CN116510025B - 提高水痘病毒疫苗滴度稳定性的冻干保护剂及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种提高水痘病毒疫苗滴度稳定性的冻干保护剂及制备方法，该冻干保护剂所包括的各成分及其在冻干原液中的初始浓度为：海藻糖70‑90g/l、甘露醇20‑40g/l、人血白蛋白0.4‑0.6g/l、PB溶液0.01M，所述冻干保护剂的pH在7.0‑7.6。本申请提供的保护剂不含明胶及199溶液，同时降低人血白蛋白的使用量，使疫苗的内毒素含量大幅降低，极大地降低了对人体的刺激性及危害性，赋予疫苗更好的安全性；同时本发明的保护剂，成分简单、清晰，因此具有提高工作效率以及降低成本的优势，更适合于产业化。在冻干过程中，保护剂中的海藻糖和甘露醇能够稳定细胞膜结构，保护疫苗病毒免受热和冷冻等环境应力的损伤。
Description
技术领域
本发明涉及水痘病毒疫苗技术领域，特别涉及一种提高水痘病毒疫苗滴度稳定性的冻干保护剂及制备方法。
背景技术
水痘是由水痘-带状疱疹病毒引起的一种具有高度传染性的疾病，是一种儿童期常见的高度传染性疾病，主要通过空气飞沫和接触传播，初次感染恢复后，普遍存在潜伏感染，潜伏病毒再激活可引起带状疱疹。水痘临床特征表现为全身皮肤粘膜成批出疹，斑丘疹、丘疹、疱疹和结痂同时存在，在全球广泛传播，严重危害人类健康。目前尚无治疗水痘的特效药物，免疫接种是唯一有效的预防方法。
水痘-带状疱疹病毒(Var icel la-zostervi rus，VZV)是引起水痘及带状疱疹这两种疾病的病原体，VZV只有一个血清型，人是该病毒的唯一自然宿主。目前对于VZV感染还没有特效的药物治疗，水痘-带状疱疹免疫球蛋白和抗疱疹病毒药物十分昂贵，所以使用水痘减毒活疫苗进行普遍的儿童免疫接种已成为世界各国降低乃至切断水痘流行的重要手段及趋势。VZV属于包膜病毒，极不稳定，对pH、温度、保护剂极其敏感。pH小于6.2或大于7.8时即丧失感染性，一般需在-65℃至-70℃保存，无稳定剂的条件下很快丧失感染性。
目前水痘疫苗还存在着一些急需解决的问题。国内上市的水痘疫苗最初都含有明胶和人血白蛋白，接种水痘疫苗后，易引起过敏反应；同时保护剂中的明胶成分也是疫苗内毒素的主要来源，可导致接种者产生发热反应，所以从保护剂中去除明胶已经成为业界共识，如公开号为CN101537186 A、CN102657870A、CN104188923A、CN105582534A等中国专利公开了一种无明胶或无明胶及人血蛋白成分的疫苗冻干保护剂，都是以水痘疫苗作为制备实施例的。另外，2017年，马锐等报道《中国药典》水痘减毒活疫苗质量标准浅析ChP、WHO TRS、EP、BP对于水痘减毒活疫苗病毒含量(滴度)的检测无论在控制点的选择和操作、结果判定方面均存在一定差异。由于目前尚无病毒滴度的国际参考品，WHO建议各国制定自己的病毒滴定参考品。对于滴度的限度要求，除ChP规定具体限值(原液≥4.0l g PFU/ml，成品≥3.6l g PFU/ml)外，WHO、BP、EP均未规定，但WHO要求各国规定成品病毒滴度的下限。特别需要说明的是，BP、EP规定至少使用3支疫苗分别测定病毒滴度，每支参考品重复滴定3次，以此综合计算疫苗病毒滴度，并在结果判定中引入统计学分析方法设定试验成立的条件(参考品3次重复结果估计病毒含量的95％可信区间大于±0.3l og PFU；参考品的病毒滴度偏离设定值超过0.5l og PFU，试验不成立)，通过对参考品的质控避免试验的系统误差，确保检测结果准确可靠。WHO规程也建议最好使用至少5支疫苗分别测定病毒活性，以参考品滴定确定疫苗病毒含量。另外，2022年，陈震等发表的病毒滴度的评价中也有报道，《中国药典》中对水痘减毒活疫苗病毒滴度测定方法能满足确保疫苗有效性的需要。
发明内容
本发明实施例提供的一种提高水痘病毒疫苗滴度稳定性的冻干保护剂，所包括的各成分及其在冻干原液中的初始浓度为：海藻糖70-90g/l、甘露醇20-40g/l、人血白蛋白0.4-0.6g/l、PB溶液0.01M，所述冻干保护剂的pH在7.0-7.6。
优选的，还包括丙基-β-环糊精1-5g/l和磷脂0.1-0.2g/l。
优选的，还包括硫酸镁0.5-2g/l。
优选的，所包括的各成分及其在冻干原液中的初始浓度为：藻糖80-85g/l、甘露醇30-35g/l、人血白蛋白0.5-0.6g/l、包括PB溶液0.01M、羟丙基-β-环糊精1-2g/l和磷脂0.15-0.2g/l和硫酸镁0.8-1.2g/l。
还提供了一种提高水痘病毒疫苗滴度稳定性的冻干保护剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤S1、称取70-90g/l的海藻糖、20-40g/l的甘露醇、0.4-0.6g/l的人血白蛋白，将上述物质充分溶解于0.01M的PB溶液；
步骤S2、调节pH至7.0-7.6之间，测定渗透压在300-500mosm范围内，定容后除菌保存。
优选的，步骤S1包括：
将1-5g/l的丙基-β-环糊精和0.1-0.2g/l的磷脂混合均匀，制备成磷脂-丙基-β-环糊精混合物；
将PB溶液加热至40-50℃，将磷脂-丙基-β-环糊精混合物加入到加热后PB溶液中，并搅拌至完全溶解；
然后再将70-90g/l的海藻糖、20-40g/l的甘露醇、0.4-0.6g/l的人血白蛋白，加入至溶解后溶液中。
优选的，步骤S1中，将磷脂-丙基-β-环糊精混合物和十二烷基聚氧乙烯醚加入到加热后PB溶液中，并搅拌至完全溶解；步骤S2中，先调节pH至7.8-8.0之间，然后在-20℃至-15℃下冷冻干燥；然后在2-8℃下调节pH至7.0-7.6之间，测定渗透压在300-500mosm范围内，定容后除菌保存。
优选的，制备成磷脂-丙基-β-环糊精混合物后，还包括：磷脂-丙基-β-环糊精混合物和羟基乙酸在溶剂中进行搅拌混合，使其充分混合；采用三氯乙酸作为催化剂，反应中羟基乙酸的羟基部分与磷脂-丙基-β-环糊精混合物的羟基部分发生酯化反应，生成羟基化的磷脂-丙基-β-环糊精混合物。
优选的，步骤S1中，将羟基化的磷脂-丙基-β-环糊精混合物和硫酸镁加入到加热后PB溶液中。
优选的，步骤S2中，定容后，用0.22μm滤器除菌，2-8℃保存。
技术效果：
(1)本申请提供的保护剂不含明胶及199溶液，同时降低人血白蛋白的使用量，使疫苗的内毒素含量大幅降低，极大地降低了对人体的刺激性及危害性，赋予疫苗更好的安全性；同时本发明的保护剂，成分简单、清晰，因此具有提高工作效率以及降低成本的优势，更适合于产业化。在冻干过程中，保护剂中的海藻糖和甘露醇能够稳定细胞膜结构，保护疫苗病毒免受热和冷冻等环境应力的损伤。同时，低剂量的人血白蛋白能够降低疫苗内毒素的含量，从而提高疫苗的安全性。
(2)丙基-β-环糊精含有一个疏水内腔和一个亲水的外表面，当丙基-β-环糊精与磷脂接触时，丙基-β-环糊精的疏水内腔与磷脂的疏水基结合，而亲水的外表面则暴露在溶液中，形成了一种类似于脂质体的复合物，这种复合物能够对海藻糖和甘露醇产生包裹作用，防止它们在冻干过程中的失活和降解，从而提高疫苗的稳定性。而且，丙基-β-环糊精能够与疫苗中的蛋白质结合，从而形成一种稳定的复合物，提高疫苗的稳定性和保护效果，海藻糖和甘露醇与丙基-β-环糊精共同形成一种保护膜，保护疫苗中的生物分子，如蛋白质和核酸，免受环境应力的损伤，如氧化、热、冷等，从而提高疫苗的稳定性和保护效果。
(3)硫酸镁本身可以作为辅助成分，具有一定的保护作用，提高保护剂的稳定性。同时，硫酸镁还可以调节保护剂的pH值，使其保持在适宜的范围内，从而增强保护剂的稳定性和保护疫苗的效果。硫酸镁还能与磷脂结合形成稳定的磷酸镁盐，从而增强磷脂在保护剂中的稳定性，保护疫苗中的病毒不受冷冻影响，硫酸镁与丙基-β-环糊精形成复合物，提高丙基-β-环糊精包裹疫苗成分的能力，而且硫酸镁与海藻糖和甘露醇形成离子交联结构，增强稳定性，，能够进一步提高对海藻糖和甘露醇产生包裹作用，防止它们在冻干过程中的失活和降解，从而进一步提高疫苗的稳定性。
(4)通过对PB溶液加热，促进磷脂和丙基-β-环糊精的混合物充分溶解，步骤S1中加入十二烷基聚氧乙烯醚来增强磷脂-丙基-β-环糊精混合物的溶解性，从而提高冻干保护剂的均匀性和稳定性。在-20℃至-15℃下进行冷冻干燥，冷冻干燥过程中水分被冻结形成冰晶，使得磷脂分子排列成层状结构，而丙基-β-环糊精则插入到磷脂分子的双层结构中。这个过程对于保护疫苗滴度的稳定性非常重要，因为它可以减少水分子对疫苗颗粒的影响，防止它们发生热力学不稳定性的变化。
(5)羟基化后，磷脂-丙基-β-环糊精混合物的亲水性增强，因此在水中的溶解度得到提高，羟基化的磷脂-丙基-β-环糊精混合物与硫酸镁与海藻糖和甘露醇进一步形成交联结构，增强稳定性。
本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过在所写的说明书、权利要求书、以及附图中所特别指出的结构来实现和获得。
下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为本发明实施例中一种高水痘病毒疫苗滴度稳定性的冻干保护剂的制备方法的流程示意图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供的一种提高水痘病毒疫苗滴度稳定性的冻干保护剂，所包括的各成分及其在冻干原液中的初始浓度为：海藻糖70-90g/l、甘露醇20-40g/l、人血白蛋白0.4-0.6g/l、PB溶液0.01M，所述冻干保护剂的pH在7.0-7.6。
本申请提供的保护剂不含明胶及199溶液，同时降低人血白蛋白的使用量，使疫苗的内毒素含量大幅降低，极大地降低了对人体的刺激性及危害性，赋予疫苗更好的安全性；同时本发明的保护剂，成分简单、清晰，因此具有提高工作效率以及降低成本的优势，更适合于产业化。在冻干过程中，保护剂中的海藻糖和甘露醇能够稳定细胞膜结构，保护疫苗病毒免受热和冷冻等环境应力的损伤。同时，低剂量的人血白蛋白能够降低疫苗内毒素的含量，从而提高疫苗的安全性。
优选的，还包括丙基-β-环糊精1-5g/l和磷脂0.1-0.2g/l。
丙基-β-环糊精含有一个疏水内腔和一个亲水的外表面，当丙基-β-环糊精与磷脂接触时，丙基-β-环糊精的疏水内腔与磷脂的疏水基结合，而亲水的外表面则暴露在溶液中，形成了一种类似于脂质体的复合物，这种复合物能够对海藻糖和甘露醇产生包裹作用，防止它们在冻干过程中的失活和降解，从而提高疫苗的稳定性。而且，丙基-β-环糊精能够与疫苗中的蛋白质结合，从而形成一种稳定的复合物，提高疫苗的稳定性和保护效果，海藻糖和甘露醇与丙基-β-环糊精共同形成一种保护膜，保护疫苗中的生物分子，如蛋白质和核酸，免受环境应力的损伤，如氧化、热、冷等，从而提高疫苗的稳定性和保护效果。
优选的，还包括硫酸镁0.5-2g/l。
硫酸镁本身可以作为辅助成分，具有一定的保护作用，提高保护剂的稳定性。同时，硫酸镁还可以调节保护剂的pH值，使其保持在适宜的范围内，从而增强保护剂的稳定性和保护疫苗的效果。硫酸镁还能与磷脂结合形成稳定的磷酸镁盐，从而增强磷脂在保护剂中的稳定性，保护疫苗中的病毒不受冷冻影响，硫酸镁与丙基-β-环糊精形成复合物，提高丙基-β-环糊精包裹疫苗成分的能力，而且硫酸镁与海藻糖和甘露醇形成离子交联结构，增强稳定性，，能够进一步提高对海藻糖和甘露醇产生包裹作用，防止它们在冻干过程中的失活和降解，从而进一步提高疫苗的稳定性。
优选的，所包括的各成分及其在冻干原液中的初始浓度为：藻糖80-85g/l、甘露醇30-35g/l、人血白蛋白0.5-0.6g/l、包括PB溶液0.01M、羟丙基-β-环糊精1-2g/l和磷脂0.15-0.2g/l和硫酸镁0.8-1.2g/l。
如图1所示，本发明还提供了一种提高水痘病毒疫苗滴度稳定性的冻干保护剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤S1、称取70-90g/l的海藻糖、20-40g/l的甘露醇、0.4-0.6g/l的人血白蛋白，将上述物质充分溶解于0.01M的PB溶液；
步骤S2、调节pH至7.0-7.6之间，测定渗透压在300-500mosm范围内，定容后除菌保存。
其中，PB溶液0.01M溶液配置鉴下表1
表1
优选的，步骤S1包括：
将1-5g/l的丙基-β-环糊精和0.1-0.2g/l的磷脂混合均匀，制备成磷脂-丙基-β-环糊精混合物；
将PB溶液加热至40-50℃，将磷脂-丙基-β-环糊精混合物加入到加热后PB溶液中，并搅拌至完全溶解；
然后再将70-90g/l的海藻糖、20-40g/l的甘露醇、0.4-0.6g/l的人血白蛋白，加入至溶解后溶液中。
优选的，步骤S1中，将磷脂-丙基-β-环糊精混合物和十二烷基聚氧乙烯醚加入到加热后PB溶液中，并搅拌至完全溶解；步骤S2中，先调节pH至7.8-8.0之间，然后在-20℃至-15℃下冷冻干燥；然后在2-8℃下调节pH至7.0-7.6之间，测定渗透压在300-500mosm范围内，定容后除菌保存。
通过对PB溶液加热，促进磷脂和丙基-β-环糊精的混合物充分溶解，步骤S1中加入十二烷基聚氧乙烯醚来增强磷脂-丙基-β-环糊精混合物的溶解性，从而提高冻干保护剂的均匀性和稳定性。在-20℃至-15℃下进行冷冻干燥，冷冻干燥过程中水分被冻结形成冰晶，使得磷脂分子排列成层状结构，而丙基-β-环糊精则插入到磷脂分子的双层结构中。这个过程对于保护疫苗滴度的稳定性非常重要，因为它可以减少水分子对疫苗颗粒的影响，防止它们发生热力学不稳定性的变化。
优选的，制备成磷脂-丙基-β-环糊精混合物后，还包括：磷脂-丙基-β-环糊精混合物和羟基乙酸在溶剂中进行搅拌混合，使其充分混合；采用三氯乙酸作为催化剂，反应中羟基乙酸的羟基部分与磷脂-丙基-β-环糊精混合物的羟基部分发生酯化反应，生成羟基化的磷脂-丙基-β-环糊精混合物。
羟基化后，磷脂-丙基-β-环糊精混合物的亲水性增强，因此在水中的溶解度得到提高，羟基化的磷脂-丙基-β-环糊精混合物与硫酸镁与海藻糖和甘露醇进一步形成交联结构，增强稳定性。
优选的，步骤S1中，将羟基化的磷脂-丙基-β-环糊精混合物和硫酸镁加入到加热后PB溶液中。
优选的，步骤S2中，定容后，用0.22μm滤器除菌，2-8℃保存。
下面将结合实施例进一步描述本发明提供的提高水痘病毒疫苗滴度稳定性的冻干保护剂及制备方法。
实施例1
称取以下物质(g/l)为：海藻糖70、甘露醇40、人血白蛋白0.5，将上述物质充分溶解于经过滤除菌的0.01M PBS溶液(800mL)中，用0.2M磷酸二氢钠调pH在7.0，测定渗透压在500mosm范围内，定容后，0.22μm滤器除菌，2℃保存。
实施例2
称取以下物质(g/l)为：海藻糖80、甘露醇30、人血白蛋白0.5，将上述物质充分溶解于经过滤除菌的0.01M PBS溶液(800mL)中，用0.2M磷酸二氢钠调pH在7.6之间，测定渗透压在300mosm范围内，定容后，0.22μm滤器除菌，8℃保存。
实施例3
称取以下物质(g/l)为：海藻糖90、甘露醇20、人血白蛋白0.5，将上述物质充分溶解于经过滤除菌的0.01M PBS溶液(800mL)中，用0.2M磷酸二氢钠调pH在7.2，测定渗透压在400mosm范围内，定容后，0.22μm滤器除菌，5℃保存。
实施例4
称取以下物质(g/l)为：海藻糖70、甘露醇40、人血白蛋白0.4，将上述物质充分溶解于经过滤除菌的0.01M PBS溶液(800mL)中，用0.2M磷酸二氢钠调pH在7.6之间，测定渗透压在400mosm范围内，定容后，0.22μm滤器除菌，5℃保存。
实施例5
称取以下物质(g/l)为：海藻糖70、甘露醇40、人血白蛋白0.6，将上述物质充分溶解于经过滤除菌的0.01M PBS溶液(800mL)中，用0.2M磷酸二氢钠调pH在7.6之间，测定渗透压在400mosm范围内，定容后，0.22μm滤器除菌，5℃保存。
实施例6
称取以下物质(g/l)为：海藻糖70、甘露醇40、人血白蛋白0.5、丙基-β-环糊精1g/l和磷脂0.2g/l。
将丙基-β-环糊精和磷脂混合均匀，制备成磷脂-丙基-β-环糊精混合物；
将PB溶液加热至40℃，将磷脂-丙基-β-环糊精混合物加入到加热后PB溶液中，并搅拌至完全溶解；
然后再将海藻糖、甘露醇、的人血白蛋白，加入至溶解后溶液中。
用0.2M磷酸二氢钠调pH在7.6，测定渗透压在400mosm范围内，定容后，0.22μm滤器除菌，5℃保存。
实施例7
称取以下物质(g/l)为：海藻糖70、甘露醇40、人血白蛋白0.5、丙基-β-环糊精5g/l和磷脂0.1g/l。
将丙基-β-环糊精和磷脂混合均匀，制备成磷脂-丙基-β-环糊精混合物；
将PB溶液加热至50℃，将磷脂-丙基-β-环糊精混合物加入到加热后PB溶液中，并搅拌至完全溶解；
然后再将海藻糖、甘露醇、的人血白蛋白，加入至溶解后溶液中。
用0.2M磷酸二氢钠调pH在7.6之间，测定渗透压在400mosm范围内，定容后，0.22μm滤器除菌，5℃保存。
实施例8
称取以下物质(g/l)为：海藻糖70、甘露醇40、人血白蛋白0.5、丙基-β-环糊精5g/l、磷脂0.1g/l、硫酸镁0.5g/l。
将丙基-β-环糊精和磷脂混合均匀，制备成磷脂-丙基-β-环糊精混合物；
将PB溶液加热至50℃，将磷脂-丙基-β-环糊精混合物和十二烷基聚氧乙烯醚加入到加热后PB溶液中，并搅拌至完全溶解；
然后再将海藻糖、甘露醇、的人血白蛋白，加入至溶解后溶液中。
先调节pH至8.0之间，然后在-20℃下冷冻干燥；然后在6℃下调节pH至7.6之间，测定渗透压在400mosm范围内，定容后除菌保存
实施例9
称取以下物质(g/l)为：海藻糖70、甘露醇40、人血白蛋白0.5、丙基-β-环糊精5g/l、磷脂0.1g/l、硫酸镁2g/l。
将丙基-β-环糊精和磷脂混合均匀，制备成磷脂-丙基-β-环糊精混合物；
将PB溶液加热至50℃，将磷脂-丙基-β-环糊精混合物和十二烷基聚氧乙烯醚加入到加热后PB溶液中，并搅拌至完全溶解；
然后再将海藻糖、甘露醇、的人血白蛋白，加入至溶解后溶液中。
，先调节pH至7.8之间，然后在-15℃下冷冻干燥；然后在8℃下调节pH至7.6之间，测定渗透压在400mosm范围内，定容后除菌保存
实施例10
称取以下物质(g/l)为：海藻糖70、甘露醇40、人血白蛋白0.5、丙基-β-环糊精5g/l、磷脂0.1g/l、硫酸镁1g/l。
将丙基-β-环糊精和磷脂混合均匀，制备成磷脂-丙基-β-环糊精混合物，磷脂-丙基-β-环糊精混合物和羟基乙酸在溶剂中进行搅拌混合，使其充分混合；采用三氯乙酸作为催化剂，反应中羟基乙酸的羟基部分与磷脂-丙基-β-环糊精混合物的羟基部分发生酯化反应，生成羟基化的磷脂-丙基-β-环糊精混合物；
将PB溶液加热至50℃，将羟基化的磷脂-丙基-β-环糊精混合物和硫酸镁加入到加热后PB溶液中，并搅拌至完全溶解；
然后再将海藻糖、甘露醇、的人血白蛋白，加入至溶解后溶液中。
先调节pH为7.8，然后在-20℃下冷冻干燥；然后在8℃下调节pH至7.6之间，测定渗透压在300-500mosm范围内，定容后除菌保存
对比例称取以下物质(g/l)为：蔗糖70、明胶8g、人血白蛋白10、精氨酸0.5、谷氨酸钠、尿素0.5、199综合培养基1，将上述物质充分溶解于适量灭菌注射用水后，然后定容，同时调整pH并在7.2-7.8范围内，最后除菌过滤，2-8℃保存。
测试：以人胚肺二倍体细胞为培养基质，制备水痘病毒收获物，以适量的实施例1配制的保护剂可直接与水痘病毒收获物混合，-70℃以下冻融或者使用EDTA消化，收获病毒经1500转，15mi n离心，用冻干保护剂复溶沉淀的方式收获毒种。
将收获的病毒收获物按0.58ml的装量分装于2mL西林瓶中，加半塞后置于冻干箱内，准备冻干。
按步骤2所得的疫苗在冻干箱内预冻至-45℃并在此温度保温2小时，然后抽真空至0.1mbar，同时隔板升温至-28℃开始一次升华，于33℃控温15小时，即完成冻干。
将上述冻干前及冻干后的疫苗进行滴度检定，同时检测冻干后疫苗的渗透压、pH、水分、2-8℃稳定性、37℃稳定性检测。
对上述实施例1-10和对照试验例的疫苗样品分别进行渗透压、水分、pH、冻干前后滴度下降、2-8℃稳定性、37℃稳定性检测，具体结果如下：
本发明的冻干保护剂制备的水痘疫苗渗透压指标的评价
将试验例及对照试验例制备的疫苗部分样品按《中国药典》三部附录ⅤH提供的方法分别进行渗透压测定。结果表明，本发明的保护剂的疫苗渗透压均在280-400m0sm范围内，远远低于对照冻干保护剂的的疫苗。结果见表2。
表2.
由表2中数据可以得出，使用本发明的只含海藻糖、人血白蛋白、甘露醇的疫苗冻干保护剂制备的水痘疫苗与现有含明胶的疫苗冻干保护剂制备的水痘疫苗相比，在疫苗滴度、热稳定性试验、残余水分含量、等方面均达到或者不亚于后者，滴度一致性方面，试验例均符合欧盟药典规定，高于现有疫苗，有着绝对的优势，这得益于冻干保护剂配方的优化，提高疫苗的安全性，并可降低生产成本。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (7)
1.一种提高水痘病毒疫苗滴度稳定性的冻干保护剂，其特征在于，所包括的各成分及其在冻干原液中的初始浓度为：海藻糖70-90g/l、甘露醇20-40g/l、人血白蛋白0.4-0.6g/l、PB溶液0.01M，所述冻干保护剂的pH在7.0-7.6；还包括丙基-β-环糊精1-5g/l和磷脂0.1-0.2g/l。
2.根据权利要求1所述的冻干保护剂，其特征在于，还包括硫酸镁0.5-2g/l。
3.根据权利要求2所述的冻干保护剂，其特征在于，所包括的各成分及其在冻干原液中的初始浓度为：海藻糖80-85g/l、甘露醇30-35g/l、人血白蛋白0.5-0.6g/l、包括PB溶液0.01M、丙基-β-环糊精1-2g/l和磷脂0.15-0.2g/l和硫酸镁0.8-1.2g/l。
4.一种提高水痘病毒疫苗滴度稳定性的冻干保护剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S1、将1-5g/l的丙基-β-环糊精和0.1-0.2g/l的磷脂混合均匀，制备成磷脂-丙基-β-环糊精混合物；
将PB溶液加热至40-50℃，将磷脂-丙基-β-环糊精混合物加入到加热后PB溶液中，并搅拌至完全溶解；
然后再将70-90g/l的海藻糖、20-40g/l的甘露醇、0.4-0.6g/l的人血白蛋白，加入至溶解后溶液中；
步骤S2、调节pH至7.0-7.6之间，测定渗透压在300-500mosm范围内，定容后除菌保存。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中，将磷脂-丙基-β-环糊精混合物和十二烷基聚氧乙烯醚加入到加热后PB溶液中，并搅拌至完全溶解；步骤S2中，先调节pH至7.8-8.0之间，然后在-20℃至-15℃下冷冻干燥；然后在2-8℃下调节pH至7.0-7.6之间，测定渗透压在300-500mosm范围内，定容后除菌保存。
6.一种提高水痘病毒疫苗滴度稳定性的冻干保护剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S1、将1-5g/l的丙基-β-环糊精和0.1-0.2g/l的磷脂混合均匀，制备成磷脂-丙基-β-环糊精混合物；
磷脂-丙基-β-环糊精混合物和羟基乙酸在溶剂中进行搅拌混合，使其充分混合；采用三氯乙酸作为催化剂，反应中羟基乙酸的羟基部分与磷脂-丙基-β-环糊精混合物的羟基部分发生酯化反应，生成羟基化的磷脂-丙基-β-环糊精混合物；
将羟基化的磷脂-丙基-β-环糊精混合物和硫酸镁加入到加热后PB溶液中，并搅拌至完全溶解；
然后再将70-90g/l的海藻糖、20-40g/l的甘露醇、0.4-0.6g/l的人血白蛋白，加入至溶解后溶液中；
步骤S2、调节pH至7.0-7.6之间，测定渗透压在300-500mosm范围内，定容后除菌保存。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中，定容后，用0.22μm滤器除菌，2-8℃保存。
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| US6884422B1 (en) * | 1998-10-19 | 2005-04-26 | Changchun Institute Of Biological Products, Ministry Of Public Health | Freeze-dried hepatitis A attenuated live vaccine and its stabilizer |
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