的阳离子交换色谱纯化步骤，但不限于此。
本文所用的术语“离子交换色谱”是指利用介质与蛋白质表面间的净电荷的可逆相互作用，即离子键强度的差异进行的树脂交换。本发明所用的阳离子交换色谱是指使用填充有阳离子交换树脂的柱的离子色谱，并且从上述步骤开始，可以进行阳离子交换色谱以进一步去除杂质并选择性地分离具有所需等电点的异构体。
本发明的阳离子交换色谱可以包括平衡阶段、进样阶段、第一洗涤阶段、第二洗涤阶段和洗脱阶段。
在一个实施方案中，本发明的阳离子交换色谱各个阶段所用的缓冲液可以包括磷酸钠、醋酸钠、或它们的组合，但不限于此。
在一个实施方案中，本发明的阳离子交换色谱的平衡阶段可以包括使5至15CV、7至13CV、8至12CV、9至11CV或10CV的缓冲液以100至200cm/hr、110至190cm/hr、120至180cm/hr、130至170cm/hr、140至170cm/hr或160cm/hr的流速通过柱，但不限于此。
在一个实施方案中，本发明的阳离子交换色谱的平衡阶段可以在约pH 3-7、约pH4-6、特别是pH 5下进行，但不限于此。
在一个实施方案中，本发明的阳离子交换色谱的平衡阶段中使用的缓冲液可以具有约pH 3-7，约pH 4-6，并且具体地pH 5，但不限于此。
在一个实施方案中，在本发明的阳离子交换色谱的第一洗涤阶段中，1至10个柱体积(CV)、2至8CV、4至6CV或5CV的缓冲液可以通过柱，但不限于此。
在一个实施方案中，本发明的阳离子交换色谱的第二洗涤阶段可以用于去除目标蛋白相关物质中的强酸性级分，并且可以在约pH 3-7、约pH 4-6、约pH 5-6、特别是约pH5.9下通过将1至5CV、2至4CV或3CV的缓冲液通过柱来进行，但不限于此。
在一个实施方案中，在本发明的阳离子交换色谱的洗脱阶段，5至15CV、8至12CV或10CV的缓冲液可以通过柱子，但不限于此。
在一个实施方案中，本发明的阳离子交换色谱的洗脱阶段可以在约pH 3-8、pH 6-8、约pH 4-7、pH 5-7、pH 6-7，并且具体地约pH 6.5下进行，但不限于此。
在一个实施方案中，本发明的阳离子交换色谱的洗脱阶段中使用的缓冲液可以具有约pH 3-8、pH 6-8、约pH 4-7、pH 5-7、pH 6-7，并且具体地约pH 6.5，但不限于此。
在一个实施方案中，本发明的阳离子交换色谱的洗脱阶段可以采用盐梯度、pH梯度或它们的组合，具体地采用盐梯度。
在一个实施方案中，本发明的阳离子交换色谱的洗脱阶段可以以结合和洗脱模式进行。
在一个实施方案中，本发明的阳离子交换色谱的洗脱阶段可以不采用流通模式。
在本发明的一个实例中，通过使10CV的平衡缓冲液以160cm/hr的速度通过来平衡树脂。作为平衡缓冲液，可以使用pH约为5的缓冲液，并且优选地可以使用磷酸钠和/或醋酸钠缓冲液。注入由多模态色谱步骤获得的回收液，并用5CV的平衡缓冲液清洗色谱柱。为了去除目标蛋白相关物质中的强酸性级分，用3CV约pH 5.9的磷酸钠和/或醋酸钠缓冲液通过柱子进行洗涤。使用10CV约pH 6.5的磷酸钠和/或醋酸钠缓冲液作为洗脱缓冲液，从而回收目标蛋白(实施例6)。本发明人开发了一种在多模态色谱结合和洗脱模式后，使用阳离子交换树脂有效纯化等电点在pH 6-8范围内的融合蛋白的方法，以进一步去除残留的宿主细胞蛋白、内毒素、阿柏西普相关物质等。
本发明的阳离子交换色谱中使用的树脂的示例可以包括CM Sepharose FastFlow、Capto ImpRes SP、SOURCE 30S、SOURCE 15S、Eshmuno S、Eshmuno CPX、Eshmuno CP-FT、Eshmuno CPS、Fractogel EMD SO3-、Fractogel EMD SE、Capto MMC、Macro-Prep 25S、Macro-Prep CM、UNOsphere S、Macro-Prep High S、POROSTM XS、POROSTM 50HS、Nuvia SResin、Nuvia HR-S、Nuvia cPrim、Exhmuno CMXTM、Capto MMC ImpResTM、Nuvia cPrime、TOYOPEARL SP-650,TOYOPEARL GigaCap S-650、TOYOPEARL CM-650、TOYOPEARL GigaCapCM-650、TOYOPEARL Salfate-650、TOYOPEARL MegaCap II Sp-550和TOYOPEARL SP-550，但不限于此。优选地，本发明的阳离子交换色谱所采用的树脂可以为Capto STM、Capto ImpResSP和Eshmuno CPS中的至少一种，但不限于此。
在一个实施方案中，阳离子交换色谱的配体可以包括磺酸(-SO3)、磺丙基和羧甲基中的至少一种，并且具体地为磺酸。
本发明的阳离子交换色谱的阳离子交换树脂是指加入到另一种水溶液中以用其水溶液中的特定阳离子交换其自身的阳离子的合成树脂，并且阳离子交换柱可以在其自身的等电点以上吸附具有阳离子的蛋白质。
在一个实施方案中，阳离子交换色谱树脂的功能基团可以是选自以下的一种：甲基磺酸盐(S)、磺丙基(SP)、羧甲基(CM)、聚天冬氨酸、磺乙基(SE)和磺丙基(SP)、磷酸盐(P)和磺酸盐(S)。
在本发明的纯化方法中，可以不进行尺寸排阻色谱、疏水相互作用色谱和阴离子交换色谱，但不限于此。在本发明中，不进行尺寸排阻色谱、疏水相互作用色谱和阴离子交换色谱，是为了便于根据样品浓缩工艺和纯化规模进行放大，避免蛋白质结构中的疏水部分暴露于盐，并提高纯化水平。
即使在这种情况下，尺寸排阻色谱法、疏水相互作用色谱法和阴离子交换色谱法也可用于除了纯化具有IgG Fc结构域的融合蛋白之外的目的(例如，研究或验证融合蛋白的纯度)。
在一个实施方案中，本发明的纯化方法可以不使用阴离子交换色谱，其通常用于纯化具有IgG Fc结构域的抗体和融合蛋白。
本发明所述的阴离子交换色谱是指采用填充有阴离子交换树脂的柱进行的离子色谱。
本发明的具有IgG Fc结构域的融合蛋白的纯化方法还可以在各个步骤之前或之后包括过滤步骤，且该过滤步骤可以是深层过滤、超滤、渗滤中的任一种，但不限于此。所述过滤可以一次或多次进行。
本文所说的深层过滤，是指采用粒径大、均匀系数小的过滤剂，以在内部捕获已经透过滤层表面而未被滤掉的絮凝物的过滤。
本文中使用的术语“超滤”是指利用压力和膜将溶解或分散在液体中的物质根据颗粒大小或分子量进行分离的过程。
本文所用的术语“渗滤”是指利用透析技术从含有溶剂和两种或更多种分子大小不同的溶质的流体中仅去除部分溶质的过程。
根据本发明的另一个方面，提供了一种纯化具有IgG Fc结构域的融合蛋白的方法，所述方法包括：a)培养产生具有IgG Fc结构域的融合蛋白的细胞；b)从步骤a)中培养的细胞中回收蛋白质；c)通过初级色谱纯化步骤b)中回收的蛋白质；d)通过多模色谱和阳离子交换色谱纯化步骤c)中初级色谱纯化的蛋白质，其中不使用阴离子交换色谱。在步骤d)中，多模式色谱可以在阳离子交换色谱之前、之后或之前和之后的组合中进行。
通过用于纯化具有IgG Fc结构域的融合蛋白的方法最终纯化的具有IgG Fc结构域的融合蛋白，可具有98％或更高的尺寸排阻HPLC纯度、内毒素＜0.05EU/mg、或6.0-8.0的pI。
通过本发明的纯化方法，本发明人无需采用尺寸排阻色谱、疏水相互作用色谱、阴离子交换色谱等，仅通过简单的三步色谱纯化工艺便可生产出高纯度的融合蛋白。此外，可以有效地纯化等电点在pH 6-8范围内的IgG Fc结构域的融合蛋白，特别是阿柏西普。
具有IgG Fc结构域的融合蛋白、多模态色谱、阳离子交换色谱和阴离子交换色谱如其他实施方案所述。
在本发明中培养产生具有IgG Fc结构域的融合蛋白的细胞的步骤a)中，所述细胞可以为动物细胞，具体为仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)，但不限于此。
本文使用的术语“培养”是指在适当控制的环境条件下培养细胞。本申请的培养可以按照本领域已知的适当培养基或培养条件进行。本领域技术人员可以根据所选的细胞类型容易地控制这种培养。
在从本发明步骤a)中培养的细胞中回收蛋白质的步骤b)中，所述回收可以是根据本发明的培养方法，采用本领域已知的合适方法收集具有所需IgG Fc结构域的融合蛋白。例如，可以组合使用离心、过滤、深层过滤、提取、超滤、透析等，采用本领域已知的合适方法从培养基或细胞中回收具有所需IgG Fc结构域的融合蛋白。
在本发明中通过初级色谱纯化步骤b)中回收的蛋白质的步骤c)中，所述初级色谱可以为亲和色谱，具体为蛋白A亲和色谱，但不限于此。
本文使用的术语“亲和色谱”是指利用目标分子和配体之间的高特异性相互作用的色谱法。
本发明的亲和色谱可以包括平衡阶段、进样阶段、第一洗涤阶段、第二洗涤阶段和洗脱阶段。
在一个实施方案中，本发明的亲和色谱的各个阶段中使用的缓冲液可以含有：氨丁三醇、磷酸钠、醋酸钠、柠檬酸，但不限于此。
在一个实施方案中，本发明的亲和色谱的平衡阶段可以包括使2至8、4至6CV或5CV的缓冲液通过柱，但不限于此。
在一个实施方案中，本发明的亲和色谱的平衡阶段可以在约pH 6-8下进行，具体地在pH7下进行，但不限于此。
在一个实施方案中，本发明的亲和色谱的平衡阶段中使用的缓冲液可以具有约pH6-8，具体地pH 7，但不限于此。
在一个实施方案中，本发明的亲和色谱的平衡阶段中使用的缓冲液可以含有氨丁三醇、磷酸钠、或它们的组合，但不限于此。
在一个实施方案中，本发明的亲和色谱方法的第一洗涤阶段所用的缓冲液可以含有柠檬酸、醋酸或其组合，还可以包括L-精氨酸和/或尿素，但不限于此。
在一个实施方案中，本发明的亲和色谱的第一洗涤阶段可以在约pH 3-7、约pH 4-7、约pH 5-6.5、具体地约pH 5.9下进行，但不限于此。
在一个实施方案中，本发明的亲和色谱的第一洗涤阶段可以是将5至15CV、7至13CV、8至12CV、9至11CV或10CV的缓冲液在约pH 3-7、约pH 4-7、pH 5-6.5、具体地约pH 5.9下通过柱子，但不限于此。
在一个实施方案中，本发明的亲和色谱技术的第二洗涤阶段中使用的缓冲液可以含有柠檬酸、醋酸、或它们的组合，但不限于此。
在一个实施方案中，本发明的亲和色谱的第二洗涤阶段可以在约pH 3-7、约pH 4-6、pH5-6、具体地约pH 5.6下进行，但不限于此。
在一个实施方案中，本发明的亲和色谱的第二洗涤阶段可以是将1至7Cv或3至5CV的缓冲液在约pH 3-7，约pH 4-6，pH 5-6、具体地pH 5.6下通过柱子，但不限于此。
在一个实施方案中，本发明的亲和色谱的洗脱阶段可以在约pH 1-5、约pH 2-4、约pH 3-4、具体地约pH 3.5下进行，但不限于此。
在一个实施方案中，本发明的亲和色谱的洗脱阶段可以是将1至7Cv或3至5CV的缓冲液在约pH 1-5、约pH 2-4、约pH 3-4，具体地约为pH 3.5下通过柱子，但不限于此。
在一个实施方案中，本发明的亲和色谱技术的洗脱阶段所用的缓冲液可以含有柠檬酸、醋酸、或它们的组合，但不限于此。
在一个实施方案中，本发明的亲和色谱的洗脱阶段可以采用盐梯度、pH梯度或它们的组合，具体地采用pH梯度。
在一个实施方案中，本发明的亲和色谱的洗脱阶段可以以结合和洗脱模式进行。
在一个实施方案中，本发明的亲和色谱的洗脱阶段可以不采用流通模式。
例如，本发明的亲和色谱中可用的柱可以是MabSelect PrismA、MabSelect、MabSelect Xtra、MabSelect SuRe、MabSelect SuRe LX、MabSelect SuRe pcc或MabCaptureCTM。
例如，本发明的亲和色谱中使用的树脂可以是选自具有碱稳定的蛋白A衍生的配体的MabSelect SuRe树脂中的至少一种，但不限于此。
在本发明的一个实施方案中，将约5个柱体积(CV)的pH为6至8，优选约pH为7的氨丁三醇和/或磷酸钠缓冲液以保留时间为7.5分钟的流速通过柱，以达到树脂平衡。随后，将实施例1中获得的收获细胞培养液注入平衡后的柱中，用3CV的平衡缓冲液洗涤柱以去除吸附在树脂上的杂质。随后，依次以10CV的洗涤缓冲液1和3-5CV的洗涤缓冲液2通过柱，以进一步去除杂质。使用pH 5-6.5，优选约pH 5.9的柠檬酸和/或醋酸缓冲液作为洗涤缓冲液1，其中洗涤缓冲液1还可以含有L-精氨酸和/或尿素。使用pH约5.6的柠檬酸和/或醋酸缓冲液作为洗涤缓冲液2。然后，将5CV的pH约3.5的柠檬酸和/或醋酸缓冲液作为洗脱液通过柱，回收目标蛋白(实施例2)。
步骤d)中通过多模态色谱和阳离子交换色谱纯化步骤c)中初级色谱纯化的蛋白，如其他方面所述。
在一个实施方案中，步骤d)中通过多模态色谱纯化可以包括：(a)将经初级色谱纯化的蛋白质上样至用pH 6-8的缓冲液平衡的多模态色谱柱上；和(b)将pH低于步骤(a)中缓冲液的pH的缓冲液注入色谱柱中，在pH 4-6的条件下洗脱并收获纯化的蛋白质，但不限于此。
在步骤d)中，采用阳离子交换色谱纯化如其他方面所述。
在一个实施方案中，通过阳离子交换色谱纯化可以包括：(a)将通过前述色谱纯化的蛋白质上样到用pH 4-6的缓冲液平衡的阳离子交换色谱柱上；和(b)通过用pH高于步骤(a)中缓冲液的pH的缓冲液洗脱，收获pI为6.0-8.0的具有IgG Fc结构域的融合蛋白，但不限于此。
在一个实施方案中，在步骤(b)中，具有比步骤(a)中的缓冲液更高的pH的缓冲液可以为约pH 5-9，约pH 6-9，或pH 5-8，并且具体地为pH 6-8，但不限于此。
在一个实施方案中，在步骤c)和d)中的至少一个之前、之后、或之前和之后的组合中还另外进行深层过滤步骤、超滤步骤、透析过滤步骤和病毒灭活步骤中的至少一个，但不限于此。
在一个实施方案中，选自步骤c)的通过初级色谱的纯化和步骤d)的通过多模式色谱和阳离子交换色谱的纯化的至少一个步骤包括洗脱阶段，并且洗脱阶段可以使用盐梯度、pH梯度或其组合，具体地是pH梯度，但不限于此。
本发明的另一方面提供了一种含有具有IgG Fc结构域的融合蛋白的组合物，该组合物是通过本发明的纯化具有IgG Fc结构域的融合蛋白的方法纯化的。
具有IgG Fc结构域的融合蛋白、其纯化方法等如在其他方面中描述的。
本发明的组合物中可以含有峰1(Peak 1)级分。当通过对本发明的纯化方法纯化的具有IgG Fc结构域的融合蛋白进行疏水相互作用色谱分析时，峰1级分可通过在下述区段(section)洗脱而获得：流动相A含有50mM磷酸钠和2M氯化钠且pH为7.0，以及流动相B含有50mM磷酸钠和30％乙腈且pH为7.0，其中流动相B的比例为40-45％。
在一个实施方案中，含有具有IgG Fc结构域的融合蛋白的组合物可以包含5％或更少、或0.001％至5％含量的峰1级分，但不限于此。
在一个实施方案中，峰1级分可以包括SEQ ID NO:1至4中至少一个的氨基酸序列。
根据本发明的另一个方面，提供了通过上述纯化方法纯化的融合蛋白。
在一个实施方案中，融合蛋白可以是阿柏西普，但不限于此。
具体实施方式
在下文中，将结合实施例对本发明进行详细描述。然而，这些实施例仅为说明本发明的优选实施例，并非旨在限制本发明的权利范围。同时，本文未描述的技术事项对于本申请所属领域或类似技术领域的技术人员而言，能够充分理解并容易地实施。
实施例1培养液的收获及预处理
将含有编码具有IgG Fc结构域的融合蛋白作为目标蛋白的多核苷酸的载体导入中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，制备培养液。将含有编码作为融合蛋白代表例的阿柏西普的多核苷酸的载体导入CHO细胞，然后进行培养。
培养液中通常含有动物细胞等杂质，因此，在进行色谱之前，需要通过深层过滤去除包括动物细胞在内的杂质。通过这一过程，制备出收获细胞培养液(HCCF)。与通过滤料表面去除杂质和颗粒的表面过滤方式不同，采用深层过滤以通过纤维结构松散、孔隙率高的三维过滤器去除杂质和颗粒，可以提高处理速度和效率。
实施例2蛋白A亲和色谱纯化
为了从实施例1中预处理后得到的收获细胞培养液中直接捕获融合蛋白(通过CHO细胞培养得到的具有IgG Fc结构域的融合蛋白，特别是阿柏西普)，进行蛋白A亲和色谱。这是使用与抗体或含Fc融合蛋白的Fc结构域结合的亲和配体的纯化步骤，使用pH 3-5、优选pH 3-4、更优选pH 3.5左右的缓冲液，例如柠檬酸和/或醋酸缓冲液，洗脱并回收蛋白质。
为此，将约5个柱体积(CV)的pH 6-8、优选约pH 7的氨丁三醇和/或磷酸钠缓冲液以保留时间为7.5分钟的流速通过柱子，进行树脂平衡。随后，将实施例1中获得的收获细胞培养液注入平衡后的柱中，用3CV的平衡缓冲液洗涤柱以去除吸附在树脂上的杂质。然后，依次以10CV的洗涤缓冲液1和3-5CV的洗涤缓冲液2通过柱子以进一步去除杂质。使用pH 5-6.5、优选约pH 5.9的柠檬酸和/或醋酸缓冲液作为洗涤缓冲液1，其中洗涤缓冲液1还可以含有L-精氨酸和/或尿素。使用pH约5.6的柠檬酸和/或醋酸缓冲液作为洗涤缓冲液2。然后，将5CV的pH约3.5的柠檬酸和/或醋酸缓冲液作为洗脱液通过柱，回收目标蛋白。为了重复使用树脂，在回收目标蛋白后，依次用剥离缓冲液、0.1M氢氧化钠、平衡缓冲液和储存缓冲液进行洗涤，然后将树脂储存。
本实施例采用MabSelect SuRe树脂以结合和洗脱模式进行蛋白A色谱。
结果如图1所示，用蛋白A亲和色谱对收获细胞培养液进行了纯化。
实施例3病毒灭活及中和
将蛋白A亲和色谱纯化得到的浸出液滴定至pH 3.5±0.1并静置1-2小时，从而灭活潜在的病毒。灭活反应后的蛋白溶液在pH 5.5±0.1条件下中和，然后进行微滤，从而去除聚集体等杂质。
实施例4深层过滤
深层过滤是主要使用深层过滤器去除工艺过程中产生的杂质的步骤。
为此，将具有5倍过滤器截留体积的平衡缓冲液以156LMH(升/m2/h)的流速通过过滤器进行平衡。使用pH约为5.5的磷酸钠和/或醋酸钠缓冲液作为洗脱缓冲液。平衡后，将蛋白质溶液注入深层过滤器以回收滤液。
实施例5多模态色谱法
多模态色谱是去除工艺中产生的杂质、内毒素和潜在病毒的步骤。通过CHO细胞培养获得的具有IgG Fc结构域的融合蛋白，特别是阿柏西普，使用Capto Adhere树脂以结合和洗脱模式进行多模态色谱。
为此，将5Cv的平衡缓冲液以150cm/hr的流速通过柱子来平衡树脂。使用pH约为7的氨丁三醇和/或磷酸钠缓冲液作为平衡缓冲液。然后，注入实施例4中获得的深度过滤回收液，并用5CV的平衡缓冲液清洗柱子。通过将7CV的洗脱缓冲液流过柱子来洗脱并回收目标蛋白。使用pH约为5的磷酸钠和/或醋酸钠缓冲液作为洗脱缓冲液。为了重复使用树脂，在回收蛋白后，依次用剥离缓冲液、1M氢氧化钠、平衡缓冲液和储存缓冲液进行洗涤，然后将树脂储存。图2显示了纯化色谱图结果。
通过多模态色谱得到病毒对数减少结果，结果如实施例7中的表5所示，对潜在病毒获得的最大对数减少至少为6，表明病毒清除效果有效。
实施例6阳离子交换色谱
阳离子交换色谱是最终的纯化步骤，用于仅捕获具有等电点在特定范围内的IgGFc结构域的融合蛋白。
为此，以160cm/hr的速度通过10CV的平衡缓冲液进行树脂平衡。作为平衡缓冲液，使用pH约为5的缓冲液，优选使用磷酸钠和/或醋酸钠缓冲液。注入由多模态色谱步骤获得的回收液，并用5CV的平衡缓冲液清洗色谱柱。为了去除目标蛋白相关物质中的强酸性级分，用3CV约pH 5.9的磷酸钠和/或醋酸钠缓冲液通过柱子进行洗涤。使用10CV约pH 6.5的磷酸钠和/或醋酸钠缓冲液作为洗脱缓冲液，从而回收目标蛋白。蛋白质回收率最高达到最大峰的8％。为了重复使用树脂，在回收蛋白后，依次用剥离缓冲液、1M氢氧化钠、平衡缓冲液和储存缓冲液进行洗涤，然后将树脂储存。
同时，根据阳离子交换树脂色谱类型进行的实验以及相应的纯化条件如下表1所示。
表1
经过实施例5中的纯化步骤(即蛋白A亲和色谱和多模态色谱)后，将获取自CHO细胞培养物的具有IgG Fc结构域的融合蛋白(特别是阿柏西普)，采用Capto S树脂以结合和洗脱模式进行阳离子交换色谱，结果如图3所示。图4显示了图3中Capto S阳离子交换色谱纯化步骤中纯化和洗脱级分的等电聚焦分析结果。图4中，泳道1和2表示内参，泳道3、4、5、6、7和8表示按照Capto S浸出液的收集段的分析结果。可以看出，尽管收集区段增加，但观察到了相似的IEF图谱。
经过实施例5中的纯化步骤(即蛋白A亲和色谱和多模态色谱)后，将获取自CHO细胞培养物的具有IgG Fc结构域的融合蛋白(特别是阿柏西普)，采用SP-550C树脂以结合和洗脱模式进行阳离子交换色谱，结果如图5所示。图6显示了图5中SP-550C阳离子交换色谱纯化步骤中纯化和洗脱级分的等电聚焦分析结果。
图7显示了阳离子交换色谱得到的盐梯度洗脱色谱图，图8显示了阳离子交换色谱得到的盐梯度洗脱级分的等电聚焦分析结果。在盐梯度洗脱中，由于异构体的清除，目标蛋白的产量降低。
实施例7多模态色谱与阳离子交换色谱纯化效果评估
为了评估多模态色谱与阴离子交换色谱的纯化效果，对Capto adhere多模态色谱和Capto Q阴离子色谱的结果进行了比较。为了进行Capto adhere多模态色谱和Capto Q阴离子色谱，分别进行AC、深层过滤01、深层过滤02、HIC、UF/DF和深层过滤03，然后分装样品，并分别进行Capto adhere多模态色谱和Capto Q阴离子色谱。
将相同的含有IgG Fc结构域的融合蛋白样品(特别是阿柏西普；实施例1至4中获得的样品)分别通过Capto Q色谱和Capto adhere色谱进行纯化，并对所得洗脱样品的残留宿主细胞蛋白(HCP，一种杂质)进行分析，以比较各个样品中残留HCP的量。Capto Q阴离子交换色谱和Capto adhere多模态色谱按以下方式进行。
AC色谱
深层过滤01
深层过滤02
疏水相互作用色谱，HIC
UF/DF
CaptoQ阴离子交换色谱
Capto Q阴离子交换色谱采用流通模式进行，缓冲液为Buffer A(Q)(50mM磷酸钠，pH7.0)和Buffer B(Q)(50mM磷酸钠，1M氯化钠，pH 7.0)。结果如图9所示。
Captoadhere多模态色谱
在上样相同样品同时使用缓冲液A(Ad(50mM磷酸钠，pH 7.0)、缓冲液B(Ad)(50mM磷酸钠，pH 5.0)和缓冲液C(Ad)(20mM磷酸钠，150mM氯化钠，pH 2.0)作为缓冲液的条件下，Capto adhere多模态色谱以结合和洗脱模式进行。结果如图10所示。
通过使用CHO宿主细胞蛋白免疫酶联法测定试剂盒(Immunoenzymetric Assayfor the Measurement of CHO Host Cell Protein kit)(GYGNUS，F550)对Capto Q色谱和Capto adhere色谱洗脱的各样品的宿主细胞蛋白(HCP)残留进行分析，分析结果如图11所示。下表2显示了疏水相互作用色谱(HIC)和阴离子交换色谱(AEX)等各纯化步骤中得到的残留HCP结果值。下表3显示了多模态色谱等各纯化步骤中得到的残留HCP结果值。HCP结果值的测定采用美国Cygnus公司的产品，通过该产品以ELISA方式检测CHO细胞中的HCP。
表2
纯化步骤 HCP(ppm)
AC 9471
深层过滤1 320.9
深层过滤2 44.6
HIC 21.5
AEX 6.7
制剂 3.2
＊AC:蛋白A色谱、HIC：疏水相互作用色谱、AEX：阴离子交换色谱
表3
纯化步骤 HCP(ppm)
AC 2420.6
深层过滤 6.579
UF 6.542
MMC 5.319
DS ＜LOQ
＊AC:蛋白A色谱，Depth filtration：深层过滤，UF：超滤，MMC：多模态色谱，AEX：阴离子交换色谱，DS：药物物质(纯化原液)，LOQ：定量限
如上表2和表3所示，表2中的方法(采用阴离子交换色谱法)需要两次深层过滤以降低HCP，而表3中的方法(采用多模态色谱法)仅需一次深层过滤即可降低HCP。
下表4显示了各纯化步骤中HCP、HCD、蛋白A浸出液和内毒素的含量。下表5显示了残留病毒的量。
HCP测量采用美国Cygnus公司产品，通过该产品以ELISA方式检测CHO细胞中的蛋白质；HCD测量采用Applied Biosystems公司产品，通过该产品以实时-聚合酶链式反应(RT-PCR)方式检测CHO细胞中的DNA。蛋白A浸出液测定采用Repligen公司产品，以ELISA方式检测树脂配体蛋白A的渗出量；内毒素含量测定采用Charles River公司产品，按照美国药典规定的方法检测内毒素含量。
LRV是通过注入预定量的病毒来测量各工序后病毒的残留量，以验证各工序是否能够去除病毒，并使用已知方法。
在表5中，低pH处理对应于实施例3中的方法；Capto Adhere对应于实施例5中的方法；病毒过滤对应于实施例6之后进行的方法。
表4
*HCCF：收获的细胞培养液，PA：蛋白A色谱，Depth filtration：深层过滤，UF：超滤，MMC：多模态色谱，CEX：阳离子交换色谱，UF/DF：超滤/渗滤，HCP：宿主细胞蛋白，HCD：宿主细胞DNA，Protein Aleachate：蛋白A浸出液，Endotoxin：内毒素
表5
*LRV：对数减少值，最小LRV：最小光反射值，MVM：小鼠微小病毒，MuLV：鼠白血病病毒，Reo-3：呼肠孤样病毒3型，PrV：伪狂犬病毒
实施例8纯化的阿柏西普的氧化/脱酰胺/脱水分析
对采用本发明方法纯化的阿柏西普样品(阿柏西普1)和市售阿柏西普样品(阿柏西普2)进行氧化、脱酰胺、脱水分析。
实施例1至6得到的纯化的阿柏西普样品(1mg)与10μl的1M二硫苏糖醇混合，并配制1ml变性缓冲液(7M盐酸胍，0.25M Tris-HCl，pH 8.4)。然后，通过在37℃下孵育1小时来还原蛋白质样品。此后，将10μl的1M碘乙酰胺加入到还原溶液中，反应1小时，使溶液烷基化。通过使用离心过滤管将缓冲液替换为50mM Tris-HCl(pH 7.8)，并将50μl如此制备的样品和2μl 1mg/mL胰蛋白酶混合，然后在37℃下反应18小时，从而将蛋白质分解成肽。将每个样本所得肽样品分别采用反相超高效色谱(RP-UPLC，ThermoFisher，美国)和在线电喷雾电离质谱吸收(Q-TOF，ThermoFisher，美国)进行LC-MS分析和LC-MS/MS分析，并使用Byonic软件(Protein Metrics，美国)对结果进行分析。
根据氧化氨基酸类型得到氧化分析结果，且甲硫氨酸残基(第10、163、192和237位氨基酸)的氧化分析结果如图12所示，以及组氨酸残基(第19、209和253位氨基酸)的氧化分析结果如图13所示。脱酰胺及脱水分析结果分别如图14及图15所示(第84、91、99、152、180、261、271、300、346、369、374和375位氨基酸；以及第2、47、52、102、173、179、234、250、255、279、341、384、386和398位氨基酸)。
如图12和13所示，氧化主要发生在甲硫氨酸残基中，并且在一些组氨酸残基中观察到，但在色氨酸残基中未观察到。
在甲硫氨酸#10(M10)、甲硫氨酸#163(M163)、甲硫氨酸#192(M192)和甲硫氨酸#237(M237)这四个氨基酸残基上观察到甲硫氨酸氧化位点。氧化程度均为10％或更低，经本发明方法纯化的样品(阿柏西普1)和市售样品(阿柏西普2)也得到类似结果。
在组氨酸#19(H19)、组氨酸#209(H209)、组氨酸#253(H253)这三个氨基酸残基上观察到组氨酸氧化位点。氧化程度均为0.5％或更低，经本发明方法纯化的样品(阿柏西普1)和市售样品(阿柏西普2)也得到类似结果。
如图14所示，在一些天冬酰胺和谷氨酰胺残基上观察到脱酰胺作用。在天冬酰胺#84(N84)、天冬酰胺#91(N91)、天冬酰胺#99(N99)、天冬酰胺#152(N152)、谷氨酰胺#180(Q180)、天冬酰胺#261/#271(N261/N271)、天冬酰胺#300(N300)、天冬酰胺#346(N346)和天冬酰胺#369/#374/#753(N369/N374/N753)这九个氨基酸残基上观察到脱酰胺位点。对于N261/N271和N369/N374/N753，在所示位置的任意一个天冬酰胺残基上证实脱酰胺作用，但未进行鉴定具体残基的分析。除N84的脱酰胺作用程度为12.8％和11.4％外，其他脱酰胺作用程度均为10％或更低。通过本发明方法纯化的样品(阿柏西普1)和市售样品(阿柏西普2)也得到了类似的结果。
如图15所示，在一些天冬氨酸残基中观察到脱水现象。脱水位点出现在包括天冬氨酸#2(D2)、天冬氨酸#39(D39)、天冬氨酸#47/#52(D47/D52)、天冬氨酸#102(D102)、天冬氨酸#173(D173)、天冬氨酸#179(D179)、天冬氨酸#234(D234)、天冬氨酸#250/#255(D250/D255)、天冬氨酸#297(D297)、天冬氨酸#341(D341)、天冬氨酸#384/#386(D384/386)的11个氨基酸残基上。脱水程度均为10％或更低，经本发明方法纯化的样品(阿柏西普1)和市售样品(阿柏西普2)也得到类似结果。
上述结果说明本发明的纯化方法可以有效的纯化阿柏西普，因为经过本发明的方法纯化的样品(阿柏西普1)和市售样品(阿柏西普2)都表现出相似的趋势。
实施例9纯化的阿柏西普及其各级分的疏水相互作用色谱分析
采用疏水相互作用色谱法对经本发明方法纯化的样品(阿柏西普1)和市售样品(阿柏西普2)进行分析。流动相A的组成为50mM磷酸钠和2M氯化钠且pH为7.0，流动相B的组成为50mM磷酸钠和30％乙腈且pH为7.0。分析柱为Phenyl-5PW(TOSOH，货号0007573)，分析条件为：洗脱时间为15分钟，流动相B比例由0％增加至90％，柱温为30℃，流速为1mL/min。本次分析采用经本发明方法纯化的阿柏西普样品(阿柏西普1)和市售阿柏西普样品(阿柏西普2)。按照表6所示的纯化的阿柏西普的各疏水相互作用色谱级分的比例，两个阿柏西普样品获得了相似的结果。峰1在流动相B为40～45％的区段洗脱，峰2在流动相B为50～55％的区段洗脱，峰3在流动相B为70～80％的区段洗脱。
表6
阿柏西普1 阿柏西普2
1 0.88％ 1.76％
2 91.86％ 90.58％
3 7.26％ 7.66％
使用LC-MS对HI-HPLC分析中观察到的峰1和峰2级分的蛋白质进行还原和去糖基化形式的完整质量分析。对峰1级分进行完整质量分析后，分析出了具有下表7所示的纯化阿柏西普的疏水相互作用色谱峰1级分的肽片段分析结果中所示的氨基酸序列的蛋白质片段。其中，202-431肽被分析为主要形式(峰1-d)，推测是VEGFR1结构域2和VEGFR2结构域3大部分缺失的形式。峰2级分被细分为峰2-1、峰2-2和峰2-3，各级分之间的完整质量分析结果没有观察到差异。
表7
将HI-HPLC分析中观察到的峰1和峰2级分的蛋白质用LC-MS进行翻译后修饰分析。下表8所示的纯化的阿柏西普疏水相互作用色谱馏分的脱酰胺分析结果表明，峰1级分和峰2级分中天冬酰胺残基的脱酰胺作用相似，没有差异。
表8
表9所示纯化的阿柏西普的疏水相互作用色谱级分的甲硫氨酸氧化分析结果证实，峰1级分蛋白质中甲硫氨酸残基的氧化程度约为峰2级分蛋白质的氧化程度的2-3倍。T1肽的M10/M20和T28肽的M237均被逐渐氧化。
表9
峰1 峰2-1 峰2-2 峰2-3
M10/M20 7％ 4％ 2％ 2％
M237 10％ 6％ 3％ 3％
实施例10纯化的阿柏西普的疏水相互作用色谱和各级分的抗VEGF生物测定
为了评估HI-HPLC测定中观察到的峰1和峰2级分的蛋白质活性，进行了Pathhunter抗VEGF生物测定(Eurofins Discoverx，美国)。将对VEGF有反应的PathHunter细胞与纯化的阿柏西普的每个疏水相互作用色谱级分在培养液中混合，通过与参比进行比较研究对VEGF结合的影响来测量每个级分的活性。
对于峰1组分，分析相对滴度为6.6％，表明由于VEGFR结构域的缺失导致活性降低；对于峰2组分，分析相对滴度保持不变，表明活性未降低。
虽然本发明已参照特定说明性实施方案进行了描述，但本发明所属领域的技术人员可以理解，本发明可以以其他具体形式实施，而不会背离其技术精神或基本特征。因此，上述实施例应被理解为示例，而不是限制本发明。本发明的范围应被理解为所附权利要求的含义和范围，而不是详细描述，并且从等效概念得出的所有改变或变化均属于本发明的范围。

Claims (25)

1.一种纯化具有IgG Fc结构域的融合蛋白的方法，其中对含有具有IgG Fc结构域的融合蛋白的原料进行多模态色谱纯化步骤，以获得内毒素＜0.05EU/mg或尺寸排阻HPLC纯度为98％或更高的具有IgG Fc结构域的融合蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法，其中添加了阳离子交换色谱纯化步骤。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中不进行尺寸排阻色谱、疏水相互作用色谱和阴离子交换树脂色谱。
4.根据权利要求1所述的方法，其中多模态色谱的配体包括具有离子结合、氢键结合和疏水结合的多模态功能的物质。
5.根据权利要求2所述的方法，其中阳离子交换色谱的配体包括磺酸(-SO3)、磺丙基和羧甲基中的至少一种。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其中在色谱纯化步骤中，采用pH梯度进行洗脱。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其中色谱包括洗脱阶段，并且洗脱阶段以结合和洗脱模式进行。
8.根据权利要求1或2所述的方法，其中具有IgG Fc结构域的融合蛋白是血管内皮细胞生长因子拮抗剂。
9.根据权利要求1或2所述的方法，其中具有IgG Fc结构域的融合蛋白是阿柏西普。
10.一种纯化具有IgG Fc结构域的融合蛋白的方法，所述方法包括：
a)培养产生具有IgG Fc结构域的融合蛋白的细胞；
b)从步骤a)中培养的细胞中回收蛋白质；
c)通过初级色谱纯化步骤b)中回收的蛋白质；
d)通过多模态色谱和阳离子交换色谱纯化步骤c)中初级色谱纯化的蛋白质，
其中不使用阴离子交换色谱。
11.根据权利要求10所述的方法，其中通过所述方法最终纯化的具有IgG Fc结构域的融合蛋白的的尺寸排阻HPLC纯度为98％或更高，内毒素＜0.05EU/mg，或pI范围为6.0-8.0。
12.根据权利要求10所述的方法，其中具有IgG Fc结构域的融合蛋白是血管内皮细胞生长因子拮抗剂。
13.根据权利要求10所述的方法，其中具有IgG Fc结构域的融合蛋白是阿柏西普。
14.根据权利要求10所述的方法，其中步骤d)中通过多模态色谱纯化包括：
(a)将经初级色谱纯化的蛋白质上样到用pH范围为6-8的缓冲液平衡的多模态色谱柱上；和
(b)将pH低于步骤(a)中缓冲液的pH的缓冲液注入色谱柱中，以在pH范围为4-6的条件下洗脱并收获纯化的蛋白质。
15.根据权利要求10所述的方法，其中多模态色谱的配体包括具有离子结合、氢键结合和疏水结合的多模态功能的物质。
16.根据权利要求10所述的方法，其中步骤d)中通过阳离子交换色谱纯化包括：
(a)将经前述色谱纯化的蛋白质上样到用pH范围为4-6的缓冲液平衡的阳离子交换色谱柱上；和
(b)通过用pH高于步骤(a)中缓冲液的pH的缓冲液洗脱，收获pI范围为6.0-8.0的具有IgG Fc结构域的融合蛋白。
17.根据权利要求16所述的方法，其中在步骤(b)中，pH高于步骤(a)中缓冲液pH的缓冲液的pH范围为5-8。
18.根据权利要求10所述的方法，其中阳离子交换色谱的配体包括磺酸(-SO3)、磺丙基和羧甲基中的至少一种。
19.根据权利要求10所述的方法，其中多模态色谱和阳离子交换色谱中的至少一个包括洗脱阶段，并且洗脱阶段以结合和洗脱模式进行。
20.根据权利要求10所述的方法，其中不进行尺寸排阻色谱和疏水相互作用色谱。
21.根据权利要求10所述的方法，其中在步骤c)和d)中的至少一个之前、之后、或之前和之后的组合，还另外进行深层过滤步骤、超滤步骤、透析过滤步骤和病毒灭活步骤中的至少一个。
22.根据权利要求10所述的方法，其中选自c)通过初级色谱纯化和d)通过多模态色谱和阳离子交换色谱纯化的至少一个步骤包括洗脱阶段，并且所述洗脱阶段采用pH梯度。
23.一种组合物，其包含通过权利要求1或10的方法纯化的具有IgG Fc结构域的融合蛋白。
24.根据权利要求23所述的组合物，其中在进行疏水相互作用色谱法分析时，所述组合物包含在下述区段洗脱而获得的峰1级分：流动相A含有50mM磷酸钠、2M氯化钠且pH为7.0，以及流动相B含有50mM磷酸钠、30％乙腈且pH为7.0，其中流动相B的比例为40-45％。
25.根据权利要求24所述的组合物，其中所述组合物包含5％或更少的峰1级分。
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