CN117120086A - 用于癌症诊断的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了与神经节苷脂(例如，GD2或GD3)特异性结合的单克隆抗体和其抗原结合片段以及包含所述单克隆抗体和其抗原结合片段的组合物和使用所述单克隆抗体和其抗原结合片段用于诊断和预后目的的方法。另外，本公开提供了用于检测各种神经节苷脂和其脂质长度的基于质谱法的方法，所述神经节苷脂和其脂质长度的变化可用于本文所描述的所述癌症诊断和预后方法。本公开进一步提供了包括神经节苷脂的经修饰形式的化合物。

Description

用于癌症诊断的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年10月5日提交的美国临时申请第63/087,427号的权益，所述申请的全部内容整体并入本文。
背景技术
癌症涉及异常细胞生长，有可能侵入或扩散到身体的其它部位。尽管进行了数十年的癌症研究，但癌症继续导致大量死亡(2020年美国每天有约1,600例死亡)，这主要是由于缺乏早期和/或准确检测的手段。例如，卵巢癌是最致命的妇科癌症，并且是女性死亡的第三大原因。浆液性卵巢癌是卵巢癌中最具侵袭性的亚型，并且通常被称为“沉默的杀手”，因为大多数患者在处于晚期时被诊断。症状不明确，并且容易与其它病状混淆。目前，CA-125是一种用于筛查和监测治疗功效的血液标志物。尽管80％的上皮肿瘤中CA-125水平升高，但这些肿瘤中的大多数都处于晚期。血清CA-125用于早期诊断的检出率低，因为其水平在少于50％的I期卵巢癌中升高，并且特异性有限。因此，非常需要新的生物标志物，例如癌症组织和血液中的生物标志物，以检测早期癌症，这将提高癌症患者的生存率。
发明内容
神经节苷脂是糖脂，所述糖脂包括(i)以名称具体定义的碳水化合物结构和(ii)碳链长度可以变化的脂质尾部。本发明至少部分基于神经节苷脂(例如，GD2、GD3、GM2和/或GD1)是用于癌症诊断和预后，特别是用于癌症早期检测的有用生物标志物的发现。本文提供了用于癌症诊断和预后的组合物和方法。例如，本文提供了包括与神经节苷脂(例如，GD2或GD3)特异性结合的单克隆抗体或其抗原结合片段的组合物以及使用所述组合物检测和测量神经节苷脂的量以及使用液体活检(例如，血液、血清)或实体组织活检来诊断癌症的方法。本文进一步提供了基于质谱的新型方法，用于检测神经节苷脂(例如，GD2、GD3、GM2和/或GD1)的存在、水平和/或脂质长度。检测到的神经节苷脂类型的异质性和/或同质性以及癌症患者脂质长度的异质性和/或同质性或其变化，或患者随时间的纵向变化可以从而为癌症诊断和预后提供新型生物标志物。
在某些方面，本文提供了一种组合物，其包括经修饰的神经节苷脂。例如，本文提供了一种组合物，其包含具有以下结构的神经节苷脂：
(A)x-[(P)y-(L)z]-(M)b；
其中A是神经节苷脂或其任何部分；x是1至32的整数；P是杂芳基；y是1；L是接头；z是0至8的整数；M是核心；并且b是0或1；
其中P任选地被1个、2个、3个、4个或5个独立地选自以下的取代基取代：(1)氢；(2)C1-7酰基；(3)C1-20烷基；(4)氨基；(5)C3-10芳基；(6)羟基；(7)硝基；(8)C1-20烷基-氨基；以及(9)-(CH2)qCONRB，其中q是0至4的整数，并且其中RB选自由以下组成的组：(a)氢；(b)C1-6烷基；(c)C3-10芳基；以及(d)C1-6烷-C6-10芳基。
在一些实施例中，神经节苷脂包括三嗪。在其它实施例中，经修饰的神经节苷脂包括三唑。
在一些实施例中，本公开的神经节苷脂被可检测地标记。在一些实施例中，包含本公开的神经节苷脂的组合物是药物组合物。
本文还提供了一种在受试者中诱导针对神经节苷脂的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用包括本公开的神经节苷脂的组合物。
本文进一步提供了一种治疗有需要的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用包括本公开的神经节苷脂的组合物。在一些实施例中，受试者患有癌症或患有感染(例如病毒(例如，HIV、丙型肝炎病毒(HCV)或爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus))或细菌感染)。例如，本公开的组合物可以用于预防或治疗受试者的癌症。
本文提供了一种在哺乳动物中产生抗体的方法，所述方法包括：
(a)用包含本公开的神经节苷脂的组合物使所述哺乳动物免疫，所述组合物任选地进一步包含佐剂；以及(b)从所述哺乳动物、来自所述哺乳动物的细胞或使用来自所述哺乳动物的细胞制备的杂交瘤中分离与所述神经节苷脂结合的抗体。在一些实施例中，所述哺乳动物选自兔、小鼠、山羊、骆驼、狗、绵羊或大鼠。
在某些方面，本文提供了一种单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体与神经节苷脂的碳水化合物部分特异性结合。在一些实施例中，神经节苷脂是：(a)GD2；(b)GD3；或(c)GD2和GD3。
在某些方面，本文提供了一种分离的核酸分子，其编码：a)包括表1和/或表2中列出的氨基酸序列的多肽；b)包括与表1和/或表2中列出的氨基酸序列具有至少或约85％同一性的氨基酸序列的多肽；和/或c)本文所描述的单克隆抗体或其抗原结合片段。
在某些方面，提供了一种包括本文所描述的分离的核酸的载体。
在某些方面，提供了一种宿主细胞，其包括本文所描述的分离的核酸、包括本文所描述的载体、表达本文所描述的抗体或其抗原结合片段。
在某些方面，提供了一种产生本公开的至少一种单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，其中所述方法包括以下步骤：(i)在适于允许表达所述单克隆抗体或其抗原结合片段的条件下培养包括核酸的宿主细胞，所述核酸包括编码本公开的至少一种单克隆抗体或其抗原结合片段的序列；以及(ii)回收所表达的单克隆抗体或其抗原结合片段。
在某些方面，一种包括本文所描述的至少一种单克隆抗体或其抗原结合片段的装置或试剂盒。
在一些实施例中，所述装置或试剂盒进一步包括：(a)用于检测所述至少一种单克隆抗体或其抗原结合片段的标记；(b)用于检测初级抗体的次级抗体；和/或(c)至少一种参考抗原，任选地其中所述参考抗原是神经节苷脂。
在一些实施例中，装置或试剂盒的参考抗原选自GD2、GD3、以及GD2或GD3的经修饰形式。在一些实施例中，参考抗原选自：本文所描述的神经节苷脂中的任何一种(例如具有(A)x-[(P)y-(L)z]-(M)b结构的那些神经节苷脂)、苯硫基GD2、苯硫基GD3、GD2-O-芳基-NH2、GD3-O-芳基-NH2、对氨基苯基醚GD2(AP-GD2)、对氨基苯基醚GD3(AP-GD3)、三嗪GD2(例如1,3,5-三嗪-GD2，例如2-氨基-4,6-二氯-1,3,5-三嗪-GD2)、三嗪GD3(例如1,3,5-三嗪-GD3，例如2-氨基-4,6-二氯-1,3,5-三嗪-GD3)、多聚体GD2(例如，PAMAM(聚酰胺-胺)-GD2)和多聚体GD3(PAMAM-GD3)。
在某些方面，一种从样品中提取脂质的方法，所述方法包括：(a)获得所述样品；(b)向所述样品中添加约1、2、3、4或5倍(或2至5倍)体积的以选自以下的比率包括CHCl3:甲醇:水的有机溶剂：(i)约1:2:1，(ii)约4:8:3，或(iii)约2:4:1；(c)振荡(b)中的混合物；以及(d)将所述样品与所述有机溶剂分离，由此从所述样品中提取脂质。
在某些方面，一种从样品中纯化神经节苷脂的方法，所述方法包括：(a)获得所述样品；(b)向所述样品中添加约1、2、3、4或5倍(或2至5倍)体积的以选自以下的比率包括CHCl3:甲醇:水的有机溶剂：(i)约1:2:1，(ii)约4:8:3，或(iii)约2:4:1；(c)振荡(b)中的混合物；以及(d)将所述样品与所述有机溶剂分离，由此从所述样品中提取脂质。
在提取脂质的方法或纯化神经节苷脂的方法的一些实施例中，(i)在用所述有机溶剂提取之前，通过离心澄清所述样品；(ii)所述样品来自哺乳动物，任选地来自人类；(iii)通过离心将所述样品与所述有机溶剂分离；(iv)所述样品来自患有癌症的受试者或无癌症的受试者；(v)所述样品包括细胞、血清、血液、瘤周组织和/或瘤内组织；(vi)所述方法进一步包括重复(b)-(d)的步骤至少1、2、3、4或5次；和/或(vii)所述方法进一步包括从(d)的所提取的样品中蒸发残留有机溶剂，任选地通过在真空(例如，快速真空)下离心溶液。
对于包括细胞和/或组织(即非液体)的样品，普通技术人员理解此类样品应充分均质化以提高提取效率。因此，在一些实施例中，细胞和/或组织在提取前被均质化。
在某些方面，一种检测至少一种神经节苷脂(例如GD2和/或GD3)的存在或水平的方法，所述方法包括使用本文所描述的至少一种单克隆抗体或其抗原结合片段检测样品中的所述神经节苷脂。在一些实施例中，其中所述样品来自患有癌症的受试者或无癌症的受试者。
如本文所描述的，某些实施例适用于本文所描述的任何方法。例如，在一些实施例中，所述至少一种单克隆抗体或其抗原结合片段与神经节苷脂(例如，GD2或GD3)形成复合物，并且所述复合物以酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、免疫化学方式(例如，免疫组织化学(IHC))的形式或使用流式细胞术检测到。在一些实施例中，所述复合物在酶联免疫吸附测定(ELISA)中检测到。在优选的实施例中，所述复合物在夹心ELISA或竞争性ELISA中检测到。在一些实施例中，所述复合物通过免疫组织化学(IHC)检测到。
在优选的实施例中，所述复合物在夹心ELISA中检测到。在一些实施例中，所述复合物使用本公开的任何两种抗体或其抗原结合片段在夹心ELISA中检测到。在其它实施例中，所述复合物使用本公开的任何一种抗体和本领域已知抗体的组合(例如，可以检测神经节苷脂的抗体，例如针对神经酰胺或神经节苷脂的脂质尾部部分的抗体)在夹心ELISA中检测到。在又其它实施例中，所述复合物使用本领域已知的两种抗体或其抗原结合片段在夹心ELISA中检测到。
在另一种优选的实施例中，所述复合物在竞争性ELISA中检测到。
在一些实施例中，所述竞争性ELISA包括参考抗原，所述参考抗原选自GD2、GD3或GD2或GD3的经修饰形式。在一些实施例中，参考抗原选自：本文所描述的神经节苷脂中的任何一种(例如具有(A)x-[(P)y-(L)z]-(M)b结构的那些神经节苷脂)、苯硫基GD2、苯硫基GD3、GD2-O-芳基-NH2、GD3-O-芳基-NH2、对氨基苯基醚GD2(AP-GD2)、对氨基苯基醚GD3(AP-GD3)、三嗪GD2(例如1,3,5-三嗪-GD2，例如2-氨基-4,6-二氯-1,3,5-三嗪-GD2)、三嗪GD3(例如1,3,5-三嗪-GD3，例如2-氨基-4,6-二氯-1,3,5-三嗪-GD3)、多聚体GD2(例如，PAMAM-GD2)和多聚体GD3(PAMAM-GD3)。
本文进一步提供了一种检测至少一种神经节苷脂的基于质谱的方法。例如，本文提供了一种检测至少一种神经节苷脂的存在、水平或脂质长度的方法，所述方法包括使用质谱法(例如，LC/MS或LC/MS/MS)检测样品中的所述神经节苷脂。
在一些实施例中，使用所述方法检测至少一种神经节苷脂的脂质长度的相对异质性或可替代地相对同质性和/或对其进行定量。在一些实施例中，使用所述方法检测在患者中发生的至少一种神经节苷脂的脂质长度的相对异质性或相对同质性的纵向变化(对于给定患者随时间发生的变化)和/或对其进行定量。
在一些实施例中，用于检测至少一种神经节苷脂的存在、水平或脂质长度(例如，使用抗体或质谱法检测)的样品包括根据本文所描述的方法(例如，脂质提取)制备的样品。
在某些方面，本文提供了本文详细描述的诊断和预后方法。
附图说明
图1示出了GD2和GD3神经节苷脂示意图。每个几何形状是一种类型的糖。暴露的聚糖树与神经酰胺相连，所述神经酰胺与两个脂质尾部相连。正常GM1和肿瘤GD3的糖头部相差2个糖，并且GD2和GD3相互相差1个糖。GD2是GD3的生物合成产物，因此GD2和GD3通常(但不总是)可以在同一细胞上检测到。
图2示出了GD2和GD3 mAb的特异性。流式细胞术中抗GD2 mAb 9A3和14C3的实例，其与表达GD2的细胞特异性结合，但不与缺乏GD2但表达GD3的细胞特异性结合。红色直方图是mAb阴性对照。
图3示出了ELISA测定对卵巢癌患者血清中GD2或GD3的量(多个测定的代表)进行定量。使用针对GD2或GD3的mAb测定固定在ELISA板上的分析物。对照＝10ng纯化的天然GD2或GD3。BG＝背景孔，无一抗。所有癌症样品(OV)对GD2或GD3是阳性的，除了一个诊断为交界性的。所有正常样品(N)均为阴性并且等于背景。每个样品的OD是一式三份的平均值±sd，并且每个ELISA独立重复至少2次，并且两种不同的mAb各自用于GD2或GD3。作为截止，使用了在统计学上显著的高2倍的值，并且是相对于所有健康对照或背景的平均值的至少2倍s.d。OD归一化为标准曲线。
图4示出了人卵巢组织上的GD2和GD3免疫染色。GD2和GD3染色在交界性和高级别活检的肿瘤细胞中被特异性检测到。只有癌组织为GD2+或GD3+，肿瘤膜标记强烈，周围正常组织为阴性。阴性对照是在相邻切片上测试的同种型匹配的无关mAb。
图5示出了人卵巢组织上的GD2和GD3 IHC与疾病分期相关。在肿瘤组织中检测到GD3和/或GD2染色，与疾病分期相关(比较低级别和高级别，没有按亚型进一步分离，p＝0.026和p＝0.015)。高级别表达GD2和GD3两者，并且在GD2和/或GD3的表达方面评分高。低级别的GD2和GD3表达评分较低，尽管GD2染色略强于GD3。
图6示出了卵巢癌组织活检中GD2和GD3的免疫染色。在IHC中，交界性(早期)和高级别(晚期)活检均对GD2和GD3呈阳性。当使用2种技术研究同一患者的样品时，液体活检数据与IHC相关。
图7示出了黑色素瘤组织活检中GD2和GD3的免疫染色。近100％的黑色素瘤组织活检在IHC中对GD2和GD3呈阳性。
图8示出了改编自国家综合癌症网络卵巢癌临床实践指南(NationalComprehensive Cancer Networks Clinical Practice Guidelines in Ovarian Cancer)v3.2019的示意图。当前用于监测和风险评估指南不足以进行早期检测或监测。添加本公开的GD2/GD3测试(黄色框)将检测到早期和后期卵巢癌，所述卵巢癌中的许多被CA-125护理标准液体活检遗漏。
图9A-图9B示出了卵巢癌活检中肿瘤标志物神经节苷脂(TMG)的免疫组织化学检测。图像示出了抗GD2(图9A)和抗GD3(图9B)抗体染色的代表性图片，评分为“0”(无染色)、“1”(弱染色)、“2”(中度染色)和“3”(强染色)。评分“0”和“1”被认为是阴性的，并且评分“2”和“3”被认为是阳性的。每列的右小图是黑色矩形内区域的更高放大倍率。
图10A-图10D示出了肿瘤标志物神经节苷脂(TMG)在卵巢癌患者中高表达。代表性图像示出了正常、交界性和卵巢组织活检中的GD2(图10A)和GD3(图10B)免疫组织化学。底部小图示出了黑色矩形内顶部小图区域的更高放大率。GD2和GD3特异性染色肿瘤细胞，但不染色周围的正常组织。染色主要定位于细胞质膜和细胞质中。对GD2(图10C)和GD3(图10D)呈阴性(评分“0”和“1”)或阳性(评分“2”和“3”)的正常、交界性和卵巢患者的百分比。与正常相比，TMG的表达在交界性和卵巢患者中显著更高(n＝9正常；n＝16交界性；n＝151卵巢)，p<0.0001(卡方)。
图11A-图11D示出了肿瘤标志物神经节苷脂(TMG)在不同卵巢癌亚型中高表达。代表性图像示出了透明细胞和子宫内膜癌组织活检中；以及来自高级别浆液性癌(HGSC)患者的减瘤手术后(PDS)癌症组织活检的GD2(图11A)和GD3(图11B)免疫组织化学。底部小图示出了黑色矩形内顶部小图区域的更高放大率。对GD2(图11C)和GD3(图11D)呈阴性(评分“0”和“1”)或阳性(评分“2”和“3”)的卵巢癌亚型患者的百分比。不同卵巢癌亚型的GD2和GD3表达水平类似，但是GD2染色存在微小的统计差异(p＝0.035，卡方)。对于GD3(n＝27透明细胞；n＝17子宫内膜；n＝55HGSC(PDS))没有观察到统计差异。
图12A-图12C示出了肿瘤标志物神经节苷脂(TMG)表达在用新辅助化学疗法(NACT)治疗的HGSC患者中降低。代表性图像示出了HGSC(PDS)或HGSC(NACT)中的GD2(图12A)和GD3(图12B)免疫组织化学。阳性和阴性患者的定量(以百分比为单位)示出，在接受NACT的患者与接受PDS的患者中，GD2和GD3表达显著降低(n＝52NACT，n＝55PDS)。对于GD2，p＝0.017并且对于GD3，p＝0.007(卡方)。
图13A-图13F示出了肿瘤标志物神经节苷脂(TMG)染色(IHC)的较高评分与更具侵袭性的卵巢癌亚型相关。在正常患者与交界性和卵巢癌患者(图13A、图13B)；卵巢癌亚型(图13C、图13D)和HGSC(PDS与NACT)(图13E、图13F)中GD2和GD3评分的定量(以百分比为单位)。与交界性和正常(图13A、图13B)相比，卵巢癌患者显示出显著更高的GD2和GD3染色评分。在HGSC(PDS)患者与透明细胞或子宫内膜癌亚型(图13C、图13D)或与HGCS(NACT)患者(图13E、图13F)中，GD2和GD3评分显著更高。(n＝9正常；n＝16交界性；n＝151卵巢；根据n＝151卵巢，n＝27透明细胞；n＝17子宫内膜；n＝55HGSC(PDS)和n＝52HGSC(NACT)。p<0.001(卡方)。
图14A-图14F示出了与临床使用的CA-125卵巢癌标志物相比，肿瘤标志物神经节苷脂(TMG)检测到阳性癌症患者百分比类似。使用IHC检测TMG，并且在液体活检中检测CA-125。示出了正常患者与交界性和卵巢癌患者(图14A)；卵巢癌亚型(图14C)和HGSC(PDS与NACT)(图14E)中的CA-125水平。尽管CA-125水平在图14A、图14C和图14E中存在统计差异(p<0.001，卡方)，但疾病的侵袭性与检测到的CA-125值之间没有直接相关性。阳性患者(以百分比为单位)GD2+、GD3+、GD2+GD3+、CA-125+的定量或在交界性与卵巢癌患者(图14B)；卵巢癌亚型(图14D)和HGSC(PDS与NACT)(图14F)中，对所有标志物一起呈阳性。单独或组合的所有标志物实现阳性卵巢癌患者的类似检测水平。基于平均年龄将女性归类为绝经后的(对于正常，62±6岁；对于交界性，57±15岁；对于所有卵巢，61±12岁；对于透明细胞，55±12岁；对于子宫内膜，60±10岁；对于HGSC(PDS)，63±12岁；并且对于HGSC(NACT)，63±10岁)。除透明细胞组与HGSC(PDS)患者外，各组之间未发现显著的年龄差异(p<0.01，使用邦费罗尼校正(Bonferroni correction)进行多重比较的单向ANOVA)(n＝9正常；n＝16交界性；n＝151卵巢；根据n＝151卵巢，n＝27透明细胞；n＝17子宫内膜；n＝55HGSC(PDS)和n＝52HGSC(NACT))。
图15A-图15D示出了肿瘤标志物神经节苷脂(TMG)在晚期卵巢癌中表达更高。疾病不同分期的阳性和阴性GD2(图15A)、CA-125(图15B)或GD3(图15C)的定量(以百分比为单位)。使用IHC检测TMG，并且在液体活检中检测CA-125。患者总数(100％)对应于每个单独分期(I或II或III或IV)检测到的患者总和。所有标志物在更晚期的卵巢癌中均显著高表达(p<0.001，卡方)。(图15D)通过每个标志物检测到的阳性患者的百分比的比较。未观察到显著差异(n＝162名患者)。
图16A-图16B示出了5年总存活期(5YOS)。在(图16A)卵巢患者和(图16B)HGSC(PDS)中，肿瘤标志物神经节苷脂(TMG)与5YOS之间的相关性。使用IHC检测TMG。数据示出为GD2+和GD2-、或GD3+和GD3-、或GD2-GD3-和GD2+GD3+中的存活率百分比。没有报告统计差异，但是通常与GD2-、GD3-和GD2-GD3-患者相比，GD2+、GD3+和GD2+GD3+患者的存活率往往略降低(在图16A中，n＝151卵巢；在图16B中，n＝55HGSC(PDS))。
图17A-图17D示出了通过ELISA检测液体活检中的GD2是比CA-125更敏感的卵巢标志物。使用IHC检测TMG(图17A-图17B)，其水平与使用ELISA在液体活检中测量的TMG的水平相匹配(图17C)。还使用ELISA在液体活检中检测CA-125(图17D)。在来自正常、交界性和卵巢癌患者的组织活检中阴性或阳性GD2(图17A)或GD3(图17B)的定量(以百分比为单位)。与正常相比，TMG的表达在交界性和卵巢患者中显著更高(n＝9正常；n＝7交界性；n＝33卵巢)，p<0.0001(卡方)。(图17C)在来自(图17A)所示的相同交界性和卵巢患者的液体活检中分析的GD2水平。与正常患者相比，GD2在卵巢癌和交界性癌症患者中显著升高(n＝19正常，n＝7交界性，n＝33卵巢)(p<0.0001，卡方)。(图17D)(图17A)和(图17C)中分析的相同患者的CA-125水平。与正常相比，卵巢患者的CA-125水平显著更高(n＝8正常，n＝7交界性，n＝33卵巢)(p<0.0001，卡方)，但与交界性相比则不然。约40％的交界性患者和8％的卵巢癌患者对CA-125呈阴性，但通过ELISA，GD2阳性表明GD2是显著的优越标志物，主要用于疾病的早期。
图18A-图18D示出了不同癌症分期的卵巢标志物的比较检测。通过IHC(图18A)、通过ELISA(图18B)或CA-125(图18C)检测到的对GD2呈阳性或阴性的患者的百分比。GD2和CA-125阳性患者的百分比显著高于阴性患者的百分比(对于18A，p＝0.04；对于图18B，p＝0.02；并且对于C，p<0.0001，卡方)。(图18D)通过每种技术检测到的阳性患者的百分比的比较。患者总数(100％)对应于所有分期(I+II+III+IV)检测到的患者总和。未观察到显著差异(n＝41名患者)。
图19A-19D示出了直接ELISA实验的结果，表明三嗪-三GD2和三嗪-三GD3分别被抗GD2或抗GD3 mAb识别。图19A示出了抗GD2抗体的结合。图19B示出了来自接种疫苗的小鼠的血清与GD2抗原的结合。图19C示出了与抗GD3抗体的结合。图19D示出了来自接种疫苗的小鼠的血清与GD3抗原的结合。
图20A和20B示出了竞争性ELISA实验的结果，所述结果表明三嗪-三GD2和三嗪-三GD3分别被抗GD2或抗GD3 mAb识别；导致与固定到板上的GD2或GD3结合的mAb竞争。图20A示出了单克隆抗体与三嗪-GD2的结合。图20B示出了单克隆抗体与三嗪-GD3的结合。
具体实施方式
神经节苷脂是超过>40种不同的含唾液酸的鞘糖脂家族。每个聚糖树在结构上都是独一无二的，并且通过名称定义每个神经节苷脂。如GM1等一些神经节苷脂是正常且普遍存在的。如GD2和GD3等其它神经节苷脂是肿瘤标志物(表3)。它们在正常细胞中低/不存在，而在癌症中以高水平表达。因此，GD2和GD3是病原学生物标志物(即，对癌症具有不可或缺的功能的生物标志物)，它们是优选的，因为癌症不容易下调标志物的表达。
GD2和GD3调节膜流动性、筏大小和功能，并且为肿瘤提供生长/转移、免疫逃避和阻断方面的优势。脂质尾部嵌入细胞膜的外叶，并且长度可变。可变脂质长度的生物学相关性尚不清楚。
GD2或GD3提供稳定、不变和非突变的靶标，表达在哺乳动物物种中是保守的(聚糖树是相同的)，表达在细胞系和原发性肿瘤中是同质和一致的，并且在化学疗法后存活的肿瘤细胞中的表达密度不会下调。除了存在于肿瘤细胞表面上之外，GD2和GD3可以脱落到细胞外环境中。
然而，对组织或循环中GD2和GD3表达的研究仅报告了少数患者样品。用于检测可能在组织或血清中表达的GD2或GD3的测定不是定量或标准化的。研究使用仅产生估计值的薄层色谱法(TLC)或脂质相关唾液酸(LASA)，并且得出相互矛盾的结论。研究GD2或GD3的工具很少。即使在40年的研究后，用于设计测定的针对GD2或GD3的mAb也非常少，并且许多mAb都不是特异性的，鉴于神经节苷脂结构的微小差异，大多数是次优的并且具有交叉反应性(图1)。由于GD2和GD3是糖脂，并且所述产物可以通过多种生物合成途径和酶生成，因此监测突变或mRNA表达是不可行的。GD2和GD3仍未充分开发用于诊断任何癌症。
因此，本公开提供了与神经节苷脂(例如，GD2或GD3)特异性结合的单克隆抗体和其抗原结合片段以及免疫球蛋白、多肽、其核酸和使用此类抗体用于诊断和预后目的的方法。本文进一步提供了基于质谱的新型方法，用于检测神经节苷脂(例如，GD2、GD3、GM2和/或GD1)的存在、水平和/或脂质长度。本文提出的癌症患者的神经节苷脂脂质长度变化的异质性发现提供了一种新型生物标志物和此类生物标志物用于癌症诊断和预后的用途。
定义
冠词“一个”和“一种”在本文中指代冠词的一个/种或多于一个/种(即，至少一个/种)语法宾语。举例来说，“要素”意指一个/种要素或超过一个/种要素。
如本文所使用的，术语“复合抗体”是指具有可变区的抗体，所述可变区包括来自两个或更多个不相关可变区的种系或非种系免疫球蛋白序列。另外，术语“复合人抗体”是指具有源自人种系或非种系免疫球蛋白序列的恒定区和包括来自两个或更多个不相关人可变区的人种系或非种系序列的可变区的抗体。
如果分子与底物共价或非共价缔合，则分子被“固定”或“附着”到底物上，这样在没有大部分分子从底物解离的情况下，底物可以用流体(例如标准柠檬酸盐，pH 7.4)冲洗。
术语“CDR”和其复数“CDR”是指互补决定区(CDR)，其中三个构成轻链可变区(CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3)的结合特征，并且三个构成重链可变区(CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)的结合特征。CDR有助于抗体分子的功能活性，并且由包括支架或框架区的氨基酸序列隔开。确切定义的CDR边界和长度取决于不同的分类和编号系统。因此，Kabat、Chothia、联系人或任何其它边界定义可能会引用CDR。尽管边界不同，但这些系统中的每个系统在可变序列内构成所谓的“高变区”的内容上有一定程度的重叠。因此，根据这些系统的CDR定义可以在长度和边界区域方面相对于相邻框架区不同。参见例如Kabat、Chothia和/或MacCallum等人(Kabat等人,“具有免疫学意义的蛋白质的序列(Sequences of Proteins ofImmunological Interest)”第5版,美国卫生与公共事业部(U.S.Department of Healthand Human Services),1992；Chothia等人(1987)《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》196,901；以及MacCallum等人,《分子生物学杂志》(1996)262,732中，所述文献中的每一个通过引用整体并入本文)。
如本文所使用的，术语“Fc区”用于描述免疫球蛋白重链的C端区，包括天然序列Fc区和变体Fc区。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的界限可能变化，但人类IgG重链Fc区通常定义为从Cys226位置或从Pro230处的氨基酸残基延伸至其羧基端。用于本发明的抗体的合适天然序列Fc区包括人IgG1、IgG2(IgG2A、IgG2B)、IgG3和IgG4。
如本文所使用的，术语“KD”旨在指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数。所公开的本发明的抗体的结合亲和力可以通过标准抗体-抗原测定测量或确定，例如竞争测定、饱和测定或如ELISA或RIA等标准免疫测定。
脂质长度是指对诊断而言重要的神经节苷脂的脂质尾部的长度。脂质尾部嵌入细胞膜的外叶。脂质的长度可以是可变的。值得注意的是，在神经节苷脂之间以及单个神经节苷脂内进行比较时，会出现这些差异。因此，脂质异质性和其变化对于本文所描述的诊断和方法而言重要。
术语“微小残留病灶”是本领域公认的，并且用于描述在癌症治疗期间或之后，当患者处于缓解期时体内的少量癌细胞。剩余细胞的数量可能很少以至于它们不会引起任何体征或症状，并且通常无法通过传统方法检测到。它是癌症复发的主要原因。
术语“新辅助疗法”是指在主要治疗之前给予的治疗。新辅助疗法的实例可以包括化学疗法、放射疗法和激素疗法。
当核酸被放置成与另一核酸序列处于功能关系中时，所述核酸是“可操作地连接的”。例如，如果启动子或增强子影响序列的转录，则其与编码序列可操作地连接。关于转录调节序列，可操作地连接意味着被连接的DNA序列是连续的，并且在需要连接两个蛋白质编码区时是连续的并且在阅读框中。对于开关序列，可操作地连接表示序列能够实现开关重组。
术语“预防”是本领域公认的，并且当用于与如病毒/细菌感染等病状或如癌症等疾病相关时在本领域中是众所周知的，并且包括施用治疗例如，相对于未接受治疗的受试者，减少受试者医学病状的症状的频率或延迟其发作的组合物。因此，预防癌症包括例如，相对于未治疗的对照群体，减少接受预防性治疗的患者群体中可检测的癌性生长的数量，和/或与未治疗的对照群体相比，延迟接受治疗的群体中可检测的癌性生长的出现，例如，通过统计学和/或临床显著量。
术语“缓解”是本领域公认的，并且是指癌症的体征和症状减轻的情况。
如本文所使用的，“受试者”是指任何健康的动物、哺乳动物或人类或任何患有癌症的动物、哺乳动物或人类。术语“受试者”可与“患者”互换。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，如非人灵长类动物、绵羊、狗、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。
化合物的“治疗有效量”是能够在接受治疗的患者中产生医学上期望的结果的量例如，诱导针对神经节苷脂的免疫应答、减少肿瘤负荷、减少肿瘤细胞的生长或减轻与癌症相关的任何症状，具有可接受的益处:风险比，优选地是在人类或非人类哺乳动物中。
术语“治疗”包括预防性和/或治疗性治疗。术语“预防性或治疗性”治疗是本领域公认的，并且包括向宿主施用主题组合物中的一种或多种主题组合物。如果治疗是在临床表现出不希望的病状(例如，宿主动物的疾病或其它不希望的状态)之前施用的，则其是预防性的(即，其保护宿主免于发展出不希望的病状)，而如果治疗是在表现出不希望的病状之后施用的，则其是治疗性的(即，其旨在减轻、改善或稳定现有的不希望的病状或其副作用)。
抗原结合蛋白
本文提供了与神经节苷脂(例如，GD2或GD3)结合的抗原结合蛋白。在各个实施例中，抗原结合蛋白与神经节苷脂的碳水化合物部分(例如，GD2或GD3)结合。本公开的抗原结合蛋白可以采用本领域已知的抗原结合蛋白的许多形式中的任何一种形式。在各个实施例中，本公开的抗原结合蛋白采用抗体或抗原结合抗体片段或抗体蛋白产物的形式。
在本公开的各个实施例中，抗原结合蛋白包括抗体、基本上由所述抗体组成或由所述抗体组成。如本文所使用的，术语“抗体”是指具有常规免疫球蛋白形式的蛋白质，包括重链和轻链，并且包括可变区和恒定区。例如，抗体可以是IgG，所述IgG是相同的两对多肽链的“Y形”结构，每对具有一个“轻”链(通常，分子量为约25kDa)和一个“重”链(通常，分子量为约50-70kDa)。抗体具有可变区和恒定区。在IgG形式中，可变区通常为约100-110个或更多个氨基酸，包括三个互补决定区(CDR)，主要负责抗原识别，并且在与不同抗原结合的其它抗体中显著不同。恒定区允许抗体募集免疫系统的细胞和分子。可变区由每条轻链和重链的N端区组成，而恒定区由重链和轻链中的每个的C端部分组成。(Janeway等人,“抗体分子的结构和免疫球蛋白基因(Structure of the Antibody Molecule and theImmunoglobulin Genes)”,《免疫生物学：健康与疾病中的免疫系统(Immunobiology:TheImmune System in Health and Disease)》,第4版爱思唯尔科学有限公司/加兰出版社(Elsevier Science Ltd./Garland Publishing),(1999))。
除非本文另有说明，否则“抗体(antibody)”或“抗体(antibodies)”广泛涵盖天然存在形式的抗体(例如IgG、IgA、IgM、IgE)和重组抗体如单链抗体、嵌合抗体和人源化抗体和多特异性抗体以及所有上述的片段和衍生物，所述片段和衍生物至少具有抗原结合位点。抗体衍生物可以包括与抗体缀合的蛋白质或化学部分。抗体是指包括通过二硫键相互连接的至少两个重(H)链和两个轻(L)链的糖蛋白或其抗原结合部分。每个重链包括一个重链可变区(本文缩写为VH)和一个重链恒定区。重链恒定区包括三个结构域，CH1、CH2以及CH3。每个轻链包括一个轻链可变区(本文缩写为VL)和一个轻链恒定区。轻链恒定区包括一个结构域，CL。VH区和VL区可以进一步细分为被称作互补决定区(CDR)的超变区，所述超变区散布有更保守的被称作构架区(FR)的区域。每个VH和VL由按以下顺序从氨基端到羧基端布置的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。如本文所指示的，框架区或FR残基是除了超变残基以外的那些可变结构域残基。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。
抗体的CDR的一般结构和特性已在本领域中描述。简言之，在抗体支架中，CDR嵌入重链和轻链可变区的框架内，其中它们构成了主要负责抗原结合和识别的区域。在框架区内(Kabat等人,1991的指定框架区1-4、FR1、FR2、FR3和FR4；还参见Chothia和Lesk,1987,同上)，可变区通常包括至少三个重链或轻链CDR(Kabat等人,1991,具有免疫学意义的蛋白质的序列,马里兰州贝塞斯达的国立卫生研究院公共卫生署(Public Health ServiceN.I.H.,Bethesda,Md.)；还参见Chothia和Lesk,1987,《分子生物学杂志》196:901-917；Chothia等人,1989,《自然(Nature)》342:877-883)。在相关实施例中，框架的残基被改变。可以改变的重链框架区位于指定为H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4的区域内，所述区域围绕重链CDR残基，并且可以改变的轻链框架区的残基位于指定为L-FR1、L-FR2、L-FR3和L-FR4的区域内，所述区域围绕轻链CDR残基。构架区内的氨基酸可以被例如，在人框架或人共有框架中鉴定的任何合适的氨基酸替换。
抗体可以包括本领域已知的任何恒定区。人轻链分类为κ和λ轻链。重链被分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG具有若干个亚类，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgM具有亚类，包括但不限于IgM1和IgM2。本公开的实施例包括所有此类类别或同种型的抗体。轻链恒定区可以是例如κ型或λ型轻链恒定区，例如，人κ型或λ型轻链恒定区。重链恒定区可以是例如α型、δ型、ε型、γ型或μ型重链恒定区，例如，人α型、δ型、ε型、γ型或μ型重链恒定区。因此，在各个实施例中，抗体是同种型IgA、IgD、IgE、IgG或IgM的抗体，包括IgG1、IgG2、IgG3或IgG4中的任何一种。在各个方面，抗体包括恒定区，所述恒定区相对于天然存在的对应物包括一个或多个氨基酸修饰，以便提高半衰期/稳定性或使抗体更适合表达/可制造性。在各种情况下，抗体包括恒定区，其中天然存在的对应物中存在的C端Lys残基被去除或剪掉。
抗体可以是单克隆抗体。在一些实施例中，抗体包括与哺乳动物例如，小鼠、兔、山羊、马、鸡、仓鼠、人等产生的天然存在的抗体基本上类似的序列。在这方面，抗体可以被认为是哺乳动物抗体例如，小鼠抗体、兔抗体、山羊抗体、马抗体、鸡抗体、仓鼠抗体、人抗体等。在某些方面，抗原结合蛋白是如人抗体等抗体。在某些方面，抗原结合蛋白是嵌合抗体或人源化抗体。术语“嵌合抗体”是指含有来自两种或更多种不同抗体的结构域的抗体。例如，嵌合抗体可以含有来自一个物种的恒定结构域和来自第二物种的可变结构域，或者更通常地，可以含有来自至少两个物种的氨基酸序列的延伸段。嵌合抗体还可以含有同一物种内的两种或更多种不同抗体的结构域。当关于抗体使用时，术语“人源化”是指至少具有来自非人来源的CDR区的抗体，其被工程化以具有比原始来源抗体更类似于真人抗体的结构和免疫功能。例如，人源化可以涉及将来自非人抗体(如小鼠抗体)的CDR移植到人抗体中。人源化还可以涉及选择氨基酸取代以使非人序列更类似于人序列。包括人抗体重链和轻链恒定区的序列信息的信息可以通过Uniprot数据库以及抗体工程化和产生领域的技术人员众所周知的其它数据库公开获得。例如，IgG2恒定区可作为Uniprot编号P01859从Uniprot数据库获得，通过引用并入本文。
本文使用的抗体还包括抗体的抗原结合部分。抗原结合部分是指保留与抗原特异性结合的能力的抗体的一个或多个片段(例如，神经节苷脂)。已经证明，抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段执行。涵盖在抗体的抗原结合部分内的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，包括在铰链区处由二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等人,(1989)《自然》341:544-546)；以及(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码，但是这两个结构域可以使用重组方法通过使这两个结构域能够成为单个蛋白链的合成接头来连接，在所述单个蛋白链中，VL区和VH区配对以形成单价多肽(被称为单链Fv(scFv))；参见例如Bird等人,(1988)《科学(Science)》242:423-426；和Huston等人,(1988)《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》85:5879-5883；以及Osbourn等人1998,《自然生物技术(Nature Biotechnology)》16:778)。此类单链抗体还旨在涵盖在抗体的抗原结合部分内。
抗体可以被酶(例如木瓜蛋白酶和胃蛋白酶)切割成片段。木瓜蛋白酶切割抗体以产生两个Fab片段和单个Fc片段。胃蛋白酶切割抗体以产生F(ab′)2片段和pFc′片段。在本公开的各个方面，本公开的抗原结合蛋白是抗体的抗原结合片段(又称为抗原结合抗体片段、抗原结合片段、抗原结合部分)。在各种情况下，抗原结合抗体片段是Fab片段或F(ab′)2片段。
抗体的架构已被利用来创建范围不断增加的替代抗体形式，所述替代抗体形式跨至少或约12–150kDa的分子量范围，并且化合价(n)范围为单体(n＝1)至二聚体(n＝2)、三聚体(n＝3)、四聚体(n＝4)，并且甚至可能更高；此类替代抗体形式在本文中称为“抗体蛋白产物”。抗体蛋白产物包括那些基于完整抗体结构的产物和那些模拟保留完整抗原结合能力的抗体片段的产物例如，scFvs、Fab和VHH/VH(下文讨论)。保留其完整抗原结合位点的最小抗原结合片段是Fv片段，所述片段完全由可变(V)区组成。可溶性柔性氨基酸肽接头用于将V区连接到scFv(单链片段可变)片段以稳定分子，或者将恒定(C)结构域添加到V区以生成Fab片段[片段，抗原结合]。scFv和Fab片段都可以很容易地在宿主细胞中产生，例如原核宿主细胞。其它抗体蛋白产物包括二硫键稳定的scFv(ds-scFv)、单链Fab(scFab)以及二聚体和多聚体抗体形式，如双功能抗体、三功能抗体和四功能抗体或微型抗体(miniAb)，它们包括由连接到寡聚化结构域的scFv组成的不同形式。最小的片段是骆驼重链Ab的VHH/VH以及单结构域Ab(sdAb)。最常用于创建新型抗体形式的构建块是单链可变(V)结构域抗体片段(scFv)，所述单链可变结构域抗体片段包括来自通过约15个氨基酸残基的肽接头连接的重链和轻链的V结构域(VH和VL结构域)。肽体或肽-Fc融合体是又另一种抗体蛋白产物。肽体的结构由嫁接到Fc结构域上的生物活性肽组成。肽体在本领域中有很好地描述。参见例如，Shimamoto等人,《mAb》4(5):586-591(2012)。
其它抗体蛋白产物包括单链抗体(SCA)；双功能抗体；三功能抗体；四功能抗体；双特异性或三特异性抗体等。双特异性抗体可以分为五大类：BsIgG、附加的IgG、双特异性抗体(BsAb)片段、双特异性融合蛋白和BsAb缀合物。参见例如，Spiess等人,《分子免疫学(Molecular Immunology)》67(2)A部分:97-106(2015)。
在各个方面，本公开的抗原结合蛋白包括这些抗体蛋白产物中的任何一种抗体蛋白产物、基本上由其组成或由其组成。在各个方面，本公开的抗原结合蛋白包括以下中的任何一种、基本上由其组成或由其组成：Fab VHH/VH、Fv片段、ds-scFv、scFab、Fv、F(ab′)2、Fab′、dsFv、scFv、sc(Fv)2、二聚体抗体、多聚体抗体(例如，双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体)、miniAb、骆驼重链抗体的肽体VHH/VH、sdAb、双功能抗体、三功能抗体和四功能抗体。
在各种情况下，本公开的抗原结合蛋白是单体形式或聚合体、寡聚体或多聚体形式的抗体蛋白产物。
在某些方面，本文提供了一种单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体与神经节苷脂的碳水化合物部分特异性结合。在一些实施例中，神经节苷脂是：(a)GD2；(b)GD3；或(c)GD2和GD3。
在各个实施例中，抗神经节苷脂抗体(针对GD2或GD3)或其抗体变体选自由以下组成的组：人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单克隆抗体、重组抗体、抗原结合抗体片段、单链抗体、单体抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、Fv、F(ab′)2、Fab′、dsFv、scFv、sc(Fv)2、IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体和IgG4抗体。
在某些方面，本文提供了一种单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体包括：a)重链互补决定区(CDR)序列，所述重链CDR序列与选自由表1中列出的序列组成的组的重链CDR序列具有至少或约30％、35％、40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％同一性；和/或b)轻链CDR序列，所述轻链CDR序列与选自由表1中列出的序列组成的组的轻链CDR序列具有至少或约30％、35％、40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％同一性。
在某些方面，提供了一种单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体包括：a)重链可变结构域(VH)，所述重链可变结构域与选自由表2中列出的VH序列组成的组的VH序列具有至少或约30％、35％、40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％同一性；和/或b)轻链可变结构域(VL)序列，所述轻链可变结构域序列与选自由表2中列出的VL序列组成的组的VL序列具有至少或约30％、35％、40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％同一性。
在某些方面，提供了一种单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体或其抗原结合片段包括：a)如表1所示的重链CDR1、CDR2和CDR3的组合，或其仅一个或两个氨基酸不同或具有至少或约30％、35％、40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％序列同一性的变体序列；和/或b)如表1所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3的组合，或其仅一个或两个氨基酸不同或具有至少或约30％、35％、40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％序列同一性的变体序列。
在某些方面，本文提供了一种单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体或其抗原结合片段包括：a)如表2所示的VH序列，或其仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约30％、35％、40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％序列同一性的变体序列；和/或b)如表2所示的VL序列，或其仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约30％、35％、40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％序列同一性的变体序列。
在一些实施例中，提供了一种单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体包括：a)选自由表2中列出的VH序列组成的组的VH序列；和/或b)选自由表2中列出的VL序列组成的组的VL序列。
在一些实施例中，单克隆抗体或其抗原结合片段包括选自以下的六个CDR氨基酸序列：a)SEQ ID NO:2、4、6、8、10和12(克隆4)，或其仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约30％、35％、40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％序列同一性的变体序列；b)SEQ ID NO:14、16、18、20、22和24(克隆6)，或其仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约30％、35％、40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％序列同一性的变体序列；c)SEQ ID NO:26、28、30、32、34和36(克隆7)，或其仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约30％、35％、40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％序列同一性的变体序列；d)SEQ ID NO:38、40、42、44、46和48(克隆8)，或其仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约30％、35％、40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％序列同一性的变体序列；e)SEQ ID NO:50、52、54、56、58和60(克隆9)，或其仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约30％、35％、40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％序列同一性的变体序列；f)SEQ ID NO:62、64、66、68、70和72(克隆10)，或其仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约30％、35％、40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％序列同一性的变体序列；g)SEQ IDNO:74、76、78、80、82和84(克隆13)，或其仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约30％、35％、40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％序列同一性的变体序列；h)SEQ ID NO:86、88、90、92、94和96(克隆14)，或其仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约30％、35％、40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％序列同一性的变体序列；i)SEQ ID NO:98、100、102、104、106和108(克隆15)，或其仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约30％、35％、40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％序列同一性的变体序列；j)SEQ ID NO:110、112、114、116、118和120(克隆17)，或其仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约30％、35％、40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％序列同一性的变体序列；k)SEQ ID NO:122、124、126、128、130和132(克隆18)，或其仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约30％、35％、40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％序列同一性的变体序列；以及l)SEQ ID NO:134、136、138、140、142和144(克隆19)，或其仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约85％序列同一性的变体序列。
在一些实施例中，单克隆抗体或其抗原结合片段包括选自以下的VH氨基酸序列和VL氨基酸序列：a)SEQ ID NO:146和148，或其仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约30％、35％、40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％序列同一性的变体序列；b)SEQ ID NO:150和152，或其仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约30％、35％、40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％序列同一性的变体序列；c)SEQ ID NO:154和156，或其仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约30％、35％、40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％序列同一性的变体序列；d)SEQ IDNO:158和160，或其仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约30％、35％、40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％序列同一性的变体序列；e)SEQ ID NO:162和164，或其仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约30％、35％、40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％序列同一性的变体序列；f)SEQ ID NO:166和168，或其仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约30％、35％、40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％序列同一性的变体序列；g)SEQ ID NO:170和172，或其仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约30％、35％、40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％序列同一性的变体序列；h)SEQ ID NO:174和176，或其仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约30％、35％、40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％序列同一性的变体序列；i)SEQ IDNO:178和180，或其仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约30％、35％、40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％序列同一性的变体序列；j)SEQ ID NO:182和184，或其仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约30％、35％、40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％序列同一性的变体序列；k)SEQ ID NO:186和188，或其仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约30％、35％、40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％序列同一性的变体序列；以及l)SEQ ID NO:190和192，或其仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约30％、35％、40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％序列同一性的变体序列。
进一步提供了许多实施例，所述实施例可以应用于本文所描述的本发明的任何方面。例如，在一些实施例中，单克隆抗体或其抗原结合片段是嵌合的、人源化的、复合的、鼠类的或人的。在一些实施例中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包括选自由以下组成的组的免疫球蛋白重链恒定结构域：IgG、IgG1、IgG2、IgG2A、IgG2B、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgD和IgE恒定结构域。在一些实施例中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段被可检测地标记，包括效应子结构域，包括Fc结构域和/或选自由以下组成的组：Fv、F(ab′)2、Fab′、dsFv、scFv、sc(Fv)2片段、双功能抗体、二价、多价和双功能工程化结构体。在一些实施例中，单克隆抗体或其抗原结合片段可从杂交瘤获得。在一些实施例中，单克隆抗体或其抗原结合片段与神经节苷脂(例如，GD2或GD3)特异性结合。在一些实施例中，单克隆抗体或其抗原结合片段与神经节苷脂(例如，GD2或GD3)的碳水化合物部分特异性结合。
在某些方面，提供了包括本文所描述的单克隆抗体或其抗原结合片段的缀合物。在一些实施例中，缀合物包括可检测部分(例如，荧光团、酶、放射性同位素等)。
在某些方面，提供了免疫球蛋白重链和/或免疫球蛋白轻链，其选自由表2中列出的免疫球蛋白重链序列和免疫球蛋白轻链序列组成的组。
序列同一性/同源性
功能保守变体是其中蛋白质或酶中的给定氨基酸残基已经被改变而不更改多肽的整体构象和功能的变体，包括但不限于用具有类似特性(例如，极性、氢键电势、酸性、碱性、疏水性、芳香族等)的氨基酸替换氨基酸。除了那些被指示为保守的氨基酸之外的氨基酸在蛋白质中可以不同，使得类似功能的任何两种蛋白质之间的蛋白质或氨基酸序列相似度百分比可以变化并且可以是如根据比对方案，如通过聚类方法确定的例如70％至99％，其中相似度是基于MEGALIGN算法。功能保守变体还包括如通过BLAST或FASTA算法确定的具有至少60％氨基酸同一性，优选地至少75％，更优选地至少85％，仍优选地至少90％并且甚至更优选地至少95％，并且具有与其所比较的天然或亲本蛋白相同或基本上类似的性质或功能的多肽。
两个序列之间的同一性百分比是由所述序列所共有的相同位置的数量的函数(即，同一性％＝相同位置的#/位置的总#×100)，所述函数考虑了需要针对两个序列的最佳比对而引入的空位的数量和每个空位的长度。两个序列之间的序列的比较和同一性百分比的确定可以使用如以下非限制性实例中所描述的数学算法来完成。
两个核苷酸序列之间的同一性百分比可以使用GCG软件包中的GAP程序(可在GCG公司网站的万维网上获得)，使用NWSgapdna来确定。CMP矩阵，并且间隙权重为40、50、60、70或80，并且长度权重为1、2、3、4、5或6。两个核苷酸或氨基酸序列之间的同一性百分比还可以使用E.Meyers和W.Miller(《计算机在生物科学中的应用(CABIOS)》,4:11 17,1989)的已并入到ALIGN程序(版本2.0)的算法，使用PAM120权重残基表、12的空位长度罚分以及4的空位罚分来确定。另外，两个氨基酸序列之间的同一性百分比可以使用已经合并到GCG软件包中的GAP程序中的Needleman和Wunsch(《分子生物学杂志》(48):444 453(1970))算法(可在GCG公司网站的万维网上获得)，使用Blosum 62矩阵或PAM250矩阵以及空位权重16、14、12、10、8、6或4以及长度权重1、2、3、4、5或6确定的。
本发明的核酸和蛋白质序列可以进一步用作“查询序列”以对公共数据库进行搜索，以例如标识相关序列。此类检索可以使用以下的NBLAST和XBLAST程序(版本2.0)：Altschul等人,(1990)《分子生物学杂志》215:403 10。可以用NBLAST程序(得分＝100，字长12)进行BLAST核苷酸检索，以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。可以用XBLAST程序(评分＝50，字长＝3)进行BLAST蛋白质检索，以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的有空位的比对，可以利用带空位的BLAST，如在以下中所描述的：Altschul等人,(1997),《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》25(17):3389 3402。当利用BLAST程序和带空位的BLAST程序时，可以使用相应程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数(可在NCBI网站的万维网上获得)。
序列
如本文所使用的，编码区是指核苷酸序列的包括翻译成氨基酸残基的密码子的区域，而非编码区是指核苷酸序列的不翻译成氨基酸的区域(例如，5′和3′非翻译区)。
与…互补(Complement[to])或互补是指两条核酸链的区域之间或同一核酸链的两个区域之间的序列互补性的广义概念。已知如果残基是胸腺嘧啶或尿嘧啶，则第一核酸区的腺嘌呤残基能够与和第一区反平行的第二核酸区的残基形成特定的氢键(碱基配对)。类似地，已知如果残基是鸟嘌呤，则第一核酸链的胞嘧啶残基能够与和第一链反平行的第二核酸链的残基进行碱基配对。如果当两个区域以反平行方式布置时，第一区的至少一个核苷酸残基能够与第二区的残基进行碱基配对，则核酸的第一区与相同或不同核酸的第二区互补。在一些实施例中，第一区包括第一部分并且第二区包括第二部分，由此，当第一部分和第二部分以反平行方式布置时，第一部分的至少或约50％，并且优选地至少或约75％、至少或约90％或至少或约95％的核苷酸残基能够与第二部分中的核苷酸残基进行碱基配对。在其它实施例中，第一部分的所有核苷酸残基都能够与第二部分中的核苷酸残基进行碱基配对。
当核酸被放置成与另一核酸序列处于功能关系中时，所述核酸是可操作地连接的。例如，如果启动子或增强子影响序列的转录，则其与编码序列可操作地连接。关于转录调节序列，可操作地连接意味着被连接的DNA序列是连续的，并且在需要连接两个蛋白质编码区时是连续的并且在阅读框中。对于开关序列，可操作地连接表示序列能够实现开关重组。
特定蛋白质的氨基酸序列与可以编码蛋白质的核苷酸序列之间存在已知且明确的对应关系，如基因密码所定义(如下所示)。同样，特定核酸的核苷酸序列与由所述核酸编码的氨基酸序列之间存在已知且明确的对应关系，如基因密码所定义的。
基因密码
基因密码的重要且众所周知的特征是其冗余性，因此，对于用于制造蛋白质的大多数氨基酸，可以采用超过一个编码核苷酸三联体(如上文所示)。因此，许多不同的核苷酸序列可以编码给定的氨基酸序列。此类核苷酸序列被认为在功能上是等效的，因为所述核苷酸序列导致在所有生物体中产生相同的氨基酸序列(尽管某些生物体可能比其它生物体更有效地翻译一些序列)。此外，有时在给定核苷酸序列中可能会发现嘌呤或嘧啶的甲基化变体。此类甲基化不影响三核苷酸密码子与对应氨基酸之间的编码关系。
在对多肽的氨基酸序列作出改变时，可以考虑氨基酸的亲水指数。亲水氨基酸指数在向蛋白赋予相互作用生物功能方面的重要性在本领域中通常是被理解的。接受的是，氨基酸的相对亲水特性有助于所得蛋白的二级结构，所述二级结构进而定义蛋白与其它分子，例如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等的相互作用。根据氨基酸的疏水性和电荷特性，每种氨基酸都被指定了亲水指数，它们是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；蛋氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(<RTI 3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。
本领域中已知某些氨基酸可以被具有类似亲水指数或得分的其它氨基酸取代并且仍导致具有类似生物活性的蛋白质，即仍获得生物功能等效蛋白质。
如上文所概述的，氨基酸取代因此通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，其疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑各种前述特性的示例性取代是本领域技术人员众所周知的，并且包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸盐和天冬氨酸盐；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
鉴于前述，DNA或RNA的核苷酸序列可以用于衍生多肽氨基酸序列，使用基因密码将DNA或RNA翻译成氨基酸序列。同样，对于多肽氨基酸序列，可以从基因密码(由于基因密码的冗余性，基因密码将针对任何给定氨基酸序列产生多个核酸序列)中推断出可以编码多肽的对应核苷酸序列。因此，本文对编码多肽的核苷酸序列的描述和/或公开内容应当被认为还包括对由核苷酸序列编码的氨基酸序列的描述和/或公开内容。类似地，本文对多肽氨基酸序列的描述和/或公开内容应当被认为还包括对可以编码氨基酸序列的所有可能的核苷酸序列的描述和/或公开内容。
表1：抗神经节苷脂单克隆抗体的CDR的示例性序列
表2：抗神经节苷脂单克隆抗体的前导区和可变区的示例性序列
SEQ ID NO:145克隆4重链可变(vH)cDNA序列
SEQ ID NO:146克隆4重链可变(vH)氨基酸序列
SEQ ID NO:147克隆4轻链(κ)可变(vL)cDNA序列
SEQ ID NO:148克隆4轻链(κ)可变(vL)氨基酸序列
SEQ ID NO:149克隆6重链可变(vH)cDNA序列
SEQ ID NO:150克隆6重链可变(vH)氨基酸序列
SEQ ID NO:151克隆6轻链(κ)可变(vL)cDNA序列
SEQ ID NO:152克隆6轻链(κ)可变(vL)氨基酸序列
SEQ ID NO:153克隆7重链可变(vH)cDNA序列
SEQ ID NO:154克隆7重链可变(vH)氨基酸序列
SEQ ID NO:155克隆7轻链(κ)可变(vL)cDNA序列
SEQ ID NO:156克隆7轻链(κ)可变(vL)氨基酸序列
SEQ ID NO:157克隆8重链可变(vH)cDNA序列
SEQ ID NO:158克隆8重链可变(vH)氨基酸序列
SEQ ID NO:159克隆8轻链(κ)可变(vL)cDNA序列
SEQ ID NO:160克隆8轻链(κ)可变(vL)氨基酸序列
SEQ ID NO:161克隆9重链可变(vH)cDNA序列
SEQ ID NO:162克隆9重链可变(vH)氨基酸序列
SEQ ID NO:163克隆9轻链(κ)可变(vL)cDNA序列
SEQ ID NO:164克隆9轻链(κ)可变(vL)氨基酸序列
SEQ ID NO:165克隆10重链可变(vH)cDNA序列
SEQ ID NO:166克隆10重链可变(vH)氨基酸序列
SEQ ID NO:167克隆10轻链(κ)可变(vL)cDNA序列
SEQ ID NO:168克隆10轻链(κ)可变(vL)氨基酸序列
SEQ ID NO:169克隆13重链可变(vH)cDNA序列
SEQ ID NO:170克隆13重链可变(vH)氨基酸序列
SEQ ID NO:171克隆13轻链(κ)可变(vL)cDNA序列
SEQ ID NO:172克隆13轻链(κ)可变(vL)氨基酸序列
SEQ ID NO:173克隆14重链可变(vH)cDNA序列
SEQ ID NO:174克隆14重链可变(vH)氨基酸序列
SEQ ID NO:175克隆14轻链(κ)可变(vL)cDNA序列
SEQ ID NO:176克隆14轻链(κ)可变(vL)氨基酸序列
SEQ ID NO:177克隆15重链可变(vH)cDNA序列
SEQ ID NO:178克隆15重链可变(vH)氨基酸序列
SEQ ID NO:179克隆15轻链(κ)可变(vL)cDNA序列
SEQ ID NO:180克隆15轻链(κ)可变(vL)氨基酸序列
SEQ ID NO:181克隆17重链可变(vH)cDNA序列
SEQ ID NO:182克隆17重链可变(vH)氨基酸序列
SEQ ID NO:183克隆17轻链(κ)可变(vL)cDNA序列
SEQ ID NO:184克隆17轻链(κ)可变(vL)氨基酸序列
SEQIDNO:185克隆18重链可变(vH)cDNA序列
SEQ ID NO:186克隆18重链可变(vH)氨基酸序列
SEQ ID NO:187克隆18轻链(κ)可变(vL)cDNA序列
SEQ ID NO:188克隆18轻链(κ)可变(vL)氨基酸序列
SEQ ID NO:189克隆19重链可变(vH)cDNA序列
SEQ ID NO:190克隆19重链可变(vH)氨基酸序列
SEQ ID NO:191克隆19轻链(κ)可变(vL)cDNA序列
SEQ ID NO:192克隆19轻链(κ)可变(vL)氨基酸序列
*表1和2中包括RNA核酸分子(例如，用尿苷代替的胸苷)、编码经编码的蛋白质的直系同源物的核酸分子，以及包括核酸序列的DNA或RNA核酸序列，所述核酸序列与表1和2中列出的任何SEQ ID NO的核酸序列或其一部分在其全长上具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多同一性。此类核酸分子可以具有如本文进一步描述的全长核酸的功能。
*表1和2中列出的抗体与神经节苷脂GD2和GD3的碳水化合物结构域结合。
核酸、载体和重组宿主细胞
本发明的另外的目的涉及编码本发明的单克隆抗体和其片段、免疫球蛋白和多肽的核酸序列。
例如，在某些实施例中，本发明部分涉及编码本公开的抗体或其抗原结合片段的vH结构域或vL结构域的核酸序列。
通常，所述核酸是DNA或RNA分子，其可以包括在任何合适的载体如质粒、粘粒、附加体、人工染色体、噬菌体或病毒载体中。
术语“载体”、“克隆载体”和“表达载体”意指可以将DNA或RNA序列(例如，外来基因)引入宿主细胞以转化宿主并促进所引入序列的表达(转录和翻译)的媒剂。因此，本发明的另外的目的涉及包括本发明核酸的载体。
此类载体可以包括调节元件如启动子、增强子、终止子等，以在施用于受试者后引起或引导所述多肽的表达。用于动物细胞表达载体的启动子和增强子的实例包括SV40的早期启动子和增强子(Mizukami T.等人1987)、莫洛尼小鼠白血病病毒(Moloney mouseleukemia virus)的LTR启动子和增强子(Kuwana Y等人1987)、免疫球蛋白H链的启动子(Mason J O等人1985)和增强子(Gillies S D等人1983)等。
可以使用任何动物细胞的表达载体。合适载体的实例包括pAGE107(Miyaji H等人1990)、pAGE103(Mizukami T等人1987)、pHSG274(Brady G等人1984)、pKCR(O′Hare K等人1981)、pSG1βd2-4-(Miyaji H等人1990)等。质粒的其它代表性实例包括包括复制起点的复制质粒或整合质粒例如pUC、pcDNA、pBR等。病毒载体的代表性实例包括腺病毒、逆转录病毒、疱疹病毒和AAV载体。此类重组病毒可以通过本领域已知的技术产生，如通过转染包装细胞或通过用辅助质粒或病毒瞬时转染。病毒包装细胞的典型实例包括PA317细胞、PsiCRIP细胞、GPenv阳性细胞、293细胞等。用于产生此类复制缺陷型重组病毒的详细方案可见于例如WO 95/14785、WO 96/22378、美国专利第5,882,877号、美国专利第6,013,516号、美国专利第4,861,719号、美国专利第5,278,056号和WO 94/19478。
本发明的另外的目的涉及已经被根据本发明的核酸和/或载体转染、感染或转化的细胞。术语“转化”意指将“外源”(即，外在的或细胞外的)基因、DNA或RNA序列引入宿主细胞，使得宿主细胞将表达引入的基因或序列以产生期望的物质，通常是由引入的基因或序列编码的蛋白质或酶。接受并表达引入的DNA或RNA的宿主细胞已被“转化”。
本发明的核酸可以用于在合适的表达系统中产生本发明的重组多肽。术语“表达系统”意指在合适条件下的宿主细胞和相容载体，例如用于表达由载体携带并引入宿主细胞的外源DNA编码的蛋白质。
常见的表达系统包括大肠杆菌(E.coli)宿主细胞和质粒载体、昆虫宿主细胞和杆状病毒载体，以及哺乳动物宿主细胞和载体。宿主细胞的其它实例包括但不限于原核细胞(如细菌)和真核细胞(如酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等)。具体实例包括大肠杆菌、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces yeast)或酵母菌属(Saccharomyces yeast)、哺乳动物细胞系(例如，Vero细胞、CHO细胞、3T3细胞、COS细胞等)以及原代或已建立的哺乳动物细胞培养物(例如，由淋巴母细胞、成纤维细胞、胚胎细胞、上皮细胞、神经细胞、脂肪细胞等产生)。实例还包括小鼠SP2/0-Ag14细胞(ATCC CRL1581)、小鼠P3X63-Ag8.653细胞(ATCC CRL1580)、二氢叶酸还原酶基因(下文称为“DHFR基因”)有缺陷的CHO细胞(Urlaub G等人；1980)、大鼠YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20细胞(ATCC CRL 1662，下文称为“YB2/0细胞”)等。YB2/0细胞是优选的，因为嵌合或人源化抗体的ADCC活性在此细胞中表达时增强。
本发明还涉及根据本发明产生表达本发明的抗体或多肽的重组宿主细胞的方法，所述方法包括由以下组成的步骤：(i)将如本文所描述的重组核酸或载体体外或离体引入感受态宿主细胞；(ii)体外或离体培养获得的重组宿主细胞；以及(iii)任选地，选择表达和/或分泌所述抗体或多肽的细胞。此类重组宿主细胞可以用于产生本发明的抗体和多肽。
另一方面，本发明提供了在选择性杂交条件下与本文公开的多核苷酸杂交的分离的核酸。因此，此实施例的多核苷酸可以用于分离、检测和/或定量包括此类多核苷酸的核酸。例如，本发明的多核苷酸可以用于鉴定、分离或扩增保藏文库中的部分或全长克隆。在一些实施例中，多核苷酸是与来自人或哺乳动物核酸文库的cDNA分离或以其它方式互补的基因组或cDNA序列。优选地，cDNA文库包括至少80％的全长序列，优选地至少85％或90％的全长序列，并且优选地至少95％的全长序列。可以对cDNA文库归一化以增加稀有序列的代表性。低或中等严格杂交条件通常但不排他地与相对于互补序列具有降低的序列同一性的序列一起使用。对于更高同一性的序列，可以任选地使用中等和高严格条件。低严格条件允许选择性杂交具有约70％序列同一性的序列，并且可以用于鉴定直系同源或旁系同源序列。任选地，本发明的多核苷酸将编码由本文所描述的多核苷酸编码的抗体的至少一部分。本发明的多核苷酸涵盖可以用于与编码本发明的抗体的多核苷酸选择性杂交的核酸序列。参见例如，Ausubel,同上；Colligan,同上，每一个均通过引用整体并入本文。
产生抗体的方法
本发明的抗体和其片段、免疫球蛋白和多肽可以通过本领域已知的任何技术产生，如但不限于任何化学、生物、遗传或酶技术，单独或组合。
已知期望序列的氨基酸序列，本领域技术人员可以通过用于产生多肽的标准技术容易地生产所述抗体或多肽。例如，所述抗体或多肽可以使用众所周知的固相方法合成，优选地使用可商购获得的肽合成设备(如由加利福尼亚州福斯特城的应用生物系统公司(Applied Biosystems,Foster City,Calif.)制造的设备)并且遵循制造商的说明。可替代地，本发明的抗体和其它多肽可以通过本领域众所周知的重组DNA技术合成。例如，在将编码期望(多)肽的DNA序列并入表达载体并将此类载体引入将表达期望多肽的合适真核或原核宿主后，这些片段可以作为DNA表达产物获得，之后可以使用众所周知的技术将它们从中分离出来。
具体地，本发明进一步涉及产生本发明的抗体或多肽的方法，所述方法包括由以下组成的步骤：(i)在适合于允许所述抗体或多肽表达的条件下培养根据本发明的转化的宿主细胞；以及(ii)回收表达的抗体或多肽。
本发明的抗体和其它多肽可以通过常规免疫球蛋白纯化程序从培养基中适当分离，例如蛋白A-琼脂糖、羟基磷灰石色谱法、凝胶电泳、透析、亲和色谱法、硫酸铵或乙醇沉淀、酸萃取、阴离子或阳离子交换色谱法、磷酸纤维素色谱法、疏水相互作用色谱法、羟基磷灰石色谱法和凝集素色谱法。高效液相色谱法(“HPLC”)也可以用于纯化。参见例如Colligan,《当代免疫学实验指南(Current Protocols in Immunology)》或《当代蛋白质科学实验指南(Current Protocols in Protein Science)》,纽约州纽约市约翰·威利父子出版公司(John Wiley&Sons,NY,N.Y.),(1997-2001),例如章节1,4,6,8,9,10，每个通过引用整体并入本文。
本发明的嵌合抗体(例如，小鼠-人嵌合体或非啮齿动物-人嵌合体)可以通过以下产生：获得如先前所描述的编码VL和VH结构域的核酸序列；通过将它们插入具有编码人抗体CH和人抗体CL的基因的动物细胞表达载体中来构建人嵌合抗体表达载体；以及通过将表达载体引入动物细胞来表达编码序列。人嵌合抗体的CH结构域可以是属于人免疫球蛋白的任何区域，如IgG类或其亚类，如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。类似地，人嵌合抗体的CL可以是属于Ig的任何区域，如κ类或λ类。可以使用标准重组DNA技术制备的嵌合和人源化单克隆抗体(包括人和非人部分)在本发明的范围内。此类嵌合和人源化单克隆抗体可以通过本领域已知的重组DNA技术产生，例如使用描述于以下的方法：Robinson等人国际专利公开PCT/US86/02269；Akira等人欧洲专利申请184,187；Taniguchi,M.欧洲专利申请171,496；Morrison等人欧洲专利申请173,494；Neuberger等人PCT申请WO 86/01533；Cabilly等人美国专利第4,816,567号；Cabilly等人欧洲专利申请125,023；Better等人(1988)《科学》240:1041-1043；Liu等人(1987)《美国国家科学院院刊》84:3439-3443；Liu等人(1987)《免疫学杂志(J.Immunol.)》139:3521-3526；Sun等人(1987)《美国国家科学院院刊》84:214-218；Nishimura等人(1987)《癌症研究(Cancer Res.)》47:999-1005；Wood等人(1985)《自然》314:446-449；Shaw等人(1988)《美国国立癌症研究所杂志(J.Natl.Cancer Inst.)》80:1553-1559)；Morrison,S.L.(1985)《科学》229:1202-1207；Oi等人(1986)《生物技术(Biotechniques)》4:214；Winter美国专利5,225,539；Jones等人(1986)《自然》321:552-525；Verhoeyan等人(1988)《科学》239:1534；以及Beidler等人(1988)《免疫学杂志》141:4053-4060。
另外，人源化抗体可以根据标准方案制备，如美国专利5,565,332中公开的那些。在另一个实施例中，抗体链或特异性结合对成员可以通过以下来产生：包括编码特异性结合对成员的多肽链和可复制的通用展示包的组分的融合的核酸分子的载体与含有编码单个结合对成员的第二多肽链的核酸分子的载体之间的重组，使用本领域已知的技术例如，如美国专利5,565,332、5,871,907或5,733,743所描述的。本发明的人源化抗体可以通过以下来产生：获得如先前所描述的编码CDR结构域的核酸序列；通过将它们插入到动物细胞的表达载体中来构建人源化抗体表达载体，所述基因编码(i)与人抗体的重链恒定区相同的重链恒定区和(ii)与人抗体的轻链恒定区相同的轻链恒定区；以及通过将表达载体引入动物细胞来表达基因。人源化抗体表达载体可以是编码抗体重链的基因和编码抗体轻链的基因存在于单独载体上的类型或两种基因存在于同一载体上的类型(串联型)。
用于基于常规重组DNA和基因转染技术产生人源化抗体的方法是本领域众所周知的(参见例如Riechmann L.等人1988；Neuberger M S.等人1985)。可以使用本领域已知的多种技术将抗体人源化，包括例如CDR-移植(EP 239,400；PCT公开WO91/09967；美国专利第5,225,539号；第5,530,101号；和第5,585,089号)、镶面或表面重修(EP 592,106；EP 519,596；Padlan EA(1991)；Studnicka G M等人(1994)；Roguska M A.等人(1994))和链改组(美国专利第5,565,332号)。用于制备此类抗体的一般重组DNA技术也是已知的(参见欧洲专利申请EP 125023和国际专利申请WO 96/02576)。
另外，用于产生抗体片段的方法是众所周知的。例如，本发明的Fab片段可以通过用蛋白酶如木瓜蛋白酶处理与神经节苷脂特异性反应的抗体来获得。此外，可以通过将编码抗体的Fab的DNA插入原核表达系统或真核表达系统的载体中，并且将载体引入原核生物或真核生物(视情况而定)以表达Fab来产生Fab。
类似地，本发明的F(ab′)2片段可以通过用蛋白酶，即木瓜蛋白酶处理与神经节苷脂特异性反应的抗体来获得。此外，F(ab′)2片段可以通过经由硫醚键或二硫键结合下文所描述的Fab′来产生。
本发明的Fab′片段可以通过用还原剂，即二硫苏糖醇处理与神经节苷脂特异性反应的F(ab′)2来获得。此外，Fab′片段可以通过将编码抗体的Fab′片段的DNA插入原核生物的表达载体或真核生物的表达载体中，并且将载体引入原核生物或真核生物(视情况而定)以进行其表达来产生。
另外，本发明的scFv可以通过获得如先前所描述的编码VH和VL结构域的cDNA，构建编码scFv的DNA，将DNA插入原核生物的表达载体或真核生物的表达载体，然后将表达载体引入原核生物或真核生物(视情况而定)以表达scFv来产生。为了产生人源化scFv片段，可以使用称为CDR移植的众所周知的技术所述技术涉及从供体scFv片段中选择互补决定区(CDR)，并且将互补决定区移植到已知三维结构的人scFv片段框架上(参见例如WO98/45322；WO 87/02671；美国专利第5,859,205号；美国专利第5,585,089号；美国专利第4,816,567号；EP0173494)。
抗体、免疫球蛋白和多肽的修饰
考虑了本文所描述的抗体的一个或多个氨基酸序列修饰。例如，可能期望改善抗体的结合亲和力和/或其它生物性质。已知当人源化抗体通过在人抗体的VH和VL的FR中简单地仅移植衍生自非人动物的抗体的VH和VL的CDR而产生时，与衍生自非人动物的原始抗体的抗原结合活性相比，抗原结合活性降低。据认为，不仅在CDR中，而且在FR中，非人抗体的VH和VL的若干个氨基酸残基与抗原结合活性直接或间接相关。因此，用源自人抗体的VH和VL的FR的不同氨基酸残基取代这些氨基酸残基会降低结合活性，并且可以通过用源自非人动物的原始抗体的氨基酸残基替换氨基酸来校正。
可以对本发明的抗体的结构和编码所述抗体的DNA序列作出修饰和改变，并且修饰和改变仍可以获得编码具有令人期望的特性的抗体和多肽的功能分子。例如，某些氨基酸可以被蛋白结构中的其它氨基酸取代，而不会明显丧失活性。由于蛋白的相互作用能力和性质限定了蛋白的生物功能活性，因此可以在蛋白序列中以及当然在其DNA编码序列中进行某些氨基酸序列取代，然而同时获得具有类似性质的蛋白质。因此考虑可以在不明显丧失其生物活性的情况下对本发明的抗体序列或编码所述多肽的对应DNA序列进行各种改变。
在一个实施例中，可以通过改变DNA序列中的密码子以编码基于基因密码的保守性的保守取代来实现氨基酸改变。具体地，特定蛋白质的氨基酸序列与可以编码蛋白质的核苷酸序列之间存在已知且明确的对应关系，如基因密码所定义(如下所示)。同样，特定核酸的核苷酸序列与由所述核酸编码的氨基酸序列之间存在已知且明确的对应关系，如基因密码所定义(参见上文的基因密码图表)。
如上文所描述的，基因密码的重要且众所周知的特征是其冗余性，因此，对于用于制造蛋白质的大多数氨基酸，可以采用超过一个编码核苷酸三联体(如上文所示)。因此，许多不同的核苷酸序列可以编码给定的氨基酸序列。此类核苷酸序列被认为在功能上是等效的，因为所述核苷酸序列导致在所有生物体中产生相同的氨基酸序列(尽管某些生物体可能比其它生物体更有效地翻译一些序列)。此外，有时在给定核苷酸序列中可能会发现嘌呤或嘧啶的甲基化变体。此类甲基化不影响三核苷酸密码子与对应氨基酸之间的编码关系。
在对多肽的氨基酸序列作出改变时，可以考虑氨基酸的亲水指数。亲水氨基酸指数在向蛋白赋予相互作用生物功能方面的重要性在本领域中通常是被理解的。接受的是，氨基酸的相对亲水特性有助于所得蛋白的二级结构，所述二级结构进而定义蛋白与其它分子，例如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等的相互作用。根据氨基酸的疏水性和电荷特性，每种氨基酸都被指定了亲水指数，它们是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；蛋氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(<RTI 3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。
本领域中已知某些氨基酸可以被具有类似亲水指数或得分的其它氨基酸取代并且仍导致具有类似生物活性的蛋白质，即仍获得生物功能等效蛋白质。
如上文所概述的，氨基酸取代因此通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，其疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑各种前述特性的示例性取代是本领域技术人员众所周知的，并且包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸盐和天冬氨酸盐；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
本发明的抗体的另一种类型的氨基酸修饰可以用于改变抗体的原始糖基化模式以例如增加稳定性。“改变”意指删除抗体中发现的一个或多个碳水化合物部分和/或添加抗体中不存在的一个或多个糖基化位点。抗体的糖基化通常是N-连接的。N-连接是指碳水化合物部分附接至天冬酰胺残基的侧链。其中X为除脯氨酸以外的任何氨基酸的三肽序列，天冬酰胺-X-丝氨酸以及天冬酰胺-X-苏氨酸，是将碳水化合物部分酶促附接至天冬酰胺侧链的识别序列。因此，在多肽中的这些三肽序列中的任何一个的存在产生潜在糖基化位点。向抗体添加糖基化位点便利地通过改变氨基酸序列以使得它含有一个或多个上述三肽序列来完成(对于N-连接糖基化位点)。另一种类型的共价修饰涉及将糖苷以化学方式或酶促方式偶联到抗体。这些程序是有利的，因为所述程序不需要在具有N-或O-连接糖基化的糖基化能力的宿主细胞中产生抗体。根据所使用的偶联模式，糖可以与以下连接：(a)精氨酸和组氨酸，(b)游离羧基，(c)游离巯氢基，如半胱氨酸的那些，(d)游离羟基，如丝氨酸、苏氨酸或羟脯氨酸的那些，(e)芳香族残基，如苯基丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的那些，或(f)谷氨酰胺的酰胺基。例如，WO87/05330中描述了此类方法。
类似地，化学去糖基化需要将抗体暴露于化合物三氟甲磺酸或等效化合物。化学去糖基化需要将抗体暴露于化合物三氟甲磺酸或等效化合物。这种治疗导致除连接糖(N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)以外的大多数或所有糖剪切，同时保持抗体完整。化学去糖基化由以下描述：Sojahr H.等人(1987)和Edge,AS.等人(1981)。抗体上的碳水化合物部分的酶促剪切可以使用各种内切和外切糖苷酶来实现，如Thotakura,N R.等人(1987)所描述的。
其它修饰可能涉及免疫缀合物的形成。例如，在一种共价修饰类型中，抗体或蛋白质以以下所示的方式与多种非蛋白质聚合物中的一种共价连接，例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯：美国专利第4,640,835号；第4,496,689号；第4,301,144号；第4,670,417号；第4,791,192号或第4,179,337号。
本发明的抗体或其它蛋白质与异源剂的缀合可以使用多种双功能蛋白质偶联剂进行，包括但不限于N-(2-吡啶基二硫代)丙酸琥珀酰亚胺酯(SPDP)、(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸琥珀酰亚胺酯、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(如己二亚氨盐酸二甲酯)、活性酯类(如辛二酸二琥珀酰亚胺基酯)、醛类(如戊二醛)、双叠氮化合物(如双(对叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(如双-(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，碳标记的1-异硫氰基苄基甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体缀合的示例性螯合剂(WO 94/11026)。
另一方面，本发明的特征在于与神经节苷脂(例如，GD2或GD3)特异性结合的抗体，所述神经节苷脂与允许检测的部分缀合。缀合的抗神经节苷脂抗体可以用于诊断或预后监测血液或组织中的神经节苷脂水平(例如，GD2或GD3)，作为临床测试程序的一部分，例如诊断患者是否患有癌症，确定癌症的不同分期，监测癌症的进展，确定给定治疗方案的功效或选择最有可能对癌症疗法(例如，免疫疗法)做出应答的患者。可检测部分的实例包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料和放射性材料。合适的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的实例包括链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；合适的荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、若丹明(rhodamine)、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白(PE)；发光材料的实例包括鲁米诺(luminol)；生物发光材料的实例包括荧光素酶、荧光素和水母发光蛋白，并且合适的放射性材料的实例包括125I、131I、35S或3H。如本文所使用的，关于抗体的术语“标记的”旨在涵盖通过将可检测物质如放射性药剂或荧光团(例如，异硫氰酸荧光素(FITC)或藻红蛋白(PE)或吲哚菁(Cy5))与抗体偶联(即物理连接)直接标记抗体，以及通过与可检测物质的反应性间接标记抗体。例如，抗体可以用可以被扩增和检测的核酸序列或反义寡核苷酸标记以减少特定基因的表达，使得然后表达可以被检测和测量。
将此类治疗部分与抗体缀合的技术是众所周知的，参见例如，Arnon等人,“用于在癌症疗法中免疫靶向药物的单克隆抗体(Monoclonal Antibodies For ImmunotargetingOf Drugs In Cancer Therapy)”,在《单克隆抗体和癌症疗法(Monoclonal AntibodiesAnd Cancer Therapy)》,Reisfeld等人(编辑),第243 56页(Alan R.Liss公司(AlanR.Liss,Inc.)1985)中；Hellstrom等人,“用于药物递送的抗体(Antibodies For DrugDelivery)”,在《受控药物递送(Controlled Drug Delivery)》(第2版),Robinson等人(编辑),第623 53页(马塞尔德克尔公司(Marcel Dekker,Inc.)1987)中；Thorpe,“癌症疗法中细胞毒剂的抗体载体：综述(Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In CancerTherapy:AReview)”,在《单克隆抗体′84：生物学和临床应用(Monoclonal Antibodies′84:Biological And Clinical Applications)》,Pinchera等人(编辑),第475 506页(1985)中；“放射标记抗体在癌症疗法中的治疗性用途的分析、结果和未来展望(Analysis,Results,And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of RadiolabeledAntibody In Cancer Therapy)”,在《用于癌症检测和疗法的单克隆抗体(MonoclonalAntibodies For Cancer Detection And Therapy)》,Baldwin等人(编辑),第303 16页(学术出版社(Academic Press)1985)中；以及Thorpe等人,“抗体-毒素缀合物的制备和细胞毒性性质(The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-ToxinConjugates)”,《免疫学综述(Immunol.Rev.)》,62:119 58(1982)。
神经节苷脂
神经节苷脂是包括一种或多种唾液酸的鞘糖脂。鞘糖脂含有通常锚定到质膜的外叶的疏水性神经酰胺或鞘氨醇脂质尾部。所述鞘糖脂还含有寡糖部分，并且根据这种碳水化合物结构进行分类(神经节、isoganglio、乳糖等)。神经节苷脂是鞘糖脂的一个重要亚类，因为所述神经节苷脂含有与脂寡糖部分连接的带负电荷的唾液酸(N-乙酰神经氨酸或N-羟乙酰神经氨酸)。神经节苷脂根据附接到内部糖部分的唾液酸残基的数量(M表示一个，D表示两个，T表示3个，Q表示4个)以及它们的色谱迁移率来命名和分类。根据Svennerholm的原始实验分类，神经节苷脂(5-x)的编号基于内部糖部分(葡萄糖、半乳糖或GalNAc)的数量(x)。因此，如果x为4，则神经节苷脂为：GM1、GD1、GT1；x＝3，则神经节苷脂为：GM2、GD2、GT2；并且x＝2，则神经节苷脂为：GM3、GD3和GT3。
如本文所述，神经节苷脂是肿瘤生物标志物(例如，参见表3)。在一些实施例中，肿瘤相关的神经节苷脂选自GD2、GD3、GD1b、GT1b、岩藻糖基-GM1、GloboH、聚唾液酸(PSA)、GM2、GM3、唾液酰-路易斯X、唾液酰-路易斯Y、唾液酰-路易斯A、唾液酰-路易斯B、路易斯Y、其任何部分和其经修饰形式。在优选的实施例中，神经节苷脂是GD2、GD3、GM2或GT1b。
在一些实施例中，神经节苷脂被修饰。经修饰神经节苷脂在本领域中是众所周知的。示例性经修饰神经节苷脂在例如专利公开第WO 2015/081438号和第WO 2018/112669号中公开，所述专利公开的全部内容通过引用并入本文。神经节苷脂可以是单体。可替代地，如专利公开第WO 2015/081438号和第WO 2018/112669号中所例示的，两个或更多个神经节苷脂可以共价附接到共同的核心以形成多聚体。在一些实施例中，多聚体包括2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个神经节苷脂。在一些实施例中，多聚体包括2个神经节苷脂。在一些实施例中，多聚体包括4个神经节苷脂。在一些实施例中，共同的核心包括聚酰胺-胺(PAMAM)。
因此，如本文所使用的，术语神经节苷脂可以指神经节苷脂、肿瘤相关的神经节苷脂、其一部分、其经修饰形式、单体或多聚体。
在一些实施例中，神经节苷脂具有以下结构：[(A)-(P)y-(L)z]x-M，其中A是神经节苷脂或其任何部分；P是环；y是0或1；L是接头；z是0或1；x是1至32的整数；M是核心。
在一些实施例中，神经节苷脂具有以下结构：(A)x-[(P)y-(L)z]-(M)b，其中A是神经节苷脂或其任何部分；x是1至32的整数；P是环；y是0或1；L是接头；z是0至8的整数；M是核心；并且b是0或1。
在一些实施例中，环P是环烷基、杂环基、芳基或杂芳基。
在一些实施例中，环P是环烷基，其中除非另有说明，否则术语“环烷基”包括任何三至八个碳的单价饱和或不饱和非芳香族环状烃基，并且例示为环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环庚基等。当环烷基包括一个碳-碳双键或一个碳-碳三键时，环烷基可以分别称为“环烯基”或“环炔基”。示例性环烯基和环炔基包括环戊烯基、环己烯基、环己炔基等。本发明的环烷基可以任选地被以下取代：(1)C1-7酰基(例如，羧醛)；(2)C1-20烷基(例如，C1-6烷基、C1-6烷氧基-C1-6烷基、C1-6烷基亚磺酰基-C1-6烷基、氨基-C1-6烷基、叠氮基-C1-6烷基、(羧醛)-C1-6烷基、卤基-C1-6烷基(例如，全氟烷基、羟基-C1-6烷基、硝基-C1-6烷基或C1-6硫代烷氧基-C1-6烷基)；(3)C1-20烷氧基(例如，C1-6烷氧基，如全氟烷氧基)；(4)C1-6烷基亚磺酰基；(5)C6-10芳基；(6)氨基；(7)C1-6烷-C6-10芳基；(8)叠氮基；(9)C3-8环烷基；(10)C1-6烷-C3-8环烷基；(11)卤基；(12)C1-12杂环基(例如，C1-12杂芳基)；(13)(C1-12杂环基)氧基；(14)羟基；(15)硝基；(16)C1-20硫代烷氧基(例如，C1-6硫代烷氧基)；(17)-(CH2)qCO2RA，其中q是零至四的整数，并且RA选自由以下组成的组：(a)烷基、(b)C6-10芳基、(c)氢和(d)烷-C6-10芳基；(18)-(CH2)qCONRB Rc，其中q是零至四的整数，并且其中RB和Rc独立地选自由以下组成的组：(a)氢、(b)C6-10烷基、(c)C6-10芳基和(d)C1-6烷-C6-10芳基；(19)-(CH2)qSO2RD，其中q是零至四的整数，并且其中RD选自由以下组成的组：(a)C6-10烷基、(b)C6-10芳基和(c)C1-6烷-C6-10芳基；(20)-(CH2)qSO2NRERF，其中q是零至四的整数，并且其中RE和RF中的每一个独立地选自由以下组成的组：(a)氢、(b)C6-10烷基、(c)C6-10芳基和(d)C1-6烷-C6-10芳基；(21)硫醇；(22)C6-10芳氧基；(23)C3-8环烷氧基；(24)C6-10芳基-C1-6烷氧基；(25)C1-6烷-C1-12杂环基(例如，C1-6烷-C1-12杂芳基)；(26)氧代；(27)C2.20烯基；以及(28)C2.20炔基。在一些实施例中，这些基团中的每一个基团都可以如本文所描述的进一步被取代。例如，C1-烷芳基或C1-烷杂环基的亚烷基可以进一步被氧代基团取代以提供相应的芳酰基和(杂环基)酰基取代基。
在一些实施例中，环P是杂环基，其中除非另有说明，否则术语“杂环基”包括5元、6元或7元环，含有一个、两个、三个或四个独立地选自由氮、氧和硫组成的组的杂原子。5元环有零至两个双键，并且6元环和7元环有零至三个双键。示例性未经取代的杂环基具有1个至12个(例如，1个至11个、1个至10个、1个至9个、2个至12个、2个至11个、2个至10个或2个至9个)碳。术语“杂环基”还表示具有桥接多环结构的杂环化合物，其中一个或多个碳和/或杂原子桥接单环的两个非相邻成员，例如奎宁基。术语“杂环基”包括双环、三环和四环基团，其中上述杂环中的任何杂环与一个、两个或三个碳环稠合，例如芳基环、环己烷环、环己烯环、环戊烷环、环戊烯环或另一种单环杂环，如吲哚基、喹啉基、异喹啉基、四氢喹啉基、苯并呋喃基、苯并噻吩基等。稠合杂环基的实例包括托烷和1 2,3,5,8,8a-六氢二氢吲嗪。杂环包括吡咯基、吡咯啉基、吡咯烷基、吡唑基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑基、咪唑啉基、咪唑烷基、吡啶基、哌啶基、高哌啶基、吡嗪基、哌嗪基、嘧啶基、哒嗪基、噁唑基、噁唑烷基、异噁唑基、异噁唑烷基、吗啉基、硫代吗啉基、噻唑基、噻唑烷基、异噻唑基、异噻唑烷基、吲哚基、吲唑基、喹啉基、异喹啉基、喹喔啉基、二氢喹喔啉基、喹唑啉基、噌啉基、酞嗪基、苯并咪唑基、苯并噻唑基，苯并噁唑基、苯并噻二唑基、呋喃基、噻吩基、噻唑烷基、异噻唑基、三唑基、四唑基、噁二唑基(例如，1,2,3-噁二唑基)、嘌呤基、噻二唑基(例如，1,2,3-噻二唑基)、四氢呋喃基、二氢呋喃基、四氢噻吩基、二氢噻吩基、二氢吲哚基、二氢喹啉基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、二氢异喹啉基、吡喃基、二氢吡喃基、二噻唑基、苯并呋喃基、异苯并呋喃基、苯并噻吩基等，包括其二氢和四氢形式，其中一个或多个双键被还原并被氢替代。还有其它示例性杂环基包括：2,3,4,5-四氢-2-氧代-噁唑基；2,3-二氢-2-氧代-1H-咪唑基；2,3,4,5-四氢-5-氧代-1H-吡唑基(例如，2,3,4,5-四氢-2-苯基-5-氧代-1H-吡唑基)；2,3,4,5-四氢-2,4-二氧代-1H-咪唑基(例如，2,3,4,5-四氢-2,4-二氧代-5-甲基-5-苯基-1H-咪唑基)；2,3-二氢-2-硫代-1,3,4-噁二唑基(例如，2,3-二氢-2-硫代-5-苯基-1,3,4-噁二唑基)；4,5-二氢-5-氧代-1H-三唑基(例如，4,5-二氢-3-甲基-4-氨基5-氧代-1H-三唑基)；1,2,3,4-四氢-2,4-二氧代吡啶基(例如，1,2,3,4-四氢-2,4-二氧代-3,3-二乙基吡啶基)；2,6-二氧代-哌啶基(例如，2,6-二氧代-3-乙基-3-苯基哌啶基)；1,6-二氢-6-氧代嘧啶基；1,6-二氢-4-氧代嘧啶基(例如，2-(甲硫基)-1,6-二氢-4-氧代-5-甲基嘧啶-1-基)；1,2,3,4-四氢-2,4-二氧代嘧啶基(例如，1,2,3,4-四氢-2,4-二氧代-3-乙基嘧啶基)；1,6-二氢-6-氧代-哒嗪基(例如，1,6-二氢-6-氧代-3-乙基哒嗪基)；1,6-二氢-6-氧代-1,2,4-三嗪基(例如，1,6-二氢-5-异丙基-6-氧代-1,2,4-三嗪基)；2,3-二氢-2-氧代-1H-吲哚基(例如，3,3-二甲基-2,3-二氢-2-氧代-1H-吲哚基和2,3-二氢-2-氧代-3,3′-螺丙烷-1H-吲哚-1-基)；1,3-二氢-1-氧代-2H-异-吲哚基；1,3-二氢-1,3-二氧代-2H-异-吲哚基；1H-苯并吡唑基(例如，l-(乙氧羰基)-1H-苯并吡唑基)；2,3-二氢-2-氧代-1H-苯并咪唑基(例如，3-乙基-2,3-二氢-2-氧代-1H-苯并咪唑基)；2,3-二氢-2-氧代-苯并噁唑基(例如，5-氯-2,3-二氢-2-氧代-苯并噁唑基)；2-氧代-2H-苯并吡喃基；1,4-苯二噁烷基；1,3-苯二噁烷基；2,3-二氢-3-氧代；4H-1,3-苯并噻嗪基；3,4-二氢-4-氧代-3H-喹唑啉基(例如，2-甲基-3,4-二氢-4-氧代-3H-喹唑啉基)；1,2,3,4-四氢-2,4-二氧代-3H-喹唑啉基(例如，1-乙基-1,2,3,4-四氢-2,4-二氧代-3H-喹唑啉基)；1,2,3,6-四氢-2,6-二氧代-7H-嘌呤基(例如，1,2,3,6-四氢-1,3-二甲基-2,6-二氧代-7H-嘌呤基)；1,2,3,6-四氢-2,6-二氧代-1H-嘌呤基(例如，1,2,3,6-四氢-3,7-二甲基-2,6-二氧代-1H-嘌呤基)；2-氧代苯[c,d]吲哚基；1,1-二氧代-2H-萘[1,8-c,d]异噻唑基；以及1,8-萘二甲酰氨基。另外的杂环包括3,3a,4,5,6,6a-六氢-吡咯并[3,4-b]吡咯-(2H)-基以及2,5-二氮杂双环[2.2.1]庚-2-基、高哌嗪基(或二氮杂环庚烷基(diazepanyl))、四氢吡喃基、二噻唑基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、氧杂环庚烷基(oxepanyl)、硫杂环庚烷基(thiepanyl)、氮杂环辛基(azocanyl)、氧杂环辛基(oxecanyl)和硫杂环辛基(thiocanyl)。本文提及的杂环基中的任何杂环基可以任选地被一个、两个、三个、四个或五个独立地选自由以下组成的组的取代基取代：(1)C1-7酰基(例如，羧醛)；(2)C1-20烷基(例如，C1-6烷基、C1-6烷氧基-C1-6烷基、C1-6烷基亚磺酰基-C1-6烷基、氨基-C1-6烷基、叠氮基-C1-6烷基、(羧醛)-C1-6烷基、卤基-C1-6烷基(例如，全氟烷基、羟基-C1-6烷基、硝基-C1-6烷基或C1-6硫代烷氧基-C1-6烷基)；(3)C1-20烷氧基(例如，C1-6烷氧基，如全氟烷氧基)；(4)C1-6烷基亚磺酰基；(5)C6-10芳基；(6)氨基；(7)C1-6烷-C6-10芳基；(8)叠氮基；(9)C3.8环烷基；(10)C1-6烷-C3-8环烷基；(11)卤基；(12)C1-12杂环基(例如，C1-12杂芳基)；(13)(C1-12杂环基)氧基；(14)羟基；(15)硝基；(16)C1-20硫代烷氧基(例如，C1-6硫代烷氧基)；(17)–(CH2)qCO2RA，其中q是零至四的整数，并且RA选自由以下组成的组：(a)C1-6烷基、(b)C6-10芳基、(c)氢和(d)C1-6烷-C6-10芳基；(18)–(CH2)qCONRB’Rc’，其中q是零至四的整数，并且其中RB’和Rc’独立地选自由以下组成的组：(a)氢、(b)C1-6烷基、(c)C3-10芳基和(d)C1-6烷-C6-10芳基；(19)-(CH2)qSO2RD，其中q是零至四的整数，并且其中RD选自由以下组成的组：(a)烷基、(b)C6-10芳基和(c)烷-C6-10芳基；(20)-(CH2)qSO2NRE’RF’，其中q是零至四的整数，并且其中RE’和RF’中的每一个独立地选自由以下组成的组：(a)氢、(b)C1-6烷基、(c)C6-10芳基和(d)C1-6烷-C6-10芳基；(21)硫醇；(22)C6-10芳氧基；(23)C3-8环烷氧基；(24)芳基烷氧基；(25)C1-6烷-C1-12杂环基(例如，C1-6烷-C1-12杂芳基)；(26)氧代；(27)(C1-12杂环基)亚氨基；(28)C2-20烯基；(29)C2-20炔基；以及(30)-(CH2)qCONRB，其中q是零至四的整数，并且其中RB选自由以下组成的组：(a)氢、(b)C1-6烷基、(c)C3-10芳基和(d)C1-6烷-C6-10芳基。在一些实施例中，这些基团中的每一个基团都可以如本文所描述的进一步被取代。例如，C1-烷芳基或C1-烷杂环基的亚烷基可以进一步被氧代基团取代以提供相应的芳酰基和(杂环基)酰基取代基。
在一些实施例中，环P是芳基。术语“芳基”包括具有一个或两个芳香族环的单环、双环或多环碳环系统并且例示为苯基、萘基、1,2-二氢萘基、1,2,3,4-四氢萘基、蒽基、菲基、芴基、茚满基、茚基等，并且可以任选地被1个、2个、3个、4个或5个取代基取代。在一些实施例中，1个、2个、3个、4个或5个取代基独立地选自由以下组成的组：(1)C1-7酰基(例如，羧醛)；(2)C1-20烷基(例如，C1-6烷基、C1-6烷氧基-C1-6烷基、C1-6烷基亚磺酰基-C1-6烷基、氨基-C1-6烷基、叠氮基-C1-6烷基、(羧醛)-C1-6烷基、卤基-C1-6烷基(例如，全氟烷基、羟基-C1-6烷基、硝基-C1-6烷基或C1-6硫代烷氧基-C1-6烷基)；(3)C1-20烷氧基(例如，C1-6烷氧基，如全氟烷氧基)；(4)C1-6烷基亚磺酰基；(5)C6-10芳基；(6)氨基；(7)C1-6烷-C6-10芳基；(8)叠氮基；(9)C3.8环烷基；(10)C1-6烷-C3-8环烷基；(11)卤基；(12)C1-12杂环基(例如，C1-12杂芳基)；(13)(C1-12杂环基)氧基；(14)羟基；(15)硝基；(16)C1-20硫代烷氧基(例如，C1-6硫代烷氧基)；(17)–(CH2)qCO2RA，其中q是零至四的整数，并且RA选自由以下组成的组：(a)C1-6烷基、(b)C6-10芳基、(c)氢和(d)C1-6烷-C6-10芳基；(18)–(CH2)qCONRB’Rc’，其中q是零至四的整数，并且其中RB’和Rc’独立地选自由以下组成的组：(a)氢、(b)C1-6烷基、(c)C3-10芳基和(d)C1-6烷-C6-10芳基；(19)-(CH2)qSO2RD，其中q是零至四的整数，并且其中RD选自由以下组成的组：(a)烷基、(b)C6-10芳基和(c)烷-C6-10芳基；(20)-(CH2)qSO2NRE’RF’，其中q是零至四的整数，并且其中RE’和RF’中的每一个独立地选自由以下组成的组：(a)氢、(b)C1-6烷基、(c)C6-10芳基和(d)C1-6烷-C6-10芳基；(21)硫醇；(22)C6-10芳氧基；(23)C3-8环烷氧基；(24)C6-10芳基-C1-6烷氧基；(25)C1-6烷-C1-12杂环基(例如，C1-6烷-C1-12杂芳基)；(26)C2.20烯基；(27)C2.20炔基；以及(28)-(CH2)qCONRB，其中q是零至四的整数，并且其中RB选自由以下组成的组：(a)氢、(b)C1-6烷基、(c)C3-10芳基和(d)C1-6烷-C6-10芳基。在一些实施例中，这些基团中的每一个基团都可以如本文所描述的进一步被取代。例如，C1-烷芳基或C1烷杂环基的亚烷基可以进一步被氧代基团取代以提供相应的芳酰基和(杂环基)酰基取代基。
在一些实施例中，芳基是杂芳基，其中“杂芳基”包括如本文所定义的杂环基的子集，它们是芳香族的：即，它们在单环或多环系统内含有4n+2个π电子。示例性未经取代的杂芳基具有1个至12个(例如，1个至11个、1个至10个、1个至9个、2个至12个、2个至11个、2个至10个或2个至9个)碳。在某个实施例中，杂芳基被1个、2个、3个或4个如针对杂环基所定义的取代基取代。
在一些实施例中，芳基是C3-C10芳基。
在一些实施例中，芳基是C6-C10芳基，如苯基或氨基苯基(例如，对氨基苯基)。
在一些实施例中，芳基选自由以下组成的组：苯基、羟基-萘基、萘-2,6-二胺、5-氨基萘-1-醇、萘-1,5-二醇、萘-1,5-二胺、(3-氨基甲基)环戊基胺、环戊烷-1,3-二基二甲胺、3-(氨基甲基)环戊胺、喹啉-3,7-二胺、4-氨基喹啉-8-醇、喹啉-4,8-二醇、喹啉-4,8-二胺、异喹啉-4,8-二胺、吡啶-2,6-二羧酸、三嗪、三唑、咪唑、吗啉代或4-(氨基甲基)哌啶，它们中的任何一个都可以如针对杂环基所定义的任选地被取代。
在一些实施例中，接头L是两个元件之间(例如，碳水化合物抗原与核心之间，或环与核心之间)的连接。接头可以是共价键(例如，通过化学缀合产生的任何键，如酰胺、酯、醚、叠氮化物、异硫氰酸酯或二硫键)或连接两个元件并在两个元件之间提供空间和/或柔性的间隔子(例如，部分或氨基酸序列)。在一些实施例中，接头是碳氢化合物接头(例如，C2-C20烷基、C2-C20烯基或C2-C20炔基)、多胺接头(例如，乙二胺、腐胺、尸胺、亚精胺或精胺)、肽接头(例如、1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸序列)或合成聚合物(例如，如聚乙二醇等聚醚)。
在一些实施例中，核心M是含有一个或多个能够(例如，直接或间接通过接头和/或环)连接到碳水化合物抗原的位点的部分，其中连接可以是共价连接(例如，通过共价键键)或非共价连接(例如，通过亲和结合对)。核心可以具有例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、16个、20个、24个、28个、32个或更多个连接位点。
在一些实施例中，核心是胺。在一些实施例中，核心选自由以下组成的组：支化聚合物(例如，星形聚合物、梳形聚合物、刷状聚合物、超支化聚合物和树枝状聚合物(例如，聚(酰氨基胺)(PAMAM)树枝状聚合物))；核酸(例如，寡核苷酸或更长的核酸分子)；多胺(例如，乙二胺或2,4,6-三吡啶基-S-三嗪)；多肽(例如，链霉亲和素和抗体或其抗原结合片段或载体蛋白(例如，KLH))；多糖(例如，细菌多糖或植物多糖)和胶束。
在一些实施例中，核心M是树枝状聚合物，如聚(酰氨基胺)(PAMAM)树枝状聚合物。在一些实施例中，核心是PAMAM树枝状聚合物，并且“x”是4或更大(例如，4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30或32或更大)。
在一些实施例中，核心是如钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH)等载体蛋白。
在一些实施例中，核心是乙二胺，并且“x”是2。
在一些实施例中，核心是胺，并且“x”是3。
在一些实施例中，核心是2,4,6-三吡啶基-S-三嗪，并且“x”是3。
在一些实施例中，“x”是1至32的整数(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或32)。在优选的实施例中，“x”是2、3、4、8或16。
例如，在一些实施例中，GD2是指具有以下结构或其经修饰形式的神经节苷脂：
在一些实施例中，GD2包括以下结构：
在一些实施例中，GD2包括苯硫基(例如，如下文所示的苯硫基GD2)。
在一些实施例中，GD2包括芳基。
在一些实施例中，GD2包括具有以下结构的GD2-O-芳基-NH2：
在一些实施例中，GD2包括对氨基苯基醚基团(例如，如下文所示的AP-GD2)。
类似地，在一些实施例中，GD3是指具有以下结构或其经修饰形式的神经节苷脂：
在一些实施例中，GD3包括以下结构：
在一些实施例中，GD3是苯硫基GD3。在一些实施例中，苯硫基GD3具有以下结构：
在一些实施例中，GD3是具有以下结构的GD3-O-芳基-NH2：
在一些实施例中，GD3是对氨基苯基醚GD3(AP-GD3)。
在一些实施例中，芳基是三嗪。在一些实施例中，三嗪是1,3,5-三嗪。在一些实施例中，三嗪任选地被取代。在一些实施例中，三嗪是2-氨基-4,6-二氯-1,3,5-三嗪。
因此，本文提供了包括杂芳基的神经节苷脂，例如三嗪或三唑。在一些实施例中，包括杂芳基的神经节苷脂是单体。在其它实施例中，包括杂芳基的神经节苷脂是多聚体(例如，三聚体)。
因此，在某些方面，本文提供了一种组合物，其包含具有以下结构的神经节苷脂：(A)x-[(P)y-(L)z]-(M)b；其中A是神经节苷脂或其任何部分；x是1至32的整数；P是杂芳基；y是1；L是接头；z是0至8的整数；M是核心；并且b是0或1；其中P任选地被1个、2个、3个、4个或5个独立地选自以下的取代基取代：(1)氢；(2)C1-7酰基；(3)C1-20烷基；(4)氨基；(5)C3-10芳基；(6)羟基；(7)硝基；(8)C1-20烷基-氨基；以及(9)-(CH2)qCONRB，其中q是0至4的整数，并且其中RB选自由以下组成的组：(a)氢；(b)C1-6烷基；(c)C3-10芳基；以及(d)C1-6烷-C6-10芳基。
在一些实施例中，杂芳基是三嗪或三唑。在一些实施例中，a)三嗪是1,3,5三嗪；或b)三唑是1,2,3三唑或1,2,4三唑。
在一些实施例中，所述P被1个、2个、3个、4个或5个独立地选自以下的取代基取代：(1)氢；(2)C1-20烷基-氨基；以及(3)-(CH2)qCONRB，其中q是0至4的整数，并且其中RB选自由以下组成的组：(a)氢；(b)C1-6烷基；(c)C3-10芳基；以及(d)C1-6烷-C6-10芳基。
在一些实施例中，M是(1)胺或(2)聚酰胺-胺(PAMAM)。在一些实施例中，x是1、2、3、4、6或8。
示例性结构包括：
以及
其中A是神经节苷脂。
在一些实施例中，所述神经节苷脂选自GD2、GD3、GD1b、GT1b、岩藻糖基-GM1、GloboH、聚唾液酸(PSA)、GM2、GM3、唾液酰-路易斯X、唾液酰-路易斯Y、唾液酰-路易斯A、唾液酰-路易斯B和路易斯Y，任选地其中所述神经节苷脂是GD2、GD3、GT1b和GM2。
在一些实施例中，所述神经节苷脂被可检测地标记，任选地其中所述神经节苷脂是用酶、辅基(例如，链霉亲和素/生物素)、荧光团、发光标签、生物发光标签和/或放射性同位素标记的。
如本文所表明的，本公开的神经节苷脂(天然的或经修饰的)可以用允许检测的部分标记。标记的神经节苷脂可以用作抗原，所述抗原可以用于诊断或预后监测血液或组织中的抗神经节苷脂抗体的水平，作为临床测试程序的一部分。标记的神经节苷脂也可以用于各种测定(例如，ELISA测定、竞争性ELISA测定等)。可检测部分的实例包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料和放射性材料。合适的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的实例包括链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；合适的荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、若丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白(PE)；发光材料的实例包括鲁米诺；生物发光材料的实例包括荧光素酶、荧光素和水母发光蛋白，并且合适的放射性材料的实例包括125I、131I、35S或3H。如本文所使用的，关于神经节苷脂的术语“标记的”旨在涵盖通过将可检测物质如放射性药剂或荧光团(例如，异硫氰酸荧光素(FITC)或藻红蛋白(PE)或吲哚菁(Cy5))与神经节苷脂偶联(即物理连接)直接标记神经节苷脂，以及通过与可检测物质的反应性间接标记神经节苷脂。例如，神经节苷脂可以用可以被扩增和检测的核酸序列标记。
在一些实施例中，包含本公开的神经节苷脂的组合物是药物组合物。
药物组合物
可以将诱导针对神经节苷脂的免疫应答的化合物并入适于施用于受试者的药物组合物中。此类组合物通常包含化合物(例如，神经节苷脂的经修饰形式)和药学上可接受的载体。如本文所使用的，药学上可接受的载剂旨在包括与药物施用相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂以及吸收延迟剂等。将这种培养基和药剂用于具有药学活性的物质在本领域中是熟知的。除非任何常规介质或试剂与活性化合物不相容，否则考虑其在组合物中的用途。补充的活性化合物也可以并入这些组合物中。
本发明的药物组合物被调配成与其预期施用途径相容。施用途径的实例包括肠胃外，例如静脉内、皮内、皮下、口服(例如，吸入)、经皮(局部)、经粘膜和直肠施用。用于肠胃外、皮内或皮下施加的溶液或悬浮液可以包括以下组分：无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂，如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲剂，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调节渗透压的药剂，如氯化钠或右旋糖。可以用如盐酸或氢氧化钠等酸或碱调整pH。肠胃外制剂可以封闭在安瓿、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多个剂量小瓶中。
适合于可注射用途的药物组合物包括无菌水溶液(在水溶性的情况下)或分散体以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(新泽西州帕西波尼市的巴斯夫公司(BASF,Parsippany,NJ))或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物应该是无菌的并且应当具有达到容易注射的程度的流动性。其必须在制造和存储的条件下稳定并且应被保存以免遭微生物如细菌和真菌的污染作用。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。恰当的流动性可以例如通过使用如卵磷脂等包衣、在分散体的情况下通过维持所需的粒度、以及通过使用表面活性剂来维持。抑制微生物的作用可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如，对羟苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等)来实现。在许多情况下，优选的是，在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇(如甘露醇、山梨醇)、氯化钠。可以通过在组合物中包括延迟吸收的药剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)来实现可注射组合物的延长吸收。
无菌可注射溶液可以通过将所需量的活性化合物根据需要与以上列举的成分中的一种或其组合一起掺入适当溶剂中，随后过滤灭菌来制备。通常，分散液是通过将活性化合物掺入无菌媒剂中来制备的，所述无菌媒剂含有基础分散介质以及来自以上列举的那些成分的所需其它成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，所述方法从其先前的无菌过滤溶液中产生具有活性成分和任何另外的期望成分的粉末。
口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用载体。它们可以被包封在明胶胶囊中或被压制成片剂。出于口服治疗性施用的目的，可以将活性化合物与赋形剂一起掺入并且以片剂、锭剂或胶囊剂的形式使用。口服组合物也可以使用用作漱口水的流体载体来制备，其中将在流体载体中的化合物口服施用并且漱口(swished)并且吐出或吞咽。可以包括药学上相容的粘合剂和/或佐剂材料作为组合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂等可以含有以下成分中的任何成分或者具有类似性质的化合物：粘合剂，如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂，如淀粉或乳糖；崩解剂，如海藻酸、初凝结(Primogel)或玉米淀粉；润滑剂，如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂，如胶体二氧化硅；甜味剂，如蔗糖或糖精；或调味剂，如薄荷、水杨酸甲酯或橙味调味剂。
也可以通过经粘膜或经皮的方式进行全身施用。对于经粘膜或经皮施用，在调配物中使用适合于待渗透的屏障的渗透剂。此类渗透剂通常是本领域中已知的并且包括例如用于经粘膜施用的洗涤剂、胆盐和夫西地酸衍生物。经粘膜施用可以通过使用鼻喷雾剂或栓剂来实现。对于经皮施用，将活性化合物配制成软膏剂、油膏剂、凝胶剂或乳膏剂，如本领域通常已知的。
在一些实施例中，将本公开的化合物与将保护这些化合物免于从体内快速消除的载剂一起制备，如控释调配物，包括植入物和微囊化的递送系统。可以使用可生物降解的、生物相容的聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备此类调配物的方法对本领域的技术人员而言应是显而易见的。这些材料也可以从阿尔扎公司(Alza Corporation)和新星制药有限公司(Nova Pharmaceuticals,Inc.)商购获得。脂质体悬浮液(包括以抗病毒抗原的单克隆抗体靶向受感染细胞的脂质体)也可以用作药学上可接受的载体。这些可以根据本领域的技术人员已知的例如美国专利第4,522,811号中描述的方法来制备。
尤其有利的是以剂量单位形式配制口服或肠胃外组合物以便于施用和剂量统一。如本文所使用的，剂量单位形式是指适于作为待治疗受试者的单位剂量的物理上离散的单位；每个单位含有预定量的活性化合物，所述预定量被计算为产生与所需的药物载剂相关联的所期望的治疗效果。本发明的剂量单位形式的规格由如下决定并且直接依赖于：活性化合物的独特特征、待实现的具体治疗效果和本领域中复合用于治疗个体的这种活性化合物固有的局限性。
分析/检测神经节苷脂
可以根据本文所描述的方法和本领域已知的其它合适的技术分析神经节苷脂生物标志物。可以使用包括但不限于以下的方法来检测神经节苷脂(例如，GD1、GD2、GD3、GM2)的存在、水平或脂质长度：免疫扩散、免疫电泳、免疫荧光测定、酶免疫测定、免疫沉淀测定、化学发光测定、免疫组织化学测定、斑点印迹测定或狭缝印迹测定。用于执行上述各种免疫测定的一般技术和所述技术的其它变体，如原位邻近连接测定(PLA)、荧光偏振免疫测定(FPIA)、荧光免疫测定(FIA)、酶免疫测定(EIA)、比浊抑制免疫测定(NIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、夹心ELISA、竞争性ELISA、凝集、补体测定、高效液相色谱法(HPLC)、薄层色谱法(TLC)、超扩散色谱法等(例如，《基础和临床免疫学(Basic andClinical Immunology)》,Sites和Terr,编辑,康涅狄格州诺沃克的阿普尔顿和兰格公司(Appleton and Lange,Norwalk,Conn.)第217-262页,1991，所述文献通过引用并入本文)单独地或与NMR、MALDI-TOF、LC-MS/MS组合或与其交替对于本领域普通技术人员来说是已知的。
此类试剂还可以用于监测细胞或组织上的神经节苷脂水平。可以通过将抗体与可检测物质偶联(例如，物理连接)来促进检测。可检测物质的实例包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料和放射性材料。合适的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的实例包括链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；合适的荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的实例包括鲁米诺；生物发光材料的实例包括荧光素酶、荧光素和水母发光蛋白，并且合适的放射性材料的实例包括125I、131I、35S或3H。
在一些实施例中，可以进行ELISA和RIA程序，使得标记期望的生物标志蛋白标准品(用放射性同位素，如125I或35S，或可测定的酶，如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)，并且与未标记的样品一起与对应的抗体接触，其中第二抗体用于与第一抗体结合，并且测定放射性或固定化酶(竞争性测定)。可替代地，使样品中的生物标志物蛋白与对应的固定化抗体反应，使放射性同位素或酶标记的抗生物标志物蛋白抗体与系统反应，并且测定放射性或酶。也可酌情采用其它常规方法。
在一些实施例中，夹心ELISA用于检测和测量神经节苷脂水平。夹心ELISA对两层抗体(即，捕获抗体与检测抗体)之间的抗原进行定量。待测量的抗原必须含有能够与抗体结合的至少两个抗原表位，因为至少两个抗体在夹心中起作用。单克隆抗体或多克隆抗体可以用作夹心ELISA系统中的捕获和检测抗体。单克隆抗体识别单个表位，所述单个表位允许精细检测抗原的微小差异并且对其进行定量。多克隆抗体通常用作捕获抗体，以尽可能多地下拉抗原。夹心ELISA的优点在于样品在分析前无需纯化，并且检测非常灵敏(比直接或间接ELISA灵敏2至5倍)。
在一些实施例中，夹心ELISA包括使用一种或多种本公开的抗体(例如，抗GD2或抗GD3抗体)。在一些实施例中，夹心ELISA包括使用一种或多种本领域众所周知的抗体(例如，可商购获得的抗GD2或抗GD3抗体)。在一些实施例中，夹心ELISA包括使用本公开的抗体和本领域已知的抗体(例如，可商购获得的抗体)的组合。
适用于本公开的测定(例如，夹心ELISA)的多种抗GD2或抗GD3抗体是本领域已知的和/或可商购获得的。
抗GD2抗体的非限制性实例包括：鼠m3F8抗体、鼠14G2a抗体、迪努希单抗(dinutuximab)、Ch14.18/CHO(迪努希单抗-β)、人3F8抗体、那昔妥单抗(Naxitamab)和Hu14.18-K322A(参见Sait和Modak(2017)《抗癌疗法专家评论(Expert Rev AnticancerTher.)》17:889-904；Voeller和Sondel(2020)《儿童血液病和肿瘤杂志(J PediatrHematol Oncol)》41:163-169；Mora等人(2020)《临床肿瘤学杂志(J of Clin Oncol)》38:15)；目录号BE0318(新罕布什尔州黎巴嫩的BioXCell公司(BioXCell,Lebanon,NH))；目录号ab68456、ab82717(马萨诸塞州沃尔瑟姆的艾博抗公司(Abcam,Waltham,MA))；目录号AGM-039YJ、AGM-143YJ、AGM-144YJ、AGM-145YJ、AGM-146YJ(纽约希尔兰的创新生物实验室(Creative Biolabs,Shirley,NY))。
抗GD3抗体的非限制性实例包括：目录号ab11779(马萨诸塞州沃尔瑟姆的艾博抗公司)；目录号14-9754-82(马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技公司(ThermoFisherScientific,Waltham,MA))；目录号917701(加利福尼亚州圣地亚哥的百进生物公司(BioLegend,San Diego,CA))；目录号MABC1112(马萨诸塞州伯灵顿的密理博西格玛公司(Millipore Sigma,Burlington,MA))；目录号sc-33685(德克萨斯州拉达斯的圣克鲁兹生物技术公司(Santa Cruz Biotechnology,Dallas,TX))；Hedberg等人(2000)《糖缀合物杂志(Glycoconjugate Journal)》17:717-726提供的抗体。
在一些实施例中，竞争性ELISA用于检测和测量神经节苷脂水平。竞争性ELISA(也称为抑制ELISA或竞争性免疫测定)通过检测信号干扰来测量抗原浓度。样品抗原与参考抗原竞争与特定量的标记的抗体结合。参考抗原可以是本公开的任何一种或多种抗原。可替代地，参考抗原可以是本领域已知的任何神经节苷脂或其经修饰形式。
在一些实施例中，参考抗原预先包被在多孔板上。将样品与标记的抗体(例如，抗GD2或抗GD3抗体，例如，本公开的抗体)一起预温育并添加到孔中。根据样品中的抗原的量，或多或少的游离抗体将可用于与参考抗原结合。这意味着样品中的抗原越多，检测到的参考抗原将越少，并且信号将越弱。一些竞争性ELISA方法使用标记的抗原而不是标记的抗体。标记的抗原和样品抗原(未标记)竞争与初级抗体结合。样品中的抗原量越低，由于孔中标记的抗原越多，信号越强。也可酌情采用其它常规变体。
在其它实施例中，竞争性ELISA测定包括在多孔板上包被初级抗体(例如，抗GD2或抗GD3抗体，例如，本公开的抗体)。在此，可检测/标记的参考抗原(例如，FITC标记的神经节苷脂)和样品在孔中共同温育，并且标记的参考抗原与天然抗原竞争与初级抗体结合。样品中的抗原量越低，由于孔中标记的抗原越多，信号越强。
在又其它实施例中，竞争性ELISA测定包括通过包被在多孔板中的抗物种次级抗体将初级抗体(例如，抗GD2或抗GD3抗体，例如，本公开的抗体)锚定到多孔板。例如，为了锚定在小鼠中产生的初级抗体，使用了抗小鼠次级抗体。然后，可检测/标记的参考抗原(例如，FITC标记的神经节苷脂)和样品在孔中共同温育，并且标记的参考抗原与天然抗原竞争与初级抗体结合。样品中的抗原量越低，由于孔中标记的抗原越多，信号越强。
在一些实施例中，用于测量生物标志物神经节苷脂水平的方法包括以下步骤：使生物样本(例如，液体活检(例如，血液、血清))和与生物标志物神经节苷脂选择性结合的抗体或其变体(例如，片段)接触，并且检测所述抗体或其变体是否与所述样品结合，从而测量生物标志物神经节苷脂水平。
免疫组织化学可以用于检测生物标志物神经节苷脂的存在或水平例如，在活检样品中。使合适的抗体与例如细胞薄层接触，洗涤，并且然后与第二标记的抗体接触。标记可以通过荧光标志物、如过氧化物酶等酶、抗生物素蛋白或放射性标记。使用显微镜对测定进行视觉评分。
抗神经节苷脂抗体也可以用于成像目的，例如检测受试者细胞和组织中生物标志物神经节苷脂的存在。合适的标记包括放射性同位素、碘(125I、121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(112In)和锝(99mTc)、如荧光素和罗丹明等荧光标记以及生物素。
可以使用的抗体和其衍生物涵盖多克隆或单克隆抗体、嵌合的、人的、人源化的、灵长类化的(CDR嫁接)、贴面或单链抗体以及抗体的功能片段，即生物标志蛋白结合片段。例如，可以使用能够与生物标志蛋白或其部分结合的抗体片段，所述抗体片段包括但不限于Fv、Fab、Fab′和F(ab′)2片段。
在一些实施例中，使用质谱法(例如，MALDI-TOF、LC/MS/MS、LC/MS或本领域已知的其它方法)检测如液体活检(例如，血液、唾液、血清，参见样品部分)等生物样本中的神经节苷脂(例如，GD1、GD2、GD3和/或GM2)的存在、水平或脂质长度。基于质谱的方法特别可用于确定神经节苷脂的脂质长度的异质性，所述神经节苷脂是本公开的新型生物标志物。
如果生物标志物的量分别大于或小于对照中的水平，其量大于用于评估量的测定的标准误差，则受试者的生物标志物(例如，神经节苷脂)的“水平”或“量”“显著”高于或低于对照中的生物标志物的水平。
在一些实施例中，如果所述量分别高于或低于生物标志物的正常和/或对照量至少或约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、550％、600％、650％、700％、750％、800％、850％、900％、950％、1000％、1500％、2000％、2500％、3000％、或更多、或介于两者之间的任何范围如5％-100％，则可以认为受试者中的生物标志物的量或水平“显著”高于或低于正常和/或对照量。此类显著调节值可以应用于本文所描述的任何度量，如神经节苷脂水平或神经节苷脂的脂质长度的异质性变化等。
术语至少一种神经节苷脂的“脂质长度的异质性”包括给定样品中的至少一种神经节苷脂的脂质长度的水平或分布模式。
在一些实施例中，如果隶属样品中的至少一种神经节苷脂的脂质长度的水平或分布模式高于或低于正常和/或对照样品中的至少一种神经节苷脂的脂质长度的水平或分布模式至少或约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、550％、600％、650％、700％、750％、800％、850％、900％、950％、1000％、1500％、2000％、2500％、3000％、或更多、或介于两者之间的任何范围如5％-100％，则脂质长度的异质性有变化(例如，增加或减少)或显著变化。
类似地，术语神经节苷脂的“脂质长度的异质性”包括具有短脂质长度与长脂质长度的神经节苷脂的分布模式(参见实例6)。神经节苷脂具有两个脂质尾部：鞘氨醇和酰基。如本文所使用的，不区分两个脂质尾部。因此，如本文所使用的术语“脂质长度的异质性”是指神经节苷脂的两个脂质尾部的平均长度。在一些实施例中，如果受试者样品中的具有短脂质长度(14个至34个碳)的神经节苷脂的量或水平高于或低于正常和/或对照样品中的神经节苷脂的量或水平至少或约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、550％、600％、650％、700％、750％、800％、850％、900％、950％、1000％、1500％、2000％、2500％、3000％、或更多、或介于两者之间的任何范围如5％-100％，则神经节苷脂的脂质长度的异质性有变化或显著变化。
在一些实施例中，如果受试者样品中的具有长脂质长度(36个至48个碳)的神经节苷脂的量或水平高于或低于正常和/或对照样品中的神经节苷脂的量或水平至少或约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、550％、600％、650％、700％、750％、800％、850％、900％、950％、1000％、1500％、2000％、2500％、3000％、或更多、或介于两者之间的任何范围如5％-100％，则神经节苷脂的脂质长度的异质性有变化或显著变化。
在一些实施例中，如果受试者样品中的具有短脂质长度(14个至34个碳)和长脂质长度(36个至48个碳)的神经节苷脂的量或水平高于或低于正常和/或对照样品中的神经节苷脂的量或水平至少或约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、550％、600％、650％、700％、750％、800％、850％、900％、950％、1000％、1500％、2000％、2500％、3000％、或更多、或介于两者之间的任何范围如5％-100％，则神经节苷脂的脂质长度的异质性有变化或显著变化。
对照
对照是指任何合适的参考标准，如正常患者；从如正常受试者等受试者分离的培养的原代细胞/组织；从患者的同一器官或身体部位获得的相邻正常细胞/组织；从正常受试者中分离的组织或细胞样品或从保藏中心获得的原代细胞/组织。在其它实施例中，对照可以包括如正常或健康受试者等受试者的神经节苷脂的表达水平(例如，神经节苷脂的水平)和/或脂质尾部长度。在一些实施例中，对照是指缺少测试剂(例如，抗神经节苷脂抗体)的样品。
对照还指适合提供与测试样品中表达产物比较的任何参考标准。在某些实施例中，对照包括获得对照样品，从所述对照样品检测神经节苷脂的水平或脂质长度并且与来自测试样品的神经节苷脂的水平或脂质长度进行比较。此类对照样品可以包括任何合适的样品，包括但不限于来自具有已知结果的对照癌症患者的样品(可以是储存的样品或先前的样品测量结果)；从如正常患者或癌症患者等受试者分离的正常组织或细胞；从如正常受试者或癌症患者等受试者分离的培养的原代细胞/组织；从癌症患者的同一器官或身体部位获得的相邻正常细胞/组织；从正常受试者中分离的组织或细胞样品或从保藏中心获得的原代细胞/组织。在一些实施例中，对照可以包括来自任何合适来源的参考标准表达产物(例如，神经节苷脂)水平，包括但不限于来自正常组织(或其它先前分析的对照样品)的表达产物水平范围、来自一组患者或一组具有特定结果(例如，存活一年、两年、三年、四年等)或接受某种治疗的患者的测试样品中先前确定的表达产物水平范围(例如，护理癌症疗法的标准)。本领域技术人员将理解，此类对照样品和参考标准表达产物水平可以组合用作本发明的方法中的对照。
在一些实施例中，蛋白质或核酸的量可以相对于同一样品中另一基因的蛋白质或核酸的量或作为其比率来确定样品内的蛋白质或核酸的量。在一些实施例中，对照包括表达产物水平的比率转化，包括但不限于确定两种神经节苷脂的产物水平的比率或测试样品中的神经节苷脂的短脂质长度与长脂质长度的比率，并且将其与参考标准中的神经节苷脂的短脂质长度与长脂质长度的任何合适比率进行比较；确定测试样品中的两个或更多个基因的产物水平，并且确定任何合适的对照中的产物水平的差异；以及确定测试样品中的两种或更多种神经节苷脂的产物水平，将它们的水平归一化为测试样品中的管家基因产物的水平，并且与任何合适的对照进行比较。在优选的实施例中，对照包括与测试样品具有相同谱系和/或类型的对照样品。在其它实施例中，对照可以包括在一组患者样品内或基于一组患者样品，如所有患有癌症的患者，分组为百分位数的产物水平。在一些实施例中，建立了对照产物水平，其中使用相对于例如特定百分位数更高或更低水平的产物作为预测结果的基础。在其它优选的实施例中，使用来自具有已知结果的癌症对照患者的产物水平建立对照产物水平，并且将来自测试样品的产物水平与对照产物水平进行比较，作为预测结果的基础。如本文提供的数据所示，本发明的方法不限于在将测试样品中的产物水平与对照进行比较时使用特定的分界点。
在一些实施例中，预定的标志物量和/或活性测量结果可以是任何合适的标准。例如，预定的标志物量和/或活性测量结果可以从为其评估患者选择的相同或不同的人获得。在一些实施例中，预定的标志物量和/或活性测量结果可以从同一患者的先前评估中获得。以此方式，可以随时间推移监测患者选择的进展。另外，如果受试者是人，则对照可以从对另外的一个人或多个人的评估获得，例如选定的一组人。以此方式，正在被评估选择的人的选择程度可以与合适的其它人进行比较，例如与所关注的人处于类似情况的其它人，如患有类似或相同病状和/或具有相同种族的那些人。
诊断测定
本发明部分地提供了用于对生物样品是否包括神经节苷脂和/或神经节苷脂的水平是否被调节(例如，上调或下调)进行准确分类的方法、系统和代码，从而指示如癌症等所关注的病症的状态。在一些实施例中，本发明可用于使用统计算法和/或经验数据(例如，神经节苷脂的存在、不存在、水平或脂质长度)将样品(例如，来自受试者)分类为与癌症或其亚型相关或有风险患上癌症或其亚型，由神经节苷脂介导。
用于检测神经节苷脂的水平并因此用于对样品是否与癌症或其临床亚型或癌症的不同分期相关进行分类的示例性方法涉及从测试受试者获得生物样品并使生物样品与能够检测神经节苷脂的本发明的抗体或其抗原结合片段接触，使得神经节苷脂的水平在生物样品中检测到。在一些实施例中，使用至少一种抗体或其抗原结合片段，其中两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多此类抗体或抗体片段可以组合使用(例如，在夹心ELISA中)或串联使用。在某些情况下，统计算法是单个学习统计分类器系统。例如，单个学习统计分类器系统可以用于基于预测或概率值以及神经节苷脂的存在或水平将样品分类为癌症样品。单个学习统计分类器系统的使用通常将样品分类为具有至少或约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的灵敏度、特异性、阳性预测值、阴性预测值和/或总体准确度的癌症样品。
其它合适的统计算法是本领域技术人员众所周知的。例如，学习统计分类器系统包括机器学习算法技术，所述技术能够适应复杂的数据集(例如，所关注的标志物面板)并基于此类数据集做出决策。在一些实施例中，使用如分类树(例如，随机森林)的单个学习统计分类器系统。在其它实施例中，优选地串联使用2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个学习统计分类器系统的组合。学习统计分类器系统的实例包括但不限于使用归纳学习的那些(例如，决策/分类树，如随机森林、分类和回归树(C&RT)、增强树等)、可能近似正确(PAC)学习、链结式学习(例如，神经网络(NN)、人工神经网络(ANN)、神经模糊网络(NFN)、网络结构、如多层感知器的感知器、多层前馈网络、神经网络的应用、信念网络中的贝叶斯学习(Bayesian learning)等)、强化学习(例如，在已知环境中的被动学习，如朴素学习、自适应动态学习和时间差学习、在未知环境中的被动学习、在未知环境中的主动学习、学习动作值函数、强化学习的应用等)，以及遗传算法和进化编程。其它学习统计分类器系统包括支持向量机(例如，核方法)、多元自适应回归样条(MARS)、列文伯格-马夸尔特算法(Levenberg-Marquardt algorithm)、高斯-牛顿算法(Gauss-Newton algorithm)、高斯混合算法(mixtures of Gaussians)、梯度下降算法和学习向量量化(LVQ)。在某些实施例中，本发明的方法进一步包括将样品分类结果发送给临床医生(非专家，例如初级保健医师；和/或专家，例如组织病理学家或肿瘤学家)。
在一些实施例中，本公开的方法进一步提供以个体患有癌症的概率形式的诊断。例如，个体可以具有约0％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高的患癌概率。在又另一个实施例中，本发明的方法进一步提供了个体癌症的预后。在一些情况下，将样品分类为癌症样品的方法可以进一步基于从其获得样品的个体的症状(例如，临床因素)。症状或症状组可以是例如，淋巴细胞计数、白细胞计数、红细胞沉降率、腹泻、腹痛、腹胀、骨盆痛、腰痛、痉挛、发烧、贫血、体重减轻、焦虑、抑郁和其组合。在一些情况下，将样品分类为癌症样品的方法可以进一步基于基因突变和/或癌症倾向，而不考虑症状。在一些实施例中，在将个体诊断为患有癌症之后向所述个体施用治疗有效量的癌症疗法(例如，化疗剂)。
用于检测神经节苷脂存在或不存在的示例性方法包括使用本公开的能够与神经节苷脂结合的抗体或其片段的抗体，优选地具有可检测标记的抗体。抗体可以是多克隆或更优选地单克隆的。此类药剂可以被标记。关于抗体，术语“标记的”旨在涵盖通过将可检测物质偶联(即，物理连接)到探针或抗体来直接标记探针或抗体，以及通过与直接标记的另一种试剂的反应性来间接标记探针或抗体。间接标记的实例包括使用荧光标记的次级抗体检测初级抗体。术语“生物样品”旨在包括从受试者分离的组织、细胞和生物流体，如血清、血液，以及存在于受试者体内的组织、细胞和流体。也就是说，本公开的检测方法可以用于在体外、离体以及体内检测生物样品中的神经节苷脂。用于检测神经节苷脂的体外技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫沉淀、免疫组织化学(IHC)、流式细胞术和相关技术以及免疫荧光。此外，用于检测神经节苷脂的体内技术包括将标记的抗神经节苷脂抗体引入到受试者中。例如，抗体可以用放射性、发光、荧光或其它类似标志物标记，它们在受试者中的存在和位置可以通过单独的标准成像技术或与用于如细胞类型的标志物(例如，CD8+T细胞标志物)等其它分子的成像相结合来检测。
用于检测神经节苷脂的存在、水平或脂质长度的另一种示例性方法是使用质谱法，优选地与HPLC结合。
在一些实施例中，所述方法进一步涉及获得对照生物样品(例如，来自未患癌症的受试者的生物样品)、缓解期间或患上癌症之前来自受试者的生物样品、或在患上癌症的治疗期间来自受试者的生物样品。
在一些实施例中，所述方法包括：使对照样品与能够检测神经节苷脂的化合物或药剂接触，使得神经节苷脂的存在和/或水平在生物样品中检测到；以及将对照样品中的神经节苷脂的存在或水平与测试样品中神经节苷脂的存在或水平进行比较。
优选的生物样品是通过常规方法从受试者分离的血清、血液、唾液、肿瘤微环境、瘤周或瘤内。
在仍其它实施例中，抗体可以与用于在ELISA或RIA中使用抗体的组件或装置相关联。非限制性实例包括固定在固体表面上用于这些测定的抗体(例如，连接和/或缀合到基于如上文所描述的光或辐射发射的可检测标记)。在其它实施例中，抗体与用于通过使用免疫层析或免疫化学测定检测神经节苷脂的装置或试纸条相关联，如在“夹心”或竞争性测定、免疫组织化学、免疫荧光显微镜等中。此类装置或试纸条的另外的实例是那些设计用于家庭测试或快速护理点测试的装置或试纸条。另外的实例包括为同时分析单个样品中的多种分析物而设计的那些。例如，本发明的未标记的抗体可以用于“捕获”生物样品中的神经节苷脂，并且捕获的(或固定化的)神经节苷脂可以与本公开的标记形式的抗神经节苷脂抗体结合用于检测。免疫测定的其它实施例是本领域技术人员众所周知的，包括基于例如免疫扩散、免疫电泳、免疫组织病理学、免疫组织化学和组织病理学的测定。
如通过本公开的组合物和方法测定的，至少一种神经节苷脂的脂质长度的水平和/或异质性与癌症的不同级别相关。因此，在一些实施例中，本公开的组合物和方法可以用于基于如本文所描述确定的至少一种神经节苷脂的脂质长度的水平和/或异质性来确定癌症的级别。癌症的级别描述了与健康细胞相比，癌细胞和组织在显微镜下看起来有多异常。看起来和组织得最像健康细胞和组织的癌细胞是低级别肿瘤。医生将这些癌症描述为分化良好。较低级别癌症通常侵袭性较小，并且预后较好。细胞看起来和组织得越异常，癌症的级别就越高。具有高级别的癌细胞往往更具侵略性。所述具有高级别的癌细胞被称为低分化的或未分化的。有些癌症有自己的肿瘤分级系统。许多其它使用标准的1-4评分量表。
●级别1：肿瘤细胞和组织看起来最像健康细胞和组织。这些被称为分化良好的肿瘤，并且被认为是低级别的。
●级别2：细胞和组织有些异常，并且被称为中度分化的。这些是中间级别肿瘤。
●级别3：细胞和组织看起来非常异常。这些癌症被认为是低分化的，因为它们不再具有建筑结构或模式。
级别3肿瘤被认为是高级别的。
●级别4：这些未分化的癌症具有看起来最异常的细胞。这些是最高级别的，并且通常比较低级别肿瘤生长和扩散得更快。
如本文所使用的，低级别癌症是指I级癌症；并且高级别癌是指2-4级癌症。
类似地，如通过本公开的组合物和方法测定的，至少一种神经节苷脂的脂质长度的水平和/或异质性与癌症的不同分期相关。因此，在一些实施例中，本公开的组合物和方法可以用于基于如本文所描述确定的至少一种神经节苷脂的脂质长度的水平和/或异质性来确定癌症的级别。
癌症的分期解释了原发性肿瘤的大小以及癌症在患者体内的扩散程度。有若干种不同的分期系统。这些分期系统中的许多分期系统是针对特定类型的癌症而创建的。其它分期系统可以用于描述若种类型的癌症。许多人都知道的一种常见系统将癌症分为0至IV级。
●0期针对未扩散且未被视为癌症的异常细胞，但是所述异常细胞将来可能会癌变。这个分期也称为“原位”。
●I期至III期针对未扩散到原发性肿瘤部位以外或仅扩散到附近组织的癌症。分期数越高，肿瘤越大，并且扩散越多。
●IV期癌症已经扩散到身体的远处区域。
如本文所使用的，早期/低期癌症是指I期癌症；并且后期/高度/晚期癌症包括II期至IV期的癌症。
同样，如通过本公开的组合物和方法测定的，至少一种神经节苷脂的脂质长度的水平和/或异质性与肿瘤负荷相关。因此，在一些实施例中，本公开的组合物和方法可以用于基于如本文所描述确定的至少一种神经节苷脂的脂质长度的水平和/或异质性来确定受试者的肿瘤负荷。肿瘤负荷(或肿瘤负载)定义为分布在患者体内(包括骨髓)的肿瘤总量(细胞/质量)。在实体瘤应答评估标准(RECIST)分析中，肿瘤负荷被认为是所有可测量病灶的最长直径的总和。可以使用多种方法来确定受试者的肿瘤负荷。例如，计算机断层扫描(CT)和磁共振(MR)成像已用于基于形态学(大小、位置)标准评估肿瘤应答，特别是通过使用RECIST。RECIST分类描述了病变的大小并区分了4种类型的治疗应答——稳定疾病(SD)、部分应答(PR)、完全应答(CR)或进行性疾病(PD)。
预后测定
术语“预后”包括对癌症可能的病程和结果或从疾病恢复的可能性的预测。在一些实施例中，统计算法的使用提供个体癌症的预后。例如，预后可以是外科手术、癌症(例如实体瘤如肺癌、黑色素瘤和肾细胞癌)临床亚型的发展、一种或多种临床因素的发展、肠癌的发展或从疾病的恢复。
如前述诊断测定或以下测定等本文所描述的测定可以用于确定是否可以向受试者施用药剂(例如，激动剂、拮抗剂、肽模拟物、多肽、肽、核酸、小分子、免疫疗法、免疫检查点抑制疗法或其它候选药物)来治疗癌症。例如，此类方法可以用于确定受试者是否可以用一种药剂或药剂组合进行有效治疗。因此，本公开提供了用于确定受试者是否可以用一种或多种用于治疗癌症的药剂有效治疗的方法，其中获得测试样品并且检测神经节苷脂。
本文所描述的方法可以例如通过使用包括至少一种本文所描述的抗体试剂的预包装的诊断试剂盒来进行，所述预包装的诊断试剂盒可以方便地用于例如在临床环境中诊断表现出癌症症状或家族史的患者。
本公开的其它方面包括本文所描述的组合物和方法用于关联和/或分层分析的用途，其中对来自患有癌症的个体的生物样品中的神经节苷脂进行分析，并且将所述信息与对照(例如，未患有癌症的个体；对照也可以称为“健康”或“正常”个体或在给定延时研究中的早期时间点)的信息进行比较，所述对照优选地具有类似的年龄和种族。适当选择患者和对照对关联和/或分层研究的成功很重要。因此，非常需要一群具有良好表征表型的个体。本文描述了用于癌症诊断、癌症易感性筛查、预测临床结果、癌症预后、确定药物应答性(药物基因组学)、药物毒性筛查等的标准。
不同的研究设计可以用于遗传关联和/或分层研究(《现代流行病学(ModernEpidemiology)》,利平科特·威廉斯和威尔金斯出版公司(Lippincott Williams&Wilkins)(1998),609-622)。观察性研究是最经常进行的，其中患者的应答不受干扰。第一种类型的观察性研究鉴定存在疑似病因的人样品和不存在疑似病因的另一样品，然后对两个样品中疾病发展的频率进行比较。这些采样群体称为队列，并且所述研究是一项前瞻性研究。另一种类型的观察性研究是病例对照或回顾性研究。在典型的病例对照研究中，样品是从具有如疾病的某些表现等所关注的表型(病例)的个体，以及从群体(目标群体)中没有要从中得出结论的表型(对照)的个体收集的。然后回顾性地调查疾病的可能原因。由于病例对照研究中收集样品的时间和成本显著低于前瞻性研究的时间和成本，病例对照研究是遗传关联研究中更常用的研究设计，至少在探索和发现阶段是这样。
在获得所有相关的表型和/或基因型信息后，进行统计分析以确定等位基因或基因型的存在与个体的表型特性之间是否存在任何显著相关性。优选地，在进行遗传关联的统计测试之前首先进行数据检查和清理。样品的流行病学和临床数据可以通过本领域众所周知的表格和图表的描述性统计来汇总。优选地执行数据验证以检查数据完整性、不一致的条目和离群值。然后可以使用卡方测试和t测试(如果分布不正常，则使用威尔科克森秩和测试(Wilcoxon rank-sum test))分别检查离散变量和连续变量的个案与对照之间的显著差异。
执行遗传关联检验的一个重要决定是确定当测试的p值达到所述水平时可以宣布显著关联的显著性水平。在阳性命中将在后续确认测试中跟进的探索性分析中，例如，未调整的p值<0.2(宽松方面的显著性水平)可以用于生成神经节苷脂水平与癌症的某些表型特性显著相关的假设。优选的是，实现p值<0.05(本领域传统上使用的显著性水平)，以便所述水平被认为与癌症相关。当命中在同一来源的更多样品或不同来源的不同样品中的确认分析中跟进时，将进行针对多重测试的调整，以避免命中数过多，同时将实验性误差率保持在0.05。虽然有不同的方法来调整多重测试以控制不同类型的误差率，但是常用但相当保守的方法是用于控制实验性或家族性误差率(多重比较和多个测试，Westfall等人,SAS研究所(SAS Institute)(1999))的邦费罗尼校正。用于控制错误发现率FDR的排列测试可以更强大(Benjamini和Hochberg,《皇家统计学会杂志(Journal of the Royal StatisticalSociety)》,系列B 57,1289-1300,1995,基于重采样的多重测试(Resampling-basedMultiple Testing),Westfall和Young,威利公司(1993))。当测试是相关的并且相对于控制实验性误差率，控制错误发现率就足够时，此类用于控制多重性的方法将是优选的。
一旦发现遗传或非遗传的个体风险因素导致疾病易感性，就可以建立分类/预测方案来预测个体将根据其表型和/或基因型以及其它非遗传风险因素所处的类别(例如，疾病或非疾病)。离散性状的逻辑回归和连续性状的线性回归是针对此类任务的标准技术(《应用回归分析(Applied Regression Analysis)》,Draper和Smith,威利公司(1998))。此外，还可以使用其它技术来建立分类。此类技术包括但不限于适用于比较不同方法性能的MART、CART、神经网络和判别分析(《统计学习基础(The Elements of StatisticalLearning)》,Hastie、Tibshirani和Friedman,施普林格(Springer)(2002))。
诊断和预后方法的示例性实施例
在某些方面，本文提供了诊断和预后方法。例如，在某些方面，本文提供了一种诊断受试者的癌症的方法，所述方法包括：a)确定受试者样品中的至少一种神经节苷脂的水平；以及b)将所述至少一种神经节苷脂的所述水平与对照样品中的所述至少一种神经节苷脂的水平进行比较，其中与所述对照样品中的所述水平相比，所述受试者样品中的所述至少一种神经节苷脂的显著更高的水平表明所述受试者患有癌症。
在某些方面，本文提供了一种鉴定患有癌症的受试者的方法，所述方法包括：a)确定受试者样品中的至少一种神经节苷脂的水平；以及b)将所述至少一种神经节苷脂的所述水平与对照样品中的所述至少一种神经节苷脂的水平进行比较，其中与所述对照样品中的所述水平相比，所述受试者样品中的所述至少一种神经节苷脂的显著更高的水平将所述受试者鉴定为患有癌症。
在某些方面，本文提供了一种确定癌症分期的方法，所述方法包括：a)确定受试者样品中的至少一种神经节苷脂的水平；以及b)将所述至少一种神经节苷脂的所述水平与对照样品中的所述至少一种神经节苷脂的水平进行比较，其中与所述对照样品中的所述水平相比，所述受试者样品中的所述至少一种神经节苷脂的水平增加至少、约或不超过10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、240％、250％、260％、270％、280％、290％、300％、310％、320％、330％、340％、350％、360％、370％、380％、390％、400％、410％、420％、430％、440％、450％、460％、470％、480％、490％、500％、510％、520％、530％、540％、550％、560％、570％、580％、590％、600％、610％、620％、630％、640％、650％、660％、670％、680％、690％、700％、710％、720％、730％、740％、750％、760％、770％、780％、790％、800％、810％、820％、830％、840％、850％、860％、870％、880％、890％、900％、910％、920％、930％、940％、950％、960％、970％、980％、990％、1000％表明所述受试者患有早期癌症；和/或其中与所述对照样品中的所述水平相比，所述受试者样品中的所述至少一种神经节苷脂的水平增加至少、约或不超过10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、240％、250％、260％、270％、280％、290％、300％、310％、320％、330％、340％、350％、360％、370％、380％、390％、400％、410％、420％、430％、440％、450％、460％、470％、480％、490％、500％、510％、520％、530％、540％、550％、560％、570％、580％、590％、600％、610％、620％、630％、640％、650％、660％、670％、680％、690％、700％、710％、720％、730％、740％、750％、760％、770％、780％、790％、800％、810％、820％、830％、840％、850％、860％、870％、880％、890％、900％、910％、920％、930％、940％、950％、960％、970％、980％、990％、1000％表明所述受试者患有后期癌症。
在一些实施例中，与所述对照样品中的所述水平相比，所述受试者样品中的所述至少一种神经节苷脂的所述水平增加至少100％且不超过200％表明所述受试者患有早期癌症。在一些实施例中，与所述对照样品中的所述水平相比，所述受试者样品中的所述至少一种神经节苷脂的所述水平增加至少200％表明所述受试者患有后期癌症。
在某些方面，本文提供了一种确定癌症级别的方法，所述方法包括：确定受试者样品中的至少一种神经节苷脂的水平；以及b)将所述至少一种神经节苷脂的所述水平与对照样品中的所述至少一种神经节苷脂的水平进行比较，其中与所述对照样品中的所述水平相比，所述受试者样品中的所述至少一种神经节苷脂的水平增加至少、约或不超过10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、240％、250％、260％、270％、280％、290％、300％、310％、320％、330％、340％、350％、360％、370％、380％、390％、400％、410％、420％、430％、440％、450％、460％、470％、480％、490％、500％、510％、520％、530％、540％、550％、560％、570％、580％、590％、600％、610％、620％、630％、640％、650％、660％、670％、680％、690％、700％、710％、720％、730％、740％、750％、760％、770％、780％、790％、800％、810％、820％、830％、840％、850％、860％、870％、880％、890％、900％、910％、920％、930％、940％、950％、960％、970％、980％、990％、1000％表明所述受试者患有I级别癌症；其中与所述对照样品中的所述水平相比，所述受试者样品中的所述至少一种神经节苷脂的水平增加至少、约或不超过10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、240％、250％、260％、270％、280％、290％、300％、310％、320％、330％、340％、350％、360％、370％、380％、390％、400％、410％、420％、430％、440％、450％、460％、470％、480％、490％、500％、510％、520％、530％、540％、550％、560％、570％、580％、590％、600％、610％、620％、630％、640％、650％、660％、670％、680％、690％、700％、710％、720％、730％、740％、750％、760％、770％、780％、790％、800％、810％、820％、830％、840％、850％、860％、870％、880％、890％、900％、910％、920％、930％、940％、950％、960％、970％、980％、990％、1000％表明所述受试者患有II级别癌症；其中与所述对照样品中的所述水平相比，所述受试者样品中的所述至少一种神经节苷脂的水平增加至少、约或不超过10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、240％、250％、260％、270％、280％、290％、300％、310％、320％、330％、340％、350％、360％、370％、380％、390％、400％、410％、420％、430％、440％、450％、460％、470％、480％、490％、500％、510％、520％、530％、540％、550％、560％、570％、580％、590％、600％、610％、620％、630％、640％、650％、660％、670％、680％、690％、700％、710％、720％、730％、740％、750％、760％、770％、780％、790％、800％、810％、820％、830％、840％、850％、860％、870％、880％、890％、900％、910％、920％、930％、940％、950％、960％、970％、980％、990％、1000％表明所述受试者患有III级别癌症；和/或其中与所述对照样品中的所述水平相比，所述受试者样品中的所述至少一种神经节苷脂的水平增加至少、约或不超过10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、240％、250％、260％、270％、280％、290％、300％、310％、320％、330％、340％、350％、360％、370％、380％、390％、400％、410％、420％、430％、440％、450％、460％、470％、480％、490％、500％、510％、520％、530％、540％、550％、560％、570％、580％、590％、600％、610％、620％、630％、640％、650％、660％、670％、680％、690％、700％、710％、720％、730％、740％、750％、760％、770％、780％、790％、800％、810％、820％、830％、840％、850％、860％、870％、880％、890％、900％、910％、920％、930％、940％、950％、960％、970％、980％、990％、1000％表明所述受试者患有IV级别癌症。
在一些实施例中，与所述对照样品中的所述水平相比，所述受试者样品中的所述至少一种神经节苷脂的水平增加至少、约或不超过10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、240％、250％、260％、270％、280％、290％、300％、310％、320％、330％、340％、350％、360％、370％、380％、390％、400％、410％、420％、430％、440％、450％、460％、470％、480％、490％、500％、510％、520％、530％、540％、550％、560％、570％、580％、590％、600％、610％、620％、630％、640％、650％、660％、670％、680％、690％、700％、710％、720％、730％、740％、750％、760％、770％、780％、790％、800％、810％、820％、830％、840％、850％、860％、870％、880％、890％、900％、910％、920％、930％、940％、950％、960％、970％、980％、990％、1000％表明所述受试者患有低级别癌症(例如，I级别)。
在一些实施例中，与所述对照样品中的所述水平相比，所述受试者样品中的所述至少一种神经节苷脂的水平增加至少、约或不超过10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、240％、250％、260％、270％、280％、290％、300％、310％、320％、330％、340％、350％、360％、370％、380％、390％、400％、410％、420％、430％、440％、450％、460％、470％、480％、490％、500％、510％、520％、530％、540％、550％、560％、570％、580％、590％、600％、610％、620％、630％、640％、650％、660％、670％、680％、690％、700％、710％、720％、730％、740％、750％、760％、770％、780％、790％、800％、810％、820％、830％、840％、850％、860％、870％、880％、890％、900％、910％、920％、930％、940％、950％、960％、970％、980％、990％、1000％表明所述受试者患有高级别癌症(例如，II、III或IV级别)。
在一些实施例中，与所述对照样品中的所述水平相比，所述受试者样品中的所述至少一种神经节苷脂的所述水平增加至少100％且不超过200％表明所述受试者患有低级别癌症(例如，I级别)。在一些实施例中，与所述对照样品中的所述水平相比，所述受试者样品中的所述至少一种神经节苷脂的所述水平增加至少200％表明所述受试者患有高级别癌症(例如，II、III或IV级别)。
在某些方面，本文提供了一种确定癌症的肿瘤负荷的方法，所述方法包括：a)确定受试者样品中的至少一种神经节苷脂的水平；以及b)将所述至少一种神经节苷脂的所述水平与对照样品中的所述至少一种神经节苷脂的水平进行比较，其中与所述对照样品中的所述水平相比，所述受试者样品中的所述至少一种神经节苷脂的水平增加至少、约或不超过10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、240％、250％、260％、270％、280％、290％、300％、310％、320％、330％、340％、350％、360％、370％、380％、390％、400％、410％、420％、430％、440％、450％、460％、470％、480％、490％、500％、510％、520％、530％、540％、550％、560％、570％、580％、590％、600％、610％、620％、630％、640％、650％、660％、670％、680％、690％、700％、710％、720％、730％、740％、750％、760％、770％、780％、790％、800％、810％、820％、830％、840％、850％、860％、870％、880％、890％、900％、910％、920％、930％、940％、950％、960％、970％、980％、990％、1000％表明所述受试者具有低肿瘤负荷；和/或其中与所述对照样品中的所述水平相比，所述受试者样品中的所述至少一种神经节苷脂的水平增加至少、约或不超过10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、240％、250％、260％、270％、280％、290％、300％、310％、320％、330％、340％、350％、360％、370％、380％、390％、400％、410％、420％、430％、440％、450％、460％、470％、480％、490％、500％、510％、520％、530％、540％、550％、560％、570％、580％、590％、600％、610％、620％、630％、640％、650％、660％、670％、680％、690％、700％、710％、720％、730％、740％、750％、760％、770％、780％、790％、800％、810％、820％、830％、840％、850％、860％、870％、880％、890％、900％、910％、920％、930％、940％、950％、960％、970％、980％、990％、1000％表明所述受试者具有高肿瘤负荷。
在一些实施例中，与所述对照样品中的所述水平相比，所述受试者样品中的所述至少一种神经节苷脂的所述水平增加至少100％且不超过200％表明所述受试者具有低肿瘤负荷。在一些实施例中，与所述对照样品中的所述水平相比，所述受试者样品中的所述至少一种神经节苷脂的所述水平增加至少200％表明所述受试者具有高肿瘤负荷。
在某些方面，本文提供了一种检测受试者的癌症复发的方法，所述方法包括：a)从接受癌症治疗后癌症消退的所述受试者获得或提供样品；b)确定所述受试者样品中的至少一种神经节苷脂的水平；以及c)将所述至少一种神经节苷脂的所述水平与对照样品中的所述至少一种神经节苷脂的水平进行比较，其中与所述对照样品中的所述水平相比，所述受试者样品中的所述至少一种神经节苷脂的显著更高的水平表明所述受试者的癌症复发。
在某些方面，本文提供了一种检测受试者的微小残留病灶的方法，所述方法包括：a)从处于缓解期的所述受试者获得或提供样品；b)确定所述受试者样品中的至少一种神经节苷脂的水平；以及c)将所述至少一种神经节苷脂的所述水平与对照样品中的所述至少一种神经节苷脂的水平进行比较，其中与所述对照样品中的所述水平相比，所述受试者样品中的所述至少一种神经节苷脂的显著更高的水平表明所述受试者患有微小残留病灶。
在某些方面，本文提供了一种根据癌症疗法(例如，免疫疗法)的益处对患有癌症的受试者进行分层的方法，所述方法包括：a)确定受试者样品中的至少一种神经节苷脂的水平；b)确定对照中的所述至少一种神经节苷脂的水平；以及c)比较在步骤a)和b)中检测到的所述至少一种神经节苷脂的所述水平，其中与所述对照中的所述水平相比，所述受试者样品中的所述至少一种神经节苷脂的所述水平无显著变化或降低表明患有所述癌症的所述受试者将从所述癌症疗法中受益。
在某些方面，本文提供了一种确定患有癌症的受试者是否可能对癌症疗法(例如，免疫疗法)做出应答或可替代地可能不对所述癌症疗法做出应答的方法，所述方法包括：a)确定受试者样品中的至少一种神经节苷脂的水平；b)确定对照中的所述至少一种神经节苷脂的水平；以及c)比较在步骤a)和b)中检测到的所述至少一种神经节苷脂的所述水平，其中与所述对照中的所述水平相比，所述受试者样品中的所述至少一种神经节苷脂的显著更高的水平表明患有所述癌症的所述受试者将不对所述癌症疗法做出应答；和/或其中与所述对照中的所述水平相比，所述受试者样品中的所述至少一种神经节苷脂的所述水平无显著变化或降低表明患有所述癌症的所述受试者将对所述癌症疗法做出应答。
在某些方面，本文提供了一种用于预测患有癌症的受试者的临床结果的方法，所述方法包括：a)确定受试者样品中的至少一种神经节苷脂的水平；b)确定对照中的所述至少一种神经节苷脂的水平；以及c)比较在步骤a)和b)中确定的所述至少一种神经节苷脂的所述水平，其中与所述对照中的所述水平相比，所述受试者样品中的所述至少一种神经节苷脂的显著更高的水平表明所述受试者具有不良的临床结果。
在某些方面，本文提供了一种监测受试者的癌症的进展的方法，所述方法包括：a)在第一时间点检测受试者样品中的至少一种神经节苷脂的水平；b)在后续时间点重复步骤a)；以及c)比较在步骤a)和b)中检测到的所述至少一种神经节苷脂的所述水平以监测所述受试者的所述癌症的所述进展。
在一些实施例中，所述方法监测在第一时间点与后续时间点之间接受过癌症疗法的受试者的癌症进展。在一些实施例中，所述受试者有风险患上癌症。
在某些方面，本文提供了一种评估受试者的癌症疗法的功效的方法，所述方法包括：a)在从受试者获得的第一样品中，确定至少一种神经节苷脂的水平；b)在施用所述癌症疗法后的至少一个后续时间点期间重复步骤a)；以及c)比较在步骤a)和b)中检测到的至少一种神经节苷脂的所述水平，其中相对于所述第一样品，至少一个后续样品中的所述至少一种神经节苷脂的显著更低的水平表明所述疗法可有效治疗所述受试者的癌症。
在一些实施例中，所述第一样品和/或所述至少一个后续样品是从所述受试者获得的单个样品或合并样品的一部分。
在一些实施例中，所述癌症疗法是外科手术、化学疗法、癌症疫苗、嵌合抗原受体、放射疗法、免疫疗法、免疫检查点抑制蛋白或配体的表达调节剂或其任何组合。在一些实施例中，免疫疗法是免疫检查点抑制疗法。在一些实施例中，癌症疗法是阿维鲁单抗(avelumab)、德瓦鲁单抗(durvalumab)、阿特朱单抗(atezolizumab)、BRAF/MEK抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、派姆单抗(pembrolizumab)、纳武单抗(nivolumab)、伊匹单抗(ipilimumab)或其组合。
进一步提供了许多实施例，所述实施例可以应用于本文所描述的本发明的任何方面。
例如，本文所描述的诊断和预后方法可以使用本领域已知的任何方法来检测和确定至少一种神经节苷脂的水平。在一些实施例中，至少一种神经节苷脂被检测到并且其水平由至少一种单克隆抗体或其抗原结合片段确定。在优选的实施例中，所述至少一种神经节苷脂被检测到并且其水平通过本文所描述的至少一种单克隆抗体或其抗原结合片段使用本文所描述的示例性方法中的任何一种示例性方法或本领域已知的方法(例如，ELISA、夹心ELISA、竞争性ELISA)确定。
在又其它优选的实施例中，所述至少一种神经节苷脂被检测到并且其水平通过质谱法(例如，LC/MS、LC/MS/MS或本领域已知的任何其它质谱法方法)确定。
在一些实施例中，所述至少一种神经节苷脂的至少、约或不超过10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、240％、250％、260％、270％、280％、290％、300％、310％、320％、330％、340％、350％、360％、370％、380％、390％、400％、410％、420％、430％、440％、450％、460％、470％、480％、490％、500％、510％、520％、530％、540％、550％、560％、570％、580％、590％、600％、610％、620％、630％、640％、650％、660％、670％、680％、690％、700％、710％、720％、730％、740％、750％、760％、770％、780％、790％、800％、810％、820％、830％、840％、850％、860％、870％、880％、890％、900％、910％、920％、930％、940％、950％、960％、970％、980％、990％、1000％的更高的水平表明显著更高的水平。
在一些实施例中，所述至少一种神经节苷脂的至少、约或不超过10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、240％、250％、260％、270％、280％、290％、300％、310％、320％、330％、340％、350％、360％、370％、380％、390％、400％、410％、420％、430％、440％、450％、460％、470％、480％、490％、500％、510％、520％、530％、540％、550％、560％、570％、580％、590％、600％、610％、620％、630％、640％、650％、660％、670％、680％、690％、700％、710％、720％、730％、740％、750％、760％、770％、780％、790％、800％、810％、820％、830％、840％、850％、860％、870％、880％、890％、900％、910％、920％、930％、940％、950％、960％、970％、980％、990％、1000％的更低的水平表明显著更低的水平。
在一些实施例中，至少一种神经节苷脂的水平增加或减少至少、约或不超过10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、240％、250％、260％、270％、280％、290％、300％、310％、320％、330％、340％、350％、360％、370％、380％、390％、400％、410％、420％、430％、440％、450％、460％、470％、480％、490％、500％、510％、520％、530％、540％、550％、560％、570％、580％、590％、600％、610％、620％、630％、640％、650％、660％、670％、680％、690％、700％、710％、720％、730％、740％、750％、760％、770％、780％、790％、800％、810％、820％、830％、840％、850％、860％、870％、880％、890％、900％、910％、920％、930％、940％、950％、960％、970％、980％、990％、1000％表明所述至少一种神经节苷脂的所述水平无显著变化。
本文进一步提供了使用至少一种神经节苷脂的脂质长度的异质性或同质性(例如，如使用质谱法所确定的)的诊断和预后方法。在一些实施例中，与所述对照样品相比，所述受试者样品中的所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度的异质性的显著变化表明所述受试者患有癌症。类似地，在一些实施例中，与所述对照样品相比，所述受试者样品中的所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度的异质性的显著变化将所述受试者鉴定为患有癌症。
在某些方面，本文提供了一种确定癌症分期的方法，所述方法包括：a)使用质谱法确定受试者样品中的至少一种神经节苷脂的脂质长度；以及b)将所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度与对照样品中的所述至少一种神经节苷脂的脂质长度进行比较，其中与所述对照样品中的所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度的异质性相比，所述受试者样品中的所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度的异质性的至少、约或不超过10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、240％、250％、260％、270％、280％、290％、300％、310％、320％、330％、340％、350％、360％、370％、380％、390％、400％、410％、420％、430％、440％、450％、460％、470％、480％、490％、500％、510％、520％、530％、540％、550％、560％、570％、580％、590％、600％、610％、620％、630％、640％、650％、660％、670％、680％、690％、700％、710％、720％、730％、740％、750％、760％、770％、780％、790％、800％、810％、820％、830％、840％、850％、860％、870％、880％、890％、900％、910％、920％、930％、940％、950％、960％、970％、980％、990％、1000％的变化表明所述受试者患有早期癌症；和/或与所述对照样品中的所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度的异质性相比，所述受试者样品中的所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度的异质性的至少、约或不超过10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、240％、250％、260％、270％、280％、290％、300％、310％、320％、330％、340％、350％、360％、370％、380％、390％、400％、410％、420％、430％、440％、450％、460％、470％、480％、490％、500％、510％、520％、530％、540％、550％、560％、570％、580％、590％、600％、610％、620％、630％、640％、650％、660％、670％、680％、690％、700％、710％、720％、730％、740％、750％、760％、770％、780％、790％、800％、810％、820％、830％、840％、850％、860％、870％、880％、890％、900％、910％、920％、930％、940％、950％、960％、970％、980％、990％、1000％的变化表明所述受试者患有后期癌症。
在一些实施例中，与所述对照样品中的所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度的异质性相比，所述受试者样品中的所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度的异质性的至少100％且不超过200％的变化(例如，增加或减少)表明所述受试者患有早期癌症。在一些实施例中，与所述对照样品中的所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度的异质性相比，所述受试者样品中的所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度的异质性的至少200％的变化(例如，增加或减少)表明所述受试者患有后期癌症。
在一些实施例中，(a)具有短脂质长度的神经节苷脂水平相对于具有长脂质长度的神经节苷脂水平；或(b)具有长脂质长度的神经节苷脂水平相对于具有短脂质长度的神经节苷脂水平增加或减少至少、约或不超过10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、240％、250％、260％、270％、280％、290％、300％、310％、320％、330％、340％、350％、360％、370％、380％、390％、400％、410％、420％、430％、440％、450％、460％、470％、480％、490％、500％、510％、520％、530％、540％、550％、560％、570％、580％、590％、600％、610％、620％、630％、640％、650％、660％、670％、680％、690％、700％、710％、720％、730％、740％、750％、760％、770％、780％、790％、800％、810％、820％、830％、840％、850％、860％、870％、880％、890％、900％、910％、920％、930％、940％、950％、960％、970％、980％、990％、1000％表明所述受试者患有早期或后期癌症。
在某些方面，本文提供了一种确定癌症级别的方法，所述方法包括：a)使用质谱法确定受试者样品中的至少一种神经节苷脂的脂质长度；以及b)将所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度与对照样品中的所述至少一种神经节苷脂的脂质长度进行比较，其中与所述对照样品中的所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度的异质性相比，所述受试者样品中的所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度的异质性的至少、约或不超过10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、240％、250％、260％、270％、280％、290％、300％、310％、320％、330％、340％、350％、360％、370％、380％、390％、400％、410％、420％、430％、440％、450％、460％、470％、480％、490％、500％、510％、520％、530％、540％、550％、560％、570％、580％、590％、600％、610％、620％、630％、640％、650％、660％、670％、680％、690％、700％、710％、720％、730％、740％、750％、760％、770％、780％、790％、800％、810％、820％、830％、840％、850％、860％、870％、880％、890％、900％、910％、920％、930％、940％、950％、960％、970％、980％、990％、1000％的变化(例如，增加或减少)表明所述受试者患有I级别、II级别、III级别或IV级别癌症。
在一些实施例中，与所述对照样品中的所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度的异质性相比，所述受试者样品中的所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度的异质性的至少、约或不超过10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、240％、250％、260％、270％、280％、290％、300％、310％、320％、330％、340％、350％、360％、370％、380％、390％、400％、410％、420％、430％、440％、450％、460％、470％、480％、490％、500％、510％、520％、530％、540％、550％、560％、570％、580％、590％、600％、610％、620％、630％、640％、650％、660％、670％、680％、690％、700％、710％、720％、730％、740％、750％、760％、770％、780％、790％、800％、810％、820％、830％、840％、850％、860％、870％、880％、890％、900％、910％、920％、930％、940％、950％、960％、970％、980％、990％、1000％的变化(例如，增加或减少)表明所述受试者患有低级别癌症或高级别癌症。
在一些实施例中，与所述对照样品中的所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度的异质性相比，所述受试者样品中的所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度的异质性的至少100％且不超过200％的变化(例如，增加或减少)表明所述受试者患有低级别癌症。在一些实施例中，与所述对照样品中的所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度的异质性相比，所述受试者样品中的所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度的异质性的至少200％的变化(例如，增加或减少)表明所述受试者患有高级别癌症。
在一些实施例中，(a)具有短脂质长度的神经节苷脂水平相对于具有长脂质长度的神经节苷脂水平；或(b)具有长脂质长度的神经节苷脂水平相对于具有短脂质长度的神经节苷脂水平增加或减少至少、约或不超过10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、240％、250％、260％、270％、280％、290％、300％、310％、320％、330％、340％、350％、360％、370％、380％、390％、400％、410％、420％、430％、440％、450％、460％、470％、480％、490％、500％、510％、520％、530％、540％、550％、560％、570％、580％、590％、600％、610％、620％、630％、640％、650％、660％、670％、680％、690％、700％、710％、720％、730％、740％、750％、760％、770％、780％、790％、800％、810％、820％、830％、840％、850％、860％、870％、880％、890％、900％、910％、920％、930％、940％、950％、960％、970％、980％、990％、1000％表明所述受试者患有低级别或高级别癌症。
在某些方面，本文提供了一种确定癌症肿瘤负荷的方法，所述方法包括：a)使用质谱法确定受试者样品中的至少一种神经节苷脂的脂质长度；以及b)将所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度与对照样品中的所述至少一种神经节苷脂的脂质长度进行比较，其中与所述对照样品中的所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度的异质性相比，所述受试者样品中的所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度的异质性的至少、约或不超过10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、240％、250％、260％、270％、280％、290％、300％、310％、320％、330％、340％、350％、360％、370％、380％、390％、400％、410％、420％、430％、440％、450％、460％、470％、480％、490％、500％、510％、520％、530％、540％、550％、560％、570％、580％、590％、600％、610％、620％、630％、640％、650％、660％、670％、680％、690％、700％、710％、720％、730％、740％、750％、760％、770％、780％、790％、800％、810％、820％、830％、840％、850％、860％、870％、880％、890％、900％、910％、920％、930％、940％、950％、960％、970％、980％、990％、1000％的变化表明所述受试者具有低肿瘤负荷；和/或与所述对照样品中的所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度的异质性相比，所述受试者样品中的所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度的异质性的至少、约或不超过10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、240％、250％、260％、270％、280％、290％、300％、310％、320％、330％、340％、350％、360％、370％、380％、390％、400％、410％、420％、430％、440％、450％、460％、470％、480％、490％、500％、510％、520％、530％、540％、550％、560％、570％、580％、590％、600％、610％、620％、630％、640％、650％、660％、670％、680％、690％、700％、710％、720％、730％、740％、750％、760％、770％、780％、790％、800％、810％、820％、830％、840％、850％、860％、870％、880％、890％、900％、910％、920％、930％、940％、950％、960％、970％、980％、990％、1000％的变化表明所述受试者具有高肿瘤负荷。
在一些实施例中，与所述对照样品中的所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度的异质性相比，所述受试者样品中的所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度的异质性的至少100％且不超过200％的变化(例如，增加或减少)表明所述受试者具有低肿瘤负荷。在一些实施例中，与所述对照样品中的所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度的异质性相比，所述受试者样品中的所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度的异质性的至少200％的变化(例如，增加或减少)表明所述受试者具有高肿瘤负荷。
在一些实施例中，(a)具有短脂质长度的神经节苷脂水平相对于具有长脂质长度的神经节苷脂水平；或(b)具有长脂质长度的神经节苷脂水平相对于具有短脂质长度的神经节苷脂水平增加或减少至少、约或不超过10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、240％、250％、260％、270％、280％、290％、300％、310％、320％、330％、340％、350％、360％、370％、380％、390％、400％、410％、420％、430％、440％、450％、460％、470％、480％、490％、500％、510％、520％、530％、540％、550％、560％、570％、580％、590％、600％、610％、620％、630％、640％、650％、660％、670％、680％、690％、700％、710％、720％、730％、740％、750％、760％、770％、780％、790％、800％、810％、820％、830％、840％、850％、860％、870％、880％、890％、900％、910％、920％、930％、940％、950％、960％、970％、980％、990％、1000％表明所述受试者具有低肿瘤负荷或高肿瘤负荷。
在某些方面，提供了一种检测受试者的癌症复发的方法，所述方法包括：a)从接受癌症治疗后癌症消退的所述受试者获得或提供样品；b)使用质谱法确定受试者样品中的至少一种神经节苷脂的脂质长度；以及c)将所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度与对照样品中的所述至少一种神经节苷脂的脂质长度进行比较，其中与所述对照样品中的所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度的异质性相比，所述受试者样品中的所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度的异质性的显著变化表明所述受试者的癌症复发。
在某些方面，本文提供了一种检测受试者的微小残留病灶的方法，所述方法包括：a)从处于缓解期的所述受试者获得或提供样品；b)使用质谱法确定受试者样品中的至少一种神经节苷脂的脂质长度；以及c)将所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度与对照样品中的所述至少一种神经节苷脂的脂质长度进行比较，其中与所述对照样品中的所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度的异质性相比，所述受试者样品中的所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度的异质性的显著变化表明所述受试者患有微小残留病灶。
在某些方面，本文提供了一种根据癌症疗法(例如，免疫疗法)的益处对患有癌症的受试者进行分层的方法，所述方法包括：a)使用质谱法确定受试者样品中的至少一种神经节苷脂的脂质长度；b)确定对照中的所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度；以及c)比较在步骤a)和b)中检测到的所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度，其中与所述对照中的所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度的异质性相比，所述受试者样品中的所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度的异质性的无显著变化表明患有所述癌症的所述受试者将从所述癌症疗法中受益。
在某些方面，本文提供了一种确定患有癌症的受试者是否可能对癌症疗法做出应答的方法，所述方法包括：
a)使用质谱法确定受试者样品中的至少一种神经节苷脂的脂质长度；b)确定对照中的所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度；以及c)比较在步骤a)和b)中检测到的所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度，
其中与所述对照中的所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度的异质性相比，所述受试者样品中的所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度的异质性的显著变化表明患有所述癌症的所述受试者将不对所述癌症疗法做出应答；和/或其中与所述对照中的所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度的异质性相比，所述受试者样品中的所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度的异质性无显著变化表明患有所述癌症的所述受试者将对所述癌症疗法做出应答。
在某些方面，本文提供了一种用于预测患有癌症的受试者的临床结果的方法，所述方法包括：a)使用质谱法确定受试者样品中的至少一种神经节苷脂的脂质长度；b)确定对照中的所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度；以及c)比较在步骤a)和b)中确定的所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度，其中与所述对照样品相比，所述受试者样品中的所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度的异质性的显著变化表明所述受试者具有不良的临床结果。
在某些方面，本文提供了一种监测受试者的癌症的进展的方法，所述方法包括：a)使用质谱法在第一时间点检测受试者样品中的至少一种神经节苷脂的脂质长度；b)在后续时间点重复步骤a)；以及c)比较在步骤a)和b)中检测到的所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度的异质性以监测所述受试者的所述癌症的所述进展，任选地其中所述受试者有风险患上癌症。
在一些实施例中，在所述第一时间点与所述后续时间点之间，所述受试者已经接受癌症疗法。
在某些方面，本文提供了一种评估受试者的癌症疗法的功效的方法，所述方法包括：a)在从受试者获得的第一样品中，使用质谱法确定至少一种神经节苷脂的脂质长度；b)在施用所述癌症疗法后的至少一个后续时间点期间重复步骤a)；以及c)比较在步骤a)和b)中检测到的至少一种神经节苷脂的所述水平，其中相对于所述第一样品，第二样品中的所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度的异质性的显著变化表明所述疗法可有效治疗所述受试者的癌症。
在一些实施例中，所述第一样品和/或所述至少一个后续样品是从所述受试者获得的单个样品或合并样品的一部分。
本文所描述的诊断和预后方法可以使用本领域已知的任何方法来检测和确定所述至少一种神经节苷脂的脂质长度的异质性。在优选的实施例中，所述至少一种神经节苷脂的脂质长度的异质性通过质谱法(例如，LC/MS、LC/MS/MS或本领域已知的任何其它质谱法方法)确定。
在一些实施例中，所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度的异质性或均质性的至少、约或不超过10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、240％、250％、260％、270％、280％、290％、300％、310％、320％、330％、340％、350％、360％、370％、380％、390％、400％、410％、420％、430％、440％、450％、460％、470％、480％、490％、500％、510％、520％、530％、540％、550％、560％、570％、580％、590％、600％、610％、620％、630％、640％、650％、660％、670％、680％、690％、700％、710％、720％、730％、740％、750％、760％、770％、780％、790％、800％、810％、820％、830％、840％、850％、860％、870％、880％、890％、900％、910％、920％、930％、940％、950％、960％、970％、980％、990％、1000％的变化表明异质性或同质性的显著变化。
在一些实施例中，(a)具有短脂质长度的神经节苷脂水平相对于具有长脂质长度的神经节苷脂水平；或(b)具有长脂质长度的神经节苷脂水平相对于具有短脂质长度的神经节苷脂水平增加或减少至少、约或不超过10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、240％、250％、260％、270％、280％、290％、300％、310％、320％、330％、340％、350％、360％、370％、380％、390％、400％、410％、420％、430％、440％、450％、460％、470％、480％、490％、500％、510％、520％、530％、540％、550％、560％、570％、580％、590％、600％、610％、620％、630％、640％、650％、660％、670％、680％、690％、700％、710％、720％、730％、740％、750％、760％、770％、780％、790％、800％、810％、820％、830％、840％、850％、860％、870％、880％、890％、900％、910％、920％、930％、940％、950％、960％、970％、980％、990％、1000％表明脂质长度的异质性或均质性的显著变化。
在一些实施例中，所述至少一种神经节苷脂的脂质长度的异质性或均质性的至少、约或不超过10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、240％、250％、260％、270％、280％、290％、300％、310％、320％、330％、340％、350％、360％、370％、380％、390％、400％、410％、420％、430％、440％、450％、460％、470％、480％、490％、500％、510％、520％、530％、540％、550％、560％、570％、580％、590％、600％、610％、620％、630％、640％、650％、660％、670％、680％、690％、700％、710％、720％、730％、740％、750％、760％、770％、780％、790％、800％、810％、820％、830％、840％、850％、860％、870％、880％、890％、900％、910％、920％、930％、940％、950％、960％、970％、980％、990％、1000％的变化表明异质性或同质性无显著变化。
在一些实施例中，(a)具有短脂质长度的神经节苷脂水平相对于具有长脂质长度的神经节苷脂水平；或(b)具有长脂质长度的神经节苷脂水平相对于具有短脂质长度的神经节苷脂水平增加或减少至少、约或不超过10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、240％、250％、260％、270％、280％、290％、300％、310％、320％、330％、340％、350％、360％、370％、380％、390％、400％、410％、420％、430％、440％、450％、460％、470％、480％、490％、500％、510％、520％、530％、540％、550％、560％、570％、580％、590％、600％、610％、620％、630％、640％、650％、660％、670％、680％、690％、700％、710％、720％、730％、740％、750％、760％、770％、780％、790％、800％、810％、820％、830％、840％、850％、860％、870％、880％、890％、900％、910％、920％、930％、940％、950％、960％、970％、980％、990％、1000％表明脂质长度的异质性或同质性无显著变化。
进一步提供了许多实施例，所述实施例可以应用于本文所描述的本发明的任何方面。例如，在一些实施例中，所述癌症疗法是外科手术、化学疗法、癌症疫苗、嵌合抗原受体、放射疗法、免疫疗法、免疫检查点抑制蛋白或配体的表达调节剂或其任何组合。在一些实施例中，免疫疗法是免疫检查点抑制疗法。在一些实施例中，癌症疗法是阿维鲁单抗、德瓦鲁单抗、阿特朱单抗、BRAF/MEK抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、派姆单抗、纳武单抗、伊匹单抗或其组合。
在一些实施例中，神经节苷脂是与肿瘤相关的神经节苷脂。在一些实施例中，所述肿瘤相关的神经节苷脂选自GD2、GD3、GD1b、GT1b、岩藻糖基-GM1、GloboH、聚唾液酸(PSA)、GM2、GM3、唾液酰-路易斯X、唾液酰-路易斯Y、唾液酰-路易斯A、唾液酰-路易斯B、路易斯Y、或其任何部分；任选地其中所述肿瘤相关的神经节苷脂选自GD1、GD2、GD3、GT1b和GM2。
在一些实施例中，所述癌症选自由以下组成的组：神经母细胞瘤、淋巴瘤、白血病、黑色素瘤、神经胶质瘤、小细胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌、软组织肉瘤、骨肉瘤、尤文氏肉瘤(Ewing′s sarcoma)、促结缔组织增生性圆细胞肿瘤、横纹肌肉瘤、视网膜母细胞瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌、威尔姆斯肿瘤(Wilms tumor)、前列腺癌、胃癌、子宫内膜癌、胰腺癌和结肠癌。
在一些实施例中，所述癌症选自由以下组成的组：神经母细胞瘤、淋巴瘤、白血病、黑色素瘤、神经胶质瘤、小细胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌、软组织肉瘤、骨肉瘤、尤文氏肉瘤、促结缔组织增生性圆细胞肿瘤、横纹肌肉瘤、视网膜母细胞瘤。
在一些实施例中，所述样品包括从所述受试者获得的细胞、血清、血液、瘤周组织和/或瘤内组织(例如，活检)。在优选的实施例中，样品包括液体活检(包括液体)。
在一些实施例中，至少一种神经节苷脂的显著更高的水平包括所述至少一种神经节苷脂的所述水平的至少百分之二十增加。
在一些实施例中，至少一种神经节苷脂的所述显著更低的水平包括所述至少一种神经节苷脂的所述水平的至少百分之二十减少。
在优选的实施例中，至少一种神经节苷脂的显著更高或更低水平是比对照(例如，非癌性样品)水平高或低至少或约50％的水平。在其它实施例中，至少一种神经节苷脂的显著更高或更低水平是比纵向研究中的受试者先前读数水平高或低至少或约25％的水平。在一些实施例中，至少一种神经节苷脂的脂质长度的异质性的显著变化包括受试者样品相对于对照样品的至少百分之二十的变化(例如，增加或减少)。
在一些实施例中，对照样品是来自无癌症受试者的样品。
在一些实施例中，本文所描述的诊断和/或预后方法进一步包括向受试者推荐、开处方和/或施用癌症疗法(例如，免疫检查点抑制疗法)。
在一些实施例中，受试者是哺乳动物。神经节苷脂的碳水化合物部分(例如GD2)在所有哺乳动物中都是高度保守的(即相同的)，因此可以用于诊断所有哺乳动物(例如人类、宠物、家畜)的癌症。
在一些实施例中，受试者是癌症的动物模型或人类。
在优选的实施例中，所述受试者是人类。
临床试验期间的效果监测
监测药剂(如化合物、药物或小分子)对神经节苷脂水平的影响不仅可以应用于基础药物筛选，还可以应用于临床试验。例如，可以在受试者的临床试验中监测通过本文所描述的筛选测定确定的药剂降低神经节苷脂水平的有效性，可通过本文所描述的抗神经节苷脂抗体或片段或通过基于质谱的方法检测。在此类临床试验中，神经节苷脂的水平和/或癌症的症状或其它标志物可以用作特定细胞、组织或系统表型的“读数”或标志物。
在优选的实施例中，本公开提供了一种用于监测用药剂(例如，激动剂、拮抗剂、拟肽、多肽、肽、核酸、小分子、免疫疗法、免疫检查点抑制疗法或其它候选药物)治疗受试者的有效性的方法，所述方法包括以下步骤：(i)在药剂施用前从受试者获得施用前样品；(ii)检测施用前样品中的至少一种神经节苷脂的水平；(iii)从受试者获得一种或多种施用后样品；(iv)检测施用后样品中的至少一种神经节苷脂的水平；(v)比较施用前样品中的至少一种神经节苷脂的水平与一种施用后样品或多种施用后样品中的至少一种神经节苷脂的水平；以及(vi)相应地改变对受试者的药剂的施用。例如，可能期望增加药剂的施用以将神经节苷脂的水平降低至低于检测到的水平，即增加药剂的有效性。根据此类实施例，神经节苷脂可以用作药剂有效性的指标，即使在没有可观察到的表型应答的情况下。类似地，如通过免疫组织化学(IHC)或通过基于质谱的方法等的神经节苷脂分析也可以用于选择将接受癌症疗法(例如免疫疗法、免疫检查点抑制疗法)的患者。
样品
可以从受试者的多种来源收集生物样品，所述生物样品包括体液样品、细胞样品或组织样品。体液是指从身体排泄或分泌的流体以及通常不排泄或分泌的流体(例如羊水、房水、胆汁、血液和血浆、脑脊液、耵聍和耳垢、考珀氏液(cowper′s fluid)或射精前液、乳糜、食糜、粪便、女性射精、间质液、细胞内液、淋巴液、月经、母乳、黏液、胸膜液、脓汁、唾液、皮脂、精液、血清、汗液、滑液、眼泪、尿液、阴道润滑液、玻璃体液、呕吐物)。在一些实施例中，受试者和/或对照样品选自由以下组成的组：细胞、细胞系、全血、血清、血浆、口腔刮片、唾液、脑脊液和骨髓。在一些实施例中，样品可以含有活细胞/组织、新鲜冷冻细胞、新鲜组织、活检、固定细胞/组织、包埋在如石蜡等介质中的细胞/组织、组织学载玻片或其任何组合。
可以在纵向时间段内(例如，约数天、数周、数月、每年、每半年等一次或多次)重复地从个体收集样品。
样品制备和分离可以涉及所述程序中的任何程序，这取决于收集的样品类型和/或生物标志物测结果的分析。仅通过实例的方式，此类程序包括浓缩、稀释、调节pH、去除高丰度多肽(例如，白蛋白、γ球蛋白和转铁蛋白等)、添加防腐剂和校准物、添加蛋白酶抑制剂、添加变性剂、样品脱盐、浓缩样品蛋白质、脂质的提取和纯化。在一些实施例中，某些细胞类型是基于细胞表面上存在的至少一种标志物纯化的。
样品可以包括固定分子。如果分子与底物共价或非共价缔合，则分子被“固定”或“附着”到底物上，这样在没有大部分分子从底物解离的情况下，底物可以用流体(例如标准柠檬酸盐，pH 7.4)冲洗。
如本文所描述的，在一些实施例中，将来自受试者的样品中的至少一种神经节苷脂测量结果的水平与对照生物样品(例如，来自未患癌症的受试者的生物样品)、缓解期间或患上癌症之前来自受试者的对照生物样品、或在患上癌症的治疗期间来自受试者的对照生物样品进行比较。在一些实施例中，对照生物样品来自用某种疗法治疗之前的受试者。在一些实施例中，其中受试者用多轮的一种或多种疗法治疗，对照生物样品可以来自在此类治疗期间相对于受试者样品的更早或更晚的时间点。例如，可以将第三轮疗法后的受试者样品与第一轮疗法后的对照受试者样品进行比较。
在一些实施例中，将来自受试者的样品中的至少一种神经节苷脂测量结果的水平与预定的对照(标准)样品进行比较。来自受试者的样品通常来自如癌细胞或组织等患病组织。对照样品可以来自同一受试者或来自不同受试者。对照样品通常是正常的、未患病的样品。然而，在一些实施例中，如为了对疾病分期或为了对治疗功效进行评估，对照样品可以来自患病组织。对照样品可以是来自若干个不同受试者的样品的组合。在一些实施例中，将来自受试者的生物标志物量和/或活性测量结果与预定水平进行比较。此预定水平通常从正常样品中获得。
如本文所描述的，“预定”生物标志物量测量结果可以是生物标志物量测量结果，仅通过实例的方式，所述生物标志物量测量结果用于评估可能被选择用于治疗的受试者、评估对癌症疗法的应答，和/或评估对抗癌疗法组合的应答。可以在患有或不患有癌症的患者群体中测定预定的生物标志物量和/或活性测量结果。预定的生物标志物量测量结果可以是同样适于每个患者的单个数字，或者预定的生物标志物量测量结果可以根据患者的特定亚群而变化。受试者的年龄、体重、身高和其它因素可能会影响个体的预定的生物标志物量测量结果。此外，可以为每个受试者单独确定预定的生物标志物量。在一些实施例中，在本文所描述的方法中确定和/或比较的量基于绝对测量结果。
在一些实施例中，将来自受试者的样品中的至少一种神经节苷脂测量结果的存在或水平与没有检测神经节苷脂的药剂的样品进行比较。例如，如果抗体或其抗原结合片段用于检测受试者样品中的神经节苷脂的水平，则用于比较的对照样品可以是省略抗体或其抗原结合片段的同一受试者样品，即“背景信号”。此类背景信号控制用于本文提供的实验数据。
在一些实施例中，在本文所描述的方法中确定和/或比较的量基于相对测量结果，如比率(例如，治疗前与治疗后的生物标志物水平、此类生物标志物测量结果相对于加标或人造对照、此类生物标志物测量结果相对于管家基因的表达等)。例如，相对分析可以基于治疗前生物标志物测量结果与治疗后生物标志物测量结果比较的比率。治疗前生物标志物测量结果可以在开始抗癌疗法之前的任何时间进行。治疗后生物标志物测量结果可以在开始抗癌疗法之后的任何时间进行。在一些实施例中，治疗后生物标志物测量结果在开始抗癌疗法之后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20周或更长时间或用于持续监测的无期限地甚至更长时间进行。治疗可以包括一种或多种抗癌疗法例如，免疫检查点抑制剂。
预定的生物标志物量测量结果可以是任何合适的标准。例如，预定的生物标志物量测量结果可以从为其评估患者选择的相同或不同的人获得。在一些实施例中，预定的生物标志物量测量结果可以从同一患者的先前评估中获得。以此方式，可以随时间推移监测患者选择的进展。另外，如果受试者是人，则对照可以从对另外的一个人或多个人的评估获得，例如选定的一组人。以此方式，正在被评估选择的人的选择程度可以与合适的其它人进行比较，例如与所关注的人处于类似情况的其它人，如患有类似或相同病状和/或具有相同种族的那些人。
在本公开的一些实施例中，生物标志物量测量结果与预定水平的变化为约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5或5.0倍或更大或介于两者之间的任何范围、包括端值。当测量结果基于相对变化，如基于治疗前生物标志物测量结果与治疗后生物标志物测量结果的比率时，此类截止值同样适用。
癌症
癌症、肿瘤或过度增生性病症是指存在具有致癌细胞的典型特性的细胞，所述特性如增殖失控、永生性、转移潜能、快速生长和增殖速率以及某些特有的形态特征。癌细胞通常呈肿瘤的形式，但这种细胞可以单独存在于动物体内，也可以是非致瘤性癌细胞，如白血病细胞。癌症包括但不限于B细胞癌例如多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(macroglobulinemia)、重链疾病例如α链病、γ链病和μ链病、良性单克隆丙球蛋白病和免疫细胞淀粉样变性、黑色素瘤、乳腺癌、肺癌、支气管癌、结直肠癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌、脑或中枢神经系统癌、外周神经系统癌、食道癌、宫颈癌、子宫或子宫内膜癌、口腔或咽癌、肝癌、肾癌、睾丸癌、胆管癌、小肠或阑尾癌、唾液腺癌、甲状腺癌、肾上腺癌、骨肉瘤、软骨肉瘤、血液组织癌等。适用于本发明所涵盖的方法的癌症类型的其它非限制性实例包括人肉瘤和癌例如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺瘤、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、肝癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、维尔姆斯瘤、宫颈癌、骨癌、脑瘤、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌(SCLC)、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤；白血病例如，急性淋巴细胞白血病和急性髓细胞白血病(成髓细胞白血病、早幼粒细胞白血病、髓单核细胞白血病、单核细胞白血病和红白血病)；慢性白血病(慢性粒细胞(粒细胞)白血病和慢性淋巴细胞白血病)；以及真性红细胞增多症、淋巴瘤(霍奇金氏病(Hodgkin′s disease)和非霍奇金氏病(non-Hodgkin′sdisease))、多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom′s macroglobulinemia)和重链病。在一些实施例中，癌症本质上是上皮性的，并且包括但不限于膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、妇科癌症、肾癌、喉癌、肺癌、口腔癌、头颈癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌或皮肤癌。在其它实施例中，癌症是乳腺癌、前列腺癌、肺癌或结肠癌。在仍其它实施例中，上皮癌是非小细胞肺癌、非乳头状肾细胞癌、宫颈癌、卵巢癌(例如浆液性卵巢癌)或乳腺癌。可以以各种其它方式表征上皮癌，包括但不限于浆液性、子宫内膜样、粘液性、透明细胞、布伦纳(Brenner)或未分化。
本发明的组合物和方法可以用于检测卵巢癌、小细胞肺癌(SCLC)或黑色素瘤。
癌症疗法
本发明的治疗剂可以单独使用或可以与例如化学治疗剂、激素、抗血管生成剂、放射性标记的化合物或外科手术、冷冻疗法、免疫疗法、癌症疫苗、免疫细胞工程化(例如，CAR-T)和/或放射疗法组合施用。前述治疗方法可以与其它形式的常规疗法(例如，本领域技术人员熟知的癌症护理标准治疗)联合施用，与常规疗法相继施用、在其之前或之后施用。例如，本发明的药剂可以与治疗有效剂量的化学治疗剂一起施用。在其它实施例中，本发明的药剂与化学疗法联合施用以增强化学治疗剂的活性和功效。《医师案头参考(Physicians′Desk Reference，PDR)》公开了已用于治疗各种癌症的化学治疗剂的剂量。治疗有效的这些上述化学治疗药物的给药方案和剂量将取决于所治疗的特定癌症、疾病程度和本领域技术人员熟悉的其它因素，并且可以由医生确定。
免疫疗法是靶向疗法，所述靶向疗法可以包括例如使用癌症疫苗和/或致敏的抗原呈递细胞。例如，溶瘤病毒是能够感染和裂解癌细胞，同时使正常细胞不受伤害的病毒，这使得它们在癌症疗法中可能有用。溶瘤病毒的复制既促进了肿瘤细胞破坏，并且还在肿瘤位点处产生了剂量放大。溶瘤病毒还可以作为抗癌基因的载体，使溶瘤病毒能够被特异性地递送到肿瘤位点。免疫疗法可以涉及用于短期保护宿主的被动免疫，通过施用针对癌症抗原或疾病抗原的预先形成的抗体来实现(例如，将任选地与化学治疗剂或毒素连接的单克隆抗体施用于肿瘤抗原)。例如，已知抗VEGF可有效治疗肾细胞癌。免疫疗法还可以专注于使用癌细胞系的细胞毒性淋巴细胞识别表位。可替代地，反义多核苷酸、核酶、RNA干扰分子、三螺旋多核苷酸等可以用于选择性调节与肿瘤或癌症的起始、进展和/或病理学相关的生物分子。
免疫疗法还涵盖免疫检查点调节剂。免疫检查点是CD4+和/或CD8+T细胞的细胞表面上的一组分子，它们通过下调或抑制抗肿瘤免疫应答来微调免疫应答。免疫检查点蛋白在本领域中是众所周知的并且包括但不限于CTLA-4、PD-1、VISTA、B7-H2、B7-H3、PD-L1、B7-H4、B7-H6、2B4、ICOS、HVEM、PD-L2、CD160、gp49B、PIR-B、KIR家族受体、TIM-1、TIM-3、TIM-4、LAG-3、BTLA、SIRPα(CD47)、CD48、2B4(CD244)、B7.1、B7.2、ILT-2、ILT-4、TIGIT、HHLA2、TMIDG2、KIR3DL3和A2aR(参见例如WO 2012/177624)。抑制一种或多种免疫检查点抑制剂可以阻断或以其它方式中和抑制性信号传导，从而上调免疫应答以便更有效地治疗癌症。在一些实施例中，癌症疫苗与一种或多种免疫检查点抑制剂(免疫检查点抑制疗法)如PD1、PD-L1和/或CD47抑制剂组合施用。
基于细胞的过继免疫疗法可以与本发明的疗法组合。众所周知的基于过继性细胞的免疫治疗形式包括但不限于辐射的自体或同种异体肿瘤细胞、肿瘤裂解物或凋亡肿瘤细胞、基于抗原呈递细胞的免疫疗法、基于树突细胞的免疫疗法、过继性T细胞转移、过继性CAR T细胞疗法、自体免疫增强疗法(AIET)、癌症疫苗和/或抗原呈递细胞。此类基于细胞的免疫疗法可以进一步被修饰成表达一种或多种基因产物以进一步调节免疫应答，如表达细胞因子如GM-CSF和/或表达肿瘤相关抗原(TAA)抗原，如Mage-1、gp-100等。
术语“嵌合抗原受体”或“CAR”是指具有期望抗原特异性的工程化T细胞受体(TCR)。T淋巴细胞通过T细胞受体(TCR)与主要组织相容性复合物(MHC)I类或II类分子呈递的短肽相互作用来识别特定抗原。对于初始激活和克隆扩增，初始T细胞依赖于提供另外共刺激信号的专职抗原呈递细胞(APC)。在不存在共刺激的情况下TCR激活可能导致无应答性和克隆无反应性。为了绕过免疫，已经开发了用于衍生具有移植识别特异性的细胞毒性效应细胞的不同方法。已经构建了由源自对TCR相关CD3复合物的细胞表面组分具有特异性的天然配体或抗体的结合结构域组成的CAR。在抗原结合后，此类嵌合抗原受体与效应细胞中的内源信号传导途径连接，并产生与由TCR复合物启动的激活信号类似的激活信号。自从首次报告关于嵌合抗原受体以来，这一概念已经稳步改进，并且嵌合受体的分子设计已经优化，并且常规使用任意数量的众所周知的结合结构域，如scFV和本文所描述的另一个蛋白质结合片段。
在其它实施例中，免疫疗法包括基于非细胞的免疫疗法。在一些实施例中，使用包括具有或不具有疫苗增强佐剂的抗原的组合物。此类组合物以许多众所周知的形式存在，如肽组合物、溶瘤病毒、包括融合蛋白的重组抗原等。在一些实施例中，使用免疫调节细胞因子，如干扰素、G-CSF、咪喹莫特(imiquimod)、TNFα等以及其调节剂(例如，阻断抗体或更有效或更持久的形式)。在一些实施例中，使用免疫调节白细胞介素，如IL-2、IL-6、IL-7、IL-12、IL-17、IL-23等以及其调节剂(例如，阻断抗体或更有效或更持久的形式)。在一些实施例中，使用免疫调节趋化因子，如CCL3、CCL26和CXCL7等以及其调节剂(例如，阻断抗体或更有效或更持久的形式)。在一些实施例中，使用靶向免疫抑制的免疫调节分子，如STAT3信号调节剂、NFκB信号调节剂和免疫检查点调节剂。
在仍其它实施例中，使用免疫调节药物，如免疫细胞抑制药物、糖皮质激素、细胞抑制剂、亲免素和其调节剂(例如，雷帕霉素(rapamycin)、神经钙调蛋白抑制剂、他克莫司(tacrolimus)、环孢素(ciclosporin)(环孢菌素(cyclosporin))、吡美莫司(pimecrolimus)、阿贝莫司(abetimus)、胍立莫司(gusperimus)、地磷莫司(ridaforolimus)、依维莫司(everolimus)、西罗莫司(temsirolimus)、唑他莫司(zotarolimus)等)、氢化可的松(hydrocortisone)(皮质醇(cortisol))、醋酸可的松(cortisone acetate)、泼尼松(prednisone)、泼尼松龙(prednisolone)、甲基强的松龙(methylprednisolone)、地塞米松(dexamethasone)、倍他米松(betamethasone)、曲安西龙(triamcinolone)、倍氯米松(beclometasone)、醋酸氟氢可的松(fludrocortisoneacetate)、醋酸脱氧皮质酮(deoxycorticosterone acetate，doca)、醛固酮(aldosterone)、非糖皮质激素、嘧啶合成抑制剂、来氟米特(leflunomide)、特立氟胺(teriflunomide)、类叶酸、甲氨蝶呤(methotrexate)、抗胸腺细胞球蛋白、抗淋巴细胞球蛋白、沙利度胺(thalidomide)、来那度胺(lenalidomide)、己酮可可碱(pentoxifylline)、安非他酮(bupropion)、姜黄素(curcumin)、儿茶素(catechin)、阿片(opioid)、IMPDH抑制剂、霉酚酸(mycophenolic acid)、多球壳菌素(myriocin)、芬戈莫德(fingolimod)、NF-xB抑制剂、雷洛昔芬(raloxifene)、替加色罗α(drotrecogin alfa)、狄诺塞麦(denosumab)、NF-xB信号传导级联抑制剂、双硫仑(disulfiram)、奥美沙坦(olmesartan)、二硫代氨基甲酸酯(dithiocarbamate)、蛋白酶体抑制剂、硼替佐米(bortezomib)、MG132、Prol、NPI-0052、姜黄素、染料木素(genistein)、白藜芦醇(resveratrol)、小白菊内酯(parthenolide)、沙利度胺、来那度胺、夫拉平度(flavopiridol)、非甾体抗炎药(NSAID)、三氧化二砷、脱羟甲基环氧喹霉素(DHMEQ)、I3C(吲哚-3-甲醇)/DIM(二吲哚甲烷)(13C/DIM)、Bay 11-7082、木犀草素、细胞渗透肽SN-50、IKBa.-超级阻遏物过度表达、NFKB诱杀寡脱氧核苷酸(ODN)或任何其衍生物或类似物。在又其它实施例中，使用免疫调节抗体或蛋白质。例如，与CD40、Toll样受体(TLR)、OX40、GITR、CD27或与4-1BB结合的抗体、T-细胞双特异性抗体、抗IL-2受体抗体、抗CD3抗体、OKT3(莫罗单抗(muromonab))、奥昔珠单抗(otelixizumab)、替利组单抗(teplizumab)、维西珠单抗(visilizumab)、抗CD4抗体、克立昔单抗(clenoliximab)、凯利昔单抗(keliximab)、扎诺米单(zanolimumab)、抗CD11抗体、依法珠单抗(efalizumab)、抗CD18抗体、厄立珠单抗(erlizumab)、罗维珠单抗(rovelizumab)、抗CD20抗体、阿夫珠单抗(afutuzumab)、奥瑞组单抗(ocrelizumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、帕昔单抗(pascolizumab)、利妥昔单抗(rituximab)、抗CD23抗体、鲁昔单抗(lumiliximab)、抗CD40抗体、替奈昔单抗(teneliximab)、托利珠单抗(toralizumab)、抗CD40L抗体、卢利珠单抗(ruplizumab)、抗CD62L抗体、阿塞珠单抗(aselizumab)、抗CD80抗体、加利昔单抗(galiximab)、抗CD147抗体、加维莫单抗(gavilimomab)、B-淋巴细胞刺激因子(BLyS)抑制抗体、贝利单抗(belimumab)、CTLA4-Ig融合蛋白、阿巴西普(abatacept)、贝拉西普(belatacept)、抗CTLA4抗体、易普利姆玛(ipilimumab)、曲美木单抗(tremelimumab)、抗嗜酸细胞活化趋化因子1抗体、柏替木单抗(bertilimumab)、抗a4-整合素抗体、那他珠单抗(natalizumab)、抗IL-6R抗体、托珠单抗(tocilizumab)、抗LFA-1抗体、奥度莫单抗(odulimomab)、抗CD25抗体、巴利昔单抗(basiliximab)、达克珠单抗(daclizumab)、伊诺莫单抗(inolimomab)、抗CD5抗体、阿佐莫单抗(zolimomab)、抗CD2抗体、西利珠单抗(siplizumab)、奈瑞莫单抗(nerelimomab)、法拉莫单抗(faralimomab)、阿特利单抗(atlizumab)、阿托木单抗(atorolimumab)、西利珠单抗(cedelizumab)、阿托度单抗(dorlimomab aritox)、得利西珠单抗(dorlixizumab)、芬特妥珠单抗(fontolizumab)、更汀芦单抗(gantenerumab)、戈利昔单抗(gomiliximab)、莱布利珠单抗(lebrilizumab)、马司莫单抗(maslimomab)、莫罗木单抗(morolimumab)、培克珠单抗(pexelizumab)、瑞利珠单抗(reslizumab)、罗维珠单抗(rovelizumab)、他利珠单抗(talizumab)、阿替莫单抗(telimomab aritox)、伐利昔单抗(vapaliximab)、维帕莫单抗(vepalimomab)、阿柏西普(aflibercept)、阿法赛特(alefacept)、利纳西普(rilonacept)、IL-1受体拮抗剂、阿那白滞素(anakinra)、抗IL-5抗体、美泊利单抗(mepolizumab)、IgE抑制剂、奥马珠单抗(omalizumab)、他利珠单抗(talizumab)、IL12抑制剂、IL23抑制剂、优特克单抗(ustekinumab)等。
增强免疫应答的营养补充剂，如维生素A、维生素E、维生素C等是本领域众所周知的(参见例如美国专利第4,981,844号和第5,230,902号以及PCT公开第WO 2004/004483号)可以用于本文所描述的方法中。
类似地，各种药剂或其组合可以用于治疗癌症。例如，化学疗法、放射、表观遗传修饰剂(例如，组蛋白脱乙酰酶(HDAC)修饰剂、甲基化修饰剂、磷酸化修饰剂等)、靶向疗法等在本领域中是众所周知的。
在一些实施例中，使用化学疗法。化学疗法包括施用化学治疗剂。此类化学治疗剂可以是但不限于选自以下化合物组的那些：铂化合物、细胞毒性抗生素、抗代谢物、抗有丝分裂剂、烷化剂、砷化合物、DNA拓扑异构酶抑制剂、紫杉烷、核苷类似物、植物生物碱和毒素；以及其合成衍生物。示例性化合物包括但不限于烷化剂：顺铂(cisplatin)、曲奥舒凡(treosulfan)和曲洛磷胺(trofosfamide)；植物生物碱：长春碱、紫杉醇(paclitaxel)、多西他赛(docetaxol)；DNA拓扑异构酶抑制剂：替尼泊苷(teniposide)、克立那托(crisnatol)和丝裂霉素；抗叶酸剂：甲氨蝶呤、霉酚酸和羟基脲；嘧啶类似物：5-氟尿嘧啶、去氧氟尿苷(doxifluridine)和阿糖胞苷；嘌呤类似物：巯嘌呤和硫鸟嘌呤；DNA抗代谢物：2′-脱氧-5-氟尿苷、甘氨酸阿非迪霉素(aphidicolin glycinate)和吡唑咪唑；以及抗有丝分裂剂：软海绵素(halichondrin)、秋水仙素(colchicine)和根霉素(rhizoxin)。还可以使用包括一种或多种化学治疗剂(例如，FLAG、CHOP)的组合物。FLAG包括氟达拉滨(fludarabine)、阿糖胞苷(Ara-C)和G-CSF。CHOP包括环磷酰胺、长春新碱(vincristine)、多柔比星(doxorubicin)和泼尼松。在另一个实施例中，使用PARP(例如，PARP-1和/或PARP-2)抑制剂并且此类抑制剂是本领域众所周知的(例如，Olaparib、ABT-888、BSI-201、BGP-15(N-基因研究实验室公司(N-Gene Research Laboratories,Inc.))；INO-1001(伊诺特克制药公司(Inotek Pharmaceuticals Inc.))；PJ34(Soriano等人,2001；Pacher等人,2002b)；3-氨基苯甲酰胺(Trevigen公司(Trevigen))；4-氨基-1,8-萘二甲酰亚胺(Trevigen公司)；6(5H)-菲啶酮(Trevigen公司)；苯甲酰胺(美国再版专利36,397)；以及NU1025(Bowman等人)。作用机制通常与PARP抑制剂与PARP结合并降低其活性的能力有关。PARP催化β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)转化为烟酰胺和聚-ADP-核糖(PAR)。聚(ADP-核糖)和PARP都与转录调控、细胞增殖、基因组稳定性和致癌作用有关(Bouchard V.J.等人《实验血液学(Experimental Hematology)》,第31卷,第6期,2003年6月,第446-454(9)页；Herceg Z.；Wang Z.-Q.《突变研究/诱变的基本和分子机制(Mutation Research/Fundamental andMolecular Mechanisms of Mutagenesis)》,第477卷,第1期,2001年6月2日,第97-110(14)页)。聚(ADP-核糖)聚合酶1(PARP1)是修复DNA单链断裂(SSB)的关键分子(de Murcia J.等人1997.《美国国家科学院院刊》94:7303-7307；Schreiber V、Dantzer F、Ame J C、deMurcia G(2006)《分子细胞生物学自然综述(Nat Rev Mol Cell Biol)》7:517-528；Wang ZQ等人(1997)《基因与发育(Genes Dev)》11:2347-2358)。通过抑制PARP1功能来敲除SSB修复诱导DNA双链断裂(DSB)，所述DNA双链断裂可以在具有缺陷的同源定向DSB修复的癌细胞中引发合成杀伤力(Bryant H E等人(2005)《自然》434:913-917；Farmer H等人(2005)《自然》434:917-921)。前述化学治疗剂的实例是说明性的，并且不旨在是限制性的。
在其它实施例中，使用放射疗法。放射疗法中使用的放射可以是电离放射。放射疗法还可以是γ射线、X射线或质子束。放射疗法的实例包括但不限于外束放射疗法、放射性同位素(I-125、钯、铱)的间质植入、如锶-89等放射性同位素、胸部放射疗法、腹膜内P-32放射疗法和/或全腹部和盆腔放射疗法。有关放射疗法的一般概述，参见Hellman,第16章:《癌症管理原则：放射疗法(Principles of Cancer Management:Radiation Therapy)》,第6版,2001,DeVita等人,编辑,宾夕法尼亚州的利平科特公司(J.B.Lippencott Company,Philadelphia)。放射疗法可以作为外部束放射或远距放射疗法来施用，其中放射是从远程源引导的。放射治疗还可以作为内部疗法或近距离放射治疗来施用，其中放射源被放置在身体内部靠近癌细胞或肿瘤块。还涵盖光动力疗法的使用，光动力疗法包括施用光敏剂，如血卟啉和其衍生物、维替泊芬(Vertoporfin)(BPD-MA)、酞菁、光敏剂Pc4、去甲氧基-次氯酚A；和2BA-2-DMHA。
在其它实施例中，使用激素疗法。激素治疗性处理可以包括例如激素激动剂、激素拮抗剂(例如氟他胺(flutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、他莫昔芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)(LUPRON)、LH-RH拮抗剂)、激素生物合成和加工抑制剂和类固醇(例如地塞米松、类维生素A、三角肌、倍他米松、皮质醇、可的松(cortisone)、泼尼松、脱氢睾酮、糖皮质激素、盐皮质激素、雌激素、睾酮、孕激素)、维生素A衍生物(例如，全反式维甲酸(ATRA))；维生素D3类似物；抗雌激素(例如，米非司酮(mifepristone)、奥那司酮(onapristone))或抗雄激素(例如，醋酸环丙孕酮(cyproteroneacetate))。
在其它实施例中，光动力疗法(也称为PDT、光辐射疗法、光疗法或光化学疗法)用于治疗一些类型的癌症。所述光动力疗法基于以下发现：当生物体暴露于特定类型的光时，某些被称为光敏剂的化学物质可以杀死单细胞生物体。
在又其它实施例中，激光疗法用于利用高强度光来破坏癌细胞。此技术通常用于缓解如出血或阻塞等癌症症状，尤其是当癌症无法通过其它治疗治愈时。所述技术还可以通过缩小或破坏肿瘤来治疗癌症。
临床功效/对疗法的应答
可以通过本领域已知的任何方法测量临床功效。例如，对疗法的应答涉及对癌症的任何应答，例如肿瘤，优选地涉及新辅助或辅助化学疗法开始后肿瘤质量和/或体积的变化。可以在新辅助或辅助情况下评估肿瘤应答，其中全身干预后肿瘤的大小可以与如通过CT、PET、乳房X线照片、超声或触诊测量的初始大小和尺寸进行比较，并且可以在组织学上估计肿瘤的细胞结构，并且与开始治疗前进行的肿瘤活检的细胞结构进行比较。应答还可以通过卡尺测量或活检或外科手术切除后的肿瘤病理学检查来评估。可以以定量方式记录反应，如肿瘤体积或细胞结构的百分比变化或使用半定量评分系统，如残留癌症负荷(Symmans等人,《临床肿瘤学杂志(J.Clin.Oncol.)》(2007)25:4414-4422)或Miller-Payne评分(Ogston等人(2003)《乳腺(Breast)》(爱丁堡,苏格兰)12:320-327)或定性方式如“病理完全应答”(pCR)、“临床完全缓解”(cCR)、“临床部分缓解”(cPR)、“临床稳定疾病”(cSD)、“临床进行性疾病”(cPD)或其它定性标准。肿瘤应答的评估可以在新辅助或辅助疗法开始后早期进行，例如几小时、几天、几周后或优选地几个月后。应答评估的典型终点是新辅助化学疗法终止时或外科手术切除残留肿瘤细胞和/或肿瘤床时。
在一些实施例中，本文所描述的治疗性处理的临床功效可以通过测量临床受益率(CBR)来确定。通过确定处于完全缓解(CR)的患者百分比、处于部分缓解(PR)的患者数量和在疗法结束后至少6个月的时间点患有稳定疾病(SD)的患者数量之和来测量临床受益率。此公式的简写是CBR＝CR+PR+超过6个月的SD。在一些实施例中，特定抗免疫检查点治疗方案的CBR为至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或更多。
用于评估对癌症疗法的应答的另外标准与“生存”有关，生存包括以下所有内容：生存至死亡，也称为总生存(其中所述死亡可能与病因无关或与肿瘤有关)；“无复发生存”(其中术语复发应包括局部复发和远处复发)；无转移生存；无病生存(其中术语疾病应包括癌症和与之相关的疾病)。所述存活的长度可以通过参考定义的起点(例如，诊断时间或治疗开始)和终点(例如，死亡、复发或转移)来计算。另外，治疗功效的标准可以扩展为包括生存概率、给定时间段内的转移概率和肿瘤复发的概率。
例如，为了确定适当的阈值，可以将特定的抗癌治疗方案施用于受试者群体，并且可以将结果与在施用任何癌症疗法之前确定的生物标志物测量结果相关。结果测量可以是对在新辅助环境中给予的疗法的病理应答。可替代地，可以在一段时间内监测生物标志物测量值已知的癌症疗法后受试者的结果测量值，如总生存和无病生存。在某些实施例中，对每个受试者施用相同剂量的抗癌剂。在相关实施例中，施用的剂量是本领域已知的抗癌剂的标准剂量。监测的受试者的时间段可以变化。例如，可以监测受试者至少2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、55或60个月。与癌症疗法的结果相关的生物标志物测量阈值可以使用如实例部分中描述的那些等方法来确定。
试剂盒
本发明还涵盖用于检测生物样品中的神经节苷脂的存在或水平的试剂盒。例如，试剂盒可以包括能够检测生物样品中的神经节苷脂的标记化合物或药剂；用于测定样品中的神经节苷脂的量的装置；以及用于将样品中的神经节苷脂的量与标准品进行比较的装置。化合物或药剂可以包装在合适的容器中。例如，在一些实施例中，本发明提供包括本文所描述的至少一种抗体或其抗原结合片段的试剂盒。含有本发明的抗体或其抗原结合片段的试剂盒可用于检测神经节苷脂，例如在诊断或预后测定中。本发明的试剂盒可以含有与固体支持物例如组织培养板或珠(例如，琼脂糖珠)偶联的抗体或其抗原结合片段。
试剂盒可以包括用于促进试剂盒设计的特定应用的另外组件。例如，可以提供含有用于在体外或离体例如在ELISA或蛋白质印迹中检测和定量神经节苷脂的抗体的试剂盒。试剂盒可以含有的另外示例性药剂包括检测标记的方法(例如，用于酶标记的酶底物、用于检测荧光标记的过滤器组、适当的二级标记，如绵羊抗小鼠-HRP等)和对照所需的试剂(例如，对照生物样品或神经节苷脂标准品)。试剂盒可以另外包括缓冲液和其它公认用于所公开的发明方法的试剂。非限制性实例包括用于减少非特异性结合的药剂，如载体蛋白或去污剂。本发明的试剂盒还可以包括说明材料，所述说明材料公开或描述了所公开的公开的试剂盒或抗体在如本文提供的所公开的公开的方法中的用途。
本发明通过以下实例进一步说明，所述实例不应被解释为限制性的。在本申请中引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容以及附图通过引用并入本文。
实例
实例1：材料和方法
小鼠
所使用的动物方案由戴维斯夫人研究所动物保护委员会(Lady Davis InstituteAnimal Care Committee)审查和批准，并且动物实验是根据加拿大动物保护委员会(Canadian Council on Animal Care)的指导方针进行的。健康野生型雌性C57/Bl6小鼠(10-12周龄，19-20g)购自哈兰公司(Harlan)(加拿大魁北克拉钦(Lachine,Quebec,Canada))并且使用PAMAM-GD2和PAMAM-GD3进行免疫以产生抗体。每个笼子最多五只小鼠被饲养在12小时的暗-明循环中，随意进食和饮水。
免疫
将PAMAM-GD2和PAMAM-GD3各自向小鼠腹膜内注射两次(PBS中50ug)，间隔约5-7天。第一次免疫有10％(v/v)gerbu(一种佐剂)，而第二次免疫没有佐剂。从免疫小鼠中采集脾细胞并且与骨髓瘤细胞系融合以产生杂交瘤(Haskard和Archer,《免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)》,74(2),361-67(1984),Roder等人,《酶学方法(MethodsEnzymol.)》,121,140-67(1986),以及Huse等人,《科学》,246,1275-81(1989))。通过流式细胞术和ELISA分析抗体与PAMAM-GD2、PAMAM-GD3或天然神经节苷脂结合的能力。
免疫组织化学(IHC)
将石蜡包埋的4μm厚组织切片脱石蜡并且在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤。内源性过氧化氢酶和生物素分别用0.3％(v/v)H2O2和亲和素/生物素封闭试剂盒(载体实验室(Vector Laboratories)，SP-2001)封闭。非特异性背景用封闭试剂封闭，随后与抗GD2抗体或抗GD3抗体一起温育过夜。将切片与抗生物素化小鼠IgG辣根过氧化物酶(HRP)一起温育，随后进行DAB反应，并且用苏木精/曙红复染。没有初级抗体的切片用作阴性对照。图像是使用光学显微镜扫描仪拍摄的。
评分
GD2和GD3的免疫反应性由病理学家使用半定量方法进行审查和评分(Ziebarth等人,2012:子宫平滑肌肉瘤弥漫性表达二唾液酸神经节苷脂GD2并与治疗性免疫细胞因子14.18-IL2结合：对癌症免疫疗法的影响(Uterine leiomyosarcoma diffusely expressdisialoganglioside GD2 and bind the therapeutic immunocytokine 14.18-IL2:Implications for immunotherapy)以及Orsi等人,2017:乳腺癌中的GD2表达(GD2expression in breast cancer)。以盲方式且独立于临床病理学数据评估免疫染色。样品根据其强度分为不同的类别。无免疫反应性(0)、1+(弱染色)、2+(中等染色)、3+(强染色)。评分为0或1+染色的那些样品被认为是阴性的，并且评分为2+和3+被认为是阳性的。最终的GD2或GD3评分显示为总卵巢样品或癌症卵巢亚型的百分比(％)。
ELISA
使用有机溶剂提取方法(参见例如实例10)从来自每个供体的等体积血清中分离神经节苷脂。血清等效体积的分析物固定在ELISA板中，并且用针对GD2或GD3的mAb进行测定。与次级抗体温育后，在450nm处读取光密度(OD)。阴性值设置在光密度(OD)<0.15处；低阳性GD2值设置在OD介于0.15-0.5之间处；并且高阳性GD2值设置在OD>0.5处。对照纯化的天然GD2或GD3(10ng/孔)用作标准阳性对照。没有一抗的孔被用作背景。每个样品一式三份进行测定，并且每个ELISA独立重复至少2-3次。
流式细胞术
将2×105个EL4-GD2+、EL4-GD3+和Jurkat细胞与2mL小鼠抗血清(1:50稀释)或阳性对照抗GD2 mAb(13nM，14G2a；圣克鲁兹生物技术公司)或阳性对照抗GD3 mAb(13nM。R24；艾博抗公司)在冰上一起温育20分钟，随后是FITC缀合的抗小鼠IgG二抗(1.8nM，西格玛公司)。立即将细胞在流式细胞仪(百克顿-迪金森公司(Becton-Dickinson))中研究，并且使用CellQuest软件分析数据。预出血血清和正常小鼠血清用作阴性对照。Jurkat细胞(对GD2和GD3呈阴性)用作阴性对照细胞。
患者
患者样品(TMA和液体活检)是在伦理批准下从LDI/JHG生物库获得的。临床病史的回顾性研究用于评估TMG与CA-125水平、癌症疾病分期和生存期以及绝经分期之间的相关性。研究了总共176名患者(n＝9正常；n＝16交界性；n＝151卵巢)。根据那些，通过ELISA分析在液体活检中的GD2的水平，并且与相同患者(n＝40名卵巢患者；n＝7交界性；n＝33卵巢)中的CA-125值进行比较。
实例2：用于产生针对GD2和GD3的抗体的碳水化合物类似物和树枝状聚合物产物 的设计和合成
如本文所描述的，神经节苷脂的上调在肿瘤中普遍存在。
表3：具有上调的肿瘤标志物神经节苷脂的癌症基质
正常神经节苷脂和TMG的碳水化合物具有共同的结构。例如，GD2和GD3彼此相差一个糖，并且普遍表达的GM1与GD2相差两个糖单位。因此，很难安全地提高抗神经节苷脂免疫力。本文制备了神经节苷脂模拟物，所述神经节苷脂模拟物在结构上与天然GD2和GD3碳水化合物相同，并且没有可变的脂质尾部，以减少异质性和交叉反应性的风险。生成了合成类似物对氨基苯基醚-GD2(AP-GD2)和对氨基苯基醚-GD3(AP-GD3)，由此可以利用它们的胺基与适合的支架缀合。在AP-GD2和AP-GD3中，连接到苯醚的葡萄糖的异头中心处于b构型，这是可见于天然神经节苷脂中的糖与神经酰胺之间的天然连接。这种立体化学是保留天然结构的关键，并且与一些仅基于化学的合成方法形成对比，所述仅基于化学的合成方法得到a构型和b构型的混合物。高效液相色谱法纯化后，通过液相色谱法-质谱法验证AP-GD2，并且使用1H核磁共振(NMR)光谱法确认构型。AP-GD3类似地表征。
使用AP-GD2和AP-GD3拟糖前体，合成了无脂质、水溶性寡聚产物，以使小鼠免疫以产生抗体。
将纯化的AP-GD2和AP-GD3转化为对应的异硫氰酸酯，并且与PAMAM G0树枝状核心的游离胺偶联，以得到对应的硫脲PAMAM-GD2和PAMAM-GD3。在与未反应的前体和过量试剂分离后，使用薄层色谱法、NMR光谱法和定量分析方法表征PAMAM-GD2和PAMAM-GD3。下文提供了关于合成的另外的细节。
AP-GD2和AP-GD3的合成
对氨基苯醚-b-D-吡喃乳糖苷(AP-Lac，来自多伦多研究化学品公司(TorontoResearch Chemicals))用于酶促合成水溶性(>20mg/ml)AP-GD2和AP-GD3中间碳水化合物。AP-GD2的合成包括在55ml的最终体积中，215mmol的AP-GD3(4mM)、295mmol的UDP-GalNAc(5.4mM)和10.5单位的CgtA(构建体CJL-30)、10mM MnCl2和24mM Hepes pH 7.0。将反应混合物在37℃下温育6.5小时。通过以27,000g离心15分钟去除不溶性材料，并且使用10kDa截留分子量膜通过超滤去除酶。将滤液装载到SepPak C18 5g柱(沃特世公司(waters Corp))上，并且将产物用水洗脱，同时不明污染物保留在柱中。将产物使用0-0.3M NH4HCO3梯度在HiTrapQ(通用电气医疗集团(GE Healthcare))上通过阴离子交换色谱法和在Superdex肽10/300GL柱(通用电气医疗集团)上通过尺寸排阻色谱法进一步纯化。AP-GD2(1,218g/mol)和AP-GD3(927g/mol)的测得分子量与预期值相符。通过1D和2D NMR光谱法和质谱法(EI-MS)验证结构。将AP-GD2和AP-GD3中间体通过尺寸排阻色谱法(Superdex 30 16mm X 85cm，通用电气医疗集团)纯化到>99％的纯度，然后通过与树枝状聚合物支架缀合以应用于疫苗合成。
PAMAM-GD2和PAMAM-GD3树枝状聚合物的合成
将硫光气(2ml)添加到AP-GD2(2mg)于80％乙醇(300ml)中的搅拌溶液中。在室温下3小时后，薄层色谱法(乙酸乙酯:甲醇:水:乙酸4:2:1:0.1v/v)显示形成了单一产物。浓缩到接近干燥得到固体，将所述固体用水处理并过滤。将滤饼用水洗涤，并且将合并的滤液和洗涤物冷冻干燥以得到呈白色粉末状的异硫代氰酰基苯基GD2(1.8mg，90％产率)。在单独的烧瓶中，将来自聚酰胺-胺(PAMAM G0，Dendritech公司(Dendritech,Inc))的甲醇溶液的易挥发物在减压下蒸发，并且将所得残余物溶解于二甲基甲酰胺(DMF)中。将含异硫代氰酰基苯基GD2(1.8mg)的DMF(110ml)逐滴添加到N,N-二异丙基乙胺(0.5ml)和PAMAM G0(2ml，85.4mg/ml)的搅拌DMF溶液(100ml)中。将反应在室温下搅拌20小时，直到通过TLC检测不到起始材料。将混合物用水稀释并且相对于水透析(2kDa截留分子量膜，光谱实验室公司(Spectrum Laboratories Inc.))。将所得溶液冷冻干燥以得到呈白色粉末的1.34mg(80％产率)的PAMAM-GD2产物，将所述产物进一步通过1D和2D NMR光谱法表征。PAMAM-GD3是使用类似的过程由AP-GD3前体和PAMAM合成的。PAMAM-GD2和PAMAM-GD3的合成各至少重复三次，产生如通过TLC和NMR测定的相同产物。
产物是不同数量的缀合到PAMAM上的GD2部分的异质混合物，范围为0-4并且包括一个完全缀合的四聚体(例如参见1H NMR的芳香区(6ppm和以上))。因此，对产物的组分进行了进一步研究。PAMAM-GD2的HPLC显示两个主峰，将所述两个主峰分离(峰1和峰2)并进行NMR分析。峰1是PAMAM-乳糖四聚体，丢失了GalNAc和唾液酸残基，并且不含有GD2表位。峰2是PAMAM-GD2和其所有组分的混合物，并且含有包括四聚体的GD2表位。通过使用选择性抗GD2 mAb(克隆14G2a；圣克鲁兹生物技术公司)对PAMAM-GD2中的抗原(AP-GD2)的量进行定量。在PAMAM-GD2混合物的不同组分中的每个组分中对GD2反应性表位的量(w/w)进行定量。峰1中唾液酸和GalNAc残基的丢失导致未检测到GD2表位。从PAMAM-GD2混合物中分离出的所有其它组分都与14G2a(圣克鲁兹生物技术公司)结合，表明那些组分具有GD2含量。剂量应答曲线的定量表明，PAMAM-GD2混合物中的AP-GD2含量为49±12％(w/w)。
实例3：神经节苷脂的经修饰形式的设计和合成
通过将杂芳基(例如，三嗪)与各种形式的GD2或GD3(例如，氨基-苯基GD、氨基-丙基GD、氨基乙基GD、氨基丁基GD等)偶联来制备经修饰的神经节苷脂的示例性物种。下文提供了合成的详细方法。
三嗪-GD2缀合物(三嗪-三-GD2)的合成
将2-氨基-4,6-二氯-1,3,5-三嗪(1mg，0.007mmol)溶解于1mL无水DMF中。向所述溶液中添加粉末状1,1-硫代羰基二咪唑(2.5mg，0.014mmol)，并且将反应混合物搅拌3小时。反应进程通过HPLC监测(使用的洗脱梯度溶剂系统是含0至100％乙腈的水)。保留时间为3.54分钟的峰(2-氨基-4,6-二氯-1,3,5-三嗪，起始材料和限制反应物)消失，并且产生了保留时间为2.29分钟的新峰。分离并冻干保留时间为2.29分钟的峰。将产物用于下一步骤，无需任何进一步纯化或表征。
向含产物(0.1mg，0.533μmol)的1mL DMF中添加氨基苯基GD2(3.2μmol，4mg)，并且将20μL的1N NaOH添加到反应混合物中。然后将反应混合物搅拌12小时，并且使用相同的梯度溶剂系统(含0至100％乙腈的水)通过HPLC监测反应进程。2.29分钟处的峰消失，并且1.89分钟处出现新的主峰。
此峰被分离、冻干并且用于活性测定(参见ELISA)。
三嗪-GD3缀合物(三嗪-三-GD3)的合成
将2-氨基-4,6-二氯-1,3,5-三嗪(1mg，0.007mmol)溶解于1mL无水DMF中。向所述溶液中添加粉末状1,1-硫代羰基二咪唑(2.5mg，0.014mmol)，并且将反应混合物搅拌3小时。反应进程通过HPLC监测(使用的洗脱梯度溶剂系统是含0至100％乙腈的水)。保留时间为3.54分钟的峰(2-氨基-4,6-二氯-1,3,5-三嗪，起始材料和限制反应物)消失，并且产生了保留时间为2.29分钟的新峰。分离并冻干保留时间为2.29分钟的峰。将产物用于下一步骤，无需任何进一步纯化或表征。
向含产物(0.1mg，0.533μmol)的1mL DMF中添加氨基苯基GD3(3.2μmol，3.2mg)，并且将20μL的1N NaOH添加到反应混合物中。然后将反应混合物搅拌12小时，并且使用相同的梯度溶剂系统(含0至100％乙腈的水)通过HPLC监测反应进程。2.29分钟处的峰消失，并且2.34分钟处出现新的主峰。
此峰被分离、冻干并且用于活性测定(参见ELISA)。
具有x＝2化学计量的三嗪-GD2类似物(三嗪-二-GD2)的合成
将2-氨基-4,6-二氯-1,3,5-三嗪(1mg，0.007mmol)溶解于1mL无水DMF中。向其中添加10mg固体碳酸钠。向所述溶液中添加粉末状Boc酸酐(3mg，0.014mmol)，并且将反应混合物搅拌12小时。反应进程通过HPLC监测(使用的洗脱梯度溶剂系统是含0至100％乙腈的水)。保留时间为3.54分钟的峰(2-氨基-4,6-二氯-1,3,5-三嗪，起始材料和限制反应物)消失，并且产生了新峰。所述峰被分离并冻干。将产物用于下一步骤，无需任何进一步纯化或表征。
向含产物(0.1mg)的1mL DMF中添加氨基苯基-GD2(3.2μmol，4mg)，并且将20μL的1N NaOH添加到反应混合物中。然后将反应混合物搅拌12小时，并且使用相同的梯度溶剂系统(含0至100％乙腈的水)通过HPLC监测反应进程。2.29分钟处的峰消失，并且1.89分钟处出现新的主峰。
BOC保护基团的去除是任选的，并且如果所述基团被去除，脱保护位点可以使用可商购获得的试剂用如生物素等荧光染料(例如，FITC或Cy7)或标签衍生化。
三嗪-二-GD3的合成
将2-氨基-4,6-二氯-1,3,5-三嗪(1mg，0.007mmol)溶解于1mL无水DMF中。向所述溶液中添加粉末状1,1-硫代羰基二咪唑(2.5mg，0.014mmol)，并且将反应混合物搅拌3小时。反应进程通过HPLC监测(使用的洗脱梯度溶剂系统是含0至100％乙腈的水)。保留时间为3.54分钟的峰(2-氨基-4,6-二氯-1,3,5-三嗪，起始材料和限制反应物)消失，并且产生了保留时间为2.29分钟的新峰。分离并冻干保留时间为2.29分钟的峰。将产物用于下一步骤，无需任何进一步纯化或表征。
向含产物(0.1mg，0.533umol)的1mL DMF中添加氨基苯基GD3(3.2umol，3.2mg)，并且将20uL的1N NaOH添加到反应混合物中。然后将反应混合物搅拌12小时，并且使用相同的梯度溶剂系统(含0至100％乙腈的水)通过HPLC监测反应进程。2.29分钟处的峰消失，并且2.34分钟处出现新的主峰。
此峰被分离并冻干。BOC保护基团的去除是任选的，并且如果所述基团被去除，脱保护位点可以使用可商购获得的试剂用如生物素等荧光染料(例如，FITC或Cy7)或标签衍生化。
FITC标记的三嗪-二-GD2的合成
向含boc保护的三嗪-二GD2的水中添加20％(v/v)乙酸溶液。将反应混合物在室温下搅拌1小时。反应进程通过HPLC监测(使用的洗脱梯度溶剂系统是含0至100％乙腈的水)。将产物用于下一步骤，无需任何进一步纯化。
向含产物的DMF中添加异硫氰酸荧光素(FITC)，并且将反应进行12小时。反应进程通过HPLC监测(使用的洗脱梯度溶剂系统是含0至100％乙腈的水)。
FITC标记的三嗪-二-GD3的合成
向含boc保护的三嗪-二GD3(1mg)溶液的水(1mL)中添加20％(v/v)乙酸溶液。将反应混合物在室温下搅拌1小时。反应进程通过HPLC监测(使用的洗脱梯度溶剂系统是含0至100％乙腈的水)。具有boc保护的三嗪-二GD3保留时间的峰消失，并且产生、分离并冻干新峰。将产物用于下一步骤，无需任何进一步纯化或表征。
向含产物的DMF中添加3摩尔过量异硫氰酸荧光素，并且将反应进行12小时。反应进程通过HPLC监测(使用的洗脱梯度溶剂系统是含0至100％乙腈的水)，并且产生、分离并冻干新峰。
然后将纯产物用于活性和结合研究。
抗人GD2和GD3抗体的生成
通过用PAMAM-GD2和PAMAM-GD3使小鼠免疫，本文产生了十二个独特的分泌选择性抗GD2或抗GD3 mAb的杂交瘤。这是一项重大成就，因为全世界只有少量选择性mAb。这是因为碳水化合物的免疫原性较差，因此难以产生与碳水化合物特异性结合的抗体，更不用说如GD2和GD3等神经节苷脂的碳水化合物部分。本文呈现的mAb与GD2或GD3的独特碳水化合物部分结合，并且具有高度选择性。在流式细胞术测定中，每个mAb仅与表达GD2或表达GD3的细胞系(小鼠、大鼠或人)的细胞表面结合，但与已知对GD2或GD3呈阴性的细胞没有结合。12种mAb的结合和选择性已通过流式细胞术表征。对于IHC和ELISA，12种不同的mAb中的四种(表1和2中公开的克隆)已得到深入表征，因为这些mAb对肿瘤也具有细胞毒性并且可用于体内癌症免疫疗法。
实例4：通过ELISA对人液体活检中的GD2和GD3进行定量
已知GD2和GD3从癌细胞中脱落，应用了针对神经节苷脂开发的ELISA方法，并且评估了五十名卵巢癌患者血液样品中的GD2或GD3的存在(n＝37诊断为高级别，以及n＝13诊断为早期或交界性)。在盲法ELISA研究中，48/50(96％)和46/50(92％)对GD2或GD3呈阳性。总体比率为49/50(98％)。来自健康和非癌症患者的所有液体活检均为阴性，并且值等于背景(n＝23个体非癌症女性；以及30名健康供体的一个合并样品)。
液体活检的纵向评估监测应答或复发。
血液样品中GD2和GD3的纵向评估将检测与肿瘤负荷和对治疗的应答相关联。在疗法前(诊断时)和治疗(外科手术加辅助化学疗法)完成后约2周收集血清。通过PET成像对肿瘤体积进行定量(数据显示全身的累积肿瘤体积；表4)。
表4：标准疗法前后收集的黑色素瘤患者的液体活检
*血液GD2或GD3可见于黑色素瘤患者中。
*血液中的GD2或GD3水平与肿瘤体积相关。
*肿瘤体积缩小(疗法后)引起血液中的GD2或GD3水平降低。
两名患者作为实例示出。患者1：诊断时的肿瘤负荷为310cm3，并且GD2/GD3水平是正常的10倍。患者对治疗做出良好应答。疗法后残留肿瘤为3.0cm3，并且GD2/GD3水平显著降低并与正常无异。患者2：诊断时的肿瘤负荷为183cm3，并且GD2/GD3水平是正常的6倍。患者对治疗做出不良应答。疗法后，残留肿瘤仍然大，为103cm3，并且GD2/GD3水平仍然高，其中GD3水平略有30％下降。
结果表明，ELISA可用于监测治疗应答或癌症复发。特别是，定量检测极限(LOQD)等同于代谢PET可检测到的微小残留病灶，这将使此测试对于监测癌症复发具有价值。在有机溶剂中从1ml血清中提取糖脂。每个样品一式三份进行测定，并且使用针对每个GD2或GD3的两个独立的mAb，每个ELISA独立重复至少2-3次。仅1ml血清就足以测试样品并且通过其它方法对其进行交叉验证。标准采血管(5ml)的剩余部分可以用于评估其它标志物；并且用于存档目的。纯化的天然GD2或GD3的标准曲线用作内部阳性对照，正常神经节苷脂GM1用作阴性对照(10ng/孔)，并且使用一系列mAb浓度(225nM、75nM、25nM)。背景孔具有所有试剂但没有初级mAb。作为临界值，在相对于对照至少2倍标准差的情况下，使用相对于所有对照的平均值在统计学上显著的高2倍的值。
实例5：通过IHC检测卵巢癌组织活检中的GD2和GD3
在113个卵巢癌组织活检(75个晚期和38个低期)的IHC中评估了抗GD2和抗GD3mAb。如本文所使用的，早期/低期癌症对应于I期癌症；并且后期/高度/晚期癌症包括II期至IV期的癌症。总体而言，109/113(96％)对GD2和GD3呈阳性；其中晚期为73/75并且早期为36/38。染色显著且均质，仅限于肿瘤组织，并且在正常周围组织中不存在(图4)。值得注意的是，其组织通过IHC研究的50名相同患者的血液被用于ELISA检测(参见实例5)。检测数据100％相符。这是交叉验证，因为血源性GD2只能来自GD2阳性肿瘤。
与标准CA-125标志物(在约60％的早期和约85％的晚期可检测到，并且不可用于监测早期复发)的比较显示，GD2/GD3是显著优越的标志物。对于早期患者，25/38个的CA-125水平异常(244±106U/l)，并且那些25个中的24个对GD2呈阳性。其它13/38个早期患者的CA-125水平正常，并且那些13个中的12个是GD2阳性。因此，ELISA将检测出以其它方式将无法检测出的12/13个早期患者。总体而言，早期患者为36/38GD2阳性。对于后期患者，66/75的CA-125水平异常(966±527U/l)，并且所述患者中的65个是GD2阳性。其它9/75个的CA-125水平正常，并且那些9个中的8个是GD2阳性。因此，ELISA将检测出以其它方式将无法检测出的8/9个后期患者。总体而言，晚期患者为73/75GD2阳性。
通过相对染色强度进一步突出了早期诊断的数据。GD3(p＝0.026)和GD2(p＝0.015)的单一染色强度与癌症分期有显著的直接相关性(图5)。此类数据表明了与对铂化学疗法缺乏应答的相关性，这可能有助于推动个性化治疗决策。
这些是回顾性研究，双盲的，由病理学家根据批准的伦理协议进行评分。还使用了具有标准DAB染色程序的肿瘤微阵列(TMA)。另外，使用了分子病理学服务(发现XTautomated IHC平台；文塔纳公司(Ventana)、罗氏公司(ROCHE))中的手动和自动方法。
这些数据支持GD2和GD3标志物的诊断用途。目前的诊断病理学指南包括CK20、ER、PAX8、P53和CK7的染色，以区分卵巢形式的转移性结直肠癌。将GD2和GD3添加到列表中将解决对更好的诊断病理学和应答预测的需求。
实例6：液体活检中的LC/MS测定——神经节苷脂水平
使用nLC-ESI-MS/MS(LC/MS)，对来自6名癌症患者(2名黑色素瘤患者、2名肾癌患者、2名新诊断的未接受过治疗的SCLC患者)和3名非癌症对照(2名单独研究的供体、来自30名供体的1种合并血浆)的液体活检进行分析(表5和6)。开发LC/MS方法是为了同时研究所有肿瘤神经节苷脂(例如，癌症神经节体基质，包括至少5,000种分析物内的20种肿瘤神经节苷脂)。
癌症患者显示出升高的肿瘤神经节苷脂，这对每种癌症都具有特异性。通过LC-MS评估并且与非癌症样品相比，黑色素瘤样品显示出GM2、GD3和GD1b水平显著增加；肾癌样品显示出GD3和GD2水平显着增加；并且肺癌样品显示出GD3和GM2水平显著增加。在专门评估GD3的卵巢癌样品研究中，与2个非癌症对照样品相比，12/13的卵巢癌样品显示出GD3显著增加。对照非癌症样品显示出非常低或低于检测阈值的水平(表5)。内标包括胆固醇(未示出)和磷脂酰胆碱(未示出)，它们在所有样品中均以高水平存在。磷脂酰丝氨酸(PS)，即，一般应激(癌症、炎症、糖尿病、感染、败血症、细胞凋亡)的非特异性阳性标志物，在所有癌症样品中均高于对照非癌症样品。
表5：神经节苷脂的LC-MS-MS检测作为癌症的诊断.
左侧表是每例1名患者，具有相对定量。可定量检测极限(LOQD)为约1-20个单位。右侧表是绝对定量(pmol/ml)。将十三个卵巢癌样品(4个早期和9个后期)与2个非癌症样品在诊断时采集的血清中测量的糖脂的平均值进行了比较。
实例7：液体活检中的LC/MS测定——脂质尾部长度
除了通过LC/MS表明癌症患者的肿瘤神经节苷脂水平升高之外，本文首次提供了令人惊讶和意外的发现：肿瘤神经节苷脂具有对每种癌症具有特异性的脂质尾部异质性模式。
在黑色素瘤中，具有短链形式(脂质尾部)的GM2占主导地位，并且相对于正常增加了10倍，而长链形式从正常中的检测不到增加到癌症中的90个单位。对于GD3，短链形式相对于正常增加了40倍。对于GD1，短链形式从正常中的检测不到增加到70个单位。肾癌的GD3和GD2显著增加(特别是短脂链形式)。肺癌的GD3显著增加或转变(特别是长脂链形式)并且具有GM2向短脂链形式的转变(表6)。所有对照样品的标记都非常低或低于阈值，但检测到了如GM1等正常的神经节苷脂。
如本文首次表明的，本公开使用LC/MS检测神经节苷脂的脂质可变长度并对其进行定量，并且建立了脂质尾部长度与癌症诊断的关联。另外，正如本文进一步表明的，LC/MS方法检测了如GM2和GD1等其它神经节苷脂肿瘤标志物，目前无法在ELISA中对所述神经节苷脂肿瘤标志物进行定量。检测许多肿瘤神经节苷脂(例如，癌症神经节体基质)的特定标记对于扩展应用和肿瘤的检测/诊断/预后具有价值。
表6：神经节苷脂的LC-MS-MS检测作为人癌症的诊断.
诊断时研究了血清的糖脂和脂质。仅以相对单位示出与正常对照相比的相关数据。为简单起见，脂质尾部分为短的(14至34个碳)或长的(36至48个碳)。示出的实例包括具有大量转移性病灶的黑色素瘤；肾癌和非小细胞肺癌。将患者与非癌症供体的平均值进行比较。数据来自约5,000种分析物(显著变化与正常以粗体显示)。其它神经节苷脂保持不变或检测不到。目前估计的可定量检测极限(LOQD)为约40个单位或0.010-0.24pmol/mL。
LC/MS方法可用于交叉验证ELISA，使用与用于ELISA的同一批的液体活检样品。总体而言，血液的ELISA和LC/MS以及组织的IHC提供了可靠的数据交叉验证。然而，LC/MS方法有其自身的内在价值，因为它可以测量IHC和ELISA无法测量的GD2和GD3标记的许多独特特征。
实例8：GD2/GD3的水平表明对癌症疗法的应答性
使用ELISA检测了用不同癌症疗法(图7)例如，免疫检查点抑制疗法和/或化学疗法治疗的黑色素瘤癌症患者血液样品中的GD2或GD3的存在。GD2/GD3的水平与通过PET成像确定的对各种癌症疗法的应答性相关。GD2或GD3的低水平或检测不到水平与对各种癌症疗法的更好应答相关。
表7：对癌症疗法的应答性
实例9：直接性结合ELISA
将天然神经节苷脂(GD2或GD3，对照)、三嗪-三-GD2、三嗪-三-GD3、PAMAM-GD2、PAMAM-GD3或单体前体AP-GD2或AP-GD3固定在聚苯乙烯康宁(Corning)Strip Well96孔板(10ng/孔)上。用白蛋白(BSA)封闭所有孔后，所述孔通过抗GD2或抗GD2mAb(最终7nM)结合进行反应或与来自接种PAMAM-GD2(1:75稀释)的小鼠的血清反应。使用的次级抗体是辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗小鼠IgG(西格玛公司)。BG＝背景对照。
参考表8和图19A-19D，三嗪-三GD2和三嗪-三GD3均分别通过抗GD2或抗GD3mAb识别和结合。另外，针对PAMAM-GD2或PAMAM-GD3产生的抗血清与三嗪-三GD2或三嗪-三GD3发生交叉反应并直接与其结合，表明例如PAMAM-GD2和三嗪-三GD2中的碳水化合物部分是相同的免疫原。
表8：直接结合ELISA数据
*BG：背景
实例10：竞争ELISA
将天然神经节苷脂GD2或GD3(高级免疫化学公司(Advanced ImmunochemicalInc.))固定在聚苯乙烯康宁Strip Well 96孔板(10ng/孔)上，并且测试抗GD2或抗GD3mAb的结合。使用的次级抗体是辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗小鼠IgG(西格玛公司)。在ELISA期间，通过添加三嗪-三-GD2或三嗪-三-GD3作为竞争配体进行竞争。
参考表9和图20A和20B，三嗪-三GD2和三嗪-三GD3均分别通过抗GD2或抗GD3mAb识别；引起与固定在板上的GD2或GD3结合的mAb竞争。
表9：
实例11：夹心ELISA
1.通过在包被缓冲液(10mM磷酸盐)中稀释抗GD2/GD3捕获抗体(1:1000–1:5000稀释)来制备包被溶液。
2.将100μL包被抗体溶液添加到微量滴定板的每个孔中。
3.将板在冷藏条件(2-8℃)下过夜温育(至多18小时)。
4.第二天，将溶液吸出，并且将板用200μL洗涤缓冲液(具有0.05％tween-20的Tris或PBS)洗涤一次。将微量滴定板倒置并且在吸附毛巾上轻敲以去除任何过量的液体。
5.每孔添加200μL封闭缓冲液(具有0.1％ BSA或5％脱脂牛奶或1％酪蛋白的PBS)，并且将板在室温下温育1小时。
6.将溶液吸出，并且将微量滴定板倒置并且在吸附毛巾上轻敲以去除任何过量的液体。
7.在封闭缓冲液中制备具有不同量GD2/GD3的样品和标准品，并且一式两份添加(每孔100μL)以与板上的捕获抗体结合，碳水化合物或脂质部分与抗体结合。
8.将板在室温下通过轻微振荡(约300-500rpm)温育2小时。在此温育期间，包括神经节苷脂的胶束被抗体捕获。
9.温育后，将溶液吸出，并且将微量滴定板倒置并且在吸附毛巾上轻敲以去除任何过量的液体。
10.将板用200μL洗涤缓冲液(具有0.05％tween-20的Tris或PBS)3-4次。
11.每次洗涤后，将微量滴定板倒置并且在吸附毛巾上轻敲以去除任何过量的液体。
12.用辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗GD2/GD3检测抗体在封闭缓冲液中通过适当稀释制备。
13.每孔添加100μL检测抗体，并且将板在室温下通过轻微振荡(约300-500rpm)温育3小时。
14.温育后，将溶液吸出，并且将微量滴定板倒置并且在吸附毛巾上轻敲以去除任何过量的液体。
15.将板用200μL洗涤缓冲液(具有0.05％tween-20的Tris或PBS)3-4次。
16.每次洗涤后，将微量滴定板倒置并且在吸附毛巾上轻敲以去除任何过量的液体。
17.链霉亲和素-HRP的工作溶液(1:5000稀释)在封闭缓冲液中制备。
18.每孔添加100μL链霉亲和素-HRP溶液，并且将板在室温下通过轻微振荡(约300-500rpm)温育45分钟。
19.温育后，将溶液吸出，并且将板用200μL洗涤缓冲液(具有0.05％tween-20的Tris或PBS)3-4次。
20.每次洗涤后，将微量滴定板倒置并且在吸附毛巾上轻敲以去除任何过量的液体。
21.每孔添加100μL TMB底物，并且将板在室温下温育30分钟。
22.将100μL终止溶液添加到每孔中，并且在添加终止溶液的30分钟内在450nm处测量吸光度。
23.使用已知量的GD2/GD3和其与观察到的OD的相关性制备标准曲线。使用其观察到的OD和标准曲线拟合计算样品的浓度。
实例12：用于ELISA研究的从血清中提取的样品的制备–使用CHCl3:MEOH:H2O提取 脂质
为了从100μL血清体积中提取糖脂，将样品以3000x g离心10分钟，并且收集不含沉淀物的上清液。然后，将5体积的CHCl3:MeOH:H2O[氯仿:甲醇:水例如，比率范围为1:2:1、或4:8:3、或2:4:1]添加到收集的上清液中，例如用于期望的分析物的提取和/或浓缩。将混合物以3000x g离心10分钟，并且避开中间相回收上清液。向回收的上清液中添加26μl的蒸馏水，然后重复提取步骤一次，并且第二次提取后回收上清液。当有机溶剂被回收后，蒸发有机相(例如，在Speed-Vac中)。提取的样品(“ELISA样品”)用于本文所描述的ELISA。
实例13：使用CHCl3:MeOH:H2O提取的脂质的ELISA
1.ELISA样品如上文制备。将ELISA样品或纯神经节苷脂(用作标准阳性对照)与95％乙醇以1:2混合。然后通过将添加到孔中的材料在室温下或在30℃的箱子中干燥约5分钟，用ELISA样品或阳性对照天然神经节苷脂的标准曲线包被ELISA板。本文例示了96孔ELISA板，但其它形式也是可能的。
2.向所有孔中添加新鲜制备的PBS-BSA0.1％封闭缓冲液并且温育30-45分钟以封闭孔中的非特异性结合。
3.去除封闭缓冲液后，添加50ul初级抗体例如，本公开的抗GD2或抗GD3抗体。初级mAb的浓度范围为1ug/ml至0.005ug/ml。
4.将初级抗体温育30-60分钟。
5.将孔用200ul/孔的封闭缓冲液洗涤三次。
6.去除封闭缓冲液后，添加50ul稀释的酶缀合或荧光标记的次级抗体，并且温育30-60分钟。
7.将孔用200ul/孔的PBS洗涤三次。
8.然后使用用于次级抗体标签的标准检测系统。在辣根过氧化物酶标记的次级抗体的情况下，每孔添加50ul TMB试剂(TMB-ELISA赛默飞世尔科技公司(ThermoScientific)[目录号34028])。
9.将板温育约3至5分钟或直到含有阳性对照(用于生成标准曲线)的孔达到浅蓝色。
10.通过添加50ul 0.5N H2SO4终止反应。
11.在450nm的吸光度下用分光光度计读取反应。
表10：固定样品的示例性绘图
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 S12
B S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 S12
C Bkg Bkg Bkg Bkg Bkg Bkg Bkg Bkg Bkg Bkg Bkg Bkg
D Bkg Bkg Bkg Bkg Bkg Bkg Bkg Bkg Bkg Bkg Bkg Bkg
E S13 S14 S15 S16 S17 S18 S19 S20 -Ctl +Ctl N1Ctl N2Ctl
F S13 S14 S15 S16 S17 S18 S19 S20 -Ctl +Ctl N1Ctl N2Ctl
G Bkg Bkg Bkg Bkg Bkg Bkg Bkg Bkg Bkg Bkg Bkg Bkg
H Bkg Bkg Bkg Bkg Bkg Bkg Bkg Bkg Bkg Bkg Bkg Bkg
表10的代码：
●S(1-20)：来自脂质提取的样品
●Ctl：阴性对照
●+Ctl：阳性对照
●N(1-2)Ctl：来自正常患者的阴性对照样品
●Bkg：仅使用次级抗体的背景
通过引用并入
本文所提及的所有公开、专利以及专利申请特此通过引用整体并入，如同每个单独的公开、专利或专利申请被专门地且单独地指示通过引用并入。在冲突的情况下，以本申请(包括本文中的任何定义)为准。
还通过引用整体并入的是任何多核苷酸和氨基酸序列，其引用与公共数据库中的条目相关的登录号，如由万维网tigr.org上的基因组研究所(The Institute for GenomicResearch，TIGR)和/或万维网ncbi.nlm.nih.gov上的国家生物技术信息中心(NCBI)维护的那些登录号。
等效方案
本领域的技术人员将认识到，或仅仅使用常规实验就能够确定本文描述的本发明的具体实施例的许多等同形式。此类等效形式旨在由以下权利要求书涵盖。
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Claims (110)

1.一种组合物，其包含具有以下结构的神经节苷脂：
(A)x-[(P)y-(L)z]-(M)b；
其中A是神经节苷脂或其任何部分；x是1至32的整数；P是杂芳基；y是1；L是接头；z是0至8的整数；M是核心；并且b是0或1；
其中P任选地被1个、2个、3个、4个或5个独立地选自以下的取代基取代：
(1)氢；(2)C1-7酰基；(3)C1-20烷基；(4)氨基；(5)C3-10芳基；(6)羟基；(7)硝基；(8)C1-20烷基-氨基；以及(9)-(CH2)qCONRB，其中q是0至4的整数，并且其中RB选自由以下组成的组：(a)氢；(b)C1-6烷基；(c)C3-10芳基；以及(d)C1-6烷-C6-10芳基。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述杂芳基是三嗪或三唑。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中
a)所述三嗪是1,3,5三嗪；或
b)所述三唑是1,2,3三唑或1,2,4三唑。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述P被1个、2个、3个、4个或5个独立地选自以下的取代基取代：(1)氢；(2)C1-20烷基-氨基；以及(3)-(CH2)qCONRB，其中q是0至4的整数，并且其中RB选自由以下组成的组：(a)氢；(b)C1-6烷基；(c)C3-10芳基；以及(d)C1-6烷-C6-10芳基。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中所述M是(1)胺或(2)聚酰胺-胺(PAMAM)。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中x是1、2、3、4、6或8。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中所述结构选自以下：
以及
其中A是神经节苷脂。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中所述神经节苷脂选自GD2、GD3、GD1b、GT1b、岩藻糖基-GM1、GloboH、聚唾液酸(PSA)、GM2、GM3、唾液酰-路易斯X、唾液酰-路易斯Y、唾液酰-路易斯A、唾液酰-路易斯B和路易斯Y，任选地其中所述神经节苷脂是GD2、GD3、GT1b和GM2。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的组合物，其中所述神经节苷脂被可检测地标记，任选地其中所述神经节苷脂是用酶、辅基(例如，链霉亲和素/生物素)、荧光团、发光标签、生物发光标签和/或放射性同位素标记的。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的组合物，其中所述组合物是药物组合物。
11.一种在受试者中诱导针对神经节苷脂的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1至10中任一项所述的组合物。
12.一种治疗有需要的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1至10中任一项所述的组合物。
13.根据权利要求11或12所述的方法，其中所述受试者患有癌症或患有感染(例如，病毒感染或细菌感染)。
14.一种在哺乳动物中产生抗体的方法，所述方法包括：
(a)用根据权利要求1至10中任一项所述的组合物使所述哺乳动物免疫，所述组合物任选地进一步包含佐剂；以及
(b)从所述哺乳动物、来自所述哺乳动物的细胞或使用来自所述哺乳动物的细胞制备的杂交瘤中分离与所述神经节苷脂结合的抗体。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述哺乳动物选自兔、小鼠、山羊、骆驼、狗、绵羊或大鼠。
16.一种单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体与神经节苷脂的碳水化合物部分特异性结合。
17.根据权利要求16所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述神经节苷脂是：(a)GD2；(b)GD3；或(c)GD2和GD3。
18.根据权利要求16或17所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体或其抗原结合片段包括：
a)如表1所示的重链CDR1、CDR2和CDR3的组合，或其仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约85％序列同一性的变体序列；和/或
b)如表1所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3的组合，或其仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约85％序列同一性的变体序列。
19.根据权利要求16或17所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体或其抗原结合片段包括：
a)如表2所示的VH序列，或其仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约85％序列同一性的变体序列；和/或
b)如表2所示的VL序列，或其仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约85％序列同一性的变体序列。
20.根据权利要求16或17所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包括选自以下的六个CDR氨基酸序列：
a)SEQ ID NO:2、4、6、8、10和12(克隆4)，或其仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约85％序列同一性的变体序列；
b)SEQ ID NO:14、16、18、20、22和24(克隆6)，或其仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约85％序列同一性的变体序列；
c)SEQ ID NO:26、28、30、32、34和36(克隆7)，或其仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约85％序列同一性的变体序列；
d)SEQ ID NO:38、40、42、44、46和48(克隆8)，或其仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约85％序列同一性的变体序列；
e)SEQ ID NO:50、52、54、56、58和60(克隆9)，或其仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约85％序列同一性的变体序列；
f)SEQ ID NO:62、64、66、68、70和72(克隆10)，或其仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约85％序列同一性的变体序列；
g)SEQ ID NO:74、76、78、80、82和84(克隆13)，或其仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约85％序列同一性的变体序列；
h)SEQ ID NO:86、88、90、92、94和96(克隆14)，或其仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约85％序列同一性的变体序列；
i)SEQ ID NO:98、100、102、104、106和108(克隆15)，或其仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约85％序列同一性的变体序列；
j)SEQ ID NO:110、112、114、116、118和120(克隆17)，或其仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约85％序列同一性的变体序列；
k)SEQ ID NO:122、124、126、128、130和132(克隆18)，或其仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约85％序列同一性的变体序列；以及
l)SEQ ID NO:134、136、138、140、142和144(克隆19)，或其仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约85％序列同一性的变体序列。
21.根据权利要求16或17所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包括选自以下的VH氨基酸序列和VL氨基酸序列：
a)SEQ ID NO:146和148，或其仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约85％序列同一性的变体序列；
b)SEQ ID NO:150和152，或其仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约85％序列同一性的变体序列；
c)SEQ ID NO:154和156，或其仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约85％序列同一性的变体序列；
d)SEQ ID NO:158和160，或其仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约85％序列同一性的变体序列；
e)SEQ ID NO:162和164，或其仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约85％序列同一性的变体序列；
f)SEQ ID NO:166和168，或其仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约85％序列同一性的变体序列；
g)SEQ ID NO:170和172，或其仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约85％序列同一性的变体序列；
h)SEQ ID NO:174和176，或其仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约85％序列同一性的变体序列；
i)SEQ ID NO:178和180，或其仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约85％序列同一性的变体序列；
j)SEQ ID NO:182和184，或其仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约85％序列同一性的变体序列；
k)SEQ ID NO:186和188，或其仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约85％序列同一性的变体序列；以及
l)SEQ ID NO:190和192，或其仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约85％序列同一性的变体序列。
22.根据权利要求16至21中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中：
a)所述单克隆抗体或其抗原结合片段是嵌合的、人源化的、复合的、鼠类的或人的；和/或
b)所述单克隆抗体或其抗原结合片段包括选自由以下组成的组的免疫球蛋白重链恒定结构域：IgG、IgG1、IgG2、IgG2A、IgG2B、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgD和IgE恒定结构域。
23.根据权利要求16至22中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体或其抗原结合片段被可检测地标记或缀合，其包括效应子结构域，其中所述效应子结构域包括Fc结构域，和/或其中所述单克隆抗体或其抗原结合片段选自由以下组成的组：Fv、F(ab')2、Fab'、dsFv、scFv、sc(Fv)2和双功能抗体片段。
24.一种免疫球蛋白重链和/或免疫球蛋白轻链，其选自表2中列出的免疫球蛋白重链序列和免疫球蛋白轻链序列。
25.一种分离的核酸分子，其编码：
a)包括表1和/或表2中列出的氨基酸序列的多肽；
b)包括与表1和/或表2中列出的氨基酸序列具有至少或约85％同一性的氨基酸序列的多肽；和/或
c)根据权利要求16至23中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段。
26.一种载体，其包括根据权利要求25所述的分离的核酸。
27.一种宿主细胞，其(a)包括根据权利要求25所述的分离的核酸，(b)包括根据权利要求26所述的载体，和/或(c)表达根据权利要求16至23中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
28.一种产生至少一种根据权利要求16至23中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，其中所述方法包括以下步骤：(i)在适于允许表达所述单克隆抗体或其抗原结合片段的条件下培养包括核酸的宿主细胞，所述核酸包括编码至少一种根据权利要求16至23中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的序列；以及(ii)回收所表达的单克隆抗体或其抗原结合片段。
29.一种装置或试剂盒，其包括至少一种根据权利要求16至23中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段。
30.根据权利要求29所述的装置或试剂盒，其进一步包括：
(a)用于检测所述至少一种单克隆抗体或其抗原结合片段的标记；
(b)用于检测初级抗体的次级抗体；和/或
(c)至少一种参考抗原，任选地其中所述参考抗原是神经节苷脂。
31.根据权利要求30所述的装置或试剂盒，其中所述参考抗原选自GD2、GD3和GD2或GD3的经修饰形式。
32.根据权利要求30或31所述的装置或试剂盒，其中所述参考抗原选自：权利要求1至9中任一项的所述神经节苷脂、苯硫基GD2、苯硫基GD3、GD2-O-芳基-NH2、GD3-O-芳基-NH2、对氨基苯基醚GD2(AP-GD2)、对氨基苯基醚GD3(AP-GD3)、三嗪GD2(例如1,3,5-三嗪-GD2，例如2-氨基-4,6-二氯-1,3,5-三嗪-GD2)、三嗪GD3(例如1,3,5-三嗪-GD3，例如2-氨基-4,6-二氯-1,3,5-三嗪-GD3)、多聚体GD2(例如PAMAM-GD2)和多聚体GD3(PAMAM-GD3)。
33.一种从样品中提取脂质的方法，所述方法包括：
(a)获得所述样品；
(b)向所述样品中添加约2倍至5倍体积的以选自以下的比率包括CHCl3:甲醇:水的有机溶剂：(i)约1:2:1，(ii)约4:8:3，或(iii)约2:4:1；
(c)振荡(b)中的混合物；以及
(d)将所述样品与所述有机溶剂分离，由此从所述样品中提取脂质。
34.一种从样品中纯化神经节苷脂的方法，所述方法包括：
(a)获得所述样品；
(b)向所述样品中添加约2倍至5倍体积的以选自以下的比率包括CHCl3:甲醇:水的有机溶剂：(i)约1:2:1，(ii)约4:8:3，或(iii)约2:4:1；
(c)振荡(b)中的混合物；以及
(d)将所述样品与所述有机溶剂分离，由此从所述样品中提取脂质。
35.根据权利要求33或34所述的方法：
(i)其中在用所述有机溶剂提取之前，通过离心澄清所述样品；
(ii)其中所述样品来自哺乳动物，任选地来自人类；
(iii)其中通过离心将所述样品与所述有机溶剂分离；
(iv)其中所述样品来自患有癌症的受试者或无癌症的受试者；
(v)其中所述样品包括细胞、血清、血液、瘤周组织和/或瘤内组织；
(vi)所述方法进一步包括重复(b)-(d)的步骤至少1、2、3、4或5次；和/或
(vii)所述方法进一步包括从(d)的所提取的样品中蒸发残留有机溶剂，任选地通过在真空(例如，快速真空)下离心溶液。
36.一种检测至少一种神经节苷脂(例如，GD2和/或GD3)的存在或水平的方法，所述方法包括使用至少一种根据权利要求16至23中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段检测样品中的所述神经节苷脂，任选地其中所述样品来自患有癌症的受试者或无癌症的受试者。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述至少一种单克隆抗体或其抗原结合片段与神经节苷脂(例如，GD2或GD3)形成复合物，并且所述复合物在酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、免疫化学方式(例如，免疫组织化学)或流式细胞术中检测到。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述复合物在酶联免疫吸附测定(ELISA)中检测到。
39.根据权利要求37或38所述的方法，其中所述复合物在夹心ELISA中检测到。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述复合物使用任何两种根据权利要求16至23中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在夹心ELISA中检测到。
41.根据权利要求37或38所述的方法，其中所述复合物在竞争性ELISA中检测到。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述竞争性ELISA包括参考抗原，所述参考抗原选自GD2、GD3或GD2或GD3的经修饰形式。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述参考抗原选自：权利要求1至9中任一项的所述神经节苷脂、苯硫基GD2、苯硫基GD3、GD2-O-芳基-NH2、GD3-O-芳基-NH2、对氨基苯基醚GD2(AP-GD2)、对氨基苯基醚GD3(AP-GD3)、三嗪GD2(例如1,3,5-三嗪-GD2，例如2-氨基-4,6-二氯-1,3,5-三嗪-GD2)、三嗪GD3(例如1,3,5-三嗪-GD3，例如2-氨基-4,6-二氯-1,3,5-三嗪-GD3)、多聚体GD2(例如PAMAM-GD2)和多聚体GD3(PAMAM-GD3)。
44.根据权利要求37所述的方法，其中所述复合物在免疫组织化学(IHC)中检测到。
45.一种检测至少一种神经节苷脂的存在、水平或脂质长度的方法，所述方法包括使用质谱法(例如，LC/MS或LC/MS/MS)检测样品中的所述神经节苷脂，任选地其中所述样品来自患有癌症的受试者或无癌症的受试者。
46.根据权利要求36至45中任一项所述的方法，其中所述样品是根据权利要求33至35中任一项所述的方法制备的。
47.一种诊断受试者的癌症的方法，所述方法包括：
a)使用至少一种单克隆抗体或其抗原结合片段确定受试者样品中的至少一种神经节苷脂的水平，任选地其中所述至少一种单克隆抗体或其抗原结合片段是根据权利要求16至23中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段；以及
b)将所述至少一种神经节苷脂的所述水平与对照样品中的所述至少一种神经节苷脂的水平进行比较，
其中与所述对照样品中的所述水平相比，所述受试者样品中的所述至少一种神经节苷脂的显著更高的水平表明所述受试者患有癌症。
48.一种鉴定患有癌症的受试者的方法，所述方法包括：
a)使用至少一种单克隆抗体或其抗原结合片段确定受试者样品中的至少一种神经节苷脂的水平，任选地其中所述至少一种单克隆抗体或其抗原结合片段是根据权利要求16至23中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段；以及
b)将所述至少一种神经节苷脂的所述水平与对照样品中的所述至少一种神经节苷脂的水平进行比较，
其中与所述对照样品中的所述水平相比，所述受试者样品中的所述至少一种神经节苷脂的显著更高的水平将所述受试者鉴定为患有癌症。
49.一种确定癌症等级的方法，所述方法包括：
a)使用至少一种单克隆抗体或其抗原结合片段确定受试者样品中的至少一种神经节苷脂的水平，任选地其中所述至少一种单克隆抗体或其抗原结合片段是根据权利要求16至23中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段；以及
b)将所述至少一种神经节苷脂的所述水平与对照样品中的所述至少一种神经节苷脂的水平进行比较，
其中与所述对照样品中的所述水平相比，所述受试者样品中的所述至少一种神经节苷脂的所述水平增加至少100％且不超过200％表明所述受试者患有低等级癌症；和/或
其中与所述对照样品中的所述水平相比，所述受试者样品中的所述至少一种神经节苷脂的所述水平增加至少200％表明所述受试者患有高等级癌症。
50.一种确定癌症的肿瘤负荷的方法，所述方法包括：
a)使用至少一种单克隆抗体或其抗原结合片段确定受试者样品中的至少一种神经节苷脂的水平，任选地其中所述至少一种单克隆抗体或其抗原结合片段是根据权利要求16至23中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段；以及
b)将所述至少一种神经节苷脂的所述水平与对照样品中的所述至少一种神经节苷脂的水平进行比较，
其中与所述对照样品中的所述水平相比，所述受试者样品中的所述至少一种神经节苷脂的所述水平增加至少100％且不超过200％表明所述受试者具有低肿瘤负荷；和/或
其中与所述对照样品中的所述水平相比，所述受试者样品中的所述至少一种神经节苷脂的所述水平增加至少200％表明所述受试者具有高肿瘤负荷。
51.一种检测受试者的癌症复发的方法，所述方法包括：
a)从接受癌症治疗后癌症消退的所述受试者获得或提供样品；
b)使用至少一种单克隆抗体或其抗原结合片段确定所述受试者样品中的至少一种神经节苷脂的水平，任选地其中所述至少一种单克隆抗体或其抗原结合片段是根据权利要求16至23中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段；以及
c)将所述至少一种神经节苷脂的所述水平与对照样品中的所述至少一种神经节苷脂的水平进行比较，
其中与所述对照样品中的所述水平相比，所述受试者样品中的所述至少一种神经节苷脂的显著更高的水平表明所述受试者的癌症复发。
52.一种检测受试者的微小残留病灶的方法，所述方法包括：
a)从处于缓解期的所述受试者获得或提供样品；
b)使用至少一种单克隆抗体或其抗原结合片段确定所述受试者样品中的至少一种神经节苷脂的水平，任选地其中所述至少一种单克隆抗体或其抗原结合片段是根据权利要求16至23中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段；以及
c)将所述至少一种神经节苷脂的所述水平与对照样品中的所述至少一种神经节苷脂的水平进行比较，
其中与所述对照样品中的所述水平相比，所述受试者样品中的所述至少一种神经节苷脂的显著更高的水平表明所述受试者患有微小残留病灶。
53.一种根据癌症疗法的益处对患有癌症的受试者进行分类的方法，所述方法包括：
a)使用至少一种单克隆抗体或其抗原结合片段确定受试者样品中的至少一种神经节苷脂的水平，任选地其中所述至少一种单克隆抗体或其抗原结合片段是根据权利要求16至23中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段；
b)确定对照中的所述至少一种神经节苷脂的水平；以及
c)比较在步骤a)和b)中检测到的所述至少一种神经节苷脂的所述水平，
其中与所述对照中的所述水平相比，所述受试者样品中的所述至少一种神经节苷脂的所述水平无显著变化或降低表明患有所述癌症的所述受试者将从所述癌症疗法中受益。
54.一种确定患有癌症的受试者是否可能对癌症疗法做出应答的方法，所述方法包括：
a)使用至少一种单克隆抗体或其抗原结合片段确定受试者样品中的至少一种神经节苷脂的水平，任选地其中所述至少一种单克隆抗体或其抗原结合片段是根据权利要求16至23中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段；
b)确定对照中的所述至少一种神经节苷脂的水平；以及
c)比较在步骤a)和b)中检测到的所述至少一种神经节苷脂的所述水平，
其中与所述对照中的所述水平相比，所述受试者样品中的所述至少一种神经节苷脂的显著更高的水平表明患有所述癌症的所述受试者将不对所述癌症疗法做出应答；和/或
其中与所述对照中的所述水平相比，所述受试者样品中的所述至少一种神经节苷脂的所述水平无显著变化或降低表明患有所述癌症的所述受试者将对所述癌症疗法做出应答。
55.一种用于预测患有癌症的受试者的临床结果的方法，所述方法包括：
a)使用至少一种单克隆抗体或其抗原结合片段确定受试者样品中的至少一种神经节苷脂的水平，任选地其中所述至少一种单克隆抗体或其抗原结合片段是根据权利要求16至23中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段；
b)确定对照中的所述至少一种神经节苷脂的水平；以及
c)比较在步骤a)和b)中确定的所述至少一种神经节苷脂的所述水平，
其中与所述对照中的所述水平相比，所述受试者样品中的所述至少一种神经节苷脂的显著更高的水平表明所述受试者具有不良的临床结果。
56.一种监测受试者的癌症的进展的方法，所述方法包括：
a)使用至少一种单克隆抗体或其抗原结合片段在第一时间点检测受试者样品中的至少一种神经节苷脂的水平，任选地其中所述至少一种单克隆抗体或其抗原结合片段是根据权利要求16至23中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段；
b)在后续时间点重复步骤a)；以及
c)比较在步骤a)和b)中检测到的所述至少一种神经节苷脂的所述水平以监测所述受试者的所述癌症的所述进展，任选地其中所述受试者有风险患上癌症。
57.根据权利要求56所述的方法，其中在所述第一时间点与所述后续时间点之间，所述受试者已经接受癌症疗法。
58.一种评估受试者的癌症疗法的功效的方法，所述方法包括：
a)在从受试者获得的第一样品中，使用至少一种单克隆抗体或其抗原结合片段确定至少一种神经节苷脂的水平，任选地其中所述至少一种单克隆抗体或其抗原结合片段是根据权利要求16至23中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段；
b)在施用所述癌症疗法后的至少一个后续时间点期间重复步骤a)；以及
c)比较在步骤a)和b)中检测到的至少一种神经节苷脂的所述水平，
其中相对于所述第一样品，至少一个后续样品中的所述至少一种神经节苷脂的显著更低的水平表明所述疗法可有效治疗所述受试者的癌症。
59.根据权利要求56至58中任一项所述的方法，其中所述第一样品和/或所述至少一个后续样品是从所述受试者获得的单个样品或混合样品的一部分。
60.根据权利要求47至59中任一项所述的方法，其中所述至少一种单克隆抗体或其抗原结合片段与神经节苷脂(例如，GD2或GD3)形成复合物，并且所述复合物在酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、免疫化学方式(例如，免疫组织化学)或流式细胞术中检测到。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述复合物在酶联免疫吸附测定(ELISA)中检测到。
62.根据权利要求60或61所述的方法，其中所述复合物在夹心ELISA中检测到。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述复合物使用任何两种根据权利要求16至23所述的抗体在夹心ELISA中检测到。
64.根据权利要求60或61所述的方法，其中所述复合物在竞争性ELISA中检测到。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述竞争性ELISA包括参考抗原，所述参考抗原选自GD2、GD3或GD2或GD3的经修饰形式。
66.根据权利要求66或67所述的方法，其中所述参考抗原选自：权利要求1至9中任一项的所述神经节苷脂、苯硫基GD2、苯硫基GD3、GD2-O-芳基-NH2、GD3-O-芳基-NH2、对氨基苯基醚GD2(AP-GD2)、对氨基苯基醚GD3(AP-GD3)、三嗪GD2(例如1,3,5-三嗪-GD2，例如2-氨基-4,6-二氯-1,3,5-三嗪-GD2)、三嗪GD3(例如1,3,5-三嗪-GD3，例如2-氨基-4,6-二氯-1,3,5-三嗪-GD3)、多聚体GD2(例如PAMAM-GD2)和多聚体GD3(PAMAM-GD3)。
67.根据权利要求60所述的方法，其中所述复合物在免疫组织化学(IHC)中检测到。
68.根据权利要求47至66中任一项所述的方法，其中所述样品是根据权利要求33至35中任一项所述的方法制备的。
69.一种诊断受试者的癌症的方法，所述方法包括：
a)使用根据权利要求45或46所述的质谱法确定受试者样品中的至少一种神经节苷脂的水平；以及
b)将所述至少一种神经节苷脂的所述水平与对照样品中的所述至少一种神经节苷脂的水平进行比较，
其中与所述对照样品相比，所述受试者样品中的所述至少一种神经节苷脂的显著更高的水平表明所述受试者患有癌症。
70.一种鉴定患有癌症的受试者的方法，所述方法包括：
a)使用根据权利要求45或46所述的质谱法确定受试者样品中的至少一种神经节苷脂的水平；以及
b)将所述至少一种神经节苷脂的所述水平与对照样品中的所述至少一种神经节苷脂的水平进行比较，
其中与所述对照样品相比，所述受试者样品中的所述至少一种神经节苷脂的显著更高的水平将所述受试者鉴定为患有癌症。
71.一种确定癌症等级的方法，所述方法包括：
a)使用根据权利要求45或46所述的质谱法确定受试者样品中的至少一种神经节苷脂的水平；以及
b)将所述至少一种神经节苷脂的所述水平与对照样品中的所述至少一种神经节苷脂的水平进行比较，
其中与所述对照样品中的所述水平相比，所述受试者样品中的所述至少一种神经节苷脂的所述水平增加至少100％且不超过200％表明所述受试者患有低等级癌症；和/或
其中与所述对照样品中的所述水平相比，所述受试者样品中的所述至少一种神经节苷脂的所述水平增加至少200％表明所述受试者患有高等级癌症。
72.一种确定癌症的肿瘤负荷的方法，所述方法包括：
a)使用根据权利要求45或46所述的质谱法确定受试者样品中的至少一种神经节苷脂的水平；以及
b)将所述至少一种神经节苷脂的所述水平与对照样品中的所述至少一种神经节苷脂的水平进行比较，
其中与所述对照样品中的所述水平相比，所述受试者样品中的所述至少一种神经节苷脂的所述水平增加至少100％且不超过200％表明所述受试者具有低肿瘤负荷；和/或
其中与所述对照样品中的所述水平相比，所述受试者样品中的所述至少一种神经节苷脂的所述水平增加至少200％表明所述受试者具有高肿瘤负荷。
73.一种检测受试者的癌症复发的方法，所述方法包括：
a)从接受癌症治疗后癌症消退的所述受试者获得或提供样品；
b)使用根据权利要求45或46所述的质谱法确定所述受试者样品中的至少一种神经节苷脂的水平；以及
c)将所述至少一种神经节苷脂的所述水平与对照样品中的所述至少一种神经节苷脂的水平进行比较，
其中与所述对照样品中的所述水平相比，所述受试者样品中的所述至少一种神经节苷脂的显著更高的水平表明所述受试者的癌症复发。
74.一种检测受试者的微小残留病灶的方法，所述方法包括：
a)从处于缓解期的所述受试者获得或提供样品；
b)使用根据权利要求45或46所述的质谱法确定所述受试者样品中的至少一种神经节苷脂的水平；以及
c)将所述至少一种神经节苷脂的所述水平与对照样品中的所述至少一种神经节苷脂的水平进行比较，
其中与所述对照样品中的所述水平相比，所述受试者样品中的所述至少一种神经节苷脂的显著更高的水平表明所述受试者患有微小残留病灶。
75.一种根据癌症疗法的益处对患有癌症的受试者进行分类的方法，所述方法包括：
a)使用根据权利要求45或46所述的质谱法确定受试者样品中的至少一种神经节苷脂的水平；
b)确定对照中的所述至少一种神经节苷脂的水平；以及
c)比较在步骤a)和b)中检测到的所述至少一种神经节苷脂的所述水平，
其中与所述对照中的所述水平相比，所述受试者样品中的所述至少一种神经节苷脂的所述水平无显著变化或降低表明患有所述癌症的所述受试者将从所述癌症疗法中受益。
76.一种确定患有癌症的受试者是否可能对癌症疗法做出应答的方法，所述方法包括：
a)使用根据权利要求45或46所述的质谱法确定受试者样品中的至少一种神经节苷脂的水平；
b)确定对照中的所述至少一种神经节苷脂的水平；以及
c)比较在步骤a)和b)中检测到的所述至少一种神经节苷脂的所述水平，
其中与所述对照中的所述水平相比，所述受试者样品中的所述至少一种神经节苷脂的显著更高的水平表明患有所述癌症的所述受试者将不对所述癌症疗法做出应答；和/或
其中与所述对照中的所述水平相比，所述受试者样品中的所述至少一种神经节苷脂的所述水平无显著变化或降低表明患有所述癌症的所述受试者将对所述癌症疗法做出应答。
77.一种用于预测患有癌症的受试者的临床结果的方法，所述方法包括：
a)使用根据权利要求45或46所述的质谱法确定受试者样品中的至少一种神经节苷脂的水平；
b)确定对照中的所述至少一种神经节苷脂的水平；以及
c)比较在步骤a)和b)中确定的所述至少一种神经节苷脂的所述水平，
其中与所述对照中的所述水平相比，所述受试者样品中的所述至少一种神经节苷脂的显著更高的水平表明所述受试者具有不良的临床结果。
78.一种监测受试者的癌症的进展的方法，所述方法包括：
a)使用根据权利要求45或46所述的质谱法在第一时间点检测受试者样品中的至少一种神经节苷脂的水平；
b)在后续时间点重复步骤a)；以及
c)比较在步骤a)和b)中检测到的所述至少一种神经节苷脂的所述水平以监测所述受试者的所述癌症的所述进展，任选地其中所述受试者有风险患上癌症。
79.根据权利要求78所述的方法，其中在所述第一时间点与所述后续时间点之间，所述受试者已经接受癌症疗法。
80.一种评估受试者的癌症疗法的功效的方法，所述方法包括：
a)在从受试者获得的第一样品中，使用根据权利要求45或46所述的质谱法确定至少一种神经节苷脂的水平；
b)在施用所述癌症疗法后的至少一个后续时间点期间重复步骤a)；以及
c)比较在步骤a)和b)中检测到的至少一种神经节苷脂的所述水平，
其中相对于所述第一样品，至少一个后续样品中的所述至少一种神经节苷脂的显著更低的水平表明所述疗法可有效治疗所述受试者的癌症。
81.根据权利要求78至80中任一项所述的方法，其中所述第一样品和/或所述至少一个后续样品是从所述受试者获得的单个样品或混合样品的一部分。
82.一种诊断受试者的癌症的方法，所述方法包括：
a)使用根据权利要求45或46所述的质谱法确定受试者样品中的至少一种神经节苷脂的脂质长度；以及
b)将所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度与对照样品中的所述至少一种神经节苷脂的脂质长度进行比较，
其中与所述对照样品相比，所述受试者样品中的所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度的异质性的显著变化表明所述受试者患有癌症。
83.一种鉴定患有癌症的受试者的方法，所述方法包括：
a)使用根据权利要求45或46所述的质谱法确定受试者样品中的至少一种神经节苷脂的脂质长度；以及
b)将所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度与对照样品中的所述至少一种神经节苷脂的脂质长度进行比较，
其中与所述对照样品相比，所述受试者样品中的所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度的异质性的显著变化将所述受试者鉴定为患有癌症。
84.一种确定癌症等级的方法，所述方法包括：
a)使用根据权利要求45或46所述的质谱法确定受试者样品中的至少一种神经节苷脂的脂质长度；以及
b)将所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度与对照样品中的所述至少一种神经节苷脂的脂质长度进行比较，
其中与所述对照样品中的所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度的异质性相比，所述受试者样品中的所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度的异质性的至少100％且不超过200％的变化(例如，增加或减少)表明所述受试者患有低等级癌症；和/或
其中与所述对照样品中的所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度的异质性相比，所述受试者样品中的所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度的异质性的至少200％的变化(例如，增加或减少)表明所述受试者患有高等级癌症。
85.一种确定癌症的肿瘤负荷的方法，所述方法包括：
a)使用根据权利要求45或46所述的质谱法确定受试者样品中的至少一种神经节苷脂的脂质长度；以及
b)将所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度与对照样品中的所述至少一种神经节苷脂的脂质长度进行比较，
其中与所述对照样品中的所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度的异质性相比，所述受试者样品中的所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度的异质性的至少100％且不超过200％的变化(例如，增加或减少)表明所述受试者具有低肿瘤负荷；和/或
其中与所述对照样品中的所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度的异质性相比，所述受试者样品中的所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度的异质性的至少200％的变化(例如，增加或减少)表明所述受试者具有高肿瘤负荷。
86.一种检测受试者的癌症复发的方法，所述方法包括：
a)从接受癌症治疗后癌症消退的所述受试者获得或提供样品；
b)使用根据权利要求45或46所述的质谱法确定受试者样品中的至少一种神经节苷脂的脂质长度；以及
c)将所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度与对照样品中的所述至少一种神经节苷脂的脂质长度进行比较，
其中与所述对照样品中的所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度的异质性相比，所述受试者样品中的所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度的异质性的显著变化表明受试者的癌症复发。
87.一种检测受试者的微小残留病灶的方法，所述方法包括：
a)从处于缓解期的所述受试者获得或提供样品；
b)使用根据权利要求45或46所述的质谱法确定受试者样品中的至少一种神经节苷脂的脂质长度；以及
c)将所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度与对照样品中的所述至少一种神经节苷脂的脂质长度进行比较，
其中与所述对照样品中的所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度的异质性相比，所述受试者样品中的所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度的异质性的显著变化表明所述受试者患有微小残留病灶。
88.一种根据癌症疗法(例如，免疫疗法)的益处对患有癌症的受试者进行分类的方法，所述方法包括：
a)使用根据权利要求45或46所述的质谱法确定受试者样品中的至少一种神经节苷脂的脂质长度；
b)确定对照中的所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度；以及
c)比较在步骤a)和b)中检测到的所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度，
其中与所述对照中的所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度的异质性相比，所述受试者样品中的所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度的异质性无显著变化表明患有所述癌症的所述受试者将从所述癌症疗法中受益。
89.一种确定患有癌症的受试者是否可能对癌症疗法(例如，免疫疗法)做出应答的方法，所述方法包括：
a)使用根据权利要求45或46所述的质谱法确定受试者样品中的至少一种神经节苷脂的脂质长度；
b)确定对照中的所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度；以及
c)比较在步骤a)和b)中检测到的所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度，
其中与所述对照中的所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度的异质性相比，所述受试者样品中的所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度的异质性的显著变化表明患有所述癌症的所述受试者将不对所述癌症疗法做出应答；和/或
其中与所述对照中的所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度的异质性相比，所述受试者样品中的所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度的异质性无显著变化表明患有所述癌症的所述受试者将对所述癌症疗法做出应答。
90.一种用于预测患有癌症的受试者的临床结果的方法，所述方法包括：
a)使用根据权利要求45或46所述的质谱法确定受试者样品中的至少一种神经节苷脂的脂质长度；
b)确定对照中的所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度；以及
c)比较在步骤a)和b)中确定的所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度，
其中与所述对照样品相比，所述受试者样品中的所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度的异质性的显著变化表明所述受试者具有不良的临床结果。
91.一种监测受试者的癌症的进展的方法，所述方法包括：
a)使用根据权利要求45或46所述的质谱法在第一时间点检测受试者样品中的至少一种神经节苷脂的脂质长度；
b)在后续时间点重复步骤a)；以及
c)比较在步骤a)和b)中检测到的所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度的异质性以监测所述受试者的所述癌症的所述进展，任选地其中所述受试者有风险患上癌症。
92.根据权利要求91所述的方法，其中在所述第一时间点与所述后续时间点之间，所述受试者已经接受癌症疗法。
93.一种评估受试者的癌症疗法的功效的方法，所述方法包括：
a)在从所述受试者获得的第一样品中，使用根据权利要求45或46所述的质谱法确定至少一种神经节苷脂的脂质长度；
b)在施用所述癌症疗法后的至少一个后续时间点期间重复步骤a)；并且
其中相对于所述第一样品，第二样品中的所述至少一种神经节苷脂的所述脂质长度的异质性的显著变化表明所述疗法可有效治疗所述受试者的癌症。
94.根据权利要求91至93中任一项所述的方法，其中所述第一样品和/或所述至少一个后续样品是从所述受试者获得的单个样品或混合样品的一部分。
95.根据权利要求53、54、57、58、75、76、79、80、88、89、92和93中任一项所述的方法，其中所述癌症疗法是外科手术、化学疗法、癌症疫苗、嵌合抗原受体、放射疗法、免疫疗法、免疫检查点抑制蛋白或配体的表达调节剂或其任何组合。
96.根据权利要求95所述的方法，其中所述免疫疗法是免疫检查点抑制疗法。
97.根据权利要求53、54、57、58、75、76、79、80、88、89、92、93、95和96中任一项所述的方法，其中所述癌症疗法是阿维鲁单抗(avelumab)、德瓦鲁单抗(durvalumab)、阿特朱单抗(atezolizumab)、BRAF/MEK抑制剂、派姆单抗(pembrolizumab)、纳武单抗(nivolumab)、伊匹单抗(ipilimumab)或其组合。
98.根据权利要求47至97中任一项所述的方法，其中所述神经节苷脂是肿瘤相关的神经节苷脂。
99.根据权利要求98所述的方法，其中所述肿瘤相关的神经节苷脂选自GD2、GD3、GD1b、GT1b、岩藻糖基-GM1、GloboH、聚唾液酸(PSA)、GM2、GM3、唾液酰-路易斯X、唾液酰-路易斯Y、唾液酰-路易斯A、唾液酰-路易斯B、路易斯Y、或其任何部分；任选地其中所述肿瘤相关的神经节苷脂选自GD1、GD2、GD3、GT1b和GM2。
100.根据权利要求13和35至99中任一项所述的方法，其中所述癌症或肿瘤选自由以下组成的组：神经母细胞瘤、淋巴瘤、白血病、黑色素瘤、神经胶质瘤、小细胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌、软组织肉瘤、骨肉瘤、尤文氏肉瘤、促结缔组织增生性圆细胞肿瘤、横纹肌肉瘤、视网膜母细胞瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌、威尔姆斯肿瘤、前列腺癌、胃癌、子宫内膜癌、胰腺癌和结肠癌。
101.根据权利要求100所述的方法，其中所述癌症或肿瘤选自由以下组成的组：神经母细胞瘤、淋巴瘤、白血病、黑色素瘤、神经胶质瘤、小细胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌、软组织肉瘤、骨肉瘤、尤文氏肉瘤、促结缔组织增生性圆细胞肿瘤、横纹肌肉瘤、视网膜母细胞瘤。
102.根据权利要求33至101中任一项所述的方法，其中所述样品包括从所述受试者获得的细胞、血清、血液、瘤周组织和/或瘤内组织。
103.根据权利要求47至102中任一项所述的方法，其中至少一种神经节苷脂的所述显著更高的水平包括所述至少一种神经节苷脂的所述水平的至少百分之二十增加。
104.根据权利要求47至102中任一项所述的方法，其中至少一种神经节苷脂的所述显著更低的水平包括所述至少一种神经节苷脂的所述水平的至少百分之二十减少。
105.根据权利要求82至102中任一项所述的方法，其中所述脂质长度的异质性的所述显著变化包括所述受试者样品相对于所述对照样品的至少百分之二十的变化(例如，增加或减少)。
106.根据权利要求47至105中任一项所述的方法，其中所述对照样品是来自无癌症受试者的样品。
107.根据权利要求47至106中任一项所述的方法，其进一步包括向所述受试者推荐、开处方和/或施用癌症疗法。
108.根据权利要求11至13和31至113中任一项所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
109.根据权利要求11至13和31至114中任一项所述的方法，其中所述受试者是癌症动物模型或人类。
110.根据权利要求11至13和31至115中任一项所述的方法，其中所述受试者是人类。
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