CN118043344A - Y染色体连锁抗原在低免疫原性细胞中表达的改变 - Google Patents

Y染色体连锁抗原在低免疫原性细胞中表达的改变 Download PDF

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CN118043344A
CN118043344A CN202280061779.0A CN202280061779A CN118043344A CN 118043344 A CN118043344 A CN 118043344A CN 202280061779 A CN202280061779 A CN 202280061779A CN 118043344 A CN118043344 A CN 118043344A
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S·施雷普费尔
E·雷拜尔
D·高曼
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Abstract

本文公开了工程化细胞和/或低免疫原性细胞，其包括工程化细胞和/或低免疫原性干细胞、从其分化的工程化细胞和/或低免疫原性细胞以及工程化细胞和/或低免疫原性CAR‑T细胞(原代或从工程化和/或低免疫原性干细胞分化)，以及它们的使用和生成的相关方法，所述工程化细胞和/或低免疫原性细胞包含降低的一种或多种Y染色体基因的表达和降低的MHC I和/或MHC II人白细胞抗原分子的表达以及CD47的过表达。本文提供了细胞，其进一步表现出降低的T细胞受体的表达。

Description

Y染色体连锁抗原在低免疫原性细胞中表达的改变
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年7月14日提交的美国临时申请号63/221,887和2021年10月14日提交的美国临时申请号63/255,914的优先权，每个临时申请的公开内容整体并入本文。
背景技术
现成的CAR-T细胞和其他治疗细胞可以提供优于基于自体细胞的策略的优势，包括易于制造、质量控制以及避免恶性污染和T细胞功能障碍。然而，针对组织不相容性T细胞的强烈宿主抗移植物免疫反应阻止同种异体CAR-T细胞的扩增和持续存在，并降低这种途径的功效。
在动物模型和人类患者中都有大量证据表明，低免疫原性细胞移植是一种科学可行并且临床上有前途的治疗多种病症、病状和疾病的途径。
仍然需要用于产生避免被受体免疫系统检测的基于细胞的疗法的新途径、组合物和方法。
发明内容
在一些实施方案中，本文提供了一种工程化细胞，其包含相对于未改变或未修饰的野生型或对照细胞降低的一种或多种Y染色体基因以及主要组织相容性复合物(MHC)I类和/或II类人白细胞抗原分子的表达和编码CD47的第一外源多核苷酸，其中所述工程化细胞由原代T细胞或其后代繁殖，或来源于诱导性多能干细胞(iPSC)或其后代。
在一些实施方案中，本文提供了一种低免疫原性T细胞，其包含相对于未改变或未修饰的野生型或对照细胞降低的一种或多种Y染色体基因以及MHC I类和/或II类人白细胞抗原分子的表达和编码CD47的第一外源多核苷酸，其中所述低免疫原性T细胞由原代T细胞或其后代繁殖，或来源于iPSC或其后代。
在一些实施方案中，本文提供了一种非活化T细胞，其包含相对于未改变或未修饰的野生型或对照细胞降低的一种或多种Y染色体基因以及MHC I类和/或II类人白细胞抗原分子的表达和编码CD47的第一外源多核苷酸，其中所述非活化T细胞由原代T细胞或其后代繁殖，或来源于iPSC或其后代。
在一些实施方案中，本文提供了一种胰岛细胞，其包含相对于未改变或未修饰的野生型或对照细胞降低的一种或多种Y染色体基因以及MHC I类和/或II类人白细胞抗原分子的表达和编码CD47的第一外源多核苷酸，其中所述胰岛细胞来源于iPSC或其后代。
在一些实施方案中，本文提供了一种心肌细胞，其包含相对于未改变或未修饰的野生型或对照细胞降低的一种或多种Y染色体基因以及MHC I类和/或II类人白细胞抗原分子的表达和编码CD47的第一外源多核苷酸，其中所述心肌细胞来源于iPSC或其后代。
在一些实施方案中，本文提供了一种神经胶质祖细胞，其包含相对于未改变或未修饰的野生型或对照细胞降低的一种或多种Y染色体基因以及MHC I类和/或II类人白细胞抗原分子的表达和编码CD47的第一外源多核苷酸，其中所述心肌细胞来源于iPSC或其后代。
在一些实施方案中，本文提供了一种NK细胞，其包含相对于未改变或未修饰的野生型或对照细胞降低的一种或多种Y染色体基因以及MHC I类和/或II类人白细胞抗原分子的表达和编码CD47的第一外源多核苷酸，其中所述心肌细胞来源于iPSC或其后代。
在一些实施方案中，Y染色体基因是Y染色体连锁抗原或与Y染色体相关的次要组织相容性抗原。
在一些实施方案中，一种或多种Y染色体连锁抗原是Y-连锁原钙粘蛋白11和/或Y-连锁神经连接蛋白4。
在一些实施方案中，细胞具有降低的Y-连锁原钙粘蛋白11的表达。
在一些实施方案中，细胞具有降低的Y-连锁神经连接蛋白4的表达。
在一些实施方案中，细胞具有降低的Y-连锁原钙粘蛋白11的表达和降低的Y-连锁神经连接蛋白4的表达。
在一些实施方案中，细胞被基因工程化以具有降低的Y-连锁原钙粘蛋白11和/或Y-连锁神经连接蛋白4的表达。
在一些实施方案中，细胞不表达Y-连锁原钙粘蛋白11。
在一些实施方案中，细胞不表达Y-连锁神经连接蛋白4。
在一些实施方案中，细胞不表达Y-连锁原钙粘蛋白11并且不表达Y-连锁神经连接蛋白4。
在一些实施方案中，细胞被基因工程化以不表达Y-连锁原钙粘蛋白11和/或Y-连锁神经连接蛋白4。
在一些实施方案中，Y-连锁原钙粘蛋白11和/或Y-连锁神经连接蛋白4的表达降低分别由PCDH11Y和/或NLGN4Y基因的敲除引起。
在一些实施方案中，细胞来源于人细胞或动物细胞。
在一些实施方案中，人细胞或动物细胞来自不具有Y染色体的供体受试者。
在一些实施方案中，人细胞或动物细胞来自具有Y染色体的供体受试者，并且细胞被基因工程化以具有降低的Y-连锁原钙粘蛋白11和/或Y-连锁神经连接蛋白4的表达。
在一些实施方案中，细胞被基因工程化以不表达Y-连锁原钙粘蛋白11。
在一些实施方案中，细胞被基因工程化以不表达Y-连锁神经连接蛋白4。
在一些实施方案中，细胞被基因工程化以不表达Y-连锁原钙粘蛋白11且不表达Y-连锁神经连接蛋白4。
在一些实施方案中，细胞繁殖自或来源于从一名或多名不同于患者的供体受试者分离的细胞池，并且一名或多名供体受试者任选地包括一名或多名具有Y染色体的受试者；一名或多名不具有Y染色体的受试者；或具有Y染色体的受试者和不具有Y染色体的受试者的混合体。
在一些实施方案中，使用CRISPR/Cas基因编辑基因工程化细胞以具有降低的Y-连锁原钙粘蛋白11和/或Y-连锁神经连接蛋白4的表达。
在一些实施方案中，使用包含表2至表5的任何序列的一种或多种指导RNA进行CRISPR/Cas基因编辑。
在一些实施方案中，使用选自由Cas9、Cas12a和Cas12b组成的组的Cas效应蛋白进行CRISPR/Cas基因编辑。
在一些实施方案中，使用选自由以下组成的组的Cas效应蛋白进行CRISPR/Cas基因编辑：(a)任选地选自由Cas3、Cas8a、Cas5、Cas8b、Cas8c、Cas10d、Cse1、Cse2、Csy1、Csy2、Csy3和GSU0054组成的组；(b)任选地选自由Cas9、Csn2和Cas4组成的组；(c)任选地选自由Cas10、Csm2、Cmr5、Cas10、Csx11和Csx10组成的组；(d)任选地Csf1；(e)任选地选自由Cas12a、Cas12b、Cas12c、C2c4、C2c8、C2c5、C2c10、C2c9、CasX(Cas12e)和CasY(Cas12d)组成的组；以及(f)任选地选自由Cas13、Cas13a、C2c2、Cas13b、Cas13c和Cas13d组成的组。
在一些实施方案中，CRISPR/Cas基因编辑是从供体受试者离体进行的。
在一些实施方案中，CRISPR/Cas基因编辑是使用慢病毒载体进行的。
在一些实施方案中，细胞包含相对于未改变或未修饰的野生型或对照细胞降低的β-2-微球蛋白(B2M)和/或MHC II类反式活化因子(CIITA)的表达。
在一些实施方案中，细胞不表达B2M和/或CIITA。
在一些实施方案中，细胞包含降低的RHD的表达。
在一些实施方案中，细胞不表达RHD。
在一些实施方案中，细胞是来源于诱导性多能干细胞或其后代的分化细胞。
在一些实施方案中，分化细胞选自由以下组成的组：T细胞、NK细胞、内皮细胞、胰岛细胞、心肌细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、肝细胞、神经胶质祖细胞、多巴胺能神经元、视网膜色素上皮细胞和甲状腺细胞。
在一些实施方案中，细胞是原代免疫细胞或其后代。
在一些实施方案中，原代免疫细胞或其后代是T细胞或NK细胞。
在一些实施方案中，细胞包含降低的TCR-α和/或TCR-β的表达。
在一些实施方案中，细胞不表达TCR-α和/或TCR-β。
在一些实施方案中，细胞还包含编码一种或多种嵌合抗原受体(CAR)的第二外源多核苷酸，并且一种或多种CAR包含对CD19、CD20、CD22或BCMA具有特异性的胞外配体结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和胞内信号传导结构域。
在一些实施方案中，一种或多种CAR包含CD8α铰链结构域、CD28铰链结构域或IgG4铰链结构域。
在一些实施方案中，一种或多种CAR包含具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CD8α铰链结构域。
在一些实施方案中，一种或多种CAR包含具有SEQ ID NO:10或113的氨基酸序列的CD28铰链结构域。
在一些实施方案中，一种或多种CAR包含具有SEQ ID NO:11或12的氨基酸序列的IgG4铰链结构域。
在一些实施方案中，一种或多种CAR包含CD8α跨膜结构域或CD28跨膜结构域。
在一些实施方案中，一种或多种CAR包含具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CD8α跨膜结构域。
在一些实施方案中，一种或多种CAR包含具有SEQ ID NO:15或114的氨基酸序列的CD28跨膜结构域。
在一些实施方案中，一种或多种CAR包含4-1BB共刺激结构域、CD28共刺激结构域或CD3ζ信号传导结构域。
在一些实施方案中，一种或多种CAR包含具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的4-1BB共刺激结构域。
在一些实施方案中，一种或多种CAR包含具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CD28共刺激结构域。
在一些实施方案中，一种或多种CAR包含具有SEQ ID NO:18或115的氨基酸序列的CD3ζ信号传导结构域。
在一些实施方案中，一种或多种CAR包含胞外配体结合结构域，所述胞外配体结合结构域包含SEQ ID NO:19、37、45、54、63、72、81或118中任一个的scFv序列，或CAR具有包含SEQ ID NO:20、25、38、42、46、50、64、68、73、77、119或123中任一个的重链和轻链序列的scFv序列。
在一些实施方案中，一种或多种CAR具有SEQ ID NO:32、34、36、117或128中任一个的序列。
在一些实施方案中，一种或多种CAR包含SEQ ID NO:117中列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO:117中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列，所述一种或多种CAR具有以下组分：CD8α信号肽、FMC63 scFv(VL-Whitlow接头-VH)、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域。
在一些实施方案中，一种或多种CAR包含SEQ ID NO:45中列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO:45中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，将第一和/或第二外源多核苷酸中的一个或多个插入到细胞的至少一个等位基因的第一和/或第二特定基因座中。
在一些实施方案中，第一和/或第二特定基因座选自由以下组成的组：安全港或靶标基因座、RHD基因座、B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座和TRB基因座。
在一些实施方案中，安全港或靶标基因座选自由以下组成的组：CCR5基因座、CXCR4基因座、PPP1R12C基因座、ALB基因座、SHS231基因座、CLYBL基因座、Rosa基因座、F3(CD142)基因座、MICA基因座、MICB基因座、LRP1(CD91)基因座、HMGB1基因座、ABO基因座、FUT1基因座和KDM5D基因座。
在一些实施方案中，使用基因疗法载体或选自由转座酶、PiggyBac转座子、睡美人(SB11)转座子、Mos1转座子和Tol2转座子组成的组的转座酶系统将第一和/或第二外源多核苷酸引入细胞中。
在一些实施方案中，基因疗法载体是逆转录病毒或融合体(fusosome)。
在一些实施方案中，逆转录病毒是慢病毒载体。
在一些实施方案中，使用CRISPR/Cas基因编辑将第一和/或第二外源多核苷酸引入细胞中。
在一些实施方案中，使用选自由Cas9、Cas12a和Cas12b组成的组的Cas效应蛋白进行CRISPR/Cas基因编辑。
在一些实施方案中，使用选自由以下组成的组的Cas效应蛋白进行CRISPR/Cas基因编辑：(a)任选地选自由Cas3、Cas8a、Cas5、Cas8b、Cas8c、Cas10d、Cse1、Cse2、Csy1、Csy2、Csy3和GSU0054组成的组；(b)任选地选自由Cas9、Csn2和Cas4组成的组；(c)任选地选自由Cas10、Csm2、Cmr5、Cas10、Csx11和Csx10组成的组；(d)任选地Csf1；(e)任选地选自由Cas12a、Cas12b、Cas12c、C2c4、C2c8、C2c5、C2c10、C2c9、CasX(Cas12e)和CasY(Cas12d)组成的组；以及(f)任选地选自由Cas13、Cas13a、C2c2、Cas13b、Cas13c和Cas13d组成的组。
在一些实施方案中，CRISPR/Cas基因编辑是从供体受试者离体进行的。
在一些实施方案中，CRISPR/Cas基因编辑是使用慢病毒载体进行的。
在一些实施方案中，细胞或其后代在施用于患者后逃避NK细胞介导的细胞毒性。
在一些实施方案中，细胞或其后代在施用于患者后受到保护而免于成熟NK细胞的细胞裂解。
在一些实施方案中，细胞或其后代在施用于患者后逃避巨噬细胞吞噬。
在一些实施方案中，细胞或其后代在施用于患者后不会诱导针对所述细胞的免疫反应。
在一些实施方案中，细胞或其后代在施用于患者后不会诱导针对所述细胞的基于抗体的免疫反应。
在一些实施方案中，野生型细胞或对照细胞是起始材料。
在一些实施方案中，本文提供了一种药物组合物，其包含本文所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞、胰岛细胞、心肌细胞、神经胶质祖细胞或NK细胞群和药学上可接受的添加剂、载剂、稀释剂或赋形剂。
在一些实施方案中，组合物包含选自由低免疫原性T细胞群、非活化T细胞群、低免疫原性CD19 CAR T细胞群和低免疫原性CD22CAR T细胞群组成的组的一个或多个细胞群，以及药学上可接受的添加剂、载剂、稀释剂或赋形剂。
在一些实施方案中，本文提供了一种治疗患有将受益于基于细胞的疗法的疾病或病状的患者的方法，所述方法包括向患者施用本文所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞、胰岛细胞、心肌细胞、神经胶质祖细胞或NK细胞群。
在一些实施方案中，患者不具有Y染色体。
在一些实施方案中，患者对Y染色体基因不敏感。
在一些实施方案中，患者对Y染色体基因敏感。
在一些实施方案中，患者先前接受了来源于具有Y染色体的供体受试者的细胞疗法或以其他方式表达一种或多种Y染色体基因的细胞疗法。
在一些实施方案中，患者是先前怀过男性孩子的女性患者。
在一些实施方案中，本文提供了一种治疗有需要的患者的癌症的方法，所述方法包括向患者施用本文公开的原代免疫细胞群。
在一些实施方案中，原代免疫细胞选自由T细胞和NK细胞组成的组。
在一些实施方案中，患者不具有Y染色体。
在一些实施方案中，患者对Y染色体基因不敏感。
在一些实施方案中，患者对Y染色体基因敏感。
在一些实施方案中，患者先前接受了来源于具有Y染色体的供体受试者的细胞疗法或以其他方式表达一种或多种Y染色体基因的细胞疗法。
在一些实施方案中，患者是先前怀过男性孩子的女性患者。
在一些实施方案中，本文提供了一种确定施用于患有将受益于基于细胞的疗法的疾病或病状的患者的适当的基于细胞的疗法的方法，所述方法包括：(a)通过以下方式确定来自患者的生物样品是否包含针对一种或多种Y染色体基因的抗体：(i)从患者获得或已经获得生物样品；(ii)进行或已经进行测定以确定生物样品中是否存在针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体；以及(iii)进行或已经进行测定以确定生物样品中是否存在针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体；和(b)施用本文所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞、胰岛细胞、心肌细胞、神经胶质祖细胞或NK细胞群，其中：(i)如果生物样品中存在针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体，那么细胞群包含降低的Y-连锁原钙粘蛋白11的表达；(ii)如果生物样品中存在针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体，那么细胞群包含降低的Y-连锁神经连接蛋白4的表达；(iii)如果生物样品中存在针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体和针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体，那么细胞群包含降低的Y-连锁原钙粘蛋白11和Y-连锁神经连接蛋白4的表达；(iv)如果生物样品中既不存在针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体，也不存在针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体，那么细胞群不包含降低的Y-连锁原钙粘蛋白11或Y-连锁神经连接蛋白4的表达。
在一些实施方案中，本文提供了一种鉴定患有将受益于基于细胞的疗法的疾病或病状的患者的方法，所述基于细胞的疗法包括降低的一种或多种Y染色体基因的表达，所述方法包括：(a)通过以下方式确定来自患者的生物样品是否包含针对一种或多种Y染色体基因的抗体：(i)从患者获得或已经获得生物样品；(ii)进行或已经进行测定以确定生物样品中是否存在针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体；以及(iii)进行或已经进行测定以确定生物样品中是否存在针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体；和(b)向患者施用本文所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞、胰岛细胞、心肌细胞、神经胶质祖细胞或NK细胞群，其中：(i)如果生物样品中存在针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体，那么细胞群包含降低的Y-连锁原钙粘蛋白11的表达；(ii)如果生物样品中存在针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体，那么细胞群包含降低的Y-连锁神经连接蛋白4的表达；(iii)如果生物样品中存在针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体和针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体，那么细胞群包含降低的Y-连锁原钙粘蛋白11和Y-连锁神经连接蛋白4的表达；(iv)如果生物样品中既不存在针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体，也不存在针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体，那么细胞群不包含降低的Y-连锁原钙粘蛋白11或Y-连锁神经连接蛋白4的表达。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于鉴定患有将受益于基于细胞的疗法的疾病或病状的患者的方法，所述基于细胞的疗法包括降低的Y-连锁原钙粘蛋白11和/或Y-连锁神经连接蛋白4的表达，所述方法包括：(a)通过以下方式确定来自患者的生物样品是否包含针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体和/或针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体：(i)从患者获得或已经获得生物样品；(ii)进行或已经进行测定以确定生物样品中是否存在针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体；以及(iii)进行或已经进行测定以确定生物样品中是否存在针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体；和(b)向患者施用本文所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞、胰岛细胞、心肌细胞、神经胶质祖细胞或NK细胞群，其中：(i)如果生物样品中存在针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体，那么细胞群包含降低的Y-连锁原钙粘蛋白11的表达；(ii)如果生物样品中存在针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体，那么细胞群包含降低的Y-连锁神经连接蛋白4的表达；(iii)如果生物样品中存在针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体和针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体，那么细胞群包含降低的Y-连锁原钙粘蛋白11和Y-连锁神经连接蛋白4的表达；(iv)如果生物样品中既不存在针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体，也不存在针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体，那么细胞群不包含降低的Y-连锁原钙粘蛋白11或Y-连锁神经连接蛋白4的表达。
在一些实施方案中，本文提供了一种确定不包括降低的Y-连锁原钙粘蛋白11和/或Y-连锁神经连接蛋白4的表达的基于细胞的疗法在施用于患者后是否易受NK介导的细胞毒性影响的方法，所述方法包括：(a)通过以下方式确定来自患者的生物样品是否包含针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体和/或针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体：(i)从患者获得或已经获得生物样品；(ii)进行或已经进行测定以确定生物样品中是否存在针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体；以及(iii)进行或已经进行测定以确定生物样品中是否存在针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体；和(b)向患者施用本文所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞、胰岛细胞、心肌细胞、神经胶质祖细胞或NK细胞群，其中：(i)如果生物样品中存在针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体，那么细胞群包含降低的Y-连锁原钙粘蛋白11的表达；(ii)如果生物样品中存在针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体，那么细胞群包含降低的Y-连锁神经连接蛋白4的表达；(iii)如果生物样品中存在针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体和针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体，那么细胞群包含降低的Y-连锁原钙粘蛋白11和Y-连锁神经连接蛋白4的表达；(iv)如果生物样品中既不存在针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体，也不存在针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体，那么细胞群不包含降低的Y-连锁原钙粘蛋白11或Y-连锁神经连接蛋白4的表达。
在一些实施方案中，本文提供了一种确定不包括降低的Y-连锁原钙粘蛋白11和/或Y-连锁神经连接蛋白4的表达的基于细胞的疗法在施用于患者后是否易被成熟NK细胞裂解的方法，所述方法包括：(a)通过以下方式确定来自患者的生物样品是否包含针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体和/或针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体：(i)从患者获得或已经获得生物样品；(ii)进行或已经进行测定以确定生物样品中是否存在针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体；以及(iii)进行或已经进行测定以确定生物样品中是否存在针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体；和(b)向患者施用本文所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞、胰岛细胞、心肌细胞、神经胶质祖细胞或NK细胞群，其中：(i)如果生物样品中存在针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体，那么细胞群包含降低的Y-连锁原钙粘蛋白11的表达；(ii)如果生物样品中存在针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体，那么细胞群包含降低的Y-连锁神经连接蛋白4的表达；(iii)如果生物样品中存在针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体和针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体，那么细胞群包含降低的Y-连锁原钙粘蛋白11和Y-连锁神经连接蛋白4的表达；(iv)如果生物样品中既不存在针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体，也不存在针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体，那么细胞群不包含降低的Y-连锁原钙粘蛋白11或Y-连锁神经连接蛋白4的表达。
在一些实施方案中，本文提供了一种确定不包括降低的Y-连锁原钙粘蛋白11和/或Y-连锁神经连接蛋白4的表达的基于细胞的疗法在施用于患者后是否易受巨噬细胞吞噬影响的方法，所述方法包括：(a)通过以下方式确定来自患者的生物样品是否包含针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体和/或针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体：(i)从患者获得或已经获得生物样品；(ii)进行或已经进行测定以确定生物样品中是否存在针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体；以及(iii)进行或已经进行测定以确定生物样品中是否存在针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体；和(b)向患者施用本文所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞、胰岛细胞、心肌细胞、神经胶质祖细胞或NK细胞群，其中：(i)如果生物样品中存在针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体，那么细胞群包含降低的Y-连锁原钙粘蛋白11的表达；(ii)如果生物样品中存在针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体，那么细胞群包含降低的Y-连锁神经连接蛋白4的表达；(iii)如果生物样品中存在针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体和针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体，那么细胞群包含降低的Y-连锁原钙粘蛋白11和Y-连锁神经连接蛋白4的表达；(iv)如果生物样品中既不存在针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体，也不存在针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体，那么细胞群不包含降低的Y-连锁原钙粘蛋白11或Y-连锁神经连接蛋白4的表达。
在一些实施方案中，本文提供了一种确定不包括降低的Y-连锁原钙粘蛋白11和/或Y-连锁神经连接蛋白4的表达的基于细胞的治疗在施用于患者后是否易受诱导的免疫反应影响的方法，所述方法包括：(a)通过以下方式确定来自患者的生物样品是否包含针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体和/或针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体：(i)从患者获得或已经获得生物样品；(ii)进行或已经进行测定以确定生物样品中是否存在针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体；以及(iii)进行或已经进行测定以确定生物样品中是否存在针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体；和(b)向患者施用本文所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞、胰岛细胞、心肌细胞、神经胶质祖细胞或NK细胞群，其中：(i)如果生物样品中存在针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体，那么细胞群包含降低的Y-连锁原钙粘蛋白11的表达；(ii)如果生物样品中存在针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体，那么细胞群包含降低的Y-连锁神经连接蛋白4的表达；(iii)如果生物样品中存在针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体和针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体，那么细胞群包含降低的Y-连锁原钙粘蛋白11和Y-连锁神经连接蛋白4的表达；(iv)如果生物样品中既不存在针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体，也不存在针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体，那么细胞群不包含降低的Y-连锁原钙粘蛋白11或Y-连锁神经连接蛋白4的表达。
在一些实施方案中，本文提供了一种确定不包括降低的Y-连锁原钙粘蛋白11和/或Y-连锁神经连接蛋白4的表达的基于细胞的疗法在施用于患者后是否易受诱导的基于抗体的免疫反应影响的方法，所述方法包括：(a)通过以下方式确定来自患者的生物样品是否包含针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体和/或针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体：(i)从患者获得或已经获得生物样品；(ii)进行或已经进行测定以确定生物样品中是否存在针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体；以及(iii)进行或已经进行测定以确定生物样品中是否存在针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体；和(b)向患者施用本文所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞、胰岛细胞、心肌细胞、神经胶质祖细胞或NK细胞群，其中：(i)如果生物样品中存在针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体，那么细胞群包含降低的Y-连锁原钙粘蛋白11的表达；(ii)如果生物样品中存在针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体，那么细胞群包含降低的Y-连锁神经连接蛋白4的表达；(iii)如果生物样品中存在针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体和针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体，那么细胞群包含降低的Y-连锁原钙粘蛋白11和Y-连锁神经连接蛋白4的表达；(iv)如果生物样品中既不存在针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体，也不存在针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体，那么细胞群不包含降低的Y-连锁原钙粘蛋白11或Y-连锁神经连接蛋白4的表达。
在一些实施方案中，本文提供了一种治疗患有将受益于基于细胞的疗法的疾病或病状的患者的方法，所述方法包括：(a)通过以下方式确定来自患者的生物样品是否包含针对一种或多种Y染色体基因的抗体：(i)从患者获得或已经获得生物样品；(ii)进行或已经进行测定以确定生物样品中是否存在针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体；以及(iii)进行或已经进行测定以确定生物样品中是否存在针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体；和(b)向患者施用本文所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞、胰岛细胞、心肌细胞、神经胶质祖细胞或NK细胞群，其中：(i)如果生物样品中存在针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体，那么细胞群包含降低的Y-连锁原钙粘蛋白11的表达；(ii)如果生物样品中存在针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体，那么细胞群包含降低的Y-连锁神经连接蛋白4的表达；(iii)如果生物样品中存在针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体和针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体，那么细胞群包含降低的Y-连锁原钙粘蛋白11和Y-连锁神经连接蛋白4的表达；(iv)如果生物样品中既不存在针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体，也不存在针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体，那么细胞群不包含降低的Y-连锁原钙粘蛋白11或Y-连锁神经连接蛋白4的表达。
在一些实施方案中，Y染色体基因是Y染色体连锁抗原或与Y染色体相关的次要组织相容性抗原。
在一些实施方案中，一种或多种Y染色体连锁抗原是Y-连锁原钙粘蛋白11和/或Y-连锁神经连接蛋白4。
在一些实施方案中，细胞具有降低的Y-连锁原钙粘蛋白11的表达。
在一些实施方案中，细胞具有降低的Y-连锁神经连接蛋白4的表达。
在一些实施方案中，细胞具有降低的Y-连锁原钙粘蛋白11的表达和降低的Y-连锁神经连接蛋白4的表达。
在一些实施方案中，细胞被基因工程化以具有降低的Y-连锁原钙粘蛋白11和/或Y-连锁神经连接蛋白4的表达。
在一些实施方案中，细胞不表达Y-连锁原钙粘蛋白11。
在一些实施方案中，细胞不表达Y-连锁神经连接蛋白4。
在一些实施方案中，细胞不表达Y-连锁原钙粘蛋白11并且不表达Y-连锁神经连接蛋白4。
在一些实施方案中，细胞被基因工程化以不表达Y-连锁原钙粘蛋白11和/或Y-连锁神经连接蛋白4。
在一些实施方案中，Y-连锁原钙粘蛋白11和/或Y-连锁神经连接蛋白4的表达降低分别由PCDH11Y和/或NLGN4Y基因的敲除引起。
在一些实施方案中，细胞来源于人细胞或动物细胞。
在一些实施方案中，人细胞或动物细胞来自不具有Y染色体的供体受试者。
在一些实施方案中，人细胞或动物细胞来自具有Y染色体的供体受试者，并且细胞被基因工程化以具有降低的Y-连锁原钙粘蛋白11和/或Y-连锁神经连接蛋白4的表达。
在一些实施方案中，细胞被基因工程化以不表达Y-连锁原钙粘蛋白11。
在一些实施方案中，细胞被基因工程化以不表达Y-连锁神经连接蛋白4。
在一些实施方案中，细胞被基因工程化以不表达Y-连锁原钙粘蛋白11且不表达Y-连锁神经连接蛋白4。
在一些实施方案中，细胞繁殖自或来源于从一名或多名不同于患者的供体受试者分离的细胞池，并且一名或多名供体受试者任选地包括一名或多名具有Y染色体的受试者；一名或多名不具有Y染色体的受试者；或具有Y染色体的受试者和不具有Y染色体的受试者的混合体。
在一些实施方案中，使用CRISPR/Cas基因编辑基因工程化细胞以具有降低的Y-连锁原钙粘蛋白11和/或Y-连锁神经连接蛋白4的表达。
在一些实施方案中，使用包含表2至表5的任何序列的一种或多种指导RNA进行CRISPR/Cas基因编辑。
在一些实施方案中，使用选自由Cas9、Cas12a和Cas12b组成的组的Cas效应蛋白进行CRISPR/Cas基因编辑。
在一些实施方案中，使用选自由以下组成的组的Cas效应蛋白进行CRISPR/Cas基因编辑：(a)任选地选自由Cas3、Cas8a、Cas5、Cas8b、Cas8c、Cas10d、Cse1、Cse2、Csy1、Csy2、Csy3和GSU0054组成的组；(b)任选地选自由Cas9、Csn2和Cas4组成的组；(c)任选地选自由Cas10、Csm2、Cmr5、Cas10、Csx11和Csx10组成的组；(d)任选地Csf1；(e)任选地选自由Cas12a、Cas12b、Cas12c、C2c4、C2c8、C2c5、C2c10、C2c9、CasX(Cas12e)和CasY(Cas12d)组成的组；以及(f)任选地选自由Cas13、Cas13a、C2c2、Cas13b、Cas13c和Cas13d组成的组。
在一些实施方案中，CRISPR/Cas基因编辑是从供体受试者离体进行的。
在一些实施方案中，CRISPR/Cas基因编辑是使用慢病毒载体进行的。
在一些实施方案中，细胞包含相对于未改变或未修饰的野生型或对照细胞降低的B2M和/或CIITA的表达。
在一些实施方案中，细胞不表达B2M和/或CIITA。
在一些实施方案中，细胞包含降低的RHD的表达。
在一些实施方案中，细胞不表达RHD。
在一些实施方案中，细胞是来源于诱导性多能干细胞或其后代的分化细胞。
在一些实施方案中，分化细胞选自由以下组成的组：T细胞、NK细胞、内皮细胞、胰岛细胞、心肌细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、肝细胞、神经胶质祖细胞、多巴胺能神经元、视网膜色素上皮细胞和甲状腺细胞。
在一些实施方案中，细胞是原代免疫细胞或其后代。
在一些实施方案中，原代免疫细胞或其后代是T细胞或NK细胞。
在一些实施方案中，细胞包含降低的TCR-α和/或TCR-β的表达。
在一些实施方案中，细胞不表达TCR-α和/或TCR-β。
在一些实施方案中，细胞还包含编码一种或多种CAR的第二外源多核苷酸，并且一种或多种CAR包含对CD19、CD20、CD22或BCMA具有特异性的胞外配体结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和胞内信号传导结构域。
在一些实施方案中，一种或多种CAR包含CD8α铰链结构域、CD28铰链结构域或IgG4铰链结构域。
在一些实施方案中，一种或多种CAR包含具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CD8α铰链结构域。
在一些实施方案中，一种或多种CAR包含具有SEQ ID NO:10或113的氨基酸序列的CD28铰链结构域。
在一些实施方案中，一种或多种CAR包含具有SEQ ID NO:11或12的氨基酸序列的IgG4铰链结构域。
在一些实施方案中，一种或多种CAR包含CD8α跨膜结构域或CD28跨膜结构域。
在一些实施方案中，一种或多种CAR包含具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CD8α跨膜结构域。
在一些实施方案中，一种或多种CAR包含具有SEQ ID NO:15或114的氨基酸序列的CD28跨膜结构域。
在一些实施方案中，一种或多种CAR包含4-1BB共刺激结构域、CD28共刺激结构域或CD3ζ信号传导结构域。
在一些实施方案中，一种或多种CAR包含具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的4-1BB共刺激结构域。
在一些实施方案中，一种或多种CAR包含具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CD28共刺激结构域。
在一些实施方案中，一种或多种CAR包含具有SEQ ID NO:18或115的氨基酸序列的CD3ζ信号传导结构域。
在一些实施方案中，一种或多种CAR包含胞外配体结合结构域，所述胞外配体结合结构域包含SEQ ID NO:19、37、45、54、63、72、81或118中任一个的scFv序列，或CAR具有包含SEQ ID NO:20、25、38、42、46、50、64、68、73、77、119或123中任一个的重链和轻链序列的scFv序列。
在一些实施方案中，一种或多种CAR具有SEQ ID NO:32、34、36、117或128中任一个的序列。
在一些实施方案中，一种或多种CAR包含SEQ ID NO:117中列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO:117中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列，所述一种或多种CAR具有以下组分：CD8α信号肽、FMC63 scFv(VL-Whitlow接头-VH)、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域。
在一些实施方案中，一种或多种CAR包含SEQ ID NO:45中列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO:45中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，将第一和/或第二外源多核苷酸中的一个或多个插入到细胞的至少一个等位基因的第一和/或第二特定基因座中。
在一些实施方案中，第一和/或第二特定基因座选自由以下组成的组：安全港或靶标基因座、RHD基因座、B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座和TRB基因座。
在一些实施方案中，安全港或靶标基因座选自由以下组成的组：CCR5基因座、CXCR4基因座、PPP1R12C基因座、ALB基因座、SHS231基因座、CLYBL基因座、Rosa基因座、F3(CD142)基因座、MICA基因座、MICB基因座、LRP1(CD91)基因座、HMGB1基因座、ABO基因座、FUT1基因座和KDM5D基因座。
在一些实施方案中，使用基因疗法载体或选自由转座酶、PiggyBac转座子、睡美人(SB11)转座子、Mos1转座子和Tol2转座子组成的组的转座酶系统将第一和/或第二外源多核苷酸引入细胞中。
在一些实施方案中，基因疗法载体是逆转录病毒或融合体。
在一些实施方案中，逆转录病毒是慢病毒载体。
在一些实施方案中，使用CRISPR/Cas基因编辑将第一和/或第二外源多核苷酸引入细胞中。
在一些实施方案中，使用选自由Cas9、Cas12a和Cas12b组成的组的Cas效应蛋白进行CRISPR/Cas基因编辑。
在一些实施方案中，使用选自由以下组成的组的Cas效应蛋白进行CRISPR/Cas基因编辑：(a)任选地选自由Cas3、Cas8a、Cas5、Cas8b、Cas8c、Cas10d、Cse1、Cse2、Csy1、Csy2、Csy3和GSU0054组成的组；(b)任选地选自由Cas9、Csn2和Cas4组成的组；(c)任选地选自由Cas10、Csm2、Cmr5、Cas10、Csx11和Csx10组成的组；(d)任选地Csf1；(e)任选地选自由Cas12a、Cas12b、Cas12c、C2c4、C2c8、C2c5、C2c10、C2c9、CasX(Cas12e)和CasY(Cas12d)组成的组；以及(f)任选地选自由Cas13、Cas13a、C2c2、Cas13b、Cas13c和Cas13d组成的组。
在一些实施方案中，CRISPR/Cas基因编辑是从供体受试者离体进行的。
在一些实施方案中，CRISPR/Cas基因编辑是使用慢病毒载体进行的。
在一些实施方案中，细胞或其后代在施用于患者后逃避NK细胞介导的细胞毒性。
在一些实施方案中，细胞或其后代在施用于患者后受到保护而免于成熟NK细胞的细胞裂解。
在一些实施方案中，细胞或其后代在施用于患者后逃避巨噬细胞吞噬。
在一些实施方案中，细胞或其后代在施用于患者后不会诱导针对所述细胞的免疫反应。
在一些实施方案中，细胞或其后代在施用于患者后不会诱导针对所述细胞的基于抗体的免疫反应。
在一些实施方案中，野生型细胞或对照细胞是起始材料。
在一些实施方案中，本文提供了一种工程化T细胞群用于治疗患者的病症或病状的用途，其中工程化T细胞包含相对于未改变或未修饰的野生型或对照细胞降低的一种或多种Y染色体基因以及MHC I类和/或II类人白细胞抗原分子的表达和编码CD47的第一外源多核苷酸，其中工程化T细胞由原代T细胞或其后代繁殖，或来源于iPSC或其后代。
在一些实施方案中，本文提供了一种工程化分化细胞群用于治疗患者的病症或病状的用途，其中工程化分化细胞包含相对于未改变或未修饰的野生型或对照细胞降低的一种或多种Y染色体基因以及MHC I类和/或II类人白细胞抗原分子的表达和编码CD47的第一外源多核苷酸，其中工程化分化细胞来源于iPSC或其后代。
在一些实施方案中，Y染色体基因是Y染色体连锁抗原或与Y染色体相关的次要组织相容性抗原。
在一些实施方案中，一种或多种Y染色体连锁抗原是Y-连锁原钙粘蛋白11和/或Y-连锁神经连接蛋白4。
在一些实施方案中，细胞具有降低的Y-连锁原钙粘蛋白11的表达。
在一些实施方案中，细胞具有降低的Y-连锁神经连接蛋白4的表达。
在一些实施方案中，细胞具有降低的Y-连锁原钙粘蛋白11的表达和降低的Y-连锁神经连接蛋白4的表达。
在一些实施方案中，细胞被基因工程化以具有降低的Y-连锁原钙粘蛋白11和/或Y-连锁神经连接蛋白4的表达。
在一些实施方案中，细胞不表达Y-连锁原钙粘蛋白11。
在一些实施方案中，细胞不表达Y-连锁神经连接蛋白4。
在一些实施方案中，细胞不表达Y-连锁原钙粘蛋白11并且不表达Y-连锁神经连接蛋白4。
在一些实施方案中，细胞被基因工程化以不表达Y-连锁原钙粘蛋白11和/或Y-连锁神经连接蛋白4。
在一些实施方案中，Y-连锁原钙粘蛋白11和/或Y-连锁神经连接蛋白4的表达降低分别由PCDH11Y和/或NLGN4Y基因的敲除引起。
在一些实施方案中，细胞来源于人细胞或动物细胞。
在一些实施方案中，人细胞或动物细胞来自不具有Y染色体的供体受试者。
在一些实施方案中，人细胞或动物细胞来自具有Y染色体的供体受试者，并且细胞被基因工程化以具有降低的Y-连锁原钙粘蛋白11和/或Y-连锁神经连接蛋白4的表达。
在一些实施方案中，细胞被基因工程化以不表达Y-连锁原钙粘蛋白11。
在一些实施方案中，细胞被基因工程化以不表达Y-连锁神经连接蛋白4。
在一些实施方案中，细胞被基因工程化以不表达Y-连锁原钙粘蛋白11且不表达Y-连锁神经连接蛋白4。
在一些实施方案中，细胞繁殖自或来源于从一名或多名不同于患者的供体受试者分离的细胞池，并且一名或多名供体受试者任选地包括一名或多名具有Y染色体的受试者；一名或多名不具有Y染色体的受试者；或具有Y染色体的受试者和不具有Y染色体的受试者的混合体。
在一些实施方案中，使用CRISPR/Cas基因编辑基因工程化细胞以具有降低的Y-连锁原钙粘蛋白11和/或Y-连锁神经连接蛋白4的表达。
在一些实施方案中，使用包含表2至表5的任何序列的一种或多种指导RNA进行CRISPR/Cas基因编辑。
在一些实施方案中，使用选自由Cas9、Cas12a和Cas12b组成的组的Cas效应蛋白进行CRISPR/Cas基因编辑。
在一些实施方案中，使用选自由以下组成的组的Cas效应蛋白进行CRISPR/Cas基因编辑：(a)任选地选自由Cas3、Cas8a、Cas5、Cas8b、Cas8c、Cas10d、Cse1、Cse2、Csy1、Csy2、Csy3和GSU0054组成的组；(b)任选地选自由Cas9、Csn2和Cas4组成的组；(c)任选地选自由Cas10、Csm2、Cmr5、Cas10、Csx11和Csx10组成的组；(d)任选地Csf1；(e)任选地选自由Cas12a、Cas12b、Cas12c、C2c4、C2c8、C2c5、C2c10、C2c9、CasX(Cas12e)和CasY(Cas12d)组成的组；以及(f)任选地选自由Cas13、Cas13a、C2c2、Cas13b、Cas13c和Cas13d组成的组。
在一些实施方案中，CRISPR/Cas基因编辑是从供体受试者离体进行的。
在一些实施方案中，CRISPR/Cas基因编辑是使用慢病毒载体进行的。
在一些实施方案中，细胞包含相对于未改变或未修饰的野生型或对照细胞降低的B2M和/或CIITA的表达。
在一些实施方案中，细胞不表达B2M和/或CIITA。
在一些实施方案中，细胞包含降低的RHD的表达。
在一些实施方案中，细胞不表达RHD。
在一些实施方案中，细胞是来源于诱导性多能干细胞或其后代的分化细胞。
在一些实施方案中，分化细胞选自由以下组成的组：T细胞、NK细胞、内皮细胞、胰岛细胞、心肌细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、肝细胞、神经胶质祖细胞、多巴胺能神经元、视网膜色素上皮细胞和甲状腺细胞。
在一些实施方案中，细胞是原代免疫细胞或其后代。
在一些实施方案中，原代免疫细胞或其后代是T细胞或NK细胞。
在一些实施方案中，细胞包含降低的TCR-α和/或TCR-β的表达。
在一些实施方案中，细胞不表达TCR-α和/或TCR-β。
在一些实施方案中，细胞还包含编码一种或多种CAR的第二外源多核苷酸，并且一种或多种CAR包含对CD19、CD20、CD22或BCMA具有特异性的胞外配体结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和胞内信号传导结构域。
在一些实施方案中，一种或多种CAR包含CD8α铰链结构域、CD28铰链结构域或IgG4铰链结构域。
在一些实施方案中，一种或多种CAR包含具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CD8α铰链结构域。
在一些实施方案中，一种或多种CAR包含具有SEQ ID NO:10或113的氨基酸序列的CD28铰链结构域。
在一些实施方案中，一种或多种CAR包含具有SEQ ID NO:11或12的氨基酸序列的IgG4铰链结构域。
在一些实施方案中，一种或多种CAR包含CD8α跨膜结构域或CD28跨膜结构域。
在一些实施方案中，一种或多种CAR包含具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CD8α跨膜结构域。
在一些实施方案中，一种或多种CAR包含具有SEQ ID NO:15或114的氨基酸序列的CD28跨膜结构域。
在一些实施方案中，一种或多种CAR包含4-1BB共刺激结构域、CD28共刺激结构域或CD3ζ信号传导结构域。
在一些实施方案中，一种或多种CAR包含具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的4-1BB共刺激结构域。
在一些实施方案中，一种或多种CAR包含具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CD28共刺激结构域。
在一些实施方案中，一种或多种CAR包含具有SEQ ID NO:18或115的氨基酸序列的CD3ζ信号传导结构域。
在一些实施方案中，一种或多种CAR包含胞外配体结合结构域，所述胞外配体结合结构域包含SEQ ID NO:19、37、45、54、63、72、81或118中任一个的scFv序列，或CAR具有包含SEQ ID NO:20、25、38、42、46、50、64、68、73、77、119或123中任一个的重链和轻链序列的scFv序列。
在一些实施方案中，一种或多种CAR具有SEQ ID NO:32、34、36、117或128中任一个的序列。
在一些实施方案中，一种或多种CAR包含SEQ ID NO:117中列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO:117中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列，所述一种或多种CAR具有以下组分：CD8α信号肽、FMC63 scFv(VL-Whitlow接头-VH)、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域。
在一些实施方案中，一种或多种CAR包含SEQ ID NO:45中列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO:45中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，将第一和/或第二外源多核苷酸中的一个或多个插入到细胞的至少一个等位基因的第一和/或第二特定基因座中。
在一些实施方案中，第一和/或第二特定基因座选自由以下组成的组：安全港或靶标基因座、RHD基因座、B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座和TRB基因座。
在一些实施方案中，安全港或靶标基因座选自由以下组成的组：CCR5基因座、CXCR4基因座、PPP1R12C基因座、ALB基因座、SHS231基因座、CLYBL基因座、Rosa基因座、F3(CD142)基因座、MICA基因座、MICB基因座、LRP1(CD91)基因座、HMGB1基因座、ABO基因座、FUT1基因座和KDM5D基因座。
在一些实施方案中，使用基因疗法载体或选自由转座酶、PiggyBac转座子、睡美人(SB11)转座子、Mos1转座子和Tol2转座子组成的组的转座酶系统将第一和/或第二外源多核苷酸引入工程化T细胞中。
在一些实施方案中，基因疗法载体是逆转录病毒或融合体。
在一些实施方案中，逆转录病毒是慢病毒载体。
在一些实施方案中，使用CRISPR/Cas基因编辑将第一和/或第二外源多核苷酸引入细胞中。
在一些实施方案中，使用选自由Cas9、Cas12a和Cas12b组成的组的Cas效应蛋白进行CRISPR/Cas基因编辑。
在一些实施方案中，使用选自由以下组成的组的Cas效应蛋白进行CRISPR/Cas基因编辑：(a)任选地选自由Cas3、Cas8a、Cas5、Cas8b、Cas8c、Cas10d、Cse1、Cse2、Csy1、Csy2、Csy3和GSU0054组成的组；(b)任选地选自由Cas9、Csn2和Cas4组成的组；(c)任选地选自由Cas10、Csm2、Cmr5、Cas10、Csx11和Csx10组成的组；(d)任选地Csf1；(e)任选地选自由Cas12a、Cas12b、Cas12c、C2c4、C2c8、C2c5、C2c10、C2c9、CasX(Cas12e)和CasY(Cas12d)组成的组；以及(f)任选地选自由Cas13、Cas13a、C2c2、Cas13b、Cas13c和Cas13d组成的组。
在一些实施方案中，CRISPR/Cas基因编辑是从供体受试者离体进行的。
在一些实施方案中，CRISPR/Cas基因编辑是使用慢病毒载体进行的。
在一些实施方案中，细胞或其后代在施用于患者后逃避NK细胞介导的细胞毒性。
在一些实施方案中，细胞或其后代在施用于患者后受到保护而免于成熟NK细胞的细胞裂解。
在一些实施方案中，细胞或其后代在施用于患者后逃避巨噬细胞吞噬。
在一些实施方案中，细胞或其后代在施用于患者后不会诱导针对所述细胞的免疫反应。
在一些实施方案中，细胞或其后代在施用于患者后不会诱导针对所述细胞的基于抗体的免疫反应。
在一些实施方案中，野生型细胞或对照细胞是起始材料。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于产生工程化细胞的方法，所述工程化细胞包含相对于未改变或未修饰的野生型或对照细胞降低的一种或多种Y染色体基因以及MHC I类和/或II类人白细胞抗原分子的表达和编码CD47的第一外源多核苷酸，所述方法包括：(a)获得分离的细胞；(b)基因修饰细胞以降低细胞中的一种或多种Y染色体基因的表达；(c)基因修饰细胞以降低细胞中MHC I类人白细胞抗原分子和/或MHC II类人白细胞抗原分子的表达；以及(d)将编码CD47的多核苷酸引入分离的细胞中，从而产生工程化细胞。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于产生工程化细胞的方法，所述工程化细胞包含相对于未改变或未修饰的野生型或对照细胞降低的一种或多种Y染色体基因以及MHC I类和/或II类人白细胞抗原分子的表达和编码CD47的第一外源多核苷酸，所述方法包括：(a)获得分离的细胞；(b)使所述细胞与包含慢病毒载体的组合物接触，所述慢病毒载体包含(i)CD4结合剂或CD8结合剂，(ii)编码靶向一种或多种Y染色体基因座的CRISPR/Cas基因编辑组分的多核苷酸，(iii)编码靶向MHC I类和/或II类人白细胞抗原基因座的CRISPR/Cas基因编辑组分的多核苷酸，以及(iv)编码CD47的第一外源多核苷酸，从而产生工程化细胞。
低免疫原性细胞、其产生方法和其使用方法的详细描述见于2015年5月9日提交的WO2016183041；2018年1月14日提交的WO2018132783；2018年3月20日提交的WO2018176390；2019年7月17日提交的WO2020018615；2019年7月17日提交的WO2020018620；2020年7月31日提交的PCT/US2020/44635；2020年7月31日提交的WO2021022223；2020年8月24日提交的WO2021041316；2021年4月27日提交的WO2021222285；以及2021年4月27日提交的WO2021222285，包括实施例、序列表和附图的公开内容通过引用整体并入本文。
附图说明
图1A描绘了测量与同种型对照相比，来源于男性供体的iPSC的细胞表面上的原钙粘蛋白-Y和神经连接蛋白-Y水平的流式细胞术数据。
图1B描绘了测量与同种型对照相比，来源于女性供体的iPSC的细胞表面上的原钙粘蛋白-Y和神经连接蛋白-Y水平的流式细胞术数据。
图2A描绘了测量与同种型对照相比，在解冻后，来自所分析的三名O型血男性供体的CD3+T细胞的细胞表面上的原钙粘蛋白-Y和神经连接蛋白-Y水平的流式细胞术数据。
图2B描绘了测量与同种型对照相比，在解冻后，来自所分析的两名A型血男性供体的CD3+T细胞的细胞表面上的原钙粘蛋白-Y和神经连接蛋白-Y水平的流式细胞术数据。
图2C描绘了测量与同种型对照相比，在解冻后，来自所分析的两名女性供体的CD3+T细胞的细胞表面上的原钙粘蛋白-Y和神经连接蛋白-Y水平的流式细胞术数据。
图3A、3B和3C示出了使用来自不同志愿者的血清对来自O型血男性供体的HIP T细胞的CDC。
图4A、4B和4C示出了使用来自不同志愿者的血清对来自O型血男性供体的HIP T细胞的ADCC(NK细胞)。
图5A、5B和5C示出了使用来自不同志愿者的血清对来自O型血男性供体的HIP T细胞的CDC和ADCC(NK细胞)以及流式分析。
本公开的其他目的、优点和实施方案将从以下具体实施方式中显而易见。
具体实施方式
I.介绍
本文描述了部分基于WO2018132783和2021年12月23日提交的PCT/US21/65157(每一个都通过引用整体并入本文)中所述的低免疫编辑平台的工程化或修饰的免疫逃避细胞，包括但不限于人免疫逃避细胞。为了克服受试者对这些原代和/或干细胞衍生的移植物的免疫排斥问题，发明人已经开发并且在本文中描述了低免疫原性细胞(例如，低免疫原性多能细胞、来源于此类低免疫原性多能细胞的分化细胞和原代细胞)，所述细胞代表任何可移植细胞类型的可行来源。此类细胞在向受体受试者施用后受到保护而免于适应性和/或先天免疫排斥。有利地，无论受试者的基因构成如何，本文公开的细胞均不会被受体受试者的免疫系统排斥，因为它们在向受体受试者施用后受到保护而免于适应性和先天免疫排斥。在一些实施方案中，工程化和/或低免疫原性细胞不表达一种或多种Y染色体基因且/或不表达MHC I和/或II抗原分子和/或T细胞受体。在某些实施方案中，工程化和/或低免疫原性细胞不表达一种或多种Y染色体基因并且不表达MHC I抗原。在某些实施方案中，工程化和/或低免疫原性细胞不表达一种或多种Y染色体基因，不表达MHC I和/或II抗原分子和/或T细胞受体，并且过表达CD47蛋白。在某些实施方案中，工程化和/或低免疫原性细胞不表达一种或多种Y染色体基因，不表达MHC I和II抗原分子和/或T细胞受体，并且过表达CD47蛋白。在某些实施方案中，工程化和/或低免疫原性细胞(诸如低免疫原性T细胞)不表达一种或多种Y染色体基因，不表达MHC I和/或II抗原分子和/或T细胞受体，过表达CD47蛋白，并且表达外源CAR。在某些实施方案中，工程化和/或低免疫原性细胞(诸如低免疫原性T细胞)不表达一种或多种Y染色体基因，不表达MHC I和II抗原分子和/或T细胞受体，过表达CD47蛋白，并且表达外源CAR。
在一些实施方案中，本文概述的低免疫原性细胞不经受先天免疫细胞排斥。在一些情况下，低免疫原性细胞对NK细胞介导的裂解不敏感。在一些情况下，低免疫原性细胞对巨噬细胞吞噬不敏感。在一些实施方案中，低免疫原性细胞不诱导免疫反应。在一些实施方案中，低免疫原性细胞可用作普遍相容的细胞或组织(例如，通用供体细胞或组织)的来源，所述细胞或组织被移植到受体受试者中而几乎不需要免疫抑制剂。此类低免疫原性细胞在移植后保留细胞特异性特征和特性，包括例如多能性，以及能够植入和与对应的天然细胞类似地发挥作用。
本文公开的技术利用人细胞中致耐受因子的表达和一种或多种Y染色体基因和任选MHC I分子、MHC II分子和/或TCR表达的调节(例如，降低或消除)。在一些实施方案中，利用罕见切割核酸内切酶(rare-cutting endonuclease)(例如，CRISPR/Cas、TALEN、锌指核酸酶、大范围核酸酶和归巢核酸内切酶系统)的基因组编辑技术还可用于降低或消除细胞中涉及免疫反应的基因的表达(例如，通过缺失涉及免疫反应的基因的基因组DNA或通过将基因组DNA插入到此类基因中，使得基因表达受到影响)。在一些实施方案中，基因组编辑技术或其他基因调节技术用于在人细胞中插入耐受诱导(致耐受)因子，使细胞及其后代(包括由其制备的任何分化细胞)能够在植入到受体受试者后逃避免疫识别。因此，本文所述的细胞表现出影响一种或多种Y染色体基因、MHC I分子、MHC II分子和/或TCR表达的一种或多种基因和因子的调节表达，并且逃避受体受试者的免疫系统。
基因组编辑技术能够在期望的基因座位点处实现双链DNA断裂。这些受控的双链断裂促进特定基因座位点处的同源重组。此过程聚焦于用识别并且结合至核酸分子的特定序列并且在核酸分子内诱导双链断裂的核酸内切酶来靶向所述特定序列(诸如染色体)。通过易错的非同源末端连接(NHEJ)或通过同源重组(HR)来修复双链断裂。
令人惊讶的是，发现来自男性供体的iPSC和T细胞表达Y染色体抗原Y-连锁原钙粘蛋白11和Y-连锁神经连接蛋白4。这些令人惊讶的发现表明，低免疫原性细胞(诸如低免疫原性供体T细胞、非活化T细胞、胰岛细胞或心脏细胞)的来源应该缺乏Y染色体，或者应该被基因修饰以降低Y染色体抗原的表达，以避免被受体的适应性免疫系统检测和消除。
除非另有明确相反的指示，否则多个实施方案的实践将采用化学、生物化学、有机化学、分子生物学、微生物学、重组DNA技术、遗传学、免疫学和细胞生物学的常规方法，所述方法在本领域的技术范围内，其中许多方法出于说明目的在下文中描述。此类技术在文献中充分解释。参见例如Sambrook等人,Molecular Cloning:ALaboratory Manual(第3版,2001)；Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版,1989)；Maniatis等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(1982)；Ausubel等人,CurrentProtocols in Molecular Biology(John Wiley and Sons,2008年7月更新)；ShortProtocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocolsin Molecular Biology,Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience；Glover,DNACloning:A Practical Approach,第I和II卷(IRL Press,Oxford,1985)；Anand,Techniques for the Analysis of Complex Genomes,(Academic Press,New York,1992)；Transcription and Translation(B.Hames和S.Higgins编辑,1984)；Perbal,APractical Guide to Molecular Cloning(1984)；Harlow和Lane,Antibodies,(ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1998)Current Protocolsin Immunology Q.E.Coligan,A.M.Kruisbeek,D.H.Margulies,E.M.Shevach和W.Strober编辑,1991)；Annual Review of Immunology；以及诸如Advances in Immunology的期刊上的专题论文。
II.定义
如本公开中所述，将采用以下术语，并且所述术语如下所述定义。
如本文所用，术语“抗原”是指能够引发免疫反应的分子。抗原包括但不限于细胞、细胞提取物、蛋白质、多肽、肽、多糖、多糖缀合物、多糖和其他分子的肽和非肽模拟物、小分子、脂质、糖脂、碳水化合物、病毒和病毒提取物以及多细胞生物诸如寄生虫和过敏原。术语抗原广泛地包括被宿主免疫系统识别为外来的任何类型的分子。
术语“自身免疫性疾病”或“自身免疫性病症”或“炎性疾病”或“炎性病症”是指受试者产生针对其自身组织和/或细胞的免疫反应的任何疾病或病症。自身免疫性病症几乎可以影响受试者(例如，人)的每个器官系统，包括但不限于神经、胃肠道和内分泌系统疾病，以及皮肤和其他结缔组织、眼睛、血液和血管疾病。自身免疫性疾病的实例包括但不限于桥本甲状腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、系统性红斑狼疮、干燥综合征(Sjogren'ssyndrome)、格雷夫斯病(Graves'disease)、硬皮病、类风湿性关节炎、多发性硬化症、重症肌无力和糖尿病。
如本文所用的术语“癌症”被定义为细胞的过度增殖，其独特特征(例如，失去正常控制)导致不受调控的生长、缺乏分化、局部组织侵袭和转移。关于本发明的方法，癌症可以是任何癌症，包括以下癌症中的任一种：急性淋巴细胞癌、急性髓性白血病、腺泡状横纹肌肉瘤、膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、肛门癌、肛管癌或肛门直肠癌、眼癌、肝内胆管癌、关节癌、颈癌、胆囊癌或胸膜癌、鼻癌、鼻腔癌或中耳癌、口腔癌、外阴癌、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病、结肠癌、食道癌、宫颈癌、纤维肉瘤、胃肠道类癌肿瘤、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)、下咽癌、肾癌、喉癌、白血病、液体瘤、肝癌、肺癌、淋巴瘤、恶性间皮瘤、肥大细胞瘤、黑色素瘤、多发性骨髓瘤、鼻咽癌、非霍奇金淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、腹膜、大网膜和肠系膜癌、咽癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌、皮肤癌、小肠癌、软组织癌、实体瘤、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、输尿管癌和尿膀胱癌。如本文所用，除非另有明确说明，否则术语“肿瘤”是指恶性类型的细胞或组织的异常生长，并且不包括良性类型组织。
术语“细胞”是指任何人细胞或动物细胞。在一些实施方案中，细胞是来自具有Y染色体的供体受试者的人细胞或动物细胞。在一些实施方案中，细胞是来自不具有Y染色体的供体受试者的人细胞或动物细胞。
术语“慢性感染性疾病”是指由感染原引起的疾病，其中感染持续存在。这样的疾病可包括肝炎(甲型、乙型或丙型)、疱疹病毒(例如VZV、HSV-1、HSV-6、HSV-II、CMV和EBV)和HIV/AIDS。非病毒实例可包括慢性真菌疾病，诸如曲霉菌病、念珠菌病、球孢子菌病和与隐球菌相关的疾病以及组织胞浆菌病。慢性细菌感染原的非限制性实例可以是肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)、单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogene)和结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)。在一些实施方案中，病症是人免疫缺陷病毒(HIV)感染。在一些实施方案中，病症是获得性免疫缺陷综合征(AIDS)。
如本文所用，“临床有效量”是指足以在疾病、病症或病状的治疗和/或管理中提供临床益处的量。在一些实施方案中，临床有效量是已显示对疾病、病症或病状的护理标准产生至少一个改进的临床终点的量。在一些实施方案中，临床有效量是例如在临床试验中已证明足以为治疗疾病、病症或病状提供统计上显著和有意义的有效性的量。在一些实施方案中，临床有效量也是治疗有效量。在一些实施方案中，临床有效量不是治疗有效量。
在一些实施方案中，本文所述的改变或修饰(包括例如遗传改变或修饰)导致靶标或选择的多核苷酸序列的表达降低。在一些实施方案中，本文所述的改变或修饰导致靶标或选择的多肽序列的表达降低。在一些实施方案中，本文所述的改变或修饰导致靶标或选择的多核苷酸序列的表达增加。在一些实施方案中，本文所述的改变或修饰导致靶标或选择的多肽序列的表达增加。
在另外的或替代的实施方案中，本公开考虑以技术人员可用的任何方式改变靶标多核苷酸序列，例如，利用TALEN系统或RNA指导的转座酶。应当理解，尽管本文详细描述了利用CRISPR/Cas(例如，Cas9和Cas12a)和TALEN的方法的实例，但本公开不限于这些方法/系统的使用。本文可以利用技术人员已知的降低或消除靶细胞中的表达的其他靶向例如B2M的方法。
术语“减少(decrease)”、“降低(reduced)”、“降低(reduction)”和“减少(decrease)”在本文中均一般用于意指减少统计上显著的量。然而，为避免疑问，“减少(decrease)”、“降低(reduced)”、“降低(reduction)、“减少(decrease)”意指与参考水平相比减少至少10％，例如与参考水平相比减少至少约20％，或至少约30％，或至少约40％，或至少约50％，或至少约60％，或至少约70％，或至少约80％，或至少约90％或至多且包括100％减少(即，与参考样品相比不存在的水平)或在10-100％之间的任何减少。在一些实施方案中，细胞经工程化以相对于未改变或未修饰的野生型或对照细胞具有降低的一个或多个靶标的表达。
在一些实施方案中，所述的工程化和/或低免疫原性细胞来源于iPSC或其后代。如本文所用，术语“来源于iPSC或其后代”涵盖生成的初始iPSC及其任何后续后代。如本文所用，术语“后代”涵盖例如第一代后代，即通过例如传统繁殖方法直接来源于、获得自、可获得自或可来源于初始iPSC的后代。术语“后代”还涵盖另外的世代，诸如第二代、第三代、第四代、第五代、第六代、第七代或更多代，即通过例如传统繁殖方法来源于、获得自、可获得自或可来源于前一代的细胞世代。术语“后代”还涵盖由于初始iPSC或其后代的修饰或改变而产生的修饰的细胞。
术语“供体受试者”是指动物，例如，可以从其获得细胞的人。如本文中可互换使用的“非人动物”和“非人哺乳动物”包括哺乳动物诸如大鼠、小鼠、兔、羊、猫、狗、牛、猪和非人灵长类动物。术语“供体受试者”还涵盖任何脊椎动物，包括但不限于哺乳动物、爬行动物、两栖动物和鱼类。然而，有利地，供体受试者是哺乳动物，诸如人或其他哺乳动物(诸如家养哺乳动物，例如狗、猫、马等，或生产哺乳动物，例如牛、羊、猪等)。“供体受试者”还可以指多于一个供体，例如一个或多个人或非人动物或非人哺乳动物。
术语“内源”是指天然存在于细胞中的参考分子或多肽。类似地，当用于提及编码核酸的表达时，所述术语是指天然包含在细胞内并且不是外源引入的编码核酸的表达。类似地，当用于提及启动子序列时，所述术语是指天然包含在细胞内并且不是外源引入的启动子序列。
如本文所用的术语“工程化细胞”是指已经通过人为干预以至少一些方式改变的细胞，所述人为干预包括例如通过遗传改变或修饰，使得工程化细胞不同于野生型细胞。
如本文所用，在表达的多核苷酸或多肽的上下文中，术语“外源”旨在意指将所提及的分子或所提及的多肽引入到感兴趣的细胞中。可以例如通过将编码核酸引入到细胞的遗传物质中(诸如通过整合到染色体中)或者作为非染色体遗传物质(诸如质粒或表达载体)来引入多肽。因此，当用于提及编码核酸的表达时，所述术语是指将编码核酸以可表达的形式引入到细胞中。
出于本公开的目的，“基因”包括编码基因产物的DNA区域，以及调控基因产物的产生的所有DNA区域，无论此类调控序列是否与编码和/或转录序列相邻。因此，基因包括但不一定限于启动子序列、终止子、翻译调控序列，诸如核糖体结合位点和内部核糖体进入位点、增强子、沉默子、绝缘子、边界元件、复制起点、基质附着位点及/或基因座控制区。
“基因表达”是指将包含在基因中的信息转化为基因产物。基因产物可以是基因的直接转录产物(例如，mRNA、tRNA、rRNA、反义RNA、核酶、结构RNA或任何其他类型的RNA)或通过mRNA翻译产生的蛋白质。基因产物还包括通过诸如加帽、聚腺苷酸化、甲基化和编辑的过程修饰的RNA，以及通过例如甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、ADP-核糖基化、豆蔻酰化和/或糖基化修饰的蛋白质。
如本文所用的术语“遗传修饰”及其语法等同物可以指代核酸(例如生物体基因组内的核酸)的一种或多种改变。例如，遗传修饰可以指代基因或基因部分或其他核酸序列的改变、添加和/或缺失。遗传修饰的细胞还可以指代具有添加的、缺失的和/或改变的基因或基因部分的细胞。遗传修饰的细胞还可以指代添加了不是基因或基因部分的核酸序列的细胞。遗传修饰包括，例如，瞬时敲入或敲低机制，以及导致靶基因或基因部分或核酸序列的永久敲入、敲低或敲除的机制。遗传修饰包括，例如，瞬时敲入，以及导致核酸序列的永久敲入的机制。遗传修饰还包括，例如，降低或增加的转录、降低或增加的mRNA稳定性、降低或增加的翻译以及降低或增加的蛋白质稳定性。
如本文所用，术语“植入(grafting)”、“施用(administering)”、“引入(introducing)”、“植入(implanting)”和“移植(transplanting)”及其语法变体在将细胞(例如，本文所述的细胞)放置到受试者中的上下文中可互换使用，所述放置通过导致引入细胞定位或至少部分定位在期望部位或全身引入(例如，进入循环)的方法或途径进行。可以将细胞直接植入期望部位，或通过任何适当的途径施用，所述途径导致递送至受试者的期望部位，在所述位置中，植入的细胞或细胞组分中的至少一部分保持存活。在向受试者施用后细胞的生存期可以短至几小时(例如，二十四小时)至几天，甚至长达若干年。在一些实施方案中，细胞还可例如以胶囊形式施用(例如，注射)到期望部位以外的位置，诸如在脑中或皮下，以将植入的细胞维持在植入位置并且避免植入的细胞迁移。
“HLA”或“人白细胞抗原”或“HLA分子”或“人白细胞抗原分子”复合物是在人体内编码MHC蛋白的基因复合物。构成HLA复合物的这些细胞表面蛋白负责调控对抗原的免疫反应。在人体内，有两种MHC，I类分子和II类分子、“HLA-I”和“HLA-II”，或“HLA-I分子”和“HLA-II分子”。HLA-I包括三种蛋白质，即HLA-A、HLA-B和HLA-C，所述三种蛋白质呈递来自细胞内的肽，并且由HLA-I复合物呈递的抗原吸引杀伤T细胞(也称为CD8+T细胞或细胞毒性T细胞)。HLA-I蛋白与β-2微球蛋白(B2M)相关。HLA-II包括五种蛋白质HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOB、HLA-DQ和HLA-DR，所述五种蛋白质将来自细胞外的抗原呈递到T淋巴细胞。这会刺激CD4+细胞(也称为辅助T细胞)。应当理解，“MHC”或“HLA”的使用并不意味着限制，因为它取决于基因是来自人(HLA)还是来自鼠(MHC)。因此，当它涉及哺乳动物细胞时，这些术语在本文中可互换使用。
如本文所用以表征细胞，术语“低免疫原性”一般意指这种细胞不太容易受到被移植此类细胞的受试者的先天或适应性免疫排斥，例如，细胞不太容易受到被移植此类细胞的受试者的同种异体排斥。例如，相对于不包含修饰的相同细胞类型的细胞，这种低免疫原性细胞可能约2.5％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97.5％、99％或更不太容易受到被移植此类细胞的受试者的先天或适应性免疫排斥。在一些实施方案中，使用基因组编辑技术来调节MHC I和MHC II基因的表达，从而促进低免疫原性细胞的生成。在一些实施方案中，低免疫原性细胞在MHC错配的同种异体受体中逃避免疫排斥。在一些情况下，当向MHC错配的同种异体受体施用(例如，移植或植入)时，由本文概述的低免疫原性干细胞产生的分化细胞逃避免疫排斥。在一些实施方案中，低免疫原性细胞受到保护而免于T细胞介导的适应性免疫排斥和/或先天免疫细胞排斥。低免疫原性细胞、其产生方法和其使用方法的详细描述见于2015年5月9日提交的WO2016183041；2018年1月14日提交的WO2018132783；2018年3月20日提交的WO2018176390；2019年7月17日提交的WO2020018615；2019年7月17日提交的WO2020018620；2020年7月31日提交的PCT/US2020/44635；2020年7月31日提交的WO2021022223；2020年8月24日提交的WO2021041316；2021年4月27日提交的WO2021222285；以及2021年4月27日提交的WO2021222285，包括实施例、序列表和附图的公开内容通过引用整体并入本文。
细胞的低免疫原性可以通过评价细胞的免疫原性(诸如细胞引发适应性和先天免疫反应或避免引发此类适应性和先天免疫反应的能力)来确定。这种免疫反应可以使用本领域技术人员认可的测定来测量。在一些实施方案中，免疫反应测定测量低免疫原性细胞对T细胞增殖、T细胞活化、T细胞杀伤、供体特异性抗体生成、NK细胞增殖、NK细胞活化和巨噬细胞活性的影响。在一些情况下，低免疫原性细胞及其衍生物在向受试者施用后经历被T细胞和/或NK细胞杀伤的降低。在一些情况下，与未修饰或野生型细胞相比，细胞及其衍生物显示出降低的巨噬细胞吞噬。在一些实施方案中，与对应的未修饰的野生型细胞相比，低免疫原性细胞在受体受试者中引发降低或减弱的免疫反应。在一些实施方案中，低免疫原性细胞是非免疫原性的或不能在受体受试者中引发免疫反应。
在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中的术语百分比“同一性”是指两个或更多个序列或子序列在比较和比对以获得最大对应关系时具有相同的核苷酸或氨基酸残基的指定百分比，如使用下述序列比较算法(例如，BLASTP和BLASTN或技术人员可用的其他算法)中的一种或通过目测所测量的。根据应用，百分比“同一性”可以存在于被比较序列的区域中，例如，存在于功能结构域中，或者存在于两个待比较序列的全长中。对于序列比较，通常一个序列充当与测试序列进行比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机中，指定子序列坐标(如果需要的话)，并且指定序列算法程序参数。然后序列比较算法基于指定的程序参数计算测试序列相对于参考序列的百分比序列同一性。
可以例如通过以下算法进行序列的最佳比对以实现比较：Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源性算法、Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比对算法、Pearson和Lipman,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)的相似性搜索方法、这些算法的计算机化实现(威斯康星遗传软件包(Genetics ComputerGroup,575Science Dr.,Madison,Wis.)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)或目测(一般参见Ausubel等人，下文)。
适用于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法的一个实例是BLAST算法，所述算法描述于Altschul等人,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)。用于执行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)公开获得。
如本文所用的“免疫信号传导因子”在一些情况下是指活化免疫信号传导通路的分子、蛋白质、肽等。
如本文所用的“免疫抑制因子”或“免疫调控因子”或“致耐受因子”包括低免疫因子(hypoimmunity factor)、补体抑制剂、以及在施用、移植或植入后调节或影响细胞被宿主或受体受试者的免疫系统识别的能力的其他因子。这些可能与额外的基因修饰相组合。
术语“增加(increased)”、“增加(increase)”或“增强(enhance)”或“活化(activate)”在本文中均用于一般意指增加统计上显著的量；为避免任何疑问，术语“增加(increased)”、“增加(increase)”或“增强(enhance)”或“活化(activate)”意指与参考水平相比增加至少10％，例如与参考水平相比增加至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％或至多并包括100％增加或在10％-100％之间的任何增加，或者与参考水平相比至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍或至少约10倍增加，或在2倍与10倍之间的任何增加，或更多增加。在一些实施方案中，也称为基础水平的参考水平是0。
在一些实施方案中，改变是插入缺失。如本文所用，“插入缺失”是指由插入、缺失或其组合产生的突变。如本领域技术人员将理解的，除非插入缺失的长度是三的倍数，否则基因组序列的编码区中的插入缺失将导致移码突变。在一些实施方案中，改变是点突变。如本文所用，“点突变”是指替换一个核苷酸的取代。本公开的基因编辑(例如CRISPR/Cas)系统可用于在靶多核苷酸序列中诱导任意长度的插入缺失或点突变。
如本文所用，“敲低”是指靶mRNA或对应靶蛋白的表达降低。通常相对于施用或表达不介导RNA表达水平降低的非对照分子(例如，非靶向对照shRNA、siRNA或miRNA)后存在的水平来报告敲低。在一些实施方案中，靶基因的敲低通过条件性或诱导型shRNA、条件性或诱导型siRNA、条件性或诱导型miRNA或条件性或诱导型CRISPR干扰(CRISPRi)来实现。在一些实施方案中，靶基因的敲低通过基于蛋白质的方法(诸如条件性或诱导型降解决定子(degron)方法)来实现。在一些实施方案中，靶基因的敲低通过遗传修饰(包括shRNA、siRNA、miRNA)或使用基因编辑系统(例如CRISPR/Cas)来实现。
通常通过使用定量聚合酶链反应(qPCR)扩增测量mRNA水平或通过用蛋白质印迹法或酶联免疫吸附测定(ELISA)测量蛋白质水平来评估敲低。分析蛋白质水平提供mRNA切割以及翻译抑制的评估。用于测量敲低的另外技术包括RNA溶液杂交、核酸酶保护、Northern杂交、用微阵列监测基因表达、抗体结合、放射免疫测定和荧光活化细胞分析。基于本文所述的细节，本领域技术人员将容易理解如何使用本公开的基因编辑系统(例如，CRISPR/Cas)来敲除靶多核苷酸序列或其部分。
本文中的“敲入(knock in)”或“敲入(knock-in)”意指由将DNA序列插入到宿主细胞的染色体基因座中而引起的遗传修饰。这引起敲入基因、基因部分或核酸序列插入产物的表达的起始或水平增加，例如RNA转录物水平和/或编码蛋白质水平的增加。如本领域技术人员将理解的，这可以以若干种方式实现，包括将基因或其部分的一个或多个额外拷贝插入或添加到宿主细胞中、或改变内源基因的调控组分以增加蛋白质的表达、或插入期望其表达的指定核酸序列。这可通过修饰启动子、添加不同的启动子、添加增强子、添加其他调控元件或修饰其他基因表达序列来实现。
如本文所用，“敲除(knock out)”或“敲除(knock-out)”包括以干扰靶多核苷酸序列的翻译或功能的方式缺失全部或部分靶多核苷酸序列。例如，可以通过在靶多核苷酸序列中(包括靶多核苷酸序列的功能结构域(例如，DNA结合结构域)中)诱导插入或缺失(“插入缺失”)来改变靶多核苷酸序列，从而实现敲除。基于本文所述的细节，本领域技术人员将容易理解如何使用本公开的基因编辑系统(例如CRISPR/Cas)来敲除靶多核苷酸序列或其部分。
在一些实施方案中，遗传修饰或改变导致靶多核苷酸序列或其部分的敲除或敲低。使用本公开的基因编辑系统(例如CRISPR/Cas)敲除靶多核苷酸序列或其部分可用于多种应用。例如，出于研究目的，敲除细胞中的靶多核苷酸序列可在体外执行。出于离体目的，敲除细胞中的靶多核苷酸序列可用于治疗或预防与靶多核苷酸序列的表达相关的病症(例如，通过离体敲除细胞中的突变体等位基因并且将包含敲除的突变体等位基因的这些细胞引入到受试者中)或用于改变细胞的基因型或表型。
基因表达的“调节”是指基因表达水平的变化。表达的调节可包括但不限于基因活化和基因抑制。调节也可以是完全的，即其中基因表达完全灭活或活化至野生型水平或更高；或者它可以是部分的，其中基因表达部分降低或部分活化至野生型水平的一部分。
在另外的或替代的方面，本公开考虑以技术人员可用的任何方式改变靶多核苷酸序列，例如，利用核酸酶系统，诸如TAL效应物核酸酶(TALEN)或锌指核酸酶(ZFN)系统。应当理解，尽管本文详细描述了利用CRISPR/Cas(例如，Cas9和Cas12a)和TALEN的方法的实例，但本公开不限于这些方法/系统的使用。本文可以利用技术人员已知的降低或消除靶细胞中的表达的其他靶向方法。本文提供的方法可以用于改变细胞中的靶多核苷酸序列。本公开出于任何目的考虑了改变细胞中的靶多核苷酸序列。在一些实施方案中，改变细胞中的靶多核苷酸序列以产生突变体细胞。如本文所用，“突变体细胞”是指具有不同于其原始基因型的所得基因型的细胞。在一些情况下，“突变体细胞”表现出突变体表型，例如当使用本公开的基因表达系统(例如，CRISPR/Cas系统)改变正常功能的基因时。在其他情况下，“突变体细胞”表现出野生型表型，例如当使用本公开的基因表达系统(例如，CRISPR/Cas系统)来校正突变体基因型时。在一些实施方案中，改变细胞中的靶多核苷酸序列以校正或修复遗传突变(例如，以恢复细胞的正常表型)。在一些实施方案中，改变细胞中的靶多核苷酸序列以诱导遗传突变(例如，以破坏基因或基因组元件的功能)。
“Y-连锁神经连接蛋白4”、“神经连接蛋白4-Y”和“NLGN4Y”及其变体是指由NLGN4Y基因编码的Y染色体连锁抗原。
术语“有效地连接(operatively linked)”或“可操作地连接(operably linked)”关于两个或更多个组件(诸如序列元件)的并置可互换使用，其中组件被排列成使得两个组件都正常运行并且允许至少一个组件可以介导施加在至少一个其他组件上的功能的可能性。举例来说，如果转录调控序列(诸如启动子)响应于一种或多种转录调控因子的存在或不存在而控制编码序列的转录水平，则所述转录调控序列有效地连接至编码序列。转录调控序列通常以顺式方式与编码序列有效地连接，但不必与其直接相邻。例如，增强子是有效地连接至编码序列的转录调控序列，即使它们不连续。
术语“患者”或“受体患者”是指动物，例如，向其提供用如本文所述的细胞的治疗(包括预防性治疗)的人。对于特定动物(诸如人患者)特有的那些感染、病状或疾病状态的治疗，术语患者是指此特定动物。术语“患者”还涵盖任何脊椎动物，包括但不限于哺乳动物、爬行动物、两栖动物和鱼类。然而，有利地，患者是哺乳动物，诸如人或其他哺乳动物(诸如家养哺乳动物，例如狗、猫、马等，或生产哺乳动物，例如牛、羊、猪等)。
如本文所用的“多能干细胞”具有分化成三个胚层中的任一个的潜力：内胚层(例如，胃连接、胃肠道、肺等)、中胚层(例如，肌肉、骨骼、血液、泌尿生殖组织等)或外胚层(例如，表皮组织和神经系统组织)。如本文所用的术语“多能干细胞”还涵盖“诱导性多能干细胞”或“iPSC”，或一类来源于非多能细胞的多能干细胞。在一些实施方案中，多能干细胞由不是多能细胞的细胞产生或生成。换句话说，多能干细胞可以是非多能细胞的直接或间接后代。亲本细胞的实例包括已被重编程以通过各种方式诱导多能、未分化表型的体细胞。此类“iPS”或“iPSC”细胞可以通过诱导某些调控基因的表达或通过某些蛋白质的外源应用来产生。用于诱导iPS细胞的方法是本领域已知的并且在下文进一步描述。(参见例如Zhou等人,Stem Cells 27(11):2667-74(2009)；Huangfu等人,Nature Biotechnol.26(7):795(2008)；Woltjen等人,Nature 458(7239):766-770(2009)；以及Zhou等人,Cell Stem Cell8:381-384(2009)；这些文献中的每一篇通过引用整体并入本文。)诱导性多能干细胞(iPSC)的生成在下文中概述。如本文所用，“hiPSC”是人诱导性多能干细胞。在一些实施方案中，如本文所用，“多能干细胞”还涵盖间充质干细胞(MSC)和/或胚胎干细胞(ESC)。
如本文所用，“启动子”、“启动子序列”或“启动子区”是指能够结合RNA聚合酶并参与启动下游编码或非编码序列转录的DNA调控区/序列。在一些实例中，启动子序列包括转录起始位点，并且向上游延伸以包括以高于背景的可检测水平启动转录所必需的最小数量的碱基或元件。在一些实施方案中，启动子序列包括转录起始位点，以及负责RNA聚合酶结合的蛋白质结合结构域。真核生物启动子将经常但不总是含有“TATA”盒和“CAT”盒。
在一些实施方案中，所述的工程化和/或低免疫原性细胞从原代T细胞或其后代繁殖。如本文所用，术语“从原代T细胞或其后代繁殖”涵盖从供体受试者分离的初始原代T细胞及其任何后续后代。如本文所用，术语“后代”涵盖例如第一代后代，即通过例如传统繁殖方法直接来源于、获得自、可获得自或可来源于初始原代T细胞的后代。术语“后代”还涵盖另外的世代，诸如第二代、第三代、第四代、第五代、第六代、第七代或更多代，即通过例如传统繁殖方法来源于、获得自、可获得自或可来源于前一代的细胞世代。术语“后代”还涵盖由于初始原代T细胞或其后代的修饰或改变而产生的修饰的细胞。
“Y-连锁原钙粘蛋白11”、“原钙粘蛋白11-Y”和“PCDH11Y”及其变体是指由PCDH11Y基因编码的Y染色体连锁抗原。
如本文所用，术语“调控序列”、“调控元件”和“控制元件”是可互换的，并且是指待表达的多核苷酸靶标的上游(5'非编码序列)、内部或下游(3'非翻译序列)的多核苷酸序列。调控序列影响例如但不限于转录的时间、转录的量或水平、RNA处理或稳定性和/或相关结构核苷酸序列的翻译。调控序列可包括活化因子结合序列、增强子、内含子、聚腺苷酸化识别序列、启动子、阻遏物结合序列、茎环结构、翻译起始序列、翻译前导序列、转录终止序列、翻译终止序列、引物结合位点等。人们认识到，由于在大多数情况下调控序列的确切边界尚未完全界定，不同长度的核苷酸序列可具有相同的调控或启动子活性。
如本文所用的“安全港基因座”是指这样的基因座，其允许以使得新插入的遗传元件能够可预测地发挥作用的方式表达转基因或外源基因，并且也不会以对宿主细胞产生风险的方式引起宿主基因组的改变。示例性“安全港”基因座包括但不限于CCR5基因、PPP1R12C(也称为AAVS1)基因、CLYBL基因和/或Rosa基因(例如，ROSA26)。
如本文所用的“靶标基因座”是指允许表达转基因或外源基因的基因座。示例性“靶标基因座”包括但不限于CXCR4基因、白蛋白基因、SHS231基因座、F3基因(也称为CD142)、MICA基因、MICB基因、LRP1基因(也称为CD91)、HMGB1基因、ABO基因、RHD基因、FUT1基因和/或KDM5D基因(也称为HY)。编码外源基因的外源多核苷酸可以插入到B2M、CIITA、TRAC、TRBC、CCR5、F3(即，CD142)、MICA、MICB、LRP1、HMGB1、ABO、RHD、FUT1、KDM5D(即，HY)、PDGFRa、OLIG2和/或GFAP的CDS区中。可将编码外源基因的外源多核苷酸插入到PPP1R12C(即AAVS1)或CCR5的内含子1或2中。可将编码外源基因的外源多核苷酸插入到CCR5的外显子1或2或3中。可将编码外源基因的外源多核苷酸插入到CLYBL的内含子2中。可将编码外源基因的外源多核苷酸插入到Ch-4:58,976,613(即，SHS231)中的500bp窗口中。可将编码外源基因的外源多核苷酸插入到上文提及的允许表达外源的安全港或靶标基因座的任何合适区域，包括例如安全港或靶标基因座中的内含子、外显子或编码序列区域。
与患者相关使用的术语“致敏”是指具有对外来细胞反应的抗体的患者。在一些实施方案中，本公开考虑了被致敏受试者的治疗。例如，考虑本治疗方法的受试者对一种或多种包含Y染色体连锁抗原的同种异体抗原敏感。在一些实施方案中，患者因先前妊娠或先前同种异体移植(包括例如但不限于同种异体细胞移植、同种异体输血、同种异体组织移植和同种异体器官移植)而被致敏。在一些实施方案中，患者表现出对一种或多种同种异体抗原有反应性的记忆B细胞和/或记忆T细胞。
在一些实施方案中，本公开考虑了非致敏受试者的治疗。例如，考虑本治疗方法的受试者对一种或多种包含Y染色体连锁抗原的同种异体抗原不敏感。在一些实施方案中，患者未因先前妊娠或先前同种异体移植(包括例如但不限于同种异体细胞移植、同种异体输血、同种异体组织移植和同种异体器官移植)而被致敏。在一些实施方案中，患者未表现出对一种或多种同种异体抗原有反应性的记忆B细胞和/或记忆T细胞。
如本文所用，“靶标”可指通过本文所述的方法经受可调控的降低表达的基因、基因部分、基因组部分或蛋白质。
如本文所用，“治疗有效量”是指足以在疾病、病症或病状的治疗和/或管理中提供治疗益处的量。在一些实施方案中，治疗有效量是足以改善、缓和、稳定、逆转、减缓、减弱或延迟疾病、病症或病状的进展或疾病、病症或病状的症状或副作用的进展的量。在一些实施方案中，治疗有效量也是临床有效量。在其他实施方案中，治疗有效量不是临床有效量。
如本文所用，术语“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”包括向受试者施用治疗或临床有效量的本文所述的细胞，使得受试者的疾病的至少一种症状得到减轻或疾病得到改善，例如，有益的或期望的治疗或临床结果。出于此技术的目的，有益的或期望的治疗或临床结果包括但不限于一种或多种症状的减轻、疾病程度的减轻、稳定(即，不恶化)的疾病状态、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善或缓和以及缓解(无论是部分的还是全部的)，无论是可检测的还是不可检测的。治疗可以指与未接受治疗的预期存活相比延长存活。因此，本领域技术人员认识到，治疗可改善疾病状况，但可能不是疾病的完全治愈。在一些实施方案中，在治疗病状、疾病或病症后，所述病状、疾病或病症的一种或多种症状减轻至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％。
出于此技术的目的，疾病治疗的有益的或期望的治疗或临床结果包括但不限于一种或多种症状的减轻、疾病程度的减轻、稳定(即，不恶化)的疾病状态、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善或缓和以及缓解(无论是部分的还是全部的)，无论是可检测的还是不可检测的。
“载体”或“构建体”能够将基因序列转移至靶细胞。通常，“载体构建体”、“表达载体”和“基因转移载体”意指能够指导感兴趣基因的表达并且可以将基因序列转移至靶细胞的任何核酸构建体。因此，该术语包括克隆和表达媒剂以及整合载体。用于将载体或构建体引入到细胞中的方法是本领域技术人员已知的并且包括但不限于脂质介导的转移(即，脂质体，包括中性和阳离子脂质)、电穿孔、直接注射、细胞融合、粒子轰击、磷酸钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转移和/或病毒载体介导的转移。
在一些实施方案中，细胞经工程化以相对于未改变或未修饰的野生型或对照细胞具有降低或增加的一个或多个靶标的表达。在细胞的上下文中，“野生型”或“wt”或“对照”意指任何天然存在的细胞。野生型或对照细胞的实例包括天然存在的原代细胞和T细胞。然而，举例来说，在工程化和/或低免疫原性T细胞的上下文中，如本文所用，“野生型”或“对照”还可意指工程化和/或低免疫原性T细胞，所述工程化和/或低免疫原性T细胞可能含有导致一种或多种MHC I类分子和/或II类分子和/或T细胞受体表达降低，和/或CD47蛋白过表达的核酸变化，但未经过本公开的实现一种或多种Y染色体基因的表达降低的基因编辑程序。例如，如本文所用，“野生型”或“对照”意指包含降低或敲除的B2M、CIITA和/或TRAC表达的工程化细胞。此外，如本文所用，“野生型”或“对照”意指包含降低或敲除的B2M、CIITA、TRAC和/或TRBC表达的工程化细胞。如本文所用，“野生型”或“对照”还意指工程化细胞，所述工程化细胞可能含有导致CD47蛋白过表达的核酸变化，但未经过导致一种或多种MHC I类分子和/或II类分子和/或T细胞受体表达降低的基因编辑程序。在iPSC或其后代的上下文中，“野生型”或“对照”还意指iPSC或其后代，所述iPSC或其后代可含有导致多能性的核酸变化，但未经过本公开的实现一种或多种MHC I类分子和/或II类分子和/或T细胞受体和/或一种或多种Y染色体基因表达降低和/或CD47蛋白过表达的基因编辑程序。例如，如本文所用，“野生型”或“对照”意指包含降低或敲除的B2M、CIITA和/或TRAC表达的iPSC或其后代。此外，如本文所用，“野生型”或“对照”意指包含降低或敲除的B2M、CIITA、TRAC和/或TRBC表达的iPSC或其后代。在原代T细胞或其后代的上下文中，“野生型”或“对照”还意指原代T细胞或其后代，所述原代T细胞或其后代可能含有导致一种或多种MHC I类分子和/或II类分子和/或T细胞受体表达降低的核酸变化，但未经过本公开的实现一种或多种Y染色体基因的表达降低的基因编辑程序。例如，如本文所用，“野生型”或“对照”意指包含降低或敲除的B2M、CIITA和/或TRAC表达的原代T细胞或其后代，但未经过实现一种或多种Y染色体基因的表达降低的基因编辑程序。此外，如本文所用，“野生型”或“对照”意指包含降低或敲除的B2M、CIITA、TRAC和/或TRBC表达的原代T细胞或其后代，但未经过实现一种或多种Y染色体基因的表达降低的基因编辑程序。此外，在原代T细胞或其后代的上下文中，“野生型”或“对照”还意指原代T细胞或其后代，所述原代T细胞或其后代可能含有导致CD47蛋白过表达的核酸变化，但未经过实现一种或多种Y染色体基因的表达降低的基因编辑程序。在一些实施方案中，野生型或对照细胞是起始材料。在一些实施方案中，起始材料以其他方式被修饰或工程化以具有改变的一个或多个基因的表达。在一些实施方案中，“野生型”或“对照”是指具有Y染色体的细胞。
如本文所用，“Y染色体连锁抗原”、“Y染色体抗原”、“组织相容性Y染色体连锁抗原”或“男性特异性抗原”及其变体是指由Y染色体上的基因编码的肽，其能够引发免疫反应。特别地，当存在于MHC分子的上下文中和/或当存在针对所述肽的抗体时，所述肽能够引发免疫反应。Y染色体连锁抗原包括为Y染色体上的基因的抗原部分或由Y染色体上的基因编码的完整蛋白质的抗原。Y染色体连锁抗原的实例包括但不限于Y-连锁原钙粘蛋白11(PCDH11Y)、Y-连锁神经连接蛋白4(NLGN4Y)、H-Y抗原等。
应当注意，权利要求可被草拟为排除任何任选要素。因此，本声明旨在作为在引用权利要求要素时使用诸如“唯一”、“仅”等排他性术语或使用“否定”限制的先行基础。如本领域技术人员在阅读本公开后将显而易见的，在不背离本公开的范围或精神的情况下，本文描述和说明的个别实施方案中的每一个都具有易于与其他若干个实施方案中的任一个的特征分离或组合的离散组分和特征。任何列举的方法可以按照列举的事件的顺序或按照逻辑上可能的任何其他顺序来进行。虽然与本文所述的那些方法和材料相似或相等的任何方法和材料也可用于实践或测试本公开，但是现在描述代表性说明性方法和材料。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本技术所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。在提供值的范围的情况下，应当理解，在该范围的上限与下限之间的每个中介值(intervening value)(除非上下文另外清楚地指出，否则直到下限的单位的十分之一)以及该所述范围内的任何其他所述值或中介值都涵盖在本公开内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在较小范围中，并且也涵盖在本公开内，属于所述范围内的任何明确排除的极限值。在所述范围包括极限值中的一个或两个的情况下，不包括那些被包括的极限值中的一个或两个的范围也包括在本公开中。某些范围在本文中以术语“约”开头的数值呈现。术语“约”在本文中用于为其后的确切数字以及接近或近似于所述术语后的数字的数字提供字面支持。在确定数字是接近还是近似具体列举的数字时，接近或近似的未列举的数字可以是在所呈现的上下文中提供与具体列举的数字的实质等效的数字。术语约在本文中用于意指值的正负百分之十(10％)。例如，“约100”是指90与110之间的任何数字。
本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请都通过引用并入本文，其程度就如每项单独的出版物、专利或专利申请被具体和单独地指示通过引用并入。此外，每项引用的出版物、专利或专利申请通过引用并入本文以公开和描述与引用的所述出版物相关的主题。对任何出版物的引用是针对其在申请日之前的公开内容，并且不应被解释为承认本文所述的本技术由于现有技术而无权先于这种出版物。此外，提供的公布日期可能与实际公布日期不同，这可能需要独立地确认。
在进一步描述本技术前，应当理解本技术不限于描述的特定实施方案，因此当然可发生变化。还应理解，本文所用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并且不意图是限制性的，因为本公开的范围将仅受所附权利要求书限制。还应理解，本文所用的标题不是限制性的并且仅旨在引导读者，但主题通常适用于本文公开的技术。
III.具体实施方式
A.低免疫原性细胞
在一些实施方案中，本公开提供了工程化的(例如，修饰的和遗传修饰的)细胞，其包含相对于未改变或未修饰的野生型或对照细胞降低的一种或多种Y染色体基因以及MHCI类和/或MHC II类人白细胞抗原分子的表达和编码CD47的第一外源多核苷酸，其中所述工程化细胞由原代T细胞或其后代、诱导性多能干细胞(iPSC)或其后代繁殖。在一些实施方案中，细胞能够逃避活化NK细胞介导的和/或基于抗体的免疫反应。
在一些实施方案中，细胞是诱导性多能干细胞、其任何类型的分化细胞、原代免疫细胞和任何组织的其他原代细胞。在一些实施方案中，分化细胞是心脏细胞及其亚群、神经细胞及其亚群、脑内皮细胞及其亚群、多巴胺能神经元及其亚群、神经胶质祖细胞及其亚群、内皮细胞及其亚群、甲状腺细胞及其亚群、肝细胞及其亚群、胰岛细胞及其亚群或视网膜色素上皮细胞及其亚群。在一些实施方案中，分化细胞是T细胞及其亚群、NK细胞及其亚群以及内皮细胞及其亚群。在一些实施方案中，原代免疫细胞是T细胞及其亚群和NK细胞及其亚群。在一些实施方案中，原代组织细胞包括原代内皮细胞及其亚群。
在一些实施方案中，本文所述的细胞包含相对于未改变或未修饰的野生型或对照细胞降低的一个或多个Y染色体基因以及MHC I类和/或II类人白细胞抗原分子的表达。在一些实施方案中，本文所述的细胞包含相对于未改变或未修饰的野生型或对照细胞降低的Y-连锁原钙粘蛋白11和/或Y-连锁神经连接蛋白4以及MHC I类和/或II类人白细胞抗原分子的表达。在一些实施方案中，本文所述的细胞包含相对于未改变或未修饰的野生型或对照细胞降低的Y-连锁原钙粘蛋白11以及MHC I类和/或II类人白细胞抗原分子的表达。在一些实施方案中，本文所述的细胞包含相对于未改变或未修饰的野生型或对照细胞降低的Y-连锁神经连接蛋白4以及MHC I类和/或II类人白细胞抗原分子的表达。在一些实施方案中，本文所述的细胞包含相对于未改变或未修饰的野生型或对照细胞降低的Y-连锁原钙粘蛋白11和Y-连锁神经连接蛋白4以及MHC I类和/或II类人白细胞抗原分子的表达。在一些实施方案中，本文所述的细胞包含编码CD47的第一外源多核苷酸。在一些实施方案中，本文所述的细胞包含编码CAR的第二外源多核苷酸。
在一些实施方案中，本公开涉及多能干细胞(例如，多能干细胞和诱导性多能干细胞(iPSC))、来源于此类多能干细胞的分化细胞(诸如但不限于T细胞、NK细胞、心脏细胞、神经细胞、脑内皮细胞、多巴胺能神经元、神经胶质祖细胞、内皮细胞、甲状腺细胞、肝细胞、胰岛细胞和视网膜色素上皮细胞)和原代细胞(诸如但不限于原代T细胞和原代NK细胞)。在一些实施方案中，多能干细胞、来源于其的分化细胞(诸如T细胞、NK细胞、心脏细胞、神经细胞、脑内皮细胞、多巴胺能神经元、神经胶质祖细胞、内皮细胞、甲状腺细胞、肝细胞、胰岛细胞和视网膜色素上皮细胞)和原代细胞(诸如原代T细胞和原代NK细胞)被工程化以实现降低的一种或多种Y染色体基因以及MHC I类和/或MHC II类人白细胞抗原分子的表达或缺乏所述表达，并且在一些情况下，实现降低的T细胞受体(TCR)复合物的表达或缺乏所述表达。在一些实施方案中，除了降低的一种或多种Y染色体基因以及MHC I类和/或MHC II类人白细胞抗原分子的表达或缺乏所述表达之外，低免疫(HIP)T细胞和原代T细胞过表达CD47和嵌合抗原受体(CAR)，并且具有降低的T细胞受体(TCR)复合物的表达或缺乏所述表达。在一些实施方案中，CAR包含与选自由CD19、CD20、CD22、CD38、CD123、CD138和BCMA组成的组的任一个结合的抗原结合结构域。在一些实施方案中，CAR是CD19特异性CAR。在一些实施方案中，CAR是CD20特异性CAR。在一些实施方案中，CAR是CD22特异性CAR。在一些情况下，CAR是CD38特异性CAR。在一些实施方案中，CAR是CD123特异性CAR。在一些实施方案中，CAR是CD138特异性CAR。在一些情况下，CAR是BCMA特异性CAR。在一些实施方案中，CAR是双特异性CAR。在一些实施方案中，双特异性CAR是CD19/CD20双特异性CAR。在一些实施方案中，双特异性CAR是CD19/CD22双特异性CAR。在一些实施方案中，双特异性CAR是BCMA/CD38双特异性CAR。在一些实施方案中，所述细胞表达CD19特异性CAR和不同的CAR，诸如但不限于CD20特异性CAR、CD22特异性CAR、CD38特异性CAR、CD123特异性CAR、CD138特异性CAR和BCMA特异性CAR。在一些实施方案中，所述细胞表达CD20特异性CAR和不同的CAR，诸如但不限于CD22特异性CAR、CD38特异性CAR、CD123特异性CAR、CD138特异性CAR、CD19特异性CAR和BCMA特异性CAR。在一些实施方案中，所述细胞表达CD22特异性CAR和不同的CAR，诸如但不限于CD19特异性CAR、CD20特异性CAR、CD38特异性CAR、CD123特异性CAR、CD138特异性CAR和BCMA特异性CAR。在一些实施方案中，所述细胞表达CD38特异性CAR和不同的CAR，诸如但不限于CD20特异性CAR、CD22特异性CAR、CD18特异性CAR、CD123特异性CAR、CD138特异性CAR和BCMA特异性CAR。在一些实施方案中，所述细胞表达CD123特异性CAR和不同的CAR，诸如但不限于CD20特异性CAR、CD22特异性CAR、CD38特异性CAR、CD19特异性CAR、CD138特异性CAR和BCMA特异性CAR。在一些实施方案中，所述细胞表达CD138特异性CAR和不同的CAR，诸如但不限于CD20特异性CAR、CD22特异性CAR、CD38特异性CAR、CD123特异性CAR、CD19特异性CAR和BCMA特异性CAR。在一些实施方案中，所述细胞表达BCMA特异性CAR和不同的CAR，诸如但不限于CD20特异性CAR、CD22特异性CAR、CD38特异性CAR、CD123特异性CAR、CD138特异性CAR和CD19特异性CAR。
在一些实施方案中，来源于iPSC的低免疫细胞，诸如但不限于T细胞、NK细胞、心脏细胞、神经细胞、脑内皮细胞、多巴胺能神经元、神经胶质祖细胞、内皮细胞、甲状腺细胞、肝细胞、胰岛细胞和视网膜色素上皮细胞过表达CD47，并且包括PCDH11Y基因的基因组修饰或敲除或敲低。在一些实施方案中，来源于iPSC的低免疫细胞，诸如但不限于T细胞、NK细胞、心脏细胞、神经细胞、脑内皮细胞、多巴胺能神经元、神经胶质祖细胞、内皮细胞、甲状腺细胞、肝细胞、胰岛细胞和视网膜色素上皮细胞过表达CD47，并且包括NLGN4Y基因的基因组修饰或敲除或敲低。在一些实施方案中，来源于iPSC的低免疫细胞，诸如但不限于T细胞、NK细胞、心脏细胞、神经细胞、脑内皮细胞、多巴胺能神经元、神经胶质祖细胞、内皮细胞、甲状腺细胞、肝细胞、胰岛细胞和视网膜色素上皮细胞过表达CD47，并且包括B2M基因的基因组修饰或敲除或敲低。在一些实施方案中，来源于iPSC的低免疫细胞，诸如但不限于T细胞、NK细胞、心脏细胞、神经细胞、脑内皮细胞、多巴胺能神经元、神经胶质祖细胞、内皮细胞、甲状腺细胞、肝细胞、胰岛细胞和视网膜色素上皮细胞过表达CD47，并且包括CIITA基因的基因组修饰或敲除或敲低。在一些实施方案中，细胞是PCDH11Y-/-、NLGN4Y-/-、B2M-/-、CIITA-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是PCDH11Y-/-、NLGN4Y-/-、B2M-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是PCDH11Y插入缺失/插入缺失、NLGN4Y插入缺失/插入缺失、B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是PCDH11Y插入缺失/插入缺失、NLGN4Y插入缺失/插入缺失、B2M插入缺失/插入缺失、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是PCDH11Y敲低、NLGN4Y敲低、B2M敲低、CIITA敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是PCDH11Y敲低、NLGN4Y敲低、B2M敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，来源于iPSC的低免疫细胞通过分化诱导性多能干细胞(诸如低免疫原性诱导性多能干细胞)产生。在一些实施方案中，与野生型或对照细胞(包括未改变或未修饰的野生型细胞或对照细胞)相比，细胞被修饰或工程化。在一些实施方案中，野生型细胞或对照细胞是起始材料。在一些实施方案中，起始材料以其他方式被修饰或工程化以具有改变的一个或多个基因的表达以生成工程化细胞。
在一些实施方案中，来源于ESC的低免疫细胞，诸如但不限于T细胞、NK细胞、心脏细胞、神经细胞、脑内皮细胞、多巴胺能神经元、神经胶质祖细胞、内皮细胞、甲状腺细胞、肝细胞、胰岛细胞和视网膜色素上皮细胞过表达CD47，并且包括PCDH11Y基因的基因组修饰或敲除或敲低。在一些实施方案中，来源于ESC的低免疫细胞，诸如但不限于T细胞、NK细胞、心脏细胞、神经细胞、脑内皮细胞、多巴胺能神经元、神经胶质祖细胞、内皮细胞、甲状腺细胞、肝细胞、胰岛细胞和视网膜色素上皮细胞过表达CD47，并且包括NLGN4Y基因的基因组修饰或敲除或敲低。在一些实施方案中，来源于ESC的低免疫细胞，诸如但不限于T细胞、NK细胞、心脏细胞、神经细胞、脑内皮细胞、多巴胺能神经元、神经胶质祖细胞、内皮细胞、甲状腺细胞、肝细胞、胰岛细胞和视网膜色素上皮细胞过表达CD47，并且包括B2M基因的基因组修饰或敲除或敲低。在一些实施方案中，来源于ESC的低免疫细胞，诸如但不限于T细胞、NK细胞、心脏细胞、神经细胞、脑内皮细胞、多巴胺能神经元、神经胶质祖细胞、内皮细胞、甲状腺细胞、肝细胞、胰岛细胞和视网膜色素上皮细胞过表达CD47，并且包括CIITA基因的基因组修饰或敲除或敲低。在一些实施方案中，细胞是PCDH11Y-/-、NLGN4Y-/-、B2M-/-、CIITA-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是PCDH11Y-/-、NLGN4Y-/-、B2M-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是PCDH11Y插入缺失/插入缺失、NLGN4Y插入缺失/插入缺失、B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是PCDH11Y插入缺失/插入缺失、NLGN4Y插入缺失/插入缺失、B2M插入缺失/插入缺失、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是PCDH11Y敲低、NLGN4Y敲低、B2M敲低、CIITA敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是PCDH11Y敲低、NLGN4Y敲低、B2M敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，来源于iPSC的低免疫细胞通过分化多能干细胞(诸如低免疫原性胚胎干细胞)产生。在一些实施方案中，与野生型或对照细胞(包括未改变或未修饰的野生型细胞或对照细胞)相比，细胞被修饰或工程化。在一些实施方案中，野生型细胞或对照细胞是起始材料。在一些实施方案中，起始材料以其他方式被修饰或工程化以具有改变的一个或多个基因的表达以生成工程化细胞。
在一些实施方案中，来源于iPSC和原代T细胞的低免疫(HIP)T细胞过表达CD47和嵌合抗原受体(CAR)，并且包括PCDH11Y基因的基因组修饰或敲除或敲低。在一些实施方案中，来源于iPSC和原代T细胞的低免疫(HIP)T细胞过表达CD47和嵌合抗原受体(CAR)，并且包括NLGN4Y基因的基因组修饰或敲除或敲低。在一些实施方案中，来源于iPSC和原代T细胞的低免疫(HIP)T细胞过表达CD47和嵌合抗原受体(CAR)，并且包括B2M基因的基因组修饰或敲除或敲低。在一些实施方案中，来源于iPSC和原代T细胞的低免疫(HIP)T细胞过表达CD47，并且包括CIITA基因的基因组修饰或敲除或敲低。在一些实施方案中，来源于iPSC和原代T细胞的低免疫(HIP)T细胞过表达CD47和CAR，并且包括TRAC基因的基因组修饰或敲除或敲低。在一些实施方案中，来源于iPSC和原代T细胞的低免疫(HIP)T细胞过表达CD47和CAR，并且包括TRB基因的基因组修饰或敲除或敲低。在一些实施方案中，来源于iPSC和原代T细胞的低免疫(HIP)T细胞过表达CD47和CAR，并且包括选自由PCDH11Y、NLGN4Y、B2M、CIITA、TRAC和TRB基因组成的组的一个或多个基因组修饰或敲除或敲低。在一些实施方案中，来源于iPSC和原代T细胞的低免疫(HIP)T细胞过表达CD47和CAR，并且包括PCDH11Y、NLGN4Y、B2M、CIITA、TRAC和TRB基因的基因组修饰或敲除或敲低。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的B2M-/-、CIITA-/-、TRAC-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的B2M-/-、TRAC-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，低免疫(HIP)T细胞通过分化诱导性多能干细胞(诸如低免疫原性诱导性多能干细胞)产生。在一些实施方案中，与野生型或对照细胞(包括未改变或未修饰的野生型细胞或对照细胞)相比，细胞被修饰或工程化。在一些实施方案中，野生型细胞或对照细胞是起始材料。在一些实施方案中，起始材料以其他方式被修饰或工程化以具有改变的一个或多个基因的表达以生成工程化细胞。
在一些实施方案中，来源于iPSC和原代T细胞的低免疫(HIP)T细胞是也表达CAR的PCDH11Y-/-、NLGN4Y-/-、B2M-/-、CIITA-/-、TRB-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，来源于iPSC和原代T细胞的低免疫(HIP)T细胞是也表达CAR的PCDH11Y-/-、NLGN4Y-/-、B2M-/-、TRB-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的PCDH11Y-/-、NLGN4Y-/-、B2M-/-、CIITA-/-、TRAC-/-、TRB-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的PCDH11Y-/-、NLGN4Y-/-、B2M-/-、TRAC-/-、TRB-/-、CD47tg细胞。在某些实施方案中，细胞是也表达CAR的PCDH11Y插入缺失/插入缺失、NLGN4Y插入缺失/插入缺失、B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失、CD47tg细胞。在某些实施方案中，细胞是也表达CAR的PCDH11Y插入缺失/插入缺失、NLGN4Y插入缺失/插入缺失、B2M插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失、CD47tg细胞。在某些实施方案中，细胞是也表达CAR的PCDH11Y插入缺失/插入缺失、NLGN4Y插入缺失/插入缺失、B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRB插入缺失/插入缺失、CD47tg细胞。在某些实施方案中，细胞是也表达CAR的PCDH11Y插入缺失/插入缺失、NLGN4Y插入缺失/插入缺失、B2M插入缺失/插入缺失、TRB插入缺失/插入缺失、CD47tg细胞。在某些实施方案中，细胞是也表达CAR的PCDH11Y插入缺失/插入缺失、NLGN4Y插入缺失/插入缺失、B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失、TRB插入缺失/插入缺失、CD47tg细胞。在某些实施方案中，细胞是也表达CAR的PCDH11Y插入缺失/插入缺失、NLGN4Y插入缺失/插入缺失、B2M插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失、TRB插入缺失/插入缺失、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的PCDH11Y敲低、NLGN4Y敲低、B2M敲低、CIITA敲低、TRAC敲低、CD47tg细胞。在某些实施方案中，细胞是也表达CAR的PCDH11Y敲低、NLGN4Y敲低、B2M敲低、CIITA敲低、TRB敲低、CD47tg细胞。在某些实施方案中，细胞是也表达CAR的PCDH11Y敲低、NLGN4Y敲低、B2M敲低、CIITA敲低、TRAC敲低、TRB敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是也表达CAR的PCDH11Y敲低、NLGN4Y敲低、B2M敲低、TRAC敲低、CD47tg细胞。在某些实施方案中，细胞是也表达CAR的PCDH11Y敲低、NLGN4Y敲低、B2M敲低、TRB敲低、CD47tg细胞。在某些实施方案中，细胞是也表达CAR的PCDH11Y敲低、NLGN4Y敲低、B2M敲低、TRAC敲低、TRB敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，与野生型或对照细胞(包括未改变或未修饰的野生型细胞或对照细胞)相比，细胞被修饰或工程化。在一些实施方案中，野生型细胞或对照细胞是起始材料。在一些实施方案中，起始材料以其他方式被修饰或工程化以具有改变的一个或多个基因的表达以生成工程化细胞。
在一些实施方案中，所述工程化或修饰的细胞是多能干细胞、诱导性多能干细胞、从此类多能干细胞和诱导性多能干细胞分化的NK细胞、从此类多能干细胞和诱导性多能干细胞分化的T细胞、或原代T细胞。原代T细胞的非限制性实例包括CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、未致敏T细胞、调控性T(Treg)细胞、非调控性T细胞、Th1细胞、Th2细胞、Th9细胞、Th17细胞、T滤泡辅助(Tfh)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、效应T(Teff)细胞、中央记忆T(Tcm)细胞、效应记忆T(Tem)细胞、表达CD45RA的效应记忆T细胞(TEMRA细胞)、组织驻留记忆(Trm)细胞、虚拟记忆T细胞、先天记忆T细胞、记忆干细胞(Tsc)、γδT细胞和T细胞的任何其他亚型。在一些实施方案中，原代T细胞选自包括细胞毒性T细胞、辅助T细胞、记忆T细胞、调控性T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞及其组合的组。NK细胞和原代NK细胞的非限制性实例包括未成熟NK细胞和成熟NK细胞。在一些实施方案中，与野生型或对照细胞(包括未改变或未修饰的野生型细胞或对照细胞)相比，细胞被修饰或工程化。在一些实施方案中，野生型细胞或对照细胞是起始材料。在一些实施方案中，起始材料以其他方式被修饰或工程化以具有改变的一个或多个基因的表达以生成工程化细胞。
在一些实施方案中，原代T细胞来自一个或多个供体受试者的原代T细胞库，所述供体受试者不同于受体受试者(例如，被施用细胞的患者)。原代T细胞可获自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50、100个或更多个供体受试者并汇集在一起。原代T细胞可获得自1个或多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、20个或更多个、50个或更多个或100个或更多个供体受试者并汇集在一起。在一些实施方案中，从一个或多个个体收获原代T细胞，并且在一些情况下，原代T细胞或原代T细胞库在体外培养。在一些实施方案中，原代T细胞或原代T细胞库被工程化以外源表达CD47，并且在体外培养。
在某些实施方案中，原代T细胞或原代T细胞库被工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)。CAR可以是本领域技术人员已知的任一种。可用的CAR包括与选自包括CD19、CD20、CD22、CD38、CD123、CD138和BCMA的组的抗原结合的那些。在一些情况下，CAR与FDA批准的CAR-T细胞疗法中使用的CAR(诸如但不限于替沙仑赛(tisagenlecleucel)和阿基仑赛(axicabtagene ciloleucel)中使用的那些)或正在临床试验中研究的其他CAR相同或等效。
在一些实施方案中，原代T细胞或原代T细胞库被工程化以与未修饰的原代T细胞相比表现出降低的内源性T细胞受体的表达。在某些实施方案中，原代T细胞或原代T细胞库被工程化以与未修饰的原代T细胞相比表现出降低的CTLA-4、PD-1或CTLA-4和PD-1两者的表达。对包括T细胞的细胞进行遗传修饰的方法在例如WO2020/018620和WO2016/183041中详细描述，其公开内容通过引用整体并入本文，包括表格、附录、序列表和附图。
在一些实施方案中，CAR-T细胞包含CAR，所述CAR选自包括以下的组：(a)第一代CAR，其包含抗原结合结构域、跨膜结构域和信号传导结构域；(b)第二代CAR，其包含抗原结合结构域、跨膜结构域和至少两个信号传导结构域；(c)第三代CAR，其包含抗原结合结构域、跨膜结构域和至少三个信号传导结构域；(d)第四代CAR，其包含抗原结合结构域、跨膜结构域、三个或四个信号传导结构域，以及在CAR的成功信号传导后诱导细胞因子基因表达的结构域。
在一些实施方案中，CAR-T包含CAR，所述CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域和一个或多个信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR还包含接头。在一些实施方案中，CAR包含CD19抗原结合结构域。在一些实施方案中，CAR包含CD20抗原结合结构域。在一些实施方案中，CAR包含CD22结合结构域。在一些实施方案中，CAR包含BCMA结合结构域。在一些实施方案中，CAR包含CD28或CD8α跨膜结构域。在一些实施方案中，CAR包含CD8α信号肽。在一些实施方案中，CAR包含Whitlow接头GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:15)。在一些实施方案中，CAR的抗原结合结构域选自包括但不限于以下的组：(a)靶向肿瘤细胞特征性抗原的抗原结合结构域；(b)靶向T细胞特征性抗原的抗原结合结构域；(c)靶向自身免疫性疾病/病症和/或炎性疾病/病症特征性抗原的抗原结合结构域；(d)靶向衰老细胞特征性抗原的抗原结合结构域；(e)靶向感染性疾病特征性抗原的抗原结合结构域；和(f)与细胞的细胞表面抗原结合的抗原结合结构域。
在一些实施方案中，CAR还包含一个或多个接头。scFv的形式通常是由柔性肽序列或“接头”连接的两个可变结构域，方向为VH-接头-VL或VL-接头-VH。根据说明书，本领域技术人员已知的任何合适的接头都可以用于CAR。合适的接头的实例包括但不限于基于GS的接头序列和Whitlow接头GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:15)。在一些实施方案中，接头是GS或gly-ser接头。示例性gly-ser多肽接头包含氨基酸序列Ser(Gly4Ser)n，以及(Gly4Ser)n和/或(Gly4Ser3)n。在一些实施方案中，n＝1。在一些实施方案中，n＝2。在一些实施方案中，n＝3，即Ser(Gly4Ser)3。在一些实施方案中，n＝4，即Ser(Gly4Ser)4。在一些实施方案中，n＝5。在一些实施方案中，n＝6。在一些实施方案中，n＝7。在一些实施方案中，n＝8。在一些实施方案中，n＝9。在一些实施方案中，n＝10。另一个示例性gly-ser多肽接头包含氨基酸序列Ser(Gly4Ser)n。在一些实施方案中，n＝1。在一些实施方案中，n＝2。在一些实施方案中，n＝3。在另一个实施方案中，n＝4。在一些实施方案中，n＝5。在一些实施方案中，n＝6。另一个示例性gly-ser多肽接头包含(Gly4Ser)n。在一些实施方案中，n＝1。在一些实施方案中，n＝2。在一些实施方案中，n＝3。在一些实施方案中，n＝4。在一些实施方案中，n＝5。在一些实施方案中，n＝6。另一个示例性gly-ser多肽接头包含(Gly3Ser)n。在一些实施方案中，n＝1。在一些实施方案中，n＝2。在一些实施方案中，n＝3。在一些实施方案中，n＝4。在另一个实施方案中，n＝5。在又另一个实施方案中，n＝6。另一个示例性gly-ser多肽接头包含(Gly4Ser3)n。在一些实施方案中，n＝1。在一些实施方案中，n＝2。在一些实施方案中，n＝3。在一些实施方案中，n＝4。在一些实施方案中，n＝5。在一些实施方案中，n＝6。另一个示例性gly-ser多肽接头包含(Gly3Ser)n。在一些实施方案中，n＝1。在一些实施方案中，n＝2。在一些实施方案中，n＝3。在一些实施方案中，n＝4。在另一个实施方案中，n＝5。在又另一个实施方案中，n＝6。
在一些实施方案中，抗原结合结构域选自包括以下的组：抗体、其抗原结合部分或片段、scFv和Fab。在一些实施方案中，抗原结合结构域与CD19、CD20、CD22、CD38、CD123、CD138或BCMA结合。在一些实施方案中，抗原结合结构域是抗CD19 scFv，诸如但不限于FMC63。在一些实施方案中，抗原结合结构域是抗CD20 scFv。在一些实施方案中，抗原结合结构域是抗CD22 scFv。在一些实施方案中，抗原结合结构域是抗BCMA scFv。
在一些实施方案中，跨膜结构域包括选自包括以下各者的跨膜区的组的跨膜结构域：TCRα、TCRβ、TCRζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD8β、CD9、CD16、CD28、CD45、CD22、CD33、CD34、CD37、CD40、CD40L/CD154、CD45、CD64、CD80、CD86、OX40/CD134、4-1BB/CD137、CD154、FcεRIγ、VEGFR2、FAS、FGFR2B及其功能变体。
在一些实施方案中，CAR的信号传导结构域包括共刺激结构域。例如，信号传导结构域可以含有共刺激结构域。或者，信号传导结构域可以含有一个或多个共刺激结构域。在某些实施方案中，信号传导结构域包括一个共刺激结构域。在其他实施方案中，信号传导结构域包括多个共刺激结构域。在一些情况下，当CAR包含两个或更多个共刺激结构域时，两个共刺激结构域不相同。在一些实施方案中，共刺激结构域包括两个不同的共刺激结构域。在一些实施方案中，所述一个共刺激结构域增强T细胞活化期间的细胞因子产生、CAR-T细胞增殖和/或CAR-T细胞持久性。在一些实施方案中，所述多个共刺激结构域增强T细胞活化期间的细胞因子产生、CAR-T细胞增殖和/或CAR-T细胞持久性。
如本文所述，第四代CAR可以含有抗原结合结构域、跨膜结构域、三个或四个信号传导结构域和在CAR的成功信号传导后诱导细胞因子基因表达的结构域。在一些情况下，细胞因子基因是工程化细胞和/或低免疫原性细胞的内源或外源细胞因子基因。在一些情况下，细胞因子基因编码促炎细胞因子。在一些实施方案中，促炎细胞因子选自包括IL-1、IL-2、IL-9、IL-12、IL-18、TNF、IFN-γ及其功能片段的组。在一些实施方案中，在CAR的成功信号传导后诱导细胞因子基因表达的结构域包含转录因子或其功能结构域或片段。
在一些实施方案中，CAR包含CD3泽塔(CD3ζ)结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能变体。在一些实施方案中，CAR包含(i)CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能变体；和(ii)CD28结构域或4-1BB结构域或其功能变体。在其他实施方案中，CAR包含(i)CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能变体；(ii)CD28结构域或其功能变体；和(iii)4-1BB结构域或CD134结构域或其功能变体。在某些实施方案中，CAR包含(i)CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能变体；(ii)CD28结构域或其功能变体；(iii)4-1BB结构域或CD134结构域或其功能变体；和(iv)细胞因子或共刺激配体转基因。在一些实施方案中，CAR包含(i)抗CD19 scFv；(ii)CD8α铰链和跨膜结构域或其功能变体；(iii)4-1BB共刺激结构域或其功能变体；和(iv)CD3ζ信号传导结构域或其功能变体。
用于引入CAR构建体或产生CAR-T细胞的方法是本领域技术人员众所周知的。详细描述可见于例如Vormittag等人,Curr Opin Biotechnol,2018,53,162-181；和Eyquem等人,Nature,2017,543,113-117。
在一些实施方案中，来源于原代T细胞的细胞包含降低的内源性T细胞受体的表达，例如通过破坏内源性T细胞受体基因(例如，T细胞受体α恒定区(TRAC)或T细胞受体β恒定区(TRB))。在一些实施方案中，将编码如本文所公开的多肽(例如，嵌合抗原受体、CD47或本文公开的另一种致耐受因子)的外源核酸插入在破坏的T细胞受体基因处。在一些实施方案中，将编码多肽的外源核酸插入在TRAC或TRB基因座处。
在一些实施方案中，来源于原代T细胞的细胞包含降低的细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)和/或程序性细胞死亡(PD1)的表达。降低或消除CTLA4、PD1以及CTLA4和PD1两者的表达的方法可以包括本领域技术人员认可的任何方法，诸如但不限于利用罕见切割核酸内切酶的遗传修饰技术和RNA沉默或RNA干扰技术。罕见切割核酸内切酶的非限制性实例包括任何Cas蛋白、TALEN、锌指核酸酶、大范围核酸酶和/或归巢核酸内切酶。在一些实施方案中，将编码如本文所公开的多肽(例如，嵌合抗原受体、CD47或本文公开的另一种致耐受因子)的外源核酸插入在CTLA4和/或PD1基因座处。
在一些实施方案中，将CD47转基因插入到细胞的预选基因座中。在一些实施方案中，将编码CAR的转基因插入到细胞的预选基因座中。在某些实施方案中，将CD47转基因和编码CAR的转基因插入到细胞的预选基因座中。预选基因座可以是安全港或靶标基因座。安全港或靶标基因座的非限制性实例包括但不限于CCR5基因座、PPP1R12C(也称为AAVS1)基因座、CLYBL基因座和Rosa基因座(例如，ROSA26基因座)。靶标基因座的非限制性实例包括但不限于CXCR4基因座、白蛋白基因座、SHS231基因座、F3基因座(也称为CD142)、MICA基因座、MICB基因座、LRP1基因座(也称为CD91基因座)、HMGB1基因座、ABO基因座、RHD基因座、FUT1基因座和KDM5D基因座。可将CD47转基因插入到PPP1R12C(即，AAVS1)或CCR5的内含子1或2中。可将CD47转基因插入到CCR5的外显子1或2或3中。可将CD47转基因插入到CLYBL的内含子2中。可将CD47转基因插入到Ch-4:58,976,613(即，SHS231)中的500bp窗口中。可将CD47转基因插入到上文提及的允许表达外源的安全港或靶标基因座的任何合适区域，包括例如安全港或靶标基因座中的内含子、外显子或编码序列区域。在一些实施方案中，预选基因座选自由B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座和TRB基因座组成的组。在一些实施方案中，预选基因座是B2M基因座。在一些实施方案中，预选基因座是CIITA基因座。在一些实施方案中，预选基因座是TRAC基因座。在一些实施方案中，预选基因座是TRB基因座。
在一些实施方案中，将CD47转基因和编码CAR的转基因插入到相同基因座中。在一些实施方案中，将CD47转基因和编码CAR的转基因插入到不同基因座中。在许多情况下，将CD47转基因插入到安全港或靶标基因座中。在许多情况下，将编码CAR的转基因插入到安全港或靶标基因座中。在一些情况下，将CD47转基因插入到B2M基因座中。在一些情况下，将编码CAR的转基因插入到B2M基因座中。在某些情况下，将CD47转基因插入到CIITA基因座中。在某些情况下，将编码CAR的转基因插入到CIITA基因座中。在特定情况下，将CD47转基因插入到TRAC基因座中。在特定情况下，将编码CAR的转基因插入到TRAC基因座中。在许多其他情况下，将CD47转基因插入到TRB基因座中。在许多其他情况下，将编码CAR的转基因插入到TRB基因座中。在一些实施方案中，将CD47转基因和编码CAR的转基因插入到安全港或靶标基因座(例如，CCR5基因座、CXCR4基因座、PPP1R12C基因座、白蛋白基因座、SHS231基因座、CLYBL基因座、Rosa基因座、F3(CD142)基因座、MICA基因座、MICB基因座、LRP1(CD91)基因座、HMGB1基因座、ABO基因座、RHD基因座、FUT1基因座和KDM5D基因座)中。
在某些实施方案中，将CD47转基因和编码CAR的转基因插入到安全港或靶标基因座中。在某些实施方案中，CD47转基因和编码CAR的转基因受单个启动子控制，并且被插入到安全港或靶标基因座中。在某些实施方案中，CD47转基因和编码CAR的转基因受其自身的启动子控制，并且被插入到安全港或靶标基因座中。在某些实施方案中，将CD47转基因和编码CAR的转基因插入到TRAC基因座中。在某些实施方案中，CD47转基因和编码CAR的转基因受单个启动子控制，并且被插入到TRAC基因座中。在某些实施方案中，CD47转基因和编码CAR的转基因受其自身的启动子控制，并且被插入到TRAC基因座中。在一些实施方案中，将CD47转基因和编码CAR的转基因插入到TRB基因座中。在一些实施方案中，CD47转基因和编码CAR的转基因受单个启动子控制，并且被插入到TRB基因座中。在一些实施方案中，CD47转基因和编码CAR的转基因受其自身的启动子控制，并且被插入到TRB基因座中。在其他实施方案中，将CD47转基因和编码CAR的转基因插入到B2M基因座中。在其他实施方案中，CD47转基因和编码CAR的转基因受单个启动子控制，并且被插入到B2M基因座中。在其他实施方案中，CD47转基因和编码CAR的转基因受其自身的启动子控制，并且被插入到B2M基因座中。在各种实施方案中，将CD47转基因和编码CAR的转基因插入到CIITA基因座中。在各种实施方案中，CD47转基因和编码CAR的转基因受单个启动子控制，并且被插入到CIITA基因座中。在各种实施方案中，CD47转基因和编码CAR的转基因受其自身的启动子控制，并且被插入到CIITA基因座中。
在一些情况下，控制所述任何转基因表达的启动子是组成型启动子。在其他情况下，所述任何转基因的启动子是诱导型启动子。在一些实施方案中，启动子是EF1α启动子。在一些实施方案中，启动子是CAG启动子。在一些实施方案中，CD47转基因和编码CAR的转基因均受组成型启动子控制。在一些实施方案中，CD47转基因和编码CAR的转基因均受诱导型启动子控制。在一些实施方案中，CD47转基因受组成型启动子控制，并且编码CAR的转基因受诱导型启动子控制。在一些实施方案中，CD47转基因受诱导型启动子控制，并且编码CAR的转基因受组成型启动子控制。在各个实施方案中，CD47转基因受EF1α启动子控制，并且编码CAR的转基因受EF1α启动子控制。在一些实施方案中，CD47转基因受CAG启动子控制，并且编码CAR的转基因受CAG启动子控制。在一些实施方案中，CD47转基因受CAG启动子控制，并且编码CAR的转基因受EF1α启动子控制。在一些实施方案中，CD47转基因受EF1α启动子控制，并且编码CAR的转基因受CAG启动子控制。在一些实施方案中，CD47转基因和编码CAR的转基因的表达受单个EF1α启动子控制。在一些实施方案中，CD47转基因和编码CAR的转基因的表达受单个CAG启动子控制。
在另一个实施方案中，本文公开的本公开涉及多能干细胞(例如，多能干细胞和诱导性多能干细胞(iPSC))、来源于此类多能干细胞的分化细胞(例如，低免疫(HIP)T细胞、NK细胞、心脏细胞、神经细胞、脑内皮细胞、多巴胺能神经元、神经胶质祖细胞、内皮细胞、甲状腺细胞、肝细胞、胰岛细胞和视网膜色素上皮细胞)和原代T细胞，其过表达CD47(诸如外源表达CD47蛋白)，具有降低的MHC I类和/或MHC II类人白细胞抗原分子的表达或缺乏所述表达，并且具有降低的T细胞受体(TCR)复合物的表达或缺乏所述表达。在一些实施方案中，低免疫(HIP)T细胞和原代T细胞过表达CD47(诸如外源表达CD47蛋白)，具有降低的一种或多种MHC I类和/或MHC II类人白细胞抗原分子的表达或缺乏所述表达，并且具有降低的T细胞受体(TCR)复合物的表达或缺乏所述表达。
在一些实施方案中，多能干细胞(例如，多能干细胞和诱导性多能干细胞(iPSC))、来源于此类多能干细胞的分化细胞(例如，低免疫(HIP)T细胞、T细胞、NK细胞、心脏细胞、神经细胞、脑内皮细胞、多巴胺能神经元、神经胶质祖细胞、内皮细胞、甲状腺细胞、肝细胞、胰岛细胞和视网膜色素上皮细胞)和原代T细胞过表达CD47并且包括B2M基因的基因组修饰。在一些实施方案中，多能干细胞、来源于此类多能干细胞的分化细胞和原代T细胞过表达CD47，并且包括CIITA基因的基因组修饰。在一些实施方案中，多能干细胞、来源于此类多能干细胞的分化细胞(诸如但不限于T细胞、NK细胞、心脏细胞、神经细胞、脑内皮细胞、多巴胺能神经元、神经胶质祖细胞、内皮细胞、甲状腺细胞、肝细胞、胰岛细胞和视网膜色素上皮细胞)是PCDH11Y-/-、NLGN4Y-/-、B2M-/-、CIITA-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是PCDH11Y-/-、NLGN4Y-/-、B2M-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是PCDH11Y插入缺失/插入缺失、NLGN4Y插入缺失/插入缺失、B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是PCDH11Y插入缺失/插入缺失、NLGN4Y插入缺失/插入缺失、B2M插入缺失/插入缺失、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是PCDH11Y敲低、NLGN4Y敲低、B2M敲低、CIITA敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是PCDH11Y敲低、NLGN4Y敲低、B2M敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，多能干细胞、从此类多能干细胞分化的T细胞和原代T细胞过表达CD47，并且包括PCDH11Y基因的基因组修饰。在一些实施方案中，多能干细胞、从此类多能干细胞分化的T细胞和原代T细胞过表达CD47，并且包括NLGN4Y基因的基因组修饰。在一些实施方案中，多能干细胞、从此类多能干细胞分化的T细胞和原代T细胞过表达CD47，并且包括TRAC基因的基因组修饰。在一些实施方案中，多能干细胞、从此类多能干细胞分化的T细胞和原代T细胞过表达CD47，并且包括TRB基因的基因组修饰。在一些实施方案中，多能干细胞、从此类多能干细胞分化的T细胞和原代T细胞过表达CD47，并且包括选自由PCDH11Y、NLGN4Y、B2M、CIITA、TRAC和TRB基因组成的组的一个或多个基因组修饰。在一些实施方案中，多能干细胞、从此类多能干细胞分化的T细胞和原代T细胞过表达CD47，并且包括PCDH11Y、NLGN4Y、B2M、CIITA和TRAC基因的基因组修饰。在一些实施方案中，多能干细胞、从此类多能干细胞分化的T细胞和原代T细胞过表达CD47，并且包括PCDH11Y、NLGN4Y、B2M、CIITA和TRB基因的基因组修饰。在一些实施方案中，多能干细胞、从此类多能干细胞分化的T细胞和原代T细胞过表达CD47，并且包括PCDH11Y、NLGN4Y、B2M、CIITA、TRAC和TRB基因的基因组修饰。在某些实施方案中，多能干细胞、来源于此类多能干细胞的分化细胞和原代T细胞是PCDH11Y-/-、NLGN4Y-/-、B2M-/-、CIITA-/-、TRAC-/-、CD47tg细胞。在某些实施方案中，细胞是PCDH11Y-/-、NLGN4Y-/-、B2M-/-、TRAC-/-、CD47tg细胞。在某些实施方案中，细胞是PCDH11Y-/-、NLGN4Y-/-、B2M-/-、CIITA-/-、TRB-/-、CD47tg细胞。在某些实施方案中，细胞是PCDH11Y-/-、NLGN4Y-/-、B2M-/-、TRB-/-、CD47tg细胞。在某些实施方案中，细胞是PCDH11Y-/-、NLGN4Y-/-、B2M-/-、CIITA-/-、TRAC-/-、TRB-/-、CD47tg细胞。在某些实施方案中，细胞是PCDH11Y-/-、NLGN4Y-/-、B2M-/-、TRAC-/-、TRB-/-、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是PCDH11Y插入缺失/插入缺失、NLGN4Y插入缺失/插入缺失、B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是PCDH11Y插入缺失/插入缺失、NLGN4Y插入缺失/插入缺失、B2M插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是PCDH11Y插入缺失/插入缺失、NLGN4Y插入缺失/插入缺失、B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRB插入缺失/插入缺失、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是PCDH11Y插入缺失/插入缺失、NLGN4Y插入缺失/插入缺失、B2M插入缺失/插入缺失、TRB插入缺失/插入缺失、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是PCDH11Y插入缺失/插入缺失、NLGN4Y插入缺失/插入缺失、B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失、TRB插入缺失/插入缺失、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是PCDH11Y插入缺失/插入缺失、NLGN4Y插入缺失/插入缺失、B2M插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失、TRB插入缺失/插入缺失、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是PCDH11Y敲低、NLGN4Y敲低、B2M敲低、CIITA敲低、TRAC敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是PCDH11Y敲低、NLGN4Y敲低、B2M敲低、CIITA敲低、TRB敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是PCDH11Y敲低、NLGN4Y敲低、B2M敲低、CIITA敲低、TRAC敲低、TRB敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是PCDH11Y敲低、NLGN4Y敲低、B2M敲低、TRAC敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是PCDH11Y敲低、NLGN4Y敲低、B2M敲低、TRB敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，细胞是PCDH11Y敲低、NLGN4Y敲低、B2M敲低、TRAC敲低、TRB敲低、CD47tg细胞。在一些实施方案中，所述工程化或修饰的细胞是多能干细胞(例如，胚胎干细胞或诱导性多能干细胞)、从此类多能干细胞分化的T细胞或原代T细胞。原代T细胞的非限制性实例包括CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、未致敏T细胞、调控性T(Treg)细胞、非调控性T细胞、Th1细胞、Th2细胞、Th9细胞、Th17细胞、T滤泡辅助(Tfh)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、效应T(Teff)细胞、中央记忆T(Tcm)细胞、效应记忆T(Tem)细胞、表达CD45RA的效应记忆T细胞(TEMRA细胞)、组织驻留记忆(Trm)细胞、虚拟记忆T细胞、先天记忆T细胞、记忆干细胞(Tsc)、γδT细胞和T细胞的任何其他亚型。在一些实施方案中，与野生型或对照细胞(包括未改变或未修饰的野生型细胞或对照细胞)相比，细胞被修饰或工程化。在一些实施方案中，野生型细胞或对照细胞是起始材料。在一些实施方案中，起始材料以其他方式被修饰或工程化以具有改变的一个或多个基因的表达以生成工程化细胞。
在一些实施方案中，将CD47转基因插入到细胞的预选基因座中。预选基因座可以是安全港或靶标基因座。安全港或靶标基因座的非限制性实例包括CCR5基因座、CXCR4基因座、PPP1R12C基因座、白蛋白基因座、SHS231基因座、CLYBL基因座、Rosa基因座、F3(CD142)基因座、MICA基因座、MICB基因座、LRP1(CD91)基因座、HMGB1基因座、ABO基因座、RHD基因座、FUT1基因座和KDM5D基因座。在一些实施方案中，预选基因座是TRAC基因座。在一些实施方案中，将CD47转基因插入到安全港或靶标基因座(例如，CCR5基因座、CXCR4基因座、PPP1R12C基因座、白蛋白基因座、SHS231基因座、CLYBL基因座、Rosa基因座、F3(CD142)基因座、MICA基因座、MICB基因座、LRP1(CD91)基因座、HMGB1基因座、ABO基因座、RHD基因座、FUT1基因座和KDM5D基因座)中。在某些实施方案中，将CD47转基因插入到B2M基因座中。在某些实施方案中，将CD47转基因插入到B2M基因座中。在某些实施方案中，将CD47转基因插入到TRAC基因座中。在某些实施方案中，将CD47转基因插入到TRB基因座中。
在一些情况下，CD47转基因的表达受组成型启动子控制。在其他情况下，CD47转基因的表达受诱导型启动子控制。在一些实施方案中，启动子是EF1阿尔法(EF1α)启动子。在一些实施方案中，启动子是CAG启动子。
在又另一个实施方案中，本文公开的本公开涉及多能干细胞(例如，多能干细胞和诱导性多能干细胞(iPSC))、来源于此类多能干细胞的T细胞(例如，低免疫(HIP)T细胞)和原代T细胞，其具有降低的一种或多种Y染色体基因以及MHC I类和/或MHC II类人白细胞抗原分子的表达或缺乏所述表达，并且具有降低的T细胞受体(TCR)复合物的表达或缺乏所述表达。在一些实施方案中，细胞具有降低的一种或多种Y染色体基因和MHC I类抗原分子、MHC II类抗原分子和TCR复合物的表达或缺乏所述表达。
在一些实施方案中，多能干细胞(例如，iPSC)、来源于此类多能干细胞的分化细胞(例如，分化自此类多能干细胞的T细胞、NK细胞、心脏细胞、神经细胞、脑内皮细胞、多巴胺能神经元、神经胶质祖细胞、内皮细胞、甲状腺细胞、肝细胞、胰岛细胞和视网膜色素上皮细胞)，以及原代T细胞包括PCDH11Y基因的基因组修饰或敲低。在一些实施方案中，多能干细胞(例如，iPSC)、来源于此类多能干细胞的分化细胞(例如，分化自此类多能干细胞的T细胞、NK细胞、心脏细胞、神经细胞、脑内皮细胞、多巴胺能神经元、神经胶质祖细胞、内皮细胞、甲状腺细胞、肝细胞、胰岛细胞和视网膜色素上皮细胞)，以及原代T细胞包括NLGN4Y基因的基因组修饰或敲低。在一些实施方案中，多能干细胞(例如，iPSC)、来源于此类多能干细胞的分化细胞(例如，分化自此类多能干细胞的T细胞、NK细胞、心脏细胞、神经细胞、脑内皮细胞、多巴胺能神经元、神经胶质祖细胞、内皮细胞、甲状腺细胞、肝细胞、胰岛细胞和视网膜色素上皮细胞)，以及原代T细胞包括B2M基因的基因组修饰或敲低。在一些实施方案中，多能干细胞(例如，iPSC)、来源于此类多能干细胞的分化细胞(例如，分化自此类多能干细胞的T细胞、NK细胞、心脏细胞、神经细胞、脑内皮细胞、多巴胺能神经元、神经胶质祖细胞、内皮细胞、甲状腺细胞、肝细胞、胰岛细胞和视网膜色素上皮细胞)，以及原代T细胞包括CIITA基因的基因组修饰或敲低。在一些实施方案中，包括iPSC和来源于此类多能干细胞的分化细胞(诸如但不限于T细胞、NK细胞、心脏细胞、神经细胞、脑内皮细胞、多巴胺能神经元、神经胶质祖细胞、内皮细胞、甲状腺细胞、肝细胞、胰岛细胞和视网膜色素上皮细胞)的细胞是PCDH11Y-/-、NLGN4Y-/-、B2M-/-、CIITA-/-细胞。在一些实施方案中，细胞是PCDH11Y-/-、NLGN4Y-/-、B2M-/-细胞。在一些实施方案中，细胞是PCDH11Y插入缺失/插入缺失、NLGN4Y插入缺失/插入缺失、B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失细胞。在一些实施方案中，细胞是PCDH11Y插入缺失/插入缺失、NLGN4Y插入缺失/插入缺失、B2M插入缺失/插入缺失细胞。在一些实施方案中，细胞是PCDH11Y敲低、NLGN4Y敲低、B2M敲低、CIITA敲低细胞。在一些实施方案中，细胞是PCDH11Y敲低、NLGN4Y敲低、B2M敲低细胞。在一些实施方案中，多能干细胞(例如，ESC或iPSC)、从此类多能干细胞分化的T细胞和原代T细胞包括PCDH11Y基因的基因组修饰或敲低。在一些实施方案中，多能干细胞(例如，ESC或iPSC)、从此类多能干细胞分化的T细胞和原代T细胞包括NLGN4Y基因的基因组修饰或敲低。在一些实施方案中，多能干细胞(例如，ESC或iPSC)、从此类多能干细胞分化的T细胞和原代T细胞包括TRAC基因的基因组修饰或敲低。在一些实施方案中，多能干细胞(例如，iPSC)、从此类多能干细胞分化的T细胞和原代T细胞包括TRB基因的基因组修饰或敲低。在一些实施方案中，多能干细胞(例如，iPSC)、从此类多能干细胞分化的T细胞和原代T细胞包括选自由B2M、CIITA和TRAC基因组成的组的一个或多个基因组修饰或敲低。在一些实施方案中，多能干细胞(例如，iPSC)、从此类多能干细胞分化的T细胞和原代T细胞包括选自由PCDH11Y、NLGN4Y、B2M、CIITA和TRB基因组成的组的一个或多个基因组修饰或敲低。在一些实施方案中，多能干细胞(例如，iPSC)、从此类多能干细胞分化的T细胞和原代T细胞包括选自由PCDH11Y、NLGN4Y、B2M、CIITA、TRAC和TRB基因组成的组的一个或多个基因组修饰或敲低。在某些实施方案中，包括iPSC、从此类iPSC分化的T细胞和原代T细胞的细胞是PCDH11Y-/-、NLGN4Y-/-、B2M-/-、CIITA-/-、TRAC-/-细胞。在某些实施方案中，包括iPSC、从此类iPSC分化的T细胞和原代T细胞的细胞是PCDH11Y-/-、NLGN4Y-/-、B2M-/-、TRAC-/-细胞。在某些实施方案中，包括iPSC、从此类iPSC分化的T细胞和原代T细胞的细胞是PCDH11Y-/-、NLGN4Y-/-、B2M-/-、CIITA-/-、TRB-/-细胞。在某些实施方案中，包括iPSC、从此类iPSC分化的T细胞和原代T细胞的细胞是PCDH11Y-/-、NLGN4Y-/-、B2M-/-、TRB-/-细胞。在某些实施方案中，包括iPSC、从此类iPSC分化的T细胞和原代T细胞的细胞是PCDH11Y-/-、NLGN4Y-/-、B2M-/-、CIITA-/-、TRAC-/-、TRB-/-细胞。在某些实施方案中，包括iPSC、从此类iPSC分化的T细胞和原代T细胞的细胞是PCDH11Y-/-、NLGN4Y-/-、B2M-/-、TRAC-/-、TRB-/-细胞。在一些实施方案中，包括iPSC、从此类iPSC分化的T细胞和原代T细胞的细胞是PCDH11Y插入缺失/插入缺失、NLGN4Y插入缺失/插入缺失、B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失细胞。在一些实施方案中，包括iPSC、从此类iPSC分化的T细胞和原代T细胞的细胞是PCDH11Y插入缺失/插入缺失、NLGN4Y插入缺失/插入缺失、B2M插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失细胞。在一些实施方案中，包括iPSC、从此类iPSC分化的T细胞和原代T细胞的细胞是PCDH11Y插入缺失/插入缺失、NLGN4Y插入缺失/插入缺失、B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRB插入缺失/插入缺失细胞。在一些实施方案中，包括iPSC、从此类iPSC分化的T细胞和原代T细胞的细胞是PCDH11Y插入缺失/插入缺失、NLGN4Y插入缺失/插入缺失、B2M插入缺失/插入缺失、TRB插入缺失/插入缺失细胞。在一些实施方案中，包括iPSC、从此类iPSC分化的T细胞和原代T细胞的细胞是PCDH11Y插入缺失/插入缺失、NLGN4Y插入缺失/插入缺失、B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失、TRB插入缺失/插入缺失细胞。在一些实施方案中，包括iPSC、从此类iPSC分化的T细胞和原代T细胞的细胞是PCDH11Y插入缺失/插入缺失、NLGN4Y插入缺失/插入缺失、B2M插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失、TRB插入缺失/插入缺失细胞。在一些实施方案中，包括ESC、iPSC、从此类ESC、iPSC分化的T细胞和原代T细胞的细胞是PCDH11Y敲低、NLGN4Y敲低、B2M敲低、CIITA敲低、TRAC敲低细胞。在一些实施方案中，包括iPSC、从此类iPSC分化的T细胞和原代T细胞的细胞是PCDH11Y敲低、NLGN4Y敲低、B2M敲低、CIITA敲低、TRB敲低细胞。在一些实施方案中，包括ESC、iPSC、从此类ESC、iPSC分化的T细胞和原代T细胞的细胞是PCDH11Y敲低、NLGN4Y敲低、B2M敲低、CIITA敲低、TRAC敲低、TRB敲低细胞。在一些实施方案中，包括ESC、iPSC、从此类ESC、iPSC分化的T细胞和原代T细胞的细胞是PCDH11Y敲低、NLGN4Y敲低、B2M敲低、TRAC敲低细胞。在一些实施方案中，包括iPSC、从此类iPSC分化的T细胞和原代T细胞的细胞是PCDH11Y敲低、NLGN4Y敲低、B2M敲低、TRB敲低细胞。在一些实施方案中，包括ESC、iPSC、从此类ESC、iPSC分化的T细胞和原代T细胞的细胞是PCDH11Y敲低、NLGN4Y敲低、B2M敲低、TRAC敲低、TRB敲低细胞。在一些实施方案中，所述修饰的细胞是多能干细胞、诱导性多能干细胞、从此类多能干细胞和诱导性多能干细胞分化的T细胞或原代T细胞。原代T细胞的非限制性实例包括CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、未致敏T细胞、调控性T(Treg)细胞、非调控性T细胞、Th1细胞、Th2细胞、Th9细胞、Th17细胞、T滤泡辅助(Tfh)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、效应T(Teff)细胞、中央记忆T(Tcm)细胞、效应记忆T(Tem)细胞、表达CD45RA的效应记忆T细胞(TEMRA细胞)、组织驻留记忆(Trm)细胞、虚拟记忆T细胞、先天记忆T细胞、记忆干细胞(Tsc)、γδT细胞和T细胞的任何其他亚型。
在一些实施方案中，与野生型或对照细胞(包括未改变或未修饰的野生型细胞或对照细胞)相比，细胞被修饰或工程化。在一些实施方案中，野生型细胞或对照细胞是起始材料。在一些实施方案中，起始材料以其他方式被修饰或工程化以具有降低的一种或多种Y染色体基因(包括但不限于PCDH11Y和/或NLGN4Y)的表达或缺乏所述表达。PCDH11Y和/或NLGN4Y表达的降低可例如通过直接靶向PCDH11Y和NLGN4Y基因来实现；和/或通过靶向对其转录、翻译或蛋白质稳定性至关重要的组分来实现。
本公开的细胞表现出降低的MHC I类抗原分子、MHC II类抗原分子和/或TCR复合物的表达或缺乏所述表达。降低一种或多种MHC I类和/或II类HLA分子表达可例如通过以下方式中的一种或多种来实现：(1)直接靶向多态HLA等位基因(HLA-A、HLA-B、HLA-C)和MHC-II基因；(2)去除B2M，这将阻止所有MHC-I分子的表面运输；(3)去除CIITA，这将阻止所有MHC-II分子的表面运输；以及/或者(4)缺失对HLA表达至关重要的MHC增强体组分，诸如LRC5、RFX5、RFXANK、RFXAP、IRFl、NF-Y(包括NFY-A、NFY-B、NFY-C)和CIITA。
在一些实施方案中，HLA表达受以下干扰：靶向个别HLA(例如，敲除、敲低或降低HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DQ和/或HLA-DR的表达)、靶向HLA表达的转录调控子(例如，敲除、敲低或降低NLRC5、CIITA、RFX5、RFXAP、RFXANK、NFY-A、NFY-B、NFY-C和/或IRF-1的表达)、阻断MHC I类分子的表面运输(例如，敲除、敲低或降低B2M和/或TAP1的表达)以及/或者用HLA-Razor靶向(参见例如WO2016183041)。
在一些实施方案中，本文公开的细胞(包括但不限于多能干细胞、诱导性多能干细胞、来源于此类干细胞的分化细胞和原代T细胞)不表达对应于MHC-I分子和/或MHC-II分子的一种或多种人白细胞抗原分子(例如，HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DQ和/或HLA-DR)，因此表征为低免疫原性。例如，在某些实施方案中，所公开的多能干细胞和诱导性多能干细胞已经被修饰，使得干细胞或由其制备的分化干细胞不表达以下MHC-I分子中的一种或多种或者表现出降低的以下MHC-I分子中的一种或多种的表达：HLA-A、HLA-B和HLA-C。在一些实施方案中，HLA-A、HLA-B和HLA-C中的一种或多种可以从细胞“敲除”。具有敲除HLA-A基因、HLA-B基因和/或HLA-C基因的细胞可能表现出降低或消除的每个敲除基因的表达。
在一些实施方案中，允许通过靶向HLA基因中的保守区域来同时缺失所有MHC I类等位基因的指导RNA、shRNA、siRNA或miRNA被鉴定为HLA Razor。在一些实施方案中，gRNA是CRISPR系统的一部分。在替代实施方案中，gRNA是TALEN系统的一部分。在一些实施方案中，靶向HLA中已鉴定的保守区域的HLA Razor在WO2016183041中描述。在一些实施方案中，利用多个靶向已鉴定的保守区域的HLA Razor。通常应理解，靶向HLA中的保守区域的任何指导物、siRNA、shRNA或miRNA都可以充当HLA Razor。
所提供的方法可用于灭活或消除细胞(诸如但不限于多能干细胞、分化细胞和原代T细胞)中的MHC I类分子表达和/或MHC II类分子表达。在一些实施方案中，利用罕见切割核酸内切酶(例如，CRISPR/Cas、TALEN、锌指核酸酶、大范围核酸酶和归巢核酸内切酶系统)的基因组编辑技术还用于降低或消除细胞中涉及免疫反应的基因的表达(例如，通过缺失涉及免疫反应的基因的基因组DNA或通过将基因组DNA插入到此类基因中，使得基因表达受到影响)。在某些实施方案中，基因组编辑技术或其他基因调节技术用于在人细胞中插入耐受诱导因子，使它们和由其制备的分化细胞是低免疫原性细胞。因此，工程化和/或低免疫原性细胞具有降低或消除的MHC I分子表达和/或MHC II分子表达。在一些实施方案中，细胞在受体受试者中是非免疫原性的(例如，不诱导先天和/或适应性免疫反应)。
在一些实施方案中，细胞包含修饰以增加CD47和选自由以下组成的组的一种或多种因子的表达：DUX4、CD24、CD27、CD46、CD55、CD59、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1抑制剂、IL-10、IL-35、IL-39、FasL、CCL21、CCL22、Mfge8和Serpinb9。
在一些实施方案中，细胞包含一个或多个靶多核苷酸序列的基因组修饰，所述修饰调控MHC I类分子、MHC II类分子或MHC I类和MHC II类分子的表达。在一些实施方案中，基因编辑系统用于修饰一个或多个靶多核苷酸序列。在一些实施方案中，RNAi系统用于敲低一个或多个靶多核苷酸序列的表达。在一些实施方案中，靶向多核苷酸序列是选自包括B2M、CIITA和NLRC5的组的一个或多个。在一些实施方案中，细胞包含对B2M基因的遗传编辑修饰。在一些实施方案中，细胞包含对CIITA基因的遗传编辑修饰。在一些实施方案中，细胞包含对NLRC5基因的遗传编辑修饰。在一些实施方案中，细胞包含对B2M和CIITA基因的遗传编辑修饰。在一些实施方案中，细胞包含对B2M和NLRC5基因的遗传编辑修饰。在一些实施方案中，细胞包含对CIITA和NLRC5基因的遗传编辑修饰。在多个实施方案中，细胞包含对B2M、CIITA和NLRC5基因的遗传编辑修饰。在某些实施方案中，细胞的基因组已被改变以减少或缺失HLA表达的关键组分。在一些实施方案中，与野生型或对照细胞(包括未改变或未修饰的野生型细胞或对照细胞)相比，细胞被修饰或工程化。在一些实施方案中，野生型细胞或对照细胞是起始材料。在一些实施方案中，起始材料以其他方式被修饰或工程化以具有改变的一个或多个基因的表达以生成工程化细胞。
在一些实施方案中，本公开提供了一种细胞(例如，干细胞、诱导性多能干细胞、分化细胞(诸如心脏细胞、神经细胞、脑内皮细胞、多巴胺能神经元、神经胶质祖细胞、内皮细胞、甲状腺细胞、肝细胞、胰岛细胞或视网膜色素上皮细胞)、造血干细胞、原代NK细胞、CAR-NK细胞、原代T细胞或CAR-T细胞)或其群体，其包含基因组，所述基因组中的基因已被编辑以缺失一段连续的基因组DNA，从而降低或消除MHC I类分子在细胞或其群体中的表面表达。在某些实施方案中，本公开提供了一种细胞(例如，干细胞、诱导性多能干细胞、分化细胞(诸如心脏细胞、神经细胞、脑内皮细胞、多巴胺能神经元、神经胶质祖细胞、内皮细胞、甲状腺细胞、肝细胞、胰岛细胞或视网膜色素上皮细胞)、造血干细胞、原代NK细胞、CAR-NK细胞、原代T细胞或CAR-T细胞)或其群体，其包含基因组，所述基因组中的基因已被编辑以缺失一段连续的基因组DNA，从而降低或消除MHC II类分子在细胞或其群体中的表面表达。在多个实施方案中，本公开提供了一种细胞(例如，干细胞、诱导性多能干细胞、分化细胞(诸如心脏细胞、神经细胞、脑内皮细胞、多巴胺能神经元、神经胶质祖细胞、内皮细胞、甲状腺细胞、肝细胞、胰岛细胞或视网膜色素上皮细胞)、造血干细胞、原代NK细胞、CAR-NK细胞、原代T细胞或CAR-T细胞)或其群体，其包含基因组，所述基因组中的一个或多个基因已被编辑以缺失一段连续的基因组DNA，从而降低或消除MHC II类分子在细胞或其群体中的表面表达。
在某些实施方案中，通过靶向和缺失一段连续的基因组DNA来调节一种或多种MHCI分子和/或MHC II分子(包括一种或多种MHC I类和/或II类HLA分子)的表达，从而降低或消除选自由B2M、CIITA和NLRC5组成的组的靶基因的表达。在一些实施方案中，本文描述了遗传编辑的细胞(例如，修饰的人细胞)，其包含外源CD47蛋白和灭活或修饰的CIITA基因序列，并且在一些情况下，包含灭活或修饰B2M基因序列的额外基因修饰。在一些实施方案中，本文描述了遗传编辑的细胞，其包含外源CD47蛋白和灭活或修饰的CIITA基因序列，并且在一些情况下，包含灭活或修饰NLRC5基因序列的额外基因修饰。在一些实施方案中，本文描述了遗传编辑的细胞，其包含外源CD47蛋白和灭活或修饰的B2M基因序列，并且在一些情况下，包含灭活或修饰NLRC5基因序列的额外基因修饰。在一些实施方案中，本文描述了遗传编辑的细胞，其包含外源CD47蛋白和灭活或修饰的B2M基因序列，并且在一些情况下，包含灭活或修饰CIITA基因序列和NLRC5基因序列的额外基因修饰。
本文提供了细胞，其表现出一个或多个靶向多核苷酸序列的修饰，所述修饰调控以下中的任一种的表达：(a)MHC I抗原分子，(b)MHC II抗原分子，(c)TCR复合物，(d)MHC I和II抗原分子两者，以及(e)MHC I和II抗原分子和TCR复合物。在某些实施方案中，修饰包括增加CD47的表达。在一些实施方案中，细胞包括外源或重组CD47多肽。在某些实施方案中，修饰包括嵌合抗原受体的表达。在一些实施方案中，细胞包含外源或重组嵌合抗原受体多肽。
在一些实施方案中，细胞包括一个或多个靶向多核苷酸序列的基因组修饰，所述修饰调控一种或多种MHC I抗原分子、MHC II抗原分子和/或TCR复合物的表达。在一些实施方案中，基因编辑系统用于修饰一个或多个靶向多核苷酸序列。在一些实施方案中，多核苷酸序列靶向选自由B2M、CIITA、TRAC和TRB组成的组的一个或多个基因。在某些实施方案中，T细胞(例如，从低免疫原性iPSC分化的T细胞和原代T细胞)的基因组已被改变以减少或缺失HLA和TCR表达的关键组分，例如HLA-A抗原、HLA-B抗原、HLA-C抗原、HLA-DP抗原、HLA-DQ抗原、HLA-DR抗原、TCR-α和TCR-β。
在一些实施方案中，本公开提供了一种细胞或其群体，其包含基因组，所述基因组中的基因已被编辑以缺失一段连续的基因组DNA，从而降低或消除MHC I类分子在细胞或其群体中的表面表达。在某些实施方案中，本公开提供了一种细胞或其群体，其包含基因组，所述基因组中的基因已被编辑以缺失一段连续的基因组DNA，从而降低或消除MHC II类分子在细胞或其群体中的表面表达。在某些实施方案中，本公开提供了一种细胞或其群体，其包含基因组，所述基因组中的基因已被编辑以缺失一段连续的基因组DNA，从而降低或消除TCR分子在细胞或其群体中的表面表达。在多个实施方案中，本公开提供了一种细胞或其群体，其包含基因组，所述基因组中的一个或多个基因已被编辑以缺失一段连续的基因组DNA，从而降低或消除一种或多种MHC I类和II类分子和TCR复合物分子在细胞或其群体中的表面表达。
在一些实施方案中，本文所述的细胞和方法包括基因组编辑人细胞以切割CIITA基因序列以及编辑此类细胞的基因组以改变一个或多个额外靶多核苷酸序列，诸如但不限于PCDH11Y、NLGN4Y、B2M、TRAC和TRB。在一些实施方案中，本文所述的细胞和方法包括基因组编辑人细胞以切割B2M基因序列以及编辑此类细胞的基因组以改变一个或多个额外靶多核苷酸序列，诸如但不限于PCDH11Y、NLGN4Y、CIITA、TRAC和TRB。在一些实施方案中，本文所述的细胞和方法包括基因组编辑人细胞以切割TRAC基因序列以及编辑此类细胞的基因组以改变一个或多个额外靶多核苷酸序列，诸如但不限于PCDH11Y、NLGN4Y、B2M、CIITA和TRB。在一些实施方案中，本文所述的细胞和方法包括基因组编辑人细胞以切割TRB基因序列以及编辑此类细胞的基因组以改变一个或多个额外靶多核苷酸序列，诸如但不限于PCDH11Y、NLGN4Y、B2M、CIITA和TRAC。
本文提供了低免疫原性干细胞，其包含相对于野生型干细胞降低的PCDH11Y和/或NLGN4Y以及HLA-A、HLA-B、HLA-C、CIITA、TCR-α和TCR-β的表达，所述低免疫原性干细胞还包含一组外源多核苷酸，其包含编码CD47的第一外源多核苷酸和编码嵌合抗原受体(CAR)的第二外源多核苷酸，其中第一和/或第二外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因的特定基因座中。本文还提供了低免疫原性原代T细胞(包括原代T细胞的任何亚型)，其包含相对于野生型原代T细胞降低的PCDH11Y和/或NLGN4Y以及HLA-A、HLA-B、HLA-C、CIITA、TCR-α和TCR-β的表达，所述低免疫原性干细胞还包含一组外源多核苷酸，其包含编码CD47的第一外源多核苷酸和编码嵌合抗原受体(CAR)的第二外源多核苷酸，其中第一和/或第二外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因的特定基因座中。本文另外提供了从低免疫原性诱导性多能干细胞分化的低免疫原性T细胞，其包含相对于野生型原代T细胞降低的PCDH11Y和/或NLGN4Y以及HLA-A、HLA-B、HLA-C、CIITA、TCR-α和TCR-β的表达，所述低免疫原性干细胞还包含一组外源多核苷酸，其包含编码CD47的第一外源多核苷酸和编码嵌合抗原受体(CAR)的第二外源多核苷酸，其中第一和/或第二外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因的特定基因座中。
在一些实施方案中，所述工程化细胞群在施用于患者后逃避NK细胞介导的细胞毒性。在一些实施方案中，工程化细胞群通过NK细胞的一个或多个亚群逃避NK细胞介导的细胞毒性。在一些实施方案中，工程化细胞群在施用于患者后受到保护而免于NK细胞(包括未成熟和/或成熟NK细胞)的细胞裂解。在一些实施方案中，工程化细胞群在施用于患者后逃避巨噬细胞吞噬。在一些实施方案中，工程化细胞群在施用于患者后不诱导对细胞的先天和/或适应性免疫反应。
在一些实施方案中，本文所述的细胞包含安全开关。本文所用的术语“安全开关”是指用于控制感兴趣基因或蛋白质的表达的系统，当所述感兴趣基因或蛋白质下调或上调时，导致例如通过宿主免疫系统的识别来产生细胞的清除或死亡。安全开关可以被设计成在发生不良临床事件时由外源分子触发。可以通过调控DNA、RNA和蛋白质水平的表达来设计安全开关。安全开关包括允许响应于不良事件而控制细胞活性的蛋白质或分子。在一个实施方案中，安全开关是“杀伤开关”，其以无活性状态表达，并且在通过选择性的外部提供的剂活化开关时对表达安全开关的细胞是致命的。在一个实施方案中，安全开关基因相对于构建体中的感兴趣基因是顺式作用的。安全开关的活化引起细胞通过凋亡或坏死单独杀伤自身或杀伤自身和邻近细胞。在一些实施方案中，本文所述的细胞(例如，干细胞、诱导性多能干细胞、造血干细胞、原代细胞或分化细胞，包括但不限于T细胞、CAR-T细胞、NK细胞和/或CAR-NK细胞)包含安全开关。
在一些实施方案中，安全开关包含抑制或阻断CD47与SIRPα的相互作用的治疗剂。在一些方面，CD47-SIRPα阻断剂是中和、阻断、拮抗或干扰CD47、SIRPα或两者的细胞表面表达的剂。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂抑制或阻断CD47、SIRPα或两者的相互作用。在一些实施方案中，CD47-SIRPα阻断剂(例如，CD47-SIRPα阻断剂、抑制剂、还原剂、拮抗剂、中和剂或干扰剂)包括选自包括以下的组的剂：结合CD47的抗体或其片段、结合CD47的双特异性抗体、结合CD47的免疫细胞因子融合蛋白、含有CD47的融合蛋白、结合SIRPα的抗体或其片段、结合SIRPα的双特异性抗体、结合SIRPα的免疫细胞因子融合蛋白、含有SIRPα的融合蛋白及其组合。
在一些实施方案中，本文所述的细胞包含“自杀基因”(或“自杀开关”)。如果低免疫原性细胞以不期望的方式生长和分裂，则自杀基因会引起它们的死亡。自杀基因消融途径包括基因转移载体中的自杀基因，所述自杀基因编码仅在被指定化合物活化时才会导致细胞杀伤的蛋白质。自杀基因可以编码选择性地将无毒化合物转化成高毒性代谢物的酶。在一些实施方案中，本文所述的细胞(例如，干细胞、诱导性多能干细胞、造血干细胞、原代细胞或分化细胞，包括但不限于T细胞、CAR-T细胞、NK细胞和/或CAR-NK细胞)包含自杀基因。
在一些实施方案中，所述工程化细胞群在施用于受体受试者后引发降低水平的免疫活化或不引发免疫活化。在一些实施方案中，细胞在受体受试者中引发降低水平的全身性TH1活化或不引发全身性TH1活化。在一些实施方案中，细胞在受体受试者中引发降低水平的外周血单核细胞(PBMC)的免疫活化或不引发PBMC的免疫活化。在一些实施方案中，细胞在施用于受体受试者后引发降低水平的针对细胞的供体特异性IgG抗体或不引发所述供体特异性IgG抗体。在一些实施方案中，细胞在受体受试者中引发降低水平的针对细胞的IgM和IgG抗体产生或不引发所述IgM和IgG抗体产生。在一些实施方案中，细胞在施用于受体受试者后引发降低水平的细胞的细胞毒性T细胞杀伤。
B.CIITA
在一些实施方案中，本文公开的技术通过靶向和调节(例如，降低或消除)II类反式活化因子(CIITA)的表达来调节(例如，降低或消除)MHC II基因的表达。在一些实施方案中，使用基因编辑系统(例如，CRISPR/Cas系统)进行调节。
CIITA是LR或核苷酸结合结构域(NBD)富亮氨酸重复序列(LRR)蛋白家族的成员，并且通过与MHC增强体缔合来调控MHC II的转录。
在一些实施方案中，本公开的靶多核苷酸序列是CIITA的变体。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是CIITA的同源物。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是CIITA的直向同源物。
在一些实施方案中，降低或消除的CIITA的表达降低或消除以下MHC II类分子中的一种或多种的表达：HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ和HLA-DR。
在一些实施方案中，本文所述的细胞在编码CIITA蛋白的基因座处包含基因修饰。换句话说，细胞在CIITA基因座处包含遗传修饰。在一些情况下，编码CIITA蛋白的核苷酸序列在RefSeq.No.NM_000246.4和NCBI Genbank No.U18259中列出。在一些情况下，CIITA基因座在NCBI Gene ID No.4261中描述。在某些情况下，CIITA的氨基酸序列被描绘为NCBIGenBank No.AAA88861.1。CIITA蛋白和基因座的额外描述可见于Uniprot No.P33076、HGNCRef.No.7067和OMIM Ref.No.600005。
在一些实施方案中，本文概述的工程化和/或低免疫原性细胞包含靶向CIITA基因的遗传修饰。在一些实施方案中，通过罕见切割核酸内切酶靶向CIITA基因的遗传修饰包括Cas蛋白或编码Cas蛋白的多核苷酸，以及用于特异性靶向CIITA基因的至少一个指导核糖核酸序列。在一些实施方案中，用于特异性靶向CIITA基因的至少一个指导核糖核酸序列选自由WO2016183041(其通过引用并入本文)的表12的SEQ ID NO:5184-36352组成的组。在一些实施方案中，细胞在受体受试者中诱导先天和/或适应性免疫反应的能力降低。在一些实施方案中，将编码如本文所公开的多肽(例如，嵌合抗原受体、CD47或本文公开的另一种致耐受因子)的外源核酸插入在CIITA基因处。
在一些实施方案中，本文概述的工程化和/或低免疫原性细胞包含CIITA表达的敲除，使得细胞是CIITA-/-。在一些实施方案中，本文概述的工程化和/或低免疫原性细胞将插入缺失引入CIITA基因座中，使得细胞是CIITA插入缺失/插入缺失。在一些实施方案中，本文概述的工程化和/或低免疫原性细胞包含CIITA表达的敲低，使得细胞是CIITA敲低。
测试CIITA基因是否已灭活的测定是已知的并且在本文中描述。在一些实施方案中，通过PCR进行的CIITA基因的所得遗传修饰和HLA-II表达的降低可以通过FACS分析进行测定。在另一个实施方案中，使用细胞裂解物的蛋白质印迹来检测CIITA蛋白表达，所述裂解物用针对CIITA蛋白的抗体进行探测。在另一个实施方案中，逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)用于确认灭活遗传修饰的存在。
C.B2M
在一些实施方案中，本文公开的技术通过靶向和调节(例如，降低或消除)辅助链B2M的表达来调节(例如，降低或消除)MHC-I基因的表达。在一些实施方案中，使用基因编辑系统(例如，CRISPR/Cas系统)进行调节。
通过调节(例如，降低或缺失)B2M的表达，MHC-I分子的表面运输被阻断并且细胞被赋予低免疫原性。在一些实施方案中，细胞在受体受试者中诱导先天和/或适应性免疫反应的能力降低。
在一些实施方案中，本公开的靶多核苷酸序列是B2M的变体。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是B2M的同源物。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是B2M的直向同源物。
在一些实施方案中，降低或消除的B2M的表达降低或消除以下MHC I分子中的一种或多种的表达：HLA-A、HLA-B和HLA-C。
在一些实施方案中，本文所述的细胞在编码B2M蛋白的基因座处包含基因修饰。换句话说，细胞在B2M基因座处包含遗传修饰。在一些情况下，编码B2M蛋白的核苷酸序列在RefSeq.No.NM_004048.4和Genbank No.AB021288.1中列出。在一些情况下，B2M基因座描述于NCBI Gene ID No.567中。在某些情况下，B2M的氨基酸序列被描绘为NCBI GenBankNo.BAA35182.1。B2M蛋白和基因座的额外描述可见于Uniprot No.P61769、HGNCRef.No.914和OMIM Ref.No.109700。
在一些实施方案中，本文概述的工程化和/或低免疫原性细胞包含靶向B2M基因的遗传修饰。在一些实施方案中，通过罕见切割核酸内切酶靶向B2M基因的遗传修饰包括Cas蛋白或编码Cas蛋白的多核苷酸，以及用于特异性靶向B2M基因的至少一个指导核糖核酸序列。在一些实施方案中，用于特异性靶向B2M基因的至少一个指导核糖核酸序列选自由WO2016183041(其通过引用并入本文)的表15的SEQ ID NO:81240-85644组成的组。在一些实施方案中，将编码如本文所公开的多肽(例如，嵌合抗原受体、CD47或本文公开的另一种致耐受因子)的外源核酸插入在B2M基因处。
测试B2M基因是否已灭活的测定是已知的并且在本文中描述。在一些实施方案中，通过PCR进行的B2M基因的所得遗传修饰和HLA-I表达的降低可以通过FACS分析进行测定。在另一个实施方案中，使用细胞裂解物的蛋白质印迹来检测B2M蛋白表达，所述裂解物用针对B2M蛋白的抗体进行探测。在另一个实施方案中，逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)用于确认灭活遗传修饰的存在。
在一些实施方案中，本文概述的工程化和/或低免疫原性细胞包含B2M表达的敲除，使得细胞是B2M-/-。在一些实施方案中，本文概述的工程化和/或低免疫原性细胞将插入缺失引入B2M基因座中，使得细胞是B2M插入缺失/插入缺失。在一些实施方案中，本文概述的工程化和/或低免疫原性细胞包含B2M表达的敲低，使得细胞是B2M敲低。
D.NLRC5
在某些实施方案中，本文公开的技术通过靶向和调节(例如，降低或消除)含有5/NOD27/CLR16.1的NLR家族CARD结构域(NLRC5)的表达来调节(例如，降低或消除)MHC-I基因的表达。在一些实施方案中，使用基因编辑系统(例如，CRISPR/Cas系统)进行调节。
NLRC5是MHC-I介导的免疫反应的关键调控子，并且与CIITA类似，NLRC5高度可被IFN-γ诱导并且可易位到细胞核中。NLRC5活化MHC-I基因的启动子并且诱导MHC-I以及参与MHC-I抗原呈递的相关基因的转录。
在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是NLRC5的变体。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是NLRC5的同源物。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是NLRC5的直向同源物。
在一些实施方案中，降低或消除的NLRC5的表达降低或消除以下MHC I分子中的一种或多种的表达：HLA-A、HLA-B和HLA-C。
在一些实施方案中，本文概述的细胞包含靶向NLRC5基因的遗传修饰。在一些实施方案中，通过罕见切割核酸内切酶靶向NLRC5基因的遗传修饰包括Cas蛋白或编码Cas蛋白的多核苷酸，以及用于特异性靶向NLRC5基因的至少一个指导核糖核酸序列。在一些实施方案中，用于特异性靶向NLRC5基因的至少一个指导核糖核酸序列选自由WO2016183041的附录3或表14的SEQ ID NO:36353-81239组成的组，其公开内容通过引用整体并入本文。
测试NLRC5基因是否已灭活的测定是已知的并且在本文中描述。在一些实施方案中，通过PCR进行的NLRC5基因的所得遗传修饰和HLA-I表达的降低可以通过FACS分析进行测定。在另一个实施方案中，使用细胞裂解物的蛋白质印迹来检测NLRC5蛋白表达，所述裂解物用针对NLRC5蛋白的抗体进行探测。在另一个实施方案中，逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)用于确认灭活遗传修饰的存在。
在一些实施方案中，本文概述的工程化和/或低免疫原性细胞包含NLRC5表达的敲除，使得细胞是NLRC5-/-。在一些实施方案中，本文概述的工程化和/或低免疫原性细胞将插入缺失引入NLRC5基因座中，使得细胞是NLRC5插入缺失/插入缺失。在一些实施方案中，本文概述的工程化和/或低免疫原性细胞包含NLRC5表达的敲低，使得细胞是NLRC5敲低。
E.TRAC
在某些实施方案中，本文公开的技术通过靶向和调节(例如，降低或消除)T细胞受体α链恒定区的表达来调节(例如，降低或消除)TCR基因(包括TRAC基因)的表达。在一些实施方案中，使用基因编辑系统(例如，CRISPR/Cas系统)进行调节。
通过调节(例如，降低或缺失)TRAC的表达，TCR分子的表面运输被阻断。在一些实施方案中，细胞在受体受试者中诱导先天和/或适应性免疫反应的能力也降低。
在一些实施方案中，本公开的靶多核苷酸序列是TRAC的变体。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是TRAC的同源物。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是TRAC的直向同源物。
在一些实施方案中，降低或消除的TRAC的表达降低或消除了TCR表面表达。
在一些实施方案中，细胞(诸如但不限于多能干细胞、诱导性多能干细胞、从诱导性多能干细胞分化的T细胞、原代T细胞和来源于原代T细胞的细胞)在编码TRAC蛋白的基因座处包含基因修饰。换句话说，细胞在TRAC基因座处包含遗传修饰。在一些情况下，编码TRAC蛋白的核苷酸序列在Genbank No.X02592.1中列出。在一些情况下，TRAC基因座在RefSeq.No.NG_001332.3和NCBI Gene IDNo.28755中描述。在某些情况下，TRAC的氨基酸序列被描绘为Uniprot No.P01848。TRAC蛋白和基因座的额外描述可见于UniprotNo.P01848、HGNC Ref.No.12029和OMIM Ref.No.186880。
在一些实施方案中，本文概述的工程化和/或低免疫原性细胞包含靶向TRAC基因的遗传修饰。在一些实施方案中，通过罕见切割核酸内切酶靶向TRAC基因的遗传修饰包括Cas蛋白或编码Cas蛋白的多核苷酸，以及用于特异性靶向TRAC基因的至少一个指导核糖核酸序列。在一些实施方案中，用于特异性靶向TRAC基因的至少一个指导核糖核酸序列选自由US20160348073(其通过引用并入本文)的SEQ ID NO:532-609和9102-9797组成的组。
测试TRAC基因是否已灭活的测定是已知的并且在本文中描述。在一些实施方案中，通过PCR进行的TRAC基因的所得遗传修饰和TCR表达的降低可以通过FACS分析进行测定。在另一个实施方案中，使用细胞裂解物的蛋白质印迹来检测TRAC蛋白表达，所述裂解物用针对TRAC蛋白的抗体进行探测。在另一个实施方案中，逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)用于确认灭活遗传修饰的存在。
在一些实施方案中，本文概述的工程化和/或低免疫原性细胞包含TRAC表达的敲除，使得细胞是TRAC-/-。在一些实施方案中，本文概述的工程化和/或低免疫原性细胞将插入缺失引入TRAC基因座中，使得细胞是TRAC插入缺失/插入缺失。在一些实施方案中，本文概述的工程化和/或低免疫原性细胞包含TRAC表达的敲低，使得细胞是TRAC敲低。
F.TRB
在某些实施方案中，本文公开的技术通过靶向和调节(例如，降低或消除)T细胞受体β链恒定区的表达来调节(例如，降低或消除)TCR基因的表达，所述TCR基因包括编码T细胞抗原受体β链的基因(例如，TRB、TRBC或TCRB基因)。在一些实施方案中，使用基因编辑系统(例如，CRISPR/Cas系统)进行调节。
通过调节(例如，降低或缺失)TRB的表达，TCR分子的表面运输被阻断。在一些实施方案中，细胞在受体受试者中诱导先天和/或适应性免疫反应的能力也降低。
在一些实施方案中，本公开的靶多核苷酸序列是TRB的变体。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是TRB的同源物。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是TRB的直向同源物。
在一些实施方案中，降低或消除的TRB的表达降低或消除了TCR表面表达。
在一些实施方案中，细胞(诸如但不限于多能干细胞、诱导性多能干细胞、从诱导性多能干细胞分化的T细胞、原代T细胞和来源于原代T细胞的细胞)在编码TRB蛋白的基因座处包含基因修饰。换句话说，细胞在TRB基因座处包含遗传修饰。在一些情况下，编码TRB蛋白的核苷酸序列在UniProt No.P0DSE2中列出。在一些情况下，TRB基因座在RefSeq.No.NG_001333.2和NCBI Gene ID No.6957中描述。在某些情况下，TRB的氨基酸序列被描绘为Uniprot No.P01848。TRB蛋白和基因座的额外描述可见于GenBankNo.L36092.2、Uniprot No.P0DSE2和HGNC Ref.No.12155。
在一些实施方案中，本文概述的工程化和/或低免疫原性细胞包含靶向TRB基因的遗传修饰。在一些实施方案中，通过罕见切割核酸内切酶靶向TRB基因的遗传修饰包括Cas蛋白或编码Cas蛋白的多核苷酸，以及用于特异性靶向TRB基因的至少一个指导核糖核酸序列。在一些实施方案中，用于特异性靶向TRB基因的至少一个指导核糖核酸序列选自由US20160348073(其通过引用并入本文)的SEQ ID NO:610-765和9798-10532组成的组。
测试TRB基因是否已灭活的测定是已知的并且在本文中描述。在一些实施方案中，通过PCR进行的TRB基因的所得遗传修饰和TCR表达的降低可以通过FACS分析进行测定。在另一个实施方案中，使用细胞裂解物的蛋白质印迹来检测TRB蛋白表达，所述裂解物用针对TRB蛋白的抗体进行探测。在另一个实施方案中，逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)用于确认灭活遗传修饰的存在。
在一些实施方案中，本文概述的工程化和/或低免疫原性细胞包含TRB表达的敲除，使得细胞是TRB-/-。在一些实施方案中，本文概述的工程化和/或低免疫原性细胞将插入缺失引入TRB基因座中，使得细胞是TRB插入缺失/插入缺失。在一些实施方案中，本文概述的工程化和/或低免疫原性细胞包含TRB表达的敲低，使得细胞是TRB敲低。
G.CD142
在某些实施方案中，本文公开的技术调节(例如，降低或消除)CD142的表达，CD142也被称为组织因子、因子III和F3。在一些实施方案中，使用基因编辑系统(例如，CRISPR/Cas系统)进行调节。
在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是CD142或CD142的变体。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是CD142的同源物。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是CD142的直向同源物。
在一些实施方案中，本文概述的细胞包含靶向CD142基因的遗传修饰。在一些实施方案中，通过罕见切割核酸内切酶靶向CD142基因的遗传修饰包括Cas蛋白或编码Cas蛋白的多核苷酸，以及用于特异性靶向CD142基因的至少一个指导核糖核酸(gRNA)序列。下文描述了可用于识别靶向CD142的gRNA序列的方法。
测试CD142基因是否已灭活的测定是已知的并且在本文中描述。在一些实施方案中，通过PCR进行的CD142基因的所得遗传修饰和CD142表达的降低可以通过FACS分析进行测定。在另一个实施方案中，使用细胞裂解物的蛋白质印迹来检测CD142蛋白表达，所述裂解物用针对CD142蛋白的抗体进行探测。在另一个实施方案中，逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)用于确认灭活遗传修饰的存在。
关于人CD142的有用的基因组、多核苷酸和多肽信息提供于例如GeneCard标识符GC01M094530、HGNC No.3541、NCBI Gene ID 2152、NCBI RefSeq No.NM_001178096.1、NM_001993.4、NP_001171567.1和NP_001984.1、UniProt No.P13726等中。
H.RHD
在一些实施方案中，本文公开的技术通过靶向和调节(例如，降低或消除)RHD基因的表达来调节(例如，降低或消除)RhD抗原的表达。在一些实施方案中，使用基因编辑系统(例如，CRISPR/Cas系统)进行调节。在一些实施方案中，细胞在受体受试者中诱导先天和/或适应性免疫反应的能力降低。
在一些实施方案中，本公开的靶多核苷酸序列是RHD基因的变体。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是RHD基因的同源物。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是RHD基因的直向同源物。
在一些实施方案中，本文所述的细胞在编码RhD抗原蛋白的基因座处包含基因修饰。换句话说，细胞在RHD基因座处包含遗传修饰。在一些情况下，编码RhD抗原蛋白的核苷酸序列在RefSeq.No.NM_001127691.2、NM_001282868.1、NM_001282869.1、NM_001282871.1或NM_016124.4中列出，或在Genbank No.L08429中列出。在一些情况下，RHD基因座描述于NCBI Gene ID No.6007中。在某些情况下，RhD抗原蛋白的氨基酸序列被描绘为NCBIGenBank No.AAA02679.1。RhD蛋白和基因座的额外描述可以见于Uniprot No.Q02161、HGNCRef.No.10009和OMIM Ref.No.111680。
在一些实施方案中，本文概述的细胞包含靶向RHD基因的遗传修饰。在一些实施方案中，通过使用基因编辑工具(诸如但不限于CRISPR/Cas、TALE-核酸酶、锌指核酸酶、其他基于病毒的基因编辑系统或RNA干扰)对RHD基因进行基因编辑来生成靶向RHD基因的遗传修饰。在一些实施方案中，基因编辑靶向RHD基因的编码序列。在一些情况下，细胞不会生成功能性RHD基因产物。在不存在RHD基因产物的情况下，细胞完全缺乏Rh血型抗原。
在一些实施方案中，通过罕见切割核酸内切酶靶向RHD基因的遗传修饰包括Cas蛋白或编码Cas蛋白的多核苷酸，以及用于特异性靶向RHD基因的至少一个指导核糖核酸(gRNA)序列。下文描述了可用于识别靶向RHD的gRNA序列的方法。
测试RHD基因是否已灭活的测定是已知的并且在本文中描述。在一些实施方案中，通过PCR进行的RHD基因的所得遗传修饰和RHD表达的降低可以通过FACS分析进行测定。在另一个实施方案中，使用细胞裂解物的蛋白质印迹来检测RhD蛋白表达，所述裂解物用针对RhD蛋白的抗体进行探测。在另一个实施方案中，逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)用于确认灭活遗传修饰的存在。
I.CTLA-4
在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是CTLA-4或CTLA-4的变体。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是CTLA-4的同源物。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是CTLA-4的直向同源物。
在一些实施方案中，本文概述的细胞包含靶向CTLA-4基因的遗传修饰。在某些实施方案中，原代T细胞包含靶向CTLA-4基因的遗传修饰。遗传修饰可以降低T细胞(包括原代T细胞和CAR-T细胞)中CTLA-4多核苷酸和CTLA-4多肽的表达。在一些实施方案中，通过罕见切割核酸内切酶靶向CTLA-4基因的遗传修饰包括Cas蛋白或编码Cas蛋白的多核苷酸，以及用于特异性靶向CTLA-4基因的至少一个指导核糖核酸(gRNA)序列。下文描述了可用于识别靶向CTLA-4的gRNA序列的方法。
测试CTLA-4基因是否已灭活的测定是已知的并且在本文中描述。在一些实施方案中，通过PCR进行的CTLA-4基因的所得遗传修饰和CTLA-4表达的降低可以通过FACS分析进行测定。在另一个实施方案中，使用细胞裂解物的蛋白质印迹来检测CTLA-4蛋白表达，所述裂解物用针对CTLA-4蛋白的抗体进行探测。在另一个实施方案中，逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)用于确认灭活遗传修饰的存在。
关于人CTLA-4的有用的基因组、多核苷酸和多肽信息提供于例如GeneCard标识符GC02P203867、HGNC No.2505、NCBI Gene ID 1493、NCBI RefSeq No.NM_005214.4、NM_001037631.2、NP_001032720.1和NP_005205.2、UniProt No.P16410等。
J.PD-1
在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是PD-1或PD-1的变体。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是PD-1的同源物。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是PD-1的直向同源物。
在一些实施方案中，本文概述的细胞包含遗传修饰，所述遗传修饰靶向编码程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)蛋白的基因或靶向PDCD1基因。在某些实施方案中，原代T细胞包含靶向PDCD1基因的遗传修饰。遗传修饰可以降低T细胞(包括原代T细胞和CAR-T细胞)中PD-1多核苷酸和PD-1多肽的表达。在一些实施方案中，通过罕见切割核酸内切酶靶向PDCD1基因的遗传修饰包括Cas蛋白或编码Cas蛋白的多核苷酸，以及用于特异性靶向PDCD1基因的至少一个指导核糖核酸(gRNA)序列。下文描述了可用于识别靶向PD-1的gRNA序列的方法。
测试PDCD1基因是否已灭活的测定是已知的并且在本文中描述。在一些实施方案中，通过PCR进行的PDCD1基因的所得遗传修饰和PD-1表达的降低可以通过FACS分析进行测定。在另一个实施方案中，使用细胞裂解物的蛋白质印迹来检测PD-1蛋白表达，所述裂解物用针对PD-1蛋白的抗体进行探测。在另一个实施方案中，逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)用于确认灭活遗传修饰的存在。
关于人PD-1(包括PDCD1基因)的有用的基因组、多核苷酸和多肽信息提供于例如GeneCard标识符GC02M241849、HGNC No.8760、NCBI Gene ID 5133、Uniprot No.Q15116以及NCBI RefSeq No.NM_005018.2和NP_005009.2。
K.CD47
在一些实施方案中，本公开提供了一种细胞或其群体，其已经被修饰以表达致耐受因子(例如，免疫调节多肽)CD47。在一些实施方案中，本公开提供了一种用于改变细胞基因组以表达CD47的方法。在一些实施方案中，干细胞表达外源CD47。在一些情况下，细胞表达表达载体，所述表达载体包含编码人CD47多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，使用同源定向修复对细胞进行遗传修饰以包含编码CD47的整合外源多核苷酸。在一些情况下，细胞表达编码人CD47多肽的核苷酸序列，使得将核苷酸序列插入到安全港或靶标基因座的至少一个等位基因中。在一些情况下，细胞表达编码人CD47多肽的核苷酸序列，使得将核苷酸序列插入到AAVS1基因座的至少一个等位基因中。在一些情况下，细胞表达编码人CD47多肽的核苷酸序列，使得将核苷酸序列插入到安全港或靶标基因座的至少一个等位基因中。在一些情况下，细胞表达编码人CD47多肽的核苷酸序列，使得将核苷酸序列插入到CCR5基因座的至少一个等位基因中。在一些情况下，细胞表达编码人CD47多肽的核苷酸序列，其中将核苷酸序列插入到AAVS1基因座的至少一个等位基因中。在一些情况下，细胞表达编码人CD47多肽的核苷酸序列，其中将核苷酸序列插入到CCR5基因座的至少一个等位基因中。在一些情况下，细胞表达编码人CD47多肽的核苷酸序列，其中将核苷酸序列插入到安全港或靶标基因座的至少一个等位基因中，所述安全港或靶标基因座诸如但不限于CCR5基因座、CXCR4基因座、PPP1R12C基因座、白蛋白基因座、SHS231基因座、CLYBL基因座、Rosa基因座、F3(CD142)基因座、MICA基因座、MICB基因座、LRP1(CD91)基因座、HMGB1基因座、ABO基因座、RHD基因座、FUT1基因座和KDM5D基因座。在一些情况下，细胞表达编码人CD47多肽的核苷酸序列，其中将核苷酸序列插入到TRAC基因座的至少一个等位基因中。
CD47是一种白细胞表面抗原，并且在细胞粘附和整联蛋白调节中发挥作用。它在细胞表面上表达，并且向循环巨噬细胞发出不要吞噬细胞的信号。
在一些实施方案中，本文概述的细胞包含编码与NCBI Ref.Sequence No.NP_001768.1和NP_942088.1中列出的氨基酸序列具有至少95％序列同一性(例如，95％、96％、97％、98％、99％或更多)的CD47多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文概述的细胞包含编码具有NCBI Ref.Sequence No.NP_001768.1和NP_942088.1中列出的氨基酸序列的CD47多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，细胞包含与NCBI Ref.No.NM_001777.3和NM_198793.2中列出的序列具有至少85％序列同一性(例如，85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)的CD47核苷酸序列。在一些实施方案中，细胞包含NCBI Ref.Sequence No.NM_001777.3和NM_198793.2中列出的CD47核苷酸序列。在一些实施方案中，编码CD47多核苷酸的核苷酸序列是密码子优化序列。在一些实施方案中，编码CD47多核苷酸的核苷酸序列是人密码子优化序列。
在一些实施方案中，细胞包含与NCBI Ref.Sequence No.NP_001768.1和NP_942088.1中列出的氨基酸序列具有至少95％序列同一性(例如，95％、96％、97％、98％、99％或更多)的CD47多肽。在一些实施方案中，本文概述的细胞包含具有NCBIRef.Sequence No.NP_001768.1和NP_942088.1中列出的氨基酸序列的CD47多肽。
表1中提供了具有信号序列和不具有信号序列的人CD47的示例性氨基酸序列。
表1.人CD47的氨基酸序列
在一些实施方案中，细胞包含与SEQ ID NO:97的氨基酸序列具有至少95％序列同一性(例如，95％、96％、97％、98％、99％或更多)的CD47多肽。在一些实施方案中，细胞包含具有SEQ ID NO:97的氨基酸序列的CD47多肽。在一些实施方案中，细胞包含与SEQ ID NO:98的氨基酸序列具有至少95％序列同一性(例如，95％、96％、97％、98％、99％或更多)的CD47多肽。在一些实施方案中，细胞包含具有SEQ ID NO:98的氨基酸序列的CD47多肽。
在一些实施方案中，细胞包含编码与SEQ ID NO:97的氨基酸序列具有至少95％序列同一性(例如，95％、96％、97％、98％、99％或更多)的CD47多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，细胞包含编码具有SEQ ID NO:97的氨基酸序列的CD47多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，细胞包含编码与SEQ ID NO:98的氨基酸序列具有至少95％序列同一性(例如，95％、96％、97％、98％、99％或更多)的CD47多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，细胞包含编码具有SEQ ID NO:98的氨基酸序列的CD47多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，对核苷酸序列进行密码子优化以在特定细胞中表达。
在一些实施方案中，使用合适的基因编辑系统(例如，CRISPR/Cas系统或本文所述的任何基因编辑系统)来促进将编码CD47的多核苷酸插入到低免疫原性细胞的基因组基因座中。在一些情况下，将编码CD47的多核苷酸插入到安全港或靶标基因座中，诸如但不限于AAVS1、CCR5、CLYBL、ROSA26、SHS231、F3(CD142)、MICA、MICB、LRP1(CD91)、HMGB1、ABO、RHD、FUT1或KDM5D基因座。在一些实施方案中，将编码CD47的多核苷酸插入到B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座或TRB基因座中。在一些实施方案中，将编码CD47的多核苷酸插入到本文提供的表21中描绘的基因座中的任一个中。在某些实施方案中，编码CD47的多核苷酸可操作地连接至启动子。
在另一个实施方案中，使用细胞裂解物的蛋白质印迹来检测CD47蛋白表达，所述裂解物用针对CD47蛋白的抗体进行探测。在另一个实施方案中，逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)用于确认外源CD47 mRNA的存在。
L.CD24
在一些实施方案中，本公开提供了一种细胞或其群体，其已经被修饰以表达致耐受因子(例如，免疫调节多肽)CD24。在一些实施方案中，本公开提供了一种用于改变细胞基因组以表达CD24的方法。在一些实施方案中，干细胞表达外源CD24。在一些情况下，细胞表达表达载体，所述表达载体包含编码人CD24多肽的核苷酸序列。
CD24也被称为热稳定抗原或小细胞肺癌簇4抗原，它是一种糖基化的糖基磷脂酰肌醇锚定表面蛋白(Pirruccello等人,J Immunol,1986,136,3779-3784；Chen等人,Glycobiology,2017,57,800-806)。它与先天免疫细胞上的Siglec-10结合。最近证明了经由Siglec-10的CD24充当先天免疫检查点(Barkal等人,Nature,2019,572,392-396)。
在一些实施方案中，本文概述的细胞包含编码与NCBI Ref.Sequence No.NP_001278666.1、NP_001278667.1、NP_001278668.1和NP_037362.1中列出的氨基酸序列具有至少95％序列同一性(例如，95％、96％、97％、98％、99％或更多)的CD24多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文概述的细胞包含编码具有NCBI Ref.Sequence No.NP_001278666.1、NP_001278667.1、NP_001278668.1和NP_037362.1中列出的氨基酸序列的CD24多肽的核苷酸序列。
在一些实施方案中，细胞包含与NCBI Ref.No.NM_00129737.1、NM_00129738.1、NM_001291739.1和NM_013230.3中列出的序列具有至少85％序列同一性(例如，85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)的核苷酸序列。在一些实施方案中，细胞包含NCBI Ref.Sequence No.NM_00129737.1、NM_00129738.1、NM_001291739.1和NM_013230.3中列出的核苷酸序列。
在一些实施方案中，使用合适的基因编辑系统(例如，CRISPR/Cas系统或本文所述的任何基因编辑系统)来促进将编码CD24的多核苷酸插入到低免疫原性细胞的基因组基因座中。在一些情况下，将编码CD24的多核苷酸插入到安全港或靶标基因座中，诸如但不限于AAVS1、CCR5、CLYBL、ROSA26、SHS231、F3(CD142)、MICA、MICB、LRP1(CD91)、HMGB1、ABO、RHD、FUT1或KDM5D基因座。在一些实施方案中，将编码CD24的多核苷酸插入到B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座或TRB基因座中。在一些实施方案中，将编码CD24的多核苷酸插入到本文提供的表20中描绘的基因座中的任一个中。在某些实施方案中，编码CD24的多核苷酸可操作地连接至启动子。
在另一个实施方案中，使用细胞裂解物的蛋白质印迹来检测CD24蛋白表达，所述裂解物用针对CD24蛋白的抗体进行探测。在另一个实施方案中，逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)用于确认外源CD24 mRNA的存在。
在一些实施方案中，使用合适的基因编辑系统(例如，CRISPR/Cas系统或本文所述的任何基因编辑系统)来促进将编码CD24的多核苷酸插入到低免疫原性细胞的基因组基因座中。在一些情况下，将编码CD24的多核苷酸插入到安全港或靶标基因座中，诸如但不限于AAVS1、CCR5、CLYBL、ROSA26、SHS231、F3(也称为CD142)、MICA、MICB、LRP1(也称为CD91)、HMGB1、ABO、RHD、FUT1或KDM5D基因座。在一些实施方案中，将编码CD24的多核苷酸插入到B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座或TRB基因座中。在一些实施方案中，将编码CD24的多核苷酸插入到本文提供的表20中描绘的基因座中的任一个中。在某些实施方案中，编码CD24的多核苷酸可操作地连接至启动子。
M.DUX4
在一些实施方案中，本公开提供了一种细胞(例如，干细胞、诱导性多能干细胞、分化细胞、造血干细胞、原代T细胞或CAR-T细胞)或其群体，其包含经修饰以增加致耐受因子或免疫抑制因子(诸如DUX4)的表达的基因组。在一些实施方案中，本公开提供了一种用于改变细胞基因组以提供增加的DUX4表达的方法。在一些实施方案中，本公开提供了一种包含外源表达的DUX4蛋白的细胞或其群体。在一些实施方案中，增加的DUX4表达抑制、降低或消除以下MHC I分子中的一种或多种的表达：HLA-A、HLA-B和HLA-C。
DUX4是一种转录因子，其在胚胎组织和诱导性多能干细胞中具有活性，并且在正常、健康的体细胞组织中沉默(Feng等人,2015,ELife4；De Iaco等人,2017,Nat Genet,49,941-945；Hendrickson等人,2017,Nat Genet,49,925-934；Snider等人,2010,PLoS Genet,e1001181；Whiddon等人,2017,Nat Genet)。DUX4表达阻断IFN-γ介导的MHC I类基因表达(例如，B2M、HLA-A、HLA-B和HLA-C的表达)的诱导。DUX4表达与被MHC I类抑制的抗原呈递有关(Chew等人,Developmental Cell,2019,50,1-14)。DUX4在切割阶段基因表达(转录)程序中充当转录因子。其靶基因包括但不限于编码基因、非编码基因和重复元件。
DUX4有至少两种亚型，最长的亚型包括DUX4 C末端转录活化结构域。亚型通过可变剪接产生。参见，例如，Geng等人,2012,Dev Cell,22,38-51；Snider等人,2010,PLoSGenet,e1001181。DUX4的活性亚型包括其N末端DNA结合结构域和其C末端活化结构域。参见，例如，Choi等人,2016,Nucleic Acid Res,44,5161-5173。
已经证明了减少DUX4的CpG基序数量会减少DUX4转基因的沉默(Jagannathan等人,Human Molecular Genetics,2016,25(20):4419-4431)。Jagannathan等人,同上中提供的核酸序列代表DUX4的密码子改变序列，其包含一个或多个碱基取代以降低CpG位点的总数，同时保留DUX4蛋白质序列。核酸序列可从Addgene目录号99281商购获得。
在许多实施方案中，可利用至少一种或多种多核苷酸来促进细胞(例如干细胞、诱导性多能干细胞、分化细胞、造血干细胞、原代T细胞或CAR-T细胞)外源表达DUX4。
在一些实施方案中，使用合适的基因编辑系统(例如，CRISPR/Cas系统或本文所述的任何基因编辑系统)来促进将编码DUX4的多核苷酸插入到低免疫原性细胞的基因组基因座中。在一些情况下，将编码DUX4的多核苷酸插入到安全港或靶标基因座中，诸如但不限于AAVS1、CCR5、CLYBL、ROSA26、SHS231、F3(CD142)、MICA、MICB、LRP1(CD91)、HMGB1、ABO、RHD、FUT1或KDM5D基因座。在一些实施方案中，将编码DUX4的多核苷酸插入到B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座或TRB基因座中。在一些实施方案中，将编码DUX4的多核苷酸插入到本文提供的表20中描绘的基因座中的任一个中。在某些实施方案中，编码DUX4的多核苷酸可操作地连接至启动子。
在一些实施方案中，编码DUX4的多核苷酸序列包含有包含密码子改变的DUX4核苷酸序列的多核苷酸序列，所述密码子改变的DUX4核苷酸序列包含一个或多个碱基取代以降低CpG位点的总数，同时保留DUX4蛋白质序列。在一些实施方案中，编码DUX4的多核苷酸序列包含一个或多个碱基取代以降低与2020年7月31日提交的PCT/US2020/44635的SEQ IDNO:1具有至少85％(例如，85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的CpG位点的总数。在一些实施方案中，编码DUX4的多核苷酸序列是PCT/US2020/44635的SEQ ID NO:1。
在一些实施方案中，编码DUX4的多核苷酸序列是编码与选自包括以下的组的序列具有至少95％(例如，95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的多肽序列的核苷酸序列：如PCT/US2020/44635中提供的SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ IDNO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28和SEQID NO:29。在一些实施方案中，编码DUX4的多核苷酸序列是编码选自包括以下的组的多肽序列的核苷酸序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29。如SEQID NO:2-29所示的氨基酸序列在PCT/US2020/44635的图1A至图1G中示出。
在一些情况下，DUX4多肽包含与GenBank登录号ACN62209.1中列出的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含GenBank登录号ACN62209.1中列出的氨基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与NCBI RefSeq No.NP_001280727.1中列出的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含NCBI RefSeq No.NP_001280727.1中列出的氨基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与GenBank登录号ACP30489.1中列出的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含GenBank登录号ACP30489.1中列出的氨基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与UniProt No.P0CJ85.1中列出的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含UniProt No.P0CJ85.1中列出的氨基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与GenBank登录号AUA60622.1中列出的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含GenBank登录号AUA60622.1中列出的氨基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与GenBank登录号ADK24683.1中列出的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含GenBank登录号ADK24683.1中列出的氨基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与GenBank登录号ACN62210.1中列出的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含GenBank登录号ACN62210.1中列出的氨基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与GenBank登录号ADK24706.1中列出的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含GenBank登录号ADK24706.1中列出的氨基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与GenBank登录号ADK24685.1中列出的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含GenBank登录号ADK24685.1中列出的氨基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与GenBank登录号ACP30488.1中列出的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含GenBank登录号ACP30488.1中列出的氨基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与GenBank登录号ADK24687.1中列出的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含GenBank登录号ADK24687.1中列出的氨基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与GenBank登录号ACP30487.1中列出的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含GenBank登录号ACP30487.1中列出的氨基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与GenBank登录号ADK24717.1中列出的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含GenBank登录号ADK24717.1中列出的氨基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与GenBank登录号ADK24690.1中列出的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含GenBank登录号ADK24690.1中列出的氨基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与GenBank登录号ADK24689.1中列出的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含GenBank登录号ADK24689.1中列出的氨基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与GenBank登录号ADK24692.1中列出的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含GenBank登录号ADK24692.1中列出的氨基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与GenBank登录号ADK24693.1中列出的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含GenBank登录号ADK24693.1中列出的氨基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与GenBank登录号ADK24712.1中列出的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含GenBank登录号ADK24712.1中列出的氨基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与GenBank登录号ADK24691.1中列出的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含GenBank登录号ADK24691.1中列出的氨基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与UniProt No.P0CJ87.1中列出的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含UniProt No.P0CJ87.1中列出的氨基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与GenBank登录号ADK24714.1中列出的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含GenBank登录号ADK24714.1中列出的氨基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与GenBank登录号ADK24684.1中列出的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含GenBank登录号ADK24684.1中列出的氨基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与GenBank登录号ADK24695.1中列出的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含GenBank登录号ADK24695.1中列出的氨基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与GenBank登录号ADK24699.1中列出的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含GenBank登录号ADK24699.1中列出的氨基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与NCBI RefSeq No.NP_001768.1中列出的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含NCBI RefSeq No.NP_001768中列出的氨基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与NCBI RefSeq No.NP_942088.1中列出的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含NCBI RefSeq No.NP_942088.1中列出的氨基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与PCT/US2020/44635中提供的SEQ ID NO:28具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含PCT/US2020/44635中提供的SEQ ID NO:28的氨基酸序列。在一些情况下，DUX4多肽包含与PCT/US2020/44635中提供的SEQ ID NO:29具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，或包含PCT/US2020/44635中提供的SEQ ID NO:29的氨基酸序列。
在其他实施方案中，使用表达载体来促进致耐受因子的表达。在一些实施方案中，表达载体包含编码DUX4的多核苷酸序列，所述编码DUX4的多核苷酸序列是密码子改变序列，其包含一个或多个碱基取代以降低CpG位点的总数，同时保留DUX4蛋白质序列。在一些情况下，DUX4的密码子改变序列包含PCT/US2020/44635的SEQ ID NO:1。在一些情况下，DUX4的密码子改变序列是PCT/US2020/44635的SEQ ID NO:1。在其他实施方案中，表达载体包含编码DUX4的多核苷酸序列，所述序列包含PCT/US2020/44635的SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，表达载体包含编码DUX4多肽序列的多核苷酸序列，所述DUX4多肽序列与选自包括以下的组的序列具有至少95％的序列同一性：PCT/US2020/44635的SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29。在一些实施方案中，表达载体包含编码DUX4多肽序列的多核苷酸序列，所述DUX4多肽序列选自包括以下的组：PCT/US2020/44635的SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ IDNO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29。
可以使用已知技术(诸如Western印迹、ELISA测定、FACS测定、免疫测定等)来测定DUX4表达的增加。
N.额外的致耐受因子
在某些实施方案中，可以将一种或多种致耐受因子插入或重新插入到基因组编辑的细胞中以产生免疫豁免的通用供体细胞，诸如通用供体干细胞、通用供体T细胞或通用供体细胞。在某些实施方案中，本文公开的工程化细胞和/或低免疫原性细胞已被进一步修饰以表达一种或多种致耐受因子。示例性致耐受因子包括但不限于以下中的一种或多种：CD47、DUX4、CD24、CD27、CD35、CD46、CD55、CD59、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制剂、IL-10、IL-35、FasL、CCL21、CCL22、Mfge8、CD16、CD52、H2-M3、CD16 Fc受体、IL15-RF和Serpinb9。在一些实施方案中，致耐受因子选自由以下组成的组：CD200、HLA-G、HLA-E、HLA-C、HLA-E重链、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、IL-10、IL-35、FasL、Serpinb9、CCL21、CCL22和Mfge8。在一些实施方案中，致耐受因子选自由以下组成的组：DUX4、HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G、PD-L1、CTLA-4-Ig、C1-抑制剂和IL-35。在一些实施方案中，致耐受因子选自由以下组成的组：HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G、PD-L1、CTLA-4-Ig、C1-抑制剂和IL-35。在一些实施方案中，致耐受因子选自包括以下的组：CD47、DUX4、CD24、CD27、CD35、CD46、CD55、CD59、CD200、HLA-C、HLA-E、HLA-E重链、HLA-G、PD-L1、IDO1、CTLA4-Ig、C1-抑制剂、IL-10、IL-35、FasL、CCL21、CCL22、Mfge8、CD16、CD52、H2-M3、CD16 Fc受体、IL15-RF和Serpinb9。
关于人CD27(其也被称为CD27L受体、肿瘤坏死因子受体超家族成员7、TNFSF7、T细胞活化抗原S152、Tp55和T14)的有用的基因组、多核苷酸和多肽信息提供于例如GeneCard标识符GC12P008144、HGNC No.11922、NCBI Gene ID 939、Uniprot No.P26842以及NCBIRefSeq No.NM_001242.4和NP_001233.1。
关于人CD46的有用的基因组、多核苷酸和多肽信息提供于例如GeneCard标识符GC01P207752、HGNC No.6953、NCBI Gene ID 4179、Uniprot No.P15529以及NCBI RefSeqNo.NM_002389.4、NM_153826.3、NM_172350.2、NM_172351.2、NM_172352.2NP_758860.1、NM_172353.2、NM_172359.2、NM_172361.2、NP_002380.3、NP_722548.1、NP_758860.1、NP_758861.1、NP_758862.1、NP_758863.1、NP_758869.1和NP_758871.1。
关于人CD55(也称为补体衰变加速因子)的有用的基因组、多核苷酸和多肽信息提供于例如GeneCard标识符GC01P207321、HGNCNo.2665、NCBI Gene ID 1604、UniprotNo.P08174以及NCBI RefSeqNo.NM_000574.4、NM_001114752.2、NM_001300903.1、NM_001300904.1、NP_000565.1、NP_001108224.1、NP_001287832.1和NP_001287833.1。
关于人CD59的有用的基因组、多核苷酸和多肽信息提供于例如GeneCard标识符GC11M033704、HGNC No.1689,NCBI Gene ID 966、Uniprot No.P13987以及NCBI RefSeqNo.NP_000602.1、NM_000611.5、NP_001120695.1、NM_001127223.1、NP_001120697.1、NM_001127225.1、NP_001120698.1、NM_001127226.1、NP_001120699.1、NM_001127227.1、NP_976074.1、NM_203329.2、NP_976075.1、NM_203330.2、NP_976076.1和NM_203331.2。
关于人CD200的有用的基因组、多核苷酸和多肽信息提供于例如GeneCard标识符GC03P112332、HGNC No.7203、NCBI Gene ID 4345、Uniprot No.P41217以及NCBI RefSeqNo.NP_001004196.2、NM_001004196.3、NP_001305757.1、NM_001318828.1、NP_005935.4、NM_005944.6、XP_005247539.1和XM_005247482.2。
关于人HLA-C的有用的基因组、多核苷酸和多肽信息提供于例如GeneCard标识符GC06M031272、HGNC No.4933、NCBI Gene ID 3107、Uniprot No.P10321以及NCBI RefSeqNo.NP_002108.4和NM_002117.5。
关于人HLA-E的有用的基因组、多核苷酸和多肽信息提供于例如GeneCard标识符GC06P047281、HGNC No.4962、NCBI Gene ID 3133、Uniprot No.P13747以及NCBI RefSeqNo.NP_005507.3和NM_005516.5。
关于人HLA-G的有用的基因组、多核苷酸和多肽信息提供于例如GeneCard标识符GC06P047256、HGNC No.4964、NCBI Gene ID 3135、Uniprot No.P17693以及NCBI RefSeqNo.NP_002118.1和NM_002127.5。
关于人PD-L1或CD274的有用的基因组、多核苷酸和多肽信息提供于例如GeneCard标识符GC09P005450、HGNC No.17635、NCBI Gene ID 29126、Uniprot No.Q9NZQ7以及NCBIRefSeq No.NP_001254635.1、NM_001267706.1、NP_054862.1和NM_014143.3。
关于人IDO1的有用的基因组、多核苷酸和多肽信息提供于例如GeneCard标识符GC08P039891、HGNC No.6059、NCBI Gene ID 3620、Uniprot No.P14902以及NCBI RefSeqNo.NP_002155.1和NM_002164.5。
关于人IL-10的有用的基因组、多核苷酸和多肽信息提供于例如GeneCard标识符GC01M206767、HGNC No.5962、NCBI Gene ID 3586、Uniprot No.P22301以及NCBI RefSeqNo.NP_000563.1和NM_000572.2。
关于人Fas配体(其也被称为FasL、FASLG、CD178、TNFSF6等)的有用的基因组、多核苷酸和多肽信息提供于例如GeneCard标识符GC01P172628、HGNC No.11936、NCBI Gene ID356、Uniprot No.P48023以及NCBI RefSeq No.NP_000630.1、NM_000639.2、NP_001289675.1和NM_001302746.1。
关于人CCL21的有用的基因组、多核苷酸和多肽信息提供于例如GeneCard标识符GC09M034709、HGNC No.10620、NCBI Gene ID6366、Uniprot No.O00585以及NCBI RefSeqNo.NP_002980.1和NM_002989.3。
关于人CCL22的有用的基因组、多核苷酸和多肽信息提供于例如GeneCard标识符GC16P057359、HGNC No.10621、NCBI Gene ID 6367、Uniprot No.O00626以及NCBI RefSeqNo.NP_002981.2、NM_002990.4、XP_016879020.1和XM_017023531.1。
关于人Mfge8的有用的基因组、多核苷酸和多肽信息提供于例如GeneCard标识符GC15M088898、HGNC No.7036、NCBI Gene ID 4240、Uniprot No.Q08431以及NCBI RefSeqNo.NP_001108086.1、NM_001114614.2、NP_001297248.1、NM_001310319.1、NP_001297249.1、NM_001310320.1、NP_001297250.1、NM_001310321.1、NP_005919.2和NM_005928.3。
关于人SerpinB9的有用的基因组、多核苷酸和多肽信息提供于例如GeneCard标识符GC06M002887、HGNC No.8955、NCBI Gene ID 5272、Uniprot No.P50453以及NCBI RefSeqNo.NP_004146.1、NM_004155.5、XP_005249241.1和XM_005249184.4。
用于调节基因和因子(蛋白质)表达的方法包括基因组编辑技术以及RNA或蛋白质表达技术等。对于所有这些技术，使用众所周知的重组技术来产生如本文所概述的重组核酸。
在一些实施方案中，细胞(例如，干细胞、诱导性多能干细胞、分化细胞、造血干细胞、原代T细胞或CAR-T细胞)具有使B2M和CIITA基因灭活的遗传修饰，并且表达选自包括以下的组的多种外源多肽：CD47和DUX4、CD47和CD24、CD47和CD27、CD47和CD46、CD47和CD55、CD47和CD59、CD47和CD200、CD47和HLA-C、CD47和HLA-E、CD47和HLA-E重链、CD47和HLA-G、CD47和PD-L1、CD47和IDO1、CD47和CTLA4-Ig、CD47和C1-抑制剂、CD47和IL-10、CD47和IL-35、CD47和IL-39、CD47和FasL、CD47和CCL21、CD47和CCL22、CD47和Mfge8以及CD47和Serpinb9及其任何组合。在一些情况下，此类细胞还具有使CD142基因灭活的遗传修饰。
在一些情况下，基因编辑系统(诸如CRISPR/Cas系统)用于促进将致耐受因子(诸如致耐受因子)插入到安全港或靶标基因座(诸如AAVS1基因座)中以主动抑制免疫排斥反应。在一些情况下，使用表达载体将致耐受因子插入到安全港或靶标基因座中。在一些实施方案中，安全港或靶标基因座是AAVS1、CCR5、CLYBL、ROSA26、SHS231、F3(也称为CD142)、MICA、MICB、LRP1(也称为CD91)、HMGB1、ABO、RHD、FUT1或KDM5D基因座。
在一些实施方案中，通过表达含有以下的融合蛋白或蛋白质复合物来增加靶基因(例如，CD47、DUX4或另一种致耐受因子基因)的表达：(1)对外源靶基因(例如，CD47、DUX4或另一种致耐受因子基因)具有特异性的位点特异性结合结构域和(2)转录活化因子。
在一些实施方案中，调控因子由位点特异性DNA结合核酸分子(诸如指导RNA(gRNA))组成。在一些实施方案中，方法通过位点特异性DNA结合靶蛋白来实现，诸如通过锌指蛋白(ZFP)或含有ZFP的融合蛋白(其也被称为锌指核酸酶(ZFN))来实现。
在一些实施方案中，调控因子包含位点特异性结合结构域，诸如使用DNA结合蛋白或DNA结合核酸，其与靶向区域的基因特异性结合或杂交。在一些实施方案中，所提供的多核苷酸或多肽与位点特异性核酸酶(诸如修饰的核酸酶)偶联或复合。例如，在一些实施方案中，使用包含修饰的核酸酶的DNA靶向蛋白的融合物来实现施用，诸如使用大范围核酸酶或RNA指导的核酸酶，诸如成簇规律间隔短回文核酸(CRISPR)-Cas系统，诸如CRISPR-Cas9系统。在一些实施方案中，核酸酶经修饰以缺乏核酸酶活性。在一些实施方案中，修饰的核酸酶是催化死亡的dCas9。
在一些实施方案中，位点特异性结合结构域可来源于核酸酶。例如，归巢核酸内切酶和大范围核酸酶的识别序列，诸如I-SceI、I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-SceII、I-PpoI、I-SceIII、I-CreI、I-TevI、I-TevII和I-TevIII。另见美国专利号5,420,032；美国专利号6,833,252；Belfort等人,(1997)Nucleic Acids Res.25:3379-3388；Dujon等人,(1989)Gene 82:115-118；Perler等人,(1994)Nucleic Acids Res.22,1125-1127；Jasin(1996)Trends Genet.12:224-228；Gimble等人,(1996)J.Mol.Biol.263:163-180；Argast等人,(1998)J.Mol.Biol.280:345-353和New England Biolabs目录。此外，可以对归巢核酸内切酶和大范围核酸酶的DNA结合特异性进行工程化以结合非天然靶位点。参见例如，Chevalier等人,(2002)Molec.Cell 10:895-905；Epinat等人,(2003)NucleicAcids Res.31:2952-2962；Ashworth等人,(2006)Nature 441:656-659；Paques等人,(2007)Current Gene Therapy 7:49-66；美国专利公开号2007/0117128。
锌指、TALE和CRISPR系统结合结构域可以被“工程化”以结合预定的核苷酸序列，例如经由天然存在的锌指或TALE蛋白的识别螺旋区域的工程化(改变一个或多个氨基酸)。工程化DNA结合蛋白(锌指或TALE)是非天然存在的蛋白质。合理的设计标准包括应用取代规则和计算机化算法来处理存储现有ZFP和/或TALE设计和结合数据的信息的数据库中的信息。参见例如美国专利号6,140,081；6,453,242；和6,534,261；另见WO 98/53058；WO 98/53059；WO 98/53060；WO 02/016536和WO 03/016496和美国公开号20110301073。
在一些实施方案中，位点特异性结合结构域包含一种或多种以序列特异性方式结合DNA的锌指蛋白(ZFP)或其结构域。ZFP或其结构域是通过一种或多种锌指以序列特异性方式结合DNA的较大蛋白质内的蛋白质或结构域，所述一种或多种锌指是其结构通过锌离子配位而稳定的结合结构域内的氨基酸序列区域。
在ZFP中，有靶向特定DNA序列的人工ZFP结构域，长度通常为9-18个核苷酸，由个别指组装生成。ZFP包括其中单一指结构域的长度为大约30个氨基酸并且含有α螺旋，并且具有两个、三个、四个、五个或六个指的ZFP，所述α螺旋含有两个不变的组氨酸残基，所述组氨酸残基通过锌与单一β转角的两个半胱氨酸配位。通常，ZFP的序列特异性可以通过在锌指识别螺旋上的四个螺旋位置(-1、2、3和6)处进行氨基酸取代来改变。因此，在一些实施方案中，ZFP或含有ZFP的分子是非天然存在的，例如，被工程化以与选择的靶位点结合。参见例如，Beerli等人(2002)Nature Biotechnol.20:135-141；Pabo等人(2001)Ann.Rev.Biochem.70:313-340；Isalan等人(2001)Nature Biotechnol.19:656-660；Segal等人(2001)Curr.Opin.Biotechnol.12:632-637；Choo等人(2000)Curr.Opin.Struct.Biol.10:411-416；美国公开号6,453,242；6,534,261；6,599,692；6,503,717；6,689,558；7,030,215；6,794,136；7,067,317；7,262,054；7,070,934；7,361,635；7,253,273；和美国专利公开号2005/0064474；2007/0218528；2005/0267061，所述文献通过引用整体并入本文。
许多基因特异性工程化锌指是可商购获得的。例如，Sangamo Biosciences(Richmond,CA,USA)与Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA)合作开发了用于锌指构建的平台(CompoZr)，其允许研究人员绕过锌指构建与验证，并且为数千种蛋白质提供特异性靶向的锌指(Gaj等人,Trends in Biotechnology,2013,31(7),397-405)。在一些实施方案中，使用或定制设计可商购获得的锌指。
在一些实施方案中，位点特异性结合结构域包含天然存在的或工程化的(非天然存在的)转录活化因子样蛋白(TAL)DNA结合结构域，诸如转录活化因子样蛋白效应物(TALE)蛋白中的所述结构域，参见例如美国专利公开号20110301073，其通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，位点特异性结合结构域来源于CRISPR/Cas系统。一般来讲，“CRISPR系统”统指参与表达CRISPR相关(“Cas”)基因或指导其活性的转录物和其他元件，包括编码Cas基因的序列、tracr(反式活化CRISPR)序列(例如，tracrRNA或活性部分tracrRNA)、tracr伴侣序列(在内源CRISPR系统的上下文中涵盖“直接重复序列”和tracrRNA加工的部分直接重复序列)、指导序列(在内源CRISPR系统的上下文中也被称为“间隔子”，或“靶向序列”)和/或来自CRISPR基因座的其他序列和转录物。
一般来讲，指导序列包括靶向结构域，所述靶向结构域包含与靶多核苷酸序列具有足够互补性以与靶序列杂交并且指导CRISPR复合物与靶序列的序列特异性结合的多核苷酸序列。在一些实施方案中，当使用合适的比对算法进行最佳比对时，指导序列与其对应靶序列之间的互补程度为约或大于约50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、97.5％、99％或更多。在一些实例中，gRNA的靶向结构域与靶核酸上的靶序列互补，例如至少80％、85％、90％、95％、98％或99％互补，例如完全互补。
在一些实施方案中，靶位点在靶基因的转录起始位点的上游。在一些实施方案中，靶位点与基因的转录起始位点相邻。在一些实施方案中，靶位点与基因转录起始位点下游的RNA聚合酶暂停位点相邻。
在一些实施方案中，靶向结构域被配置为靶向靶基因的启动子区域以促进转录起始、一种或多种转录增强子或活化因子和/或RNA聚合酶的结合。一种或多种gRNA可用于靶向基因的启动子区域。在一些实施方案中，可以靶向基因的一个或多个区域。在某些方面，靶位点位于基因转录起始位点(TSS)任一侧的600个碱基对内。
设计或鉴定作为或包含靶向基因的序列(包括外显子序列和调控区(包括启动子和活化因子)的序列)的gRNA序列在技术人员的水平内。用于CRISPR基因组编辑的全基因组gRNA数据库是公开可用的，其含有人类基因组或小鼠基因组中的基因的组成型外显子中的示例性单一指导RNA(sgRNA)靶序列(参见，例如，genescript.com/gRNA-database.html；另见Sanjana等人(2014)Nat.Methods,11:783-4；www.e-crisp.org/E-CRISP/；crispr.mit.edu/)。在一些实施方案中，gRNA序列是或包含与非靶基因具有最小脱靶结合的序列。
在一些实施方案中，调控因子还包含功能结构域，例如转录活化因子。
在一些实施方案中，转录活化因子是或含有一种或多种调控元件，诸如靶基因的一种或多种转录控制元件，由此识别如上文所提供的位点特异性结构域以驱动这种基因的表达。在一些实施方案中，转录活化因子驱动靶基因的表达。在一些情况下，转录活化因子可以是或含有异源反式活化结构域的全部或一部分。例如，在一些实施方案中，转录活化因子选自单纯疱疹衍生的反式活化结构域、Dnmt3a甲基转移酶结构域、p65、VP16和VP64。
在一些实施方案中，调控因子是锌指转录因子(ZF-TF)。在一些实施方案中，调控因子是VP64-p65-Rta(VPR)。
在某些实施方案中，调控因子还包含转录调控结构域。常见结构域包括，例如，转录因子结构域(活化因子、抑制因子、共活化因子、共抑制因子)、沉默子、癌基因(例如，myc、jun、fos、myb、max、mad、rel、ets、bcl、myb、mos家族成员等)；DNA修复酶及其相关因子和修饰因子；DNA重排酶及其相关因子和修饰因子；染色质相关蛋白及其修饰因子(例如，激酶、乙酰化酶和去乙酰化酶)；和DNA修饰酶(例如，甲基转移酶，诸如DNMT家族成员(例如，DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、DNMT3L等、拓扑异构酶、解旋酶、连接酶、激酶、磷酸酶、聚合酶、核酸内切酶)及其相关因子和修饰因子。参见，例如，美国公开号2013/0253040，其通过引用整体并入本文。
用于实现活化的合适结构域包括HSV VP 16活化结构域(参见，例如，Hagmann等人,J.Virol.71,5952-5962(1 97))核激素受体(参见，例如，Torchia等人,Curr.Opin.Cell.Biol.10:373-383(1998))；核因子κB的p65亚基(Bitko和Bank,J.Virol.72:5610-5618(1998)和Doyle和Hunt,Neuroreport 8:2937-2942(1997))；Liu等人,Cancer Gene Ther.5:3-28(1998))或人工嵌合功能结构域，诸如VP64(Beerli等人,(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:14623-33)、和降解决定子(Molinari等人,(1999)EMBO J.18,6439-6447)。额外的示例性活化结构域包括Oct 1、Oct-2A、Spl、AP-2和CTF1(Seipel等人,EMBOJ.11,4961-4968(1992)以及p300、CBP、PCAF、SRC1 PvALF、AtHD2A和ERF-2。参见，例如，Robyr等人,(2000)Mol.Endocrinol.14:329-347；Collingwood等人,(1999)J.Mol.Endocrinol 23:255-275；Leo等人,(2000)Gene245:1-11；Manteuffel-Cymborowska(1999)Acta Biochem.Pol.46:77-89；McKenna等人,(1999)J.SteroidBiochem.Mol.Biol.69:3-12；Malik等人,(2000)Trends Biochem.Sci.25:277-283；和Lemon等人,(1999)Curr.Opin.Genet.Dev.9:499-504。额外的示例性活化结构域包括但不限于OsGAI、HALF-1、Cl、AP1、ARF-5、-6、-1和-8、CPRF1、CPRF4、MYC-RP/GP和TRAB1，参见，例如，Ogawa等人，(2000)Gene 245:21-29；Okanami等人,(1996)Genes Cells 1:87-99；Goff等人,(1991)Genes Dev.5:298-309；Cho等人,(1999)Plant Mol Biol 40:419-429；Ulmason等人,(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:5844-5849；Sprenger-Haussels等人,(2000)Plant J.22:1-8；Gong等人,(1999)Plant Mol.Biol.41:33-44；和Hobo等人,(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:15,348-15,353。
可用于制备遗传阻遏物的示例性阻遏结构域包括但不限于KRAB A/B、KOX、TGF-β-诱导型早期基因(TIEG)、v-erbA、SID、MBD2、MBD3、DNMT家族成员(例如，DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、DNMT3L等)、Rb和MeCP2。参见，例如，Bird等人,(1999)Cell99:451-454；Tyler等人,(1999)Cell 99:443-446；Knoepfler等人,(1999)Cell 99:447-450；和Robertson等人,(2000)Nature Genet.25:338-342。额外的示例性抑制结构域包括但不限于ROM2和AtHD2A。参见，例如，Chem等人,(1996)Plant Cell 8:305-321；和Wu等人,(2000)Plant J.22:19-27。
在一些情况下，所述结构域参与染色体的表观遗传调控。在一些实施方案中，所述结构域是组蛋白乙酰转移酶(HAT)，例如A型、核定位的，诸如MYST家族成员MOZ、Ybf2/Sas3、MOF和Tip60、GNAT家族成员Gcn5或pCAF、p300家族成员CBP、p300或Rttl09(Bemdsen和Denu(2008)Curr Opin Struct Biol 18(6):682-689)。在其他情况下，所述结构域是组蛋白去乙酰化酶(HD AC)，诸如I类(HDAC-l、2、3和8)、II类(HDAC IIA(HDAC-4、5、7和9)、HD AC IIB(HDAC 6和10))、IV类(HDAC-l 1)、III类(也称为sirtuin(SIRT)；SIRT1-7)(参见Mottamal等人,(2015)Molecules 20(3):3898-394l)。在一些实施方案中使用的另一个结构域是组蛋白磷酸化酶或激酶，其中实例包括MSK1、MSK2、ATR、ATM、DNA-PK、Bubl、VprBP、IKK-a、PKCpi、Dik/Zip、JAK2、PKC5、WSTF和CK2。在一些实施方案中，使用甲基化结构域并且其可以选自诸如Ezh2、PRMT1/6、PRMT5/7、PRMT 2/6、CARM1、set7/9、MLL、ALL-1、Suv 39h、G9a、SETDB1、Ezh2、Set2、Dotl、PRMT 1/6、PRMT 5/7、PR-Set7和Suv4-20h的组。参与苏木化和生物素化的结构域(Lys9、13、4、18和12)也可用于一些实施方案中(综述参见Kousarides(2007)Cell 128:693-705)。
融合分子通过本领域技术人员众所周知的克隆和生化缀合方法构建。融合分子包含DNA结合结构域和功能结构域(例如，转录活化或抑制结构域)。融合分子还任选地包含核定位信号(例如，来自SV40培养基T抗原的信号)和表位标签(诸如，例如，FLAG和血凝素)。设计融合蛋白(和编码它们的核酸)，使得翻译阅读框保留在融合组分中。
一个方面的功能结构域(或其功能片段)的多肽组分与另一方面的非蛋白质DNA结合结构域(例如，抗生素、嵌入剂、小沟结合物、核酸)之间的融合体通过本领域技术人员已知的生化缀合方法来构建。参见，例如Pierce Chemical Company(Rockford,IL)目录。已经描述了用于进行小沟结合物与多肽之间的融合的方法和组合物。Mapp等人,(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:3930-3935。同样，CRISPR/Cas TF以及包含与多肽组分功能结构域缔合的sgRNA核酸组分的核酸酶也是本领域技术人员已知的并在本文中详细描述。
在一些实施方案中，本公开提供了一种包含基因组的细胞(例如，原代T细胞和低免疫原性干细胞及其衍生物)或其群体，其中细胞基因组已被修饰以表达CD47。在一些实施方案中，本公开提供了一种用于改变细胞基因组以表达CD47的方法。在某些实施方案中，至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸可用于促进将CD47插入到细胞系中。在某些实施方案中，至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸选自由WO2016183041的表29的SEQ ID NO:200784-231885组成的组，所述文献通过引用并入本文。
在一些实施方案中，本公开提供了一种包含基因组的细胞(例如，原代T细胞和低免疫原性干细胞及其衍生物)或其群体，其中细胞基因组已被修饰以表达HLA-C。在一些实施方案中，本公开提供了一种用于改变细胞基因组以表达HLA-C的方法。在某些实施方案中，至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸可用于促进将HLA-C插入到细胞系中。在某些实施方案中，至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸选自由WO2016183041的表10的SEQ IDNO:3278-5183组成的组，所述文献通过引用并入本文。
在一些实施方案中，本公开提供了一种包含基因组的细胞(例如，原代T细胞和低免疫原性干细胞及其衍生物)或其群体，其中细胞基因组已被修饰以表达HLA-E。在一些实施方案中，本公开提供了一种用于改变细胞基因组以表达HLA-E的方法。在某些实施方案中，至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸可用于促进将HLA-E插入到细胞系中。在某些实施方案中，至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸选自由WO2016183041的表19的SEQ IDNO:189859-193183组成的组，所述文献通过引用并入本文。
在一些实施方案中，本公开提供了一种包含基因组的细胞(例如，原代T细胞和低免疫原性干细胞及其衍生物)或其群体，其中细胞基因组已被修饰以表达HLA-F。在一些实施方案中，本公开提供了一种用于改变细胞基因组以表达HLA-F的方法。在某些实施方案中，至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸可用于促进将HLA-F插入到细胞系中。在某些实施方案中，至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸选自由WO2016183041的表45的SEQ IDNO:688808-399754组成的组，所述文献通过引用并入本文。
在一些实施方案中，本公开提供了一种包含基因组的细胞(例如，原代T细胞和低免疫原性干细胞及其衍生物)或其群体，其中细胞基因组已被修饰以表达HLA-G。在一些实施方案中，本公开提供了一种用于改变细胞基因组以表达HLA-G的方法。在某些实施方案中，至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸可用于促进将HLA-G插入到干细胞系中。在某些实施方案中，至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸选自由WO2016183041的表18的SEQ IDNO:188372-189858组成的组，所述文献通过引用并入本文。
在一些实施方案中，本公开提供了一种包含基因组的细胞(例如，原代T细胞和低免疫原性干细胞及其衍生物)或其群体，其中细胞基因组已被修饰以表达PD-L1。在一些实施方案中，本公开提供了一种用于改变细胞基因组以表达PD-L1的方法。在某些实施方案中，至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸可用于促进将PD-L1插入到干细胞系中。在某些实施方案中，至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸选自由WO2016183041的表21的SEQ IDNO:193184-200783组成的组，所述文献通过引用并入本文。
在一些实施方案中，本公开提供了一种包含基因组的细胞(例如，原代T细胞和低免疫原性干细胞及其衍生物)或其群体，其中细胞基因组已被修饰以表达CTLA4-Ig。在一些实施方案中，本公开提供了一种用于改变细胞基因组以表达CTLA4-Ig的方法。在某些实施方案中，至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸可用于促进将CTLA4-Ig插入到干细胞系中。在某些实施方案中，至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸选自WO2016183041(包括序列表)中公开的任一种。
在一些实施方案中，本公开提供了一种包含基因组的细胞(例如，原代T细胞和低免疫原性干细胞及其衍生物)或其群体，其中细胞基因组已被修饰以表达CI-抑制剂。在一些实施方案中，本公开提供了一种用于改变细胞基因组以表达CI-抑制剂的方法。在某些实施方案中，至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸可用于促进将CI-抑制剂插入到干细胞系中。在某些实施方案中，至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸选自WO2016183041(包括序列表)中公开的任一种。
在一些实施方案中，本公开提供了一种包含基因组的细胞(例如，原代T细胞和低免疫原性干细胞及其衍生物)或其群体，其中细胞基因组已被修饰以表达IL-35。在一些实施方案中，本公开提供了一种用于改变细胞基因组以表达IL-35的方法。在某些实施方案中，至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸可用于促进将IL-35插入到干细胞系中。在某些实施方案中，至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸选自WO2016183041(包括序列表)中公开的任一种。
在一些实施方案中，使用表达载体在细胞中表达致耐受因子。例如，用于在细胞中表达CD47的表达载体包含编码CD47的多核苷酸序列。表达载体可以是诱导型表达载体。表达载体可以是病毒载体，诸如但不限于慢病毒载体。在一些实施方案中，使用融合原介导的递送或选自由以下组成的组的转座酶系统将致耐受因子引入到细胞中：条件性或诱导型转座酶、条件性或诱导型PiggyBac转座子、条件性或诱导型睡美人(SB11)转座子、条件性或诱导型Mos1转座子和条件性或诱导型Tol2转座子。
在一些实施方案中，使用合适的基因编辑系统(例如，CRISPR/Cas系统或本文所述的任何基因编辑系统)来促进将编码致耐受因子的多核苷酸插入到低免疫原性细胞的基因组基因座中。在一些情况下，将编码致耐受因子的多核苷酸插入到安全港或靶标基因座(诸如但不限于AAVS1、CCR5、CLYBL、ROSA26、SHS231、F3(CD142)、MICA、MICB、LRP1(CD91)、HMGB1、ABO、RHD、FUT1或KDM5D基因座)中。在一些实施方案中，将编码致耐受因子的多核苷酸插入到B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座或TRB基因座中。在一些实施方案中，将编码致耐受因子的多核苷酸插入到本文提供的表2至表5中描绘的基因座中的任一个中。在某些实施方案中，编码致耐受因子的多核苷酸可操作地连接至启动子。
O.Y-连锁原钙粘蛋白11
在某些实施方案中，本文公开的技术通过靶向和调节(例如，降低或消除)Y染色体基因的表达来调节(例如，降低或消除)一种或多种Y染色体基因的表达。在一些实施方案中，使用基因编辑系统(例如，CRISPR/Cas系统)进行调节。在一些实施方案中，细胞在受体受试者中诱导先天和/或适应性免疫反应的能力降低。
在某些实施方案中，本文公开的技术通过靶向和调节(例如，降低或消除)Y-连锁原钙粘蛋白11基因(例如，PCDH11Y)的表达来调节(例如，降低或消除)Y-连锁原钙粘蛋白11抗原的表达。在一些实施方案中，使用CRISPR/Cas系统进行调节。在一些实施方案中，细胞在受体受试者中具有降低的诱导免疫反应的能力。
在一些实施方案中，本公开的靶多核苷酸序列是PCDH11Y基因的变体。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是PCDH11Y基因的同源物。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是PCDH11Y基因的直向同源物。
在一些实施方案中，本文所述的细胞在编码Y-连锁原钙粘蛋白11抗原蛋白的基因座处包含基因修饰。换句话说，细胞在PCDH11Y基因座处包含遗传修饰。在一些情况下，编码Y-连锁原钙粘蛋白11抗原蛋白的核苷酸序列在RefSeq.No.N NM_001278619.1、NM_032971.2、NM_032972.2、NM_032973.2或XM_017030082.1中，或在Genbank No.AJ276803、AF277053、AF332216、AF332217、AJ564958、AJ564959、AJ564960、AJ564961、AJ564962、AJ564963、AJ564966或AJ56496中列出。在一些情况下，PCDH11Y基因座在NCBI Gene IDNo.83259中描述。在某些情况下，Y-连锁原钙粘蛋白11抗原的氨基酸序列描绘为NCBIGenBank No.CAC13122.1、AAL55729.1、AAK13468.1、AAK13469.1、CAD92429.1、CAD92430.1、CAD92431.1、CAD92432.1、CAD92433.1、CAD92434.1、CAD92437.1或CAD92440.1。Y-连锁原钙粘蛋白11抗原蛋白和基因座的额外描述可见于Uniprot No.Q9BZA8,HGNC Ref.No.15813和OMIM Ref.No.400022。
在一些实施方案中，本文概述的工程化和/或低免疫原性细胞包含靶向PCDH11Y基因的遗传修饰。在一些实施方案中，通过使用基因编辑工具(诸如但不限于CRISPR/Cas、TALE-核酸酶、锌指核酸酶、其他基于病毒的基因编辑系统或RNA干扰)对PCDH11Y基因进行基因编辑来生成靶向PCDH11Y基因的遗传修饰。在一些实施方案中，基因编辑靶向PCDH11Y基因的编码序列。在一些情况下，细胞不会生成功能性PCDH11Y基因产物。在不存在PCDH11Y基因产物的情况下，细胞完全缺乏Y-连锁原钙粘蛋白11抗原。
在一些实施方案中，Cas9或Cas12a编辑系统用于靶向PCDH11Y基因的序列以将插入或缺失引入基因中来破坏其功能，并且在一些情况下使其灭活。在一些实施方案中，使用单一指导RNA。在一些实施方案中，使用双指导RNA。在一些实施方案中，使用表2A或表2B的gRNA靶序列中的任一个。在一些情况下，使用表2A和/或表2B的超过一种gRNA靶序列用于基因编辑。在一些实施方案中，Cas9编辑系统包含Cas9蛋白或其片段、tracrRNA和crRNA。在一些实施方案中，Cas12a编辑系统包含Cas12a蛋白或其片段和crRNA。
在一些实施方案中，在基因的任何编码序列中引入移码插入-缺失。在一些实施方案中，在基因的UTR、内含子或外显子内添加修饰以破坏PCDH11Y基因的功能。在一些实施方案中，使用包含表2A和/或表2B的gRNA靶序列中的任何一种或多种的CRISPR/Cas编辑。
在一些实施方案中，将修饰引入PCDH11Y基因中以使所述基因灭活。在一些实施方案中，靶向诸如PCDH11Y基因的外显子1或外显子2或外显子3的编码外显子。在一些情况下，使用Cas编辑系统和靶向PCDH11Y基因的5’处序列的指导RNA靶序列以及靶向外显子(诸如但不限于外显子1或2)的指导RNA靶序列来产生缺失。在一些实施方案中，本文所述的细胞包含PCDH11Y基因的纯合修饰，从而使基因灭活。
表2A.示例性PCDH11Y gRNA靶序列-外显子1
表2B.示例性PCDH11Y gRNA靶序列-外显子2
在一些实施方案中，gRNA靶序列针对PCDH11Y基因的外显子1或外显子2。在一些实施方案中，gRNA靶序列是表2A和/或表2B的gRNA，其诱导移码突变以使外显子1或外显子2灭活。
在一些实施方案中，通过PCDH11Y基因的外显子1或外显子2内的插入或缺失使PCDH11Y基因的表达部分或完全灭活。
测试PCDH11Y基因是否已灭活的测定是已知的并且在本文中描述。在一个实施方案中，通过PCR得到的PCDH11Y基因遗传修饰和Y-连锁原钙粘蛋白11抗原蛋白表达的降低可以通过FACS分析进行测定。在另一个实施方案中，使用用针对Y-连锁原钙粘蛋白11抗原蛋白的抗体探测的细胞裂解物的蛋白质印迹来检测Y-连锁原钙粘蛋白11抗原蛋白表达。在另一个实施方案中，逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)用于确认灭活遗传修饰的存在。
P.Y-连锁神经连接蛋白4
在某些实施方案中，本文公开的技术通过靶向和调节(例如，降低或消除)Y-连锁神经连接蛋白4基因(例如，NLGN4Y)的表达来调节(例如，降低或消除)Y-连锁神经连接蛋白4抗原的表达。在一些实施方案中，使用基因编辑系统(例如，CRISPR/Cas系统)进行调节。在一些实施方案中，细胞在受体受试者中诱导先天和/或适应性免疫反应的能力降低。
在一些实施方案中，本公开的靶多核苷酸序列是NLGN4Y基因的变体。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是NLGN4Y基因的同源物。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是NLGN4Y基因的直向同源物。
在一些实施方案中，本文所述的细胞在编码Y-连锁神经连接蛋白4抗原蛋白的基因座处包含基因修饰。换句话说，细胞在NLGN4Y基因座处包含遗传修饰。在一些情况下，编码Y-连锁神经连接蛋白4抗原蛋白的核苷酸序列在RefSeq.No.N NM_001164238.1、NM_001206850.1、NM_014893.4、XM_017030034.1、XM_017030035.1、XM_017030036.1、XM_017030037.1、XM_017030038.1、XM_017030040.1或XM_017030041.1中，或在GenbankNo.AF376804、AB023168、BX537428、AC010726、AC010879、AC010979、AC011903、BC032567、BC113525或BC113551中列出。在一些情况下，NLGN4Y基因座在NCBI Gene ID No.22829中描述。在某些情况下，Y-连锁神经连接蛋白4抗原的氨基酸序列描绘为NCBI GenBankNo.AAM46113.1、BAA76795.2、CAD97670.1、AAH32567.1、AAI13526.1或AAI13552.1。Y-连锁神经连接蛋白4抗原蛋白和基因座的额外描述可见于Uniprot No.Q8NFZ3、HGNCRef.No.15529和OMIM Ref.No.400028。
在一些实施方案中，本文概述的工程化和/或低免疫原性细胞包含靶向NLGN4Y基因的遗传修饰。在一些实施方案中，通过使用基因编辑工具(诸如但不限于CRISPR/Cas、TALE-核酸酶、锌指核酸酶、其他基于病毒的基因编辑系统或RNA干扰)对NLGN4Y基因进行基因编辑来生成靶向NLGN4Y基因的遗传修饰。在一些实施方案中，基因编辑靶向NLGN4Y基因的编码序列。在一些情况下，细胞不会生成功能性NLGN4Y基因产物。在不存在NLGN4Y基因产物的情况下，细胞完全缺乏Y-连锁神经连接蛋白4抗原。
在一些实施方案中，Cas9或Cas12a编辑系统用于靶向NLGN4Y基因的序列以将插入或缺失引入基因中来破坏其功能，并且在一些情况下使其灭活。在一些实施方案中，使用单一指导RNA。在一些实施方案中，使用双指导RNA。在一些实施方案中，使用表3、表4和/或表5的gRNA靶序列中的任一种。在一些情况下，使用表3、表4和/或表5的超过一种gRNA靶序列用于基因编辑。在一些实施方案中，Cas9编辑系统包含Cas9蛋白或其片段、tracrRNA和crRNA。在一些实施方案中，Cas12a编辑系统包含Cas12a蛋白或其片段和crRNA。
在一些实施方案中，在基因的任何编码序列中引入移码插入-缺失。在一些实施方案中，在基因的UTR、内含子或外显子内添加修饰以破坏NLGN4Y基因的功能。在一些实施方案中，使用包含表3、表4和/或表5的gRNA靶序列中的任何一种或多种的CRISPR/Cas编辑。
在一些实施方案中，将修饰引入NLGN4Y基因中以使所述基因灭活。在一些实施方案中，靶向诸如NLGN4Y基因的外显子3或外显子4或外显子5的编码外显子。在一些情况下，使用Cas编辑系统和靶向NLGN4Y基因的5’处序列的指导RNA靶序列以及靶向外显子(诸如但不限于外显子3或外显子4或外显子5)的指导RNA靶序列来产生缺失。在一些实施方案中，本文所述的细胞包含NLGN4Y基因的纯合修饰，从而使基因灭活。
表3.示例性NLGN4Y gRNA靶序列-外显子3
表4.示例性NLGN4Y gRNA靶序列-外显子4
SEQ ID NO 位置 链 序列 PAM
285 301455 1 GTTTTTAAGTACCGGTGACC AGG
286 301455 -1 GCCTTTTGCTGCCTGGTCAC CGG
287 301462 -1 CATAGTTGCCTTTTGCTGCC TGG
288 301465 1 ACCGGTGACCAGGCAGCAAA AGG
289 301474 1 CAGGCAGCAAAAGGCAACTA TGG
290 301475 1 AGGCAGCAAAAGGCAACTAT GGG
291 301482 1 AAAAGGCAACTATGGGCTCC TGG
292 301489 -1 TCAGTGCTTGAATCTGATCC AGG
293 301502 1 TGGATCAGATTCAAGCACTG AGG
294 301505 1 ATCAGATTCAAGCACTGAGG TGG
295 301512 1 TCAAGCACTGAGGTGGATTG AGG
296 301522 1 AGGTGGATTGAGGAGAATGT CGG
297 301531 1 GAGGAGAATGTCGGAGCCTT TGG
298 301534 1 GAGAATGTCGGAGCCTTTGG CGG
299 301535 1 AGAATGTCGGAGCCTTTGGC GGG
300 301536 1 GAATGTCGGAGCCTTTGGCG GGG
301 301536 -1 TCTCTTGGGGTCCCCGCCAA AGG
302 301549 -1 CAAAGATAGTCACTCTCTTG GGG
303 301550 -1 CCAAAGATAGTCACTCTCTT GGG
304 301551 -1 GCCAAAGATAGTCACTCTCT TGG
305 301561 1 CCCAAGAGAGTGACTATCTT TGG
306 301566 1 GAGAGTGACTATCTTTGGCT CGG
307 301567 1 AGAGTGACTATCTTTGGCTC GGG
308 301568 1 GAGTGACTATCTTTGGCTCG GGG
309 301569 1 AGTGACTATCTTTGGCTCGG GGG
310 301573 1 ACTATCTTTGGCTCGGGGGC TGG
311 301574 1 CTATCTTTGGCTCGGGGGCT GGG
312 301575 1 TATCTTTGGCTCGGGGGCTG GGG
313 301587 -1 GGTCAACAGGCTGACACAGG AGG
314 301590 -1 CAGGGTCAACAGGCTGACAC AGG
315 301600 -1 AGTAGTGGGACAGGGTCAAC AGG
表5.示例性NLGN4Y gRNA靶序列-外显子5
在一些实施方案中，gRNA靶序列针对NLGN4Y基因的外显子1或外显子2。在一些实施方案中，gRNA靶序列是表3、表4和/或表5的gRNA，其诱导移码突变以使外显子3、外显子4或外显子5灭活。
在一些实施方案中，通过NLGN4Y基因的外显子3、外显子4或外显子5内的插入或缺失使NLGN4Y基因的表达部分或完全灭活。
测试NLGN4Y基因是否已灭活的测定是已知的并且在本文中描述。在一个实施方案中，通过PCR得到的NLGN4Y基因的遗传修饰和Y-连锁神经连接蛋白4抗原蛋白表达的降低可以通过FACS分析进行测定。在另一个实施方案中，使用用针对Y-连锁神经连接蛋白4抗原蛋白的抗体探测的细胞裂解物的蛋白质印迹来检测Y-连锁神经连接蛋白4抗原蛋白表达。在另一个实施方案中，逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)用于确认灭活遗传修饰的存在。
Q.嵌合抗原受体
本文提供了包含嵌合抗原受体(CAR)的低免疫原性细胞。在一些实施方案中，CAR与CD19结合。在一些实施方案中，CAR与CD20结合。在一些实施方案中，CAR与CD22结合。在一些实施方案中，CAR与CD19结合。在一些实施方案中，CAR与CD19和CD22结合。在一些实施方案中，CAR选自由第一代CAR、第二代CAR、第三代CAR和第四代CAR组成的组。在一些实施方案中，CAR包括与单一靶抗原结合的单一结合结构域。在一些实施方案中，CAR包括与多于一种靶抗原(例如，2、3或更多种靶抗原)结合的单一结合结构域。在一些实施方案中，CAR包括两个结合结构域，使得每个结合结构域与不同的靶抗原结合。在一些实施方案中，CAR包括两个结合结构域，使得每个结合结构域与相同的靶抗原结合。包括CD19特异性、CD20特异性、CD19/CD20双特异性CAR、CD22特异性和CD19/CD22双特异性CAR的示例性CAR的详细描述可见于WO2012/079000、WO2016/149578和WO2020/014482，包括序列表和附图的公开内容通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，CAR包括两个结合结构域，使得每个结合结构域与相同的靶抗原结合。
在一些实施方案中，CD19特异性CAR包括抗CD19单链抗体片段(scFv)、跨膜结构域(诸如来源于人CD8α的跨膜结构域)、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域和CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，CD20特异性CAR包括抗CD20 scFv、跨膜结构域(诸如来源于人CD8α的跨膜结构域)、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域和CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，CD19/CD20双特异性CAR包括抗CD19 scFv、抗CD20 scFv、跨膜结构域(诸如来源于人CD8α的跨膜结构域)、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域和CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，CD22特异性CAR包括抗CD22 scFv、跨膜结构域(诸如来源于人CD8α的跨膜结构域)、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域和CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，CD19/CD22双特异性CAR包括抗CD19 scFv、抗CD22scFv、跨膜结构域(诸如源自人CD8α的跨膜结构域)、4-1BB(CD137)共刺激信号传导结构域和CD3ζ信号传导结构域。
在一些实施方案中，CAR包含由T细胞携带的商业CAR构建体。基于商业CAR-T细胞的疗法的非限制性实例包括得自Cartesian Therapeutics的布瑞基奥仑赛(brexucabtagene autoleucel)阿基仑赛艾基维仑赛(idecabtagene vicleucel)利基迈仑赛(lisocabtagene maraleucel)替沙仑赛Descartes-08和Descartes-11、得自Novartis的CTL119、得自Poseida Therapeutics的P-BMCA-101、得自PrecisionBiosciences的PBCAR19B和PBCAR269A、得自Fate Therapeutics的FT819以及得自ClyadOncology的CYAD-211。
在一些实施方案中，本文所述的低免疫原性细胞包含多核苷酸，所述多核苷酸编码包含抗原结合结构域的嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，本文所述的低免疫原性细胞包含有包含抗原结合结构域的嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，多核苷酸是或包含有包含抗原结合结构域的嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，CAR是或包含有包含抗原结合结构域、跨膜结构域和至少一个信号传导结构域(例如，一个、两个或三个信号传导结构域)的第一代CAR。在一些实施方案中，CAR包含含有抗原结合结构域、跨膜结构域和至少两个信号传导结构域的第二代CAR。在一些实施方案中，CAR包含含有抗原结合结构域、跨膜结构域和至少三个信号传导结构域的第三代CAR。在一些实施方案中，第四代CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域、三个或四个信号传导结构域和在CAR成功信号传导时诱导细胞因子基因表达的结构域。在一些实施方案中，抗原结合结构域是或包含抗体、抗体片段、scFv或Fab。
1.抗原结合结构域(ABD)靶向肿瘤细胞或癌细胞特征性抗原
在一些实施方案中，抗原结合结构域(ABD)靶向肿瘤细胞特征性抗原。换句话说，抗原结合结构域靶向肿瘤细胞或癌细胞表达的抗原。在一些实施方案中，ABD结合肿瘤相关抗原。在一些实施方案中，肿瘤细胞特征性抗原(例如，与肿瘤细胞或癌细胞相关的抗原)或肿瘤相关抗原选自细胞表面受体、离子通道连接的受体、酶连接的受体、G蛋白偶联受体、受体酪氨酸激酶、酪氨酸激酶相关受体、受体样酪氨酸磷酸酶、受体丝氨酸/苏氨酸激酶、受体鸟苷酰环化酶、组氨酸激酶相关受体、表皮生长因子受体(EGFR)(包括ErbB1/EGFR、ErbB2/HER2、ErbB3/HER3和ErbB4/HER4)、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)(包括FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF18和FGF21)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)(包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和PIGF)、RET受体和Eph受体家族(包括EphA1、EphA2、EphA3、EphA4、EphA5、EphA6、EphA7、EphA8、EphA9、EphA10、EphB1、EphB2、EphB3、EphB4和EphB6)、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR6、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR8、CFTR、CIC-1、CIC-2、CIC-4、CIC-5、CIC-7、CIC-Ka、CIC-Kb、Bestrophins、TMEM16A、GABA受体、甘氨酸受体、ABC转运蛋白、NAV1.1、NAV1.2、NAV1.3、NAV1.4、NAV1.5、NAV1.6、NAV1.7、NAV1.8、NAV1.9、鞘氨醇-1-磷酸受体(S1P1R)、NMDA通道、跨膜蛋白、多跨跨膜蛋白、T细胞受体基序、T细胞α链、T细胞β链、T细胞γ链、T细胞δ链、CCR7、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD11b、CD11c、CD16、CD19、CD20、CD21、CD22、CD25、CD28、CD34、CD35、CD40、CD45RA、CD45RO、CD52、CD56、CD62L、CD68、CD80、CD95、CD117、CD127、CD133、CD137(4-1BB)、CD163、F4/80、IL-4Ra、Sca-1、CTLA-4、GITR、GARP、LAP、粒酶B、LFA-1、转铁蛋白受体、NKp46、穿孔素、CD4+、Th1、Th2、Th17、Th40、Th22、Th9、Tfh、典型Treg、FoxP3+、Tr1、Th3、Treg17、TREG、CDCP、NT5E、EpCAM、CEA、gpA33、粘蛋白、TAG-72、碳酸酐酶IX、PSMA、叶酸结合蛋白、神经节苷脂(例如，CD2、CD3、GM2)、Lewis-γ2、VEGF、VEGFR 1/2/3、αVβ3、α5β1、ErbB1/EGFR、ErbB1/HER2、ErB3、c-MET、IGF1R、EphA3、TRAIL-R1、TRAIL-R2、RANKL、FAP、肌腱蛋白、PDL-1、BAFF、HDAC、ABL、FLT3、KIT、MET、RET、IL-1β、ALK、RANKL、mTOR、CTLA-4、IL-6、IL-6R、JAK3、BRAF、PTCH、Smoothened、PIGF、ANPEP、TIMP1、PLAUR、PTPRJ、LTBR、ANTXR1、叶酸受体α(FRa)、ERBB2(Her2/neu)、EphA2、IL-13Ra2、表皮生长因子受体(EGFR)、间皮素、TSHR、CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、MUC16(CA125)、L1CAM、LeY、MSLN、IL13Rα1、L1-CAM、Tn Ag、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、白介素-11受体a(IL-11Ra)、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、血小板源生长因子受体-β(PDGFR-β)、SSEA-4、CD20、MUC1、NCAM、前列腺酶、PAP、ELF2M、肝配蛋白B2、IGF-1受体、CAIX、LMP2、gpl00、bcr-abl、酪氨酸酶、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLACl、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-la、MAGE-A1、legumain、HPV E6、E7、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、主要组织相容性复合物I类相关基因蛋白(MR1)、尿激酶型纤溶酶原活化因子受体(uPAR)、Fos-相关抗原1、p53、p53突变体、prostein、生存素、端粒酶、PCTA-1/半乳凝素8、MelanA/MART1、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、细胞周期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYPIB I、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、新抗原、CD133、CD15、CD184、CD24、CD56、CD26、CD29、CD44、HLA-A、HLA-B、HLA-C、(HLA-A,B,C)CD49f、CD151 CD340、CD200、tkrA、trkB或trkC或其抗原片段或抗原部分。
2.ABD靶向T细胞特征性抗原
在一些实施方案中，抗原结合结构域靶向T细胞特征性抗原。在一些实施方案中，ABD结合与T细胞相关的抗原。在一些情况下，这种抗原由T细胞表达或位于T细胞的表面上。在一些实施方案中，T细胞特征性抗原或T细胞相关抗原选自细胞表面受体、膜转运蛋白(例如，主动或被动转运蛋白，例如，离子通道蛋白、成孔蛋白等)、跨膜受体、膜酶和/或T细胞特征性细胞粘附蛋白。在一些实施方案中，T细胞特征性抗原可以是G蛋白偶联受体、受体酪氨酸激酶、酪氨酸激酶相关受体、受体样酪氨酸磷酸酶、受体丝氨酸/苏氨酸激酶、受体鸟苷酰环化酶、组氨酸激酶相关受体、AKT1、AKT2、AKT3、ATF2、BCL10、CALM1、CD3D(CD3δ)、CD3E(CD3ε)、CD3G(CD3γ)、CD4、CD8、CD28、CD45、CD80(B7-1)、CD86(B7-2)、CD247(CD3ζ)、CTLA-4(CD152)、ELK1、ERK1(MAPK3)、ERK2、FOS、FYN、GRAP2(GADS)、GRB2、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HRAS、IKBKA(CHUK)、IKBKB、IKBKE、IKBKG(NEMO)、IL2、ITPR1、ITK、JUN、KRAS2、LAT、LCK、MAP2K1(MEK1)、MAP2K2(MEK2)、MAP2K3(MKK3)、MAP2K4(MKK4)、MAP2K6(MKK6)、MAP2K7(MKK7)、MAP3K1(MEKK1)、MAP3K3、MAP3K4、MAP3K5、MAP3K8、MAP3K14(NIK)、MAPK8(JNK1)、MAPK9(JNK2)、MAPK10(JNK3)、MAPK11(p38β)、MAPK12(p38γ)、MAPK13(p38δ)、MAPK14(p38α)、NCK、NFAT1、NFAT2、NFKB1、NFKB2、NFKBIA、NRAS、PAK1、PAK2、PAK3、PAK4、PIK3C2B、PIK3C3(VPS34)、PIK3CA、PIK3CB、PIK3CD、PIK3R1、PKCA、PKCB、PKCM、PKCQ、PLCY1、PRF1(穿孔素)、PTEN、RAC1、RAF1、RELA、SDF1、SHP2、SLP76、SOS、SRC、TBK1、TCRA、TEC、TRAF6、VAV1、VAV2或ZAP70。
3.ABD靶向自身免疫性疾病/病症和/或炎性疾病/病症特征性抗原
在一些实施方案中，抗原结合结构域靶向自身免疫性疾病/病症和/或炎性疾病/病症特征性抗原。在一些实施方案中，ABD结合与自身免疫或炎性病症相关的抗原。在一些情况下，抗原由与自身免疫性疾病/病症和/或炎性疾病/病症相关的细胞表达。在一些实施方案中，自身免疫或炎性病症选自慢性移植物抗宿主病(GVHD)、狼疮、关节炎、免疫复合物肾小球肾炎、古德帕斯丘综合征、葡萄膜炎、肝炎、系统性硬化症或硬皮病、I型糖尿病、多发性硬化、冷凝集素病、寻常型天疱疮、格雷夫氏病、自身免疫性溶血性贫血、A型血友病、原发性干燥综合征、血栓性血小板减少性紫癜、视神经脊髓炎、埃文氏综合征、IgM介导的神经病、冷球蛋白血症、皮肌炎、特发性血小板减少症、强直性脊柱炎、大疱性类天疱疮、获得性血管性水肿、慢性荨麻疹、抗磷脂脱髓鞘性多发性神经病和自身免疫性血小板减少症或中性粒细胞减少症或纯红细胞再生障碍，虽然同种免疫疾病的示例性非限制性实例包括同种异体致敏(参见例如Blazar等人,2015,Am.J.Transplant,15(4):931-41)或来自造血或实体器官移植、输血、妊娠与胎儿的异种致敏、新生儿同种免疫血小板减少症、新生儿溶血性疾病、对外来抗原的致敏，诸如用酶或蛋白质替代疗法治疗的遗传性或获得性缺陷病症的替代、血液制品和基因疗法可发生。在一些实施方案中，自身免疫或炎性病症特征性抗原选自细胞表面受体、离子通道连接的受体、酶连接的受体、G蛋白偶联受体、受体酪氨酸激酶、酪氨酸激酶相关受体、受体样酪氨酸磷酸酶、受体丝氨酸/苏氨酸激酶、受体鸟苷酸环化酶或组氨酸激酶相关受体。
在一些实施方案中，CAR的抗原结合结构域结合B细胞、浆细胞或成浆细胞上表达的配体。在一些实施方案中，CAR的抗原结合结构域结合CD10、CD19、CD20、CD22、CD24、CD27、CD38、CD45R、CD138、CD319、BCMA、CD28、TNF、干扰素受体、GM-CSF、ZAP-70、LFA-1、CD3γ、CD5或CD2。参见例如US2003/0077249；WO 2017/058753；WO 2017/058850；US2021/0230245；WO2019/201995A1；EP 3 781 590 A1，其内容通过引用并入本文。
4.ABD靶向衰老细胞特征性抗原
在一些实施方案中，抗原结合结构域靶向衰老细胞特征性抗原，例如尿激酶型纤溶酶原活化因子受体(uPAR)。在一些实施方案中，ABD结合与衰老细胞相关的抗原。在一些情况下，抗原由衰老细胞表达。在一些实施方案中，CAR可用于治疗或预防以衰老细胞的异常积累为特征的病症，例如肝和肺纤维化、动脉粥样硬化、糖尿病和骨关节炎。
5.ABD靶向感染性疾病特征性抗原
在一些实施方案中，抗原结合结构域靶向感染性疾病特征性抗原。在一些实施方案中，ABD结合与感染性疾病相关的抗原。在一些情况下，抗原由感染性疾病的细胞表达。在一些实施方案中，其中感染性疾病选自HIV、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人疱疹病毒、人疱疹病毒8型(HHV-8、卡波西肉瘤相关疱疹病毒(KSHV))、人T-淋巴细胞病毒-1性(HTLV-1)、默克尔细胞多瘤病毒(MCV)、猿猴病毒40(SV40)、爱泼斯坦-巴尔病毒、CMV、人乳头瘤病毒。在一些实施方案中，感染性疾病特征性抗原选自细胞表面受体、离子通道连接的受体、酶连接的受体、G蛋白偶联受体、受体酪氨酸激酶、酪氨酸激酶相关受体、受体样酪氨酸磷酸酶、受体丝氨酸/苏氨酸激酶、受体鸟苷酸环化酶、组氨酸激酶相关受体、HIV Env、gpl20或HIV-1Env上的CD4诱导的表位。
6.ABD结合细胞的细胞表面抗原
在一些实施方案中，抗原结合结构域与细胞的细胞表面抗原结合。在一些实施方案中，细胞表面抗原是具体或特定细胞类型的特征(例如，由其表达)。在一些实施方案中，细胞表面抗原是多于一种类型的细胞的特征。
在一些实施方案中，CAR抗原结合结构域结合T细胞特征性细胞表面抗原，诸如T细胞上的细胞表面抗原。在一些实施方案中，T细胞特征性抗原可以是细胞表面受体、膜转运蛋白(例如，主动或被动转运蛋白，例如，离子通道蛋白、成孔蛋白等)、跨膜受体、膜酶和/或T细胞特征性细胞粘附蛋白。在一些实施方案中，T细胞特征性抗原可以是G蛋白偶联受体、受体酪氨酸激酶、酪氨酸激酶相关受体、受体样酪氨酸磷酸酶、受体丝氨酸/苏氨酸激酶、受体鸟苷酸环化酶或组氨酸激酶相关受体。
在一些实施方案中，CAR的抗原结合结构域结合T细胞受体。在一些实施方案中，T细胞受体可以是AKT1、AKT2、AKT3、ATF2、BCL10、CALM1、CD3D(CD3δ)、CD3E(CD3ε)、CD3G(CD3γ)、CD4、CD8、CD28、CD45、CD80(B7-1)、CD86(B7-2)、CD247(CD3ζ)、CTLA-4(CD152)、ELK1、ERK1(MAPK3)、ERK2、FOS、FYN、GRAP2(GADS)、GRB2、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HRAS、IKBKA(CHUK)、IKBKB、IKBKE、IKBKG(NEMO)、IL2、ITPR1、ITK、JUN、KRAS2、LAT、LCK、MAP2K1(MEK1)、MAP2K2(MEK2)、MAP2K3(MKK3)、MAP2K4(MKK4)、MAP2K6(MKK6)、MAP2K7(MKK7)、MAP3K1(MEKK1)、MAP3K3、MAP3K4、MAP3K5、MAP3K8、MAP3K14(NIK)、MAPK8(JNK1)、MAPK9(JNK2)、MAPK10(JNK3)、MAPK11(p38β)、MAPK12(p38γ)、MAPK13(p38δ)、MAPK14(p38α)、NCK、NFAT1、NFAT2、NFKB1、NFKB2、NFKBIA、NRAS、PAK1、PAK2、PAK3、PAK4、PIK3C2B、PIK3C3(VPS34)、PIK3CA、PIK3CB、PIK3CD、PIK3R1、PKCA、PKCB、PKCM、PKCQ、PLCY1、PRF1(穿孔素)、PTEN、RAC1、RAF1、RELA、SDF1、SHP2、SLP76、SOS、SRC、TBK1、TCRA、TEC、TRAF6、VAV1、VAV2或ZAP70。
7.跨膜结构域
在一些实施方案中，CAR跨膜结构域包含以下的至少一个跨膜区：T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154或其功能变体。在一些实施方案中，跨膜结构域至少包含以下的跨膜区：CD8α、CD8β、4-1BB/CD137、CD28、CD34、CD4、FcεRIγ、CD16、OX40/CD134、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、TCRβ、TCRζ、CD32、CD64、CD64、CD45、CD5、CD9、CD22、CD37、CD80、CD86、CD40、CD40L/CD154、VEGFR2、FAS和FGFR2B或其功能变体。抗原结合结构域结合
8.信号传导结构域或多个信号传导结构域
在一些实施方案中，本文所述的CAR包含选自以下中的一种或多种的一个或至少一个信号传导结构域：B7-1/CD80；B7-2/CD86；B7-H1/PD-L1；B7-H2；B7-H3；B7-H4；B7-H6；B7-H7；BTLA/CD272；CD28；CTLA-4；Gi24/VISTA/B7-H5；ICOS/CD278；PD-1；PD-L2/B7-DC；PDCD6)；4-1BB/TNFSF9/CD137；4-1BB配体/TNFSF9；BAFF/BLyS/TNFSF13B；BAFF R/TNFRSF13C；CD27/TNFRSF7；CD27配体/TNFSF7；CD30/TNFRSF8；CD30配体/TNFSF8；CD40/TNFRSF5；CD40/TNFSF5；CD40配体/TNFSF5；DR3/TNFRSF25；GITR/TNFRSF18；GITR配体/TNFSF18；HVEM/TNFRSF14；LIGHT/TNFSF14；淋巴毒素-α/TNF-β；OX40/TNFRSF4；OX40配体/TNFSF4；RELT/TNFRSF19L；TACI/TNFRSF13B；TL1A/TNFSF15；TNF-α；TNF RII/TNFRSF1B)；2B4/CD244/SLAMF4；BLAME/SLAMF8；CD2；CD2F-10/SLAMF9；CD48/SLAMF2；CD58/LFA-3；CD84/SLAMF5；CD229/SLAMF3；CRACC/SLAMF7；NTB-A/SLAMF6；SLAM/CD150)；CD2；CD7；CD53；CD82/Kai-1；CD90/Thy1；CD96；CD160；CD200；CD300a/LMIR1；HLA I类；HLA-DR；Ikaros；整联蛋白α4/CD49d；整联蛋白α4β1；整联蛋白α4β7/LPAM-1；LAG-3；TCL1A；TCL1B；CRTAM；DAP12；Dectin-1/CLEC7A；DPPIV/CD26；EphB6；TIM-1/KIM-1/HAVCR；TIM-4；TSLP；TSLP R；淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)；NKG2C、CD3ζ结构域、基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)、CD27、CD28、4-1BB、CD134/OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、特异性地结合CD83的配体、或其功能片段。
在一些实施方案中，至少一个信号传导结构域包含CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能变体。在其他实施方案中，至少一个信号传导结构域包含(i)CD3ζ结构域，或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)，或其功能变体；以及(ii)CD28结构域，或4-1BB结构域，或其功能变体。在其他实施方案中，至少一个信号传导结构域包含(i)CD3ζ结构域，或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)，或其功能变体；(ii)CD28结构域或其功能变体；以及(iii)4-1BB结构域，或CD134结构域，或其功能变体。在一些实施方案中，至少一个信号传导结构域包含(i)CD3ζ结构域，或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)，或其功能变体；(ii)CD28结构域或其功能变体；(iii)4-1BB结构域，或CD134结构域，或其功能变体；以及(iv)细胞因子或共刺激配体转基因。
在一些实施方案中，至少两个信号传导结构域包含CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能变体。在其他实施方案中，至少两个信号传导结构域包含(i)CD3ζ结构域，或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)，或其功能变体；以及(ii)CD28结构域，或4-1BB结构域，或其功能变体。在其他实施方案中，至少一个信号传导结构域包含(i)CD3ζ结构域，或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)，或其功能变体；(ii)CD28结构域或其功能变体；以及(iii)4-1BB结构域，或CD134结构域，或其功能变体。在一些实施方案中，至少两个信号传导结构域包含(i)CD3ζ结构域，或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)，或其功能变体；(ii)CD28结构域或其功能变体；(iii)4-1BB结构域，或CD134结构域，或其功能变体；以及(iv)细胞因子或共刺激配体转基因。
在一些实施方案中，至少三个信号传导结构域包含CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能变体。在其他实施方案中，至少三个信号传导结构域包含(i)CD3ζ结构域，或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)，或其功能变体；以及(ii)CD28结构域，或4-1BB结构域，或其功能变体。在其他实施方案中，至少三个信号传导结构域包含(i)CD3ζ结构域，或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)，或其功能变体；(ii)CD28结构域或其功能变体；以及(iii)4-1BB结构域，或CD134结构域，或其功能变体。在一些实施方案中，至少三个信号传导结构域包含(i)CD3ζ结构域，或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)，或其功能变体；(ii)CD28结构域或其功能变体；(iii)4-1BB结构域，或CD134结构域，或其功能变体；以及(iv)细胞因子或共刺激配体转基因。
在一些实施方案中，CAR包含CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能变体。在一些实施方案中，CAR包含(i)CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能变体；和(ii)CD28结构域或4-1BB结构域或其功能变体。
在一些实施方案中，CAR包含(i)CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能变体；(ii)CD28结构域或其功能变体；和(iii)4-1BB结构域或CD134结构域或其功能变体。
在一些实施方案中，CAR包含(i)CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能变体；(ii)CD28结构域或4-1BB结构域或其功能变体，和/或(iii)4-1BB结构域或CD134结构域或其功能变体。
在一些实施方案中，CAR包含(i)CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能变体；(ii)CD28结构域或其功能变体；(iii)4-1BB结构域或CD134结构域或其功能变体；和(iv)细胞因子或共刺激配体转基因。
9.在CAR成功信号传导后诱导细胞因子基因表达的结构域
在一些实施方案中，第一、第二、第三或第四代CAR还包含在CAR成功信号传导后诱导细胞因子基因表达的结构域。在一些实施方案中，细胞因子基因对于包含CAR的靶细胞是内源性或外源性的，该CAR包含在CAR成功信号传导后诱导细胞因子基因表达的结构域。在一些实施方案中，细胞因子基因编码促炎细胞因子。在一些实施方案中，细胞因子基因编码IL-1、IL-2、IL-9、IL-12、IL-18、TNF或IFN-γ或其功能片段。在一些实施方案中，在CAR成功信号传导后诱导细胞因子基因表达的结构域是或包含转录因子或其功能结构域或片段。在一些实施方案中，在CAR成功信号传导后诱导细胞因子基因表达的结构域是或包含转录因子或其功能结构域或片段。在一些实施方案中，转录因子或其功能结构域或片段是或包含活化T细胞的核因子(NFAT)、NF-kB或其功能结构域或片段。参见例如Zhang.C.等人,Engineering CAR-T cells.Biomarker Research.5:22(2017)；WO 2016126608；Sha,H.等人Chimaeric antigen receptor T-cell therapy for tumourimmunotherapy.Bioscience Reports,2017年1月27日,37(1)。
在一些实施方案中，CAR还包含一个或多个间隔区，例如，其中所述间隔区是抗原结合结构域与跨膜结构域之间的第一间隔区。在一些实施方案中，第一间隔区包括免疫球蛋白恒定区或其变体或修饰形式的至少一部分。在一些实施方案中，间隔区是跨膜结构域与信号传导结构域之间的第二间隔区。在一些实施方案中，第二间隔区是寡肽，例如，其中寡肽包含甘氨酸和丝氨酸残基，例如但不限于甘氨酸-丝氨酸双联体。在一些实施方案中，CAR包含两个或更多个间隔区，例如抗原结合结构域与跨膜结构域之间的间隔区以及跨膜结构域与信号传导结构域之间的间隔区。
在一些实施方案中，本文所述的任一种细胞包含编码CAR或第一代CAR的核酸。在一些实施方案中，第一代CAR包含一个抗原结合结构域、一个跨膜结构域和一个信号传导结构域。在一些实施方案中，信号传导结构域在T细胞活化过程中介导下游信号传导。
在一些实施方案中，本文所述的任一种细胞包含编码CAR或第二代CAR的核酸。在一些实施方案中，第二代CAR包含一个抗原结合结构域、一个跨膜结构域和两个信号传导结构域。在一些实施方案中，信号传导结构域在T细胞活化过程中介导下游信号传导。在一些实施方案中，信号传导结构域是共刺激结构域。在一些实施方案中，共刺激结构域增强T细胞活化过程中的细胞因子产生、CAR-T细胞增殖和/或CAR-T细胞持久性。
在一些实施方案中，本文所述的任一种细胞包含编码CAR或第三代CAR的核酸。在一些实施方案中，第三代CAR包含一个抗原结合结构域、一个跨膜结构域和至少三个信号传导结构域。在一些实施方案中，信号传导结构域在T细胞活化过程中介导下游信号传导。在一些实施方案中，信号传导结构域是共刺激结构域。在一些实施方案中，共刺激结构域增强T细胞活化过程中的细胞因子产生、CAR-T细胞增殖和/或CAR-T细胞持久性。在一些实施方案中，第三代CAR包含至少两个共刺激结构域。在一些实施方案中，至少两个共刺激结构域不同。
在一些实施方案中，本文所述的任一种细胞包含编码CAR或第四代CAR的核酸。在一些实施方案中，第四代CAR包含一个抗原结合结构域、一个跨膜结构域和至少两个、三个或四个信号传导结构域。在一些实施方案中，信号传导结构域在T细胞活化过程中介导下游信号传导。在一些实施方案中，信号传导结构域是共刺激结构域。在一些实施方案中，共刺激结构域增强T细胞活化过程中的细胞因子产生、CAR-T细胞增殖和/或CAR-T细胞持久性。
10.包含抗体或其抗原结合部分的ABD
在一些实施方案中，CAR抗原结合结构域是或包含抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，CAR抗原结合结构域是或包含scFv或Fab。在一些实施方案中，CAR抗原结合结构域包含CD19抗体、CD22抗体、T细胞α链抗体、T细胞β链抗体、T细胞γ链抗体、T细胞δ链抗体、CCR7抗体、CD3抗体、CD4抗体、CD5抗体、CD7抗体、CD8抗体、CD11b抗体、CD11c抗体、CD16抗体、CD20抗体、CD21抗体、CD25抗体、CD28抗体、CD34抗体、CD35抗体、CD40抗体、CD45RA抗体、CD45RO抗体、CD52抗体、CD56抗体、CD62L抗体、CD68抗体、CD80抗体、CD95抗体、CD117抗体、CD127抗体、CD133抗体、CD137(4-1BB)抗体、CD163抗体、F4/80抗体、IL-4Ra抗体、Sca-1抗体、CTLA-4抗体、GITR抗体、GARP抗体、LAP抗体、粒酶B抗体、LFA-1抗体、MR1抗体、uPAR抗体或转铁蛋白受体抗体的scFv或Fab片段。
在一些实施方案中，CAR包含作为共刺激结构域的信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR包含第二共刺激结构域。在一些实施方案中，CAR包含至少两个共刺激结构域。在一些实施方案中，CAR包含至少三个共刺激结构域。在一些实施方案中，CAR包含共刺激结构域，该共刺激结构域选自CD27、CD28、4-1BB、CD134/OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体中的一种或多种。在一些实施方案中，如果CAR包含两个或更多个共刺激结构域，则两个共刺激结构域是不同的。在一些实施方案中，如果CAR包含两个或更多个共刺激结构域，则两个共刺激结构域是相同的。
除了本文所述的CAR之外，多种嵌合抗原受体和编码其的核苷酸序列是本领域已知的，并且将适用于如本文所述的体内和体外的靶细胞的融合体递送和重编程。参见例如WO2013040557、WO2012079000、WO2016030414、Smith T等人,NatureNanotechnology.2017.DOI:10.1038/NNANO.2017.57，它们的公开内容通过引用并入本文。
11.CAR的额外描述
在某些实施方案中，细胞可包含编码CAR的外源多核苷酸。CAR(也称为嵌合免疫受体、嵌合T细胞受体或人工T细胞受体)是已经被工程化以给予宿主细胞(例如，T细胞)靶向特定蛋白质的新能力的受体蛋白。所述受体是嵌合的，因为它们将抗原结合和T细胞活化功能结合在单个受体中。本公开的多顺反子载体可用于在宿主细胞(例如，T细胞)中表达一种或多种CAR以用于针对各种靶抗原的基于细胞的疗法。由一个或多个表达盒表达的CAR可以相同或不同。在这些实施方案中，CAR可以包含特异性结合靶抗原的胞外结合结构域(也称为“结合剂”)、跨膜结构域和胞内信号传导结构域。在某些实施方案中，CAR还可以包含一种或多种另外的元件，包括一种或多种信号肽、一种或多种胞外铰链结构域和/或一种或多种胞内共刺激结构域。结构域可以彼此直接相邻，或者可以有一个或多个氨基酸连接结构域。编码CAR的核苷酸序列可以源自哺乳动物序列，例如小鼠序列、灵长类动物序列、人序列或它们的组合。在编码CAR的核苷酸序列是非人的情况下，CAR的序列可以是人源化的。编码CAR的核苷酸序列还可以针对在哺乳动物细胞例如人细胞中表达进行密码子优化。在这些实施方案的任一个中，编码CAR的核苷酸序列可以与本文公开的核苷酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)。序列变异可能是由于密码子优化、人源化、基于限制酶的克隆疤痕和/或连接功能结构域的额外氨基酸残基等。
在某些实施方案中，CAR可在N末端包含信号肽。信号肽的非限制性实例包括CD8α信号肽、IgK信号肽和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体亚基α(GMCSFR-α，也称为集落刺激因子2受体亚基α(CSF2RA))信号肽及其变体，所述信号肽的氨基酸序列提供于下表6中。
表6.信号肽的示例性序列
在某些实施方案中，CAR的胞外结合结构域可以包含对一种靶抗原或多种靶抗原具有特异性的一种或多种抗体。抗体可以是抗体片段，例如scFv，或单结构域抗体片段，例如VHH。在某些实施方案中，scFv可以包含通过接头连接的抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。VH和VL可以以任一顺序连接，即VH-接头-VL或VL-接头-VH。接头的非限制性实例包括Whitlow接头、(G4S)n(n可以是正整数，例如，1、2、3、4、5、6等)接头及其变体。在某些实施方案中，抗原可以是仅在肿瘤细胞上或优先在肿瘤细胞上表达的抗原，或是自身免疫或炎性疾病的特征性抗原。示例性靶抗原包括但不限于CD5、CD19、CD20、CD22、CD23、CD30、CD70、κ、λ和B细胞成熟剂(BCMA)、G蛋白偶联受体家族C组5成员D(GPRC5D)(与白血病相关)；CS1/SLAMF7、CD38、CD138、GPRC5D、TACI和BCMA(与骨髓瘤相关)；GD2、HER2、EGFR、EGFRvIII、B7H3、PSMA、PSCA、CAIX、CD171、CEA、CSPG4、EPHA2、FAP、FRα、IL-13Rα、间皮素、MUC1、MUC16和ROR1(与实体瘤相关)。在这些实施方案中的任一个中，CAR的胞外结合结构域可以针对在宿主细胞中的表达进行密码子优化，或具有变体序列以增加胞外结合域的功能。
在某些实施方案中，CAR可以包含铰链结构域，也称为间隔区。术语“铰链”和“间隔区”在本公开中可以互换使用。铰链结构域的非限制性实例包括CD8α铰链结构域、CD28铰链结构域、IgG4铰链结构域、IgG4铰链-CH2-CH3结构域及其变体，所述铰链结构域的氨基酸序列提供于下表7中。
表7.铰链结构域的示例性序列
在某些实施方案中，CAR的跨膜结构域可以包含以下的跨膜区：T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154或其功能变体，包括这些序列中的每一种的人形式。在其他实施方案中，跨膜结构域可以包含以下的跨膜区：CD8α、CD8β、4-1BB/CD137、CD28、CD34、CD4、FcεRIγ、CD16、OX40/CD134、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、TCRβ、TCRζ、CD32、CD64、CD64、CD45、CD5、CD9、CD22、CD37、CD80、CD86、CD40、CD40L/CD154、VEGFR2、FAS和FGFR2B或其功能变体，包括这些序列中的每一个的人形式。表8提供了一些示例性跨膜结构域的氨基酸序列。
表8.跨膜结构域的示例性序列
在某些实施方案中，CAR的胞内信号传导结构域和/或胞内共刺激结构域可以包含选自以下中的一种或多种信号传导结构域：B7-1/CD80、B7-2/CD86、B7-H1/PD-L1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、B7-H7、BTLA/CD272、CD28、CTLA-4、Gi24/VISTA/B7-H5、ICOS/CD278、PD-1、PD-L2/B7-DC、PDCD6、4-1BB/TNFSF9/CD137、4-1BB配体/TNFSF9、BAFF/BLyS/TNFSF13B、BAFF R/TNFRSF13C、CD27/TNFRSF7、CD27配体/TNFSF7、CD30/TNFRSF8、CD30配体/TNFSF8、CD40/TNFRSF5、CD40/TNFSF5、CD40配体/TNFSF5、DR3/TNFRSF25、GITR/TNFRSF18、GITR配体/TNFSF18、HVEM/TNFRSF14、LIGHT/TNFSF14、淋巴毒素-α/TNFβ、OX40/TNFRSF4、OX40配体/TNFSF4、RELT/TNFRSF19L、TACI/TNFRSF13B、TL1A/TNFSF15、TNFα、TNF RII/TNFRSF1B、2B4/CD244/SLAMF4、BLAME/SLAMF8、CD2、CD2F-10/SLAMF9、CD48/SLAMF2、CD58/LFA-3、CD84/SLAMF5、CD229/SLAMF3、CRACC/SLAMF7、NTB-A/SLAMF6、SLAM/CD150、CD2、CD7、CD53、CD82/Kai-1、CD90/Thy1、CD96、CD160、CD200、CD300a/LMIR1、HLA I类、HLA-DR、Ikaros、整合素α4/CD49d、整合素α4β1、整合素α4β7/LPAM-1、LAG-3、TCL1A、TCL1B、CRTAM、DAP12、Dectin-1/CLEC7A、DPPIV/CD26、EphB6、TIM-1/KIM-1/HAVCR、TIM-4、TSLP、TSLP R、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、NKG2C、CD3ζ、基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)、CD27、CD28、4-1BB、CD134/OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体，及其功能变体，包括这些序列中的每一种的人形式。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域和/或胞内共刺激结构域包含选自CD3ζ结构域、ITAM、CD28结构域、4-1BB结构域或其功能变体的一个或多个信号传导结构域。表9提供了一些示例性胞内共刺激和/或信号传导结构域的氨基酸序列。在某些实施方案中，如在下文所述的替沙仑赛的情况下，SEQ ID NO:18的CD3ζ信号传导结构域可在氨基酸位置14处具有突变，例如谷氨酰胺(Q)至赖氨酸(K)的突变(参见SEQ ID NO:115)。
表9.胞内共刺激和/或信号传导结构域的示例性序列
在多顺反子载体编码两个或更多个CAR的某些实施方案中，两个或更多个CAR可以包含相同的功能结构域，或一个或多个不同的功能结构域，如所描述的。例如，两个或更多个CAR可以包含不同的信号肽、胞外结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和/或胞内信号传导结构域，以最小化由于序列相似性导致的重组风险。或者，替代性地，两个或更多个CAR可以包含相同的结构域。在使用相同结构域和/或主链的情况下，任选在核苷酸序列水平上引入密码子差异以最小化重组的风险。
CD19 CAR
在一些实施方案中，CAR是CD19 CAR(“CD19-CAR”)，并且在这些实施方案中，多顺反子载体包含含有编码CD19 CAR的核苷酸序列的表达盒。在一些实施方案中，CD19 CAR可以串联地包含信号肽、特异性结合CD19的胞外结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、胞内共刺激结构域和/或胞内信号传导结构域。
在一些实施方案中，CD19 CAR的信号肽包括CD8α信号肽。在一些实施方案中，CD8α信号肽包含SEQ ID NO:6中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:6中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，信号肽包括IgK信号肽。在一些实施方案中，IgK信号肽包含SEQ ID NO:7中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:7中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，信号肽包括GMCSFR-α或CSF2RA信号肽。在一些实施方案中，GMCSFR-α或CSF2RA信号肽包含SEQ ID NO:8中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:8中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，CD19 CAR的胞外结合结构域对CD19(例如，人CD19)具有特异性。CD19 CAR的胞外结合结构域可以针对在宿主细胞中的表达进行密码子优化，或具有变体序列以增加胞外结合域的功能。在一些实施方案中，胞外结合结构域包含免疫球蛋白分子的免疫原性活性部分，例如scFv。
在一些实施方案中，CD19 CAR的胞外结合结构域包含源自FMC63单克隆抗体(FMC63)的scFv，其包含通过接头连接的FMC63的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。FMC63和衍生的scFv已在Nicholson等人,Mol.Immun.34(16-17):1157-1165(1997)和PCT申请公开号WO2018/213337中进行了描述，这些文献中每一篇的全部内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，完整FMC63衍生的scFv(也称为FMC63 scFv)及其不同部分的氨基酸序列提供于下表10中。在一些实施方案中，CD19特异性scFv包含SEQ ID NO:19、20或25中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:19、20或25中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，CD19特异性scFv可包含一个或多个具有SEQ ID NO:21-23和26-28中列出的氨基酸序列的CDR。在一些实施方案中，CD19特异性scFv可包含具有一个或多个CDR的轻链，所述CDR具有SEQ ID NO:21-23中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD19特异性scFv可包含具有一个或多个CDR的重链，所述CDR具有SEQ ID NO:26-28中列出的氨基酸序列。在这些实施方案中的任一个中，CD19特异性scFv可包含一个或多个CDR，所述CDR包含一个或多个氨基酸取代或包含与所鉴定的任何序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的序列。在一些实施方案中，CD19 CAR的胞外结合结构域包含如本文所述的一个或多个CDR或由其组成。
在一些实施方案中，连接scFv的VH和VL部分的接头是具有SEQ ID NO:24中列出的氨基酸序列的Whitlow接头。在一些实施方案中，Whitlow接头可以被不同的接头替代，例如具有SEQ ID NO:30中列出的氨基酸序列的3xG4S接头，其产生不同的FMC63衍生的具有SEQID NO:29中列出的氨基酸序列的scFv。在这些实施方案中的某些中，CD19特异性scFv包含SEQ ID NO:29中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:29中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。
表10.抗CD19 scFv和组分的示例性序列
在一些实施方案中，CD19 CAR的胞外结合结构域源自CD19特异性抗体，包括例如SJ25C1(Bejcek等人,Cancer Res.55:2346-2351(1995))、HD37(Pezutto等人,J.Immunol.138(9):2793-2799(1987))、4G7(Meeker等人,Hybridoma 3:305-320(1984))、B43(Bejcek(1995)),BLY3(Bejcek(1995))、B4(Freedman等人,70:418-427(1987))、B4HB12b(Kansas&Tedder,J.Immunol.147:4094-4102(1991)；Yazawa等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:15178-15183(2005)；Herbst等人,J.Pharmacol.Exp.Ther.335:213-222(2010))、BU12(Callard等人,J.Immunology,148(10):2983-2987(1992))和CLB-CD19(De Rie Cell.Immunol.118:368-381(1989))。在这些实施方案中的任一个中，CD19CAR的胞外结合结构域可以包含任何抗体的VH、VL和/或一个或多个CDR或由其组成。
在一些实施方案中，CD19 CAR的铰链结构域包含CD8α铰链结构域，例如人CD8α铰链结构域。在一些实施方案中，CD8α铰链结构域包含SEQ ID NO:9中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:9中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，铰链结构域包括CD28铰链结构域，例如人CD28铰链结构域。在一些实施方案中，CD28铰链结构域包含SEQ ID NO:10中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:10中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，铰链结构域包含IgG4铰链结构域，例如人IgG4铰链结构域。在一些实施方案中，IgG4铰链结构域包含SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，铰链结构域包含IgG4铰链-Ch2-Ch3结构域，例如人IgG4铰链-Ch2-Ch3结构域。在一些实施方案中，IgG4铰链-Ch2-Ch3结构域包含SEQ ID NO:13中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:13中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，CD19 CAR的跨膜结构域包含CD8α跨膜结构域，例如人CD8α跨膜结构域。在一些实施方案中，CD8α跨膜结构域包含SEQ ID NO:14中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:14中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，跨膜结构域包括CD28跨膜结构域，例如人CD28跨膜结构域。在一些实施方案中，CD28跨膜结构域包含SEQ ID NO:15中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:15中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，CD19 CAR的胞内共刺激结构域包含4-1BB共刺激结构域。4-1BB(也称为CD137)向T细胞传递有效的共刺激信号，促进分化并增强T淋巴细胞的长期存活。在一些实施方案中，4-1BB共刺激结构域是人的。在一些实施方案中，4-1BB共刺激结构域包含SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，细胞内共刺激结构域包括CD28共刺激结构域。CD28是T细胞上的另一种共刺激分子。在一些实施方案中，CD28共刺激结构域是人的。在一些实施方案中，CD28共刺激结构域包含SEQ ID NO:17中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:17中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，CD19 CAR的细胞内共刺激结构域包括如所述的4-1BB共刺激结构域和CD28共刺激结构域。
在一些实施方案中，CD19 CAR的胞内信号传导结构域包含CD3zeta(ζ)信号传导结构域。CD3ζ与T细胞受体(TCR)结合产生信号并含有基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。CD3ζ信号传导结构域是指来自ζ链胞质结构域的氨基酸残基，其足以功能性地传递T细胞活化所必需的初始信号。在一些实施方案中，CD3ζ信号传导结构域是人的。在一些实施方案中，CD3ζ信号传导结构域包含SEQ ID NO:18中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:18中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码CD19 CAR的核苷酸序列，所述CD19 CAR包括例如包含以下的CD19 CAR：具有SEQ ID NO:19或SEQ IDNO:29中列出的序列的CD19特异性scFv、SEQ ID NO:9的CD8α铰链结构域、SEQ ID NO:14的CD8α跨膜结构域、SEQ ID NO:16的4-1BB共刺激结构域、SEQ ID NO:18的CD3ζ信号传导结构域和/或其变体(即，具有与所公开的序列具有至少80％同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一性的序列)。在这些实施方案中的任一个中，CD19 CAR可额外包含如所述的信号肽(例如，CD8α信号肽)。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码CD19 CAR的核苷酸序列，所述CD19 CAR包括例如包含以下的CD19 CAR：具有SEQ ID NO:19或SEQ IDNO:29中列出的序列的CD19特异性scFv、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的IgG4铰链结构域、SEQ ID NO:15的CD28跨膜结构域、SEQ ID NO:16的4-1BB共刺激结构域、SEQ ID NO:18的CD3ζ信号传导结构域和/或其变体(即，具有与所公开的序列具有至少80％同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一性的序列)。在这些实施方案中的任一个中，CD19 CAR可额外包含如所述的信号肽(例如，CD8α信号肽)。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码CD19 CAR的核苷酸序列，所述CD19 CAR包括例如包含以下的CD19 CAR：具有SEQ ID NO:19或SEQ IDNO:29中列出的序列的CD19特异性scFv、SEQ ID NO:10的CD28铰链结构域、SEQ ID NO:15的CD28跨膜结构域、SEQ ID NO:17的CD28共刺激结构域、SEQ ID NO:18的CD3ζ信号传导结构域和/或其变体(即，具有与所公开的序列具有至少80％同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一性的序列)。在这些实施方案中的任一个中，CD19 CAR可额外包含如所述的信号肽(例如，CD8α信号肽)。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含含有核苷酸序列的表达盒，所述核苷酸序列编码SEQ ID NO:116中列出的CD19 CAR或与SEQ ID NO:116中列出的核苷酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)(参见表11)。编码的CD19 CAR具有SEQ ID NO:117中列出的对应氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:117中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)，具有以下组分：CD8α信号肽、FMC63 scFv(VL-Whitlow接头-VH)、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含含有编码可商购获得的CD19 CAR实施方案的核苷酸序列的表达盒。由T细胞表达和/或编码的CD19 CAR的市售实施方案的非限制性实例包括替沙仑赛、利基迈仑赛、阿基仑赛和布瑞基奥仑赛。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含含有编码替沙仑赛或其部分的核苷酸序列的表达盒。替沙仑赛包含具有以下组分的CD19CAR：CD8α信号肽、FMC63 scFv(VL-3xG4S接头-VH)、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域。替沙仑赛中的CD19 CAR的核苷酸和氨基酸序列提供于表11中，序列的注释提供于表12中。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含含有编码利基迈仑赛或其部分的核苷酸序列的表达盒。利基迈仑赛包含具有以下组分的CD19CAR：GMCSFR-α或CSF2RA信号肽、FMC63scFv(VL-Whitlow接头-VH)、IgG4铰链结构域、CD28跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域。利基迈仑赛中的CD19 CAR的核苷酸和氨基酸序列提供于表11中，序列的注释提供于表13中。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含含有编码阿基仑赛或其部分的核苷酸序列的表达盒。阿基仑赛包含具有以下组分的CD19CAR：GMCSFR-α或CSF2RA信号肽、FMC63 scFv(VL-Whitlow接头-VH)、CD28铰链结构域、CD28跨膜结构域、CD28共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域。阿基仑赛中的CD19 CAR的核苷酸和氨基酸序列提供于表11中，序列的注释提供于表14中。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含含有编码布瑞基奥仑赛或其部分的核苷酸序列的表达盒。布瑞基奥仑赛包含具有以下组分的CD19 CAR：GMCSFR-α信号肽、FMC63scFv、CD28铰链结构域、CD28跨膜结构域、CD28共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含含有核苷酸序列的表达盒，所述核苷酸序列编码SEQ ID NO:31、33或35中列出的CD19CAR或与SEQ ID NO:31、33或35中列出的核苷酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)。编码的CD19 CAR具有SEQ ID NO:32、34或36中分别列出的对应氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:32、34或36中分别列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)。
表11.CD19 CAR的示例性序列
表12.替沙仑赛CD19 CAR序列的注释
表13.利基迈仑赛CD19 CAR序列的注释
表14.阿基仑赛CD19 CAR序列的注释
在一些实施方案中，多顺反子载体包含含有核苷酸序列的表达盒，所述核苷酸序列编码SEQ ID NO:31、33或35中列出的CD19CAR或与SEQ ID NO:31、33或35中列出的核苷酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)。编码的CD19 CAR具有SEQ ID NO:32、34或36中分别列出的对应氨基酸序列，与SEQ ID NO:32、34或36中分别列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)。
CD20 CAR
在一些实施方案中，CAR是CD20 CAR(“CD20-CAR”)，并且在这些实施方案中，多顺反子载体包含含有编码CD20 CAR的核苷酸序列的表达盒。CD20是这样的抗原，早在前-B期就在B细胞表面上发现，并以逐渐增加的水平直到B细胞成熟，也在大多数B细胞肿瘤的细胞上发现。CD20阳性细胞有时也在霍奇金病、骨髓瘤和胸腺瘤的病例中发现。在一些实施方案中，CD20 CAR可以串联地包含信号肽、特异性结合CD20的胞外结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、胞内共刺激结构域和/或胞内信号传导结构域。
在一些实施方案中，CD20 CAR的信号肽包括CD8α信号肽。在一些实施方案中，CD8α信号肽包含SEQ ID NO:6中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:6中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，信号肽包括IgK信号肽。在一些实施方案中，IgK信号肽包含SEQ ID NO:7中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:7中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，信号肽包括GMCSFR-α或CSF2RA信号肽。在一些实施方案中，GMCSFR-α或CSF2RA信号肽包含SEQ ID NO:8中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:8中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，CD20 CAR的胞外结合结构域对CD20(例如，人CD20)具有特异性。CD20 CAR的胞外结合结构域可以针对在宿主细胞中的表达进行密码子优化，或具有变体序列以增加胞外结合域的功能。在一些实施方案中，胞外结合结构域包含免疫球蛋白分子的免疫原性活性部分，例如scFv。
在一些实施方案中，CD20 CAR的胞外结合结构域来源于CD20特异性抗体，包括例如Leu16、IF5、1.5.3、利妥昔单抗、奥妥珠单抗、替伊莫单抗、奥法妥木单抗、托西莫单抗、奥尼妥单抗、维妥珠单抗、乌妥昔单抗和奥瑞利珠单抗。在一些实施方案中，CD20 CAR来源于CD20特异性CAR，包括例如MB-106、UCART20或C-CAR066，如表15A中详述。在这些实施方案中的任一个中，CD20CAR的胞外结合结构域可以包含表15A中详述的任何抗体或CAR的VH、VL和/或一个或多个CDR或由其组成。
表15A.示例性CD20特异性CAR
在一些实施方案中，CD20 CAR的胞外结合结构域包含来源于Leu16单克隆抗体的scFv，其包含通过接头连接的Leu16的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。参见Wu等人,Protein Engineering.14(12):1025-1033(2001)。在一些实施方案中，接头是3xG4S接头。在其他实施方案中，接头是如本文所述的Whitlow接头。在一些实施方案中，完整Leu16衍生的scFv(也称为Leu16 scFv)的不同部分及其不同部分的氨基酸序列提供于下表15B中。在一些实施方案中，CD20特异性scFv包含SEQ ID NO:37、38或42中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:37、38或42中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，CD20特异性scFv可包含一个或多个具有SEQ ID NO:39-41、43和44中列出的氨基酸序列的CDR。在一些实施方案中，CD20特异性scFv可包含具有一个或多个CDR的轻链，所述CDR具有SEQ ID NO:39-41中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD20特异性scFv可包含具有一个或多个CDR的重链，所述CDR具有SEQ ID NO:43-44中列出的氨基酸序列。在这些实施方案中的任一个中，CD20特异性scFv可包含一个或多个CDR，所述CDR包含一个或多个氨基酸取代或包含与所鉴定的任何序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的序列。在一些实施方案中，CD20 CAR的胞外结合结构域包含如本文所述的一个或多个CDR或由其组成。
表15B.抗CD20 scFv和组分的示例性序列
在一些实施方案中，CD20 CAR的铰链结构域包含CD8α铰链结构域，例如人CD8α铰链结构域。在一些实施方案中，CD8α铰链结构域包含SEQ ID NO:9中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:9中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，铰链结构域包括CD28铰链结构域，例如人CD28铰链结构域。在一些实施方案中，CD28铰链结构域包含SEQ ID NO:10中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:10中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，铰链结构域包含IgG4铰链结构域，例如人IgG4铰链结构域。在一些实施方案中，IgG4铰链结构域包含SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，铰链结构域包含IgG4铰链-Ch2-Ch3结构域，例如人IgG4铰链-Ch2-Ch3结构域。在一些实施方案中，IgG4铰链-Ch2-Ch3结构域包含SEQ ID NO:13中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:13中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，CD20 CAR的跨膜结构域包含CD8α跨膜结构域，例如人CD8α跨膜结构域。在一些实施方案中，CD8α跨膜结构域包含SEQ ID NO:14中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:14中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，跨膜结构域包括CD28跨膜结构域，例如人CD28跨膜结构域。在一些实施方案中，CD28跨膜结构域包含SEQ ID NO:15中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:15中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，CD20 CAR的胞内共刺激结构域包含4-1BB共刺激结构域，例如人4-1BB共刺激结构域。在一些实施方案中，4-1BB共刺激结构域包含SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，胞内共刺激结构域包含CD28共刺激结构域，例如人CD28共刺激结构域。在一些实施方案中，CD28共刺激结构域包含SEQ ID NO:17中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:17中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，CD20 CAR的胞内信号传导结构域包含CD3zeta(ζ)信号传导结构域，例如人CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，CD3ζ信号传导结构域包含SEQ IDNO:18中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:18中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码CD20 CAR的核苷酸序列，所述CD20 CAR包括例如包含以下的CD20 CAR：具有SEQ ID NO:37中列出的序列的CD20特异性scFv、SEQ ID NO:9的CD8α铰链结构域、SEQ ID NO:14的CD8α跨膜结构域、SEQ ID NO:16的4-1BB共刺激结构域、SEQ ID NO:18的CD3ζ信号传导结构域和/或其变体(即，具有与所公开的序列具有至少80％同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一性的序列)。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码CD20 CAR的核苷酸序列，所述CD20 CAR包括例如包含以下的CD20 CAR：具有SEQ ID NO:37中列出的序列的CD20特异性scFv、SEQ ID NO:10的CD28铰链结构域、SEQ ID NO:14的CD8α跨膜结构域、SEQ ID NO:16的4-1BB共刺激结构域、SEQ ID NO:18的CD3ζ信号传导结构域和/或其变体(即，具有与所公开的序列具有至少80％同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一性的序列)。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码CD20 CAR的核苷酸序列，所述CD20 CAR包括例如包含以下的CD20 CAR：具有SEQ ID NO:37中列出的序列的CD20特异性scFv、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的IgG4铰链结构域、SEQ ID NO:14的CD8α跨膜结构域、SEQ ID NO:16的4-1BB共刺激结构域、SEQ ID NO:18的CD3ζ信号传导结构域和/或其变体(即，具有与所公开的序列具有至少80％同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一性的序列)。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码CD20 CAR的核苷酸序列，所述CD20 CAR包括例如包含以下的CD20 CAR：具有SEQ ID NO:37中列出的序列的CD20特异性scFv、SEQ ID NO:9的CD8α铰链结构域、SEQ ID NO:15的CD28跨膜结构域、SEQ ID NO:16的4-1BB共刺激结构域、SEQ ID NO:18的CD3ζ信号传导结构域和/或其变体(即，具有与所公开的序列具有至少80％同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一性的序列)。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码CD20 CAR的核苷酸序列，所述CD20 CAR包括例如包含以下的CD20 CAR：具有SEQ ID NO:37中列出的序列的CD20特异性scFv、SEQ ID NO:10的CD28铰链结构域、SEQ ID NO:15的CD28跨膜结构域、SEQ ID NO:16的4-1BB共刺激结构域、SEQ ID NO:18的CD3ζ信号传导结构域和/或其变体(即，具有与所公开的序列具有至少80％同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一性的序列)。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码CD20 CAR的核苷酸序列，所述CD20 CAR包括例如包含以下的CD20 CAR：具有SEQ ID NO:37中列出的序列的CD20特异性scFv、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:1的IgG4铰链结构域、SEQ IDNO:15的CD28跨膜结构域、SEQ ID NO:16的4-1BB共刺激结构域、SEQ ID NO:18的CD3ζ信号传导结构域和/或其变体(即，具有与所公开的序列具有至少80％同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一性的序列)。
CD22 CAR
在一些实施方案中，CAR是CD22 CAR(“CD22-CAR”)，并且在这些实施方案中，多顺反子载体包含含有编码CD22 CAR的核苷酸序列的表达盒。CD22是一种跨膜蛋白，主要存在于成熟B细胞的表面，作为B细胞受体(BCR)信号传导的抑制性受体起作用。CD22在60-70％的B细胞淋巴瘤和白血病(例如，慢性B淋巴细胞白血病、毛细胞白血病、急性淋巴细胞白血病(ALL)和伯基特淋巴瘤(Burkitt'slymphoma))中表达，并且在B细胞发育早期阶段的细胞表面或干细胞上不存在。在一些实施方案中，CD22 CAR可以串联地包含信号肽、特异性结合CD22的胞外结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、胞内共刺激结构域和/或胞内信号传导结构域。
在一些实施方案中，CD22 CAR的信号肽包括CD8α信号肽。在一些实施方案中，CD8α信号肽包含SEQ ID NO:6中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:6中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，信号肽包括IgK信号肽。在一些实施方案中，IgK信号肽包含SEQ ID NO:7中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:7中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，信号肽包括GMCSFR-α或CSF2RA信号肽。在一些实施方案中，GMCSFR-α或CSF2RA信号肽包含SEQ ID NO:8中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:8中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，CD22 CAR的胞外结合结构域对CD22(例如，人CD22)具有特异性。CD22 CAR的胞外结合结构域可以针对在宿主细胞中的表达进行密码子优化，或具有变体序列以增加胞外结合域的功能。在一些实施方案中，胞外结合结构域包含免疫球蛋白分子的免疫原性活性部分，例如scFv。
在一些实施方案中，CD22 CAR的胞外结合结构域源自CD22特异性抗体，包括例如SM03、奥加伊妥珠单抗、依帕珠单抗、莫塞妥莫单抗和匹那妥珠单抗。在这些实施方案中的任一个中，CD22 CAR的胞外结合结构域可以包含任何抗体的VH、VL和/或一个或多个CDR或由其组成。
在一些实施方案中，CD22 CAR的胞外结合结构域包含源自m971单克隆抗体(m971)的scFv，其包含通过接头连接的m971的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。在一些实施方案中，接头是3xG4S接头。在其他实施方案中，可以使用Whitlow接头代替。在一些实施方案中，完整m971衍生的scFv(也称为m971 scFv)及其不同部分的氨基酸序列提供于下表16中。在一些实施方案中，CD22特异性scFv包含SEQ ID NO:45、46或50中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:45、46或50中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，CD22特异性scFv可包含一个或多个具有SEQ ID NO:47-49和51-53中列出的氨基酸序列的CDR。在一些实施方案中，CD22特异性scFv可包含具有一个或多个CDR的重链，所述CDR具有SEQ ID NO:47-49中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD22特异性scFv可包含具有一个或多个CDR的轻链，所述CDR具有SEQ ID NO:51-53中列出的氨基酸序列。在这些实施方案中的任一个中，CD22特异性scFv可包含一个或多个CDR，所述CDR包含一个或多个氨基酸取代或包含与所鉴定的任何序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的序列。在一些实施方案中，CD22 CAR的胞外结合结构域包含如本文所述的一个或多个CDR或由其组成。
在一些实施方案中，CD22 CAR的胞外结合结构域包含来源于m971-L7的scFv，其是与亲本抗体m971相比CD22结合亲和力显著提高(从约2nM提高至小于50pM)的m971的亲和力成熟变体。在一些实施方案中，来源于m971-L7的scFv包含通过3xG4S接头连接的m971-L7的VH和VL。在其他实施方案中，可以使用Whitlow接头代替。在一些实施方案中，完整m971-L7衍生的scFv(也称为m971-L7scFv)及其不同部分的氨基酸序列提供于下表16中。在一些实施方案中，CD22特异性scFv包含SEQ ID NO:54、55或59中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:54、55或59中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，CD22特异性scFv可包含一个或多个具有SEQID NO:56-58和60-62中列出的氨基酸序列的CDR。在一些实施方案中，CD22特异性scFv可包含具有一个或多个CDR的重链，所述CDR具有SEQ ID NO:56-58中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD22特异性scFv可包含具有一个或多个CDR的轻链，所述CDR具有SEQ ID NO:60-62中列出的氨基酸序列。在这些实施方案中的任一个中，CD22特异性scFv可包含一个或多个CDR，所述CDR包含一个或多个氨基酸取代或包含与所鉴定的任何序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的序列。在一些实施方案中，CD22 CAR的胞外结合结构域包含如本文所述的一个或多个CDR或由其组成。
表16.抗CD22 scFv和组分的示例性序列
在一些实施方案中，CD22 CAR的胞外结合结构域包含免疫毒素HA22或BL22。免疫毒素BL22和HA22是包含与细菌毒素融合的CD22特异性scFv的治疗剂，因此可以结合表达CD22的癌细胞的表面并杀死癌细胞。BL22包含抗CD22抗体的dsFv，RFB4，其与38-kDa截短形式的假单胞菌外毒素A融合(Bang等人,Clin.Cancer Res.,11:1545-50(2005))。HA22(CAT8015，莫塞妥莫单抗免疫毒素)是BL22的突变的、较高亲和力形式(Ho等人,J.Biol.Chem.,280(1):607-17(2005))。对CD22具有特异性的HA22和BL22的抗原结合结构域的合适序列公开于例如美国专利号7,541,034、7,355,012和7,982,011中，这些专利通过引用整体并入。
在一些实施方案中，CD22 CAR的铰链结构域包含CD8α铰链结构域，例如人CD8α铰链结构域。在一些实施方案中，CD8α铰链结构域包含SEQ ID NO:9中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:9中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，铰链结构域包括CD28铰链结构域，例如人CD28铰链结构域。在一些实施方案中，CD28铰链结构域包含SEQ ID NO:10中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:10中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，铰链结构域包含IgG4铰链结构域，例如人IgG4铰链结构域。在一些实施方案中，IgG4铰链结构域包含SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，铰链结构域包含IgG4铰链-Ch2-Ch3结构域，例如人IgG4铰链-Ch2-Ch3结构域。在一些实施方案中，IgG4铰链-Ch2-Ch3结构域包含SEQ ID NO:13中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:13中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，CD22 CAR的跨膜结构域包含CD8α跨膜结构域，例如人CD8α跨膜结构域。在一些实施方案中，CD8α跨膜结构域包含SEQ ID NO:14中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:14中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，跨膜结构域包括CD28跨膜结构域，例如人CD28跨膜结构域。在一些实施方案中，CD28跨膜结构域包含SEQ ID NO:15中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:15中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，CD22 CAR的胞内共刺激结构域包含4-1BB共刺激结构域，例如人4-1BB共刺激结构域。在一些实施方案中，4-1BB共刺激结构域包含SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，胞内共刺激结构域包含CD28共刺激结构域，例如人CD28共刺激结构域。在一些实施方案中，CD28共刺激结构域包含SEQ ID NO:17中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:17中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，CD22 CAR的胞内信号传导结构域包含CD3zeta(ζ)信号传导结构域，例如人CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，CD3ζ信号传导结构域包含SEQ IDNO:18中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:18中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码CD22 CAR的核苷酸序列，所述CD22 CAR包括例如包含以下的CD22 CAR：具有SEQ ID NO:45或SEQ IDNO:54中列出的序列的CD22特异性scFv、SEQ ID NO:9的CD8α铰链结构域、SEQ ID NO:14的CD8α跨膜结构域、SEQ ID NO:16的4-1BB共刺激结构域、SEQ ID NO:18的CD3ζ信号传导结构域和/或其变体(即，具有与所公开的序列具有至少80％同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一性的序列)。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码CD22 CAR的核苷酸序列，所述CD22 CAR包括例如包含以下的CD22 CAR：具有SEQ ID NO:45或SEQ IDNO:54中列出的序列的CD22特异性scFv、SEQ ID NO:10的CD28铰链结构域、SEQ ID NO:14的CD8α跨膜结构域、SEQ ID NO:16的4-1BB共刺激结构域、SEQ ID NO:18的CD3ζ信号传导结构域和/或其变体(即，具有与所公开的序列具有至少80％同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一性的序列)。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码CD22 CAR的核苷酸序列，所述CD22 CAR包括例如包含以下的CD22 CAR：具有SEQ ID NO:45或SEQ IDNO:54中列出的序列的CD22特异性scFv、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的IgG4铰链结构域、SEQ ID NO:14的CD8α跨膜结构域、SEQ ID NO:16的4-1BB共刺激结构域、SEQ ID NO:18的CD3ζ信号传导结构域和/或其变体(即，具有与所公开的序列具有至少80％同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一性的序列)。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码CD22 CAR的核苷酸序列，所述CD22 CAR包括例如包含以下的CD22 CAR：具有SEQ ID NO:45或SEQ IDNO:54中列出的序列的CD22特异性scFv、SEQ ID NO:9的CD8α铰链结构域、SEQ ID NO:15的CD28跨膜结构域、SEQ ID NO:16的4-1BB共刺激结构域、SEQ ID NO:18的CD3ζ信号传导结构域和/或其变体(即，具有与所公开的序列具有至少80％同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一性的序列)。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码CD22 CAR的核苷酸序列，所述CD22 CAR包括例如包含以下的CD22 CAR：具有SEQ ID NO:45或SEQ IDNO:54中列出的序列的CD22特异性scFv、SEQ ID NO:10的CD28铰链结构域、SEQ ID NO:15的CD28跨膜结构域、SEQ ID NO:16的4-1BB共刺激结构域、SEQ ID NO:18的CD3ζ信号传导结构域和/或其变体(即，具有与所公开的序列具有至少80％同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一性的序列)。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含表达盒，所述表达盒含有编码CD22 CAR的核苷酸序列，所述CD22 CAR包括例如包含以下的CD22 CAR：具有SEQ ID NO:45或SEQ IDNO:54中列出的序列的CD22特异性scFv、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的IgG4铰链结构域、SEQ ID NO:15的CD28跨膜结构域、SEQ ID NO:16的4-1BB共刺激结构域、SEQ ID NO:18的CD3ζ信号传导结构域和/或其变体(即，具有与所公开的序列具有至少80％同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一性的序列)。
BCMACAR
在一些实施方案中，CAR是BCMACAR(“BCMA-CAR”)，并且在这些实施方案中，多顺反子载体包含含有编码BCMACAR的核苷酸序列的表达盒。BCMA是在B细胞谱系的细胞上表达的肿瘤坏死家族受体(TNFR)成员，在终末分化的B细胞或成熟的B淋巴细胞上表达最高。BCMA参与介导浆细胞的存活以维持长期体液免疫。最近发现，BCMA的表达与多种癌症有关，诸如多发性骨髓瘤、霍奇金和非霍奇金淋巴瘤、各种白血病和成胶质细胞瘤。在一些实施方案中，BCMACAR可以串联地包含信号肽、特异性结合BCMA的胞外结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、胞内共刺激结构域和/或胞内信号传导结构域。
在一些实施方案中，BCMACAR的信号肽包含CD8α信号肽。在一些实施方案中，CD8α信号肽包含SEQ ID NO:6中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:6中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，信号肽包括IgK信号肽。在一些实施方案中，IgK信号肽包含SEQ ID NO:7中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:7中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，信号肽包括GMCSFR-α或CSF2RA信号肽。在一些实施方案中，GMCSFR-α或CSF2RA信号肽包含SEQ ID NO:8中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:8中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，BCMACAR的胞外结合结构域对BCMA(例如，人BCMA)具有特异性。BCMACAR的胞外结合结构域可以针对在宿主细胞中的表达进行密码子优化，或具有变体序列以增加胞外结合域的功能。
在一些实施方案中，胞外结合结构域包含免疫球蛋白分子的免疫原性活性部分，例如scFv。在一些实施方案中，BCMACAR的胞外结合结构域源自BCMA特异性抗体，包括例如贝兰他单抗、埃拉那他单抗、特利司他单抗、LCAR-B38M和西达基。在这些实施方案中的任一个中，BCMACAR的胞外结合结构域可以包含任何抗体的VH、VL和/或一个或多个CDR或由其组成。
在一些实施方案中，BCMACAR的胞外结合结构域包含源自C11D5.3的scFv，其是如Carpenter等人,Clin.Cancer Res.19(8):2048-2060(2013)中描述的鼠单克隆抗体。还参见PCT申请公开号WO2010/104949。C11D5.3衍生的scFv可以包含通过Whitlow接头连接的C11D5.3的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其氨基酸序列提供于表17中。在一些实施方案中，BCMA特异性胞外结合结构域包含SEQ ID NO:63、64或68中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:63、64或68中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，BCMA特异性胞外结合结构域可包含一个或多个具有SEQ ID NO:65-67和69-71中列出的氨基酸序列的CDR。在一些实施方案中，BCMA特异性胞外结合结构域可包含具有一个或多个CDR的轻链，所述CDR具有SEQID NO:65-67中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，BCMA特异性胞外结合结构域可包含具有一个或多个CDR的重链，所述CDR具有SEQ ID NO:69-71中列出的氨基酸序列。在这些实施方案中的任一个中，BCMA特异性scFv可包含一个或多个CDR，所述CDR包含一个或多个氨基酸取代或包含与所鉴定的任何序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的序列。在一些实施方案中，BCMACAR的胞外结合结构域包含如本文所述的一个或多个CDR或由其组成。
在一些实施方案中，BCMACAR的胞外结合结构域包含来源于另一种鼠单克隆抗体C12A3.2的scFv，如Carpenter等人,Clin.Cancer Res.19(8):2048-2060(2013)和PCT申请公开号WO2010/104949中所描述的，其氨基酸序列也提供于下表17中。在一些实施方案中，BCMA特异性胞外结合结构域包含SEQ ID NO:72、73或77中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:72、73或77中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，BCMA特异性胞外结合结构域可包含一个或多个具有SEQ ID NO:74-76和78-80中列出的氨基酸序列的CDR。在一些实施方案中，BCMA特异性胞外结合结构域可包含具有一个或多个CDR的轻链，所述CDR具有SEQ ID NO:74-76中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，BCMA特异性胞外结合结构域可包含具有一个或多个CDR的重链，所述CDR具有SEQ ID NO:78-80中列出的氨基酸序列。在这些实施方案中的任一个中，BCMA特异性scFv可包含一个或多个CDR，所述CDR包含一个或多个氨基酸取代或包含与所鉴定的任何序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的序列。在一些实施方案中，BCMACAR的胞外结合结构域包含如本文所述的一个或多个CDR或由其组成。
在一些实施方案中，BCMACAR的胞外结合结构域包含对人BCMA具有高特异性的鼠单克隆抗体，在Friedman等人,Hum.Gene Ther.29(5):585-601(2018)中称为BB2121。还参见PCT申请公开号WO2012163805。
在一些实施方案中，BCMACAR的胞外结合结构域包含两条重链(VHH)的单个可变片段，其可以结合BCMA的两个表位，如Zhao等人,J.Hematol.Oncol.11(1):141(2018)中所描述的，也称为LCAR-B38M。还参见PCT申请公开号WO2018/028647。
在一些实施方案中，BCMACAR的胞外结合结构域包含完全人重链可变结构域(FHVH)，如Lam等人,Nat.Commun.11(1):283(2020)中所描述的，也称为FHVH33。还参见PCT申请公开号WO2019/006072。FHVH33及其CDR的氨基酸序列提供于下表17中。在一些实施方案中，BCMA特异性胞外结合结构域包含SEQ ID NO:81中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:81中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，BCMA特异性胞外结合结构域可包含一个或多个具有SEQ ID NO:82-84中列出的氨基酸序列的CDR。在这些实施方案中的任一个中，BCMA特异性胞外结合结构域可包含一个或多个CDR，所述CDR包含一个或多个氨基酸取代或包含与所鉴定的任何序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的序列。在一些实施方案中，BCMACAR的胞外结合结构域包含如本文所述的一个或多个CDR或由其组成。
在一些实施方案中，BCMACAR的胞外结合结构域包含来源于CT103A(或CAR0085)的scFv，如美国专利号11,026,975B2中所描述的，其氨基酸序列提供于下表17中。在一些实施方案中，BCMA特异性胞外结合结构域包含SEQ ID NO:118、119或123中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:118、119或123中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，BCMA特异性胞外结合结构域可包含一个或多个具有SEQ ID NO:120-122和124-126中列出的氨基酸序列的CDR。在一些实施方案中，BCMA特异性胞外结合结构域可包含具有一个或多个CDR的轻链，所述CDR具有SEQ ID NO:120-122中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，BCMA特异性胞外结合结构域可包含具有一个或多个CDR的重链，所述CDR具有SEQ ID NO:124-126中列出的氨基酸序列。在这些实施方案中的任一个中，BCMA特异性scFv可包含一个或多个CDR，所述CDR包含一个或多个氨基酸取代或包含与所鉴定的任何序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的序列。在一些实施方案中，BCMACAR的胞外结合结构域包含如本文所述的一个或多个CDR或由其组成。
另外，针对BCMA的CAR和结合剂已在美国申请公开号2020/0246381A1和2020/0339699A1中进行了描述，这些申请中的每一个的全部内容通过引用并入本文。
表17.抗BCMA结合剂和组分的示例性序列
在一些实施方案中，BCMACAR的铰链结构域包含CD8α铰链结构域，例如人CD8α铰链结构域。在一些实施方案中，CD8α铰链结构域包含SEQ ID NO:9中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:9中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，铰链结构域包括CD28铰链结构域，例如人CD28铰链结构域。在一些实施方案中，CD28铰链结构域包含SEQ ID NO:10中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:10中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，铰链结构域包含IgG4铰链结构域，例如人IgG4铰链结构域。在一些实施方案中，IgG4铰链结构域包含SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，铰链结构域包含IgG4铰链-Ch2-Ch3结构域，例如人IgG4铰链-Ch2-Ch3结构域。在一些实施方案中，IgG4铰链-Ch2-Ch3结构域包含SEQ ID NO:13中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:13中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，BCMACAR的跨膜结构域包含CD8α跨膜结构域，例如人CD8α跨膜结构域。在一些实施方案中，CD8α跨膜结构域包含SEQ ID NO:14中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:14中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，跨膜结构域包括CD28跨膜结构域，例如人CD28跨膜结构域。在一些实施方案中，CD28跨膜结构域包含SEQ ID NO:15中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:15中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，BCMACAR的胞内共刺激结构域包含4-1BB共刺激结构域，例如人4-1BB共刺激结构域。在一些实施方案中，4-1BB共刺激结构域包含SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，胞内共刺激结构域包含CD28共刺激结构域，例如人CD28共刺激结构域。在一些实施方案中，CD28共刺激结构域包含SEQ ID NO:17中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:17中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，BCMACAR的胞内信号传导结构域包含CD3 zeta(ζ)信号传导结构域，例如人CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，CD3ζ信号传导结构域包含SEQ IDNO:18中列出的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:18中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含含有核苷酸序列的表达盒，所述核苷酸序列编码BCMACAR，包括例如包含如所描述的BCMA特异性胞外结合结构域、SEQ ID NO:9的CD8α铰链结构域、SEQ ID NO:14的CD8α跨膜结构域、SEQ ID NO:16的4-1BB共刺激结构域、SEQID NO:18的CD3ζ信号传导结构域和/或其变体(即，具有与所公开的序列至少80％同一性，例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一性的序列)中的任一种的BCMACAR。在这些实施方案中的任一个中，BCMACAR可额外包含如所述的信号肽(例如，CD8α信号肽)。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含含有核苷酸序列的表达盒，所述核苷酸序列编码BCMACAR，包括例如包含如所描述的BCMA特异性胞外结合结构域、SEQ ID NO:9的CD8α铰链结构域、SEQ ID NO:14的CD8α跨膜结构域、SEQ ID NO:17的CD28共刺激结构域、SEQID NO:18的CD3ζ信号传导结构域和/或其变体(即，具有与所公开的序列至少80％同一性，例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99同一性的序列)中的任一种的BCMACAR。在这些实施方案中的任一个中，BCMACAR可以额外包含如所述的信号肽。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含含有核苷酸序列的表达盒，所述核苷酸序列编码SEQ ID NO:127中列出的BCMACAR或与SEQ ID NO:127中列出的核苷酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)(参见表18)。编码的BCMACAR具有SEQ ID NO:128中列出的对应氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:128中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)，具有以下组分：CD8α信号肽、CT103A scFv(VL-Whitlow接头-VH)、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域。
在一些实施方案中，多顺反子载体包含含有编码可商购获得的BCMACAR实施方案的核苷酸序列的表达盒，包括例如艾基维仑赛(ide-cel，也称为bb2121)。在一些实施方案中，多顺反子载体包含含有编码艾基维仑赛或其部分的核苷酸序列的表达盒。艾基维仑赛包含具有以下组分的BCMACAR：BB2121结合剂、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域。
表18.BCMACAR的示例性序列
R.低免疫原性细胞的特征
在一些实施方案中，低免疫原性干细胞群与对照干细胞(例如，野生型干细胞或免疫原性干细胞)相比保留多能性。在一些实施方案中，低免疫原性干细胞群与对照干细胞(例如，野生型干细胞或免疫原性干细胞)相比保留分化潜能。
在一些实施方案中，施用的低免疫原性细胞(诸如低免疫原性分化细胞和CAR-T细胞)群在受试者或患者中引发降低或较低水平的免疫活化。在一些情况下，与施用免疫原性细胞产生的免疫活化水平相比，所述低免疫原性细胞引发的免疫活化水平低至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施方案中，施用的低免疫原性细胞群无法在受试者或患者中引发免疫活化。
在一些实施方案中，施用的低免疫原性细胞(诸如低免疫原性分化细胞和CAR-T细胞)群在受试者或患者中引发降低或较低水平的T细胞反应。在一些情况下，与施用免疫原性细胞产生的T细胞反应水平相比，所述低免疫原性细胞引发的T细胞反应水平低至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施方案中，施用的低免疫原性细胞群无法在受试者或患者中引发对细胞的T细胞反应。
在一些实施方案中，施用的低免疫原性细胞(诸如低免疫原性分化细胞和CAR-T细胞)群在受试者或患者中引发降低或较低水平的NK细胞反应。在一些情况下，与施用免疫原性细胞产生的NK细胞反应水平相比，所述低免疫原性细胞引发的NK细胞反应水平低至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施方案中，施用的低免疫原性细胞群无法在受试者或患者中引发对细胞的NK细胞反应。
在一些实施方案中，施用的低免疫原性细胞(诸如低免疫原性分化细胞和CAR-T细胞)群在受试者或患者中引发降低或较低水平的巨噬细胞吞噬。在一些情况下，与施用免疫原性细胞产生的巨噬细胞吞噬水平相比，所述低免疫原性细胞引发的NK细胞反应水平低至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施方案中，施用的低免疫原性细胞群无法在受试者或患者中引发细胞的巨噬细胞吞噬。
在一些实施方案中，施用的低免疫原性细胞(诸如低免疫原性分化细胞和CAR-T细胞)群在受试者或患者中引发降低或较低水平的全身性TH1活化。在一些情况下，与施用免疫原性细胞产生的全身性TH1活化水平相比，所述低免疫原性细胞引发的全身性TH1活化水平低至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施方案中，施用的低免疫原性细胞群无法在受试者或患者中引发全身性TH1活化。
在一些实施方案中，施用的低免疫原性细胞(诸如低免疫原性分化细胞和CAR-T细胞)群在受试者或患者中引发降低或较低水平的NK细胞杀伤。在一些情况下，与施用免疫原性细胞产生的NK细胞杀伤水平相比，所述低免疫原性细胞引发的NK细胞杀伤水平低至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施方案中，施用的低免疫原性细胞群无法在受试者或患者中引发NK细胞杀伤。
在一些实施方案中，施用的低免疫原性细胞(诸如低免疫原性分化细胞和CAR-T细胞)群在受试者或患者中引发降低或较低水平的外周血单核细胞(PBMC)的免疫活化。在一些情况下，与施用免疫原性细胞产生的PBMC的免疫活化水平相比，所述低免疫原性细胞引发的PBMC的免疫活化水平低至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施方案中，施用的低免疫原性细胞群无法在受试者或患者中引发PBMC的免疫活化。
在一些实施方案中，施用的低免疫原性细胞(诸如低免疫原性分化细胞和CAR-T细胞)群在受试者或患者中引发降低或较低水平的供体特异性IgG抗体。在一些情况下，与施用免疫原性细胞产生的供体特异性IgG抗体水平相比，所述低免疫原性细胞引发的供体特异性IgG抗体水平低至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施方案中，施用的低免疫原性细胞群无法在受试者或患者中引发供体特异性IgG抗体。
在一些实施方案中，施用的低免疫原性细胞(诸如低免疫原性分化细胞和CAR-T细胞)群在受试者或患者中引发降低或较低水平的供体特异性IgM抗体。在一些情况下，与施用免疫原性细胞产生的供体特异性IgM抗体水平相比，所述低免疫原性细胞引发的供体特异性IgM抗体水平低至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施方案中，施用的低免疫原性细胞群无法在受试者或患者中引发供体特异性IgM抗体。
在一些实施方案中，施用的低免疫原性细胞(诸如低免疫原性分化细胞和CAR-T细胞)群在受试者或患者中引发降低或较低水平的IgM和IgG抗体产生。在一些情况下，与施用免疫原性细胞产生的IgM和IgG抗体产生水平相比，所述低免疫原性细胞引发的IgM和IgG抗体产生水平低至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施方案中，施用的低免疫原性细胞群无法在受试者或患者中引发IgM和IgG抗体产生。
在一些实施方案中，施用的低免疫原性细胞(诸如低免疫原性分化细胞和CAR-T细胞)群在受试者或患者中引发降低或较低水平的细胞毒性T细胞杀伤。在一些情况下，与施用免疫原性细胞产生的细胞毒性T细胞杀伤水平相比，所述低免疫原性细胞引发的细胞毒性T细胞杀伤水平低至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施方案中，施用的低免疫原性细胞群无法在受试者或患者中引发细胞毒性T细胞杀伤。
在一些实施方案中，施用的低免疫原性细胞(诸如低免疫原性分化细胞和CAR-T细胞)群在受试者或患者中引发降低或较低水平的补体依赖性细胞毒性(CDC)。在一些情况下，与施用免疫原性细胞产生的CDC水平相比，所述低免疫原性细胞引发的CDC水平低至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施方案中，施用的低免疫原性细胞群无法在受试者或患者中引发CDC。
S.来自原代T细胞的治疗性细胞
本文提供低免疫原性细胞，包括但不限于逃避免疫识别的原代T细胞。在一些实施方案中，工程化和/或低免疫原性细胞由T细胞(诸如原代T细胞)产生(例如，生成、培养或衍生)。在一些情况下，从受试者或个体获得(例如，收获、提取、取出或取得)原代T细胞。在一些实施方案中，由T细胞库产生原代T细胞，使得T细胞来自一个或多个受试者(例如，一个或多个人，包括一个或多个健康的人)。在一些实施方案中，原代T细胞库来自1-100个、1-50个、1-20个、1-10个、1或更多个、2或更多个、3或更多个、4或更多个、5或更多个、10或更多个、20或更多个、30或更多个、40或更多个、50或更多个、或100或更多个受试者。在一些实施方案中，供体受试者与患者(例如，施用治疗性细胞的受体)不同。在一些实施方案中，T细胞库不包括来自患者的细胞。在一些实施方案中，从中获得T细胞库的一个或多个供体受试者与患者不同。
在一些实施方案中，工程化和/或低免疫原性细胞不活化患者(例如，施用后的受体)体内的先天和/或适应性免疫反应。提供了通过向有需要的受试者(例如，受体)或患者施用低免疫原性细胞群来治疗病症的方法。在一些实施方案中，本文所述的工程化和/或低免疫原性细胞包含经工程化(例如，修饰)以表达嵌合抗原受体的T细胞，所述嵌合抗原受体包括但不限于本文所述的嵌合抗原受体。在一些情况下，T细胞是来自一个或多个个体的原代T细胞群或亚群。在一些实施方案中，本文所述的T细胞诸如工程化或修饰的T细胞包含降低的内源性T细胞受体的表达。
在一些实施方案中，本公开涉及低免疫原性原代T细胞，其过表达CD47和CAR，并且具有降低的一种或多种Y染色体基因的表达和降低的一种或多种MHC I类和/或MHC II类人白细胞抗原分子的表达或缺乏所述表达，并且具有降低的TCR复合物分子的表达或缺乏所述表达。本文概述的细胞过表达CD47和CAR并且逃避免疫识别。在一些实施方案中，原代T细胞表现出降低的一种或多种Y染色体基因的表达和降低的MHC I类抗原分子、MHC II类抗原分子和/或TCR复合物分子的水平或活性。在某些实施方案中，原代T细胞过表达CD47和CAR，并且在PCDH11Y基因中具有遗传修饰。在某些实施方案中，原代T细胞过表达CD47和CAR，并且在NLGN4Y基因中具有遗传修饰。在某些实施方案中，原代T细胞过表达CD47和CAR，并且在PCDH11Y基因中具有遗传修饰且在NLGN4Y基因中具有遗传修饰。在某些实施方案中，原代T细胞过表达CD47和CAR，并且在B2M基因中具有基因组修饰。在一些实施方案中，T细胞过表达CD47和CAR，并且在CIITA基因中具有基因组修饰。在一些实施方案中，原代T细胞过表达CD47和CAR，并且在TRAC基因中具有基因组修饰。在一些实施方案中，原代T细胞过表达CD47和CAR，并且在TRB基因中具有基因组修饰。在一些实施方案中，T细胞过表达CD47和CAR，并且在以下基因中的一种或多种中具有基因组修饰：PCDH11Y、NLGN4Y、B2M、CIITA、TRAC和TRB基因。
本公开的示例性T细胞选自由以下组成的组：细胞毒性T细胞、辅助T细胞、记忆T细胞、中央记忆T细胞、效应记忆T细胞、效应记忆RA T细胞、调控性T细胞、组织浸润淋巴细胞及其组合。在某些实施方案中，T细胞表达CCR7、CD27、CD28和CD45RA。在一些实施方案中，中央T细胞表达CCR7、CD27、CD28和CD45RO。在其他实施方案中，效应记忆T细胞表达PD-1、CD27、CD28和CD45RO。在其他实施方案中，效应记忆RA T细胞表达PD-1、CD57和CD45RA。
在一些实施方案中，T细胞是修饰的(例如，工程化的)T细胞。在一些情况下，修饰的T细胞包含引起细胞表达至少一种嵌合抗原受体的修饰，所述嵌合抗原受体与以下细胞中的至少一种的表面上表达的感兴趣的抗原或表位结合：受损细胞、发育异常细胞、感染细胞、免疫原性细胞、发炎细胞、恶性细胞、化生细胞、突变体细胞及其组合。在其他情况下，修饰的T细胞包含引起细胞表达至少一种蛋白质的修饰，当细胞接近相邻细胞、组织或器官时，所述蛋白质在相邻细胞、组织或器官中调节感兴趣的生物学效应。对原代T细胞的有用修饰在US2016/0348073和WO2020/018620中详细描述，所述文献的公开内容整体并入本文。
在一些实施方案中，本文所述的工程化和/或低免疫原性细胞包含经工程化(例如，修饰)以表达嵌合抗原受体的T细胞，所述嵌合抗原受体包括但不限于本文所述的嵌合抗原受体。在一些情况下，T细胞是来自一个或多个个体的原代T细胞群或亚群。在一些实施方案中，本文所述的T细胞诸如工程化或修饰的T细胞包括降低的内源性T细胞受体的表达。在一些实施方案中，本文所述的T细胞诸如工程化或修饰的T细胞包括降低的细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)的表达。在其他实施方案中，本文所述的T细胞诸如工程化或修饰的T细胞包括降低的程序性细胞死亡(PD-1)的表达。在某些实施方案中，本文所述的T细胞诸如工程化或修饰的T细胞包括降低的CTLA-4和PD-1的表达。降低或消除CTLA-4、PD-1以及CTLA-4和PD-1两者的表达的方法可以包括本领域技术人员认可的任何方法，诸如但不限于利用罕见切割核酸内切酶的遗传修饰技术和RNA沉默或RNA干扰技术。罕见切割核酸内切酶的非限制性实例包括任何Cas蛋白、TALEN、锌指核酸酶、大范围核酸酶和归巢核酸内切酶。在一些实施方案中，将编码如本文所公开的多肽(例如，嵌合抗原受体、CD47或本文公开的另一种致耐受因子)的外源核酸插入在CTLA-4和/或PD-1基因座处。
在一些实施方案中，本文所述的T细胞诸如工程化或修饰的T细胞包含增强的PD-L1表达。
在一些实施方案中，低免疫原性T细胞包含编码CAR的多核苷酸，其中将所述多核苷酸插入到基因组基因座中。在一些实施方案中，将多核苷酸插入到安全港或靶标基因座中，诸如但不限于AAVS1、CCR5、CLYBL、ROSA26、SHS231、F3(也称为CD142)、MICA、MICB、LRP1(也称为CD91)、HMGB1、ABO、RHD、FUT1或KDM5D基因座。在一些实施方案中，将多核苷酸插入到B2M、CIITA、TRAC、TRB、PD-1或CTLA-4基因中。
在一些实施方案中，低免疫原性T细胞包含编码CAR的多核苷酸，使用表达载体在细胞中表达所述CAR。在一些实施方案中，使用介导将CAR序列整合到细胞基因组中的病毒表达载体将CAR引入到细胞中。例如，用于在细胞中表达CAR的表达载体包含编码所述CAR的多核苷酸序列。表达载体可以是诱导型表达载体。表达载体可以是病毒载体，诸如但不限于慢病毒载体。
本文提供的低免疫原性T细胞可用于治疗合适的癌症，包括但不限于B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、肝癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌、肺癌、非小细胞肺癌、急性髓性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、胃癌、胃腺癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、肺鳞状细胞癌、肝细胞癌和膀胱癌。
T.从低免疫原性多能干细胞分化的治疗性细胞
本文提供低免疫原性细胞，其包括来源于多能干细胞的逃避免疫识别的细胞。在一些实施方案中，细胞不活化患者或受试者(例如，施用后的受体)中的先天和/或适应性免疫反应。提供了治疗病症的方法，所述方法包括向有需要的受体受试者重复给药低免疫原性细胞群。
在一些实施方案中，多能干细胞和从此类多能干细胞分化的任何细胞被修饰以表现出降低的一种或多种Y染色体基因的表达和降低的MHC I类人白细胞抗原分子的表达。在其他实施方案中，多能干细胞和从此类多能干细胞分化的任何细胞被修饰以表现出降低的一种或多种Y染色体基因的表达和降低的MHC II类人白细胞抗原分子的表达。在某些实施方案中，多能干细胞和从此类多能干细胞分化的任何细胞被修饰以表现出降低的一种或多种Y染色体基因的表达和降低的TCR复合物的表达。在一些实施方案中，多能干细胞和从此类多能干细胞分化的任何细胞被修饰以表现出降低的一种或多种Y染色体基因的表达和降低的MHC I类和II类人白细胞抗原分子的表达。在一些实施方案中，多能干细胞和从此类多能干细胞分化的任何细胞被修饰以表现出降低的一种或多种Y染色体基因的表达和降低的MHC I类和II类人白细胞抗原分子以及TCR复合物的表达。
在一些实施方案中，多能干细胞和从此类多能干细胞分化的任何细胞被修饰以表现出降低的一种或多种Y染色体基因的表达和降低的MHC I类和/或II类人白细胞抗原分子的表达，并且表现出增加的CD47表达。在一些情况下，细胞通过具有一个或多个CD47转基因而过表达CD47。在一些实施方案中，多能干细胞和从此类多能干细胞分化的任何细胞被修饰以表现出降低的一种或多种Y染色体基因的表达和降低的MHC I类和II类人白细胞抗原分子的表达，并且表现出增加的CD47表达。在一些实施方案中，多能干细胞和从此类多能干细胞分化的任何细胞被修饰以表现出降低的一种或多种Y染色体基因的表达和降低的MHCI类和II类人白细胞抗原分子以及TCR复合物的表达，并且表现出增加的CD47表达。
在一些实施方案中，多能干细胞和从此类多能干细胞分化的任何细胞被修饰以表现出降低的一种或多种Y染色体基因的表达和降低的MHC I类和/或II类人白细胞抗原分子的表达、表现出增加的CD47表达，并且被修饰以外源表达嵌合抗原受体。在一些情况下，细胞通过具有一个或多个CD47转基因而过表达CD47多肽。在一些情况下，细胞通过具有一个或多个CAR转基因而过表达CAR多肽。在一些实施方案中，多能干细胞和从此类多能干细胞分化的任何细胞被修饰以表现出降低的一种或多种Y染色体基因的表达和降低的MHC I类和II类人白细胞抗原分子的表达、表现出增加的CD47表达，并且被修饰以外源表达嵌合抗原受体。在一些实施方案中，多能干细胞和从此类多能干细胞分化的任何细胞被修饰以表现出降低的一种或多种Y染色体基因的表达和降低的MHC I类和II类人白细胞抗原分子以及TCR复合物的表达、表现出增加的CD47表达，并且被修饰以外源表达嵌合抗原受体。
此类多能干细胞是低免疫原性干细胞。此类分化的细胞是低免疫原性细胞。
本文所述的任何多能干细胞都可以分化成生物体和组织的任何细胞。在一些实施方案中，细胞表现出降低的一种或多种Y染色体基因的表达、降低的MHC I类和/或II类人白细胞抗原分子的表达和降低的TCR复合物的表达。在一些情况下，与相同细胞类型的未修饰或野生型细胞相比，一种或多种Y染色体基因的表达降低。在一些情况下，与相同细胞类型的未修饰或野生型细胞相比，MHC I类和/或II类人白细胞抗原分子的表达降低。在一些情况下，与相同细胞类型的未修饰或野生型细胞相比，TCR复合物的表达降低。在一些实施方案中，细胞表现出增加的CD47表达。在一些情况下，与相同细胞类型的未修饰或野生型细胞相比，本公开涵盖的细胞中的CD47的表达增加。在一些实施方案中，细胞表现出外源CAR表达。本文描述了用于降低MHC I类和/或II类人白细胞抗原分子和TCR复合物的水平并增加CD47和CAR的表达的方法。
在一些实施方案中，当施用于患者(例如，受体受试者)时，本文所述方法中使用的细胞逃避免疫识别和反应。所述细胞可以逃避免疫细胞在体外和体内的杀伤。在一些实施方案中，细胞逃避巨噬细胞和NK细胞的杀伤。在一些实施方案中，细胞被免疫细胞或受试者的免疫系统忽略。换句话说，根据本文所述的方法施用的细胞不可被免疫系统的免疫细胞检测到。在一些实施方案中，细胞被遮蔽并因此避免免疫排斥。
确定多能干细胞和从这种多能干细胞分化的任何细胞是否逃避免疫识别的方法包括但不限于IFN-γElispot测定、小胶质细胞杀伤测定、细胞植入动物模型、细胞因子释放测定、ELISA、使用生物发光成像或铬释放测定或用于细胞分析的实时定量微电子生物传感器系统(RTCA系统,Agilent)进行的杀伤测定、混合淋巴细胞反应、免疫荧光分析等。
本文概述的治疗性细胞可用于治疗病症，诸如但不限于癌症、遗传病症、慢性感染性疾病、自身免疫性病症、神经病症等。
1.从低免疫原性多能细胞分化的T淋巴细胞
本文提供的T淋巴细胞(T细胞，包括原代T细胞)来源于本文所述的HIP细胞(例如，低免疫原性iPSC)。用于从多能干细胞(例如，iPSC)生成T细胞(包括CAR-T细胞)的方法在例如Iriguchi等人,Nature Communications 12,430(2021)；Themeli等人,Cell Stem Cell,16(4):357-366(2015)；Themeli等人,Nature Biotechnology 31:928-933(2013)中描述。
T淋巴细胞衍生的低免疫原性细胞包括但不限于逃避免疫识别的原代T细胞。在一些实施方案中，低免疫原性细胞由T细胞(诸如原代T细胞)产生(例如，生成、培养或衍生)。在一些情况下，从受试者或个体获得(例如，收获、提取、取出或取得)原代T细胞。在一些实施方案中，由T细胞库产生原代T细胞，使得T细胞来自一个或多个受试者(例如，一个或多个人，包括一个或多个健康的人)。在一些实施方案中，原代T细胞库来自1-100个、1-50个、1-20个、1-10个、1或更多个、2或更多个、3或更多个、4或更多个、5或更多个、10或更多个、20或更多个、30或更多个、40或更多个、50或更多个、或100或更多个受试者。在一些实施方案中，供体受试者与患者(例如，施用治疗性细胞的受体)不同。在一些实施方案中，T细胞库不包括来自患者的细胞。在一些实施方案中，从中获得T细胞库的一个或多个供体受试者与患者不同。
在一些实施方案中，低免疫原性细胞不活化患者(例如，施用后的受体)中的免疫反应。提供了通过向有需要的受试者(例如，受体)或患者施用低免疫原性细胞群来治疗病症的方法。在一些实施方案中，本文所述的低免疫原性细胞包含经工程化(例如，修饰)以表达嵌合抗原受体的T细胞，所述嵌合抗原受体包括但不限于本文所述的嵌合抗原受体。在一些情况下，T细胞是来自一个或多个个体的原代T细胞群或亚群。在一些实施方案中，本文描述的T细胞诸如工程化或修饰的T细胞包含降低的内源性T细胞受体的表达。
在一些实施方案中，HIP衍生的T细胞包括嵌合抗原受体(CAR)。任何合适的CAR都可以包括在hyHIP衍生的T细胞中，包括本文所述的CAR。在一些实施方案中，低免疫原性诱导性多能干细胞衍生的T细胞包括编码CAR的多核苷酸，其中将所述多核苷酸插入到基因组基因座中。在一些实施方案中，将多核苷酸插入到安全港或靶标基因座中。在一些实施方案中，将多核苷酸插入到B2M、CIITA、TRAC、TRB、PD-1或CTLA-4基因中。可以使用任何合适的方法将CAR插入到低免疫原性细胞的基因组基因座中，所述方法包括本文所述的基因编辑方法(例如，CRISPR/Cas系统)。
本文提供的HIP衍生的T细胞可用于治疗合适的自身免疫性疾病/病症和/或炎性疾病/病症，包括但不限于神经、胃肠道和内分泌系统以及皮肤和其他结缔组织、眼睛、血液和血管的疾病。自身免疫性疾病的实例包括但不限于桥本甲状腺炎(Hashimoto'sthyroiditis)、系统性红斑狼疮、干燥综合征(Sjogren's syndrome)、格雷夫斯病(Graves'disease)、硬皮病、类风湿性关节炎、多发性硬化症、与EBV感染相关的MS、重症肌无力和糖尿病。
2.来源于低免疫原性多能细胞的NK细胞
本文提供的自然杀伤(NK)细胞来源于本文所述的HIP细胞(例如，低免疫原性iPSC)。
NK细胞(也定义为“大颗粒淋巴细胞”)代表一种从普通淋巴祖细胞(也产生B淋巴细胞和T淋巴细胞)分化的细胞谱系。与T细胞不同，NK细胞在质膜上不天然包含CD3。重要的是，NK细胞不表达TCR，并且通常也缺乏其他抗原特异性细胞表面受体(以及TCR和CD3，它们也不表达免疫球蛋白B细胞受体，而是通常表达CD16和CD56)。NK细胞的细胞毒性活性不需要致敏作用，但可通过使用多种细胞因子(包括IL-2)的活化而增强。NK细胞通常被认为缺乏抗原受体介导的信号传导所必需的适当或完整的信号传导通路，因此不被认为能够进行抗原受体依赖性信号传导、活化和扩增。NK细胞具有细胞毒性，并且平衡活化性和抑制性受体信号传导以调节其细胞毒性活性。例如，表达CD16的NK细胞可结合与感染细胞结合的抗体的Fc结构域，从而导致NK细胞活化。相比之下，针对表达高水平MHC I类蛋白/分子的细胞的活性降低。在与靶细胞接触时，NK细胞释放蛋白质(诸如穿孔素)和酶(诸如蛋白酶(颗粒酶))。穿孔素可以在靶细胞的细胞膜上形成孔，从而诱导细胞凋亡或细胞裂解。
有许多技术可以用于从多能干细胞(例如iPSC)生成NK细胞，包括CAR-NK细胞；参见，例如Zhu等人,Methods Mol Biol.2019；2048:107-119；Knorr等人,Stem Cells TranslMed.2013 2(4):274-83.doi:10.5966/sctm.2012-0084；Zeng等人,Stem CellReports.2017Dec12；9(6):1796-1812；Ni等人,Methods Mol Biol.2013；1029:33-41；Bernareggi等人,Exp Hematol.2019 71:13-23；Shankar等人,Stem Cell Res Ther.2020；11(1):234，所述文献全部通过引用整体并入本文，特别是用于分化的方法和试剂。可以如本领域已知的那样，通常通过评价NK细胞相关和/或特异性标志物的存在来测定分化，所述标志物包括但不限于CD56、KIRs、CD16、NKp44、NKp46、NKG2D、TRAIL、CD122、CD27、CD244、NK1.1、NKG2A/C、NCR1、Ly49、CD49b、CD11b、KLRG1、CD43、CD62L和/或CD226。
3.心脏细胞
本文提供了从低免疫原性诱导性多能(HIP)细胞分化的用于随后移植或植入到受试者(例如，接受者)中的心脏细胞类型。如本领域技术人员将理解的，用于分化的方法取决于使用已知技术的所需细胞类型。示例性心脏细胞类型包括但不限于心肌细胞、结节心肌细胞、传导心肌细胞、工作心肌细胞、心肌细胞前体细胞、心肌祖细胞、心脏干细胞、心肌细胞、心房心脏干细胞、心室心脏干细胞、心外膜细胞、造血细胞、血管内皮细胞、心内膜内皮细胞、心脏瓣膜间质细胞、心脏起搏细胞等。
在一些实施方案中，将本文所述的心脏细胞施用于受体受试者以治疗选自由以下组成的组的心脏病症：小儿心肌病、年龄相关性心肌病、扩张性心肌病、肥厚性心肌病、限制性心肌病、慢性缺血性心肌病、围产期心肌病、炎症性心肌病、特发性心肌病、其他心肌病、心肌缺血再灌注损伤、心室功能障碍、心力衰竭、充血性心力衰竭、冠心病、终末期心脏病、动脉粥样硬化、缺血、高血压、再狭窄、心绞痛、风湿性心脏病、动脉炎症、心血管疾病、心肌梗塞、心肌缺血、充血性心力衰竭、心肌梗塞、心肌缺血、心脏损伤、心肌缺血、血管疾病、后天性心脏病、先天性心脏病、动脉粥样硬化、冠状动脉疾病、传导系统功能障碍、冠状动脉功能障碍、肺动脉高压、心律失常、肌营养不良、肌肉质量异常、肌肉变性、心肌炎、感染性心肌炎、药物或毒素引起的肌肉异常、过敏性心肌炎和自身免疫性心内膜炎。
因此，本文提供了用于在有需要的受试者中治疗和预防心脏损伤或心脏病或心脏病症的方法。本文所述的方法可用于治疗、改善、预防多种心脏病或其症状(诸如导致心脏结构和/或功能病理性损伤的那些疾病或其症状)或减缓其进展。术语“心脏病”、“心脏病症”和“心脏损伤”在本文中可互换使用，并且是指与心脏(包括瓣膜、内皮、梗塞区或心脏的其他组件或结构)相关的病状和/或病症。此类心脏病或心脏相关疾病包括但不限于心肌梗塞、心力衰竭、心肌病、先天性心脏缺陷、心脏瓣膜疾病或功能障碍、心内膜炎、风湿热、二尖瓣脱垂、感染性心内膜炎、肥厚性心肌病、扩张性心肌病、心肌炎、心脏扩大和/或二尖瓣关闭不全等。
在一些实施方案中，心肌细胞前体包括能够产生包括成熟(末期)心肌细胞的后代的细胞。通常可以使用选自GATA-4、Nkx2.5和MEF-2转录因子家族的一种或多种标志物来鉴定心肌细胞前体细胞。在一些情况下，心肌细胞是指表达来自以下列表的一种或多种标志物(有时至少2、3、4或5种标志物)的未成熟心肌细胞或成熟心肌细胞：心肌肌钙蛋白I(cTnl)、心肌肌钙蛋白T(cTnT)、肌节肌球蛋白重链(MHC)、GATA-4、Nkx2.5、N-钙粘蛋白、β2-肾上腺素受体、ANF、MEF-2转录因子家族、肌酸激酶MB(CK-MB)、肌红蛋白和心房利尿钠因子(ANF)。在一些实施方案中，心脏细胞表现出自发的周期性收缩活动。在一些情况下，当心脏细胞在具有适当Ca2+浓度和电解质平衡的合适组织培养环境中培养时，不必向培养基中添加任何额外成分就可以观察到细胞沿细胞的一个轴以周期性方式收缩，然后从收缩中释放。在一些实施方案中，心脏细胞是低免疫原性心脏细胞。
在一些实施方案中，通过体外分化从低免疫原性诱导性多能干细胞群产生低免疫原性心脏细胞群的方法包括：(a)在包含GSK抑制剂的培养基中培养低免疫原性诱导性多能干细胞群；(b)在包含WNT拮抗剂的培养基中培养低免疫原性诱导性多能干细胞群以产生前心脏细胞群；以及(c)在包含胰岛素的培养基中培养前心脏细胞群以产生免疫低下心脏细胞群。在一些实施方案中，GSK抑制剂是CHIR-99021、其衍生物或其变体。在一些情况下，GSK抑制剂的浓度范围为约2mM至约10mM。在一些实施方案中，WNT拮抗剂是IWR1、其衍生物或其变体。在一些情况下，WNT拮抗剂的浓度范围为约2mM至约10mM。
在一些实施方案中，低免疫原性心脏细胞群与非心脏细胞分离。在一些实施方案中，在施用之前扩增分离的低免疫原性心脏细胞群。在某些实施方案中，在施用之前扩增分离的低免疫原性心脏细胞群并将其冷冻保存。
用于将诱导性多能干细胞或多能干细胞分化成心脏细胞的其他有用方法描述于例如US2017/0152485；US2017/0058263；US2017/0002325；US2016/0362661；US2016/0068814；US9,062,289；US7,897,389；和US7,452,718中。用于从诱导性多能干细胞或多能干细胞产生心脏细胞的额外方法描述于例如Xu等人,Stem Cells and Development,2006,15(5):631-9,Burridge等人,Cell Stem Cell,2012,10:16-28和Chen等人,Stem CellRes,2015,l5(2):365-375中。
在各种实施方案中，低免疫原性心脏细胞可以在包含以下的培养基中培养：BMP途径抑制剂、WNT信号传导活化剂、WNT信号传导抑制剂、WNT激动剂、WNT拮抗剂、Src抑制剂、EGFR抑制剂、PCK活化剂、细胞因子、生长因子、心肌剂、化合物等。
WNT信号传导活化剂包括但不限于CHIR99021。PCK活化剂包括但不限于PMA。WNT信号传导抑制剂包括但不限于选自KY02111、SO3031(KY01-I)、SO2031(KY02-I)和SO3042(KY03-I)以及XAV939的化合物。Src抑制剂包括但不限于A419259。EGFR抑制剂包括但不限于AG1478。
用于从iPSC产生心脏细胞的剂的非限制性实例包括活化素A、BMP4、Wnt3a、VEGF、可溶性卷曲蛋白、环孢菌素A、血管紧张素II、去氧肾上腺素、抗坏血酸、二甲基亚砜、5-氮杂-2'-脱氧胞苷等。
本文提供的细胞可以在表面诸如合成表面上培养，以支持和/或促进低免疫原性多能细胞分化成心脏细胞。在一些实施方案中，所述表面包含聚合物材料，包括但不限于所选的一种或多种丙烯酸酯单体的均聚物或共聚物。丙烯酸酯单体和甲基丙烯酸酯单体的非限制性实例包括四(乙二醇)二丙烯酸酯、二甲基丙烯酸甘油酯、二甲基丙烯酸1,4-丁二醇、聚(乙二醇)二丙烯酸酯、二(乙二醇)二甲基丙烯酸酯、四(乙二醇)二甲基丙烯酸酯、1,6-己二醇丙氧基化物二丙烯酸酯、新戊二醇二丙烯酸酯、三羟甲基丙烷苯甲酸酯二丙烯酸酯、三羟甲基丙烷乙氧基化物(1EO/QH)甲基、三环[5.2.1.02,6]癸烷二甲醇二丙烯酸酯、新戊二醇乙氧基化物二丙烯酸酯和三羟甲基丙烷三丙烯酸酯。丙烯酸酯按照本领域已知的方式合成或从商业供应商获得，诸如Polysciences,Inc.、Sigma Aldrich,Inc.和Sartomer,Inc。
聚合物材料可以分散在支撑材料的表面上。适用于培养细胞的有用的支撑材料包括陶瓷物质、玻璃、塑料、聚合物或共聚物、其任何组合、或一种材料在另一种材料上的涂层。在一些情况下，玻璃包括钠钙玻璃、耐热玻璃、高硅氧玻璃、石英玻璃、硅或这些玻璃的衍生物等。
在一些情况下，包括树枝状聚合物的塑料或聚合物包括聚(氯乙烯)、聚(乙烯醇)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(乙酸乙烯酯-马来酸酐)、聚(二甲基硅氧烷)单甲基丙烯酸酯、环烯烃聚合物、氟碳聚合物、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯亚胺或这些的衍生物等。在一些情况下，共聚物包括聚(乙酸乙烯酯-共-马来酸酐)、聚(苯乙烯-共-马来酸酐)、聚(乙烯-共-丙烯酸)或这些的衍生物等。
可以在心脏冷冻损伤的动物模型中评估如本文所述制备的心脏细胞的功效，所述心脏冷冻损伤导致55％的左心室壁组织在未经治疗的情况下变成疤痕组织(Li等人,Ann.Thorac.Surg.62:654,1996；Sakai等人,Ann.Thorac.Surg.8:2074,1999,Sakai等人,Thorac.Cardiovasc.Surg.118:715,1999)。成功的治疗可以减少疤痕面积，限制疤痕扩张，并改善心脏功能(通过收缩压、舒张压和发展压确定)。还可以使用左前降支的远端部分中的栓塞线圈来对心脏损伤进行建模(Watanabe等人,Cell Transplant.7:239,1998)，并且可以通过组织学和心脏功能来评价治疗功效。
在一些实施方案中，施用包括植入受试者的心脏组织、静脉内注射、动脉内注射、冠状动脉内注射、肌内注射、腹膜内注射、心肌内注射、经心内膜注射、经心外膜注射或输注。
在一些实施方案中，施用了工程化心脏细胞的患者还施用了心脏药物。适用于联合疗法的心脏药物的说明性实例包括但不限于生长因子、编码生长因子的多核苷酸、血管生成剂、钙通道阻断剂、抗高血压剂、抗有丝分裂剂、正性肌力剂、抗动脉粥样硬化剂、抗凝血剂、β-受体阻滞剂、抗心律失常剂、抗炎剂、血管扩张剂、溶栓剂、强心苷、抗生素、抗病毒剂、抗真菌剂、原生动物抑制剂、硝酸盐、血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂、血管紧张素II受体拮抗剂、脑钠肽(BNP)；抗肿瘤剂、类固醇等。
可以多种方式监测根据本文提供的方法的治疗效果。例如，可以利用心电图(ECG)或霍特监测器(holier monitor)来确定治疗功效。ECG是心律和电脉冲的量度，并且是一种用于确定治疗是否改善或维持、预防或减缓受试者心脏电传导的退化的非常有效且非侵入性方式。使用可以长时间佩戴的便携式ECG霍特监测器来监测心脏异常、心律失常病症等也是评估治疗有效性的可靠方法。ECG或核研究可用于确定心室功能的改善。
4.神经细胞
本文提供了从低免疫原性诱导性多能干(HIP)细胞分化的可用于随后移植或植入到受体受试者中的不同神经细胞类型。如本领域技术人员将理解的，用于分化的方法取决于使用已知技术的所需细胞类型。示例性神经细胞类型包括但不限于脑内皮细胞、神经元(例如，多巴胺能神经元)、神经胶质细胞等。
在一些实施方案中，诱导性多能干细胞的分化通过将细胞暴露或接触已知产生特定细胞谱系的特定因子来进行，以便将其分化物靶向特定的、期望的谱系和/或感兴趣的细胞类型。在一些实施方案中，终末分化细胞表现出专门的表型特性或特征。在某些实施方案中，本文所述的干细胞分化成神经外胚层、神经元、神经内分泌、多巴胺能、胆碱能、血清素能(5-HT)、谷氨酸能、GABA能、肾上腺素能、去甲肾上腺素能、交感神经元、副交感神经元、交感周围神经元或神经胶质细胞群。在一些情况下，神经胶质细胞群包括小胶质(例如，变形、分支、活化的吞噬和活化的非吞噬)细胞群或大胶质(中枢神经系统细胞：星形胶质细胞、少突胶质细胞、室管膜细胞和放射状胶质细胞；和周围神经系统细胞：雪旺氏细胞(Schwanncell)和卫星细胞)细胞群，或任何前述细胞的前体和祖细胞。
用于产生不同类型的神经细胞的方案描述于PCT申请号WO2010144696、美国专利号9,057,053；9,376,664；和10,233,422。用于分化低免疫原性多能细胞的方法的额外描述可见于例如Deuse等人,Nature Biotechnology,2019,37,252-258和Han等人,Proc NatlAcad Sci USA,2019,116(21),10441-10446。以下参考文献中描述了用于确定神经细胞移植在神经系统病症或病状的动物模型中的效果的方法：对于脊髓损伤，Curtis等人,CellStem Cell,2018,22,941-950；对于帕金森病(Parkinson’s disease)，Kikuchi等人,Nature,2017,548:592-596；对于ALS–Izrael等人,Stem Cell Research,2018,9(1):152和Izrael等人,IntechOpen,DOI:10.5772/intechopen.72862；对于癫痫，Upadhya等人,PNAS,2019,116(1):287-296
5.脑内皮细胞
在一些实施方案中，向受试者施用神经细胞以治疗帕金森病、亨廷顿病(Huntington disease)、多发性硬化症、其他神经变性疾病或病状、注意力缺陷多动障碍(ADHD)、抽动秽语综合征(TS)、精神分裂症、精神病、抑郁症、其他神经精神病症。在一些实施方案中，将本文所述的神经细胞施用于受试者以治疗或改善中风。在一些实施方案中，将神经元和神经胶质细胞施用于患有肌萎缩侧索硬化症(ALS)的受试者。在一些实施方案中，施用脑内皮细胞以减轻脑出血的症状或影响。在一些实施方案中，将多巴胺能神经元施用于患有帕金森病的患者。在一些实施方案中，将去甲肾上腺素能神经元、GABA能中间神经元施用于经历过癫痫发作的患者。在一些实施方案中，将运动神经元、中间神经元、雪旺氏细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞施用于经历过脊髓损伤的患者。
在一些实施方案中，脑内皮细胞(EC)、其前体和祖细胞通过在包含促进EC或神经细胞产生的一种或多种因子的培养基中培养细胞来从表面上的多能干细胞(例如，诱导性多能干细胞)分化。在一些情况下，培养基包含以下中的一种或多种：CHIR-99021、VEGF、碱性FGF(bFGF)和Y-27632。在一些实施方案中，培养基包含被设计用于促进神经细胞的存活和功能性的补充物。
在一些实施方案中，脑内皮细胞(EC)、其前体和祖细胞通过在非条件或条件培养基中培养细胞来从表面上的多能干细胞分化。在一些情况下，培养基包含促进或促成分化的因子或小分子。在一些实施方案中，培养基包含选自由以下组成的组的一种或多种因子或小分子：VEGR、FGF、SDF-1、CHIR-99021、Y-27632、SB 431542及其任何组合。在一些实施方案中，用于分化的表面包含一种或多种细胞外基质蛋白。表面可以涂覆有一种或多种细胞外基质蛋白。可以使细胞在悬浮液中分化，然后将其放入凝胶基质形式(诸如基质胶、明胶或纤维蛋白/凝血酶形式)中以促进细胞存活。在一些情况下，如本领域已知的那样，通常通过评价细胞特异性标志物的存在来测定分化。
在一些实施方案中，脑内皮细胞表达或分泌选自由CD31、VE钙粘蛋白及其组合组成的组的因子。在某些实施方案中，脑内皮细胞表达或分泌选自由以下组成的组的一种或多种因子：CD31、CD34、CD45、CD117(c-kit)、CD146、CXCR4、VEGF、SDF-1、PDGF、GLUT-1、PECAM-1、eNOS、封闭蛋白-5、闭锁蛋白、ZO-1、p-糖蛋白、血管性血友病因子(vonWillebrand factor)、VE-钙粘蛋白、低密度脂蛋白受体LDLR、低密度脂蛋白受体相关蛋白1LRP1、胰岛素受体INSR、瘦素受体LEPR、基底细胞粘附分子BCAM、转铁蛋白受体TFRC、晚期糖基化终产物特异性受体AGER、视黄醇摄取受体STRA6、大中性氨基酸转运蛋白小亚基1SLC7A5、兴奋性氨基酸转运蛋白3SLC1A1、钠偶联中性氨基酸转运蛋白5SLC38A5、溶质载体家族16成员1SLC16A1、ATP依赖性转位酶ABCB1、ATP-ABCC2结合盒转运蛋白ABCG2、多药耐药相关蛋白1ABCC1、小管多特异性有机阴离子转运蛋白1ABCC2、多药耐药相关蛋白4ABCC4和多药耐药相关蛋白5ABCC5。
在一些实施方案中，脑EC的特征在于具有选自由以下组成的组的一种或多种特征：紧密连接的高表达、高电阻、低开窗、小血管周围间隙、胰岛素和转铁蛋白受体的普遍存在以及高线粒体数量。
在一些实施方案中，使用正选择策略来选择或纯化脑EC。在一些情况下，根据内皮细胞标志物诸如但不限于CD31对脑EC进行分选。换句话说，将CD31阳性脑EC分离出来。在一些实施方案中，使用负选择策略来选择或纯化脑EC。在一些实施方案中，通过选择表达多能性标志物(包括但不限于TRA-1-60和SSEA-1)的细胞来去除未分化或多能干细胞。
6.多巴胺能神经元
在一些实施方案中，本文所述的低免疫原性诱导性多能干(HIP)细胞分化成多巴胺能神经元，包括神经元干细胞、神经元祖细胞、未成熟多巴胺能神经元和成熟多巴胺能神经元。
在一些情况下，术语“多巴胺能神经元”包括表达酪氨酸羟化酶(TH)的神经元细胞，所述酪氨酸羟化酶是多巴胺合成的限速酶。在一些实施方案中，多巴胺能神经元分泌神经递质多巴胺，并且很少或不表达多巴胺羟化酶。多巴胺能(DA)神经元可以表达以下标志物中的一种或多种：神经元特异性烯醇化酶(NSE)、1-芳香族氨基酸脱羧酶、囊泡单胺转运蛋白2、多巴胺转运蛋白、Nurr-l和多巴胺2受体(D2受体)。在某些情况下，术语“神经干细胞”包括沿着神经细胞途径部分分化并表达一种或多种神经标志物(包括例如巢蛋白)的多能细胞群。神经干细胞可以分化成神经元或神经胶质细胞(例如，星形胶质细胞和少突胶质细胞)。术语“神经祖细胞”包括表达FOXA2和低水平b-微管蛋白但不表达酪氨酸羟化酶的培养细胞。在培养适当的因子诸如本文所述的那些时，此类神经祖细胞具有分化成多种神经元亚型；特别是多种多巴胺能神经元亚型的能力。
在一些实施方案中，将来源于低免疫原性诱导性多能干(HIP)细胞的DA神经元施用于患者，例如人类患者，以治疗神经变性疾病或病状。在一些情况下，神经变性疾病或病状选自由帕金森病、亨廷顿病和多发性硬化症组成的组。在其他实施方案中，DA神经元用于治疗或改善神经精神障碍的一种或多种症状，诸如注意力缺陷多动障碍(ADHD)、抽动秽语综合征(TS)、精神分裂症、精神病和抑郁症。在又其他实施方案中，DA神经元用于治疗DA神经元受损的患者。
在一些实施方案中，DA神经元、其前体和祖细胞通过在包含一种或多种因子或添加剂的培养基中培养干细胞来从多能干细胞分化。促进DA神经元分化、生长、扩增、维持和/或成熟的有用因子和添加剂包括但不限于Wntl、FGF2、FGF8、FGF8a、音猬因子(SHH)、脑源性神经营养因子(BDNF)、转化生长因子a(TGF-a)、TGF-b、白细胞介素1β、胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)、GSK-3抑制剂(例如，CHIR-99021)、TGF-b抑制剂(例如，SB-431542)、B-27补充剂、多索吗啡(dorsomorphin)、嘌吗啡胺(purmorphamine)、头蛋白(noggin)、视黄酸、cAMP、抗坏血酸、神经秩蛋白(neurturin)、敲除血清替代物、N-乙酰半胱氨酸、c-kit配体、其修饰形式、其模拟物、其类似物、及其变体。在一些实施方案中，DA神经元在活化或抑制WNT途径、NOTCH途径、SHH途径、BMP途径、FGF途径等的一种或多种因子的存在下分化。分化方案及其详细描述提供于例如US9,968,637、US7,674,620、Kim等人,Nature,2002,418,50-56；Bjorklund等人,PNAS,2002,99(4),2344-2349；Grow等人,Stem Cells TranslMed.2016,5(9):1133-44和Cho等人,PNAS,2008,105:3392-3397，包括实施例、方法、附图和结果的详细描述的公开内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，低免疫原性多巴胺能神经元群体是从非神经元细胞中分离的。在一些实施方案中，在施用之前扩增分离的低免疫原性多巴胺能神经元群体。在某些实施方案中，在施用之前扩增分离的低免疫原性多巴胺能神经元群体并将其冷冻保存。
为了表征和监测DA分化并评估DA表型，可以评价任何数量的分子和遗传标志物的表达。例如，遗传标志物的存在可以通过本领域技术人员已知的各种方法来确定。分子标志物的表达可以通过定量方法来确定，诸如但不限于基于qPCR的测定、免疫测定、免疫细胞化学测定、免疫印迹测定等。DA神经元的示例性标志物包括但不限于TH、b-微管蛋白、配对盒蛋白(Pax6)、胰岛素基因增强蛋白(Isl1)、巢蛋白、二氨基联苯胺(DAB)、G蛋白活化的内向整流钾通道2(GIRK2)、微管相关蛋白2(MAP-2)、NURR1、多巴胺转运蛋白(DAT)、叉头盒蛋白A2(FOXA2)、FOX3、双皮质素和LIM同源盒转录因子l-β(LMX1B)等。在一些实施方案中，DA神经元表达选自corin、FOXA2、TuJ1、NURR1及其任何组合的一种或多种标志物。
在一些实施方案中，根据细胞电生理活性评估DA神经元。细胞的电生理学可以通过使用本领域技术人员已知的测定来评价。例如，全细胞和穿孔膜片钳、用于检测细胞电生理活性的测定、用于测量细胞动作电位大小和持续时间的测定、以及用于检测DA细胞的多巴胺产生的功能测定。
在一些实施方案中，DA神经元分化的特征在于自发节律性动作电位和在注入去极化电流后具有尖峰频率适应的高频动作电位。在其他实施方案中，DA分化的特征在于多巴胺的产生。产生的多巴胺水平是通过测量动作电位达到其最大幅度一半(尖峰半最大宽度)时的宽度来计算的。
在一些实施方案中，静脉内或通过注射将分化的DA神经元移植到患者体内的特定位置。在一些实施方案中，将分化的DA细胞移植到大脑的黑质(特别是致密区域中或附近)、腹侧被盖区(VTA)、尾状核、壳核、伏隔核、丘脑底核或其任何组合中，以替代其变性导致帕金森病的DA神经元。分化的DA细胞可以作为细胞悬浮液注射到目标区域中。或者，当包含在此种递送装置中时，可将分化的DA细胞嵌入支持基质或支架中。在一些实施方案中，支架是可生物降解的。在其他实施方案中，支架是不可生物降解的。支架可包含天然或合成(人工)材料。
DA神经元的递送可通过使用合适的媒介物来实现，所述媒介物诸如但不限于脂质体、微粒或微胶囊。在其他实施方案中，分化的DA神经元以包含等渗赋形剂的药物组合物的形式施用。所述药物组合物是在对于人类施用而言足够无菌的条件下制备的。在一些实施方案中，从HIP细胞分化的DA神经元以药物组合物的形式提供。细胞组合物的治疗制剂的一般原则可见于Cell Therapy:Stem Cell Transplantation,Gene Therapy,and CellularImmunotherapy,G.Morstyn和W.Sheridan编辑,Cambridge University Press,1996和Hematopoietic Stem Cell Therapy,E.Ball、J.Lister和P.Law,Churchill Livingstone,2000，其公开内容通过引用并入本文。
对来源于干细胞的神经元及其制备方法的有用描述可见于例如Kirkeby等人,Cell Rep,2012,1:703-714；Kriks等人,Nature,2011,480:547-551；Wang等人,Stem CellReports,2018,11(1):171-182；Lorenz Studer,“Chapter 8-Strategies for BringingStem Cell-Derived Dopamine Neurons to the clinic-The NYSTEM Trial”in Progressin Brain Research,2017,第230卷,第191-212页；Liu等人,Nat Protoc,2013,8:1670-1679；Upadhya等人,Curr Protoc Stem Cell Biol,38,2D.7.1-2D.7.47；美国公布申请号20160115448和US8,252,586；US8,273,570；US9,487,752和US10,093,897，其内容通过引用整体并入本文。
除了DA神经元之外，其他神经元细胞、其前体和祖细胞也可以通过在包含一种或多种因子或添加剂的培养基中培养细胞来从本文概述的HIP细胞分化。因子和添加剂的非限制性实例包括GDNF、BDNF、GM-CSF、B27、碱性FGF、碱性EGF、NGF、CNTF、SMAD抑制剂、Wnt拮抗剂、SHH信号传导活化剂及其任何组合。在一些实施方案中，SMAD抑制剂选自由以下组成的组：SB431542、LDN-193189、Noggin PD169316、SB203580、LY364947、A77-01、A-83-01、BMP4、GW788388、GW6604、SB-505124、乐德木单抗(lerdelimumab)、美替木单抗(metelimumab)、GC-I008、AP-12009、AP-110I4、LY550410、LY580276、LY364947、LY2109761、SB-505124、E-616452(RepSox ALK抑制剂)、SD-208、SMI6、NPC-30345、K 26894、SB-203580、SD-093、活化素-M108A、P144、可溶性TBR2-Fc、DMH-1、dorsomorphin二盐酸盐及其衍生物。在一些实施方案中，Wnt拮抗剂选自由以下组成的组：XAV939、DKK1、DKK-2、DKK-3、DKK-4、SFRP-1、SFRP-2、SFRP-3、SFRP-4、SFRP-5、WIF-1、Soggy、IWP-2、IWR1、ICG-001、KY0211、Wnt-059、LGK974、IWP-L6及其衍生物。在一些实施方案中，SHH信号传导活化剂选自由以下组成的组：平滑激动剂(SAG)、SAG类似物、SHH、C25-SHH、C24-SHH、purmorphamine、Hg-Ag和/或其衍生物。
在一些实施方案中，神经元表达选自由以下组成的组的一种或多种标志物：离子型谷氨酸受体NMDA型亚基1GRIN1、谷氨酸脱羧酶1GAD1、γ-氨基丁酸GABA、酪氨酸羟化酶TH、LIM同源盒转录因子1-αLMX1A、叉头盒蛋白O1 FOXO1、叉头盒蛋白A2 FOXA2、叉头盒蛋白O4 FOXO4、FOXG1、2',3'-环核苷酸3'-磷酸二酯酶CNP、髓磷脂碱性蛋白MBP、微管蛋白β链3TUB3、微管蛋白β链3NEUN、溶质载体家族1成员6SLC1A6、SST、PV、钙结合蛋白、RAX、LHX6、LHX8、DLX1、DLX2、DLX5、DLX6、SOX6、MAFB、NPAS1、ASCL1、SIX6、OLIG2、NKX2.1、NKX2.2、NKX6.2、VGLUT1、MAP2、CTIP2、SATB2、TBR1、DLX2、ASCL1、ChAT、NGFI-B、c-fos、CRF、RAX、POMC、下视丘分泌素、NADPH、NGF、Ach、VAChT、PAX6、EMX2p75、CORIN、TUJ1、NURR1和/或其任何组合。
7.神经胶质细胞
在一些实施方案中，所描述的神经细胞包括神经胶质细胞，诸如但不限于小神经胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞、室管膜细胞和雪旺氏细胞、神经胶质前体及其神经胶质祖细胞是通过将多能干细胞分化成治疗有效的神经胶质细胞等产生的。低免疫原性多能干细胞的分化产生低免疫原性神经细胞，诸如低免疫原性神经胶质细胞。
在一些实施方案中，通过在包含选自由以下组成的组的一种或多种剂的培养基中培养多能干细胞来产生神经胶质细胞、其前体和祖细胞：视黄酸、IL-34、M-CSF、FLT3配体、GM-CSF、CCL2、TGFβ抑制剂、BMP信号传导抑制剂、SHH信号传导活化剂、FGF、血小板衍生生长因子PDGF、PDGFR-α、HGF、IGF1、noggin、SHH、dorsomorphin、noggin及其任何组合。在某些情况下，BMP信号传导抑制剂是LDN193189、SB431542或其组合。在一些实施方案中，神经胶质细胞表达NKX2.2、PAX6、SOX10、脑源性神经营养因子BDNF、中性粒细胞营养因子-3NT-3、NT-4、EGF、睫状神经营养因子CNTF、神经生长因子NGF、FGF8、EGFR、OLIG1、OLIG2、髓磷脂碱性蛋白MBP、GAP-43、LNGFR、nestin、GFAP、CD11b、CD11c、CX3CR1、P2RY12、IBA-1、TMEM119、CD45及其任何组合。示例性分化培养基可以包括可促进或能够产生本领域技术人员所认识的神经胶质细胞类型的任何特定因子和/或小分子。
为了确定根据体外分化方案产生的细胞是否表现出神经胶质细胞的特性和特征，可将细胞移植到动物模型中。在一些实施方案中，将神经胶质细胞注射到免疫受损的小鼠，例如免疫受损的shiverer小鼠中。将神经胶质细胞施用于小鼠的大脑中，并在预先选择的时间后对植入的细胞进行评价。在一些情况下，通过使用免疫染色和成像方法来使大脑中的植入细胞可视化。在一些实施方案中，确定神经胶质细胞表达已知的神经胶质细胞生物标志物。
用于从干细胞产生神经胶质细胞、其前体和祖细胞的有用方法可见于例如US7,579,188；US7,595,194；US8,263,402；US8,206,699；US8,252,586；US9,193,951；US9,862,925；US8,227,247；US9,709,553；US2018/0187148；US2017/0198255；US2017/0183627；US2017/0182097；US2017/253856；US2018/0236004；WO2017/172976；和WO2018/093681。用于分化多能干细胞的方法描述于例如Kikuchi等人,Nature,2017,548,592-596；Kriks等人,Nature,2011,547-551；Doi等人,Stem Cell Reports,2014,2,337-50；Perrier等人,Proc Natl Acad Sci USA,2004,101,12543-12548；Chambers等人,Nat Biotechnol,2009,27,275-280；和Kirkeby等人,Cell Reports,2012,1,703-714。
神经细胞移植对于脊髓损伤的功效可在例如急性脊髓损伤的大鼠模型中进行评估，如McDonald等人,Nat.Med.,1999,5:1410)和Kim等人,Nature,2002,418:50所述。例如，成功的移植可能会显示2-5周后病灶处存在移植源细胞，分化成星形胶质细胞、少突胶质细胞和/或神经元，并从病灶端沿着脊髓迁移，步态、协调性和负重能力改善。基于神经细胞类型和待治疗的神经疾病或病状选择特定的动物模型。
神经细胞可以允许它们植入到预期组织部位并重建或再生功能缺陷区域的方式施用。例如，根据所治疗的疾病，神经细胞可以直接移植到中枢神经系统的实质或鞘内部位。在一些实施方案中，通过静脉内、脊柱内、脑室内、鞘内、动脉内、肌内、腹膜内、皮下、肌内、腹内、眼内、球后及其组合将本文所述的任何神经细胞(包括脑内皮细胞、神经元、多巴胺能神经元、室管膜细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞、少突胶质细胞和雪旺氏细胞)注射到患者体内。在一些实施方案中，细胞以推注或连续输注的形式注射或沉积。在某些实施方案中，神经细胞通过注射到脑内、脑部附近及其组合来施用。例如，可通过在受试者的头骨中开的钻孔来进行注射。向脑施用神经细胞的合适位点包括但不限于脑室、侧脑室、大池、壳核、基底核、海马皮层、纹状体、脑尾状区及其组合。
用于本公开的包括多巴胺能神经元的神经细胞的额外描述可见于WO2020/018615，其公开内容通过引用整体并入本文。
8.内皮细胞
本文提供了分化成各种内皮细胞类型的低免疫原性多能细胞，用于随后移植或植入到受试者(例如，接受者)中。如本领域技术人员将理解的，用于分化的方法取决于使用已知技术的所需细胞类型。
在一些实施方案中，将从受试者低免疫原性多能细胞分化的内皮细胞施用于有需要的患者，例如人患者。内皮细胞可以施用于患有疾病或病状的患者，所述疾病或病状诸如但不限于心血管疾病、血管疾病、外周血管疾病、缺血性疾病、心肌梗塞、充血性心力衰竭、外周血管阻塞性疾病、中风、再灌注损伤、肢体缺血、神经病变(例如，周围神经病变或糖尿病性神经病变)、器官衰竭(例如，肝衰竭、肾衰竭等)、糖尿病、类风湿性关节炎、骨质疏松、血管损伤、组织损伤、高血压、心绞痛以及冠状动脉疾病引起的心肌梗塞、肾血管性高血压、肾动脉狭窄引起的肾功能衰竭、下肢跛行等。在某些实施方案中，患者已经患有或正患有短暂性脑缺血发作或中风，在一些情况下，这可能是由于脑血管疾病引起的。在一些实施方案中，施用工程化内皮细胞以治疗组织缺血(例如在动脉粥样硬化、心肌梗塞和肢体缺血中发生的组织缺血)，并且修复损伤的血管。在一些情况下，细胞用于移植物的生物工程。
例如，内皮细胞可用于细胞疗法，用于修复缺血组织、形成血管和心脏瓣膜、工程化人工血管、修复受损血管以及诱导工程化组织中血管的形成(例如，移植前)。此外，内皮细胞可被进一步修饰以递送剂来靶向和治疗肿瘤。
在某些实施方案中，本文提供了一种修复或替换需要血管细胞或血管化的组织的方法。所述方法涉及向需要此类治疗的人患者施用含有分离的内皮细胞的组合物以促进此类组织中的血管形成。需要血管细胞或血管化的组织可以是心脏组织、肝脏组织、胰腺组织、肾组织、肌肉组织、神经组织、骨组织等，其可以是受损的并且以过度细胞死亡为特征的组织、有受损风险的组织或人工工程化组织。
在一些实施方案中，可通过施用内皮细胞来治疗可能与心脏疾病或病症相关的血管疾病，所述内皮细胞诸如但不限于如本文所述衍生的定形血管内皮细胞和心内膜内皮细胞。此类血管疾病包括但不限于冠状动脉疾病、脑血管疾病、主动脉狭窄、主动脉瘤、外周动脉疾病、动脉粥样硬化、静脉曲张、血管病、缺乏冠状动脉灌注的心脏梗塞区域、不愈合的伤口、糖尿病或非糖尿病性溃疡，或希望诱导血管形成的任何其他疾病或病症。
在某些实施方案中，内皮细胞用于改进在血管重建手术中使用的假体植入物(例如，由诸如Dacron和Gortex的合成材料制成的血管)。例如，假体动脉移植物通常用于替代灌注重要器官或肢体的患病动脉。在其他实施方案中，工程化内皮细胞用于覆盖假体心脏瓣膜的表面，以通过使瓣膜表面不易形成血栓来降低栓塞形成的风险。
可使用众所周知的外科技术将所概述的内皮细胞移植到患者体内，以将组织和/或分离的细胞移植到血管中。在一些实施方案中，通过注射(例如，心肌内注射、冠状动脉内注射、经心内膜注射、经心外膜注射、经皮注射)、输注、移植和植入将细胞引入患者的心脏组织中。
内皮细胞的施用(递送)包括但不限于皮下或胃肠外施用，包括静脉内、动脉内(例如，冠状动脉内)、肌内、腹膜内、心肌内、经心内膜、经心外膜、鼻内施用以及鞘内施用，和输液技术。
如本领域技术人员将理解的，使用本领域已知的技术移植HIP衍生物，这取决于细胞类型和这些细胞的最终用途。在一些实施方案中，本文提供的从受试者分化的细胞HIP可以静脉内移植或通过在患者的特定位置注射来移植。当移植到特定位置时，可将细胞悬浮在凝胶基质中，以防止它们在固定时分散。
示例性内皮细胞类型包括但不限于毛细血管内皮细胞、血管内皮细胞、主动脉内皮细胞、动脉内皮细胞、静脉内皮细胞、肾内皮细胞、脑内皮细胞、肝内皮细胞等。
本文概述的内皮细胞可表达一种或多种内皮细胞标志物。此类标志物的非限制性实例包括VE-钙粘蛋白(CD 144)、ACE(血管紧张素转换酶)(CD 143)、BNH9/BNF13、CD31、CD34、CD54(ICAM-l)、CD62E(E-选择素)、CD105(Endoglin)、CD146、Endocan(ESM-l)、Endoglyx-l、内皮粘蛋白(Endomucin)、Eotaxin-3、EPAS1(内皮PAS结构域蛋白1)、因子VIII相关抗原、FLI-l、Flk-l(KDR、VEGFR-2)、FLT-l(VEGFR-l)、GATA2、GBP-l(鸟苷酸结合蛋白-l)、GRO-α、HEX、ICAM-2(细胞间粘附分子2)、LM02、LYVE-l、MRB(神奇迂回(magicroundabout))、核仁素、PAL-E(病理解剖学Leiden-内皮(pathologische anatomieLeiden-endothelium))、RTK、sVCAM-l、TALI、TEM1(肿瘤内皮标志物1)、TEM5(肿瘤内皮标志物5)、TEM7(肿瘤内皮标志物7)、血栓调节蛋白(TM、CD141)、VCAM-l(血管细胞粘附分子-1)(CD106)、VEGF、vWF(血管性血友病因子)、ZO-l、内皮细胞选择性粘附分子(ESAM)、CD102、CD93、CD184、CD304和DLL4。
在一些实施方案中，内皮细胞被遗传修饰以表达编码可用于治疗病症/病状或改善所述病症/病状的症状的感兴趣的蛋白质(诸如但不限于酶、激素、受体、配体或药物)的外源基因。用于遗传修饰内皮细胞的标准方法描述于例如US5,674,722中。
此类内皮细胞可用于提供可用于预防或治疗疾病的多肽或蛋白质的组成型合成和递送。以此方式，多肽被直接分泌到个体的血流或身体其他区域(例如，中枢神经系统)中。在一些实施方案中，内皮细胞可被修饰以分泌胰岛素、凝血因子(例如，因子VIII或血管性血友病因子)、α-l抗胰蛋白酶、腺苷脱氨酶、组织纤溶酶原活化剂、白细胞介素(例如，IL-l、IL-2、IL-3)等。
在某些实施方案中，可以改善内皮细胞在植入的移植物的情况下的性能的方式修饰内皮细胞。非限制性说明性实例包括分泌或表达血栓溶解剂以防止管腔内凝块形成、分泌平滑肌增殖抑制剂以防止由于平滑肌肥大导致的管腔狭窄、以及表达和/或分泌内皮细胞有丝分裂原或自分泌因子以刺激内皮细胞增殖并改善移植物管腔内皮细胞衬里的程度或持续时间。
在一些实施方案中，工程化内皮细胞用于将治疗水平的分泌产物递送至特定器官或肢体。例如，可将体外工程化(转导)的内皮细胞内衬的血管植入物移植到特定的器官或肢体中。转导的内皮细胞的分泌产物将以高浓度递送至灌注组织，从而达到目标解剖位置的预期效果。
在其他实施方案中，内皮细胞被遗传修饰以含有当由血管化肿瘤中的内皮细胞表达时破坏或抑制血管生成的基因。在一些情况下，还可以对内皮细胞进行遗传修饰以表达本文所述的任何一种选择性自杀基因，其允许在完成肿瘤治疗后对移植的内皮细胞进行阴性选择。
在一些实施方案中，将本文所述的内皮细胞施用于受体受试者以治疗选自由以下组成的组的血管病症：血管损伤、心血管疾病、血管疾病、外周血管疾病、缺血性疾病、心肌梗塞、充血性心力衰竭、外周血管阻塞性疾病、高血压、缺血性组织损伤、再灌注损伤、肢体缺血、中风、神经病变(例如，周围神经病变或糖尿病性神经病变)、器官衰竭(例如，肝衰竭、肾衰竭等)、糖尿病、类风湿性关节炎、骨质疏松、脑血管疾病、高血压、心绞痛以及冠状动脉疾病引起的心肌梗塞、肾血管性高血压、肾动脉狭窄引起的肾功能衰竭、其他血管病状或疾病。
在一些实施方案中，低免疫原性多能细胞分化成内皮集落形成细胞(ECFC)以形成新血管，从而解决外周动脉疾病。分化内皮细胞的技术是已知的。参见例如Prasain等人,doi:10.1038/nbt.3048，其通过引用整体并入本文，特别是用于从人多能干细胞产生内皮细胞以及用于移植技术的方法和试剂。可以如本领域已知的那样，通常通过评价内皮细胞相关或特异性标志物的存在或通过在功能上测量来测定分化。
在一些实施方案中，通过体外分化从低免疫原性诱导性多能干(HIP)细胞群产生低免疫原性内皮细胞群的方法包括：(a)在包含GSK抑制剂的第一培养基中培养HIP细胞群；(b)在包含VEGF和bFGF的第二培养基中培养HIP细胞群以产生前内皮细胞群；以及(c)在包含ROCK抑制剂和ALK抑制剂的第三培养基中培养前内皮细胞群，以产生低免疫原性内皮细胞群。
在一些实施方案中，GSK抑制剂是CHIR-99021、其衍生物或其变体。在一些情况下，GSK抑制剂的浓度范围为约1mM至约10mM。在一些实施方案中，ROCK抑制剂是Y-27632、其衍生物或其变体。在一些情况下，ROCK抑制剂的浓度范围为约1pM至约20pM。在一些实施方案中，ALK抑制剂是SB-431542、其衍生物或其变体。在一些情况下，ALK抑制剂的浓度范围为约0.5pM至约10pM。
在一些实施方案中，第一培养基包含2pM至约10pM的CHIR-99021。在一些实施方案中，第二培养基包含50ng/ml VEGF和10ng/ml bFGF。在其他实施方案中，第二培养基还包含Y-27632和SB-431542。在各种实施方案中，第三培养基包含10pM Y-27632和1pM SB-431542。在某些实施方案中，第三培养基还包含VEGF和bFGF。在特定情况下，第一培养基和/或第二培养基不含胰岛素。
本文提供的细胞可以在表面诸如合成表面上培养，以支持和/或促进低免疫原性多能细胞分化成心脏细胞。在一些实施方案中，所述表面包含聚合物材料，包括但不限于所选的一种或多种丙烯酸酯单体的均聚物或共聚物。丙烯酸酯单体和甲基丙烯酸酯单体的非限制性实例包括四(乙二醇)二丙烯酸酯、二甲基丙烯酸甘油酯、二甲基丙烯酸1,4-丁二醇、聚(乙二醇)二丙烯酸酯、二(乙二醇)二甲基丙烯酸酯、四(乙二醇)二甲基丙烯酸酯、1,6-己二醇丙氧基化物二丙烯酸酯、新戊二醇二丙烯酸酯、三羟甲基丙烷苯甲酸酯二丙烯酸酯、三羟甲基丙烷乙氧基化物(1EO/QH)甲基、三环[5.2.1.02,6]癸烷二甲醇二丙烯酸酯、新戊二醇乙氧基化物二丙烯酸酯和三羟甲基丙烷三丙烯酸酯。丙烯酸酯按照本领域已知的方式合成或从商业供应商获得，诸如Polysciences,Inc.、Sigma Aldrich,Inc.和Sartomer,Inc。
在一些实施方案中，内皮细胞可以接种到聚合物基质上。在一些情况下，聚合物基质是可生物降解的。合适的可生物降解的基质是本领域众所周知的并且包括胶原-GAG、胶原、纤维蛋白、PLA、PGA和PLA/PGA共聚物。额外的可生物降解的材料包括聚(酸酐)、聚(羟基酸)、聚(原酸酯)、聚(富马酸丙酯)、聚(己内酯)、聚酰胺、聚氨基酸、聚缩醛、可生物降解的聚氰基丙烯酸酯、可生物降解的聚氨酯和多糖。
也可以使用不可生物降解的聚合物。其他不可生物降解但生物相容的聚合物包括聚吡咯、聚苯胺、聚噻吩、聚苯乙烯、聚酯、不可生物降解的聚氨酯、聚脲、聚(乙烯乙酸乙烯酯)、聚丙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯、聚碳酸酯和聚(环氧乙烷)。聚合物基质可以形成为任何形状，例如颗粒、海绵、管、球、线、卷绕线、毛细管网络、膜、纤维、网或片。聚合物基质可被修饰以包含天然或合成的细胞外基质材料和因子。
聚合物材料可以分散在支撑材料的表面上。适用于培养细胞的有用的支撑材料包括陶瓷物质、玻璃、塑料、聚合物或共聚物、其任何组合、或一种材料在另一种材料上的涂层。在一些情况下，玻璃包括钠钙玻璃、耐热玻璃、高硅氧玻璃、石英玻璃、硅或这些玻璃的衍生物等。
在一些情况下，包括树枝状聚合物的塑料或聚合物包括聚(氯乙烯)、聚(乙烯醇)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(乙酸乙烯酯-马来酸酐)、聚(二甲基硅氧烷)单甲基丙烯酸酯、环烯烃聚合物、氟碳聚合物、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯亚胺或这些的衍生物等。在一些情况下，共聚物包括聚(乙酸乙烯酯-共-马来酸酐)、聚(苯乙烯-共-马来酸酐)、聚(乙烯-共-丙烯酸)或这些的衍生物等。
在一些实施方案中，低免疫原性内皮细胞群与非内皮细胞分离。在一些实施方案中，在施用之前扩增分离的低免疫原性内皮细胞群。在某些实施方案中，在施用之前扩增分离的低免疫原性内皮细胞群并将其冷冻保存。
用于本文提供的方法中的内皮细胞的额外描述可见于WO2020/018615，其公开内容通过引用整体并入本文。
9.甲状腺细胞
在一些实施方案中，低免疫原性多能细胞分化成甲状腺祖细胞和甲状腺滤泡类器官，它们可以分泌甲状腺激素以解决自身免疫性甲状腺炎。分化甲状腺细胞的技术是本领域已知的。参见例如Kurmann等人,Cell Stem Cell,2015年11月5日；17(5):527-42，其通过引用整体并入本文，特别是用于从人多能干细胞产生甲状腺细胞以及用于移植技术的方法和试剂。可以如本领域已知的那样，通常通过评价甲状腺细胞相关或特异性标志物的存在或通过在功能上测量来测定分化。
10.肝细胞
在一些实施方案中，低免疫原性移动性多能干(HIP)细胞分化成肝细胞以解决肝细胞功能丧失或肝硬化。有许多技术可以用于使HIP细胞分化为肝细胞；参见例如Pettinato等人,doi:10.1038/spre32888、Snykers等人,Methods Mol Biol,2011 698:305-314、Si-Tayeb等人,Hepatology,2010,51:297-305和Asgari等人,Stem Cell Rev,2013,9(4):493-504，所有这些文献都通过引用整体并入本文，特别是用于分化的方法和试剂。可以如本领域已知的那样，通常通过评价肝细胞相关和/或特异性标志物的存在来测定分化，所述标志物包括但不限于白蛋白、甲胎蛋白和纤维蛋白原。还可以在功能上(诸如氨的代谢、LDL储存和摄取、ICG摄取和释放以及糖原储存)测量分化。
11.胰岛细胞
在一些实施方案中，胰岛细胞(也称为胰腺β细胞)来源于本文所述的低免疫原性诱导性多能干(HIP)细胞。在一些情况下，将分化成各种胰岛细胞类型的低免疫原性多能细胞移植或植入到受试者(例如，接受者)中。如本领域技术人员将理解的，用于分化的方法取决于使用已知技术的所需细胞类型。示例性胰岛细胞类型包括但不限于胰岛祖细胞、未成熟胰岛细胞、成熟胰岛细胞等。在一些实施方案中，将本文所述的胰腺细胞施用于受试者以治疗糖尿病。
在一些实施方案中，胰岛细胞来源于本文所述的低免疫原性多能细胞。用于将多能干细胞分化为胰岛细胞的有用方法描述于例如US9,683,215；US9,157,062；和US8,927,280。
在一些实施方案中，通过如本文所公开的方法产生的胰岛细胞分泌胰岛素。在一些实施方案中，胰岛细胞表现出内源胰岛细胞的至少两个特征，例如但不限于响应于葡萄糖而分泌胰岛素和β细胞标志物的表达。
示例性β细胞标志物或β细胞祖细胞标志物包括但不限于c肽、Pdxl、葡萄糖转运蛋白2(Glut2)、HNF6、VEGF、葡萄糖激酶(GCK)、激素原转换酶(PC 1/3)、Cdcpl、NeuroD、Ngn3、Nkx2.2、Nkx6.l、Nkx6.2、Pax4、Pax6、Ptfla、Isll、Sox9、Soxl7和FoxA2。
在一些实施方案中，分离的胰岛细胞响应于葡萄糖的增加而产生胰岛素。在各种实施方案中，分离的胰岛细胞响应于葡萄糖的增加而分泌胰岛素。在一些实施方案中，细胞具有独特的形态，诸如鹅卵石细胞形态和/或约17pm至约25pm的直径。
在一些实施方案中，低免疫原性多能细胞分化成β样细胞或胰岛类器官以用于移植以解决I型糖尿病(T1DM)。细胞系统是解决T1DM的有前景的方法，参见例如Ellis等人,Nat Rev Gastroenterol Hepatol.2017年10月；14(10):612-628，其通过引用并入本文。此外，Pagliuca等人(Cell,2014,159(2):428-39)关于从人iPSC中成功分化β细胞的报告，其内容通过引用整体并入本文，特别是其中概述的用于从人多能干细胞大规模产生功能性人β细胞的方法和试剂)。此外，Vegas等人显示了从人多能干细胞产生人β细胞，然后进行封装以避免宿主的免疫排斥；Vegas等人,Nat Med,2016,22(3):306-11，其通过引用整体并入本文，特别是其中概述的用于从人多能干细胞大规模产生功能性人β细胞的方法和试剂。
在一些实施方案中，通过体外分化从低免疫原性诱导性多能干(HIP)细胞群产生低免疫原性胰岛细胞群的方法包括：(a)在包含选自由以下组成的组的一种或多种因子的第一培养基中培养HIP细胞群：胰岛素样生长因子、转化生长因子、FGF、EGF、HGF、SHH、VEGF、转化生长因子-b超家族、BMP2、BMP7、GSK抑制剂、ALK抑制剂、BMP 1型受体抑制剂和视黄酸，以产生未成熟的胰岛细胞群；以及(b)在与第一培养基不同的第二培养基中培养未成熟的胰岛细胞群，以产生低免疫胰岛细胞群。在一些实施方案中，GSK抑制剂是CHIR-99021、其衍生物或其变体。在一些情况下，GSK抑制剂的浓度范围为约2mM至约10mM。在一些实施方案中，ALK抑制剂是SB-431542、其衍生物或其变体。在一些情况下，ALK抑制剂的浓度范围为约1pM至约10pM。在一些实施方案中，第一培养基和/或第二培养基不含动物血清。
在一些实施方案中，低免疫原性胰岛细胞群与非胰岛细胞分离。在一些实施方案中，在施用之前扩增分离的低免疫原性胰岛细胞群。在某些实施方案中，在施用之前扩增分离的低免疫原性胰岛细胞群并将其冷冻保存。
如本领域已知的那样，通常通过评价β细胞相关或特异性标志物(包括但不限于胰岛素)的存在来测定分化。也可以在功能上测量分化，诸如测量葡萄糖代谢，一般参见Muraro等人,Cell Syst.2016年10月26日；3(4):385–394.e3，其特此通过引用整体并入，特别是其中概述的生物标志物。一旦生成β细胞，就可以将其移植(作为细胞悬浮液或在如本文所讨论的凝胶基质内)到门静脉/肝脏、网膜、胃肠粘膜、骨髓、肌肉或皮下囊中。
用于本公开的包括多巴胺能神经元的胰岛细胞的额外描述可见于WO2020/018615，其公开内容通过引用整体并入本文。
12.视网膜色素上皮(RPE)细胞
本文提供了来源于所描述的低免疫原性诱导性多能干(HIP)细胞的视网膜色素上皮(RPE)细胞。例如，可通过分化人HIP细胞来产生人RPE细胞。在一些实施方案中，将分化成各种RPE细胞类型的低免疫原性多能细胞移植或植入到受试者(例如，接受者)中。如本领域技术人员将理解的，用于分化的方法取决于使用已知技术的所需细胞类型。
术语“RPE”细胞是指具有与天然RPE细胞相似或基本相似的基因表达谱的色素视网膜上皮细胞。当在平面基底上生长至汇合时，来源于多能干细胞的此类RPE细胞可具有天然RPE细胞的多边形、平面片状形态。
可将RPE细胞植入患有黄斑变性的患者或具有受损RPE细胞的患者体内。在一些实施方案中，患者患有年龄相关性黄斑变性(AMD)、早期AMD、中期AMD、晚期AMD、非新生血管性年龄相关性黄斑变性、干性黄斑变性(干性年龄相关性黄斑变性)、湿性黄斑变性(湿性年龄相关性黄斑变性)、青少年黄斑变性(JMD)(例如，斯塔加特病(Stargardt disease)、贝斯特病(Best disease)和青少年视网膜劈裂)、莱伯氏先天性黑蒙(Leber's CongenitalAmeurosis)或色素性视网膜炎。在其他实施方案中，患者患有视网膜脱离。
示例性RPE细胞类型包括但不限于视网膜色素上皮(RPE)细胞、RPE祖细胞、未成熟RPE细胞、成熟RPE细胞、功能性RPE细胞等。
用于将多能干细胞分化成RPE细胞的有用方法描述于例如US9,458,428和US9,850,463中，其公开内容通过引用整体并入本文，包括说明书。用于从人诱导性多能干细胞产生RPE细胞的额外方法可见于例如Lamba等人,PNAS,2006,103(34):12769-12774；Mellough等人,Stem Cells,2012,30(4):673-686；Idelson等人,Cell Stem Cell,2009,5(4):396-408；Rowland等人,Journal of Cellular Physiology,2012,227(2):457-466、Buchholz等人,Stem Cells Trans Med,2013,2(5):384-393和da Cruz等人,Nat Biotech,2018,36:328-337。
已经使用Kamao等人,Stem Cell Reports 2014:2:205-18(其特此通过引用整体并入，特别是其中概述的用于分化技术和试剂的方法和试剂)中概述的技术使人多能干细胞分化成RPE细胞；还可参见Mandai等人,N Engl J Med,2017,376:1038-1046，其内容对于用于产生RPE细胞片和移植到患者体内的技术整体并入。可以如本领域已知的那样，通常通过评价RPE相关和/或特异性标志物的存在或通过在功能上测量来测定分化。参见例如Kamao等人,Stem Cell Reports,2014,2(2):205-18，其内容通过引用整体并入本文，特别是结果部分的第一段中概述的标志物。
在一些实施方案中，通过体外分化从低免疫原性多能细胞群产生低免疫原性视网膜色素上皮(RPE)细胞群的方法包括：(a)在包含选自由以下组成的组的任一种因子的第一培养基中培养低免疫原性多能细胞群：活化素A、bFGF、BMP4/7、DKK1、IGF1、noggin、BMP抑制剂、ALK抑制剂、ROCK抑制剂和VEGFR抑制剂，以产生前RPE细胞群；以及(b)在与第一培养基不同的第二培养基中培养前RPE细胞群，以产生低免疫原性RPE细胞群。在一些实施方案中，ALK抑制剂是SB-431542、其衍生物或其变体。在一些情况下，ALK抑制剂的浓度范围为约2mM至约10pM。在一些实施方案中，ROCK抑制剂是Y-27632、其衍生物或其变体。在一些情况下，ROCK抑制剂的浓度范围为约1pM至约10pM。在一些实施方案中，第一培养基和/或第二培养基不含动物血清。
可以如本领域已知的那样，通常通过评价RPE相关和/或特异性标志物的存在或通过在功能上测量来测定分化。参见例如Kamao等人,Stem Cell Reports,2014,2(2):205-18，其内容通过引用整体并入本文，特别是结果部分。
用于本公开的RPE细胞的额外描述可见于WO2020/018615，其公开内容通过引用整体并入本文。
对于治疗应用，根据所公开的方法制备的细胞通常可以以包含等渗赋形剂的药物组合物的形式提供，并且在对人体施用足够无菌的条件下制备。对于细胞组合物的药物制剂的一般原则，参见"Cell Therapy:Stem Cell Transplantation,Gene Therapy,andCellular Immunotherapy,"Morstyn和Sheridan编辑,Cambridge University Press,1996；和"Hematopoietic Stem Cell Therapy,"E.D.Ball、J.Lister和P.Law,ChurchillLivingstone,2000。可以将细胞包装在适合分配或临床使用的装置或容器中。
13.T淋巴细胞
本文提供的T淋巴细胞(T细胞)来源于所描述的低免疫原性诱导性多能干(HIP)细胞。用于从多能干细胞(例如，iPSC)生成T细胞(包括CAR-T细胞)的方法在例如Iriguchi等人,Nature Communications 12,430(2021)；Themeli等人,Cell Stem Cell,16(4):357-366(2015)；Themeli等人,Nature Biotechnology 31:928-933(2013)中描述。
在一些实施方案中，低免疫原性诱导性多能干细胞衍生的T细胞包括嵌合抗原受体(CAR)。任何合适的CAR都可以包括在低免疫原性诱导性多能干细胞衍生的T细胞中，包括本文所述的CAR。在一些实施方案中，低免疫原性诱导性多能干细胞衍生的T细胞包括编码CAR的多核苷酸，其中将所述多核苷酸插入到基因组基因座中。在一些实施方案中，将多核苷酸插入到安全港或靶标基因座中。在一些实施方案中，将多核苷酸插入到B2M、CIITA、TRAC、TRB、PD-1或CTLA-4基因中。可以使用任何合适的方法将CAR插入到低免疫原性细胞的基因组基因座中，所述方法包括本文所述的基因编辑方法(例如，CRISPR/Cas系统)。
本文提供的HIP衍生的T细胞可用于治疗合适的癌症，包括但不限于B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、肝癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌、肺癌、非小细胞肺癌、急性髓性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、胃癌、胃腺癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、肺鳞状细胞癌、肝细胞癌和膀胱癌。
U.遗传修饰方法
在一些实施方案中，本文的载体是能够转移或转运另一核酸分子(包括转移或转运到细胞或细胞基因组中)的核酸分子。转移的核酸通常与载体核酸分子连接，例如插入载体核酸分子中。载体可包括在细胞中指导自主复制的序列，或者可包括足以允许整合到宿主细胞DNA中的序列。有用的载体包括例如质粒(例如，DNA质粒或RNA质粒)、转座子、粘粒、细菌人工染色体和病毒载体。有用的病毒载体包括例如复制缺陷逆转录病毒和慢病毒。非病毒载体可能需要递送媒介物以促进核酸分子进入到细胞中。
病毒载体可包含核酸分子，其包括病毒衍生的核酸元件，所述核酸元件通常促进核酸分子转移或整合到细胞基因组中或者转移或整合到介导核酸转移的病毒颗粒中。病毒颗粒通常将包括各种病毒组分，并且有时除了核酸外还包括宿主细胞组分。病毒载体可以包含例如能够将核酸转移到细胞中或转移到被转移的核酸中的病毒或病毒颗粒(例如，作为裸DNA)。病毒载体和转移质粒可以包含主要来源于病毒的结构和/或功能遗传元件。逆转录病毒载体可包含病毒载体或质粒，其含有主要来源于逆转录病毒的结构和功能遗传元件或其部分。
在本文所述的一些载体中，与对应的野生型病毒相比，有助于复制或复制所必需的一个或多个蛋白质编码区的至少一部分可能不存在。这使得病毒载体复制有缺陷。在一些实施方案中，载体能够转导靶非分裂宿主细胞和/或将其基因组整合到宿主基因组中。
在一些实施方案中，逆转录病毒核酸包含以下中的一种或多种(例如，全部)：5'启动子(例如，用于控制整个包装的RNA的表达)、5'LTR(例如，其包括R(聚腺苷酸化尾信号)和/或包括引物活化信号的U5)、引物结合位点、psi包装信号、用于核输出的RRE元件、直接位于转基因上游以控制转基因表达的启动子、转基因(或其他外源药剂元件)、多嘌呤区和3'LTR(例如，其包括突变的U3、R和U5)。在一些实施方案中，逆转录病毒核酸还包含cPPT、WPRE和/或绝缘子元件中的一种或多种。
逆转录病毒通常通过将其基因组RNA逆转录成线性双链DNA拷贝并随后将其基因组DNA共价整合到宿主基因组中来复制。野生型逆转录病毒基因组的结构通常包含5'长末端重复序列(LTR)和3'LTR，在它们之间或之内有能够使基因组被包装的包装信号、引物结合位点、实现整合到宿主细胞基因组中的整合位点以及编码促进病毒颗粒组装的包装组分的gag、pol和env基因。更复杂的逆转录病毒具有额外的特征，诸如HIV中的rev和RRE序列，其使得整合的原病毒的RNA转录物能够从感染靶细胞的细胞核有效输出到细胞质。在原病毒中，病毒基因在两个末端侧接称为长末端重复序列(LTR)的区域。LTR参与原病毒整合和转录。LTR也充当增强子-启动子序列，并且可以控制病毒基因的表达。逆转录病毒RNA的衣壳化是通过位于病毒基因组的5’端的psi序列发生的。
LTR本身通常是相似的(例如相同的)序列，其可以分成三个元件，称为U3、R和U5。U3来源于对RNA的3'末端独特的序列。R来源于在RNA两端重复的序列，并且U5来源于对RNA的5'末端独特的序列。这三种元件的尺寸在不同的逆转录病毒中可以有相当大的变化。
对于病毒基因组，转录起始位点通常在一个LTR中的U3与R之间的边界处，而聚(A)添加(终止)位点在另一个LTR中的R与U5之间的边界处。U3含有原病毒的大部分转录控制元件，其包括对细胞和在一些情况下病毒转录活化因子蛋白作出反应的启动子和多个增强子序列。一些逆转录病毒包含编码参与调控基因表达的蛋白质的以下基因中的任何一种或多种：tot、rev、tax和rex。
关于结构基因gag、pol和env本身，gag编码病毒的内部结构蛋白。Gag蛋白被蛋白水解加工为成熟蛋白MA(基质)、CA(衣壳)和NC(核衣壳)。pol基因编码逆转录酶(RT)，它含有介导基因组复制的DNA聚合酶、相关RNA酶H和整合酶(IN)。env基因编码病毒体的表面(SU)糖蛋白和跨膜(TM)蛋白，它们形成与细胞受体蛋白特异性相互作用的复合物。这种相互作用例如通过使过病毒膜与细胞膜融合来促进感染。
在复制缺陷逆转录病毒载体基因组中，gag、pol和env可以不存在或没有功能。RNA两个末端的R区通常是重复序列。U5和U3分别代表RNA基因组的5'和3'末端的独特序列。逆转录病毒还可以含有编码除gag、pol和env以外的蛋白质的额外基因。额外基因的实例包括(在HIV中)vif、vpr、vpx、vpu、tat、rev和nef中的一种或多种。EIAV具有(尤其)额外基因S2。
适用于特定的实施方案的说明性逆转录病毒包括但不限于：莫洛尼鼠白血病病毒(M-MuLV)、莫洛尼鼠肉瘤病毒(MoMSV)、哈维鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猫白血病病毒(FLV)、泡沫病毒(spumavirus)、弗瑞德鼠(Friend murine)白血病病毒、鼠干细胞病毒(MSCV)和劳斯肉瘤病毒(RSV))和慢病毒。
在一些实施方案中，逆转录病毒是γ逆转录病毒。在一些实施方案中，逆转录病毒是ε逆转录病毒。在一些实施方案中，逆转录病毒是α逆转录病毒。在一些实施方案中，逆转录病毒是β逆转录病毒。在一些实施方案中，逆转录病毒是δ逆转录病毒。在一些实施方案中，逆转录病毒是泡沫逆转录病毒。在一些实施方案中，逆转录病毒是内源性逆转录病毒。在一些实施方案中，逆转录病毒是慢病毒。
在一些实施方案中，逆转录病毒或慢病毒载体还包含一个或多个绝缘子元件，例如本文所述的绝缘子元件。在各种实施方案中，载体包含与编码外源性剂的多核苷酸可操作地连接的启动子。载体可以具有一个或多个LTR，其中任一个LTR包含一个或多个修饰，诸如一个或多个核苷酸取代、添加或缺失。载体还可包含一个或多个增加转导效率的辅助元件(例如，cPPT/FLAP)、病毒包装(例如，Psi(Y)包装信号，RRE)和/或增加外源基因表达的其他元件(例如，聚(A)序列)，并且可任选地包含WPRE或HPRE。在一些实施方案中，慢病毒核酸例如从5'至3'包含以下中的一种或多种(例如全部)：启动子(例如CMV)、R序列(例如包含TAR)、U5序列(例如用于整合)、PBS序列(例如用于逆转录)、DIS序列(例如用于基因组二聚化)、psi包装信号、部分gag序列、RRE序列(例如用于核输出)、cPPT序列(例如用于核输入)、驱动外源药剂表达的启动子、编码外源药剂的基因、WPRE序列(例如，用于有效的转基因表达)、PPT序列(例如，用于逆转录)、R序列(例如，用于聚腺苷酸化和终止)和U5信号(例如，用于整合)。
说明性慢病毒包括但不限于：HIV(人免疫缺陷病毒；包括HIV 1型和HIV 2型)；维士那-梅地病毒(VMV)病毒；山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)；马传染性贫血病毒(EIAV)；猫免疫缺陷病毒(FIV)；牛免疫缺陷病毒(BIV)；和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。在一些实施方案中，使用基于HIV的载体主链(即，HIV顺式作用序列元件)。慢病毒载体可包含含有结构和功能遗传元件或其部分的病毒载体或质粒，包括主要来源于慢病毒的LTR。
在实施方案中，慢病毒载体(例如，慢病毒表达载体)可包含慢病毒转移质粒(例如，作为裸DNA)或感染性慢病毒颗粒。关于诸如克隆位点、启动子、调控元件、异源核酸等的元件，应当理解这些元件的序列可以在慢病毒颗粒中以RNA形式存在，并且可以在DNA质粒中以DNA形式存在。
在实施方案中，慢病毒载体是具有足够的逆转录病毒遗传信息以允许在包装组分的存在下将RNA基因组包装到能够感染靶细胞的病毒颗粒中的载体。靶细胞的感染可以包括逆转录和整合到靶细胞基因组中。RLV通常携带非病毒编码序列，所述序列将由载体递送至靶细胞。在实施方案中，RLV不能在靶细胞内独立复制产生感染性逆转录病毒颗粒。通常，RLV缺乏功能性gag-pol和/或env基因和/或参与复制的其他基因。载体可以被配置为分裂内含子载体，例如，如PCT专利申请WO 99/15683中所述，所述申请通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，慢病毒载体包含最小的病毒基因组，例如，病毒载体已被操纵以去除非必需元件并保留必需元件，以便提供感染、转导和递送感兴趣的核苷酸序列至靶宿主细胞所需的功能，例如，如WO 98/17815中所述，所述专利通过引用整体并入本文。
最小慢病毒基因组可包含例如(5')R-U5-一个或多个第一核苷酸序列-U3-R(3')。然而，用于在源细胞中产生慢病毒基因组的质粒载体也可以包括可操作地连接至慢病毒基因组上以指导基因组在源细胞中的转录的转录调控控制序列。这些调控序列可包含与转录的逆转录病毒序列缔合的天然序列，例如5'U3区，或者它们可包含异源启动子，诸如另一种病毒启动子，例如CMV启动子。一些慢病毒基因组包含促进有效病毒产生的额外序列。例如，在HIV的情况下，可包括rev和RRE序列。
在一些实施方案中，将罕见切割核酸内切酶以编码罕见切割核酸内切酶的核酸的形式引入到含有靶多核苷酸序列的细胞中。将核酸引入细胞中的过程可以通过任何合适的技术来实现。合适的技术包括磷酸钙或脂质介导的转染、电穿孔和使用病毒载体进行的转导或感染。在一些实施方案中，核酸包含DNA。在一些实施方案中，核酸包含如本文所述的修饰的DNA。在一些实施方案中，核酸包含mRNA。在一些实施方案中，核酸包含如本文所述的修饰的mRNA(例如，合成的修饰mRNA)。
本公开考虑以本领域技术人员可用的任何方式利用本公开的基因编辑系统(例如CRISPR/Cas)来改变靶多核苷酸序列。可使用能够改变细胞中的靶多核苷酸序列的任何CRISPR/Cas系统。此类CRISPR-Cas系统可采用多种Cas蛋白(Haft等人,PLoS ComputBiol.2005；1(6)e60)。此类Cas蛋白的允许CRISPR/Cas系统改变细胞中的靶多核苷酸序列的分子机制包括RNA结合蛋白、核酸内切酶和外切酶、解旋酶和聚合酶。在一些实施方案中，CRISPR/Cas系统是I型CRISPR系统。在一些实施方案中，CRISPR/Cas系统是II型CRISPR系统。在一些实施方案中，CRISPR/Cas系统是V型CRISPR系统。
本公开的CRISPR/Cas系统可用于改变细胞中的任何靶多核苷酸序列。本领域技术人员将容易理解，在任何特定细胞中待改变的期望的靶多核苷酸序列可以对应于基因组序列的表达与病症相关或以其他方式促进病原体进入细胞的任何基因组序列。例如，在细胞中改变的期望的靶多核苷酸序列可以是对应于含有疾病相关单多核苷酸多态性的基因组序列的多核苷酸序列。在此类实例中，本公开的CRISPR/Cas系统可用于通过用野生型等位基因替换细胞中的疾病相关SNP来校正所述疾病相关SNP。作为另一个实例，负责使病原体进入或增殖到细胞中的靶基因的多核苷酸序列可能是合适的靶标，所述靶标用于缺失或插入以破坏靶基因的功能，从而防止病原体进入细胞或在细胞内增殖。
在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是基因组序列。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是人基因组序列。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是哺乳动物基因组序列。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是脊椎动物基因组序列。
在一些实施方案中，本公开的CRISPR/Cas系统包括Cas蛋白和能够将Cas蛋白引导至靶多核苷酸序列的靶基序并与其杂交的至少一种至两种核糖核酸。如本文所用，“蛋白质”和“多肽”可互换使用以指代通过肽键连接的一系列氨基酸残基(即，氨基酸的聚合物)，并且包括修饰的氨基酸(例如，磷酸化、糖化、糖基化等)和氨基酸类似物。示例性多肽或蛋白质包括基因产物、天然存在的蛋白质、上述项的同源物、旁系同源物、片段以及其他等效物、变体和类似物。
在一些实施方案中，Cas蛋白包含一个或多个氨基酸取代或修饰。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸取代包括保守氨基酸取代。在一些情况下，取代和/或修饰可以防止或减少蛋白水解降解和/或延长多肽在细胞中的半衰期。在一些实施方案中，Cas蛋白可以包含肽键替换(例如，脲、硫脲、氨基甲酸酯、磺酰脲等)。在一些实施方案中，Cas蛋白可以包含天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，Cas蛋白可以包含替代氨基酸(例如，D-氨基酸、β-氨基酸、同型半胱氨酸、磷酸丝氨酸等)。在一些实施方案中，Cas蛋白可以包含修饰以包含部分(例如，聚乙二醇化、糖基化、脂化、乙酰化、封端等)。
在一些实施方案中，Cas蛋白包含核心Cas蛋白、其同种型或具有任何Cas蛋白或其同种型的类似功能或活性的任何Cas样蛋白。在一些实施方案中，Cas蛋白包含核心Cas蛋白。示例性Cas核心蛋白包括但不限于Cas1、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8和Cas9。在一些实施方案中，Cas蛋白包含V型Cas蛋白。在一些实施方案中，Cas蛋白包含大肠杆菌(E.coli)亚型的Cas蛋白(也称为CASS2)。大肠杆菌亚型的示例性Cas蛋白包括但不限于Cse1、Cse2、Cse3、Cse4和Cas5e。在一些实施方案中，Cas蛋白包含Ypest亚型的Cas蛋白(也称为CASS3)。Ypest亚型的示例性Cas蛋白包括但不限于Csy1、Csy2、Csy3和Csy4。在一些实施方案中，Cas蛋白包含Nmeni亚型的Cas蛋白(也称为CASS4)。Nmeni亚型的示例性Cas蛋白包括但不限于Csn1和Csn2。在一些实施方案中，Cas蛋白包含Dvulg亚型的Cas蛋白(也称为CASS1)。Dvulg亚型的示例性Cas蛋白包括Csd1、Csd2和Cas5d。在一些实施方案中，Cas蛋白包含Tneap亚型的Cas蛋白(也称为CASS7)。Tneap亚型的示例性Cas蛋白包括但不限于Cst1、Cst2、Cas5t。在一些实施方案中，Cas蛋白包含Hmari亚型的Cas蛋白。Hmari亚型的示例性Cas蛋白包括但不限于Csh1、Csh2和Cas5h。在一些实施方案中，Cas蛋白包含Apern亚型的Cas蛋白(也称为CASS5)。Apern亚型的示例性Cas蛋白包括但不限于Csa1、Csa2、Csa3、Csa4、Csa5和Cas5a。在一些实施方案中，Cas蛋白包含Mtube亚型的Cas蛋白(也称为CASS6)。Mtube亚型的示例性Cas蛋白包括但不限于Csm1、Csm2、Csm3、Csm4和Csm5。在一些实施方案中，Cas蛋白包括RAMP模块Cas蛋白。示例性RAMP模块Cas蛋白包括但不限于Cmr1、Cmr2、Cmr3、Cmr4、Cmr5和Cmr6。参见，例如，Klompe等人,Nature 571,219–225(2019)；Strecker等人,Science 365,48–53(2019)。Cas蛋白的实例包括但不限于：Cas3、Cas8a、Cas5、Cas8b、Cas8c、Cas10d、Cse1、Cse2、Csy1、Csy2、Csy3和/或GSU0054。在一些实施方案中，Cas蛋白包括Cas3、Cas8a、Cas5、Cas8b、Cas8c、Cas10d、Cse1、Cse2、Csy1、Csy2、Csy3和/或GSU0054。Cas蛋白的实例包括但不限于：Cas9、Csn2和/或Cas4。在一些实施方案中，Cas蛋白包括Cas9、Csn2和/或Cas4。在一些实施方案中，Cas蛋白的实例包括但不限于：Cas10、Csm2、Cmr5、Cas10、Csx11和/或Csx10。在一些实施方案中，Cas蛋白包括Cas10、Csm2、Cmr5、Cas10、Csx11和/或Csx10。在一些实施方案中，Cas蛋白的实例包括但不限于：Csf1。在一些实施方案中，Cas蛋白包括Csf1。在一些实施方案中，Cas蛋白的实例包括但不限于：Cas12a、Cas12b、Cas12c、C2c4、C2c8、C2c5、C2c10和C2c9；以及CasX(Cas12e)和CasY(Cas12d)。另见，例如，Koonin等人,Curr Opin Microbiol.2017；37:67-78:“Diversity,classification andevolution of CRISPR-Cas systems”。在一些实施方案中，Cas蛋白包括Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d、Cas12e、Cas12d和/或Cas12e。在一些实施方案中，Cas蛋白包括在一些实施方案中，Cas蛋白包括Cas13、Cas13a、C2c2、Cas13b、Cas13c和/或Cas13d。
在一些实施方案中，Cas蛋白包括本文所述的Cas蛋白中的任一种或其功能部分。如本文所用，“功能部分”是指肽的一部分，其保留其与至少一种核糖核酸(例如，指导RNA(gRNA))复合并且切割靶多核苷酸序列的能力。在一些实施方案中，功能部分包含可操作地连接的Cas9蛋白功能结构域的组合，所述Cas9蛋白功能结构域选自由DNA结合结构域、至少一个RNA结合结构域、解旋酶结构域和核酸内切酶结构域组成的组。在一些实施方案中，功能部分包含可操作地连接的Cas12a(也称为Cpf1)蛋白功能结构域的组合，所述Cas12a蛋白功能结构域选自由DNA结合结构域、至少一个RNA结合结构域、解旋酶结构域和核酸内切酶结构域组成的组。在一些实施方案中，功能结构域形成复合物。在一些实施方案中，Cas9蛋白的功能部分包含RuvC样结构域的功能部分。在一些实施方案中，Cas9蛋白的功能部分包含HNH核酸酶结构域的功能部分。在一些实施方案中，Cas12a蛋白的功能部分包含RuvC样结构域的功能部分。
在一些实施方案中，可以将外源Cas蛋白以多肽形式引入到细胞中。在某些实施方案中，可以将Cas蛋白缀合或融合至细胞穿透多肽或细胞穿透肽。如本文所用，“细胞穿透多肽”和“细胞穿透肽”分别指代促进分子摄取到细胞中的多肽或肽。细胞穿透多肽可以含有可检测标记。
在某些实施方案中，可以将Cas蛋白缀合或融合至带电蛋白(例如，其携带正电荷、负电荷或整体中性电荷)。此类连接可以是共价的。在一些实施方案中，可以将Cas蛋白融合至超正电荷GFP以显著增加Cas蛋白穿透细胞的能力(Cronican等人ACS Chem Biol.2010；5(8):747-52)。在某些实施方案中，可以将Cas蛋白融合至蛋白转导结构域(PTD)以促进其进入细胞。示例性PTD包括Tat、寡精氨酸和穿透肽。在一些实施方案中，Cas9蛋白包含融合至细胞穿透肽的Cas9多肽。在一些实施方案中，Cas9蛋白包含融合至PTD的Cas9多肽。在一些实施方案中，Cas9蛋白包含融合至tat结构域的Cas9多肽。在一些实施方案中，Cas9蛋白包含融合至寡精氨酸结构域的Cas9多肽。在一些实施方案中，Cas9蛋白包含融合至穿透肽结构域的Cas9多肽。在一些实施方案中，Cas9蛋白包含融合至超正电荷GFP的Cas9多肽。在一些实施方案中，Cas12a蛋白包含融合至细胞穿透肽的Cas12a多肽。在一些实施方案中，Cas12a蛋白包含融合至PTD的Cas12a多肽。在一些实施方案中，Cas12a蛋白包含融合至tat结构域的Cas12a多肽。在一些实施方案中，Cas12a蛋白包含融合至寡精氨酸结构域的Cas12a多肽。在一些实施方案中，Cas12a蛋白包含融合至穿透肽结构域的Cas12a多肽。在一些实施方案中，Cas12a蛋白包含融合至超正电荷GFP的Cas12a多肽。
在一些实施方案中，可以将Cas蛋白以编码Cas蛋白的核酸的形式引入含有靶多核苷酸序列的细胞中。将核酸引入细胞中的过程可以通过任何合适的技术来实现。合适的技术包括磷酸钙或脂质介导的转染、电穿孔和使用病毒载体进行的转导或感染。在一些实施方案中，核酸包含DNA。在一些实施方案中，核酸包含如本文所述的修饰的DNA。在一些实施方案中，核酸包含mRNA。在一些实施方案中，核酸包含如本文所述的修饰的mRNA(例如，合成的修饰mRNA)。
在一些实施方案中，Cas蛋白与一种至两种核糖核酸复合。在一些实施方案中，Cas蛋白与两种核糖核酸复合。在一些实施方案中，Cas蛋白与一种核糖核酸复合。在一些实施方案中，Cas蛋白由如本文所述的修饰的核酸(例如，合成的修饰mRNA)编码。
本公开的方法考虑使用能够将Cas蛋白引导至靶多核苷酸序列的靶基序并与其杂交的任何核糖核酸。在一些实施方案中，至少一种核糖核酸包含tracrRNA。在一些实施方案中，至少一种核糖核酸包含CRISPR RNA(crRNA)。在一些实施方案中，单个核糖核酸包含将Cas蛋白引导到细胞中的靶多核苷酸序列的靶基序并与其杂交的指导RNA。在一些实施方案中，至少一种核糖核酸包含将Cas蛋白引导到细胞中的靶多核苷酸序列的靶基序并与其杂交的指导RNA。在一些实施方案中，一种至两种核糖核酸均包含将Cas蛋白引导至细胞中的靶多核苷酸序列的靶基序并与其杂交的指导RNA。如本领域技术人员将理解的，可以选择本公开的核糖核酸与多种不同的靶基序杂交，这取决于采用的特定CRISPR/Cas系统和靶多核苷酸的序列。还可以选择一种至两种核糖核酸以最大程度的减少与除靶多核苷酸序列之外的核酸序列的杂交。在一些实施方案中，当与细胞中的所有其他基因组核苷酸序列相比时，一种至两种核糖核酸与含有至少两个错配的靶基序杂交。在一些实施方案中，当与细胞中的所有其他基因组核苷酸序列相比时，一种至两种核糖核酸与含有至少一个错配的靶基序杂交。在一些实施方案中，一种至两种核糖核酸被设计成与紧邻被Cas蛋白识别的脱氧核糖核酸基序的靶基序杂交。在一些实施方案中，一种至两种核糖核酸中的每一个被设计为与紧邻由Cas蛋白识别的脱氧核糖核酸基序的靶基序杂交，所述脱氧核糖核酸基序侧接位于靶基序之间的突变等位基因。
在一些实施方案中，一种至两种核糖核酸中的每一种包含将Cas蛋白引导到细胞中的靶多核苷酸序列的靶基序并与其杂交的指导RNA。
在一些实施方案中，一种或两种核糖核酸(例如，指导RNA)与靶多核苷酸序列的相同链上的序列互补和/或杂交。在一些实施方案中，一种或两种核糖核酸(例如，指导RNA)与靶多核苷酸序列的相反链上的序列互补和/或杂交。在一些实施方案中，一种或两种核糖核酸(例如，指导RNA)不与靶多核苷酸序列的相反链上的序列互补和/或杂交。在一些实施方案中，一种或两种核糖核酸(例如，指导RNA)与靶多核苷酸序列的重叠靶基序互补和/或杂交。在一些实施方案中，一种或两种核糖核酸(例如，指导RNA)与靶多核苷酸序列的偏移靶基序互补和/或杂交。
在一些实施方案中，经由病毒转导(例如，慢病毒转导)将编码Cas蛋白的核酸和编码至少一种至两种核糖核酸的核酸引入细胞中。在一些实施方案中，Cas蛋白与1-2种核糖核酸复合。在一些实施方案中，Cas蛋白与两种核糖核酸复合。在一些实施方案中，Cas蛋白与一种核糖核酸复合。在一些实施方案中，Cas蛋白由如本文所述的修饰的核酸(例如，合成的修饰mRNA)编码。
可用于本文所述的基于CRISPR/Cas的基因靶向的示例性gRNA序列在表19中提供。所述序列可见于2016年5月9日提交的WO2016183041，包括表、附录和序列表的公开内容通过引用整体并入本文。
表19.可用于靶向基因的示例性gRNA序列
可用于本文所述基因的基于CRISPR/Cas的靶向的其他示例性gRNA序列提供于2022年5月20日提交的PCT/US22/30394中，包括表、附录和序列表的公开内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，本技术的细胞使用转录活化因子样效应物核酸酶(TALEN)方法来制备。
“TALE核酸酶”(TALEN)意指由通常来源于转录活化因子样效应物(TALE)的核酸结合结构域和一个核酸酶催化结构域组成的用以切割核酸靶序列的融合蛋白。催化结构域优选地是核酸酶结构域，并且更优选地是具有核酸内切酶活性的结构域，例如I-TevI、ColE7、NucA和Fok-I。在多个实施方案中，可以将TALE结构域融合至大范围核酸酶，例如I-CreI和I-Onul或其功能变体。在更优选的实施方案中，所述核酸酶是单体TALE核酸酶。单体TALE核酸酶是不需要二聚化来进行特异性识别和裂解的TALE核酸酶，诸如在WO2012138927中描述的工程化的TAL重复序列与I-TevI的催化结构域的融合物。转录活化因子样效应物(TALE)是来自细菌物种黄单胞菌属(Xanthomonas)的蛋白质，其包含多个重复序列，每个重复序列包含对核酸靶向序列的每个核苷酸碱基具有特异性的位置12和13中的二残基(RVD)。具有相似模块化逐碱基核酸结合性质(MBBBD)的结合结构域也可以来源于申请人最近在不同细菌物种中发现的新模块化蛋白。新模块化蛋白具有比TAL重复序列显示更多序列可变性的优势。优选地，与识别不同核苷酸相关的RVD是用于识别C的HD；用于识别T的NG；用于识别A的NI；用于识别G或A的NN；用于识别A、C、G或T的NS；用于识别T的HG；用于识别T的IG；用于识别G的NK；用于识别C的HA；用于识别C的ND；用于识别C的HI；用于识别G的HN；用于识别G的NA；用于识别G或A的SN；和用于识别T的YG；用于识别A的TL；用于识别A或G的VT；以及用于识别A的SW。在另一个实施方案中，关键氨基酸12和13可以向其他氨基酸残基突变，以便调节其对核苷酸A、T、C和G的特异性，特别是增强这种特异性。TALEN套件在商业上出售。
在一些实施方案中，使用锌指核酸酶(ZFN)对细胞进行操作。“锌指结合蛋白”是一种由于通过锌离子的配位稳定蛋白质结构而优选地以序列特异性方式结合DNA、RNA和/或蛋白质的蛋白质或多肽。术语锌指结合蛋白通常缩写为锌指蛋白或ZFP。单个DNA结合结构域通常被称为“指”。ZFP具有至少一个指，通常具有两个指、三个指或六个指。每个指结合两个至四个DNA碱基对，通常是三个或四个DNA碱基对。ZFP与被称为靶位点或靶区段的核酸序列结合。每个指通常包含大约30个氨基酸的锌螯合DNA结合亚结构域。研究表明，这类单个锌指由含有与锌配位的两个不变组氨酸残基的α螺旋以及单个β转角的两个半胱氨酸残基组成(参见，例如，Berg&Shi,Science271:1081-1085(1996))。
在一些实施方案中，本公开的细胞使用归巢核酸内切酶来制备。此类归巢核酸内切酶是本领域众所周知的(Stoddard 2005)。归巢核酸内切酶识别DNA靶序列并生成单链或双链断裂。归巢核酸内切酶具有高度特异性，识别长度范围为12个至45个碱基对(bp)、通常长度范围为14bp至40bp的DNA靶位点。根据本技术的归巢核酸内切酶可例如对应于LAGLIDADG核酸内切酶、HNH核酸内切酶或GIY-YIG核酸内切酶。根据本公开的优选归巢核酸内切酶可以是I-CreI变体。
在一些实施方案中，本技术的细胞使用大范围核酸酶来制备。按照定义，大范围核酸酶是识别大序列的序列特异性核酸内切酶(Chevalier,B.S.和B.L.Stoddard,NucleicAcids Res.,2001,29,3757-3774)。它们可以切割活细胞中的独特位点，从而将切割位点附近的基因靶向增强1000倍或更多(Puchta等人,Nucleic Acids Res.,1993,21,5034-5040；Rouet等人,Mol.Cell.Biol.,1994,14,8096-8106；Choulika等人,Mol.Cell.Biol.,1995,15,1968-1973；Puchta等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1996,93,5055-5060；Sargent等人,Mol.Cell.Biol.,1997,17,267-77；Donoho等人,Mol.Cell.Biol,1998,18,4070-4078；Elliott等人,Mol.Cell.Biol.,1998,18,93-101；Cohen-Tannoudji等人,Mol.Cell.Biol.,1998,18,1444-1448)。
在一些实施方案中，使用RNA沉默或RNA干扰(RNAi)敲低(例如，降低、消除或抑制)多肽(诸如致耐受因子)的表达以制备本技术的细胞。可用的RNAi方法包括利用合成RNAi分子、短干扰RNA(siRNA)、PIWI相互作用NRA(piRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微小RNA(miRNA)的方法以及本领域技术人员认可的其他瞬时敲低方法。包括序列特异性shRNA、siRNA、miRNA等的用于RNAi的试剂是可商购获得的。例如，通过将CIITA siRNA引入到细胞中或将表达CIITA shRNA的病毒转导到细胞中，可以在多能干细胞中敲低CIITA。在一些实施方案中，采用RNA干扰来降低或抑制选自由CIITA、B2M、NLRC5、TCR-α和TCR-β组成的组的至少一种的表达。
在一些实施方案中，本文提供的细胞经遗传修饰以降低一种或多种免疫因子(包括靶多肽)的表达以产生免疫豁免或低免疫原性细胞。在某些实施方案中，本文公开的细胞(例如，干细胞、诱导性多能干细胞、分化细胞、造血干细胞、原代T细胞和CAR-T细胞)包含一种或多种遗传修饰以降低一种或多种靶多核苷酸的表达。此类靶多核苷酸和多肽的非限制性实例包括CIITA、B2M、NLRC5、CTLA-4、PD-1、HLA-A、HLA-BM、HLA-C、RFX-ANK、NFY-A、RFX5、RFX-AP、NFY-B、NFY-C、IRF1和TAP1。
在一些实施方案中，使用CRISPR/Cas系统进行遗传修饰。通过调节(例如，降低或缺失)一个或多个靶多核苷酸的表达，此类细胞在植入到受体受试者中时表现出降低的免疫活化。在一些实施方案中，细胞被认为是低免疫原性的，例如，在施用时在受体受试者或患者中。
I.基因编辑系统
在一些实施方案中，用于遗传修饰细胞以敲除、敲低或以其他方式修饰一个或多个基因的方法包括使用定点核酸酶，包括例如锌指核酸酶(ZFN)、转录活化因子样效应物核酸酶(TALEN)、大范围核酸酶、转座酶和成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/Cas系统，以及本领域已知的切口酶系统、碱基编辑系统、引物编辑系统和基因编写系统。
i.ZFN
ZFN是包含一系列位点特异性DNA结合结构域的融合蛋白，所述结构域改编自附接至细菌FokI限制酶的核酸内切酶结构域的含锌指转录因子。ZFN可具有一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)DNA结合结构域或锌指结构域。参见，例如，Carroll等人,Genetics Society of America(2011)188:773-782；Kim等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1996)93:1156-1160。每个锌指结构域都是被一个或多个锌离子稳定的小蛋白质结构基序，并且通常识别3至4bp的DNA序列。因此，串联结构域可以潜在地与细胞基因组中独特的延伸核苷酸序列结合。
可以组合特异性已知的各种锌指以产生识别约6、9、12、15或18bp序列的多指多肽。各种选择和模块化组装技术可用于生成识别特定序列的锌指(及其组合)，包括噬菌体展示、酵母单杂交系统、细菌单杂交和双杂交系统以及哺乳动物细胞。可以对锌指进行工程化以结合预定的核酸序列。工程化锌指以结合预定核酸序列的标准是本领域已知的。参见，例如，Sera等人,Biochemistry(2002)41:7074-7081；Liu等人,Bioinformatics(2008)24:1850-1857。
含有FokI核酸酶结构域或其他二聚核酸酶结构域的ZFN用作二聚体。因此，需要一对ZFN来靶向非回文DNA位点。两个单独的ZFN必须通过适当间隔开的核酸酶结合DNA的相反链。参见Bitinaite等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1998)95:10570-10575。为了切割基因组中的指定位点，设计了一对ZFN以识别侧接所述位点的两个序列，一个在正向链上，而另一个在反向链上。当ZFN在所述位点的任一侧结合后，核酸酶结构域二聚化并且切割所述位点处的DNA，从而生成具有5'突出端的DSB。然后可以借助含有被同源臂侧接的期望突变的修复模板，利用HDR来引入特定突变。修复模板通常是引入到细胞中的外源双链DNA载体。参见Miller等人,Nat.Biotechnol.(2011)29:143-148；Hockemeyer等人,Nat.Biotechnol.(2011)29:731-734。
ii.TALEN
TALEN是可以用于编辑靶基因的人工核酸酶的另一个实例。TALEN来源于被称为TALE重复序列的DNA结合结构域，它通常包含具有10至30个重复序列的串联阵列，所述重复序列结合并识别延伸的DNA序列。每个重复序列长度为33至35个氨基酸，两个相邻的氨基酸(称为重复可变双残基或RVD)赋予四个DNA碱基对之一的特异性。因此，重复序列与靶DNA序列中的碱基对之间存在一一对应关系。
通过将一个或多个TALE DNA结合结构域(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)融合至核酸酶结构域(例如FokI核酸内切酶结构域)而人工产生TALEN。参见Zhang,Nature Biotech.(2011)29:149-153。为了在TALEN中使用，已经对FokI进行了若干种突变；例如，这些改善了切割特异性或活性。参见Cermak等人,Nucl.Acids Res.(2011)39:e82；Miller等人,Nature Biotech.(2011)29:143-148；Hockemeyer等人,Nature Biotech.(2011)29:731-734；Wood等人,Science(2011)333:307；Doyon等人,Nature Methods(2010)8:74-79；Szczepek等人,Nature Biotech(2007)25:786-793；Guo等人,J.Mol.Biol.(2010)200:96。FokI结构域用作二聚体，需要具有独特的DNA结合结构域的两个构建体，用于靶基因组中的具有正确的方向和间距的位点。TALE DNA结合结构域与FokI核酸酶结构域之间的氨基酸残基数量以及两个单独的TALEN结合位点之间的碱基数量似乎都是实现高水平活性的重要参数。Miller等人,Nature Biotech.(2011)29:143-148。
通过将工程化TALE重复序列与核酸酶结构域相组合，可以产生对任何期望的DNA序列具有特异性的位点特异性核酸酶。与ZFN类似，可以将TALEN引入到细胞中以在基因组中的期望靶位点生成DSB，因此TALEN可以用于以类似的HDR介导的途径敲除基因或敲入突变。参见Boch,Nature Biotech.(2011)29:135-136；Boch等人,Science(2009)326:1509-1512；Moscou等人,Science(2009)326:3501。
iii.大范围核酸酶
大范围核酸酶是内切核酸酶家族中的酶，其特征在于它们能够识别并切割大DNA序列(14至40个碱基对)。基于大范围核酸酶的影响核酸酶活性和/或DNA识别的结构基序，将大范围核酸酶分为多个家族。最广泛和最有名的大范围核酸酶是LAGLIDADG家族中的蛋白质，其名称来源于保守的氨基酸序列。参见Chevalier等人,Nucleic Acids Res.(2001)29(18):3757-3774。另一方面，GIY-YIG家族成员具有GIY-YIG模块，其长度为70-100个残基，并且包括具有四个不变残基的四个或五个保守序列基序，其中两个是活性所需的。参见Van Roey等人,Nature Struct.Biol.(2002)9:806-811。His-Cys家族大范围核酸酶的特征在于在涵盖数百个氨基酸残基的区域中的一系列高度保守的组氨酸和半胱氨酸。参见Chevalier等人,Nucleic Acids Res.(2001)29(18):3757-3774。NHN家族的成员由含有被天冬酰胺残基包围的两对保守组氨酸的基序定义。参见Chevalier等人,Nucleic AcidsRes.(2001)29(18):3757-3774。
由于高特异性要求，鉴定特定靶DNA序列的天然大范围核酸酶的机会较低，因此已使用各种方法(包括诱变和高通量筛选方法)来创建识别独特序列的大范围核酸酶变体。用于对具有改变的DNA结合特异性的大范围核酸酶进行工程化(例如以结合预定核酸序列)的策略是本领域已知的。参见，例如,Chevalier等人,Mol.Cell.(2002)10:895-905；Epinat等人,Nucleic Acids Res(2003)31:2952-2962；Silva等人,J Mol.Biol.(2006)361:744-754；Seligman等人,Nucleic Acids Res(2002)30:3870-3879；Sussman等人,J Mol Biol(2004)342:31-41；Doyon等人,J Am Chem Soc(2006)128:2477-2484；Chen等人,ProteinEng Des Sel(2009)22:249-256；Arnould等人,J Mol Biol.(2006)355:443-458；Smith等人,Nucleic Acids Res.(2006)363(2):283-294。
与ZFN和TALEN一样，大范围核酸酶可以在基因组DNA中产生DSB，如果修复不当(例如，经由NHEJ)，它可以产生移码突变，从而导致靶基因在细胞中的表达降低。或者，可以将外来DNA与大范围核酸酶一起引入到细胞中。根据外来DNA的序列和染色体序列，此过程可用于修饰靶基因。参见Silva等人,Current Gene Therapy(2011)11:11-27。
iv.转座酶
转座酶是结合转座子的末端并且通过剪切和粘贴机制或复制性转座机制催化其移动到基因组另一部分的酶。通过将转座酶连接至其他系统(诸如CRISPER/Cas系统)，可以开发新的基因编辑工具以实现基因组DNA的位点特异性插入或操作。有两种已知的使用转座子的DNA整合方法，其使用催化无活性的Cas效应蛋白和Tn7样转座子。转座酶依赖性DNA整合不在基因组中引发DSB，这可以保证更安全和更具特异性的DNA整合。
v.CRISPR/Cas系统
CRISPR系统作为提供一种获得性免疫的参与防御入侵噬菌体和质粒的系统最初在原核生物(例如，细菌和古细菌)中发现。现在它已被改编并用作研究和临床应用中流行的基因编辑工具。
CRISPR/Cas系统通常包含至少两种组件：一个或多个指导RNA(gRNA)和Cas蛋白。Cas蛋白是一种将DSB引入到靶位点中的核酸酶。CRISPR-Cas系统有两大类：1类系统使用多种Cas蛋白的复合物来降解核酸；2类系统使用单一大Cas蛋白来达到相同目的。1类分为I、III和IV型；2类分为II、V和VI型。适用于基因编辑应用的不同Cas蛋白包括但不限于Cas3、Cas4、Cas5、Cas8a、Cas8b、Cas8c、Cas9、Cas10、Cas12、Cas12a(Cpf1)、Cas12b(C2c1)、Cas12c(C2c3)、Cas12d(CasY)、Cas12e(CasX)、Cas12f(C2c10)、Cas12g、Cas12h、Cas12i、Cas12k(C2c5)、Cas13、Cas13a(C2c2)、Cas13b、Cas13c、Cas13d、C2c4、C2c8、C2c9、Cmr5、Cse1、Cse2、Csf1、Csm2、Csn2、Csx10、Csx11、Csy1、Csy2、Csy3和Mad7。最广泛使用的Cas9在本文中被描述为说明性的。这些Cas蛋白可来源于不同的来源物种。例如，Cas9可以来源于化脓性链球菌(S.pyogenes)或金黄色葡萄球菌(S.aureus)。
在原始微生物基因组中，II型CRISPR系统将来自入侵DNA的序列掺入到宿主基因组内编码为阵列的CRISPR重复序列之间。来自CRISPR重复序列阵列的转录物被加工成CRISPR RNA(crRNA)，每个都具有从入侵DNA转录的可变序列(称为“原间隔”序列)，以及CRISPR重复序列的一部分。每个crRNA与第二反式活化CRISPR RNA(tracrRNA)杂交，并且这两个RNA与Cas9核酸酶形成复合物。crRNA的原间隔编码部分指导Cas9复合物切割互补的靶DNA序列，前提条件是它们与被称为“原间隔相邻基序”(PAM)的短序列相邻。
自发现以来，CRISPR系统已被改编用于在从细菌到真核细胞(包括人类细胞)的广泛细胞和生物体中诱导序列特异性DSB和靶向基因组编辑。在基因编辑应用的用途中，人工设计的合成gRNA已经替代了原始的crRNA:tracrRNA复合物。例如，gRNA可以是由crRNA、四环和tracrRNA构成的单一指导RNA(sgRNA)。crRNA通常包含互补区域(也称为间隔子，长度通常为约20个核苷酸)，其经过用户设计以识别感兴趣的靶DNA。tracrRNA序列包含用于Cas核酸酶结合的支架区域。crRNA序列和tracrRNA序列通过四环连接，每个都具有用于彼此杂交的短重复序列，因此生成嵌合sgRNA。可以通过简单地改变gRNA中存在的间隔子或互补区域序列来改变Cas核酸酶的基因组靶标。互补区域将通过标准的RNA-DNA互补碱基配对规则将Cas核酸酶引导至靶DNA位点。
为了使Cas核酸酶发挥作用，紧邻基因组DNA中的靶序列的下游必须有PAM的存在。Cas蛋白对PAM的识别被认为会破坏相邻基因组序列的稳定性，从而允许gRNA询问序列并且在存在匹配序列时导致gRNA-DNA配对。PAM的特定序列因Cas基因的种类而异。例如，最常用的来源于化脓性链球菌的Cas9核酸酶识别5'-NGG-3'的PAM序列，或者以较低的效率识别5'-NAG-3'的PAM序列，其中“N”可以是任何核苷酸。具有替代PAM的其他Cas核酸酶变体也已经表征并成功用于基因组编辑，所述变体总结在下表20中。
表20.示例性Cas核酸酶变体及其PAM序列
R＝A或G；Y＝C或T；W＝A或T；V＝A或C或G；N＝任何碱基
在一些实施方案中，Cas核酸酶可包含一个或多个突变以改变它们的活性、特异性、识别和/或其他特征。例如，Cas核酸酶可具有一个或多个突变，所述突变改变其保真度以减轻脱靶效应(例如，SpCas9的eSpCas9、SpCas9-HF1、HypaSpCas9、HeFSpCas9和evoSpCas9高保真变体)。再例如，Cas核酸酶可具有一个或多个改变其PAM特异性的突变。
vi.切口酶
Cas(特别是Cas9)的核酸酶结构域，核酸酶可以独立突变以生成被称为DNA“切口酶”的酶。切口酶能够通过与常规CRISPR/Cas核酸酶系统(包括例如CRISPR/Cas9)相同的特异性引入单链切割。切口酶可用于生成可用于基因编辑系统的双链断裂(Mali等人,NatBiotech,31(9):833-838(2013)；Mali等人Nature Methods,10:957–963(2013)；Mali等人,Science,339(6121):823-826(2013))。在一些情况下，当使用两种Cas切口酶时，在每个切割末端上会产生长突出端而不是平末端，这允许对精确基因整合和插入进行额外控制(Mali等人,Nat Biotech,31(9):833-838(2013)；Mali等人Nature Methods,10:957–963(2013)；Mali等人,Science,339(6121):823-826(2013))。由于两种切口Cas酶必须有效地切割其靶DNA，因此与基于双链切割Cas的系统相比，配对的切口酶可以具有更低的脱靶效应(Ran等人,Cell,155(2):479-480(2013)；Mali等人,Nat Biotech,31(9):833-838(2013)；Mali等人Nature Methods,10:957–963(2013)；Mali等人,Science,339(6121):823-826(2013))。
V.致耐受因子和/或嵌合抗原受体的重组表达方法
对于所有这些技术，使用众所周知的重组技术来生成如本文所概述的重组核酸。在某些实施方案中，编码致耐受因子或嵌合抗原受体的重组核酸可与表达构建体中的一个或多个调控核苷酸序列可操作地连接。调控核苷酸序列通常适用于待治疗的宿主细胞和受体受试者。对于多种宿主细胞，多种类型的适当的表达载体和合适的调控序列是本领域已知的。通常，一种或多种调控核苷酸序列可包括但不限于启动子序列、前导或信号序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列以及增强子或活化因子序列。还考虑了本领域已知的组成型或诱导型启动子。启动子可以是天然存在的启动子、组合了超过一个启动子的元件的杂合启动子、或合成启动子。表达构建体可存在于细胞中的附加体(诸如质粒)上，或者表达构建体可插入到染色体中，诸如基因座中。在一些实施方案中，表达载体包括可选择的标记基因以允许选择转化的宿主细胞。一些实施方案包括这样的表达载体，其包含编码变体多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列与至少一个调控序列可操作地连接。本文使用的调控序列包括启动子、增强子和其他表达控制元件。在一些实施方案中，表达载体被设计用于选择待转化的宿主细胞、期望表达的特定变体多肽、载体的拷贝数、控制该拷贝数的能力和/或载体编码的任何其他蛋白质(诸如抗生素标志物)的表达。
合适的哺乳动物启动子的实例包括例如来自以下基因的启动子：延伸因子1α(EF1α)启动子、CAG启动子、仓鼠的泛素/S27a启动子(WO 97/15664)、猿猴空泡病毒40(SV40)早期启动子、腺病毒主要晚期启动子、小鼠金属硫蛋白-I启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)的长末端重复区、小鼠乳腺肿瘤病毒启动子(MMTV)、莫洛尼氏鼠白血病病毒长末端重复区和人巨细胞病毒(CMV)早期启动子。其他异源哺乳动物启动子的实例是肌动蛋白、免疫球蛋白或热休克启动子。在额外的实施方案中，用于哺乳动物宿主细胞的启动子可以从病毒的基因组获得，所述病毒诸如多瘤病毒、禽痘病毒(1989年7月5日公开的UK 2,211,504)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒和猿猴病毒40(SV40)。在其他实施方案中，使用异源哺乳动物启动子。实例包括肌动蛋白启动子、免疫球蛋白启动子和热休克启动子。SV40的早期和晚期启动子以SV40限制性片段方便地获得，所述限制性片段还含有SV40病毒复制起点(Fiers等人,Nature273:113-120(1978))。人类巨细胞病毒的即刻早期启动子以HindIII限制酶片段方便地获得(Greenaway等人,Gene 18:355-360(1982))。前述参考文献通过引用整体并入。
在一些实施方案中，表达载体是双顺反子或多顺反子表达载体。双顺反子或多顺反子表达载体可包括(1)与每个开放阅读框融合的多个启动子；(2)基因之间的剪接信号的插入；(3)表达受单一启动子驱动的基因的融合；和(4)基因之间的蛋白水解切割位点(自切割肽)的插入或基因之间的内部核糖体进入位点(IRES)的插入。
将本文所述的多核苷酸引入到细胞中的过程可以通过任何合适的技术来实现。合适的技术包括磷酸钙或脂质介导的转染、电穿孔、融合原和使用病毒载体进行的转导或感染。在一些实施方案中，经由病毒转导(例如，AAV转导、慢病毒转导)或者以其他方式在病毒载体上递送(例如，融合原介导的递送)，将多核苷酸引入到细胞中。在一些实施方案中，经由融合原介导的递送或选自由以下组成的组的转座酶系统将多核苷酸引入到细胞中：条件性或诱导型转座酶、条件性或诱导型PiggyBac转座子、条件性或诱导型睡美人(SB11)转座子、条件性或诱导型Mos1转座子和条件性或诱导型Tol2转座子。
在一些实施方案中，本文提供的细胞经遗传修饰以包括插入到低免疫原性细胞的一个或多个基因组基因座中的一种或多种外源多核苷酸。在一些实施方案中，外源多核苷酸编码感兴趣的蛋白质，例如嵌合抗原受体。可以使用任何合适的方法将外源多核苷酸插入到低免疫原性细胞的基因组基因座中，所述方法包括本文所述的基因编辑方法(例如，CRISPR/Cas系统)。在一些实施方案中，使用病毒转导(例如使用载体)将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。在一些实施方案中，载体是携带外源多核苷酸的假型化、自灭活慢病毒载体。在一些实施方案中，载体是用水疱性口炎VSV-G包膜假型化的自灭活慢病毒载体，并携带外源多核苷酸。在一些实施方案中，使用病毒转导将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。在一些实施方案中，使用基于慢病毒的病毒载体将外源多核苷酸插入到细胞的至少一个等位基因中。
与通常涉及活化细胞(诸如活化T细胞(例如，CD8+T细胞))的将本文所述的多核苷酸引入到细胞中的某些方法不同，可以利用合适的技术将多核苷酸引入到非活化T细胞中。合适的技术包括但不限于用一种或多种结合CD3、CD8和/或CD28的抗体或其可以或不可以结合珠子的片段或部分(例如，scFv和VHH)来活化T细胞(CD8+T细胞)。令人惊讶的是，融合原介导的将多核苷酸引入到T细胞中是在非活化T细胞(例如，CD8+T细胞)中执行的，所述细胞先前未接触过一种或多种活化抗体或其片段或部分(例如，CD3、CD8和/或CD28)。在一些实施方案中，融合原介导的将多核苷酸引入到T细胞中是在体内进行的(例如，在T细胞已经被施用于受试者之后)。在其他实施方案中，融合原介导的将多核苷酸引入到T细胞中是在体外进行的(例如，在T细胞被施用于受试者之前)。
本文提供了非活化T细胞，其包含相对于野生型T细胞降低的一种或多种Y染色体基因HLA-A、HLA-B、HLA-C、CIITA、TCR-α和/或TCR-β的表达，其中非活化T细胞还包含编码CD47的第一基因。在一些实施方案中，非活化T细胞包含相对于野生型T细胞降低的Y-连锁原钙粘蛋白11和/或Y-连锁神经连接蛋白4、HLA-A、HLA-B、HLA-C、CIITA、TCR-α和/或TCR-β的表达，其中非活化T细胞还包含编码CD47的第一外源多核苷酸。
在一些实施方案中，非活化T细胞未用抗CD3抗体、抗CD28抗体、T细胞活化细胞因子或可溶性T细胞共刺激分子处理。在一些实施方案中，非活化T细胞不表达活化标志物。在一些实施方案中，非活化T细胞表达CD3和CD28，并且其中CD3和/或CD28是无活性的。
在一些实施方案中，抗CD3抗体是OKT3。在一些实施方案中，抗CD28抗体是CD28.2。在一些实施方案中，T细胞活化细胞因子选自由IL-2、IL-7、IL-15和IL-21组成的T细胞活化细胞因子组。在一些实施方案中，可溶性T细胞共刺激分子选自由抗CD28抗体、抗CD80抗体、抗CD86抗体、抗CD137L抗体和抗ICOS-L抗体组成的可溶性T细胞共刺激分子组。
在一些实施方案中，非活化T细胞是原代T细胞。在其他实施方案中，非活化T细胞从本公开的工程化和/或低免疫原性细胞分化。在一些实施方案中，T细胞是CD8+T细胞。
在一些实施方案中，第一外源多核苷酸编码CD47。
在一些实施方案中，非活化T细胞还包含编码嵌合抗原受体(CAR)的第二外源多核苷酸。在一些实施方案中，CAR选自由CD19特异性CAR、CD20特异性CAR、BCMA特异性CAR和CD22特异性CAR组成的组。
在一些实施方案中，第一和/或第二外源多核苷酸由病毒载体(包括慢病毒载体)携带。在一些实施方案中，第一和/或第二外源多核苷酸由包含CD8结合剂的慢病毒载体携带。在一些实施方案中，使用融合原介导的递送或选自由以下组成的组的转座酶系统将第一和/或第二外源多核苷酸引入到细胞中：条件性或诱导型转座酶、条件性或诱导型PiggyBac转座子、条件性或诱导型睡美人(SB11)转座子、条件性或诱导型Mos1转座子和条件性或诱导型Tol2转座子。
在一些实施方案中，将第一和/或第二外源多核苷酸插入到T细胞的至少一个等位基因的特定基因座中。在一些实施方案中，特定基因座选自由以下组成的组：安全港或靶标基因座、B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座和TRB基因座。在一些实施方案中，将编码CAR的第二外源多核苷酸插入到选自由以下组成的组的特定基因座中：安全港或靶标基因座、B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座和TRB基因座。在一些实施方案中，将编码CD47的第一外源多核苷酸插入到选自由以下组成的组的特定基因座中：安全港或靶标基因座、B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座和TRB基因座。在一些实施方案中，将编码CAR的第二外源多核苷酸和编码CD47的第一外源多核苷酸插入到不同的基因座中。在一些实施方案中，将编码CAR的第二外源多核苷酸和编码CD47的第一外源多核苷酸插入到相同的基因座中。在一些实施方案中，将编码CAR的第二外源多核苷酸和编码CD47的第一外源多核苷酸插入到B2M基因座中。在一些实施方案中，将编码CAR的第二外源多核苷酸和编码CD47的第一外源多核苷酸插入到CIITA基因座中。在一些实施方案中，将编码CAR的第二外源多核苷酸和编码CD47的第一外源多核苷酸插入到TRAC基因座中。在一些实施方案中，将编码CAR的第二外源多核苷酸和编码CD47的第一外源多核苷酸插入到TRB基因座中。在一些实施方案中，将编码CAR的第二外源多核苷酸和编码CD47的第一外源多核苷酸插入到安全港或靶标基因座中。在一些实施方案中，安全港或靶标基因座选自由以下组成的组：CCR5基因座、CXCR4基因座、PPP1R12C基因座、白蛋白基因座、SHS231基因座、CLYBL基因座、Rosa基因座、F3(CD142)基因座、MICA基因座、MICB基因座、LRP1(CD91)基因座、HMGB1基因座、ABO基因座、RHD基因座、FUT1基因座和KDM5D基因座。
在一些实施方案中，非活化T细胞不表达HLA-A、HLA-B和/或HLA-C抗原。在一些实施方案中，非活化T细胞不表达B2M。在一些实施方案中，非活化T细胞不表达HLA-DP、HLA-DQ和/或HLA-DR抗原。在一些实施方案中，非活化T细胞不表达CIITA。在一些实施方案中，非活化T细胞不表达TCR-α。在一些实施方案中，非活化T细胞不表达TCR-β。在一些实施方案中，非活化T细胞不表达TCR-α和TCR-β。
在一些实施方案中，非活化T细胞是包含插入到TRAC基因座中的编码CD47的第一外源多核苷酸和/或编码CAR的第二外源多核苷酸的PCDH11Y插入缺失/插入缺失、NLGN4Y插入缺失/插入缺失、B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失细胞。在一些实施方案中，非活化T细胞是包含插入到TRAC基因座中的编码CD47的第一外源多核苷酸和编码CAR的第二外源多核苷酸的PCDH11Y插入缺失/插入缺失、NLGN4Y插入缺失/插入缺失、B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失细胞。在一些实施方案中，非活化T细胞是包含插入到TRB基因座中的编码CD47的第一外源多核苷酸和/或编码CAR的第二外源多核苷酸的PCDH11Y插入缺失/插入缺失、NLGN4Y插入缺失/插入缺失、B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失细胞。在一些实施方案中，非活化T细胞是包含插入到TRB基因座中的编码CD47的第一外源多核苷酸和编码CAR的第二外源多核苷酸的PCDH11Y插入缺失/插入缺失、NLGN4Y插入缺失/插入缺失、B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失细胞。在一些实施方案中，非活化T细胞是包含插入到B2M基因座中的编码CD47的第一外源多核苷酸和/或编码CAR的第二外源多核苷酸的PCDH11Y插入缺失/插入缺失、NLGN4Y插入缺失/插入缺失、B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失细胞。在一些实施方案中，非活化T细胞是包含插入到B2M基因座中的编码CD47的第一外源多核苷酸和编码CAR的第二外源多核苷酸的PCDH11Y插入缺失/插入缺失、NLGN4Y插入缺失/插入缺失、B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失细胞。在一些实施方案中，非活化T细胞是包含插入到CIITA基因座中的编码CD47的第一外源多核苷酸和/或编码CAR的第二外源多核苷酸的PCDH11Y插入缺失/插入缺失、NLGN4Y插入缺失/插入缺失、B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失细胞。在一些实施方案中，非活化T细胞是包含插入到CIITA基因座中的编码CD47的第一外源多核苷酸和编码CAR的第二外源多核苷酸的PCDH11Y插入缺失/插入缺失、NLGN4Y插入缺失/插入缺失、B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失细胞。
在一些实施方案中，非活化T细胞是包含插入到TRAC基因座中的编码CD47的第一外源多核苷酸和/或编码CAR的第二外源多核苷酸的PCDH11Y插入缺失/插入缺失、NLGN4Y插入缺失/插入缺失、B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRB插入缺失/插入缺失细胞。在一些实施方案中，非活化T细胞是包含插入到TRAC基因座中的编码CD47的第一外源多核苷酸和编码CAR的第二外源多核苷酸的PCDH11Y插入缺失/插入缺失、NLGN4Y插入缺失/插入缺失、B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRB插入缺失/插入缺失细胞。在一些实施方案中，非活化T细胞是包含插入到TRB基因座中的编码CD47的第一外源多核苷酸和/或编码CAR的第二外源多核苷酸的PCDH11Y插入缺失/插入缺失、NLGN4Y插入缺失/插入缺失、B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRB插入缺失/插入缺失细胞。在一些实施方案中，非活化T细胞是包含插入到TRB基因座中的编码CD47的第一外源多核苷酸和编码CAR的第二外源多核苷酸的PCDH11Y插入缺失/插入缺失、NLGN4Y插入缺失/插入缺失、B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRB插入缺失/插入缺失细胞。在一些实施方案中，非活化T细胞是包含插入到B2M基因座中的编码CD47的第一外源多核苷酸和/或编码CAR的第二外源多核苷酸的PCDH11Y插入缺失/插入缺失、NLGN4Y插入缺失/插入缺失、B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRB插入缺失/插入缺失细胞。在一些实施方案中，非活化T细胞是包含插入到B2M基因座中的编码CD47的第一外源多核苷酸和编码CAR的第二外源多核苷酸的PCDH11Y插入缺失/插入缺失、NLGN4Y插入缺失/插入缺失、B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRB插入缺失/插入缺失细胞。在一些实施方案中，非活化T细胞是包含插入到CIITA基因座中的编码CD47的第一外源多核苷酸和/或编码CAR的第二外源多核苷酸的PCDH11Y插入缺失/插入缺失、NLGN4Y插入缺失/插入缺失、B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRB插入缺失/插入缺失细胞。在一些实施方案中，非活化T细胞是包含插入到CIITA基因座中的编码CD47的第一外源多核苷酸和编码CAR的第二外源多核苷酸的PCDH11Y插入缺失/插入缺失、NLGN4Y插入缺失/插入缺失、B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRB插入缺失/插入缺失细胞。
本文提供了工程化T细胞，其包含相对于野生型T细胞降低的HLA-A、HLA-B、HLA-C、CIITA、TCR-α和/或TCR-β的表达，其中工程化T细胞还包含由包含CD8结合剂的慢病毒载体携带的编码CD47的第一外源多核苷酸。在一些实施方案中，工程化T细胞包含相对于野生型T细胞降低的Y-连锁原钙粘蛋白11和/或Y-连锁神经连接蛋白4、HLA-A、HLA-B、HLA-C、CIITA、TCR-α和/或TCR-β的表达，其中工程化T细胞还包含由包含CD8结合剂的慢病毒载体携带的编码CD47的第一外源多核苷酸。
在一些实施方案中，工程化T细胞是原代T细胞。在其他实施方案中，工程化T细胞从本公开的低免疫原性细胞分化。在一些实施方案中，T细胞是CD8+T细胞。在一些实施方案中，T细胞是CD4+T细胞。
在一些实施方案中，工程化T细胞不表达活化标志物。在一些实施方案中，工程化T细胞表达CD3和CD28，并且其中CD3和/或CD28是无活性的。
在一些实施方案中，工程化T细胞未用抗CD3抗体、抗CD28抗体、T细胞活化细胞因子或可溶性T细胞共刺激分子处理。在一些实施方案中，抗CD3抗体是OKT3，其中抗CD28抗体是CD28.2，其中T细胞活化细胞因子选自由IL-2、IL-7、IL-15和IL-21组成的T细胞活化细胞因子组，并且其中可溶性T细胞共刺激分子选自由抗CD28抗体、抗CD80抗体、抗CD86抗体、抗CD137L抗体和抗ICOS-L抗体组成的可溶性T细胞共刺激分子组。在一些实施方案中，工程化T细胞尚未用选自由IL-2、IL-7、IL-15和IL-21组成的组的一种或多种T细胞活化细胞因子处理。在一些情况下，细胞因子是IL-2。在一些实施方案中，一种或多种细胞因子是IL-2，并且另一种选自由IL-7、IL-15和IL-21组成的组。
在一些实施方案中，非活化T细胞还包含编码嵌合抗原受体(CAR)的第二外源多核苷酸。在一些实施方案中，CAR选自由CD19特异性CAR和CD22特异性CAR组成的组。
在一些实施方案中，工程化T细胞还包含编码嵌合抗原受体(CAR)的第二外源多核苷酸。在一些实施方案中，将第一和/或第二外源多核苷酸插入到T细胞的至少一个等位基因的特定基因座中。在一些实施方案中，特定基因座选自由以下组成的组：安全港或靶标基因座、B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座和TRB基因座。在一些实施方案中，将编码CD47的第一外源多核苷酸插入到选自由以下组成的组的特定基因座中：安全港或靶标基因座、B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座和TRB基因座。在一些实施方案中，将编码CAR的第二外源多核苷酸插入到选自由以下组成的组的特定基因座中：安全港或靶标基因座、B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座和TRB基因座。在一些实施方案中，将编码CD47的第一外源多核苷酸和编码CAR的第二外源多核苷酸插入到不同的基因座中。在一些实施方案中，将编码CD47的第一外源多核苷酸和编码CAR的第二外源多核苷酸插入到相同的基因座中。在一些实施方案中，将编码CD47的第一外源多核苷酸和编码CAR的第二外源多核苷酸插入到B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座、TRB基因座或安全港或靶标基因座中。在一些实施方案中，安全港或靶标基因座选自由以下组成的组：CCR5基因座、CXCR4基因座、PPP1R12C基因座、白蛋白基因座、SHS231基因座、CLYBL基因座、Rosa基因座、F3(CD142)基因座、MICA基因座、MICB基因座、LRP1(CD91)基因座、HMGB1基因座、ABO基因座、RHD基因座、FUT1基因座和KDM5D基因座。
在一些实施方案中，CAR选自由CD19特异性CAR和CD22特异性CAR组成的组。在一些实施方案中，CAR是CD19特异性CAR。在一些实施方案中，CAR是CD22特异性CAR。在一些实施方案中，CAR包含与选自由CD19、CD20、CD22、CD38、CD123、CD138和BCMA组成的组的任一个结合的抗原结合结构域。
在一些实施方案中，工程化T细胞不表达HLA-A、HLA-B和/或HLA-C抗原，其中工程化T细胞不表达B2M，其中工程化T细胞不表达HLA-DP、HLA-DQ和/或HLA-DR抗原，其中工程化T细胞不表达CIITA，且/或其中工程化T细胞不表达TCR-α和TCR-β。
在一些实施方案中，使用病毒转导将第一和/或第二外源多核苷酸插入到T细胞的至少一个等位基因中。在一些实施方案中，使用基于慢病毒的病毒载体将第一和/或第二外源多核苷酸插入到T细胞的至少一个等位基因中。
在一些实施方案中，工程化T细胞是包含插入到TRAC基因座、TRB基因座、B2M基因座或CIITA基因座中的编码CD47的第一外源多核苷酸和/或编码CAR的第二外源多核苷酸的PCDH11Y插入缺失/插入缺失、NLGN4Y插入缺失/插入缺失、B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRAC插入缺失/插入缺失细胞。在一些实施方案中，工程化T细胞是包含插入到TRAC基因座、TRB基因座、B2M基因座或CIITA基因座中的编码CD47的第一外源多核苷酸和/或编码CAR的第二外源多核苷酸的PCDH11Y插入缺失/插入缺失、NLGN4Y插入缺失/插入缺失、B2M插入缺失/插入缺失、CIITA插入缺失/插入缺失、TRB插入缺失/插入缺失细胞。
在一些实施方案中，本公开的非活化T细胞和/或工程化T细胞在受试者中。在其他实施方案中，本公开的非活化T细胞和/或工程化T细胞在体外。
在一些实施方案中，本公开的非活化T细胞和/或工程化T细胞表达CD8结合剂。在一些实施方案中，CD8结合剂是抗CD8抗体。在一些实施方案中，抗CD8抗体选自由以下组成的组：小鼠抗CD8抗体、兔抗CD8抗体、人抗CD8抗体、人源化抗CD8抗体、骆驼科动物(例如美洲驼、羊驼、骆驼)抗CD8抗体及其片段。在一些实施方案中，其片段是scFv或VHH。在一些实施方案中，CD8结合剂结合CD8α链和/或CD8β链。
在一些实施方案中，CD8结合剂融合至掺入病毒包膜中的跨膜结构域。在一些实施方案中，慢病毒载体用病毒融合蛋白假型化。在一些实施方案中，病毒融合蛋白包含一种或多种修饰以降低与其天然受体的结合。
在一些实施方案中，病毒融合蛋白融合至CD8结合剂。在一些实施方案中，病毒融合蛋白包含融合至CD8结合剂的尼帕病毒F糖蛋白和尼帕病毒G糖蛋白。在一些实施方案中，慢病毒载体不包含T细胞活化分子或T细胞共刺激分子。在一些实施方案中，本公开的非活化T细胞和/或工程化T细胞在受试者中。在其他实施方案中，本公开的非活化T细胞和/或工程化T细胞在体外。
在一些实施方案中，本公开的非活化T细胞和/或工程化T细胞表达CD8结合剂。在一些实施方案中，CD8结合剂是抗CD8抗体。在一些实施方案中，抗CD8抗体选自由以下组成的组：小鼠抗CD8抗体、兔抗CD8抗体、人抗CD8抗体、人源化抗CD8抗体、骆驼科动物(例如美洲驼、羊驼、骆驼)抗CD8抗体及其片段。在一些实施方案中，其片段是scFv或VHH。在一些实施方案中，CD8结合剂结合CD8α链和/或CD8β链。
在一些实施方案中，CD8结合剂融合至掺入病毒包膜中的跨膜结构域。在一些实施方案中，慢病毒载体用病毒融合蛋白假型化。在一些实施方案中，病毒融合蛋白包含一种或多种修饰以降低与其天然受体的结合。
在一些实施方案中，病毒融合蛋白融合至CD8结合剂。在一些实施方案中，病毒融合蛋白包含融合至CD8结合剂的尼帕病毒F糖蛋白和尼帕病毒G糖蛋白。在一些实施方案中，慢病毒载体不包含T细胞活化分子或T细胞共刺激分子。在一些实施方案中，慢病毒载体编码第一外源多核苷酸和/或第二外源多核苷酸。
在一些实施方案中，在转移到第一受试者体内后，非活化T细胞或工程化T细胞表现出选自由以下组成的组的一种或多种反应：(a)T细胞反应，(b)NK细胞反应，和(c)巨噬细胞反应，所述反应与转移到第二受试者体内后的野生型细胞相比有所降低。在一些实施方案中，第一受试者和第二受试者是不同的受试者。在一些实施方案中，巨噬细胞反应是吞噬。
在一些实施方案中，与转移到受试者体内后的野生型细胞相比，非活化T细胞或工程化T细胞在转移到受试者体内后表现出选自由以下组成的组的一项或多项：(a)受试者的TH1活化减少，(b)受试者的NK细胞杀伤减少，和(c)受试者的完整PBMC的杀伤减少。
在一些实施方案中，与转移到受试者体内后的野生型细胞相比，非活化T细胞或工程化T细胞在转移到受试者体内后引发选自由以下组成的组的一项或多项：(a)受试者的供体特异性抗体减少，(b)受试者的IgM或IgG抗体减少，和(c)受试者的补体依赖性细胞毒性(CDC)减少。
在一些实施方案中，在受试者体内用包含CD8结合剂的慢病毒载体转导非活化T细胞或工程化T细胞。在一些实施方案中，慢病毒载体携带编码CAR和/或CD47的基因。
在一些实施方案中，使用基因疗法载体或选自由转座酶、PiggyBac转座子、睡美人(SB11)转座子、Mos1转座子和Tol2转座子组成的组的转座酶系统将编码CAR和/或CD47的基因引入细胞中。在一些实施方案中，基因疗法载体是逆转录病毒或融合体。
在一些实施方案中，在转移到第一受试者体内后，非活化T细胞或工程化T细胞表现出选自由以下组成的组的一种或多种反应：(a)T细胞反应，(b)NK细胞反应，和(c)巨噬细胞反应，所述反应与转移到第二受试者体内后的野生型细胞相比有所降低。在一些实施方案中，第一受试者和第二受试者是不同的受试者。在一些实施方案中，巨噬细胞反应是吞噬。
在一些实施方案中，与转移到受试者体内后的野生型细胞相比，非活化T细胞或工程化T细胞在转移到受试者体内后表现出选自由以下组成的组的一项或多项：(a)受试者的TH1活化减少，(b)受试者的NK细胞杀伤减少，和(c)受试者的完整PBMC的杀伤减少。
在一些实施方案中，与转移到受试者体内后的野生型细胞相比，非活化T细胞或工程化T细胞在转移到受试者体内后引发选自由以下组成的组的一项或多项：(a)受试者的供体特异性抗体减少，(b)受试者的IgM或IgG抗体减少，和(c)受试者的补体依赖性细胞毒性(CDC)减少。
在一些实施方案中，在受试者体内用包含CD8结合剂的慢病毒载体转导非活化T细胞或工程化T细胞。在一些实施方案中，慢病毒载体携带编码CAR和/或CD47的基因。
本文提供药物组合物，其包含本公开的非活化T细胞和/或工程化T细胞群和药学上可接受的添加剂、载剂、稀释剂或赋形剂。
本文提供的方法包括向受试者施用包含本公开的非活化T细胞和/或工程化T细胞群的组合物，或一种或多种本公开的药物组合物。
在一些实施方案中，在施用组合物之前、之后和/或同时不向受试者施用T细胞活化治疗。在一些实施方案中，T细胞活化治疗包括淋巴细胞清除。
本文提供了治疗罹患癌症的受试者的方法，其包括向受试者施用包含本公开的非活化T细胞和/或工程化T细胞群的组合物，或一种或多种本公开的药物组合物，其中在施用组合物之前、之后和/或同时不向受试者施用T细胞活化治疗。在一些实施方案中，T细胞活化治疗包括淋巴细胞清除。
本文提供了用于在有需要的受试者体内扩增能够识别并杀伤所述受试者的肿瘤细胞的T细胞的方法，其包括向受试者施用包含本公开的非活化T细胞和/或工程化T细胞群的组合物，或一种或多种本公开的药物组合物，其中在施用组合物之前、之后和/或同时不向受试者施用T细胞活化治疗。在一些实施方案中，T细胞活化治疗包括淋巴细胞清除。
本文提供药物组合物，其包含本公开的非活化T细胞和/或工程化T细胞群和药学上可接受的添加剂、载剂、稀释剂或赋形剂。
本文提供的方法包括向受试者施用包含本公开的非活化T细胞和/或工程化T细胞群的组合物，或一种或多种本公开的药物组合物。
在一些实施方案中，在施用组合物之前、之后和/或同时不向受试者施用T细胞活化治疗。在一些实施方案中，T细胞活化治疗包括淋巴细胞清除。
本文提供了治疗罹患自身免疫性疾病/病症和/或炎性疾病/病症的受试者的方法，其包括向受试者施用包含本公开的非活化T细胞和/或工程化T细胞群的组合物，或一种或多种本公开的药物组合物，其中在施用组合物之前、之后和/或同时不向受试者施用T细胞活化治疗。在一些实施方案中，T细胞活化治疗包括淋巴细胞清除。
本文提供了用于在有需要的受试者体内扩增能够识别并杀伤所述受试者的肿瘤细胞的T细胞的方法，其包括向受试者施用包含本公开的非活化T细胞和/或工程化T细胞群的组合物，或一种或多种本公开的药物组合物，其中在施用组合物之前、之后和/或同时不向受试者施用T细胞活化治疗。在一些实施方案中，T细胞活化治疗包括淋巴细胞清除。
本文提供了用于治疗受试者的病状、疾病或病症的剂量方案，其包括施用包含本公开的非活化T细胞和/或工程化T细胞群的组合物，或一种或多种本公开的药物组合物，以及药学上可接受的添加剂、载剂、稀释剂或赋形剂，其中药物组合物以约1-3个治疗有效剂量施用。
本文提供了用于治疗受试者的病状、疾病或病症的剂量方案，其包括施用包含本公开的非活化T细胞和/或工程化T细胞群的组合物，或一种或多种本公开的药物组合物，以及药学上可接受的添加剂、载剂、稀释剂或赋形剂，其中药物组合物以约1-3个临床有效剂量施用。
一旦改变，本文所述的任何分子的表达的存在可以使用已知技术来测定，诸如蛋白质印迹、ELISA测定、FACS测定、其他免疫测定、逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)等。
W.诱导性多能干细胞的生成
本技术提供了产生低免疫原性多能细胞的方法。在一些实施方案中，方法包括生成多能干细胞。小鼠和人多能干细胞(通常称为iPSC；对于鼠细胞为miPSC或对于人细胞为hiPSC)的生成在本领域中通常是已知的。如本领域技术人员将理解的，有多种不同的方法用于生成iPSC。最初的诱导是使用四种转录因子Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4的病毒引入在小鼠胚胎或成年成纤维细胞中进行的；参见Takahashi和Yamanaka Cell 126:663-676(2006)，所述文献特此通过引用整体并入，特别是其中概述的技术。从那时起，已经开发了许多方法；参见Seki等人,World J.Stem Cells 7(1):116-125(2015)进行回顾，以及Lakshmipathy和Vermuri编辑,Methods in Molecular Biology:Pluripotent StemCells,Methods and Protocols,Springer 2013，所述文献特此通过引用明确地整体并入，特别是用于生成hiPSC的方法(参见例如后一篇参考文献的第3章)。
通常，iPSC通过在宿主细胞中瞬时表达一种或多种重编程因子来生成，所述重编程因子通常使用附加型载体引入。在这些条件下，少量的细胞被诱导成为iPSC(一般来讲，这一步的效率很低，因为没有使用选择标志物)。一旦细胞被“重编程”并成为多能细胞，它们就会失去附加型载体并使用内源基因产生因子。
如本领域技术人员还理解的，可以使用或被使用的重编程因子的数量可以变化。通常，当使用较少的重编程因子时，细胞转化为多能状态的效率下降，“多能性”也下降，例如，较少的重编程因子可能导致细胞不是完全多能的，而是可能只能够分化成较少的细胞类型。
在一些实施方案中，使用单个重编程因子OCT4。在其他实施方案中，使用两个重编程因子OCT4和KLF4。在其他实施方案中，使用三个重编程因子OCT4、KLF4和SOX2。在其他实施方案中，使用四个重编程因子OCT4、KLF4、SOX2和c-Myc。在其他实施方案中，可以使用选自SOKMNLT；SOX2、OCT4(POU5F1)、KLF4、MYC、NANOG、LIN28和SV40L T抗原的5、6或7个重编程因子。一般来讲，这些重编程因子基因是在附加型载体上提供的，诸如是本领域已知的和可商购获得的。
一般来讲，如本领域已知的，iPSC通过瞬时表达如本文所述的重编程因子由非多能细胞(诸如但不限于血细胞、成纤维细胞等)制成。
X.低免疫原性表型和多能性保留的测定
一旦已经生成工程化和/或低免疫原性细胞，就可如WO2016183041和WO2018132783中所述测定它们的低免疫原性和/或多能性保留。
在一些实施方案中，使用如WO2018132783的图13和图15中例示的多种技术测定低免疫原性。这些技术包括移植到同种异体宿主中和监测逃脱宿主免疫系统的低免疫原性多能细胞生长(例如畸胎瘤)。在一些情况下，低免疫原性多能细胞衍生物被转导以表达荧光素酶，然后可以使用生物发光成像进行跟踪。类似地，测试宿主动物对此类细胞的T细胞和/或B细胞反应，以确认所述细胞不在宿主动物中引起免疫反应。通过Elispot、ELISA、FACS、PCR或质谱流式细胞术(CYTOF)评估T细胞反应。使用FACS或Luminex来评估B细胞反应或抗体反应。另外或另选地，可测定细胞避免先天免疫反应(例如，NK细胞杀伤)的能力，如WO2018132783的图14和图15中通常所示。
在一些实施方案中，使用本领域技术人员认可的T细胞免疫测定(诸如T细胞增殖测定、T细胞活化测定和T细胞杀伤测定)来评价细胞的免疫原性。在一些情况下，T细胞增殖测定包括用干扰素-γ预处理细胞并将细胞与标记的T细胞共培养，并且在预先选择的时间量后测定T细胞群(或增殖的T细胞群)的存在。在一些情况下，T细胞活化测定包括将T细胞与本文概述的细胞共培养，并且确定T细胞中T细胞活化标志物的表达水平。
可以执行体内测定以评估本文概述的细胞的免疫原性。在一些实施方案中，使用同种异体人源化免疫缺陷小鼠模型来确定低免疫原性细胞的存活率和免疫原性。在一些情况下，将低免疫原性多能干细胞移植到同种异体人源化NSG-SGM3小鼠中并测定细胞排斥、细胞存活率和畸胎瘤形成。在一些情况下，植入的低免疫原性多能干细胞或其分化细胞在小鼠模型中展现出长期存活。
用于确定免疫原性(包括细胞的低免疫原性)的额外技术描述于例如Deuse等人,Nature Biotechnology,2019,37,252-258和Han等人,Proc Natl Acad Sci USA,2019,116(21),10441-10446，包括附图、附图说明和方法描述的公开内容通过引用整体并入本文。
类似地，以多种方式测试多能性保留。在一些实施方案中，通过某些多能性特异性因子的表达来测定多能性，如本文一般描述和WO2018132783的图29所示。另外或替代地，将多能细胞分化成一种或多种细胞类型作为多能性的指示。
如本领域技术人员将理解的，多能细胞中MHC I功能(当细胞来源于人细胞时为HLA I)的成功降低可使用本领域已知并且如下文所述的技术来测量；例如，使用结合HLA复合物的标记抗体的FACS技术；例如，使用与人主要组织相容性HLA I类抗原分子的α链结合的可商购获得的HLA-A、HLA-B和HLA-C抗体。
另外，可以对细胞进行测试，以确认HLA I复合物不在细胞表面上表达。这可使用如上文所讨论的一种或多种HLA细胞表面组分的抗体通过FACS分析来测定。
可以使用本领域已知的技术(诸如使用针对蛋白质的抗体的蛋白质印迹、FACS技术、RT-PCR技术等)来测量多能细胞或其衍生物中MHC II功能(当细胞来源于人细胞时，为HLA II)的成功降低。
另外，可以对细胞进行测试，以确认HLA II复合物不在细胞表面上表达。再次，这种测定如本领域已知的那样进行(例如参见WO2018132783的图21)并且通常使用基于与人HLA II类HLA-DR、DP和大多数DQ抗原结合的商业抗体的蛋白质印迹或FACS分析进行。
除了减少一种或多种HLA I和II(或MHC I和II)分子之外，本技术的工程化和/或低免疫原性细胞对巨噬细胞吞噬作用和NK细胞杀伤的易感性降低。由于TCR复合物的减少或缺乏以及一种或多种CD47转基因的表达，所得的低免疫原性细胞“逃脱”免疫巨噬细胞和先天途径。
Y.外源多核苷酸
在一些实施方案中，本文提供的工程化和/或低免疫原性细胞经遗传修饰以包含插入到低免疫原性细胞的一个或多个基因组基因座中的一种或多种外源多核苷酸。在一些实施方案中，外源多核苷酸编码感兴趣的蛋白质，例如嵌合抗原受体。可以使用任何合适的方法将外源多核苷酸插入到低免疫原性细胞的基因组基因座中，所述方法包括本文所述的基因编辑方法(例如，CRISPR/Cas系统)。
可以将外源多核苷酸插入低免疫原性细胞的任何合适的基因组基因座中。在一些实施方案中，将外源多核苷酸插入到如本文所述的安全港或靶标基因座中。合适的安全港和靶标基因座包括但不限于CCR5基因、CXCR4基因、PPP1R12C(也称为AAVS1)基因、白蛋白基因、SHS231基因座、CLYBL基因、Rosa基因(例如，ROSA26)、F3基因(也称为CD142)、MICA基因、MICB基因、LRP1基因(也称为CD91)、HMGB1基因、ABO基因、RHD基因、FUT1基因、PDGFRa基因、OLIG2基因、GFAP基因和KDM5D基因(也称为HY)。在一些实施方案中，将外源多核苷酸插入到安全港或靶标基因座的内含子、外显子或编码序列区域中。在一些实施方案中，将外源多核苷酸插入到内源基因中，其中插入导致内源基因的沉默或表达降低。在一些实施方案中，将多核苷酸插入到B2M、CIITA、TRAC、TRB、PD-1或CTLA-4基因座中。用于插入外源多核苷酸的示例性基因组基因座描述于表21中。
表21：用于插入外源多核苷酸的示例性基因组基因座
表22：Cas9指导RNA的非限制性实例
对于Cas9指导物，表23中提供了所有Cas9指导物的间隔序列，其中描述了20nt指导序列对应于独特的指导序列，并且可以是本文所述的那些中的任一种，包括例如表22中列出的那些。
表23：Cas9指导RNA
在一些实施方案中，包含外源多核苷酸的低免疫原性细胞来源于低免疫原性诱导性多能细胞(HIP)，例如，如本文所述。此类低免疫原性细胞包括例如心脏细胞、神经细胞、脑内皮细胞、多巴胺能神经元、神经胶质祖细胞、内皮细胞、甲状腺细胞、胰岛细胞(β细胞)、视网膜色素上皮细胞、NK细胞和T细胞。在一些实施方案中，包含外源多核苷酸的低免疫原性细胞是胰腺β细胞、T细胞(例如，原代T细胞)或神经胶质祖细胞。
在一些实施方案中，外源多核苷酸编码外源CD47多肽(例如，人CD47多肽)，并且将外源多肽插入到如本文所公开的安全港或靶标基因座或安全港或靶位点中，或插入到引起内源基因的沉默或表达降低的基因组基因座中。在一些实施方案中，将多核苷酸插入到B2M、CIITA、TRAC、TRB、PD1或CTLA4基因座中。
在一些实施方案中，包含外源多核苷酸的低免疫原性细胞是原代T细胞或来源于低免疫原性多能细胞(例如，低免疫原性iPSC)的T细胞。在示例性实施方案中，外源多核苷酸是嵌合抗原受体(例如，本文所述的任何CAR)。在一些实施方案中，外源多核苷酸可操作地连接至用于在低免疫原性细胞中表达外源多核苷酸的启动子。
Z.药学上可接受的载剂
在一些实施方案中，本文提供的药物组合物还包括药学上可接受的载剂。可接受的载剂、赋形剂或稳定剂在采用的剂量和浓度下对受体是无毒的，并且包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂(包括抗坏血酸和甲硫氨酸)；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；氯化苯甲烃铵、氯化苄乙氧铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；及间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)的多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白等；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，诸如钠；金属络合物(例如，Zn-蛋白络合物)；盐，诸如氯化钠；和/或非离子表面活性剂，诸如聚山梨醇酯(TWEENTM)、泊洛沙姆(PLURONICSTM)或聚乙二醇(PEG)。在一些实施方案中，药物组合物包括药学上可接受的缓冲剂(例如，中性缓冲盐水或磷酸盐缓冲盐水)。
在一些实施方案中，药物组合物包括选自由以下组成的组的一种或多种电解质基础溶液：乳酸林格氏溶液(Ringer'ssolution)、PlasmaLyte-ATM、Iscove的改进Dulbecco培养基、Normosol-RTM、Veen-DTM、和Hank平衡盐溶液(不含酚红)。这些基础溶液非常接近哺乳动物细胞外生理液体的组成。
在一些实施方案中，药物组合物包括一种或多种选自由以下组成的组的冷冻保护剂：阿拉伯半乳聚糖、甘油、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、右旋糖、葡聚糖、海藻糖、蔗糖、棉子糖、羟乙基淀粉(HES)、丙二醇、人血清白蛋白(HSA)和二甲基亚砜(DMSO)。在一些实施方案中，药学上可接受的缓冲剂是中性缓冲盐水或磷酸盐缓冲盐水。在一些实施方案中，本文提供的药物组合物包括CSB、Plasma-Lyte-ATM、HSA、DMSO和海藻糖中的一种或多种。
是一种细胞内样的优化溶液，其含有渗透剂(osmotic agent)/渗透压剂(oncotic agent)、自由基清除剂和能量源以最大程度地减少细胞凋亡、最大程度地减少局部缺血/再灌注损伤并最大限度地提高最大数量的活的功能细胞的解冻后恢复。不含血清和蛋白质，并且无免疫原性。由USP级或更高级的原料遵循cGMP制造。是用0％、2％、5％或10％ DMSO预先配制的一系列溶液。CSB是的无DMSO版本。在一些实施方案中，药物组合物包括浓度为约0-100％、5-95％、10-90％、15-85％、20-80％、30-80％、40-80％、50-80％、60-80％、70-80％、25-75％、30-70％、35-65％、40-60％或45-55％重量/重量的CSB的基础溶液。在一些实施方案中，药物组合物包括浓度为约0％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％重量/重量的CSB的基础溶液。
PlasmaLyte-ATM是一种非聚合血浆增容剂，并且含有与培养基中发现的那些类似的必需盐和营养物质，但不含有组织培养基中发现的未批准用于人体输注或在U.S.P.等级中不可用的额外成分(例如，酚红)。PlasmaLyte-ATM含有约140mEq/L的钠(Na)、约5mEq/L的钾(K)、约3mEq/L的镁(Mg)、约98mEq/L的氯(Cl)、约27mEq/L的乙酸盐和约23mEq/L的葡糖酸盐。(PlasmaLyte-ATM可从Baxter,Hyland Division,Glendale Calif.商购获得，产品号为2B2543)。在一些实施方案中，药物组合物包括浓度为约0-100％、5-95％、10-90％、15-85％、15-80％、15-75％、15-70％、15-65％、15-60％、15-55％、15-50％、15-45％、15-40％、15-35％、15-30％、15-25％、20-80％、20-75％、20-70％、20-65％、20-60％、20-55％、20-50％、20-45％、20-40％、20-35％、20-30％、25-75％、30-70％、35-65％、40-60％或45-55％重量/重量的PlasmaLyte-ATM基础溶液。在一些实施方案中，药物组合物包括浓度为约0％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％重量/重量的PlasmaLyte-ATM基础溶液。
在一些实施方案中，药物组合物包括浓度为约0-10％、0.3-9.3％、0.3-8.3％、0.3-7.3％、0.3-6.3％、0.3-5.3％、0.3-4.3％、0.3-3.3％、0.3-2.3％、0.3-1.3％、0.6-8.3％、0.9-7.3％、1.2-6.3％、1.5-5.3％、1.8-4.3％或2.1-3.3％重量/体积的人血清白蛋白(HSA)。在一些实施方案中，药物组合物包括浓度为约0％、0.3％、0.6％、0.9％、1.2％、1.5％、1.8％、2.1％、2.4％、2.7％、3.0％、3.3％、3.6％、3.9％、4.3％、4.6％、4.9％、5.3％、5.6％、5.9％、6.3％、6.6％、6.9％、7.3％、7.6％、7.9％、8.3％、8.6％、8.9％、9.3％、9.6％、9.9％或10％重量/体积的HSA。
在一些实施方案中，药物组合物包括浓度为约0-10％、0.5-9.5％、1-9％、1.5-8.5％、2-8％、3-8％、4-8％、5-8％、6-8％、7-8％、2.5-7.5％、3-7％、3.5-6.5％、4-6％或4.5-5.5％体积/体积的二甲基亚砜(DMSO)。在一些实施方案中，药物组合物包括浓度为约0％、0.25％、0.5％、0.75％、1.0％,1.25％、1.5％、1.75％、2.0％、2.25％、2.5％、2.75％、3.0％、3.25％、3.5％、3.75％、4.0％、4.25％、4.5％、4.75％、5.0％、5.25％、5.5％、5.75％、6.0％、6.25％、6.5％、6.75％、7.0％、7.25％、7.5％、7.75％、8.0％、8.25％、8.5％、8.75％、9.0％、9.25％、9.5％、9.75％或10.0％体积/体积的HSA。
在一些实施方案中，药物组合物包括浓度为约0-500mM、50-450mM、100-400mM、150-350mM或200-300mM的海藻糖。在一些实施方案中，药物组合物包括浓度为约0mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、125mM、150mM、175mM、200mM、225mM、250mM、275mM、300mM、325mM、350mM、375mM、400mM、425mM、450mM、475mM或500mM的海藻糖。
示例性药物组合物组分在表24中示出。
表24.示例性药物组合物组分。
*除PlasmaLyte之外的额外HSA。
在一些实施方案中，药物组合物包含本文所述的工程化和/或低免疫原性细胞和药学上可接受的载剂，所述载剂包含31.25％(体积/体积)Plasma-Lyte A、31.25％(体积/体积)的5％右旋糖/0.45％氯化钠、10％葡聚糖40(LMD)/5％右旋糖、20％(体积/体积)的25％人血清白蛋白(HSA)和7.5％(体积/体积)二甲基亚砜(DMSO)。
AA.制剂和剂量方案
任何治疗有效量的本文所述的细胞都可以包括在药物组合物中，这取决于所治疗的适应症。细胞的非限制性实例包括原代T细胞、从低免疫原性诱导性多能干细胞分化的T细胞以及本文所述的从低免疫原性诱导性多能干细胞分化的其他细胞。在一些实施方案中，药物组合物包括至少约1x 102、5x 102、1x 103、5x 103、1x 104、5x 104、1x 105、5x 105、1x 106、5x 106、1x 107、5x 107、1x 108、5x 108、1x 109、5x 109、1x 1010或5x 1010个细胞。在一些实施方案中，药物组合物包括至多约1x 102、5x 102、1x 103、5x 103、1x 104、5x 104、1x105、5x 105、1x 106、5x 106、1x 107、5x 107、1x 108、5x 108、1x 109、5x 109、1x 1010或5x1010个细胞。在一些实施方案中，药物组合物包括至多约6.0x 108个细胞。在一些实施方案中，药物组合物包括至多约8.0x 108个细胞。在一些实施方案中，药物组合物包括至少约1x102-5x 102、5x 102-1x 103、1x 103-5x 103、5x 103-1x 104、1x 104-5x 104、5x 104-1x 105、1x 105-5x 105、5x 105-1x 106、1x 106-5x 106、5x 106-1x 107、1x 107-5x 107、5x 107-1x108、1x 108-5x 108、5x 108-1x 109、1x 109-5x 109、5x 109-1x 1010或1x 1010-5x 1010个细胞。在示例性实施方案中，药物组合物包括约1.0x 106至约2.5x108个细胞。在某些实施方案中，药物组合物包括约2.0x 106至约2.0x 108个细胞，诸如但不限于原代T细胞、从低免疫原性诱导性多能干细胞分化的T细胞。
在一些实施方案中，药物组合物具有至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400或500ml的体积。在示例性实施方案中，药物组合物具有至多约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400或500ml的体积。在示例性实施方案中，药物组合物具有约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400或500ml的体积。在一些实施方案中，药物组合物具有约1-50ml、50-100ml、100-150ml、150-200ml、200-250ml、250-300ml、300-350ml、350-400ml、400-450ml或450-500ml的体积。在一些实施方案中，药物组合物具有约1-50ml、50-100ml、100-150ml、150-200ml、200-250ml、250-300ml、300-350ml、350-400ml、400-450ml或450-500ml的体积。在一些实施方案中，药物组合物具有约1-10ml、10-20ml、20-30ml、30-40ml、40-50ml、50-60ml、60-70ml、70-80ml、70-80ml、80-90ml或90-100ml的体积。在一些实施方案中，药物组合物具有范围为约5ml至约80ml的体积。在示例性实施方案中，药物组合物具有范围为约10ml至约70ml的体积。在某些实施方案中，药物组合物具有范围为约10ml至约50ml的体积。
具体的量/剂量方案将因以下因素而异：个体的体重、性别、年龄和健康状况；制剂、生化性质、生物活性、生物利用度和细胞的副作用以及完整治疗方案中细胞的数量和特性。
在一些实施方案中，治疗有效剂量或临床有效剂量的药物组合物包括体积为约10ml至50ml的约1.0x 105至约2.5x 108个细胞，并且药物组合物作为单一治疗有效剂量或临床有效剂量施用。在一些情况下，治疗有效剂量或临床有效剂量包括体积为约10ml至50ml的约1.0x 105至约2.5x 108个本文所述的原代T细胞。在一些情况下，治疗有效剂量或临床有效剂量包括体积为约10ml至50ml的约1.0x105至约2.5x 108个上文已经描述的原代T细胞。在各种情况下，治疗有效剂量或临床有效剂量包括体积为约10ml至50ml的约1.0x105至约2.5x 108个本文所述的从低免疫原性诱导性多能干细胞分化的T细胞。在一些实施方案中，治疗有效剂量或临床有效剂量是体积为约10ml至50ml的1.0x 105、1.1x 105、1.2x105、1.3x 105、1.4x105、1.5x 105、1.6x 105、1.7x 105、1.8x 105、1.9x 105、2.0x 105、2.1x105、2.2x 105、2.3x 105、2.4x 105、2.5x 105、1.0x 106、1.1x 106、1.2x 106、1.3x 106、1.4x106、1.5x 106、1.6x 106、1.7x 106、1.8x 106、1.9x 106、2.0x 106、2.1x 106、2.2x 106、2.3x106、2.4x 106、2.5x 106、1.0x 107、1.1x 107、1.2x 107、1.3x 107、1.4x 107、1.5x 107、1.6x107、1.7x 107、1.8x 107、1.9x 107、2.0x 107、2.1x 107、2.2x 107、2.3x 107、2.4x 107、2.5x107、1.0x 108、1.1x 108、1.2x 108、1.3x 108、1.4x 108、1.5x 108、1.6x 108、1.7x 108、1.8x108、1.9x 108、2.0x 108、2.1x 108、2.2x 108、2.3x 108、2.4x 108或2.5x 108个本文所述的从低免疫原性诱导性多能干细胞分化的T细胞。在其他情况下，治疗有效剂量或临床有效剂量的范围低于约1.0x 105至约2.5x 108个T细胞，包括原代T细胞或从低免疫原性诱导性多能干细胞分化的T细胞。在又其他情况下，治疗有效剂量或临床有效剂量的范围高于约1.0x105至约2.5x108个T细胞，包括原代T细胞和从低免疫原性诱导性多能干细胞分化的T细胞。
在一些实施方案中，药物组合物作为单一治疗有效剂量或临床有效剂量施用，所述剂量对于50kg或更轻的受试者为约1.0x 105至约1.0x 107个细胞(诸如原代T细胞和从低免疫原性诱导性多能干细胞分化的T细胞)/kg体重。在一些实施方案中，药物组合物作为单一治疗有效剂量或临床有效剂量施用，所述剂量对于50kg或更轻的受试者为约0.5x 105至约1.0x 107、约1.0x 105至约1.0x 107、约1.0x 105至约1.0x 107、约5.0x 105至约1x 107、约1.0x 106至约1x 107、约5.0x 106至约1.0x 107、约1.0x 105至约5.0x 106、约1.0x 105至约1.0x 106、约1.0x 105至约5.0x 105、约1.0x 105至约5.0x 106、约2.0x 105至约5.0x106、约3.0x 105至约5.0x 106、约4.0x 105至约5.0x 106、约5.0x 105至约5.0x 106、约6.0x105至约5.0x 106、约7.0x 105至约5.0x 106、约8.0x 105至约5.0x 106或约9.0x 105至约5.0x 106个细胞/kg体重。在一些实施方案中，对于50kg或更轻的受试者，治疗有效剂量或临床有效剂量为0.5x 105、0.6x 105、0.7x 105、0.8x 105、0.9x 105、1.0x 105、1.1x 105、1.2x 105、1.3x 105、1.4x 105、1.5x 105、1.6x 105、1.7x 105、1.8x 105、1.9x 105、2.0x105、2.1x 105、2.2x 105、2.3x 105、2.4x 105、2.5x 105、2.6x 105、2.7x 105、2.8x 105、2.9x105、3.0x 105、3.1x 105、3.2x 105、3.3x 105、3.4x 105、3.5x 105、3.6x 105、3.7x 105、3.8x105、3.9x 105、4.0x 105、4.1x 105、4.2x 105、4.3x 105、4.4x 105、4.5x 105、4.6x 105、4.7x105、4.8x 105、4.9x 105、5.0x 105、0.5x 106、0.6x 106、0.7x 106、0.8x 106、0.9x 106、1.0x106、1.1x 106、1.2x 106、1.3x 106、1.4x 106、1.5x 106、1.6x 106、1.7x 106、1.8x 106、1.9x106、2.0x 106、2.1x 106、2.2x 106、2.3x 106、2.4x 106、2.5x 106、2.6x 106、2.7x 106、2.8x106、2.9x 106、3.0x 106、3.1x 106、3.2x 106、3.3x 106、3.4x 106、3.5x 106、3.6x 106、3.7x106、3.8x 106、3.9x 106、4.0x 106、4.1x 106、4.2x 106、4.3x 106、4.4x 106、4.5x 106、4.6x106、4.7x 106、4.8x 106、4.9x 106、5.0x 106、5.1x 106、5.2x 106、5.3x 106、5.4x 106、5.5x106、5.6x 106、5.7x 106、5.8x 106、5.9x 106、6.0x 106、6.1x 106、6.2x 106、6.3x 106、6.4x106、6.5x 106、6.6x 106、6.7x 106、6.8x 106、6.9x 106、7.0x 106、7.1x 106、7.2x 106、7.3x106、7.4x 106、7.5x 106、7.6x 106、7.7x 106、7.8x 106、7.9x 106、8.0x 106、8.1x 106、8.2x106、8.3x 106、8.4x 106、8.5x 106、8.6x 106、8.7x 106、8.8x 106、8.9x 106、9.0x 106、9.1x106、9.2x 106、9.3x 106、9.4x 106、9.5x 106、9.6x 106、9.7x 106、9.8x 106、9.9x 106、0.5x107、0.6x 107、0.7x 107、0.8x 107、0.9x 107或1.0x 107个细胞/kg体重。在一些实施方案中，对于50kg或更轻的受试者，治疗有效剂量或临床有效剂量为约0.2x 106至约5.0x 106个细胞/kg体重。在某些实施方案中，对于50kg或更轻的受试者，治疗有效剂量或临床有效剂量的范围低于约0.2x 106至约5.0x 106个细胞/kg体重。或临床有效剂量在示例性实施方案中，单一治疗有效剂量或临床有效剂量的体积为约10ml至50ml。在一些实施方案中，治疗有效剂量或临床有效剂量静脉内施用。
在示例性实施方案中，细胞以单一治疗有效剂量施用，所述剂量对于超过50kg的受试者为约1.0x 106至约5.0x 108个细胞(诸如原代T细胞和从低免疫原性诱导性多能干细胞分化的T细胞)。在一些实施方案中，药物组合物作为单一治疗有效剂量或临床有效剂量施用，所述剂量对于50kg或更轻的受试者为约0.5x 106至约1.0x 109、约1.0x 106至约1.0x109、约1.0x 106至约1.0x 109、约5.0x 106至约1.0x 109、约1.0x 107至约1.0x 109、约5.0x107至约1.0x 109、约1.0x 106至约5.0x 107、约1.0x 106至约1.0x 107、约1.0x 106至约5.0x 107、约1.0x 107至约5.0x 108、约2.0x 107至约5.0x 108、约3.0x 107至约5.0x 108、约4.0x 107至约5.0x 108、约5.0x 107至约5.0x 108、约6.0x 107至约5.0x 108、约7.0x 107至约5.0x 108、约8.0x 107至约5.0x 108或约9.0x 107至约5.0x 108个细胞/kg体重。在一些实施方案中，对于50kg或更轻的受试者，治疗有效剂量或临床有效剂量为1.0x 106、1.1x106、1.2x 106、1.3x 106、1.4x 106、1.5x 106、1.6x 106、1.7x 106、1.8x 106、1.9x 106、2.0x106、2.1x 106、2.2x 106、2.3x 106、2.4x 106、2.5x 106、2.6x 106、2.7x 106、2.8x 106、2.9x106、3.0x 106、3.1x 106、3.2x 106、3.3x 106、3.4x 106、3.5x 106、3.6x 106、3.7x 106、3.8x106、3.9x 106、4.0x 106、4.1x 106、4.2x 106、4.3x 106、4.4x 106、4.5x 106、4.6x 106、4.7x106、4.8x 106、4.9x 106、5.0x 106、5.1x 106、5.2x 106、5.3x 106、5.4x 106、5.5x 106、5.6x106、5.7x 106、5.8x 106、5.9x 106、6.0x 106、6.1x 106、6.2x 106、6.3x 106、6.4x 106、6.5x106、6.6x 106、6.7x 106、6.8x 106、6.9x 106、7.0x 106、7.1x 106、7.2x 106、7.3x 106、7.4x106、7.5x 106、7.6x 106、7.7x 106、7.8x 106、7.9x 106、8.0x 106、8.1x 106、8.2x 106、8.3x106、8.4x 106、8.5x 106、8.6x 106、8.7x 106、8.8x 106、8.9x 106、9.0x 106、9.1x 106、9.2x106、9.3x 106、9.4x 106、9.5x 106、9.6x 106、9.7x 106、9.8x 106、9.9x 106、1.0x 107、1.1x107、1.2x 107、1.3x 107、1.4x 107、1.5x 107、1.6x 107、1.7x 107、1.8x 107、1.9x 107、2.0x107、2.1x 107、2.2x 107、2.3x 107、2.4x 107、2.5x 107、2.6x 107、2.7x 107、2.8x 107、2.9x107、3.0x 107、3.1x 107、3.2x 107、3.3x 107、3.4x 107、3.5x 107、3.6x 107、3.7x 107、3.8x107、3.9x 107、4.0x 107、4.1x 107、4.2x 107、4.3x 107、4.4x 107、4.5x 107、4.6x 107、4.7x107、4.8x 107、4.9x 107、5.0x 107、5.1x 107、5.2x 107、5.3x 107、5.4x 107、5.5x 107、5.6x107、5.7x 107、5.8x 107、5.9x 107、6.0x 107、6.1x 107、6.2x 107、6.3x 107、6.4x 107、6.5x107、6.6x 107、6.7x 107、6.8x 107、6.9x 107、7.0x 107、7.1x 107、7.2x 107、7.3x 107、7.4x107、7.5x 107、7.6x 107、7.7x 107、7.8x 107、7.9x 107、8.0x 107、8.1x 107、8.2x 107、8.3x107、8.4x 107、8.5x 107、8.6x 107、8.7x 107、8.8x 107、8.9x 107、9.0x 107、9.1x 107、9.2x107、9.3x 107、9.4x 107、9.5x 107、9.6x 107、9.7x 107、9.8x 107、9.9x 107、1.0x 108、1.1x108、1.2x 108、1.3x 108、1.4x 108、1.5x 108、1.6x 108、1.7x 108、1.8x 108、1.9x 108、2.0x108、2.1x 108、2.2x 108、2.3x 108、2.4x 108、2.5x 108、2.6x 108、2.7x 108、2.8x 108、2.9x108、3.0x 108、3.1x 108、3.2x 108、3.3x 108、3.4x 108、3.5x 108、3.6x 108、3.7x 108、3.8x108、3.9x 108、4.0x 108、4.1x 108、4.2x 108、4.3x 108、4.4x 108、4.5x 108、4.6x 108、4.7x108、4.8x 108、4.9x 108或5.0x 108细胞/kg体重。在某些实施方案中，细胞以单一治疗有效剂量或临床有效剂量施用，所述剂量对于超过50kg的受试者为约1.0x 107至约2.5x 108个细胞。在一些实施方案中，细胞以单一治疗有效剂量或临床有效剂量施用，对于超过50kg的受试者，所述剂量的范围小于约1.0x 107至约2.5x 108个细胞。在一些实施方案中，细胞以单一治疗有效剂量或临床有效剂量施用，对于超过50kg的受试者，所述剂量的范围高于约1.0x 107至约2.5x 108个细胞。在一些实施方案中，剂量静脉内施用。在示例性实施方案中，单一治疗有效剂量或临床有效剂量的体积为约10ml至50ml。在一些实施方案中，治疗有效剂量或临床有效剂量静脉内施用。
在示例性实施方案中，治疗有效剂量或临床有效剂量以约每分钟1至50ml、每分钟1至40ml、每分钟1至30ml、每分钟1至20ml、每分钟10至20ml、每分钟10至30ml、每分钟10至40ml、每分钟10至50ml、每分钟20至50ml、每分钟30至50ml、每分钟40至50ml的速率静脉内施用。在多个实施方案中，药物组合物储存在一个或多个输液袋中用于静脉内施用。在一些实施方案中，剂量以不超过10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、60分钟、70分钟、80分钟、90分钟、120分钟、150分钟、180分钟、240分钟或300分钟完全施用。
在一些实施方案中，单一治疗有效剂量或临床有效剂量的药物组合物存在于单个输液袋中。在其他实施方案中，将单一治疗有效剂量或临床有效剂量的药物组合物分成2、3、4或5个单独的输液袋。
在一些实施方案中，本文所述的细胞以多个剂量(诸如2、3、4、5、6或更多个剂量)施用，其中多个剂量一起构成治疗有效剂量或临床有效剂量方案。在一些实施方案中，多个剂量中的每个剂量以间隔1至24小时的范围施用于受试者。在一些情况下，后续剂量在初始剂量或先前剂量后约1小时至约24小时(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或约24小时)施用。在一些实施方案中，多个剂量中的每个剂量以间隔约1天至28天的范围施用于受试者。在一些情况下，后续剂量在初始剂量或先前剂量后约1天至约28天(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或约28天)施用。在某些实施方案中，多个剂量中的每个剂量以间隔1周至约6周的范围施用于受试者。在某些情况下，后续剂量在初始剂量或先前剂量后约1周至约6周(例如，约1、2、3、4、5或6周)施用。在若干实施方案中，多个剂量中的每个剂量以间隔约1个月至约12个月的范围施用于受试者。在若干种情况下，后续剂量在初始剂量或先前剂量后约1个月至约12个月(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月)施用。
在一些实施方案中，在第一时间点向受试者施用第一剂量方案，然后随后在第二时间点向受试者施用第二剂量方案。在一些实施方案中，第一剂量方案与第二剂量方案相同。在其他实施方案中，第一剂量方案与第二剂量方案不同。在一些情况下，第一剂量方案和第二剂量方案中的细胞数量相同。在一些情况下，第一剂量方案和第二剂量方案中的细胞数量不同。在一些情况下，第一剂量方案和第二剂量方案的剂量数相同。在一些情况下，第一剂量方案和第二剂量方案的剂量数不同。
在一些实施方案中，第一剂量方案包括表达第一CAR的低免疫(HIP)T细胞或原代T细胞，并且第二剂量方案包括表达第二CAR的低免疫(HIP)T细胞或原代T细胞，使得第一CAR和第二CAR不同。例如，第一CAR和第二CAR结合不同的靶抗原。在一些情况下，第一CAR包括结合抗原的scFv，而第二CAR包括结合不同抗原的scFv。在一些实施方案中，第一剂量方案包括表达第一CAR的低免疫(HIP)T细胞或原代T细胞，并且第二剂量方案包括表达第二CAR的低免疫(HIP)T细胞或原代T细胞，使得第一CAR和第二CAR相同。第一剂量方案可以与第二剂量方案间隔至少1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、1-3个月、1-6个月、4-6个月、3-9个月、3-12个月或更多个月施用于受试者。在一些实施方案中，在疾病(例如，自身免疫性疾病)过程期间向受试者施用多个剂量方案，并且所述剂量方案中的至少两个包含相同类型的本文所述的低免疫(HIP)T细胞或原代T细胞。在其他实施方案中，多个剂量方案中的至少两个包含不同类型的本文所述的低免疫(HIP)T细胞或原代T细胞。
在一些实施方案中，本文所述的CD19特异性(CD19)CAR-T细胞以约50x 106至约110x 106(例如，50x 106、51x 106、52x 106、53x 106、54x 106、55x 106、56x 106、57x 106、58x 106、59x 106、60x 106、61x 106、62x 106、63x 106、64x 106、65x 106、66x 106、67x 106、68x 106、69x 106、70x 106、71x 106、72x 106、73x 106、74x 106、75x 106、76x 106、77x 106、78x 106、79x 106、80x 106、81x 106、82x 106、83x 106、84x 106、85x 106、86x 106、87x 106、88x 106、89x 106、90x 106、91x 106、92x 106、93x 106、94x 106、95x 106、96x 106、97x 106、98x 106、99x 106、100x 106、101x 106、102x 106、103x 106、104x 106、105x 106、106x 106、107x 106、108x 106、109x 106或110x 106)个活CD19特异性CAR-T细胞的剂量施用于受试者。在一些实施方案中，剂量是活CD19特异性CAR-T细胞的治疗有效量。在其他实施方案中，剂量是活CD19特异性CAR-T细胞的临床有效量。在一些实施方案中，活CD19特异性CAR-T细胞包括表达CD19特异性CAR的CD4+T细胞和表达CD19特异性CAR的CD8+T细胞，其比例为约1:1。在一些实施方案中，细胞的CD19特异性CAR是利基迈仑赛其结构等同物或其功能等同物。
在一些实施方案中，向受试者施用约50x 106至约110x 106(例如，50x 106、51x106、52x 106、53x 106、54x 106、55x 106、56x 106、57x 106、58x 106、59x 106、60x 106、61x106、62x 106、63x 106、64x 106、65x 106、66x 106、67x 106、68x 106、69x 106、70x 106、71x106、72x 106、73x 106、74x 106、75x 106、76x 106、77x 106、78x 106、79x 106、80x 106、81x106、82x 106、83x 106、84x 106、85x 106、86x 106、87x 106、88x 106、89x 106、90x 106、91x106、92x 106、93x 106、94x 106、95x 106、96x 106、97x 106、98x 106、99x 106、100x 106、101x 106、102x 106、103x 106、104x 106、105x 106、106x 106、107x 106、108x 106、109x 106或110x 106)个本文所述的活CD19特异性CAR-T细胞。在一些实施方案中，剂量是活CD19特异性CAR-T细胞的治疗有效量。在其他实施方案中，剂量是活CD19特异性CAR-T细胞的临床有效量。在一些情况下，50％的活CD19特异性CAR-T细胞是表达CD19特异性CAR的CD4+T细胞，并且50％的活CD19特异性CAR-T细胞是表达CD19特异性CAR的CD8+T细胞。在一些实施方案中，细胞的CD19特异性CAR是利基迈仑赛其结构等同物或其功能等同物。
在一些实施方案中，本文所述的CD19特异性CAR-T细胞以约2x 106个/kg体重的剂量施用于受试者。在一些实施方案中，施用的最大剂量是约2x 108个活CD19特异性CAR-T细胞。在一些实施方案中，剂量是活CD19特异性CAR-T细胞的治疗有效量。在其他实施方案中，剂量是活CD19特异性CAR-T细胞的临床有效量。在一些实施方案中，细胞的CD19特异性CAR是与阿基仑赛相同的CD19特异性CAR、其结构等同物或其功能等同物。
在一些实施方案中，本文所述的CD19特异性CAR-T细胞以约2x 106个/kg体重的剂量施用于受试者。在一些实施方案中，将最大剂量的约2x 108个活CD19特异性CAR-T细胞施用于体重约100kg和更重的患者。在一些实施方案中，剂量是活CD19特异性CAR-T细胞的治疗有效量。在其他实施方案中，剂量是活CD19特异性CAR-T细胞的临床有效量。在一些实施方案中，细胞的CD19特异性CAR是与布瑞基奥仑赛相同的CD19特异性CAR、其结构等同物或其功能等同物。
在一些实施方案中，本文所述的CD19特异性CAR-T细胞以至多约2x 108个活CD19特异性CAR-T细胞的剂量施用于受试者。在一些实施方案中，对于体重约50kg或更轻的受试者，向受试者施用约0.2x 106至约5.0x 106(例如，约0.2x 106、0.4x 106、0.5x 106、0.6x106、0.8x 106、0.9x 106、1.0x 106、1.2x 106、1.4x 106、1.5x 106、1.6x 106、1.8x 106、1.9x106、2.0x 106、2.2x 106、2.4x 106、2.5x 106、2.6x 106、2.8x 106、2.9x 106、3.0x 106、3.2x106、3.4x 106、3.5x 106、3.6x 106、3.8x 106、3.9x 106、4.0x 106、4.2x 106、4.4x 106、4.5x106、4.6x 106、4.8x 106、4.9x 106或5.0x 106)个活CD19特异性CAR-T细胞/kg体重。在一些实施方案中，对于体重大于约50kg的受试者，向受试者施用约0.1x 108至约2.5x 108(例如，约0.1x 106、0.2x 106、0.4x 106、0.5x 106、0.6x 106、0.8x 106、0.9x 106、1.0x 106、1.2x106、1.4x 106、1.5x 106、1.6x 106、1.8x 106、1.9x 106、2.0x 106、2.2x 106、2.4x 106或2.5x 106)个活CD19特异性CAR-T细胞。在一些实施方案中，向受试者施用约0.6x 108至约6.0x 108(例如，约0.6x 108、0.8x 108、0.9x 108、1.0x 108、1.2x 108、1.4x 108、1.5x 108、1.6x 108、1.8x 108、1.9x 108、2.0x 108、2.2x 108、2.4x 108、2.5x 108、2.6x 108、2.8x108、2.9x 108、3.0x 108、3.2x 108、3.4x 108、3.5x 108、3.6x 108、3.8x 108、3.9x 108、4.0x108、4.2x 108、4.4x 108、4.5x 108、4.6x 108、4.8x 108、4.9x 108、5.0x 108、5.2x 108、5.4x108、5.5x 108、5.6x 108、5.8x 108、5.9x 108或6.0x 108)个活CD19特异性CAR-T细胞。在一些实施方案中，剂量是活CD19特异性CAR-T细胞的治疗有效量。在其他实施方案中，剂量是活CD19特异性CAR-T细胞的临床有效量。在一些实施方案中，细胞的CD19特异性CAR是与替沙仑赛相同的CD19特异性CAR、其结构等同物或其功能等同物。
在一些实施方案中，单剂量的本文所述的任何CD19特异性CAR-T细胞包括约50x106至约110x 106(例如，50x 106、51x 106、52x 106、53x 106、54x 106、55x 106、56x 106、57x106、58x 106、59x 106、60x 106、61x 106、62x 106、63x 106、64x 106、65x 106、66x 106、67x106、68x 106、69x 106、70x 106、71x 106、72x 106、73x 106、74x 106、75x 106、76x 106、77x106、78x 106、79x 106、80x 106、81x 106、82x 106、83x 106、84x 106、85x 106、86x 106、87x106、88x 106、89x 106、90x 106、91x 106、92x 106、93x 106、94x 106、95x 106、96x 106、97x106、98x 106、99x 106、100x 106、101x 106、102x 106、103x 106、104x 106、105x 106、106x106、107x 106、108x 106、109x 106或110x 106)个活CD19特异性CAR-T细胞。在一些实施方案中，剂量是活CD19特异性CAR-T细胞的治疗有效量。在其他实施方案中，剂量是活CD19特异性CAR-T细胞的临床有效量。在一些实施方案中，活CD19特异性CAR-T细胞包括表达CD19特异性CAR的CD4+T细胞和表达CD19特异性CAR的CD8+T细胞，其比例为约1:1。在一些实施方案中，CD19特异性CAR是与利基迈仑赛相同的CD19特异性CAR、其结构等同物或其功能等同物。
在一些实施方案中，单剂量的本文所述的任何CD19特异性CAR-T细胞包括约2x108个活CD19特异性CAR-T细胞。在一些实施方案中，本文描述的任何CD19特异性CAR-T细胞的单个输液袋包括约68mL的细胞悬浮液中的约2x 108个活CD19特异性CAR-T细胞。在一些实施方案中，CD19特异性CAR是与阿基仑赛相同的CD19特异性CAR、其结构等同物或其功能等同物。
在一些实施方案中，单剂量的本文所述的任何CD19特异性CAR-T细胞包括约2x108个活CD19特异性CAR-T细胞。在一些实施方案中，本文描述的任何CD19特异性CAR-T细胞的单个输液袋包括约68mL的细胞悬浮液中的约2x 108个活CD19特异性CAR-T细胞。在一些实施方案中，CD19特异性CAR是与布瑞基奥仑赛相同的CD19特异性CAR、其结构等同物或其功能等同物。
在一些实施方案中，对于体重50kg或更轻的受试者，单剂量的本文所述的任何CD19特异性CAR-T细胞包括约0.2x 106至约5.0x106(例如，约0.2x 106、0.3x 106、0.4x 106、0.5x 106、0.6x 106、0.7x 106、0.8x 106、0.9x 106、1.0x 106、1.1x 106、1.2x 106、1.3x106、1.4x 106、1.5x 106、1.6x 106、1.7x 106、1.8x 106、1.9x 106、2.0x 106、2.1x 106,2.2x106、2.3x 106、2.4x 106、2.5x 106、2.6x 106、2.7x 106、2.8x 106、2.9x 106、3.0x 106、3.1x106、3.2x 106、3.3x 106、3.4x 106、3.5x 106、3.6x 106、3.7x 106、3.8x 106、3.9x 106、4.0x106、4.1x 106、4.2x 106、4.3x 106、4.4x 106、4.5x 106、4.6x 106、4.7x 106、4.8x 106、4.9x106或5.0x 106)个活CD19特异性CAR-T细胞/kg体重。在一些实施方案中，对于体重大于50kg的受试者，单剂量的本文所述的任何CD19特异性CAR-T细胞包括约0.1x 108至约2.5x 108(例如，约0.1x 106、0.2x 106、0.3x 106、0.4x 106、0.5x 106、0.6x 106、0.7x 106、0.8x 106、0.9x 106、1.0x 106、1.1x 106、1.2x 106、1.3x 106、1.4x 106、1.5x 106、1.6x 106、1.7x106、1.8x 106、1.9x 106、2.0x 106、2.1x 106、2.2x 106、2.3x 106、2.4x 106或2.5x 106)个活CD19特异性CAR-T细胞/kg体重。在一些实施方案中，单剂量的本文所述的任何CD19特异性CAR-T细胞包括约0.6x 108至约6.0x 108(例如，约0.6x 108、0.7x 108、0.8x 108、0.9x108、1.0x 108、1.1x 108,1.2x 108、1.3x 108、1.4x 108、1.5x 108、1.6x 108、1.7x 108、1.8x108、1.9x 108、2.0x 108、2.1x 108、2.2x 108、2.3x 108、2.4x 108、2.5x 108、2.6x 108、2.7x108、2.8x 108、2.9x 108、3.0x 108、3.1x 108、3.2x 108、3.3x 108、3.4x 108、3.5x 108、3.6x108、3.7x 108、3.8x 108、3.9x 108、4.0x 108、4.1x 108、4.2x 108、4.3x 108、4.4x 108、4.5x108、4.6x 108、4.7x 108、4.8x 108、4.9x 108、5.0x 108、5.1x 108、5.2x 108、5.3x 108、5.4x108、5.5x 108、5.6x 108、5.7x 108、5.8x 108、5.9x 108或6.0x 108)个活CD19特异性CAR-T细胞。在一些实施方案中，本文所述的任何CD19特异性CAR-T细胞的单个输液袋包括约10mL至约50mL的细胞悬浮液中的约0.6x 108至约6.0x 108(例如，约0.6x 108、0.7x 108、0.8x108、0.9x 108、1.0x 108、1.1x 108、1.2x 108、1.3x 108、1.4x 108、1.5x 108、1.6x 108、1.7x108、1.8x 108、1.9x 108、2.0x 108、2.1x 108、2.2x 108、2.3x 108、2.4x 108、2.5x 108、2.6x108、2.7x 108、2.8x 108、2.9x 108、3.0x 108、3.1x 108、3.2x 108、3.3x 108、3.4x 108、3.5x108、3.6x 108、3.7x 108、3.8x 108、3.9x 108、4.0x 108、4.1x 108、4.2x 108、4.3x 108、4.4x108、4.5x 108、4.6x 108、4.7x 108、4.8x 108、4.9x 108、5.0x 108、5.1x 108、5.2x 108、5.3x108、5.4x 108、5.5x 108、5.6x 108、5.7x 108、5.8x 108、5.9x 108或6.0x 108)个活CD19特异性CAR-T细胞。在一些实施方案中，剂量是活CD19特异性CAR-T细胞的治疗有效量。在其他实施方案中，剂量是活CD19特异性CAR-T细胞的临床有效量。在一些实施方案中，细胞的CD19特异性CAR是与替沙仑赛相同的CD19特异性CAR、其结构等同物或其功能等同物。
在一些实施方案中，本文所述的BCMA特异性(BCMA)CAR-T细胞以约250x 106至约500x 106(例如，250x 106、255x 106、260x106、265x 106、270x 106、275x 106、280x 106、285x106、290x 106、295x 106、300x 106、305x 106、310x 106、315x 106、320x 106、325x 106、330x106、335x 106、340x 106、345x 106、350x 106、355x 106、360x 106、365x 106、370x 106、375x106、380x 106、385x 106、390x 106、395x 106、400x 106、405x 106、410x 106、415x 106、420x106、425x 106、430x 106、435x 106、440x 106、445x 106、450x 106、455x 106、460x 106、465x106、470x 106、475x 106、480x 106、485x 106、490x 106、495x 106或500x 106)个活BCMA特异性CAR-T细胞的剂量施用于受试者。在一些实施方案中，剂量是活BCMA特异性CAR-T细胞的治疗有效量。在其他实施方案中，剂量是活BCMA特异性CAR-T细胞的临床有效量。在一些实施方案中，活BCMA特异性CAR-T细胞包括表达BCMA特异性CAR的CD4+T细胞和表达BCMA特异性CAR的CD8+T细胞，其比例为约1:1。在一些实施方案中，细胞的BCMA特异性CAR是艾基维仑赛其结构等同物或其功能等同物。
在一些实施方案中，向受试者施用约250x 106至约500x 106(例如，250x 106、255x106、260x 106、265x 106、270x 106、275x 106、280x 106、285x 106、290x 106、295x 106、300x106、305x 106、310x 106、315x 106、320x 106、325x 106、330x 106、335x 106、340x 106、345x106、350x 106、355x 106、360x 106、365x 106、370x 106、375x 106、380x 106、385x 106、390x106、395x 106、400x 106、405x 106、410x 106、415x 106、420x 106、425x 106、430x 106、435x106、440x 106、445x 106、450x 106、455x 106、460x 106、465x 106、470x 106、475x 106、480x106、485x 106、490x 106、495x 106或500x 106)个本文所述的活BCMA特异性CAR-T细胞。在一些实施方案中，剂量是活BCMA特异性CAR-T细胞的治疗有效量。在其他实施方案中，剂量是活BCMA特异性CAR-T细胞的临床有效量。在一些情况下，50％的活BCMA特异性CAR-T细胞是表达BCMA特异性CAR的CD4+T细胞，并且50％的活BCMA特异性CAR-T细胞是表达BCMA特异性CAR的CD8+T细胞。在一些实施方案中，细胞的BCMA特异性CAR是艾基维仑赛其结构等同物或其功能等同物。
在一些实施方案中，本文所述的BCMA特异性CAR-T细胞以至多约5x 108个活BCMA特异性CAR-T细胞的剂量施用于受试者。在一些实施方案中，向受试者施用约2.5x 108至约5.0x 108(例如，约0.2x 108、0.4x 108、0.5x 108、0.6x 108、0.8x 108、0.9x 108、1.0x 108、1.2x 108、1.4x 108、1.5x 108、1.6x 108、1.8x 108、1.9x 108、2.0x 108、2.2x 108、2.4x108、2.5x 108、2.6x 108、2.8x 108、2.9x 108、3.0x 108、3.2x 108、3.4x 108、3.5x 108、3.6x108、3.8x 108、3.9x 108、4.0x 108、4.2x 108、4.4x 108、4.5x 108、4.6x 108、4.8x 108、4.9x108或5.0x108)个活BCMA特异性CAR-T细胞/kg体重。在一些实施方案中，剂量是活BCMA特异性CAR-T细胞的治疗有效量。在其他实施方案中，剂量是活BCMA特异性CAR-T细胞的临床有效量。在一些实施方案中，细胞的BCMA特异性CAR是与艾基维仑赛相同的BCMA特异性CAR、其结构等同物或其功能等同物。
在一些实施方案中，单剂量的本文所述的任何BCMA特异性CAR-T细胞包括约250x106至约500x 106(例如，250x 106、255x106、260x 106、265x 106、270x 106、275x 106、280x106、285x 106、290x 106、295x 106、300x 106、305x 106、310x 106、315x 106、320x 106、325x106、330x 106、335x 106、340x 106、345x 106、350x 106、355x 106、360x 106、365x 106、370x106、375x 106、380x 106、385x 106、390x 106、395x 106、400x 106、405x 106、410x 106、415x106、420x 106、425x 106、430x 106、435x 106、440x 106、445x 106、450x 106、455x 106、460x106、465x 106、470x 106、475x 106、480x 106、485x 106、490x 106、495x 106或500x 106)个活BCMA特异性CAR-T细胞。在一些实施方案中，剂量是活BCMA特异性CAR-T细胞的治疗有效量。在其他实施方案中，剂量是活BCMA特异性CAR-T细胞的临床有效量。在一些实施方案中，活BCMA特异性CAR-T细胞包括表达BCMA特异性CAR的CD4+T细胞和表达BCMA特异性CAR的CD8+T细胞，其比例为约1:1。在一些实施方案中，BCMA特异性CAR是与艾基维仑赛相同的BCMA特异性CAR、其结构等同物或其功能等同物。
在一些实施方案中，单剂量的本文所述的任何BCMA特异性CAR-T细胞包括约250x106至约500x 106(例如，250x 106、255x106、260x 106、265x 106、270x 106、275x 106、280x106、285x 106、290x 106、295x 106、300x 106、305x 106、310x 106、315x 106、320x 106、325x106、330x 106、335x 106、340x 106、345x 106、350x 106、355x 106、360x 106、365x 106、370x106、375x 106、380x 106、385x 106、390x 106、395x 106、400x 106、405x 106、410x 106、415x106、420x 106、425x 106、430x 106、435x 106、440x 106、445x 106、450x 106、455x 106、460x106、465x 106、470x 106、475x 106、480x 106、485x 106、490x 106、495x 106或500x 106)个活BCMA特异性CAR-T细胞/kg体重。在一些实施方案中，单剂量的本文所述的任何BCMA特异性CAR-T细胞包括约2.5x 108至约5.0x 108(例如，约0.2x 108、0.4x 108、0.5x 108、0.6x108、0.8x 108、0.9x 108、1.0x 108、1.2x 108、1.4x 108、1.5x 108、1.6x 108、1.8x 108、1.9x108、2.0x 108、2.2x 108、2.4x 108、2.5x 108、2.6x 108、2.8x 108、2.9x 108、3.0x 108、3.2x108、3.4x 108、3.5x 108、3.6x 108、3.8x 108、3.9x 108、4.0x 108、4.2x 108、4.4x 108、4.5x108、4.6x 108、4.8x 108、4.9x 108或5.0x 108)个活BCMA特异性CAR-T细胞/kg体重。在一些实施方案中，单剂量的本文所述的任何BCMA特异性CAR-T细胞包括约2.5x 108至约5.0x108(例如，约0.2x 108、0.4x 108、0.5x 108、0.6x 108、0.8x 108、0.9x 108、1.0x 108、1.2x 108、1.4x 108、1.5x 108、1.6x 108、1.8x 108、1.9x 108、2.0x 108、2.2x 108、2.4x 108、2.5x108、2.6x 108、2.8x 108、2.9x 108、3.0x 108、3.2x 108、3.4x 108、3.5x 108、3.6x 108、3.8x108、3.9x 108、4.0x 108、4.2x 108、4.4x 108、4.5x 108、4.6x 108、4.8x 108、4.9x 108或5.0x 108)个活BCMA特异性CAR-T细胞。在一些实施方案中，本文所述的任何BCMA特异性CAR-T细胞的单个输液袋包括约10mL至约500mL的细胞悬浮液中的约2.5x 108至约5.0x 108(例如，约0.2x 108、0.4x 108、0.5x 108、0.6x 108、0.8x 108、0.9x 108、1.0x 108、1.2x 108、1.4x 108、1.5x 108、1.6x 108、1.8x 108、1.9x 108、2.0x 108、2.2x 108、2.4x 108、2.5x108、2.6x 108、2.8x 108、2.9x 108、3.0x 108、3.2x 108、3.4x 108、3.5x 108、3.6x 108、3.8x108、3.9x 108、4.0x 108、4.2x 108、4.4x 108、4.5x 108、4.6x 108、4.8x 108、4.9x 108或5.0x 108)个活BCMA特异性CAR-T细胞。在一些实施方案中，细胞悬浮液为约50mL、250mL或约500mL。在一些实施方案中，剂量是活BCMA特异性CAR-T细胞的治疗有效量。在其他实施方案中，剂量是活BCMA特异性CAR-T细胞的临床有效量。在一些实施方案中，细胞的BCMA特异性CAR是与艾基维仑赛相同的BCMA特异性CAR、其结构等同物或其功能等同物。
BB.用于施用低免疫原性细胞(包括T细胞)的方法
如本文进一步详细描述的，本文提供了通过施用低免疫原性细胞(特别是低免疫原性T细胞)来治疗患有病状、病症或病症的患者的方法。应当理解，对于本文所述的与疗法的时间安排和/或组合相关的所有多个实施方案，细胞的施用是通过导致所引入的细胞至少部分定位于期望部位的方法或途径来完成的。可以将细胞直接输注、植入或移植到期望的部位，或通过任何适当的途径施用，所述途径导致递送至受试者的期望位置，植入的细胞或细胞组分中的至少一部分在所述位置中保持活性。
本文提供了用于治疗患有病状、病症或病症的患者的方法，包括向受试者(例如人类患者)施用低免疫原性细胞群(例如，原代T细胞、从低免疫原性诱导性多能干细胞分化的T细胞，或从本文所述低免疫原性诱导性多能干细胞分化的其他细胞)。例如，向患者施用低免疫原性原代T细胞群，诸如但不限于CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、未致敏T细胞、调控性T(Treg)细胞、非调控性T细胞、Th1细胞、Th2细胞、Th9细胞、Th17细胞、T滤泡辅助(Tfh)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、效应T(Teff)细胞、中央记忆T(Tcm)细胞、效应记忆T(Tem)细胞、表达CD45RA的效应记忆T细胞(TEMRA细胞)、组织驻留记忆(Trm)细胞、虚拟记忆T细胞、先天记忆T细胞、记忆干细胞(Tsc)、γδT细胞和T细胞的任何其他亚型，以治疗病状、病症或病症。在一些实施方案中，在施用低免疫原性细胞群之前，不向患者施用免疫抑制剂和/或免疫调节剂(诸如但不限于淋巴细胞清除剂)。在一些实施方案中，在施用细胞前至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14天或更多天施用免疫抑制剂和/或免疫调节剂。在一些实施方案中，在施用细胞前至少1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周或更多周施用免疫抑制剂和/或免疫调节剂。在多个实施方案中，在施用细胞后不向患者施用免疫抑制剂和/或免疫调节剂，或者在施用细胞后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14天施用免疫抑制剂和/或免疫调节剂。在一些实施方案中，在施用细胞后至少1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周或更多周施用免疫抑制剂和/或免疫调节剂。在一些实施方案中，其中免疫抑制剂和/或免疫调节剂在施用细胞之前或之后向患者施用，施用的剂量低于具有一种或多种MHC I和/或MHC II分子表达且无外源CD47表达的细胞所需的剂量。
免疫抑制剂和/或免疫调节剂(诸如但不限于淋巴细胞耗竭剂)的非限制性实例包括环孢菌素(cyclosporine)、硫唑嘌呤(azathioprine)、麦考酚酸(mycophenolic acid)、霉酚酸酯(mycophenolate mofetil)、皮质类固醇，诸如泼尼松(prednisone)、甲氨蝶呤、金盐、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)、抗疟药、布喹那(brequinar)、来氟米特(leflunomide)、咪唑立宾(mizoribine)、15-脱氧精胍菌素、6-巯基嘌呤、环磷酰胺、雷帕霉素(rapamycin)、他克莫司(tacrolimus)(FK-506)、OKT3、抗胸腺细胞球蛋白、胸腺五肽、胸腺肽-α和类似剂。在一些实施方案中，免疫抑制剂和/或免疫调节剂选自由以下组成的免疫抑制抗体组：与IL-2受体的p75结合的抗体、与例如MHC、CD2、CD3、CD4、CD7、CD28、B7、CD40、CD45、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-5、IL-6R、IL-6、IGF、IGFR1、IL-7、IL-8、IL-10、CD11a或CD58结合的抗体、以及与其任何配体结合的抗体。在一些实施方案中，此类免疫抑制剂和/或免疫调节剂可选自可溶性IL-15R、IL-10、B7分子(例如，B7-1、B7-2、其变体及其片段)、ICOS和OX40、负性T细胞调控子的抑制剂(诸如针对CTLA-4的抗体)和类似的剂。
在一些实施方案中，其中免疫抑制剂和/或免疫调节剂在施用细胞之前或之后向患者施用，施用的剂量低于具有一种或多种MHC I和/或MHC II分子表达、TCR表达且无外源CD47表达的细胞所需的剂量。在一些实施方案中，其中免疫抑制剂和/或免疫调节剂在第一次施用细胞之前或之后向患者施用，施用的剂量低于具有一种或多种MHC I和/或MHC II分子表达、TCR表达且无外源CD47表达的细胞所需的剂量。
在一些实施方案中，将所述细胞与治疗剂共同施用，所述治疗剂与选自由以下组成的组的一种或多种受体结合和/或相互作用：CD94、KIR2DL4、PD-1、抑制性NK细胞受体和活化NK受体。在一些情况下，治疗剂与NK细胞(包括NK细胞的一个或多个亚群)表面的受体结合。在一些实施方案中，治疗剂选自由以下组成的组：抗体及其片段和变体、抗体模拟物、小分子、阻断肽和受体拮抗剂。
对于治疗应用，根据所公开的方法制备的细胞通常可以以包含等渗赋形剂的药物组合物的形式提供，并且在对人体施用足够无菌的条件下制备。对于细胞组合物的药物制剂的一般原则，参见"Cell Therapy:Stem Cell Transplantation,Gene Therapy,andCellular Immunotherapy,"Morstyn和Sheridan编辑,Cambridge University Press,1996；和"Hematopoietic Stem Cell Therapy,"E.D.Ball、J.Lister和P.Law,ChurchillLivingstone,2000。可以将细胞包装在适合分配或临床使用的装置或容器中。
在一些实施方案中，本文所述的细胞禁忌用于已知对鼠蛋白、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞蛋白或本文所述的组合物的任何组分具有I型超敏反应或过敏反应的患者。在一些实施方案中，本文所述的细胞禁忌用于患有或已经患有进行性多灶性脑白质病(PML)的患者。在一些实施方案中，本文所述的细胞不推荐用于患有严重、活动性感染的患者。
在一些实施方案中，将本文所述的细胞施用于先前已用利妥昔单抗治疗的患有自身免疫性疾病/病症和/或炎性疾病/病症的受试者。在一些实施方案中，将本文所述的细胞施用于先前已用利妥昔单抗治疗并且利妥昔单抗治疗失败和/或无反应的患有自身免疫性疾病/病症和/或炎性疾病/病症的受试者。在一些实施方案中，患者患有类风湿性关节炎(RA)。在一些实施方案中，患者患有RA并且利妥昔单抗治疗与甲氨蝶呤组合。在一些实施方案中，患者是患有中度至重度活动性RA的成年患者。在一些实施方案中，患者是患有中度至重度活动性RA的成年患者，并且利妥昔单抗治疗与甲氨蝶呤组合。在一些实施方案中，患者是患有中度至重度活动性RA的成年患者，其对一种或多种TNF拮抗剂疗法反应不足，并且利妥昔单抗治疗与甲氨蝶呤组合。在一些实施方案中，与甲氨蝶呤组合的用于RA的利妥昔单抗剂量是每24周和/或基于临床评估但不短于每16周间隔2周(一个疗程)两次1000mg静脉输注。在一些实施方案中，推荐在每次输注前30分钟静脉注射甲泼尼龙100mg或等效糖皮质激素。
在一些实施方案中，将本文所述的细胞施用于先前已用利妥昔单抗治疗的患有自身免疫性疾病/病症和/或炎性疾病/病症的受试者。在一些实施方案中，将本文所述的细胞施用于先前已用利妥昔单抗治疗并且利妥昔单抗治疗失败和/或无反应的患有自身免疫性疾病/病症和/或炎性疾病/病症的受试者。在一些实施方案中，专利具有肉芽肿性多血管炎(GPA)(韦格纳肉芽肿)。在一些实施方案中，专利具有与糖皮质激素组合的成年患者的显微镜下多血管炎(MPA)。在一些实施方案中，GPA和MPA与糖皮质激素组合的利妥昔单抗剂量为375mg/m2，每周一次，持续4周。在一些实施方案中，利妥昔单抗作为一次性小瓶中的100mg/10mL溶液施用。在一些实施方案中，利妥昔单抗作为一次性小瓶中的500mg/50mL溶液施用。
CC.用于检测抗体存在的方法
在一些实施方案中，对来自患者的生物样品进行测定以确定样品是否包含针对一种或多种Y染色体基因的抗体。
检测生物样品中的抗体的方法是本领域众所周知的。在一些实施方案中，使用本领域任何成熟的方法(诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)、核酸和测试、蛋白质印迹等)从自患者获得的生物样品中检测抗Y-连锁原钙粘蛋白11抗体和/或抗Y-连锁神经连接蛋白4抗体。
在一些实施方案中，生物样品是从患者获得的血浆样品、外周血样品、尿液样品、痰/唾液样品或血清样品。
在一些实施方案中，所述方法用于确定施用于患有将受益于基于细胞的疗法的疾病或病状的患者的适当的基于细胞的疗法。在一些实施方案中，所述方法用于鉴定患有将受益于基于细胞的疗法的疾病或病状的患者，所述基于细胞的疗法包括降低的一种或多种Y染色体基因的表达。在一些实施方案中，所述方法用于确定不包括降低的Y-连锁原钙粘蛋白11和/或Y-连锁神经连接蛋白4的表达的基于细胞的疗法在施用于患者后是否易受NK介导的细胞毒性影响。在一些实施方案中，所述方法用于确定不包括降低的Y-连锁原钙粘蛋白11和/或Y-连锁神经连接蛋白4的表达的基于细胞的疗法在施用于患者后是否易被成熟NK细胞裂解。在一些实施方案中，所述方法用于确定不包括降低的Y-连锁原钙粘蛋白11和/或Y-连锁神经连接蛋白4的表达的基于细胞的疗法在施用于患者后是否易受巨噬细胞吞噬影响。在一些实施方案中，所述方法用于确定不包括降低的Y-连锁原钙粘蛋白11和/或Y-连锁神经连接蛋白4的表达的基于细胞的疗法在施用于患者后是否易受诱导的免疫反应影响。在一些实施方案中，所述方法用于确定不包括降低的Y-连锁原钙粘蛋白11和/或Y-连锁神经连接蛋白4的表达的基于细胞的疗法在施用于患者后是否易受诱导的基于抗体的免疫反应影响。在一些实施方案中，所述方法用于治疗患有将受益于基于细胞的疗法的疾病或病状的患者的方法中。
在一些实施方案中，所述方法包括：(a)通过以下方式确定来自患者的生物样品是否包含针对一种或多种Y染色体基因的抗体：(i)从患者获得或已经获得生物样品；(ii)进行或已经进行测定以确定生物样品中是否存在针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体；以及(iii)进行或已经进行测定以确定生物样品中是否存在针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体；和(b)向患者施用如权利要求1-50中任一项所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞、胰岛细胞、心肌细胞或神经胶质祖细胞群，其中：(i)如果生物样品中存在针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体，那么细胞群包含降低的Y-连锁原钙粘蛋白11的表达；(ii)如果生物样品中存在针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体，那么细胞群包含降低的Y-连锁神经连接蛋白4的表达；(iii)如果生物样品中存在针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体和针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体，那么细胞群包含降低的Y-连锁原钙粘蛋白11和Y-连锁神经连接蛋白4的表达；(iv)如果生物样品中既不存在针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体，也不存在针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体，那么细胞群不包含降低的Y-连锁原钙粘蛋白11或Y-连锁神经连接蛋白4的表达。
IV.实施例
实施例1：原钙粘蛋白-Y和神经连接蛋白-Y在iPSC和T细胞上的表达
iPSC
为了确定原钙粘蛋白-Y和/或神经连接蛋白-Y是否在iPSC上表达，使用标准技术分析来源于雄性恒河猴的iPSC的原钙粘蛋白-Y和神经连接蛋白-Y表达。通过流式细胞术(使用标准方法)分析iPSC。来源于人类女性的iPSC作为对照。
用抗Fc受体抗体封闭细胞，并用与同种型对照浓度匹配的抗原钙粘蛋白-Y抗体或抗神经连接蛋白-Y抗体染色。如图1A和1B所示，原钙粘蛋白-Y和神经连接蛋白-Y均在来源于男性供体的iPSC上表达。原钙粘蛋白-Y和神经连接蛋白-Y在来源于女性供体的iPSC上均不表达。
不受理论的束缚，原钙粘蛋白-Y和神经连接蛋白-Y在iPSC上表达这一令人惊讶的发现表明Y染色体编码的抗原可在女性受体中被识别为外来抗原，导致T细胞和B细胞活化。
T细胞
为了确定原钙粘蛋白-Y和/或神经连接蛋白-Y是否在T细胞上表达，对来自5名男性供体的T细胞进行CD3表达分选以生成CD3+群体，并且使用标准技术分析CD3+T细胞的原钙粘蛋白-Y和神经连接蛋白-Y表达。解冻后通过流式细胞术(使用标准方法)分析T细胞。来自两名女性供体的CD3+T细胞作为对照。
用抗Fc受体抗体封闭细胞，并用与同种型对照浓度匹配的抗原钙粘蛋白-Y抗体或抗神经连接蛋白-Y抗体染色。如图2A、2B和2C所示，原钙粘蛋白-Y和神经连接蛋白-Y均在来源于男性供体的T细胞上表达。原钙粘蛋白-Y和神经连接蛋白-Y在来源于女性供体的T细胞上均不表达。
不受理论的束缚，原钙粘蛋白-Y和神经连接蛋白-Y在T细胞上表达这一令人惊讶的发现表明Y染色体编码的抗原可在女性受体中被识别为外来抗原，导致T细胞和B细胞活化。
ADCC(抗体依赖性细胞毒性)和CDC(补体依赖性细胞毒性)
将男性HIP T细胞(＝HLA-I/II KO；CD47 KI)与来自男性、女性、怀女孩后的女性和怀男孩后的女性的血清一起孵育。使用Xcelligence细胞杀伤测定分析CDC和ADCC机制对HIP T细胞的杀伤。
如图3至5所示，男性来源的HIP T细胞被NK细胞和来自具有抗H-Y抗体的女性(即因先前怀男孩而不是女孩而致敏的女性)的血清中的CDC杀伤。

Claims (236)

1.一种工程化细胞，所述工程化细胞包含相对于未改变或未修饰的野生型或对照细胞降低的一种或多种Y染色体基因以及主要组织相容性复合物(MHC)I类和/或II类人白细胞抗原分子的表达和编码CD47的第一外源多核苷酸，其中所述工程化细胞由原代T细胞或其后代繁殖，或来源于诱导性多能干细胞(iPSC)或其后代。
2.一种低免疫原性T细胞，所述低免疫原性T细胞包含相对于未改变或未修饰的野生型或对照细胞降低的一种或多种Y染色体基因以及MHC I类和/或II类人白细胞抗原分子的表达和编码CD47的第一外源多核苷酸，其中所述低免疫原性T细胞由原代T细胞或其后代繁殖，或来源于iPSC或其后代。
3.一种非活化T细胞，所述非活化T细胞包含相对于未改变或未修饰的野生型或对照细胞降低的一种或多种Y染色体基因以及MHC I类和/或II类人白细胞抗原分子的表达和编码CD47的第一外源多核苷酸，其中所述非活化T细胞由原代T细胞或其后代繁殖，或来源于iPSC或其后代。
4.一种胰岛细胞，所述胰岛细胞包含相对于未改变或未修饰的野生型或对照细胞降低的一种或多种Y染色体基因以及MHC I类和/或II类人白细胞抗原分子的表达和编码CD47的第一外源多核苷酸，其中所述胰岛细胞来源于iPSC或其后代。
5.一种心肌细胞，所述心肌细胞包含相对于未改变或未修饰的野生型或对照细胞降低的一种或多种Y染色体基因以及MHC I类和/或II类人白细胞抗原分子的表达和编码CD47的第一外源多核苷酸，其中所述心肌细胞来源于iPSC或其后代。
6.一种神经胶质祖细胞，所述神经胶质祖细胞包含相对于未改变或未修饰的野生型或对照细胞降低的一种或多种Y染色体基因以及MHC I类和/或II类人白细胞抗原分子的表达和编码CD47的第一外源多核苷酸，其中所述心肌细胞来源于iPSC或其后代。
7.一种NK细胞，所述NK细胞包含相对于未改变或未修饰的野生型或对照细胞降低的一种或多种Y染色体基因以及MHC I类和/或II类人白细胞抗原分子的表达和编码CD47的第一外源多核苷酸，其中所述心肌细胞来源于iPSC或其后代。
8.如权利要求1-7中任一项所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞、胰岛细胞、心肌细胞、神经胶质祖细胞或NK细胞，其中所述Y染色体基因是Y染色体连锁抗原或与Y染色体相关的次要组织相容性抗原。
9.如权利要求8所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞、胰岛细胞、心肌细胞、神经胶质祖细胞或NK细胞，其中所述一种或多种Y染色体连锁抗原是Y-连锁原钙粘蛋白11和/或Y-连锁神经连接蛋白4。
10.如权利要求1-9中任一项所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞、胰岛细胞、心肌细胞、神经胶质祖细胞或NK细胞，其中所述细胞具有降低的Y-连锁原钙粘蛋白11的表达。
11.如权利要求1-10中任一项所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞、胰岛细胞、心肌细胞、神经胶质祖细胞或NK细胞，其中所述细胞具有降低的Y-连锁神经连接蛋白4的表达。
12.如权利要求1-11中任一项所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞、胰岛细胞、心肌细胞、神经胶质祖细胞或NK细胞，其中所述细胞具有降低的Y-连锁原钙粘蛋白11的表达和降低的Y-连锁神经连接蛋白4的表达。
13.如权利要求1-12中任一项所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞、胰岛细胞、心肌细胞、神经胶质祖细胞或NK细胞，其中所述细胞被基因工程化以具有降低的Y-连锁原钙粘蛋白11和/或Y-连锁神经连接蛋白4的表达。
14.如权利要求1-13中任一项所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞、胰岛细胞、心肌细胞、神经胶质祖细胞或NK细胞，其中所述细胞不表达Y-连锁原钙粘蛋白11。
15.如权利要求1-14中任一项所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞、胰岛细胞、心肌细胞、神经胶质祖细胞或NK细胞，其中所述细胞不表达Y-连锁神经连接蛋白4。
16.如权利要求1-15中任一项所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞、胰岛细胞、心肌细胞、神经胶质祖细胞或NK细胞，其中所述细胞不表达Y-连锁原钙粘蛋白11并且不表达Y-连锁神经连接蛋白4。
17.如权利要求1-16中任一项所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞、胰岛细胞、心肌细胞、神经胶质祖细胞或NK细胞，其中所述细胞被基因工程化以不表达Y-连锁原钙粘蛋白11和/或Y-连锁神经连接蛋白4。
18.如权利要求1-17中任一项所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞、胰岛细胞、心肌细胞、神经胶质祖细胞执行NK细胞，其中降低的Y-连锁原钙粘蛋白11和/或Y-连锁神经连接蛋白4的表达分别由PCDH11Y和/或NLGN4Y基因的敲除引起。
19.如权利要求1-18中任一项所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞、胰岛细胞、心肌细胞、神经胶质祖细胞或NK细胞，其中所述细胞来源于人细胞或动物细胞。
20.如权利要求19所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞、胰岛细胞、心肌细胞、神经胶质祖细胞或NK细胞，其中所述人细胞或动物细胞来自不具有Y染色体的供体受试者。
21.如权利要求19所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞、胰岛细胞、心肌细胞、神经胶质祖细胞或NK细胞，其中所述人细胞或动物细胞来自具有Y染色体的供体受试者，并且其中所述细胞被基因工程化以具有降低的Y-连锁原钙粘蛋白11和/或Y-连锁神经连接蛋白4的表达。
22.如权利要求21所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞、胰岛细胞、心肌细胞、神经胶质祖细胞或NK细胞，其中所述细胞被基因工程化以不表达Y-连锁原钙粘蛋白11。
23.如权利要求21所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞、胰岛细胞、心肌细胞、神经胶质祖细胞或NK细胞，其中所述细胞被基因工程化以不表达Y-连锁神经连接蛋白4。
24.如权利要求21所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞、胰岛细胞、心肌细胞、神经胶质祖细胞或NK细胞，其中所述细胞被基因工程化以不表达Y-连锁原钙粘蛋白11且不表达Y-连锁神经连接蛋白4。
25.如权利要求1-24中任一项所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞、胰岛细胞、心肌细胞、神经胶质祖细胞或NK细胞，其中所述细胞繁殖自或来源于从一名或多名不同于所述患者的供体受试者分离的细胞池，其中所述一名或多名供体受试者任选地包括一名或多名具有Y染色体的受试者；一名或多名不具有Y染色体的受试者；或具有Y染色体的受试者和不具有Y染色体的受试者的混合体。
26.如权利要求1-25中任一项所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞、胰岛细胞、心肌细胞、神经胶质祖细胞或NK细胞，其中使用CRISPR/Cas基因编辑基因工程化所述细胞以具有降低的Y-连锁原钙粘蛋白11和/或Y-连锁神经连接蛋白4的表达。
27.如权利要求26所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞、胰岛细胞、心肌细胞、神经胶质祖细胞或NK细胞，其中使用包含表2至表5的任何序列的一种或多种指导RNA进行所述CRISPR/Cas基因编辑。
28.如权利要求1-27中任一项所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞、胰岛细胞、心肌细胞、神经胶质祖细胞或NK细胞，其中使用选自由Cas9、Cas12a和Cas12b组成的组的Cas效应蛋白进行所述CRISPR/Cas基因编辑。
29.如权利要求28所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞、胰岛细胞、心肌细胞、神经胶质祖细胞或NK细胞，其中使用选自由以下组成的组的Cas效应蛋白进行所述CRISPR/Cas基因编辑：
a.任选地选自由Cas3、Cas8a、Cas5、Cas8b、Cas8c、Cas10d、Cse1、Cse2、Csy1、Csy2、Csy3和GSU0054组成的组；
b.任选地选自由Cas9、Csn2和Cas4组成的组；
c.任选地选自由Cas10、Csm2、Cmr5、Cas10、Csx11和Csx10组成的组；
d.任选地Csf1；
e.任选地选自由Cas12a、Cas12b、Cas12c、C2c4、C2c8、C2c5、C2c10、C2c9、CasX(Cas12e)和CasY(Cas12d)组成的组；以及
f.任选地选自由Cas13、Cas13a、C2c2、Cas13b、Cas13c和Cas13d组成的组。
30.如权利要求26-29中任一项所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞、胰岛细胞、心肌细胞、神经胶质祖细胞或NK细胞，其中所述CRISPR/Cas基因编辑是从供体受试者离体进行的。
31.如权利要求30所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞、胰岛细胞、心肌细胞、神经胶质祖细胞或NK细胞，其中使用慢病毒载体进行所述CRISPR/Cas基因编辑。
32.如权利要求1-31中任一项所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞、胰岛细胞、心肌细胞、神经胶质祖细胞或NK细胞，其中所述细胞包含相对于未改变或未修饰的野生型或对照细胞降低的β-2-微球蛋白(B2M)和/或MHC II类反式活化因子(CIITA)的表达。
33.如权利要求32所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞、胰岛细胞、心肌细胞、神经胶质祖细胞或NK细胞，其中所述细胞不表达B2M和/或CIITA。
34.如权利要求1-33中任一项所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞、胰岛细胞、心肌细胞、神经胶质祖细胞或NK细胞，其中所述细胞包含降低的RHD的表达。
35.如权利要求34所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞、胰岛细胞、心肌细胞、神经胶质祖细胞或NK细胞，其中所述细胞不表达RHD。
36.如权利要求1-35中任一项所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞、胰岛细胞、心肌细胞、神经胶质祖细胞或NK细胞，其中所述细胞是来源于诱导性多能干细胞或其后代的分化细胞。
37.如权利要求36所述的工程化细胞，其中所述分化细胞选自由以下组成的组：T细胞、NK细胞、内皮细胞、胰岛细胞、心肌细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、肝细胞、神经胶质祖细胞、多巴胺能神经元、视网膜色素上皮细胞和甲状腺细胞。
38.如权利要求1-37中任一项所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞、胰岛细胞、心肌细胞、神经胶质祖细胞或NK细胞，其中所述细胞是原代免疫细胞或其后代。
39.如权利要求38所述的工程化细胞，其中所述原代免疫细胞或其后代是T细胞或NK细胞。
40.如权利要求1-39中任一项所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞或非活化T细胞，其中所述细胞包含降低的TCR-α和/或TCR-β的表达。
41.如权利要求40所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞或非活化T细胞，其中所述细胞不表达TCR-α和/或TCR-β。
42.如权利要求1-41中任一项所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞或NK细胞，其中所述细胞还包含编码一种或多种嵌合抗原受体(CAR)的第二外源多核苷酸，其中所述一种或多种CAR包含对CD19、CD20、CD22或BCMA具有特异性的胞外配体结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和胞内信号传导结构域。
43.如权利要求42所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞或NK细胞，其中所述一种或多种CAR包含CD8α铰链结构域、CD28铰链结构域或IgG4铰链结构域。
44.如权利要求43所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞或NK细胞，其中所述一种或多种CAR包含具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CD8α铰链结构域。
45.如权利要求43所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞或NK细胞，其中所述一种或多种CAR包含具有SEQ ID NO:10或113的氨基酸序列的CD28铰链结构域。
46.如权利要求43所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞或NK细胞，其中所述一种或多种CAR包含具有SEQ ID NO:11或12的氨基酸序列的IgG4铰链结构域。
47.如权利要求42-46中任一项所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞或NK细胞，其中所述一种或多种CAR包含CD8α跨膜结构域或CD28跨膜结构域。
48.如权利要求47所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞或NK细胞，其中所述一种或多种CAR包含具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CD8α跨膜结构域。
49.如权利要求47所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞或NK细胞，其中所述一种或多种CAR包含具有SEQ ID NO:15或114的氨基酸序列的CD28跨膜结构域。
50.如权利要求42-49中任一项所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞或NK细胞，其中所述一种或多种CAR包含4-1BB共刺激结构域、CD28共刺激结构域或CD3ζ信号传导结构域。
51.如权利要求50所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞或NK细胞，其中所述一种或多种CAR包含具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的4-1BB共刺激结构域。
52.如权利要求50所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞或NK细胞，其中所述一种或多种CAR包含具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CD28共刺激结构域。
53.如权利要求50所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞或NK细胞，其中所述一种或多种CAR包含具有SEQ IDNO:18或115的氨基酸序列的CD3ζ信号传导结构域。
54.如权利要求42-53中任一项所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞或NK细胞，其中所述一种或多种CAR包含胞外配体结合结构域，所述胞外配体结合结构域包含SEQ ID NO:19、37、45、54、63、72、81或118中任一个的scFv序列，或其中所述CAR具有包含SEQ ID NO:20、25、38、42、46、50、64、68、73、77、119或123中任一个的重链和轻链序列的scFv序列。
55.如权利要求42-54中任一项所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞或NK细胞，其中所述一种或多种CAR具有SEQ ID NO:32、34、36、117或128中任一个的序列。
56.如权利要求42-55中任一项所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞或NK细胞，其中所述一种或多种CAR包含SEQ ID NO:117中列出的氨基酸序列或与所述SEQ IDNO:117中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列，所述一种或多种CAR具有以下组分：CD8α信号肽、FMC63 scFv(VL-Whitlow接头-VH)、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域。
57.如权利要求42-55中任一项所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞或NK细胞，其中所述一种或多种CAR包含SEQ ID NO:45中列出的氨基酸序列或与所述SEQ IDNO:45中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列。
58.如权利要求1-57中任一项所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、NK细胞、非活化T细胞、胰岛细胞、心肌细胞、神经胶质祖细胞或NK细胞，其中将所述第一和/或第二外源多核苷酸中的一个或多个插入到所述细胞的至少一个等位基因的第一和/或第二特定基因座中。
59.如权利要求58所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞、胰岛细胞、心肌细胞、神经胶质祖细胞或NK细胞，其中所述第一和/或第二特定基因座选自由以下组成的组：安全港或靶标基因座、RHD基因座、B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座和TRB基因座。
60.如权利要求59所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞、胰岛细胞、心肌细胞、神经胶质祖细胞或NK细胞，其中所述安全港或靶标基因座选自由以下组成的组：CCR5基因座、CXCR4基因座、PPP1R12C基因座、ALB基因座、SHS231基因座、CLYBL基因座、Rosa基因座、F3(CD142)基因座、MICA基因座、MICB基因座、LRP1(CD91)基因座、HMGB1基因座、ABO基因座、FUT1基因座和KDM5D基因座。
61.如权利要求1-60中任一项所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞、胰岛细胞、心肌细胞、神经胶质祖细胞或NK细胞，其中使用基因疗法载体或选自由转座酶、PiggyBac转座子、睡美人(SB11)转座子、Mos1转座子和Tol2转座子组成的组的转座酶系统将所述第一和/或第二外源多核苷酸引入所述细胞中。
62.如权利要求61所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞、胰岛细胞、心肌细胞、神经胶质祖细胞或NK细胞，其中所述基因疗法载体是逆转录病毒或融合体。
63.如权利要求62所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞、胰岛细胞、心肌细胞、神经胶质祖细胞或NK细胞，其中所述逆转录病毒是慢病毒载体。
64.如权利要求1-63中任一项所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞、胰岛细胞、心肌细胞、神经胶质祖细胞或NK细胞，其中使用CRISPR/Cas基因编辑将所述第一和/或第二外源多核苷酸引入所述细胞中。
65.如权利要求1-64中任一项所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞、胰岛细胞、心肌细胞、神经胶质祖细胞或NK细胞，其中使用选自由Cas9、Cas12a和Cas12b组成的组的Cas效应蛋白进行所述CRISPR/Cas基因编辑。
66.如权利要求65所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞、胰岛细胞、心肌细胞、神经胶质祖细胞或NK细胞，其中使用选自由以下组成的组的Cas效应蛋白进行所述CRISPR/Cas基因编辑：
a.任选地选自由Cas3、Cas8a、Cas5、Cas8b、Cas8c、Cas10d、Cse1、Cse2、Csy1、Csy2、Csy3和GSU0054组成的组；
b.任选地选自由Cas9、Csn2和Cas4组成的组；
c.任选地选自由Cas10、Csm2、Cmr5、Cas10、Csx11和Csx10组成的组；
d.任选地Csf1；
e.任选地选自由Cas12a、Cas12b、Cas12c、C2c4、C2c8、C2c5、C2c10、C2c9、CasX(Cas12e)和CasY(Cas12d)组成的组；以及
f.任选地选自由Cas13、Cas13a、C2c2、Cas13b、Cas13c和Cas13d组成的组。
67.如权利要求64-66中任一项所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞、胰岛细胞、心肌细胞、神经胶质祖细胞或NK细胞，其中所述CRISPR/Cas基因编辑是从供体受试者离体进行的。
68.如权利要求67所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞、胰岛细胞、心肌细胞、神经胶质祖细胞或NK细胞，其中使用慢病毒载体进行所述CRISPR/Cas基因编辑。
69.如权利要求1-68中任一项所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞、胰岛细胞、心肌细胞、神经胶质祖细胞或NK细胞，其中所述细胞或其后代在施用于患者后逃避NK细胞介导的细胞毒性。
70.如权利要求1-69中任一项所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞、胰岛细胞、心肌细胞、神经胶质祖细胞或NK细胞，其中所述细胞或其后代在施用于患者后受到保护而免于成熟NK细胞的细胞裂解。
71.如权利要求1-70中任一项所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞、胰岛细胞、心肌细胞、神经胶质祖细胞或NK细胞，其中所述细胞或其后代在施用于患者后逃避巨噬细胞吞噬。
72.如权利要求1-71中任一项所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞、胰岛细胞、心肌细胞、神经胶质祖细胞或NK细胞，其中所述细胞或其后代在施用于患者后不会诱导针对所述细胞的免疫反应。
73.如权利要求1-72中任一项所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞、胰岛细胞、心肌细胞、神经胶质祖细胞或NK细胞，其中所述细胞或其后代在施用于患者后不会诱导针对所述细胞的基于抗体的免疫反应。
74.如权利要求1-73中任一项所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞、胰岛细胞、心肌细胞、神经胶质祖细胞或NK细胞，其中所述野生型细胞或所述对照细胞是起始材料。
75.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求1-74中任一项所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞、胰岛细胞、心肌细胞、神经胶质祖细胞或NK细胞群和药学上可接受的添加剂、载剂、稀释剂或赋形剂。
76.如权利要求75所述的药物组合物，其中所述组合物包含选自由低免疫原性T细胞群、非活化T细胞群、低免疫原性CD19 CAR T细胞群和低免疫原性CD22 CAR T细胞群组成的组的一个或多个细胞群，以及药学上可接受的添加剂、载剂、稀释剂或赋形剂。
77.一种治疗患有将受益于基于细胞的疗法的疾病或病状的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用如权利要求1-76中任一项所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞、胰岛细胞、心肌细胞、神经胶质祖细胞或NK细胞群。
78.如权利要求77所述的方法，其中所述患者不具有Y染色体。
79.如权利要求77或78所述的方法，其中所述患者对Y染色体基因不敏感。
80.如权利要求77或78所述的方法，其中所述患者对Y染色体基因敏感。
81.如权利要求80所述的方法，其中所述患者先前接受了来源于具有Y染色体的供体受试者的细胞疗法或以其他方式表达一种或多种Y染色体基因的细胞疗法。
82.如权利要求80或81所述的方法，其中所述患者是先前怀过男性孩子的女性患者。
83.一种治疗有需要的患者的癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用如权利要求1-3或7-74中任一项所述的原代免疫细胞群。
84.如权利要求83所述的方法，其中所述原代免疫细胞选自由T细胞和NK细胞组成的组。
85.如权利要求83或84所述的方法，其中所述患者不具有Y染色体。
86.如权利要求83-85中任一项所述的方法，其中所述患者对Y染色体基因不敏感。
87.如权利要求83-85中任一项所述的方法，其中所述患者对Y染色体基因敏感。
88.如权利要求87所述的方法，其中所述患者先前接受了来源于具有Y染色体的供体受试者的细胞疗法或以其他方式表达一种或多种Y染色体基因的细胞疗法。
89.如权利要求87或88所述的方法，其中所述患者是先前怀过男性孩子的女性患者。
90.一种确定施用于患有将受益于基于细胞的疗法的疾病或病状的患者的适当的基于细胞的疗法的方法，所述方法包括：
(a)通过以下方式确定来自所述患者的生物样品是否包含针对一种或多种Y染色体基因的抗体：
(i)从所述患者获得或已经获得生物样品；
(ii)进行或已经进行测定以确定所述生物样品中是否存在针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体；以及
(iii)进行或已经进行测定以确定所述生物样品中是否存在针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体；和
(b)向所述患者施用如权利要求1-74中任一项所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞、胰岛细胞、心肌细胞、神经胶质祖细胞或NK细胞群，其中：
(i)如果所述生物样品中存在针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体，那么所述细胞群包含降低的Y-连锁原钙粘蛋白11的表达；
(ii)如果所述生物样品中存在针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体，那么所述细胞群包含降低的Y-连锁神经连接蛋白4的表达；
(iii)如果所述生物样品中存在针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体和针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体，那么所述细胞群包含降低的Y-连锁原钙粘蛋白11和Y-连锁神经连接蛋白4的表达；
(iv)如果所述生物样品中既不存在针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体，也不存在针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体，那么所述细胞群不包含降低的Y-连锁原钙粘蛋白11或Y-连锁神经连接蛋白4的表达。
91.一种鉴定患有将受益于基于细胞的疗法的疾病或病状的患者的方法，所述基于细胞的疗法包括降低的一种或多种Y染色体基因的表达，所述方法包括：
(a)通过以下方式确定来自所述患者的生物样品是否包含针对一种或多种Y染色体基因的抗体：
(i)从所述患者获得或已经获得生物样品；
(ii)进行或已经进行测定以确定所述生物样品中是否存在针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体；以及
(iii)进行或已经进行测定以确定所述生物样品中是否存在针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体；和
(b)向所述患者施用如权利要求1-74中任一项所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞、胰岛细胞、心肌细胞、神经胶质祖细胞或NK细胞群，其中：
(i)如果所述生物样品中存在针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体，那么所述细胞群包含降低的Y-连锁原钙粘蛋白11的表达；
(ii)如果所述生物样品中存在针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体，那么所述细胞群包含降低的Y-连锁神经连接蛋白4的表达；
(iii)如果所述生物样品中存在针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体和针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体，那么所述细胞群包含降低的Y-连锁原钙粘蛋白11和Y-连锁神经连接蛋白4的表达；
(iv)如果所述生物样品中既不存在针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体，也不存在针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体，那么所述细胞群不包含降低的Y-连锁原钙粘蛋白11或Y-连锁神经连接蛋白4的表达。
92.一种用于鉴定患有将受益于基于细胞的疗法的疾病或病状的患者的方法，所述基于细胞的疗法包括降低的Y-连锁原钙粘蛋白11和/或Y-连锁神经连接蛋白4的表达，所述方法包括：
(a)通过以下方式确定来自所述患者的生物样品是否包含针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体和/或针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体：
(i)从所述患者获得或已经获得生物样品；
(ii)进行或已经进行测定以确定所述生物样品中是否存在针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体；以及
(iii)进行或已经进行测定以确定所述生物样品中是否存在针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体；和
(b)向所述患者施用如权利要求1-74中任一项所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞、胰岛细胞、心肌细胞、神经胶质祖细胞或NK细胞群，其中：
(i)如果所述生物样品中存在针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体，那么所述细胞群包含降低的Y-连锁原钙粘蛋白11的表达；
(ii)如果所述生物样品中存在针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体，那么所述细胞群包含降低的Y-连锁神经连接蛋白4的表达；
(iii)如果所述生物样品中存在针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体和针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体，那么所述细胞群包含降低的Y-连锁原钙粘蛋白11和Y-连锁神经连接蛋白4的表达；
(iv)如果所述生物样品中既不存在针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体，也不存在针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体，那么所述细胞群不包含降低的Y-连锁原钙粘蛋白11或Y-连锁神经连接蛋白4的表达。
93.一种确定不包括降低的Y-连锁原钙粘蛋白11和/或Y-连锁神经连接蛋白4的表达的基于细胞的疗法在施用于患者后是否易受NK介导的细胞毒性影响的方法，所述方法包括：
(a)通过以下方式确定来自所述患者的生物样品是否包含针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体和/或针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体：
(i)从所述患者获得或已经获得生物样品；
(ii)进行或已经进行测定以确定所述生物样品中是否存在针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体；以及
(iii)进行或已经进行测定以确定所述生物样品中是否存在针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体；和
(b)向所述患者施用如权利要求1-74中任一项所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞、胰岛细胞、心肌细胞、神经胶质祖细胞或NK细胞群，其中：
(i)如果所述生物样品中存在针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体，那么所述细胞群包含降低的Y-连锁原钙粘蛋白11的表达；
(ii)如果所述生物样品中存在针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体，那么所述细胞群包含降低的Y-连锁神经连接蛋白4的表达；
(iii)如果所述生物样品中存在针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体和针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体，那么所述细胞群包含降低的Y-连锁原钙粘蛋白11和Y-连锁神经连接蛋白4的表达；
(iv)如果所述生物样品中既不存在针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体，也不存在针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体，那么所述细胞群不包含降低的Y-连锁原钙粘蛋白11或Y-连锁神经连接蛋白4的表达。
94.一种确定不包括降低的Y-连锁原钙粘蛋白11和/或Y-连锁神经连接蛋白4的表达的基于细胞的疗法在施用于患者后是否易被成熟NK细胞裂解的方法，所述方法包括：
(a)通过以下方式确定来自所述患者的生物样品是否包含针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体和/或针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体：
(i)从所述患者获得或已经获得生物样品；
(ii)进行或已经进行测定以确定所述生物样品中是否存在针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体；以及
(iii)进行或已经进行测定以确定所述生物样品中是否存在针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体；和
(b)向所述患者施用如权利要求1-74中任一项所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞、胰岛细胞、心肌细胞、神经胶质祖细胞或NK细胞群，其中：
(i)如果所述生物样品中存在针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体，那么所述细胞群包含降低的Y-连锁原钙粘蛋白11的表达；
(ii)如果所述生物样品中存在针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体，那么所述细胞群包含降低的Y-连锁神经连接蛋白4的表达；
(iii)如果所述生物样品中存在针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体和针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体，那么所述细胞群包含降低的Y-连锁原钙粘蛋白11和Y-连锁神经连接蛋白4的表达；
(iv)如果所述生物样品中既不存在针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体，也不存在针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体，那么所述细胞群不包含降低的Y-连锁原钙粘蛋白11或Y-连锁神经连接蛋白4的表达。
95.一种确定不包括降低的Y-连锁原钙粘蛋白11和/或Y-连锁神经连接蛋白4的表达的基于细胞的疗法在施用于患者后是否易受巨噬细胞吞噬影响的方法，所述方法包括：
(a)通过以下方式确定来自所述患者的生物样品是否包含针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体和/或针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体：
(i)从所述患者获得或已经获得生物样品；
(ii)进行或已经进行测定以确定所述生物样品中是否存在针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体；以及
(iii)进行或已经进行测定以确定所述生物样品中是否存在针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体；和
(b)向所述患者施用如权利要求1-74中任一项所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞、胰岛细胞、心肌细胞、神经胶质祖细胞或NK细胞群，其中：
(i)如果所述生物样品中存在针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体，那么所述细胞群包含降低的Y-连锁原钙粘蛋白11的表达；
(ii)如果所述生物样品中存在针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体，那么所述细胞群包含降低的Y-连锁神经连接蛋白4的表达；
(iii)如果所述生物样品中存在针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体和针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体，那么所述细胞群包含降低的Y-连锁原钙粘蛋白11和Y-连锁神经连接蛋白4的表达；
(iv)如果所述生物样品中既不存在针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体，也不存在针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体，那么所述细胞群不包含降低的Y-连锁原钙粘蛋白11或Y-连锁神经连接蛋白4的表达。
96.一种确定不包括降低的Y-连锁原钙粘蛋白11和/或Y-连锁神经连接蛋白4的表达的基于细胞的治疗在施用于患者后是否易受诱导的免疫反应影响的方法，所述方法包括：
(a)通过以下方式确定来自所述患者的生物样品是否包含针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体和/或针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体：
(i)从所述患者获得或已经获得生物样品；
(ii)进行或已经进行测定以确定所述生物样品中是否存在针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体；以及
(iii)进行或已经进行测定以确定所述生物样品中是否存在针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体；和
(b)向所述患者施用如权利要求1-74中任一项所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞、胰岛细胞、心肌细胞、神经胶质祖细胞或NK细胞群，其中：
(i)如果所述生物样品中存在针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体，那么所述细胞群包含降低的Y-连锁原钙粘蛋白11的表达；
(ii)如果所述生物样品中存在针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体，那么所述细胞群包含降低的Y-连锁神经连接蛋白4的表达；
(iii)如果所述生物样品中存在针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体和针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体，那么所述细胞群包含降低的Y-连锁原钙粘蛋白11和Y-连锁神经连接蛋白4的表达；
(iv)如果所述生物样品中既不存在针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体，也不存在针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体，那么所述细胞群不包含降低的Y-连锁原钙粘蛋白11或Y-连锁神经连接蛋白4的表达。
97.一种确定不包括降低的Y-连锁原钙粘蛋白11和/或Y-连锁神经连接蛋白4的表达的基于细胞的疗法在施用于患者后是否易受诱导的基于抗体的免疫反应影响的方法，所述方法包括：
(a)通过以下方式确定来自所述患者的生物样品是否包含针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体和/或针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体：
(i)从所述患者获得或已经获得生物样品；
(ii)进行或已经进行测定以确定所述生物样品中是否存在针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体；以及
(iii)进行或已经进行测定以确定所述生物样品中是否存在针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体；和
(b)向所述患者施用如权利要求1-74中任一项所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞、胰岛细胞、心肌细胞、神经胶质祖细胞或NK细胞群，其中：
(i)如果所述生物样品中存在针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体，那么所述细胞群包含降低的Y-连锁原钙粘蛋白11的表达；
(ii)如果所述生物样品中存在针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体，那么所述细胞群包含降低的Y-连锁神经连接蛋白4的表达；
(iii)如果所述生物样品中存在针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体和针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体，那么所述细胞群包含降低的Y-连锁原钙粘蛋白11和Y-连锁神经连接蛋白4的表达；
(iv)如果所述生物样品中既不存在针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体，也不存在针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体，那么所述细胞群不包含降低的Y-连锁原钙粘蛋白11或Y-连锁神经连接蛋白4的表达。
98.一种治疗患有将受益于基于细胞的疗法的疾病或病状的患者的方法，所述方法包括：
(a)通过以下方式确定来自所述患者的生物样品是否包含针对一种或多种Y染色体基因的抗体：
(i)从所述患者获得或已经获得生物样品；
(ii)进行或已经进行测定以确定所述生物样品中是否存在针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体；以及
(iii)进行或已经进行测定以确定所述生物样品中是否存在针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体；和
(b)向所述患者施用如权利要求1-74中任一项所述的工程化细胞、低免疫原性T细胞、非活化T细胞、胰岛细胞、心肌细胞、神经胶质祖细胞或NK细胞群，其中：
(i)如果所述生物样品中存在针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体，那么所述细胞群包含降低的Y-连锁原钙粘蛋白11的表达；
(ii)如果所述生物样品中存在针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体，那么所述细胞群包含降低的Y-连锁神经连接蛋白4的表达；
(iii)如果所述生物样品中存在针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体和针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体，那么所述细胞群包含降低的Y-连锁原钙粘蛋白11和Y-连锁神经连接蛋白4的表达；
(iv)如果所述生物样品中既不存在针对Y-连锁原钙粘蛋白11的抗体，也不存在针对Y-连锁神经连接蛋白4的抗体，那么所述细胞群不包含降低的Y-连锁原钙粘蛋白11或Y-连锁神经连接蛋白4的表达。
99.如权利要求77-98中任一项所述的方法，其中所述Y染色体基因是Y染色体连锁抗原或与所述Y染色体相关的次要组织相容性抗原。
100.如权利要求99所述的方法，其中所述一种或多种Y染色体连锁抗原是Y-连锁原钙粘蛋白11和/或Y-连锁神经连接蛋白4。
101.如权利要求77-100中任一项所述的方法，其中所述细胞具有降低的Y-连锁原钙粘蛋白11的表达。
102.如权利要求77-101中任一项所述的方法，其中所述细胞具有降低的Y-连锁神经连接蛋白4的表达。
103.如权利要求77-102中任一项所述的方法，其中所述细胞具有降低的Y-连锁原钙粘蛋白11的表达和降低的Y-连锁神经连接蛋白4的表达。
104.如权利要求77-103中任一项所述的方法，其中所述细胞被基因工程化以具有降低的Y-连锁原钙粘蛋白11和/或Y-连锁神经连接蛋白4的表达。
105.如权利要求77-104中任一项所述的方法，其中所述细胞不表达Y-连锁原钙粘蛋白11。
106.如权利要求77-105中任一项所述的方法，其中所述细胞不表达Y-连锁神经连接蛋白4。
107.如权利要求77-106中任一项所述的方法，其中所述细胞不表达Y-连锁原钙粘蛋白11并且不表达Y-连锁神经连接蛋白4。
108.如权利要求77-107中任一项所述的方法，其中所述细胞被基因工程化以不表达Y-连锁原钙粘蛋白11和/或Y-连锁神经连接蛋白4。
109.如权利要求77-108中任一项所述的方法，其中降低的Y-连锁原钙粘蛋白11和/或Y-连锁神经连接蛋白4的表达分别由PCDH11Y和/或NLGN4Y基因的敲除引起。
110.如权利要求77-109中任一项所述的方法，其中所述细胞来源于人细胞或动物细胞。
111.如权利要求110所述的方法，其中所述人细胞或动物细胞来自不具有Y染色体的供体受试者。
112.如权利要求110所述的方法，其中所述人细胞或动物细胞来自具有Y染色体的供体受试者，并且其中所述细胞被基因工程化以具有降低的Y-连锁原钙粘蛋白11和/或Y-连锁神经连接蛋白4的表达。
113.如权利要求112所述的方法，其中所述细胞被基因工程化以不表达Y-连锁原钙粘蛋白11。
114.如权利要求112所述的方法，其中所述细胞被基因工程化以不表达Y-连锁神经连接蛋白4。
115.如权利要求112所述的方法，其中所述细胞被基因工程化以不表达Y-连锁原钙粘蛋白11且不表达Y-连锁神经连接蛋白4。
116.如权利要求77-115中任一项所述的方法，其中所述细胞繁殖自或来源于从一名或多名不同于所述患者的供体受试者分离的细胞池，其中所述一名或多名供体受试者任选地包括一名或多名具有Y染色体的受试者；一名或多名不具有Y染色体的受试者；或具有Y染色体的受试者和不具有Y染色体的受试者的混合体。
117.如权利要求77-116中任一项所述的方法，其中使用CRISPR/Cas基因编辑基因工程化所述细胞以具有降低的Y-连锁原钙粘蛋白11和/或Y-连锁神经连接蛋白4的表达。
118.如权利要求117所述的方法，其中使用包含表2至表5的任何序列的一种或多种指导RNA进行所述CRISPR/Cas基因编辑。
119.如权利要求117-118中任一项所述的方法，其中使用选自由Cas9、Cas12a和Cas12b组成的组的Cas效应蛋白进行所述CRISPR/Cas基因编辑。
120.如权利要求119所述的方法，其中使用选自由以下组成的组的Cas效应蛋白进行所述CRISPR/Cas基因编辑：
a.任选地选自由Cas3、Cas8a、Cas5、Cas8b、Cas8c、Cas10d、Cse1、Cse2、Csy1、Csy2、Csy3和GSU0054组成的组；
b.任选地选自由Cas9、Csn2和Cas4组成的组；
c.任选地选自由Cas10、Csm2、Cmr5、Cas10、Csx11和Csx10组成的组；
d.任选地Csf1；
e.任选地选自由Cas12a、Cas12b、Cas12c、C2c4、C2c8、C2c5、C2c10、C2c9、CasX(Cas12e)和CasY(Cas12d)组成的组；以及
f.任选地选自由Cas13、Cas13a、C2c2、Cas13b、Cas13c和Cas13d组成的组。
121.如权利要求117-120中任一项所述的方法，其中所述CRISPR/Cas基因编辑是从供体受试者离体进行的。
122.如权利要求121所述的方法，其中所述CRISPR/Cas基因编辑是使用慢病毒载体进行的。
123.如权利要求77-122中任一项所述的方法，其中所述细胞包含相对于未改变或未修饰的野生型或对照细胞降低的B2M和/或CIITA的表达。
124.如权利要求123所述的方法，其中所述细胞不表达B2M和/或CIITA。
125.如权利要求77-124中任一项所述的方法，其中所述细胞包含降低的RHD的表达。
126.如权利要求125所述的方法，其中所述细胞不表达RHD。
127.如权利要求77-126中任一项所述的方法，其中所述细胞是来源于诱导性多能干细胞或其后代的分化细胞。
128.如权利要求127所述的方法，其中所述分化细胞选自由以下组成的组：T细胞、NK细胞、内皮细胞、胰岛细胞、心肌细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、肝细胞、神经胶质祖细胞、多巴胺能神经元、视网膜色素上皮细胞和甲状腺细胞。
129.如权利要求77-126中任一项所述的方法，其中所述细胞是原代免疫细胞或其后代。
130.如权利要求129所述的工程化细胞，其中所述原代免疫细胞或其后代是T细胞或NK细胞。
131.如权利要求77-130中任一项所述的方法，其中所述细胞包含降低的TCR-α和/或TCR-β的表达。
132.如权利要求131所述的方法，其中所述细胞不表达TCR-α和/或TCR-β。
133.如权利要求77-132中任一项所述的方法，其中所述细胞还包含编码一种或多种CAR的第二外源多核苷酸，其中所述一种或多种CAR包含对CD19、CD20、CD22或BCMA具有特异性的胞外配体结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和胞内信号传导结构域。
134.如权利要求133所述的方法，其中所述一种或多种CAR包含CD8α铰链结构域、CD28铰链结构域或IgG4铰链结构域。
135.如权利要求134所述的方法，其中所述一种或多种CAR包含具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CD8α铰链结构域。
136.如权利要求134所述的方法，其中所述一种或多种CAR包含具有SEQ ID NO:10或113的氨基酸序列的CD28铰链结构域。
137.如权利要求134所述的方法，其中所述一种或多种CAR包含具有SEQ ID NO:11或12的氨基酸序列的IgG4铰链结构域。
138.如权利要求133-137中任一项所述的方法，其中所述一种或多种CAR包含CD8α跨膜结构域或CD28跨膜结构域。
139.如权利要求138所述的方法，其中所述一种或多种CAR包含具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CD8α跨膜结构域。
140.如权利要求138所述的方法，其中所述一种或多种CAR包含具有SEQ ID NO:15或114的氨基酸序列的CD28跨膜结构域。
141.如权利要求133-140中任一项所述的方法，其中所述一种或多种CAR包含4-1BB共刺激结构域、CD28共刺激结构域或CD3ζ信号传导结构域。
142.如权利要求141所述的方法，其中所述一种或多种CAR包含具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的4-1BB共刺激结构域。
143.如权利要求141所述的方法，其中所述一种或多种CAR包含具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CD28共刺激结构域。
144.如权利要求141所述的方法，其中所述一种或多种CAR包含具有SEQ ID NO:18或115的氨基酸序列的CD3ζ信号传导结构域。
145.如权利要求133-144中任一项所述的方法，其中所述一种或多种CAR包含胞外配体结合结构域，所述胞外配体结合结构域包含SEQ ID NO:19、37、45、54、63、72、81或118中任一个的scFv序列，或其中所述CAR具有包含SEQ ID NO:20、25、38、42、46、50、64、68、73、77、119或123中任一个的重链和轻链序列的scFv序列。
146.如权利要求133-145中任一项所述的方法，其中所述一种或多种CAR具有SEQ IDNO:32、34、36、117或128中任一个的序列。
147.如权利要求133-146中任一项所述的方法，其中所述一种或多种CAR包含SEQ IDNO:117中列出的氨基酸序列或与所述SEQ ID NO:117中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列，所述一种或多种CAR具有以下组分：CD8α信号肽、FMC63scFv(VL-Whitlow接头-VH)、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域。
148.如权利要求133-146中任一项所述的方法，其中所述一种或多种CAR包含SEQ IDNO:45中列出的氨基酸序列或与所述SEQ ID NO:45中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列。
149.如权利要求77-148中任一项所述的方法，其中将所述第一和/或第二外源多核苷酸中的一个或多个插入到所述细胞的至少一个等位基因的第一和/或第二特定基因座中。
150.如权利要求149所述的方法，其中所述第一和/或第二特定基因座选自由以下组成的组：安全港或靶标基因座、RHD基因座、B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座和TRB基因座。
151.如权利要求150所述的方法，其中所述安全港或靶标基因座选自由以下组成的组：CCR5基因座、CXCR4基因座、PPP1R12C基因座、ALB基因座、SHS231基因座、CLYBL基因座、Rosa基因座、F3(CD142)基因座、MICA基因座、MICB基因座、LRP1(CD91)基因座、HMGB1基因座、ABO基因座、FUT1基因座和KDM5D基因座。
152.如权利要求77-151中任一项所述的方法，其中使用基因疗法载体或选自由转座酶、PiggyBac转座子、睡美人(SB11)转座子、Mos1转座子和Tol2转座子组成的组的转座酶系统将所述第一和/或第二外源多核苷酸引入所述细胞中。
153.如权利要求152所述的方法，其中所述基因疗法载体是逆转录病毒或融合体。
154.如权利要求153所述的方法，其中所述逆转录病毒是慢病毒载体。
155.如权利要求77-154中任一项所述的方法，其中使用CRISPR/Cas基因编辑将所述第一和/或第二外源多核苷酸引入所述细胞中。
156.如权利要求77-155中任一项所述的方法，其中使用选自由Cas9、Cas12a和Cas12b组成的组的Cas效应蛋白进行所述CRISPR/Cas基因编辑。
157.如权利要求156所述的方法，其中使用选自由以下组成的组的Cas效应蛋白进行所述CRISPR/Cas基因编辑：
a.任选地选自由Cas3、Cas8a、Cas5、Cas8b、Cas8c、Cas10d、Cse1、Cse2、Csy1、Csy2、Csy3和GSU0054组成的组；
b.任选地选自由Cas9、Csn2和Cas4组成的组；
c.任选地选自由Cas10、Csm2、Cmr5、Cas10、Csx11和Csx10组成的组；
d.任选地Csf1；
e.任选地选自由Cas12a、Cas12b、Cas12c、C2c4、C2c8、C2c5、C2c10、C2c9、CasX(Cas12e)和CasY(Cas12d)组成的组；以及
f.任选地选自由Cas13、Cas13a、C2c2、Cas13b、Cas13c和Cas13d组成的组。
158.如权利要求155-157中任一项所述的方法，其中所述CRISPR/Cas基因编辑是从供体受试者离体进行的。
159.如权利要求158所述的方法，其中所述CRISPR/Cas基因编辑是使用慢病毒载体进行的。
160.如权利要求77-159中任一项所述的方法，其中所述细胞或其后代在施用于患者后逃避NK细胞介导的细胞毒性。
161.如权利要求77-160中任一项所述的方法，其中所述细胞或其后代在施用于患者后受到保护而免于成熟NK细胞的细胞裂解。
162.如权利要求77-161中任一项所述的方法，其中所述细胞或其后代在施用于患者后逃避巨噬细胞吞噬。
163.如权利要求77-162中任一项所述的方法，其中所述细胞或其后代在施用于患者后不会诱导针对所述细胞的免疫反应。
164.如权利要求77-163中任一项所述的方法，其中所述细胞或其后代在施用于患者后不会诱导针对所述细胞的基于抗体的免疫反应。
165.如权利要求77-164中任一项所述的方法，其中所述野生型细胞或所述对照细胞是起始材料。
166.一种工程化T细胞群用于治疗患者的病症或病状的用途，其中所述工程化T细胞包含相对于未改变或未修饰的野生型或对照细胞降低的一种或多种Y染色体基因以及MHC I类和/或II类人白细胞抗原分子的表达和编码CD47的第一外源多核苷酸，其中所述工程化T细胞由原代T细胞或其后代繁殖，或来源于iPSC或其后代。
167.一种工程化分化细胞群用于治疗患者的病症或病状的用途，其中所述工程化分化细胞包含相对于未改变或未修饰的野生型或对照细胞降低的一种或多种Y染色体基因以及MHC I类和/或II类人白细胞抗原分子的表达和编码CD47的第一外源多核苷酸，其中所述工程化分化细胞来源于iPSC或其后代。
168.如权利要求166或167所述的用途，其中所述Y染色体基因是Y染色体连锁抗原或与所述Y染色体相关的次要组织相容性抗原。
169.如权利要求168所述的用途，其中所述一种或多种Y染色体连锁抗原是Y-连锁原钙粘蛋白11和/或Y-连锁神经连接蛋白4。
170.如权利要求166-169中任一项所述的用途，其中所述细胞具有降低的Y-连锁原钙粘蛋白11的表达。
171.如权利要求166-170中任一项所述的用途，其中所述细胞具有降低的Y-连锁神经连接蛋白4的表达。
172.如权利要求166-171中任一项所述的用途，其中所述细胞具有降低的Y-连锁原钙粘蛋白11的表达和降低的Y-连锁神经连接蛋白4的表达。
173.如权利要求166-172中任一项所述的用途，其中所述细胞被基因工程化以具有降低的Y-连锁原钙粘蛋白11和/或Y-连锁神经连接蛋白4的表达。
174.如权利要求166-173中任一项所述的用途，其中所述细胞不表达Y-连锁原钙粘蛋白11。
175.如权利要求166-174中任一项所述的用途，其中所述细胞不表达Y-连锁神经连接蛋白4。
176.如权利要求166-175中任一项所述的用途，其中所述细胞不表达Y-连锁原钙粘蛋白11并且不表达Y-连锁神经连接蛋白4。
177.如权利要求166-176中任一项所述的用途，其中所述细胞被基因工程化以不表达Y-连锁原钙粘蛋白11和/或Y-连锁神经连接蛋白4。
178.如权利要求166-177中任一项所述的用途，其中降低的Y-连锁原钙粘蛋白11和/或Y-连锁神经连接蛋白4的表达分别由PCDH11Y和/或NLGN4Y基因的敲除引起。
179.如权利要求166-178中任一项所述的用途，其中所述细胞来源于人细胞或动物细胞。
180.如权利要求179所述的用途，其中所述人细胞或动物细胞来自不具有Y染色体的供体受试者。
181.如权利要求179所述的用途，其中所述人细胞或动物细胞来自具有Y染色体的供体受试者，并且其中所述细胞被基因工程化以具有降低的Y-连锁原钙粘蛋白11和/或Y-连锁神经连接蛋白4的表达。
182.如权利要求181所述的用途，其中所述细胞被基因工程化以不表达Y-连锁原钙粘蛋白11。
183.如权利要求181所述的用途，其中所述细胞被基因工程化以不表达Y-连锁神经连接蛋白4。
184.如权利要求181所述的用途，其中所述细胞被基因工程化以不表达Y-连锁原钙粘蛋白11且不表达Y-连锁神经连接蛋白4。
185.如权利要求166-184中任一项所述的用途，其中所述细胞繁殖自或来源于从一名或多名不同于所述患者的供体受试者分离的细胞池，其中所述一名或多名供体受试者任选地包括一名或多名具有Y染色体的受试者；一名或多名不具有Y染色体的受试者；或具有Y染色体的受试者和不具有Y染色体的受试者的混合体。
186.如权利要求166-185中任一项所述的用途，其中使用CRISPR/Cas基因编辑基因工程化所述细胞以具有降低的Y-连锁原钙粘蛋白11和/或Y-连锁神经连接蛋白4的表达。
187.如权利要求186所述的用途，其中使用包含表2至表5的任何序列的一种或多种指导RNA进行所述CRISPR/Cas基因编辑。
188.如权利要求186-187中任一项所述的用途，其中使用选自由Cas9、Cas12a和Cas12b组成的组的Cas效应蛋白进行所述CRISPR/Cas基因编辑。
189.如权利要求188所述的用途，其中使用选自由以下组成的组的Cas效应蛋白进行所述CRISPR/Cas基因编辑：
a.任选地选自由Cas3、Cas8a、Cas5、Cas8b、Cas8c、Cas10d、Cse1、Cse2、Csy1、Csy2、Csy3和GSU0054组成的组；
b.任选地选自由Cas9、Csn2和Cas4组成的组；
c.任选地选自由Cas10、Csm2、Cmr5、Cas10、Csx11和Csx10组成的组；
d.任选地Csf1；
e.任选地选自由Cas12a、Cas12b、Cas12c、C2c4、C2c8、C2c5、C2c10、C2c9、CasX(Cas12e)和CasY(Cas12d)组成的组；以及
f.任选地选自由Cas13、Cas13a、C2c2、Cas13b、Cas13c和Cas13d组成的组。
190.如权利要求186-189中任一项所述的用途，其中所述CRISPR/Cas基因编辑是从供体受试者离体进行的。
191.如权利要求144所述的用途，其中所述CRISPR/Cas基因编辑是使用慢病毒载体进行的。
192.如权利要求166-191中任一项所述的用途，其中所述细胞包含相对于未改变或未修饰的野生型或对照细胞降低的B2M和/或CIITA的表达。
193.如权利要求192所述的用途，其中所述细胞不表达B2M和/或CIITA。
194.如权利要求166-193中任一项所述的用途，其中所述细胞包含降低的RHD的表达。
195.如权利要求194所述的用途，其中所述细胞不表达RHD。
196.如权利要求166-195中任一项所述的用途，其中所述细胞是来源于诱导性多能干细胞或其后代的分化细胞。
197.如权利要求196所述的用途，其中所述分化细胞选自由以下组成的组：T细胞、NK细胞、内皮细胞、胰岛细胞、心肌细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、肝细胞、神经胶质祖细胞、多巴胺能神经元、视网膜色素上皮细胞和甲状腺细胞。
198.如权利要求166-195中任一项所述的用途，其中所述细胞是原代免疫细胞或其后代。
199.如权利要求198所述的用途，其中所述原代免疫细胞或其后代是T细胞或NK细胞。
200.如权利要求166-199中任一项所述的用途，其中所述细胞包含降低的TCR-α和/或TCR-β的表达。
201.如权利要求200所述的用途，其中所述细胞不表达TCR-α和/或TCR-β。
202.如权利要求166-201中任一项所述的用途，其中所述细胞还包含编码一种或多种CAR的第二外源多核苷酸，其中所述一种或多种CAR包含对CD19、CD20、CD22或BCMA具有特异性的胞外配体结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和胞内信号传导结构域。
203.如权利要求202所述的用途，其中所述一种或多种CAR包含CD8α铰链结构域、CD28铰链结构域或IgG4铰链结构域。
204.如权利要求203所述的用途，其中所述一种或多种CAR包含具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CD8α铰链结构域。
205.如权利要求203所述的用途，其中所述一种或多种CAR包含具有SEQ ID NO:10或113的氨基酸序列的CD28铰链结构域。
206.如权利要求203所述的用途，其中所述一种或多种CAR包含具有SEQ ID NO:11或12的氨基酸序列的IgG4铰链结构域。
207.如权利要求202-206中任一项所述的用途，其中所述一种或多种CAR包含CD8α跨膜结构域或CD28跨膜结构域。
208.如权利要求207所述的用途，其中所述一种或多种CAR包含具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CD8α跨膜结构域。
209.如权利要求207所述的用途，其中所述一种或多种CAR包含具有SEQ ID NO:15或114的氨基酸序列的CD28跨膜结构域。
210.如权利要求202-209中任一项所述的用途，其中所述一种或多种CAR包含4-1BB共刺激结构域、CD28共刺激结构域或CD3ζ信号传导结构域。
211.如权利要求210所述的用途，其中所述一种或多种CAR包含具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的4-1BB共刺激结构域。
212.如权利要求210所述的用途，其中所述一种或多种CAR包含具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CD28共刺激结构域。
213.如权利要求210所述的用途，其中所述一种或多种CAR包含具有SEQ ID NO:18或115的氨基酸序列的CD3ζ信号传导结构域。
214.如权利要求202-213中任一项所述的用途，其中所述一种或多种CAR包含胞外配体结合结构域，所述胞外配体结合结构域包含SEQ ID NO:19、37、45、54、63、72、81或118中任一个的scFv序列，或其中所述CAR具有包含SEQ ID NO:20、25、38、42、46、50、64、68、73、77、119或123中任一个的重链和轻链序列的scFv序列。
215.如权利要求202-214中任一项所述的用途，其中所述一种或多种CAR具有SEQ IDNO:32、34、36、117或128中任一个的序列。
216.如权利要求202-215中任一项所述的用途，其中所述一种或多种CAR包含SEQ IDNO:117中列出的氨基酸序列或与所述SEQ ID NO:117中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列，所述一种或多种CAR具有以下组分：CD8α信号肽、FMC63scFv(VL-Whitlow接头-VH)、CD8α铰链结构域、CD8α跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域。
217.如权利要求202-216中任一项所述的用途，其中所述一种或多种CAR包含SEQ IDNO:45中列出的氨基酸序列或与所述SEQ ID NO:45中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)的氨基酸序列。
218.如权利要求166-217中任一项所述的用途，其中将所述第一和/或第二外源多核苷酸中的一个或多个插入到所述细胞的至少一个等位基因的第一和/或第二特定基因座中。
219.如权利要求218所述的用途，其中所述第一和/或第二特定基因座选自由以下组成的组：安全港或靶标基因座、RHD基因座、B2M基因座、CIITA基因座、TRAC基因座和TRB基因座。
220.如权利要求219所述的用途，其中所述安全港或靶标基因座选自由以下组成的组：CCR5基因座、CXCR4基因座、PPP1R12C基因座、ALB基因座、SHS231基因座、CLYBL基因座、Rosa基因座、F3(CD142)基因座、MICA基因座、MICB基因座、LRP1(CD91)基因座、HMGB1基因座、ABO基因座、FUT1基因座和KDM5D基因座。
221.如权利要求166-220中任一项所述的用途，其中使用基因疗法载体或选自由转座酶、PiggyBac转座子、睡美人(SB11)转座子、Mos1转座子和Tol2转座子组成的组的转座酶系统将所述第一和/或第二外源多核苷酸引入所述工程化T细胞中。
222.如权利要求221所述的用途，其中所述基因疗法载体是逆转录病毒或融合体。
223.如权利要求222所述的用途，其中所述逆转录病毒是慢病毒载体。
224.如权利要求166-223中任一项所述的用途，其中使用CRISPR/Cas基因编辑将所述第一和/或第二外源多核苷酸引入所述细胞中。
225.如权利要求177-224中任一项所述的用途，其中使用选自由Cas9、Cas12a和Cas12b组成的组的Cas效应蛋白进行所述CRISPR/Cas基因编辑。
226.如权利要求225所述的用途，其中使用选自由以下组成的组的Cas效应蛋白进行所述CRISPR/Cas基因编辑：
a.任选地选自由Cas3、Cas8a、Cas5、Cas8b、Cas8c、Cas10d、Cse1、Cse2、Csy1、Csy2、Csy3和GSU0054组成的组；
b.任选地选自由Cas9、Csn2和Cas4组成的组；
c.任选地选自由Cas10、Csm2、Cmr5、Cas10、Csx11和Csx10组成的组；
d.任选地Csf1；
e.任选地选自由Cas12a、Cas12b、Cas12c、C2c4、C2c8、C2c5、C2c10、C2c9、CasX(Cas12e)和CasY(Cas12d)组成的组；以及
f.任选地选自由Cas13、Cas13a、C2c2、Cas13b、Cas13c和Cas13d组成的组。
227.如权利要求224-226中任一项所述的用途，其中所述CRISPR/Cas基因编辑是从供体受试者离体进行的。
228.如权利要求227所述的用途，其中所述CRISPR/Cas基因编辑是使用慢病毒载体进行的。
229.如权利要求166-228中任一项所述的用途，其中所述细胞或其后代在施用于患者后逃避NK细胞介导的细胞毒性。
230.如权利要求166-229中任一项所述的用途，其中所述细胞或其后代在施用于患者后受到保护而免于成熟NK细胞的细胞裂解。
231.如权利要求166-230中任一项所述的用途，其中所述细胞或其后代在施用于患者后逃避巨噬细胞吞噬。
232.如权利要求166-231中任一项所述的用途，其中所述细胞或其后代在施用于患者后不会诱导针对所述细胞的免疫反应。
233.如权利要求166-232中任一项所述的用途，其中所述细胞或其后代在施用于患者后不会诱导针对所述细胞的基于抗体的免疫反应。
234.如权利要求177-233中任一项所述的方法，其中所述野生型细胞或所述对照细胞是起始材料。
235.一种用于产生工程化细胞的方法，所述工程化细胞包含相对于未改变或未修饰的野生型或对照细胞降低的一种或多种Y染色体基因以及MHC I类和/或II类人白细胞抗原分子的表达和编码CD47的第一外源多核苷酸，所述方法包括：
(a)获得分离的细胞；
(b)基因修饰所述细胞以减少所述细胞中的所述一种或多种Y染色体基因的表达；
(c)基因修饰所述细胞以减少所述细胞中MHC I类人白细胞抗原分子和/或MHC II类人白细胞抗原分子的表达；以及
(d)将编码CD47的多核苷酸引入所述分离的细胞中，从而产生所述工程化细胞。
236.一种用于产生工程化细胞的方法，所述工程化细胞包含相对于未改变或未修饰的野生型或对照细胞降低的一种或多种Y染色体基因以及MHC I类和/或II类人白细胞抗原分子的表达和编码CD47的第一外源多核苷酸，所述方法包括：
(a)获得分离的细胞；
(b)使所述细胞与包含慢病毒载体的组合物接触，所述慢病毒载体包含
(i)CD4结合剂或CD8结合剂，
(ii)编码靶向所述一种或多种Y染色体基因座的CRISPR/Cas基因编辑组分的多核苷酸，
(iii)编码靶向所述MHC I类和/或II类人白细胞抗原基因座的CRISPR/Cas基因编辑组分的多核苷酸，以及
(iv)编码CD47的第一外源多核苷酸，从而产生所述工程化细胞。
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